[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN111363808B - 一种与阿尔茨海默相关的生物标志物及其应用 - Google Patents

一种与阿尔茨海默相关的生物标志物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111363808B
CN111363808B CN202010383293.1A CN202010383293A CN111363808B CN 111363808 B CN111363808 B CN 111363808B CN 202010383293 A CN202010383293 A CN 202010383293A CN 111363808 B CN111363808 B CN 111363808B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tes
gene
ppp1r18
alzheimer
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN202010383293.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111363808A (zh
Inventor
杨庆河
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Second People's Hospital Of Liaocheng
Original Assignee
Second People's Hospital Of Liaocheng
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second People's Hospital Of Liaocheng filed Critical Second People's Hospital Of Liaocheng
Publication of CN111363808A publication Critical patent/CN111363808A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111363808B publication Critical patent/CN111363808B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种与阿尔茨海默相关的生物标志物及其应用，涉及生物标志物TES和PPP1R18在阿尔茨海默中的应用，尤其涉及TES或PPP1R18在阿尔茨海默诊断和治疗中的应用。

Description

一种与阿尔茨海默相关的生物标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，涉及一种与阿尔茨海默相关的生物标志物及其应用，所述分子标志物为TES或PPP1R18。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是痴呆最常见的病因，占所有痴呆病例的75％。AD起病较为隐匿，主要临床表现为缓慢、进行性的记忆减退，认知障碍以及人格与行为改变等。AD的典型病理特征主要包括神经炎性斑(neuritic plaques，NP)及神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)的形成以及神经元和突触的丢失。近几年来关于AD的研究进展较为迅速，包括AD的病因和病理学研究、AD的发病机制、脑脊液和影像标记物以及由此开发的一系列治疗策略的。但是，目前AD的病因尚未完全明确，其发病机制也甚为复杂，目前普遍认为AD的发病是在环境因素、遗传因素，以及二者相互作用的影响下发生。得益于基因检测技术的不断提升，目前关于AD发病的遗传学研究已成为世界范围内关注的焦点，一些新的风险基因的新的位点通过大量大型的全基因组关联性分析研究被发现。
阿尔茨海默病的起病形式隐匿，主要分为痴呆前阶段和痴呆阶段。痴呆前阶段又可以分为轻度认知功能障碍前期和轻度认知障碍期(Scheltens P,Blennow K,BretelerMM,et al.Alzheimer's disease[J].Lancet,2016,388(10043):505-17)。痴呆前阶段病人可以没有任何认知功能障碍或者仅仅表现为轻度的记忆力损害，其他语言、执行能力和视空间能力也可以有轻度的受损。若没有及时发现、没有进行积极有效的干预，随着病人病情的进一步加重可进入痴呆阶段。记忆力损害、执行能力与社会接触能力减退是痴呆阶段的主要临床特征。记忆力损害早期主要表现为近事记忆障碍，晚期为远事记忆受损。病人执行能力与社会接触能力减退主要表现为计算能力、语言及视空间等能力明显降低，出现性格改变如易激怒、孤僻等。在痴呆的晚期，除了上述症状加重外，病人还会出现一定精神神经症状如喜怒无常、情感淡漠，以及椎体外系和自主神经功能障碍如四肢强直、括约肌障碍等，逐渐丧失日常生活能力。此外，也有病人因首发症状为语言、视觉、执行能力障碍，而不是以典型的记忆力障碍而被忽视AD的诊断(Barnes J,Dickerson BC,Frost C,etal.Alzheimer's disease first symptoms are age dependent:Evidence from theNACC dataset[J].Alzheimer's&dementia:the journal of the Alzheimer'sAssociation,2015,11(11):1349-57)。随着医疗技术的发展，AD的临床诊断将不再局限于询问患者及家属病史、神经心理学测试等，AD标志物的检测将为AD的诊断提供新的依据。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供与阿尔茨海默相关的分子标志物用于阿尔茨海默的诊断和治疗。
