CN108721155B

CN108721155B - 含有白松露提取物的化妆品制备物和其化妆方法

Info

Publication number: CN108721155B
Application number: CN201710244119.7A
Authority: CN
Inventors: C·科凯; R·沙贝尔
Original assignee: ISP Investments LLC
Current assignee: ISP Investments LLC
Priority date: 2017-04-14
Filing date: 2017-04-14
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2037-04-14
Also published as: EP3609469B1; US11083686B2; EP3609469A1; FR3065172B1; CN108721155A; US20200146971A1; FR3065172A1; WO2018189194A1

Abstract

本发明提供一种从白松露(白块菌(Tuber magnatum))获得提取物用于皮肤化妆用途的方法，可以通过所述方法获得的白松露提取物和包含所述提取物的化妆品组合物。本发明提供减少老化迹象和使皮肤有光泽的方法。

Description

含有白松露提取物的化妆品制备物和其化妆方法

技术领域

本发明属于化妆品领域，更具体地，属于皮肤护理领域。本发明涉及一种通过水性提取制备白松露(白块菌(Tuber magnatum))提取物的方法，通过所述方法可以获得的白松露提取物和包含所述白松露提取物的化妆品组合物。

本发明还涉及减少和/或纠正皮肤的老化和光老化的迹象，以及使皮肤有光泽的方法。

所述白松露提取物可以单独使用或与其它活性物质组合使用。

背景技术

皮肤是重要的器官，由数层(真皮、增殖层和角质层)组成，覆盖身体的整个表面，并确保保护、感觉、免疫、代谢或热调节功能。皮肤与其它器官一样经历老化。

例如，皮肤的外观被各种类型的内部(疾病和激素改变如怀孕)或外部侵害(环境因子，如污染、阳光、紫外照射、病原体等)改变。然后，可能会出现皱纹和细纹、色素沉着过度或色素减退斑、皮肤干燥或甚至脱水、表皮变薄、弹性组织变性、瑕疵、老年斑等。

在皮肤中，观察到成熟前老化(premature aging)，在暴露于紫外照射的区域中出现。

随着年龄增长，皮肤外观改变。暗点、肤色黯淡、肤色不均是与年龄相关的显著效果。皮肤失去年轻的色彩通常是首先出现的老化的外部迹象之一，经常暴露于太阳的UV射线也会导致皮肤出现黯淡和干燥。

已知真菌是生物体大家族。一些野生和可栽培的蘑菇的子实体含有用于传统医药和化妆品的药用化合物。在其进化过程中，真菌进化出各种性质以抵抗环境胁迫，已知一些真菌化合物可以具有调节由生活环境和自然环境对生物体造成的损伤的作用。因此，加强了对来自真菌来源的新的天然生物活性化合物的研究。例如，桦褐孔菌(Inonotusobliquus)蘑菇含有酶如超氧化物歧化酶(SOD)，其是保护细胞对抗ROS的关键元件。

还有，已知松露对某些病症有效，如改善免疫力和高脂血症。块菌属属于子囊菌门，是地下真菌。块菌真菌属包含一些松露物种。这些松露物种是下生真菌，其与乔木和灌木建立外生菌根共生，并形成子实体。

因为子实体特有的香味和美味，一些松露物种是高价食物。这些物种称为“松露”或“真松露”，其是珍贵并且昂贵的佳肴，广泛用于著名的法国和意大利烹饪中。

一般的松露属于子囊菌纲，块菌目，被认为是极好的食用真菌已经很多世纪，并且因为其特别的香味具有显著的重要性。松露是地下真菌，与橡树根共生，并形成块状子实体。在松露提取方法中，释放若干活性物质。已经发现，可以实现对免疫系统的非特异性刺激。

在本发明的说明书中，“松露”是指以下物种：意大利白松露(学名：意大利白块菌(Tuber magnatum pico))、黑松露(也称为来自法国的佩里哥松露，学名：黑孢块菌(Tubermelanosporum)、勃艮第松露(钩块菌(Tuber uncinatum))、卡拉哈里松露(沙漠块菌(Terfezia pfeilii))、狮松露(Trefezia leonis)、夏季松露(夏眠块菌(Tuberaestivum))、冬季松露(冬季块菌(Tuber brumale))、中国松露(中国块菌(Tubersinensis)或印度块菌(Tuber indicum))和比安凯托或发白的松露(Tuber borchii)。

白松露(白块菌)称为山麓或阿尔巴松露。松露在地下几英寸生长，与硬木乔木如橡树、栗树、榛树和鹅耳枥的根共生。形状不规则的多瘤小球尺寸范围从一英寸左右到超过一磅(尽管该尺寸的松露是稀有的)。白松露的坚实的肉的颜色是浅黄色到浅棕色，通体具有白色大理石花纹。松露是真正的地球的果实，比任何其它可食用的根、块茎或蘑菇更稀有和珍贵。在地球上没有其它像它们一样的风味，这也许是为什么它们常常被描述为来自天国。

