CN108624678A

CN108624678A - 一种用于子痫前期诊治的生物标志物

Info

Publication number: CN108624678A
Application number: CN201810669608.1A
Authority: CN
Inventors: 孙耀兰; 杨承刚; 张冬梅
Original assignee: Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Priority date: 2018-06-26
Filing date: 2018-06-26
Publication date: 2018-10-09
Anticipated expiration: 2038-06-26
Also published as: CN108624678B

Abstract

本发明公开了用于子痫前期诊治的生物标志物，所述生物标志物KIAA1949在子痫前期孕妇胎盘组织和血液中均表达下调，提示KIAA1949可作为检测靶标应用于子痫前期的早期诊断；过表达KIAA1949基因可以促进滋养细胞的增殖和侵袭，据此可将其作为分子靶标应用于子痫前期的治疗。

Description

一种用于子痫前期诊治的生物标志物

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种用于子痫前期诊治的生物标志物，具体的涉及的生物标志物为在子痫前期中显著下调的KIAA1949。

背景技术

子痫前期(pre-eclampsia,PE)、子痫(eclampsia)和妊娠期高血压是妊娠期特有疾病，属于妊娠期高血压疾病(hypertensive disorders in pregnancy)的范畴，发病率在我国约为10％左右，其中尤其以子痫前期多发(Redman CW，Sargent IL.Latest advancesin understanding pre-eclampsia[J].Science,2005，308:1592-1594)。PE主要表现为妊娠20周后出现的高血压、蛋白尿，可引起全身多器官功能损害以及功能的衰竭，可以导致高达15％孕产妇死亡率，是导致孕产妇以及围产儿死亡的主要原因，一直是病理产科研究的重点，至今发病机制不明(Duley L.The global impact of pre-eclampsia andeclampsia.Semin Perinatol.2009；33:130-137.)。临床研究发现，当PE患者妊娠结束后，其症状往往随之而结束，仅有少部分迁延成为慢性高血压。由此，目前研究普遍认为，胚胎在子痫前期发病中扮演着重要的角色，进一步研究认为，胚胎期滋养层细胞侵入性低下导致子宫螺旋动脉重铸障碍以及胎盘形成不良是子痫前期的起始性病理变化(Rigourd M TChelbi S,Uaiman D.Preeclampsia.Med Sci.2008,24(12):1017一1019.)。

子痫前期发生的高危因素除受到低龄或高龄初产、营养缺乏、多胎妊娠和曾有原发性高血压、肾炎、糖尿病病史等环境因素影响外，遗传学上还受到多个基因或多个多态位点相互交叉作用的影响，具有明显的遗传倾向(Serrano N C,Casas JP,Diaz LA,etal.Endothelial NO synthase genotype and risk of preeclampsia:a multicentercase-control study[J].Hypertension,2004,44(5):702-707.)。19世纪以来，针对子痫前期的家族性发病已经被证实，也说明遗传因素参与了子痫前期的发生(Paula J.Williams,Fiona Broughton Pipkin.The genetics of pre-eclampsia and other hypertensivedisorders of pregnancy.Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2011 August,25(4-4):405-417.)。随着人类基因组计划的发展，子痫前期发病相关基因的定位和识别已成为研究热点。阐明子痫前期在分子及细胞水平上的发病机理，及临床上对于子痫前期的预防、及时有效地预测和治疗提供实验依据，对保障母婴健康、降低患病率及产妇死亡率具有重要意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种子痫前期的生物标志物，灵敏和特异性的实现子痫前期的诊断和治疗。

本发明的目的之二在于提供生物标志物在筛选治疗子痫前期的生物标志物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了KIAA1949的检测试剂在制备诊断子痫前期的产品中的应用。

进一步，所述产品包括包括：芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条。

本发明提供了一种诊断子痫前期的产品，所述产品包括KIAA1949的检测试剂。

进一步，所述试剂包括：

特异性识别KIAA1949基因的探针；或

特异性扩增KIAA1949基因的引物；或

特异性结合KIAA1949蛋白的抗体或配体。

本发明所述的产品可用于检测包括KIAA1949基因在内的多个基因及所编码的蛋白(例如，与子痫前期相关的多个基因及所编码的蛋白)的表达水平。

本发明提供了KIAA1949在制备治疗子痫前期的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括KIAA1949功能性表达的促进剂，其中，所述促进剂包括提高KIAA1949基因或其表达产物稳定性、上调KIAA1949基因或其表达产物的表达水平、增加KIAA1949基因或其表达产物有效作用时间的物质。