为了实现上述目的，本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序的方法，检测阿尔茨海默患者和正常人中的差异表达基因，探讨其与阿尔茨海默的发生之间的关系，从而为阿尔茨海默的早期检测提供标志物。
本发明首次发现了阿尔茨海默患者中TES和PPP1R18显著性上调，基于此，本发明提供了生物标志物在制备诊断阿尔茨海默的产品中的应用，生物标志物选自以下一种或两种：TES、PPP1R18。
进一步，所述产品包括检测TES或PPP1R18的试剂。
进一步，所述试剂包括：特异性识别TES或PPP1R18基因的探针；或特异性扩增TES或PPP1R18基因的引物；或特异性结合TES或PPP1R18编码的蛋白的结合剂。
进一步，所述特异性扩增TES或PPP1R18基因的引物序列对分别如SEQ ID NO.1～2和SEQ ID NO.3～4所示。
本发明提供了一种诊断阿尔茨海默的产品，所述产品包括检测TES或PPP1R18水平的试剂。
进一步，所述产品包括核酸膜条、芯片或试剂盒。
进一步，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片，其中基因芯片包括针对TES或PPP1R18的引物或寡核苷酸探针，蛋白质芯片包括特异性结合TES或PPP1R18蛋白的结合剂。
进一步，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括特异性针对TES或PPP1R18的引物、寡核苷酸探针或芯片；所述蛋白检测试剂盒包括特异性结合TES或PPP1R18蛋白的结合剂。
进一步，特异性针对TES或PPP1R18的引物序列如SEQ ID NO.1～4所示。
本发明提供了TES或PPP1R18在制备治疗阿尔茨海默的药物组合物中的应用。
进一步，所述药物组合物包括TES或PPP1R18的抑制剂。所述抑制剂包括核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子。其中核酸抑制物选自：以TES或PPP1R18或其转录本为靶序列、且能够抑制TES或PPP1R18基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。蛋白结合分子选自：与TES或PPP1R18蛋白特异性结合的物质，如能够抑制TES或PPP1R18蛋白活性的抗体或配体。
进一步，所述抑制剂为降低TES或PPP1R18的表达的试剂。
进一步，所述抑制剂为siRNA。
进一步，降低TES的表达的siRNA的序列如SEQ ID NO.7～8所示，降低PPP1R18表达的siRNA的序列如SEQ ID NO.9～10所示。
本发明提供了一种治疗阿尔茨海默的药物组合物，所述药物组合物包括TES或PPP1R18的抑制剂。所述抑制剂包括核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子。其中核酸抑制物选自：以TES或PPP1R18或其转录本为靶序列、且能够抑制TES或PPP1R18基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。蛋白结合分子选自：与TES或PPP1R18蛋白特异性结合的物质，如能够抑制TES或PPP1R18蛋白活性的抗体或配体。
进一步，所述抑制剂为降低TES或PPP1R18的表达的试剂。
进一步，所述抑制剂为siRNA。
进一步，降低TES的表达的siRNA的序列如SEQ ID NO.7～8所示，降低PPP1R18表达的siRNA的序列如SEQ ID NO.9～10所示。
在本发明中，TES(基因ID：26136)包括人TES基因及其所编码的蛋白。作为非限制性的实例，TES的基因序列如NM_015641.4、NM_152829.3任一转录本所示，其相应的氨基酸序列如NP_056456.1、NP_690042.1所示。在本发明中，一种代表性的TES的基因序列如NM_015641.4所示，氨基酸序列如NP_056456.1所示。
PPP1R18(基因ID：170954)包括人PPP1R18基因及其所编码的蛋白。作为非限制性的实例，PPP1R18的基因序列如NM_001134870.2、NM_133471.4任一转录本所示，其相应的氨基酸序列如NP_001128342.1、NP_597728.1所示。在本发明中，一种代表性的PPP1R18的基因序列如NM_001134870.2所示，氨基酸序列如NP_001128342.1所示。
本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。本领域技术人员知道，进行生物信息学分析时，通常会将测序序列和已知的基因进行比对，只要有关序列可以比对到相关基因(如ID：170954或ID：26136)上，就可以看做是该基因的表达，因此，在提及差异表达的基因时，该基因的不同的转录本、突变型或其片段也包含在本发明中。
本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因的表达水平。
本发明的TES或PPP1R18使用本领域普通技术人员已知的多种核酸以及蛋白技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。
本发明可在检测前或与检测同时地对核酸进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。
本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。