有很多驯化这些野生松露的尝试，但是它们要生长十年。这些尝试中的一些成功了，但最可靠的来源还是在自然界中寻找它们。

从本领域的状况来看，已知很多化妆品以某些方式含有基于植物的原料，形式是油或提取物。在多数情况中，已知的个体植物的有益效果用于实现相应的全体效果。

现有技术已知在化妆品组合物中使用白松露提取物。多数提取物是总提取物或水-醇提取物。例如，中国专利申请CN-A-104856928公开了一种抗皱化妆品，其中活性物质是混合物A、紫锥菊(Echinacea purpurea)提取物和白松露提取物之一或其任何组合，所述混合物A是三氟乙酰三肽-2和甘油和葡聚糖的混合物。美国授权专利6843995公开了一种化妆品制备物，包含一般松露(块菌科)的至少一种水性提取物以及喷雾干燥的香槟，其中活性复合物在化妆品可接受的凝胶和稳定剂中提供。中国专利CN-A-104666237公开了使用水-醇提取物的制备方法和应用松露活性成分制备抗氧化剂和皮肤美白产品。然而，没有文件公开水提取方法制备完全安全并有效的来自白松露的化妆品成分。

尽管市场上有各种抗老化化妆品产品用于处理皮肤，仍然需要有效的局部施用的化妆品组合物，其使用天然成分作为活性物质对皮肤、毛发和/或指甲提供抗老化或恢复活力的益处。非天然的、化学合成的产品可能被认为对环境或个人不安全。与此相反，天然产物被认为是纯粹的、温和的，并且优于化学合成的产品。已知很多从植物或草药提取的基于天然的产品含有抗氧化剂/自由基清除剂，其可以中和自由基损伤作用。另外，其可以含有刺激真皮中损伤的结缔组织结构和表皮中的屏障功能的合成和恢复的物质。

仍然需要处理老化迹象特别是出现皱纹、细纹和下垂的化妆品组合物。因此，本发明的目标是提供新的组合物和方法用于处理、减轻和/或预防老化的或正在老化的皮肤的迹象。本发明的进一步的目标是改善正在老化的或老化的皮肤的整体外观。

前述介绍只是为了更好的理解本领域面对的问题的性质，不应以任何方式解释为承认是现有技术，也不应将本文引用任何参考文件解释为承认这些参考文件构成本申请的“现有技术”。

发明内容

本发明的主要方面提供获得含有白块菌蘑菇(白松露)的子实体的提取物的方法，包括如下步骤：

(i)向白松露加水以制备混合物；

(ii)搅动所述混合物，维持温度从RT到低于80℃；

(iii)过滤所述混合物以去除固体部分，获得所述提取物。

在另一方面，本发明提供通过本发明的方法获得的白松露提取物。

在另一方面，本发明提供化妆品组合物，包含通过水性提取获得的白松露提取物，其中所述白松露提取物包含在生理学可接受介质中的分子量小于60kDa的化合物。

在另一方面，本发明提供减少和/或纠正皮肤的老化和光老化的迹象的方法，包括对皮肤局部施用化妆品组合物，所述组合物包含通过水性提取获得的白松露提取物，其中所述白松露提取物包含在生理学可接受介质中的分子量小于60kDa的化合物。

在另一方面，本发明提供减少皮肤色素沉积和/或使皮肤有光泽的方法，包括对皮肤局部施用化妆品组合物，所述组合物包含通过水性提取获得的白松露提取物，其中所述白松露提取物包含在生理学可接受介质中的分子量小于60kDa的化合物。

附图说明

本发明进一步的实施方案可以根据附图理解。

图1图示通过免疫荧光评估的成纤维细胞上的胶原I表达。

图2图示在离体皮肤活检上的黑色素含量(Fontana-Masson)。

图3图示LC3的刺激(自体吞噬途径)，在角质形成细胞上评估。

图4图示LC3的刺激(自体吞噬途径)，在离体皮肤活检上评估。

发明详述

本文公开本发明的详细实施方案；然而，应理解，所公开的实施方案仅仅为了说明本发明，其可以用不同形式实施。因此，本文公开的特定的结构和功能细节不理解为限定，而仅仅是作为代表性的基础，用于教导本领域技术人员多方面使用本发明。

任何时候，当术语参考范围而确定时，所述范围应理解为明确地公开其每一元素。作为非限制性实例，范围1-10％应理解为包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％，以及1到10％之间的所有值。

当两个或更多个替换元素称为“选自”一组枚举的替代选择，意思是每个替换元素可以是该组的任一元素，不依赖于其它替换元素的特性。

如本文所用，如无另外规定，“％”指重量％，其是一种组分相对于组合物总重量(即包括任何载体、载剂、溶剂、填料，或施用于皮肤之前添加的其它组分)的重量百分比。

如无另外规定，本文所用的所有术语具有其通常含义。为了描述和要求保护本发明的目的，定义下列术语：

“提取物”理解为从天然来源提取的任何物质或分离的制备物，无论提取方法或成分。该术语用于广义概念，包括，例如，溶于水或有机溶剂、用所述溶剂从天然物质提取的成分，或天然物质的特定成分。