进一步，所述促进剂为含有KIAA1949的载体。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物包含KIAA1949功能性表达的促进剂，和药学上可接受的载体。

其中，所述促进剂包括提高KIAA1949基因或其表达产物稳定性、上调KIAA1949基因或其表达产物的表达水平、增加KIAA1949基因或其表达产物有效作用时间的物质。

进一步，所述促进剂为含有KIAA1949的载体。

本发明提供了KIAA1949在筛选治疗子痫前期的药物中的应用。

进一步，筛选治疗子痫前期的药物的步骤包括：

用待筛选物质处理表达或含有KIAA1949基因或其编码的蛋白的体系；和

检测所述体系中KIAA1949基因或其编码的蛋白的表达或活性。

其中，若待筛选物质可促进KIAA1949的表达或活性，则表明该待筛选的物质是治疗子痫前期的药物。

在本发明中，所述体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在本发明中，所述的步骤还包括：对获得的候选药物进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选药物中进一步选择可以治疗子痫前期的药物。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了与子痫前期发生发展相关的生物标志物KIAA1949，通过检测受试者KIAA1949的水平，来实现子痫前期的早期诊断，当KIAA1949呈现差异性低表达时，说明患者可能患有子痫前期。

本发明提供了治疗子痫前期的分子靶标KIAA1949，通过靶向于分子标志物，改变标志物的水平来治疗疾病具有敏感性和特异性。

本发明为治疗子痫前期药物的研究与开发提供了一种新的手段。

附图说明

图1是利用QPCR检测KIAA1949基因在子痫前期患者中的表达情况；其中，A是胎盘组织中的表达水平，图B是血液中的表达水平；

图2是KIAA1949基因的表达水平图；

图3是KIAA1949蛋白的表达水平图；

图4显示MTT法检测KIAA1949对细胞增殖活性的影响图；

图5显示利用Transwell小室检测KIAA1949基因对细胞侵袭的影响图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序技术与生物信息学分析，检测子痫前期患者和正常孕妇血液中的基因表达水平，发现其中具有明显差异的基因，探讨其与子痫前期的发生之间的关系，从而为子痫前期的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。经过筛选本发明首次发现了KIAA1949与子痫前期的发生发展相关，并验证了KIAA1949在子痫前期中低表达。KIAA1949可作为子痫前期的独立预测因子，也可以和其他的基因标志物联合应用。

本发明中术语“生物标志物”是其在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因或蛋白。

KIAA1949基因位于6号染色体短臂2区1带上，本发明中的KIAA1949包括野生型、突变型或其片段。在本发明的具体实施例中，KIAA1949具有如目前国际公共核酸数据库GeneBank中KIAA1949基因(NM_001134870.1)所示的序列。

本文所述的生物标志物包括基因和蛋白。此类生物标志物包括含有编码生物标志物的核酸序列或此序列的互补序列的完整或部分序列的DNA。生物标志物核酸还包括含有所关注的任何核酸序列的完整或部分序列的RNA。生物标志物蛋白是由本发明的DNA生物标志物编码的或对应于本发明的DNA生物标志物的蛋白。生物标志物蛋白包含任何生物标志物蛋白或多肽的完整或部分氨基酸序列。生物标志物基因和蛋白的片段和变体也包括在本发明的范围内。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录或翻译(即蛋白)水平上检测生物标志物的表达水平。

本发明的基因和蛋白可以使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术、蛋白免疫检测技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

蛋白免疫技术包括(但不限于)夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。

在本发明的生物标志物的检测中可使用任何直接(如使用传感器芯片)或间接的方法。

芯片、制剂、核酸膜条、试剂盒

本发明提供了检测中KIAA1949基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)芯片、制剂、核酸膜条或试剂盒。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于KIAA1949所示的部分或全部序列。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。

这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

在本发明中，术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体。所述KIAA1949蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与KIAA1949蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测KIAA1949的表达。所述试剂盒包括用于扩增KIAA1949的特异性引物对；标准DNA模板；PCR反应液。

在一个优选的实施方案中，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，序列如SEQ ID NO.3～4所示。

作为更优选的实施方案，所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述引物适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。

在一个更优选的实施方案中，所述试剂盒中的PCR反应液为荧光定量PCR反应液，并进一步包含荧光染料。

在一个更优选的实施方案中，所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg²⁺、Taq酶及buffer缓冲液，所述荧光染料为SYBR Green II，Taq酶为热启动酶。