将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。
蛋白免疫技术包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。
本文所用术语“差异表达”表示与第二种样品中相同的一种或多种本发明生物标志物的表达水平比较，经测定mRNA的量或水平，在一个样品中本发明的一种或多种生物标志物的RNA和/或所述生物标志物mRNA的一种或多种剪接变体表达水平的差异。“差异表达的”还可以包括与第二种样品或样品群中蛋白质表达量或水平比较，对样品或样品群中本发明生物标志物编码的蛋白质的测定。差异表达可以如本文所述和本领域技术人员理解的方法确定。术语“差异表达”或“表达水平的变化”表示与第二种样品中给定生物标志物的可测定表达水平比较，经测定RNA的量和/或蛋白质的量，样品中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。术语“差异表达”或“表达水平的变化”还可以表示与第二个样品群中生物标志物的可测定表达水平比较，样品群中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。本文所用“差异表达”可以用给定生物标志物的表达水平相对于对照中给定生物标志物的平均表达水平的比率进行测定，其中比率不等于1.0。还可以用p值测定差异表达。当使用p值时，当p值小于0.1时生物标志物被鉴定为在第一和第二群体之间差异表达。更优选p值小于0.05。甚至更优选p值小于0.01。还更优选p值小于0.005。最优选p值小于0.001。当基于比率确定差异表达时，如果第一种和第二种样品中表达水平的比率大于或小于1.0，则RNA或蛋白质是差异表达的。举例来说，大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小于1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中，如果第一群体的平均表达水平与第二群体的平均表达水平的比率大于或小于1.0，则核酸转录本是差异表达的。举例来说，大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小于1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中，如果第一个样品中表达水平与第二个群体中平均表达水平的比率大于或小于1.0，例如包括比率大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20，或比率小于1，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05，则核酸转录本是差异表达的。
“表达差异增加”或“上调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以RNA表达或蛋白质表达测定)显示增加至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或更多或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或更多。
“表达差异降低”或“下调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以RNA表达或蛋白质表达测定)显示降低至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或少于1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更少的基因。例如，上调基因包括与从正常个体分离的mRNA或蛋白质的表达相比，从以患有阿尔茨海默为特征的个体分离的血中mRNA或蛋白质表达水平增加的基因。例如，下调基因包括与从正常个体分离的血相比，从以患有阿尔茨海默为特征的个体分离的血中mRNA或蛋白质表达水平降低的基因。
核酸膜条、芯片、试剂盒
在本发明中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的特异性识别TES或PPP1R18的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。
在本发明中芯片包括基因芯片、蛋白芯片；所述基因芯片包括固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于TES或PPP1R18所示的部分或全部序列。所述蛋白芯片包括固相载体，以及固定在固相载体上的TES或PPP1R18编码的蛋白的特异性结合剂。
特异性结合剂是例如蛋白质TES或PPP1R18的受体、结合蛋白质TES或PPP1R18的凝集素、针对蛋白质TES或PPP1R18的抗体、针对蛋白质TES或PPP1R18的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。
特异性结合剂的例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。在本发明的具体实施例中，所述特异性结合剂为TES或PPP1R18特异性抗体。
所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测TES或PPP1R18基因或蛋白的表达水平，包含用于TES或PPP1R18检测和/或定量的引物、寡核苷酸探针、配体、和/或芯片。任选的与试剂盒的说明书在一起。
试剂盒包括一种或多种无菌容器，这样的容器可以是盒、安瓿、瓶子、管形瓶、管、袋、小袋、泡罩包装、或本领域已知的其它合适的容器形式。这样的容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或适于容器药物的其它材料。