“水性提取物”理解为通过用水提取获得的化合物的混合物。

“生理学可接受”理解为，本发明的活性物质或含有所述物质的组合物适合与皮肤或粘膜接触，而不会引起毒性或不耐受反应。

“皮肤的老化和光老化迹象”是指由老化导致的皮肤和角质附属物外观的所有改变，例如皮肤变薄、下垂、失水和松弛、深皱纹和细纹、失去紧致、黯淡、真皮萎缩或由暴露于紫外照射导致的任何其它皮肤内部退化，如老年斑。

“使皮肤有光泽”是指改善肤色、光彩和/或明晰(clarity)和/或恢复皮肤光泽或亮度。

种名“白块菌”或“白松露”或“trifola d'Alba Madonna”(意大利语“白色母亲的松露”)主要发现于意大利北部山麓区域的Langhe和Montferrat区，最著名的是，在Alba和Asti市周围的农村。白松露的特征在于非常好且稀有的特定气味，湿度81％，蛋白质含量约10％和糖含量约2％。

如本文所用，“皮肤”是指所有构成皮肤的覆盖组织、粘膜和角质附属物，包括毛发、指甲、睫毛和眉毛。

“局部施用”理解为施用或涂敷含有所述白松露提取物的组合物于皮肤或粘膜表面上。

本文描述的是从磨碎的白松露获得提取物的方法，包含所述提取物的化妆品组合物，通过将所述包含白松露提取物的组合物局部施用到皮肤，减少和/或纠正皮肤的老化和光老化迹象的方法。

抗氧化剂作为健康保护因子发挥重要作用。科学证据提示，抗氧化剂减少慢性疾病包括癌症和心脏病的风险。天然存在的抗氧化剂的主要来源是全谷类、水果、花和蔬菜。植物抗氧化剂是维生素C、维生素E、胡萝卜素、酚酸、黄酮。

知道本发明的白松露提取物富含多酚化合物，如酚酸。所有这些已知其抗氧化活性的水溶性分子有助于提供本发明的白松露提取物的抗氧化效力。所测量的总多酚含量是100mg/kg提取物。

多酚化合物被认为是强力抗氧化分子。“多酚化合物”是在天然植物食物来源中发现的丰富的化合物，其具有抗氧化性质。其是指所有多酚类，意指包含至少一个二酚芳香环的化合物，任选地，酚基可以醚化或酯化。其亦简称为“多酚”。

多酚在保持健康中起重要作用。抗氧化剂总体来讲帮助保护体内的细胞免受自由基损害，从而控制老化速率。抗氧化剂主要可以分为三组：类胡萝卜素、在蒜和洋葱中发现的烯丙基硫醚、多酚(也称为酚类物质)。

多酚可以进一步分成四类：酚酸、黄酮、木脂素和芪类，基于其含有的酚环数量和使这些环彼此结合的结构元件另外分亚组。

酚酸是一类称为多酚的植物化学品，在多种基于植物的食物中发现；种子和果皮以及蔬菜叶中含有的浓度最高。酚酸容易通过肠道壁吸收，且可能有益于健康，因为其作为抗氧化剂防止自由基氧化反应造成的细胞损伤。在自然界中发现了许多不同的酚酸，其可以分为两类：苯甲酸衍生物如没食子酸，和肉桂酸衍生物，包括咖啡酸和阿魏酸。肉桂酸比苯甲酸更常见。

本发明提供获得自磨碎的白松露的白松露提取物。

本发明的白松露提取物可以通过水性提取获得。在白松露提取物中发现的可能有生物学活性的大量化合物是水溶性的。

在优选的实施方案中，本发明提供从白松露(白块菌)获得提取物的方法，所述方法包括：

(i)向磨碎的白松露加水以制备混合物；

(ii)搅动所述混合物2小时，维持温度从RT到低于80℃；

(iii)过滤所述混合物以去除固体部分，获得所述提取物。

在优选的实施方案中，所述磨碎的白松露浸渍于水中。溶液经短时间温和浸渍2小时，温度从RT到低于80℃。最优选的温度是保持在RT到50℃之间以保持感兴趣的分子如酚酸的完整性，从而保持其作为抗氧化剂起作用的能力。

提取温度的选择依据所需待提取化合物的类型，植物学来源(花、果实、茎、种子、叶、根)的结构特征，提取所要求的质量和产量，以及按比例放大所述方法的经济可行性。从植物材料提取酚类化合物受提取温度和时间影响，其反映溶解和分析物氧化降解的冲突作用。然而，很多酚类化合物容易水解和氧化。长的提取时间和高温增加酚类氧化的机会，这降低提取物中酚类的产量。在不同温度进行分析，显示高温使这些类型的分子降解。