促进剂和药物组合物

本发明的药物组合物包括KIAA1949功能性表达的抑制剂，和药学上可接受的载体。

在本发明中，关于KIAA1949的“功能性表达”，意指功能性基因产物的转录和/或翻译。“功能性表达”可以在至少三个水平上失调。第一，在DNA水平上，例如通过基因的缺失或破坏，或者是没有转录发生(在两种情况下都阻止相关基因产物的合成)。转录的缺失可以例如由表观遗传的变化(例如DNA甲基化)或由功能缺失性突变导致。如本文中所使用的“功能缺失”或“LOF”突变是，相对于赋予蛋白质增强的或新的活性的功能获得性突变而言，阻止、减少或消除基因产物的功能的突变。功能性缺失可由广泛的突变类型引起，包括但不限于整个基因或基因部分的删除、剪接位点突变、由小的插入和删除引起的移码突变、无义突变、取代了必需氨基酸的错义突变、和阻止产物的正确细胞定位的突变。该定义也包括KIAA1949基因的启动子或调控区域的突变，如果这些突变干扰了基因的功能。无效突变是完全破坏基因产物功能的LOF突变。一个等位基因中的无效突变通常将使表达水平降低50％但可能对基因产物的功能具有严重影响。值得注意的是，功能性表达也可以因为功能获得性突变而失调：通过赋予蛋白质新的活性，蛋白质的正常功能失调，表达的功能活性蛋白减少。反之亦然，功能性表达可以例如通过基因复制或通过缺乏DNA甲基化而增加。功能性表达也可以因为功能获得性突变而失调：通过赋予蛋白质新的活性，蛋白质的正常功能失调，表达的功能活性蛋白减少。反之亦然，功能性表达可以例如通过基因复制或通过缺乏DNA甲基化而增加。

第二，在RNA水平上，例如通过缺乏有效的翻译，例如因为mRNA的不稳定(例如通过UTR变体)，可以导致在转录物翻译之前mRNA被降解。或者通过缺乏有效的转录，例如因为突变诱导了新的剪接变体。

作为本发明的一种可选择的实施方式，所述促进剂包括提高KIAA1949基因或其表达产物稳定性、上调KIAA1949基因或其表达产物的表达水平、增加KIAA1949基因或其表达产物有效作用时间的物质。

通常，可将这些促进剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

作为本发明的一种优选方式，所述的KIAA1949的促进剂是一种KIAA1949的表达载体。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

在本发明中，是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。

在本发明中，“宿主细胞”胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的所述的KIAA1949的促进剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于治疗子痫前期患者。任何前述的KIAA1949的促进剂均可用于组合物的制备。所述药学上可接受的载体和/或辅料，包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

其中，稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

本发明中的药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂等添加剂。

本发明中术语“治疗”是指以治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或病症为目的对患者进行的医学管理。该术语包括积极疗法，即专门以改善疾病、病理状态或病症为目的的治疗，并且还包括病因治疗，即以除去相关疾病、病理状态或病症的病因为目的的治疗。此外，该术语还包括姑息治疗，即设计用于缓解症状而非治愈疾病、病理状态或病症的治疗；预防性治疗，即以最大程度降低或者部分或完全抑制相关疾病、病理状态或病症的发展为目的的治疗；以及支持性治疗，即用于补充另一种以改善相关疾病、病理状态或病症为目的的特定疗法的治疗。

统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与子痫前期相关的基因标志物

1、样品收集

1)血清标本的收集

各收集45例正常孕妇与未接受治疗的子痫前期患者的血液，EDTA抗凝管静置10min，离心分离血清，-20℃保存备用。

2)胎盘标本的收集

各收集45例子痫前期和正常孕妇的胎盘组织，生理盐水漂洗2次，去除水分后分装于冻存管内，-80℃保存备用。

两组均排除多胎妊娠、传染性疾病、化学药物依赖、孕妇吸烟、胎儿先天畸形及其他妊娠合并症及并发症，所有纳入的研究对象均于收集标本前签署知情同意书。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。每组各取5例标本进行基因表达谱的检测分析，进行差异表达基因的筛选，并在各组全部45例标本中进行验证实验。

2、RNA样品的制备

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取胎盘组织中的总RNA，具体步骤参考说明书。

3、RNA样品的质量分析

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。

4、去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。

5、构建cDNA文库

利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

6、上机测序

使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

7、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位，通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，利用cuffdiff检测差异表达，当p值<0.05时，认为基因显著差异表达。