本发明中诊断阿尔茨海默的产品可用于检测包括TES或PPP1R18基因在内的多个基因(例如，与阿尔茨海默相关的多个基因)的表达水平，将阿尔茨海默的多个标志物同时进行检测，可大大提高阿尔茨海默诊断的准确率。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了TES或PPP1R18基因在阿尔茨海默患者中表达水平上调，通过检测TES或PPP1R18基因的表达水平可以辅助诊断受试者是否患有阿尔茨海默或患阿尔茨海默病病的风险，从而指导医生提供预防或治疗方案。
附图说明
图1是利用QPCR检测TES在阿尔茨海默患者中的表达水平图，其中图A是TES的表达水平图，图B是PPP1R18的表达水平图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与阿尔茨海默相关的基因标志物
1、样品收集
收集4例健康人血液和阿尔茨海默患者血液样本，加入抗凝剂混合，进行高通量测序。
2、RNA样品的制备及质量分析
使用Takara公司的血液提取试剂盒提取RNA，步骤如下：
1)将0.25ml血液样品移至离心管中，添加0.75ml RNAiso Blood，用移液枪上下反复吸打直至细胞完全裂解；
2)加入氯仿(样品液+RNAiso Blood体积量的1/5体积量)，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色，室温静置5min；
3)12,000×g、4℃离心15min，吸取上清液移至新的离心管中；
4)向上清中加入等量体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10min；
5)12,000×g、4℃离心10min；
6)弃上清，加入等量的75％乙醇，使用Vortex振荡清洗沉淀后，7,500×g、4℃离心5min，弃上清；
7)室温干燥沉淀，沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀；
8)检测RNA浓度，鉴定RNA的产量和纯度。
3、cDNA文库的构建及测序
cDNA文库的构建及测序由华大基因完成，步骤如下：
1)总RNA DNase I消化：利用DNase I消化Total RNA样品中存在的DNA片段，磁珠纯化回收反应产物，最后溶解于DEPC水；
2)去除rRNA：取消化好的Total RNA样品，使用Epicentre的Ribo-Zero试剂盒去除rRNA，去除之后进行Agilent 2100检测，验证rRNA去除效果；
3)RNA打断：取上一步样品，加入打断Buffer，置于PCR仪中进行热打断，打断到140-160nt；
4)反转录一链的合成：向打断后的样品中加入适量引物，充分混匀后在Thermomixer适温反应一定时间，使之打开二级结构并与引物结合，再加入提前配制的一链合成反应体系Mix，在PCR仪上按相应程序合成一链cDNA；
5)反转录二链的合成：配制二链合成反应体系，在Thermomixer上适温反应一定时间，合成带有dUTP的二链cDNA，反应产物用磁珠进行纯化回收；
6)末端修复：配制末端修复反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，对反转录得到的cDNA双链的粘性末端进行修复，末端修复产物用磁珠进行纯化回收，最后将样品溶于EB Solution；
7)cDNA 3’末端加“A”：配制加“A”反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使末端修复的产物cDNA的3’末端加上A碱基；
8)cDNA 5’adapter的连接：配制接头连接反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使接头与A碱基连接，产物用磁珠进行纯化回收；
9)UNG消化cDNA二链：配制UNG消化反应体系，通过UNG酶消化掉双链DNA中的二链，并用磁珠对产物进行纯化回收；
10)PCR反应及产物回收：配制PCR反应体系，选择适当的PCR反应程序，对上步骤得到的产物进行扩增，对PCR产物进行磁珠纯化回收，回收产物溶于EB溶液中，贴上标签；
11)文库质量检测：使用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System对文库质量进行检测；
12)上机测序：检测合格的文库，加入NaOH变性成单链，按照预期上机数据量，稀释至一定的上机浓度。变性稀释后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交，在cBot上完成桥式PCR扩增，最后使用Illumina Hiseq x-ten平台进行测序。
4、生物信息学分析
利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位，通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，利用cuffdiff检测差异表达，采用meta分析中的inverse normal method对p值合并，当FDR值<0.01时，认为基因显著差异表达。
5、结果
测序结果显示，与健康人相比，TES和PPP1R18基因在阿尔茨海默患者中的表达量显著增加。
实施例2QPCR测序验证基因的差异表达
1、按照实施例1的收集方式收集31例阿尔茨海默患者的血液样本以及24例健康人的血液样本进行QPCR验证。
2、RNA提取
使用Takara RNA提取试剂盒提取血液中的RNA，具体步骤参见实施例1。
3、QPCR
1)引物的设计