水提取可以在室温实施或在搅拌时对水加热不超过80℃。优选地，通过在加热到50℃的水中浸渍2小时进行提取。然后将粗溶液进行网格过滤以去除不溶性材料。网格过滤后，收集水性或液体部分。为去除水性提取物的较小的残余物，可以通过本领域技术人员众所周知的任何方法进行过滤。

在优选的实施方案中，纯化方法通过使用从50-20μm直到0.5-0.2μm的孔径递减的滤器进行依次过滤开始以得到提取物。

在优选的实施方案中，纯化方法之后用炭黑进行双重纯化。

在另一优选的实施方案中，所获得的提取物包含蛋白质片段和肽，分子量小于60kDa，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证明。所获得的提取物是澄清且明亮的溶液。

在另一优选的实施方案中，所述提取物随后用溶剂稀释，浓度为0.5g/kg到1.5g/kg、优选1g/kg干物质，所述溶剂如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基或丙氧基乙二醇、环多元醇或这些溶剂的任何混合物，例如30％丁二醇和2％1,2-己二醇，保持pH在4和5之间。

然后，通过灭菌过滤对稀释的活性物质进行灭菌。然后所述溶液在65℃加热过夜以进行低温巴斯德灭菌。

此外，本发明的稀释的活性物质可以定性和定量分析。特征如下：

-蛋白质：0.05–0.15g/kg,

-糖：0.35–1.05g/kg,

-氨基酸：0.025–0.075g/kg,

-酚类化合物：0.05–0.15g/kg,

-所述提取物不含有任何神经酰胺或鞘脂。

所述白松露提取物的蛋白质含量通过Lowry蛋白质分析(Lowry OH,RosebroughNJ,Farr AL,Randall RJ(1951).“Protein measurement with the Folin phenolreagent”,J.Biol.Chem.193(1)：265–75)进行测定，其用于定量所述提取物的总蛋白质含量。Lowry分析是用于测定溶液中的蛋白质总水平的生物化学分析。Lowry方法基于由肽键氧化产生的Cu⁺与Folin–Ciocalteu试剂的反应。在分光光度计于550nm读取样品的吸收。使用BSA标准曲线确定蛋白质含量。

白松露提取物的氨基酸含量测定起始于Moore等公开的方案(Moore et al,“Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids”,Journal of Biological Chemistry 1948Vol.176pp.367-388)。通过试剂茚三酮破坏氨基和羧基官能团，然后形成有色复合物来评估提取物的游离氨基酸含量。在分光光度计于570nm读取所述复合物的吸收。使用氨基酸集合体(pool)标准曲线确定总氨基酸含量。

白松露提取物的总糖含量通过改编Dubois等描述的分析(Dubois et al.,“Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances”,Anal.Chem.,1956,28(3),350–356)比色测定。这一分析包括原料溶于浓硫酸然后与酚反应形成有色复合物。在分光光度计于490nm读取所述复合物的吸收。使用葡萄糖标准曲线确定糖含量。

白松露提取物的多酚含量使用Folin-Ciocalteu分析(Singleton et al.(1999).“Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants bymeans of Folin–Ciocalteu reagent”,299：152)测定。样品中的多酚化合物与Folin-Ciocalteu试剂反应，所述试剂氧化产生蓝色。在分光光度计于760nm读取所述样品的吸收。使用没食子酸标准曲线将含量表达为没食子酸当量。

进行SDS-PAGE电泳以评估提取物的蛋白质的分子量。所述白松露提取物在还原性变性条件下，在变性样品缓冲液中加热到70℃，10分钟。抗氧化溶液加入到内室(阴极)，这样还原的蛋白质不会在电泳过程中再氧化。蛋白质迁移使用MES运行缓冲液进行，以标准

Sharp作为分子量标记。使用银染进行蛋白质染色。

本申请提供化妆品组合物，包含通过水性提取获得的白松露提取物，其中所述白松露提取物包含分子量小于60kDa的化合物和生理学可接受的介质。

本发明提取物的优点在于小化合物更稳定且可再生产，而不会有致敏作用。

在另一优选的实施方案中，所述白松露提取物以所述组合物总重量的约0.01％重量至约20％重量，优选约0.1％重量至约5％重量的浓度存在。

在另一实施方案中，所述白松露提取物用于化妆品应用，更优选地，用于局部施用。

在另一优选的实施方案中，本发明提供本领域技术人员改造的口服、胃肠外或局部配制物，特别是用于化妆品或皮肤病学(dermatological)组合物。有利地，本发明的组合物设计为局部施用。因此，这些组合物必须含有生理学可接受的介质，即与皮肤相容，涵盖所有化妆品和皮肤病学形式。

进一步，本发明的组合物优选形式为水性、水醇性或油性溶液；水包油乳剂，油包水乳剂或多乳剂；适于在皮肤、粘膜、嘴唇和/或角质附属物上施用的乳膏、悬浮液、粉。这些组合物还可以或多或少是液体并且外观是乳膏、洗液(lotion)、乳液、精华液(serum)、发蜡、凝胶、糊或摩丝。其还可以固态形式存在，如棒，或可以作为气溶胶施用于皮肤。其还可以用作护肤品和/或化妆品。