8、结果

RNA-seq结果显示，与正常孕妇的胎盘组织相比，KIAA1949基因在子痫前期组织中的表达量显著下调。

实施例2 QPCR测序验证KIAA1949基因的差异表达

1、对KIAA1949基因差异表达进行大样本QPCR验证。

2、RNA提取

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取胎盘组织中的总RNA，血液RNA提取试剂盒提取血清中的RNA，具体步骤参考说明书。

3、逆转录：

1)加入dNTP mixture1μl，Oligo dT primer 1μl，总RNA 2μg，加Rnase FreeddH₂O使总体积至10μl，在PCR仪上进行变性、退火反应，65℃，5min，反应完成后置于4℃。

2)构建20μl反应体系，继续加入5×Primer Script Buffer 4μl，RNaseInhibitor 0.5μl，Prime Script RTase 0.5μl，RNase Free ddH₂O 5.0μl，在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：42℃15～30min，95℃5min，反应完成之后，置于冰上。

3)水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，-20℃储存备用。

4、QPCR检测KIAA1949的表达水平

1)引物设计

根据Genebank中KIAA1949基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

管家基因GAPDH的引物序列为：

正向引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.1)

反向引物：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.2)

KIAA1949基因：

正向引物为5’-CAGGAACAGAGTTTGGTA-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-TCCGAGTAGTCTTGTCTT-3’(SEQ ID NO.4)。

2)PCR反应体系：正向引物和反向引物各1μl，SYBR Green PCR master mix 10μl，cDNA 1μl，ddH₂O 7μl。

3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 15s)×40个循环，65℃～95℃，温度升高速度0.5℃/5s。在Bio-Rad iQ5荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

以GAPDH为内参，计算子痫前期组织与正常胎盘组织，子痫前期患者血液与正常孕妇血液中KIAA1949荧光定量RT-PCR的实验结果，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，以P<0.05具有统计学差异。

6、结果

结果如图1所示，与正常孕妇相比，子痫前期孕妇中KIAA1949基因表达显著下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，胎盘组织中的阳性检出率＝下调表达例数/总检测例数×100％＝43/45×100％＝95.56％，血液中的阳性检出率为42/45×100％＝93.33％，提示检测血液或胎盘组织中KIAA1949的表达水平可以用于子痫前期的辅助诊断。

实施例3 KIAA1949基因的过表达

1、细胞培养

人早孕绒毛滋养细胞株(HTR-8/SVneo)用含10％胎牛血清的RPIM-1640培养基在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、转染

1)转染前细胞的处理

将处于对数期的滋养细胞HTR-8/SVneo以1×10⁵的密度分别种于六孔板中，于37℃5％CO₂的培养箱中培养。

2)基因过表达载体的构建

根据GeneBank中KIAA1949的序列合成特异的PCR扩增引物，引物序列如下：

正向引物：5’-CCGGTTTAAACGCCACCATGGCCACCATCCCAG-3’(SEQ ID NO.5)

反向引物：5’-CGGGCGGCCGCCCGCCGGCAGGACTCATCCA-3’(SEQ ID NO.6)

在5’端引物和3’端引物分别添加PmeI和NotI两个限制性酶切位点。以子痫前期患者提取和反转录得到的cDNA作为扩增模板，上述cDNA序列经限制性内切酶PmeI和NotI双酶切后插入到经PmeI和NotI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-1用于后续实验。

3)转染

将神经细胞分为3组，分别为对照组(HTR-8/SVneo)、空白对照组(转染pcDNA3.1-NC)、实验组(转染pcDNA3.1-1)。使用脂质体3000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-1的转染浓度均为0.5μg/ml。

3、QPCR检测KIAA1949基因的转录水平

3.1细胞总RNA的提取

采用QIAGEN的细胞RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，具体步骤详见试剂盒说明书

3.2逆转录步骤同实施例2。

3.3 QPCR扩增步骤同实施例2。

4、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，过表达KIAA1949基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图2显示，相比对照组HTR-8/SVneo和转染空载pcDNA3.1-NC，实验组能够显著增加KIAA1949基因的表达水平。

实施例4 ELISA检测HTR-8/SVneo细胞中KIAA1949的蛋白表达

应用双抗体夹心酶标免疫(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)分析法测定HTR-8/SVneo细胞上清中KIAA1949蛋白水平。转染后48h分别收集三组HTR-8/SVneo细胞的上清液，按照ELISA试剂盒操作流程定量检测肿瘤细胞上清液中KIAA1949的浓度。