根据TES、PPP1R18和GADPH的基因序列设计引物，引物序列如下所示。
TES基因：
SEQ ID NO.1(正向引物)：5’-TTGAGCAATGAAGAGGAT-3’
SEQ ID NO.2(反向引物)：5’-GTAACTGTATTGATGGAGAC-3’；
PPP1R18基因：
SEQ ID NO.3(正向引物)：5’-CAGGAACAGAGTTTGGTA-3’
SEQ ID NO.4(反向引物)：5’-TCCGAGTAGTCTTGTCTT-3’；
GAPDH基因：
SEQ ID NO.5(正向引物)：5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’
SEQ ID NO.6(反向引物)：5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’
2)实时定量PCR
使用TaKaRa One Step TB GreenTM Prime ScriptTM RT-PCR试剂盒(CodeNo.RR066A)进行PCR反应，反应体系和反应条件如表1所示。
表1 QPCR反应体系和反应条件
Figure BDA0002482865330000111
在Thermal Cycler
Figure BDA0002482865330000112
Time System扩增仪上进行PCR扩增，反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和溶解曲线，ΔΔCT法进行相对定量。
4、ROC分析
对变量TES和PPP1R18使用SPSS进行ROC分析，判断基因的诊断效能、灵敏度和特异性。
5、结果
QPCR结果如图1所示，相比健康人，TES和PPP1R18在阿尔茨海默患者表达上调，TES上调约4.5倍，PPP1R18上调约5.3倍，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示TES或PPP1R18基因可作为基因标志物应用于阿尔茨海默的早期诊断，从而实现早发现，早干预。同时，通过TES和PPP1R18与阿尔茨海默之间的关系可以设计靶向TES和PPP1R18的siRNA、shRNA或其他试剂从而治疗阿尔茨海默。
ROC分析结果如表2所示，以TES和PPP1R18作为检测变量的AUC值分别为0.919和0.902，具有较高的曲线下面积，说明以TES和PPP1R18作为检测变量用于阿尔茨海默的诊断具有较高的效能。
表2 ROC分析结果
Figure BDA0002482865330000121
实施例3基因标志物的功能验证
1、细胞培养
使用含10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素的DMEM培养液中培养PC12细胞，在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养，以1:3比例传代，24小时后细胞进入对数生长期更换培养液，并根据实验要求给予不同的干预。
2、转染
2.1转染前细胞的处理
转染前一天，6孔培养板上种5×105个细胞/孔，在无抗生素培养基中培养一天，转染时细胞密度为60％，于转染前换成无血清培养基。
2.2基因过表达载体以及干扰RNA的设计与合成
由上海吉码制药技术有限公司设计并合成针对TES和PPP1R18的干扰RNA：siRNA-TES和siRNA-PPP1R18，对照为通用的siRNA-NC。siRNA-TES和siRNA-PPP1R18的序列如下：
siRNA-TES：
SEQ ID NO.7：5’-UUCUUUCAUACUCAGUUUGCA-3’
SEQ ID NO.8：5’-CAAACUGAGUAUGAAAGAAGG-3’；
siRNA-PPP1R18：
SEQ ID NO.9：5’-AGUUUGAGCCUCUAUGUCCCU-3’
SEQ ID NO.10：5’-GGACAUAGAGGCUCAAACUCA-3’；
实验分为三组：空白对照组，阴性对照组：转染siRNA-NC；实验组：转染siRNA-TES和siRNA-PPP1R18。使用Invitrogen公司的lipofectamine 2000进行转染，具体操作按照说明书进行。
2.3转染效果的检测
使用QPCR检测细胞中TES和PPP1R18的表达水平，按照实施例2的方式进行实时定量PCR检测。
3、CCK-8检测TES和PPP1R18对AD细胞的影响
收集对数期细胞，调整细胞浓度为5×104/ml，将细胞悬液100μL接种到96孔板中，置于37℃、5％CO2孵育过夜，每组设定五个复孔。将实验分为三组，空白对照组、模型组、实验组。对照组：细胞不进行任何处理；阴性对照组：转染siRNA-NC但是不进行药物处理；模型组：细胞只进行Aβ1-42处理；实验组：细胞转染siRNA-TES或siRNA-PPP1R18并进行Aβ1-42处理。药物处理48h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，37℃孵育4h，在酶标仪450nm波长下检测各孔的吸光度值(OD值)
4、统计学分析
所有数据采用graphpad软件进行处理，数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，组间差异使用配对样本t检验分析，p<0.05时表示差异具有统计学差异。
5、结果
以TES和PPP1R18在空白对照组的表达水平作为基准定为1，转染结果显示如表3所示，实验组的siRNA对TES或PPP1R18具有较好的沉默效果。
表3 TES和PPP1R18的相对表达量
Figure BDA0002482865330000131
Figure BDA0002482865330000141
注：P值是阴性对照组(实验组)vs空白对照组