在另一实施方案中，所述组合物包含在本申请的范围内可想到的常规使用的添加剂以及其配制所必需的添加剂，如共溶剂(乙醇、甘油、苄基醇、阻尼剂(damper)……)、增稠剂、稀释剂、乳化剂、抗氧化剂、着色剂、防晒剂、色素、填料、防腐剂、香料、去味剂、精油、少量元素(oligo element)、必需脂肪酸、表面活性剂、成膜聚合物、化学滤器或矿物质、润湿剂或温泉水(thermal water)等。例如，可以引用(优选天然的)水溶性聚合物如多糖或多肽、甲基纤维素或羟丙基纤维素类纤维素衍生物，甚或合成的聚合物、泊洛沙姆、卡波姆、硅氧烷、PVA或PVP，特别是Ashland公司出售的聚合物。

应充分理解，本发明的活性物质可以单独使用或与其他活性成分共同使用。

此外，可以根据本发明使用的组合物有利地含有至少一种其他活性物质。可以非限制方式引用下列类型的成分：其它肽活性物质、蔬菜提取物、治愈剂、抗老化剂、抗皱剂、安抚剂(soothing agent)、抗自由基剂、抗紫外照射剂、刺激真皮大分子合成或能量代谢的物质、润湿剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗炎药、麻醉剂、调节皮肤分化或皮肤色素沉积或脱色的物质和刺激指甲和毛发生长的物质。

在更具体的实施方案中，本发明的组合物包含：

-遮光剂、遮紫外和红外剂；

-抗自由基剂；

-DHEA(脱氢表雄酮)；

-至少一种细胞色素共激活化合物；和/或

-一(或多)种水通道蛋白活化化合物；和/或

-一(或多)种Sirtuin活化化合物；和/或

-一(或多)种增加细胞粘附的化合物；和/或

-一(或多)种增加胶原蛋白或层粘连蛋白等类型的基质蛋白产生的化合物；

-一(或多)种HSP蛋白调节化合物；

-一(或多)种增加细胞能量的化合物；

-一(或多)种调节色素沉积的化合物，如酵母、苋菜、亚麻籽、豆类、可可、玉米、大豆、葵花、油菜籽或豌豆肽提取物；

-一(或多)种改善皮肤屏障功能的化合物；

-一(或多)种保护线粒体的化合物；

-维生素A，尤其是视黄酸、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇棕榈酸酯；

-维生素B3，尤其是烟酰胺、生育酚烟酸酯；,

-维生素B5、维生素B6、维生素B12、泛醇；

-维生素C，尤其是抗坏血酸、抗坏血酸葡萄糖苷、抗坏血酸四棕榈酸、抗坏血酸磷酸镁和钠；

-维生素E、F、H、K、PP和辅酶Q10、金属蛋白酶抑制剂、组织抑制剂金属蛋白酶(TIMP)活化剂；

-氨基酸，尤其是精氨酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、羟脯氨酸二棕榈酸、棕榈酰甘氨酸、羟赖氨酸、甲硫氨酸及其衍生物、N-酰化的氨基酸

-天然或合成的肽，包括二肽、三肽、四肽、五肽、六肽及其亲脂性衍生物、同分异构体和与其它分子如金属离子(即铜、锌、锰、镁及其它)形成的复合物，以商业名

CHRONOGEN^TM、LAMINIXYL IS^TM、PEPTIDE Q10^TM、COLLAXYL^TM(专利FR2827170、

)、PEPTIDE VINCI 01^TM(专利FR2837098、

)、PEPTIDE VINCI 02^TM(专利FR2841781、

)、ATPeptide^TM(专利FR2846883、

)出售的肽，序列为Arg-Gly-Ser-NH₂的合成肽，以商业名ATPeptide^TM由

出售的肽；

-Artémia salina提取物，以商业名GP4G^TM(FR2817748,

)出售；

-植物肽提取物，如亚麻籽提取物(Lipigénine^TM,专利FR2956818,

)、大豆提取物、单粒小麦、葡萄、油菜籽、水稻、玉米或豌豆；

-酵母提取物，如Dynagen^TM,(专利FR2951946,

)或Actopontine^TM(专利FR2944526,

)，脱氢乙酸(DHA)；

-天然或合成的植物甾醇(phystosterol)；

-α-和β-羟基酸，硅醇；

-糖胺、葡萄糖胺、D-葡萄糖胺、N-乙酰-葡萄糖胺、N-乙酰-D-葡萄糖胺、甘露糖胺、N-乙酰-甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙酰-半乳糖胺；