1、配置浓度为70000pg/ml的标准品，10倍稀释后，再进行2倍倍比稀释，共有7个稀释度。

2、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液50μl，余孔分别加不同浓度梯度的标准品和待测样品各50μl。轻轻晃动混匀，酶标板加上盖，37℃反应2h。

3、弃去液体，晾干。每孔加200μl VEGF-C结合物。37℃，120min后，弃去孔内液体，晾干，PBS洗板3次。

4、依序每孔加底物溶液200μl，37℃避光显色30min。

5、依序每孔加终止溶液50μl，终止反应。

6、用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。所有标准品和待测样品的OD值均需减去零孔的OD值以得到校正值。

7、计算样品的实际浓度。

8、结果如下图3所示，过表达HTR-8/SVneo细胞的KIAA1949基因，KIAA1949的蛋白含量也相应增加，差异具有统计学意义。

实施例5 MTT法检测HTR-8/SVneo细胞增殖活性

1、细胞转染后24h，0.25％胰蛋白酶消化，培养基重悬后计数，稀释细胞悬液，按每孔调整浓度控制在10⁴/ml；

2、按每孔150μl将细胞接种至96孔板，复设5个平行孔；

3、分别于转染1～6天时，弃掉各孔培养基，加入MTT培养液100μl(0.5mg/ml)继续培养5h。弃去MTT培养液，每孔加入150μl DMSO溶解MTT还原物甲瓒，摇床上震荡10min，使结晶物充分溶解，酶联免疫仪检测490nm处吸光度值；

4、统计每天的细胞吸光度值，得到的数值用曲线图表示。

5、结果

结果如图4所示，与对照相比，转染pcDNA3.1-1组的细胞增殖显著增加，提示改变KIAA1949的表达水平可以改变滋养细胞的增殖能力。

实施例7 Transwell细胞体外侵袭实验

细胞转染后48h收集不同组别的HTR-8/SVneo细胞，重悬于培养液中，使细胞终浓度为10⁶/ml，吸取100μl细胞悬液加入Transwell小室中。应用Transwell小室方法观察KIAA1949基因过表达对HTR-8/SVneo细胞侵袭性的影响。

1、将Matrigel放入4℃融化，准备冰盒(冰浴环境)。Matrigel用RPIM-1640稀释后使用，终浓度为1mg/ml。

2、取出预冷的Transwell小室放入24孔板中，向每个Transwell小室膜上均匀加入稀释好的Matrigel胶50μ1，37℃，细胞培养箱放置3～4h使胶凝聚。

3、收集对数生长期的细胞，重悬于培养液中，终浓度为10⁶/ml，轻轻加100μ1细胞悬液入小室。

4、24孔板中加入600μ1含20％血清的培养基，37℃、5％CO₂孵箱内孵育36h。

5、棉签轻轻地擦净Transwell孔内Matrigel胶和细胞，用甲醛固定小室底端的细胞，室温放置25min，取出小室后晾干。

6、0.4％结晶紫染色10min，生理盐水快速洗涤三次，甩干后显微镜下观察，随机选择八个不同的视野照相并计数，统计结果并分析。

7、结果

结果如图5所示，HTR-8/SVneo、pcDNA3.1-NC、pcDNA3.1-1在transwell小室中培养后，实验组pcDNA3.1-1细胞膜下室面的细胞数增加，说明增加KIAA1949的表达水平可以增加滋养细胞的浸润能力，提示KIAA1949可以用于子痫前期的治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> 一种用于子痫前期诊治的生物标志物

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctctggtaaa gtggatattg t 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtggaatca tattggaaca 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caggaacaga gtttggta 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccgagtagt cttgtctt 18

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccggtttaaa cgccaccatg gccaccatcc cag 33

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgggcggccg cccgccggca ggactcatcc a 31

Claims

1.KIAA1949的检测试剂在制备诊断子痫前期的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条。

3.一种诊断子痫前期的产品，其特征在于，所述产品包括KIAA1949的检测试剂。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述试剂包括：

特异性识别KIAA1949基因的探针；或

特异性扩增KIAA1949基因的引物；或

特异性结合KIAA1949蛋白的抗体或配体。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述特异性扩增KIAA1949基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

6.KIAA1949在制备治疗子痫前期的药物组合物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括KIAA1949功能性表达的促进剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述促进剂为含有KIAA1949的载体。

9.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求7或8所述的促进剂，和/或药学上可接受的载体。

10.KIAA1949在筛选治疗子痫前期的药物组合物中的应用。