CCK-8检测结果如表4所示，实验组(siRNA-TES，siRNA-PPP1R18)的OD值相对于模型组显著增加，说明TES和PPP1R18对神经细胞具有保护作用。
表4 OD值
Figure BDA0002482865330000142
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 聊城市第二人民医院
<120> 一种与阿尔茨海默相关的生物标志物及其应用
<150> 2019105401186
<151> 2019-06-21
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgagcaatg aagaggat 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtaactgtat tgatggagac 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caggaacaga gtttggta 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccgagtagt cttgtctt 18
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatcccatca ccatcttcca g 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagccccagc cttctccat 19
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uucuuucaua cucaguuugc a 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caaacugagu augaaagaag g 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aguuugagcc ucuauguccc u 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggacauagag gcucaaacuc a 21

Claims (11)

1.检测生物标志物TES基因RNA表达水平的试剂在制备诊断阿尔茨海默的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：特异性识别TES基因的寡核苷酸探针；或特异性扩增TES基因的引物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增TES基因的引物序列如SEQIDNO.1~2所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括核酸膜条、芯片或试剂盒。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述芯片包括基因芯片，其中基因芯片包括针对TES基因的寡核苷酸探针。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括基因检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括特异性针对TES基因的引物、寡核苷酸探针或芯片。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，特异性针对TES基因的引物序列如SEQIDNO.1~2所示。
8.TES的抑制剂在制备治疗阿尔茨海默的药物组合物中的应用，其中所述抑制剂为siRNA。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制剂降低TES的表达。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7~8所示。
11.根据权利要求8-10任一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
CN202010383293.1A 2019-06-21 2020-05-08 一种与阿尔茨海默相关的生物标志物及其应用 Expired - Fee Related CN111363808B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910540118.6A CN110144397A (zh) 2019-06-21 2019-06-21 一种与阿尔茨海默相关的生物标志物及其应用
CN2019105401186 2019-06-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111363808A CN111363808A (zh) 2020-07-03
CN111363808B true CN111363808B (zh) 2022-09-20

Family

ID=67596175

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910540118.6A Pending CN110144397A (zh) 2019-06-21 2019-06-21 一种与阿尔茨海默相关的生物标志物及其应用
CN202010383293.1A Expired - Fee Related CN111363808B (zh) 2019-06-21 2020-05-08 一种与阿尔茨海默相关的生物标志物及其应用