-多酚、异黄酮、黄酮，如葡萄提取物、菠萝提取物、橄榄提取物；

-脂质如神经酰胺或磷脂；

-动物油，如鲨烯或角鲨烯；

-植物油，如扁桃仁油、椰子油、蓖麻油、荷荷巴油、橄榄油、菜籽油、花生油、葵花油、麦胚油、玉米胚芽油、大豆油、棉籽油、苜蓿油、罂粟油、南瓜籽油、月见草油、小米油、大麦油、黑麦油、红花油、西番莲油(passion oil)、榛子油、棕榈油、杏仁油、鳄梨油、金盏花油、乙氧基植物油或乳木果油(shea butter)，以上提及的化合物可以是天然的，如植物的肽水解产物，或也可以是合成的，如肽化合物。

在另一实施方案中，本申请提供化妆方法以减少和/或纠正皮肤老化和光老化的迹象，包括对皮肤局部施用包含本申请的白松露提取物的组合物。

清楚的是，本发明一般而言是设计用于哺乳动物，更具体地，用于人类。发明人实际上鉴定了可用于减少和/或纠正皮肤和老化和光老化的皮肤迹象和使皮肤有光泽的生物学活性。

在另一方面，本申请提供化妆方法以使皮肤有光泽，其中在待处理的皮肤上局部施用包含本发明白松露提取物的化妆品组合物。

针对这一化妆方法的实施方案也来自以上描述。

本发明的进一步优点和特征更详见所提供的说明性、非限制性实施例。

实施例1、制备白松露(白块菌)提取物

白松露(子实体)获得自意大利Alba。将50g磨碎的白松露置于1升蒸馏水中。溶液加热两小时，温度为50℃。然后进行20-50μm过滤以分离固体松露残渣和液体部分。纯化方法始于通过使用从50-20μm直到0.3-0.5μm孔径递减的滤器进行依次过滤开始，然后向溶液加入0.25％炭黑(Cabot Norit SXplus)，并在50℃30分钟的过程中混合；然后用0.3-0.5μm过滤去除炭；向溶液加入另外的0.25％炭黑(Cabot Norit SXplus)，并在50℃30分钟的过程中混合；然后用0.3-0.5μm过滤去除炭。然后用30％丁二醇和2％己二醇将滤液稀释以获得具有0.5-1.5g/kg干物质的提取物。

将溶液pH调节到4至5之间以增加提取物的稳定性。澄清和稀释之后，滤液用0.2μm过滤孔隙在无菌条件下过滤灭菌。用标准程序分析白松露提取物。所获得的白松露提取物的特征如下：干物质：1g/kg-蛋白质：0.1g/kg-糖：0.70g/kg-氨基酸：0.01g/kg以及多酚化合物0.1g/kg。

所述白松露提取物的蛋白质含量通过Lowry蛋白质分析进行测定(Lowry et al,1951)，以定量所述提取物的总蛋白质含量。Lowry分析是用于测定溶液中的蛋白质总水平的生物化学分析。Lowry方法基于由肽键氧化产生的Cu⁺与Folin–Ciocalteu试剂的反应。在分光光度计于550nm读取样品的吸收。使用BSA(牛血清白蛋白)标准曲线确定蛋白质含量。

提取物的氨基酸含量测定起始于Moore等(1948)公开的方案。通过试剂茚三酮破坏氨基和羧基官能团，然后形成有色复合物来评估提取物的游离氨基酸含量。在分光光度计于570nm读取所述复合物的吸收。使用氨基酸集合体标准曲线确定总氨基酸含量。

提取物的总糖含量通过改编Dubois等(1956)描述的分析(Dubois et al.,“Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances”,Anal.Chem.,1956,28(3),350–356)比色测定。这一分析包括原料溶于浓硫酸然后与酚反应形成有色复合物。在分光光度计于490nm读取所述复合物的吸收。使用葡萄糖标准曲线确定糖含量。

Sharp作为分子量标记。使用银染进行蛋白质染色。

所获得的提取物包含分子量小于60kDa的肽。

实施例2、制备白松露(白块菌)提取物

简言之，白松露(子实体)获得自意大利Alba。将100g磨碎的白松露置于1升蒸馏水中。用盐酸将溶液pH调节至2。溶液在80℃温度加热两小时。然后进行20-50μm过滤以分离固体松露残渣和液体部分。纯化方法始于通过使用从50-20μm直到0.3-0.5μm的孔径递减的滤器进行依次过滤开始，然后向溶液加入1％炭黑(Cabot Norit SXplus)，并在50℃30分钟的过程中混合；然后用0.3-0.5μm过滤去除炭。所得滤液具有20g/kg干物质，然后将滤液稀释以获得具有0.5-1.5g/kg干物质的提取物。将溶液pH调节到4至5之间以增加提取物的稳定性。澄清和稀释之后，滤液用0.2μm过滤孔隙在无菌条件下过滤灭菌。

实施例3、制备白松露(白块菌)提取物

简言之，白松露(子实体)获得自意大利Alba。将100g磨碎的白松露置于1升蒸馏水中。用盐酸将溶液pH调节至2。溶液在80℃温度加热两小时。然后进行20-50μm过滤以分离固体松露残渣和液体部分。纯化方法始于通过使用从50-20μm直到0.3-0.5μm的孔径递减的滤器进行依次过滤开始，然后向溶液加入0.25％炭黑(Cabot Norit SXplus)，并在50℃30分钟的过程中混合；然后用0.3-0.5μm过滤去除炭；向溶液加入另外的0.25％炭黑(CabotNorit SXplus)，并在50℃30分钟的过程中混合；然后用0.3-0.5μm过滤去除炭。所得滤液具有20g/kg干物质，然后将滤液稀释以获得具有0.5-1.5g/kg干物质的提取物。将溶液pH调节到4至5之间以增加提取物的稳定性。澄清和稀释之后，滤液用0.2μm过滤孔隙在无菌条件下过滤灭菌。

实施例4、制备白松露(白块菌)提取物

简言之，白松露(子实体)获得自意大利Alba。将100g磨碎的白松露置于1升包含10mM EDTA四钠的溶液中。溶液在50℃温度加热两小时。然后进行20-50μm过滤以分离固体松露残渣和液体部分。纯化方法始于通过使用从50-20μm直到0.3-0.5μm的孔径递减的滤器进行依次过滤开始，然后向溶液加入0.25％炭黑(Cabot Norit SXplus)，并在50℃30分钟的过程中混合；然后用0.3-0.5μm过滤去除炭；向溶液加入另外的0.25％炭黑(Cabot NoritSXplus)，并在50℃30分钟的过程中混合；然后用0.3-0.5μm过滤去除炭。所得滤液具有20g/kg干物质，然后将滤液稀释以获得具有0.5-1.5g/kg干物质的提取物。将溶液pH调节到4至5之间以增加提取物的稳定性。澄清和稀释之后，滤液用0.2μm过滤孔隙在无菌条件下过滤灭菌。

实施例5、评估白松露对皮肤老化的作用，通过成纤维细胞上的细胞外基质评估进行

此研究的目的在于显示白松露提取物对老化的作用，通过细胞外基质(ECM)评估进行，涉及胶原蛋白I表达。

方案：

正常的人成纤维细胞每天用实施例1、2、3或4的白松露提取物溶液处理两次，进行48小时，所述提取物在培养基中1/200稀释，终浓度0.5％vol/vol。

为了通过抗胶原蛋白I抗体免疫标记，清洗所述细胞并用冷甲醇固定。然后在存在特异性抗胶原蛋白I抗体(Tebu，ref.600-401-103-0.5，兔多克隆)的条件下温育所述细胞，然后与偶联荧光染料的合适二抗温育。在特定介质中装片之后，将玻片用落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)观察。通过使用

6.3.软件(PerkinElmer,Inc.)分析图像来定量荧光强度。

结果：

只有用稀释到0.5％的实施例1的白松露提取物处理48小时显示高度显著的成纤维细胞上胶原蛋白I表达增加。施用其它提取物没有显示任何效力。

结果图示于图1。

总结：

0.5％的白松露提取物通过刺激胶原蛋白I改善成纤维细胞上的细胞外基质。实施例1的提取物给出了最好结果。

实施例6、评估白松露提取物对使皮肤有光泽的作用，通过离体皮肤活检上的黑色素含量评估进行

此研究的目的在于显示白松露提取物对使皮肤有光泽的作用，通过使用Fontan-Masson染色的黑色素含量评估进行。Fontan-Masson染色基于不用外部还原剂，黑色素还原含氨的硝酸银溶液成为金属银(褐色)的能力。

方案：

将直径6mm的正常人皮肤活检离体维持在特定培养基中(DMEM 1g/L、HAMF12、胎牛血清和抗生素)。活检每天分别用实施例1、2、3或4的白松露提取物溶液处理两次，进行48小时，所述提取物在PBS中1/200稀释，终浓度分别为0.5％vol/vol。对照条件为施用1X PBS。

为了Fontan-Masson染色，在石蜡中固定并包埋组织。然后将包埋的皮肤活检切割，并将切片脱蜡和复水。然后，将含有氨水和硝酸银的原液施加于每一切片。蒸馏水清洗后，将活检与5％硫代硫酸钠温育并再次清洗。在特定介质中装片之后，用Eclipse E600显微镜(Nikon)检查玻片。褐色/黑色像素数目通过使用ImageJ软件分析图像而定量。

结果：

用稀释至0.5％的实施例1和4的白松露提取物处理48小时显示显著降低(Student’s t-检验)离体皮肤活检上的黑色素含量。施用其它提取物没有显示任何效力。

结果图示于图2。观察到实施例1的提取物的结果比实施例4的提取物更好。

总结：

施用0.5％的白松露提取物通过降低离体皮肤活检上的黑色素含量显示使皮肤有光泽的效力。实施例1的提取物结果最好。实施例1制备的提取物是仅有的对细胞外基质和使皮肤有光泽途径都有作用的提取物。将其选为最佳候选物。

实施例7、评估实施例1的白松露提取物对自体吞噬途径的作用，在角质形成细胞和离体皮肤活检上进行

此研究的目的在于显示白松露提取物对自体吞噬的作用。自体吞噬是自体吞噬-溶酶体降解多数细胞质内含物的分解代谢过程(Cuervo AM et al.“Autophagy,nutritionand immunology”,Mol Aspects Med.33(1):2-13,2012)。在此，评估LC3(微管相关蛋白1A/1B-轻链3)，其是涉及自噬体形成的结构蛋白(Melendez A and Levine B.“Autophagy inC.elegans”,WormBook.24:1-26,2009)。

方案：

在角质形成细胞上的评估

每天用实施例1的白松露提取物溶液处理正常人角质形成细胞两次，进行48小时，所述提取物在培养基中1/200稀释，终浓度0.5％vol/vol。

为通过LC3抗体免疫标记，清洗所述细胞并用冷甲醇固定。然后在存在特异性LC3抗体(Cell Signaling，ref.PM036，兔多克隆)的条件下温育所述细胞，然后与偶联荧光染料的合适二抗温育。在特定介质中装片之后，将玻片用落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert200M显微镜)观察。通过使用

6.3.软件(PerkinElmer,Inc.)分析图像来定量荧光强度。

在离体皮肤活检上的评估

将直径6mm的正常人皮肤活检离体维持在特定培养基中(DMEM 1g/L、HAMF12、胎牛血清和抗生素)。活检每天用实施例1的白松露提取物溶液处理两次，进行48小时，所述提取物在PBS中1/200稀释，终浓度0.5％vol/vol。对照条件为施用1X PBS。

为通过LC3抗体免疫标记，在石蜡中固定并包埋组织。然后将包埋的皮肤活检切割，并将切片脱蜡和复水。然后，进行揭露(unmasking)方案，接着应用特异性抗LC3抗体(Cell Signaling，PM036，兔多克隆)，然后是偶联荧光染料的合适二抗。在特定介质中装片之后，将玻片用落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)观察。

结果：

在角质形成细胞和离体皮肤活检上，用稀释到0.5％的白松露提取物溶液处理48小时都显示高度显著增加LC3表达(Student’s t-检验)。

总结：

0.5％的白松露提取物通过刺激LC3改善自体吞噬途径。

Claims

1.一种从白块菌(Tuber magnatum)物种的白松露获得提取物的方法，所述方法由以下步骤组成：

(i)向磨碎的白松露加水以制备混合物；

(ii)搅动所述混合物，维持温度在50℃，维持2小时；

(iii)过滤所述混合物以去除所述白松露的固体部分，获得所述提取物，其中白松露提取物包含分子量小于60kDa的化合物。

2.权利要求1的方法，其中步骤(iii)的所述提取物通过从50μm至20μm孔隙直至0.5μm到0.2μm的相继过滤进一步澄清以获得提取物。

3.权利要求1或2的方法，其中步骤(iii)的所述白松露提取物随后在溶剂中稀释，所述溶剂选自水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、二丙二醇、乙氧基或丙氧基乙二醇、环多元醇或这些溶剂的任何混合物。

4.通过权利要求1-3之一的方法获得的白松露提取物。

5.权利要求4的白松露提取物，其中所述白松露提取物包含0.5至1.5g/kg的干物质，0.05至0.15g/kg的蛋白质，0.35至1.05g/kg的糖，0.025至0.075g/kg的氨基酸，和0.05至0.15g/kg的酚类化合物。

6.化妆品组合物，包含根据权利要求1-3之一的方法获得的白松露提取物，其中所述白松露提取物包含分子量小于60kDa的化合物和生理学可接受的介质。

7.权利要求6的化妆品组合物，其中所述白松露提取物的使用浓度为所述组合物总重量的0.01％重量至20％重量。

8.权利要求6的化妆品组合物，其中所述白松露提取物的使用浓度为所述组合物总重量的0.1％重量至5％重量。

9.权利要求6-8之一的化妆品组合物，其中所述组合物是适合局部施用的形式。

10.权利要求6-8之一的化妆品组合物，其中所述组合物是凝胶、乳膏、软膏、乳液或发泡产品的形式。

11.权利要求6-8之一的化妆品组合物，进一步包含至少一种其它活性物质。

12.权利要求6-8之一的化妆品组合物，进一步包含至少一种选自抗氧化剂、植物水解产物、合成的肽化合物、遮光剂和抗皱剂的其它活性物质。

13.一种减少和/或纠正皮肤老化和光老化的迹象的非治疗方法，包括对皮肤局部施用化妆品组合物，所述组合物包含根据权利要求1-3之一的方法获得的白松露提取物。

14.一种使皮肤有光泽的非治疗方法，包括对皮肤局部施用化妆品组合物，所述组合物包含根据权利要求1-3之一的方法获得的白松露提取物。