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910540118.6A Pending CN110144397A (zh) 2019-06-21 2019-06-21 一种与阿尔茨海默相关的生物标志物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN110144397A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018009727A1 (en) * 2016-07-06 2018-01-11 Brigham Young University Methods for diagnosing and treating alzheimer's disease
CN108624678A (zh) * 2018-06-26 2018-10-09 北京泱深生物信息技术有限公司 一种用于子痫前期诊治的生物标志物
CN109576362A (zh) * 2018-12-28 2019-04-05 北京泱深生物信息技术有限公司 阿尔茨海默诊治用标志物fam170a

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018009727A1 (en) * 2016-07-06 2018-01-11 Brigham Young University Methods for diagnosing and treating alzheimer's disease
CN108624678A (zh) * 2018-06-26 2018-10-09 北京泱深生物信息技术有限公司 一种用于子痫前期诊治的生物标志物
CN109576362A (zh) * 2018-12-28 2019-04-05 北京泱深生物信息技术有限公司 阿尔茨海默诊治用标志物fam170a

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Identification of learning-induced changes in protein networks in the hippocampi of a mouse model of Alzheimer’s disease;E Ferreira等;《Transl Psychiatry》;20160715;第1-7页 *
TES was epigenetically silenced and suppressed the epithelial-mesenchymal transition in breast cancer;Yang Yongbin等;《Tumour Biol》;20140815;摘要、第2-3页的材料方法、表3 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110144397A (zh) 2019-08-20
CN111363808A (zh) 2020-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2014210676B2 (en) Methods of Using miRNA for Detection of In Vivo Cell Death
US20110195848A1 (en) Gene expression and breast cancer
CN109576362B (zh) 阿尔茨海默诊治用标志物fam170a
EP2759602A1 (en) Non-invasive prenatal genetic diagnostic methods
CN108796065B (zh) Fam127a在妊娠疾病中的应用
CN112626207B (zh) 一种用于区分非侵袭性和侵袭性无功能垂体腺瘤的基因组合
CN111154865B (zh) 帕金森生物标志物及其在制备检测产品中的应用
CN106906290B (zh) Cdsn作为舌鳞癌的诊治靶标
CN111363808B (zh) 一种与阿尔茨海默相关的生物标志物及其应用
CN107583052B (zh) miR-6734-5p在制备Luminal型乳腺癌诊断工具中的应用
CN111979315A (zh) 环状tp63作为肺鳞癌诊断或治疗靶点的应用
CN110656169A (zh) 心房颤动的诊断标志物
CN111363809B (zh) 用于开发阿尔茨海默诊断产品的分子标志物
CN114959003A (zh) 急性心肌梗死标志物及其应用
CN111424096B (zh) 一种与胃腺癌发生发展相关的生物标志物
CN109182513B (zh) 生物标志物scfd2在阿尔茨海默诊治中的应用
CN108384858B (zh) 肺癌相关基因及其在肺癌诊治中的应用
CN111378743B (zh) 基因在阿尔茨海默诊断中的应用
WO2021119499A1 (en) Materials and methods for inflammatory molecular markers
CN107034270B (zh) Clic3作为肺腺癌的诊治靶标
CN109971854B (zh) 用于开发宫颈疾病的诊疗产品的靶分子
CN110592218B (zh) 一种诊治乳腺癌的生物标志物
LU500371B1 (en) Application of GAS5 in the diagnosis of severe asthma
CN110951867A (zh) 生物标志物及其在阿尔茨海默中的应用
CN114959002A (zh) 一种诊断急性心肌梗死的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20220920

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee