CN110257499A - 一种预测脑卒中易感性或预后风险的诊断系统或产品及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了ARHGEF7(Rho Guanine Nucleotide Exchange Factor 7,鸟苷酸交换因子7)基因单核苷酸多态位点在制备脑卒中易感性和预后风险的诊断系统或产品中的应用，所述ARHGEF7基因单核苷酸多态位点为rs3809340；进一步，本发明还公开了一种早期评估脑卒中风险的诊断试剂盒。本发明首次阐明了ARHGEF7多态位点rs3809340与女性出血性脑卒中患病风险及卒中后心血管疾病死亡风险的相关性，提供ARHGEF7基因多态位点作为预测女性脑卒中易感性以及脑卒中预后风险的生物标志物，提供所述标志物在脑卒中的预测，辅助诊断和治疗中的应用，还可用于脑卒中的新药研发。

Description

一种预测脑卒中易感性或预后风险的诊断系统或产品及其 应用

技术领域

本发明属于医学生物技术和基因诊断领域，是关于一种预测脑卒中易感性或预后风险的诊断系统或产品及其应用，更具体的说，是通过检测易感基因ARHGEF7(Rho GuanineNucleotide Exchange Factor 7，鸟苷酸交换因子7)单核苷酸多态位点rs3809340，预测女性受试者对于脑卒中的易感性以及预后风险，该方法可用于脑卒中预防、辅助诊断、治疗和新药开发。

背景技术

脑卒中是由于脑部血管突然破裂出血或因血管堵塞造成大脑缺血、缺氧而引起的一组脑血管疾病，包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中。临床表现以突发意识障碍或口眼歪斜、半身不遂、口齿不清、认知障碍为主要特征，有极高的病死率和致残率。根据最新“中国心脑血管病流行病学协作研究组”发表的数据，我国卒中患者中，缺血性脑卒中占62.4％，脑出血占27.5％，蛛网膜下腔出血占1.8％。随着我国人口老龄化和群众生活方式的改变，近年脑卒中发病率呈显著上升趋势。据流行病学调查资料显示：中国目前约有700万脑卒中患者，每年新发脑卒中200万人，每年死于脑卒中的患者约150万，平均每15秒钟就有一例新发脑中风患者，每21秒有一例因脑中风而死亡的患者。目前，脑卒中发病率仍以接近约每年9％的速度上升。与西方国家相比较，中国人群与西方人群脑卒中的病理类型构成有明显不同。西方以缺血性脑卒中为主(约占脑卒中的80％)，出血性脑卒中少见；而中国人群出血性脑卒中发病率较高，脑出血所占的比例为30％-40％。脑血管疾病以其高发病率、高复发率、高致残率、高死亡率以及越来越高的诊治费用，已成为严重影响我国国计民生的重要公共卫生问题，防治需求极其迫切。

脑卒中是一种多因素的复杂疾病，受多个基因之间以及多个基因与环境因素相互作用的影响。近年来，遗传学理论、研究手段和认识水平的不断进步和发展给疾病遗传学研究带来了新的思路和突破，因此，寻找、鉴定新的遗传生物标志物在脑卒中的预防、诊断和治疗中具有重要价值。

ARHGEF7(Rho Guanine Nucleotide Exchange Factor 7,鸟苷酸交换因子7)基因，又称为β-pix，位于人13号染色体13q34上，包括17个外显子，编码803个氨基酸，在脑组织和血管中高表达，具有促进血管内皮细胞的增殖、迁移、细胞与细胞间的黏连、细胞外基质重建及血管新生的作用，调控血管壁的稳定性、通透性和完整性，在血管发育、重构及成熟等过程中发挥着重要作用。在斑马鱼模式动物研究中发现，ARHGEF7基因突变或者缺失时，斑马鱼的胚胎发育过程受阻，导致血管发育不完全，血管缺失或者破裂，最终发生脑出血。因此，阐明ARHGEF7基因单核苷酸多态位点与脑卒中易感性的关系，有助于从分子遗传水平阐明脑卒中的发病机制，而且对脑卒中的预测、预防、治疗，遗传咨询等具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于阐明ARHGEF7基因单核苷酸多态位点rs3809340对脑卒中易感性和预后的影响，提供预测脑卒中患病风险和卒中后心血管疾病风险的生物学标志物；提供所述标志物在制备脑卒中易感性和预后风险的诊断产品中的应用。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

本发明是基于Sequenome MassASSAY分型系统，包含ARHGEF7基因单核苷酸多态位点rs3809340的PCR扩增引物和单碱基延伸引物，实现检测来自待测个体的样品中ARHGEF7多态位点rs3809340的基因分型，并用于制备评估脑卒中易感性以及预后风险的检测系统中的应用：ARHGEF7基因启动子区域的单核苷酸多态位点rs3809340与女性出血性脑卒中的患病风险以及卒中后心血管疾病的死亡风险显著相关。具有ARHGEF7rs3809340-A危险等位基因的待测女性个体，具有较高的出血性脑卒中患病风险，同时具有较高的脑卒中后心血管疾病死亡风险。进一步地，本发明通过构建单核苷酸多态位点rs3809340序列的荧光素酶重组质粒，检测rs3809340-A危险等位基因对ARHGEF7基因转录活性的影响。

首先，本发明提供了ARHGEF7基因单核苷酸多态位点在制备脑卒中易感性与脑卒中预后风险的诊断系统或产品中的应用，所述ARHGEF7基因单核苷酸多态位点为rs3809340。

优选的，所述脑卒中包括缺血性脑卒中、出血性脑卒中。

优选的，所述脑卒中为出血性脑卒中。

优选的，所述脑卒中为女性出血性脑卒中。

优选的，所述诊断系统通过测定受试者的ARHGEF7基因rs3809340位点的基因型，预测女性受试者脑卒中的易感性以及脑卒中的预后风险：rs3809340-A危险等位基因显著增加女性出血性脑卒中的患病风险以及卒中后心血管疾病死亡的风险。

进一步地，本发明提供了一种基因多态性位点早期评估脑卒中风险的诊断试剂盒，所述的试剂盒包括ARHGEF7基因rs3809340位点的特异性引物。

优选的，所述rs3809340位点的特异性引物序列如下：

上游引物F:5’-ACGTTGGATGTGAGTAACCCCTGATCGTTG-3’(SEQ ID NO:1)；

下游引物R:5’-ACGTTGGATGGAATAGTAACTGCGCTCTCC-3’(SEQ ID NO:2)；

延伸引物的核苷酸序列：5’-ccctCGCTCTCCATGAGCCT-3’(SEQ ID NO:3)。

优选的，所述的试剂盒是基于Sequenom MassASSAYR SNP技术用于检测待测者ARHGEF7多态位点rs3809340基因型的试剂盒，试剂盒由以下试剂组成：PCR混合缓冲液(PCRBuffer Mix)，PCR酶(PCR Enzyme),碱性磷酸酶酶，延伸酶(Extend Enzyme)，延伸混合缓冲液(Extend Buffer Mix)。

进一步地，本发明提供了ARHGEF7基因表达水平的检测试剂在制备脑卒中检测试剂中的应用。

优选的，所述ARHGEF7基因表达水平的检测试剂包括用于扩增ARHGEF7基因的引物对。优选的，所述引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO:8-9。

本发明首次阐明了ARHGEF7基因的单核苷酸多态位点rs3809340与女性出血性脑卒中的患病风险及脑卒中后的心血管疾病死亡风险相关；提供ARHGEF7多态位点rs3809340作为预测女性脑卒中易感性和脑卒中预后风险的生物标志物，提供所述标志物在脑卒中的预测，辅助诊断和治疗中的应用，还可用于脑卒中新药的研发。

本发明通过构建包含ARHGEF7单核苷酸多态位点rs3809340序列的荧光素酶重组质粒pGL3-rs3809340-T和pGL3-rs3809340-A，以及转录因子NFIC(nuclear factor I C,核因子)的真核表达载体重组质粒pcDNA3.1-NFIC，发现rs3809340-A危险等位基因通过增强ARHGEF7启动子序列与转录因子NFIC的结合作用，抑制ARHGEF7基因的转录活性和表达水平。

进一步，本发明提供ARHGEF7基因及单核苷酸多态位点rs3809340在制备预测脑卒中的患病风险或治疗脑卒中疾病的产品中应用。

本发明首次明确雌激素β-雌二醇(β-Estradiol)和雌激素受体拮抗剂氟维司群(Fulvestrant)对ARHGEF7基因表达水平的影响，发现ARHGEF7的表达水平受到雌激素的调控。

本发明通过检测ARHGEF7与脑卒中易感性以及脑卒中预后风险相关的单核苷酸多态位点rs3809340，不仅可以从分子遗传水平上阐明脑卒中的发病机制，而且对脑卒中的预测、预防、诊断、治疗，以及遗传咨询等具有重要的临床价值。

附图说明

图1.ARHGEF7基因单核苷酸多态位点rs3809340基因型的质谱峰图。基因型依次为TT,TA,AA，其中TT为rs3809340位点的非易感基因型，TA和AA为rs3809340位点的易感基因型。

图2.ARHGEF7基因单核苷酸多态rs3809340与脑卒中患病风险和脑卒中预后风险的相关性。(A)女性待测者中，具有rs3809340-A危险等位基因时，出血性脑卒中的患病风险增加1.89倍(OR＝1.89,95％CI 1.22-2.93,P＝0.004)；(B)女性脑卒中患者中，具有rs3809340-A危险等位基因时，卒中后发生心血管疾病死亡的风险增加1.86倍(HR＝1.86，95％CI 1.06-3.26,P＝0.03)。

图3.Kaplan-Meier生存概率分析。携带rs3809340-A危险等位基因的女性脑卒中患者，发生心血管疾病死亡的概率显著高于携带rs3809340-TT基因型的女性脑卒中患者(P＝0.03)。

图4.pGL3-rs3809340-T荧光素酶报告载体重组质粒的结构示意图。

图5.pGL3-rs3809340-A荧光素酶报告载体重组质粒的结构示意图。

图6.pcDNA3.1-NFIC真核表达载体重组质粒的结构示意图。

图7.ARHGEF7单核苷酸多态rs3809340-A危险等位基因对启动子区转录活性的影响。(A)rs3809340-A等位基因显著降低荧光素酶的表达活性约40％。*P<0.05,**P<0.01。(B)rs3809340-A等位基因通过增强ARHGEF7启动子区序列与转录因子NFIC(nuclearfactor I C,核因子)的结合作用，抑制该基因启动子区域的转录活性。*P<0.05,**P<0.01。

图8.转录因子NFIC对ARHGEF7基因表达的影响。(A)过表达转录因子NFIC后，ARHGEF7基因mRNA的表达水平显著降低约27％(P＝0.02)；(B)过表达转录因子NFIC，ARHGEF7蛋白水平显著降低约21％(P＝0.03)。*P<0.05,**P<0.01。

图9.雌激素和雌激素受体拮抗剂对ARHGEF7基因表达的影响。(A)雌激素β-雌二醇(β-Estradiol)显著抑制ARHGEF7基因的mRNA表达水平，约38％；(B)雌激素受体拮抗剂氟维司群(Fulvestrant)显著上调ARHGEF7基因的mRNA表达水平，约51％；(C)雌激素β-雌二醇(β-Estradiol)显著降低ARHGEF7的蛋白表达水平，约46％；(D)雌激素受体拮抗剂氟维司群(Fulvestrant)显著上调ARHGEF7的蛋白表达水平，约1.7倍。*P<0.05,**P<0.01。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

需要说明的是，受测者的生物样品可以是包括但不限于来自主体任意部位的生物样品，例如可以是组织型样本如头发、指甲以及骨组织、细胞组织等；也可以是液体型样本如血液、尿液、唾液、黏液以及精液等。

本发明涉及的统计学方法：

数值变量用均值±标准差表示，分类变量用百分数表示。对于正态分布的数值变量，采用单因素方差分析比较不同组间的差异；对于非正态分布的数值变量，采用Mann-Whitney非参数检验比较不同组间的差异；对于分类变量，采用卡方检验(Chi-squaretest)比较不同组间的差异。采用卡方检验进行单核苷酸多态位点与脑卒中的单位点关联分析。采用多元Logistic回归模型计算比值比(Odds ratio，ORs)和95％置信区间(Confidence interval，CI)，用于评估单核苷酸多态位点与脑卒中患病风险的相关性，并校正传统心脑血管疾病危险因素的影响，包括年龄、性别、体重指数、血压、血脂、血糖、是否吸烟、是否饮酒，以及高血压、冠心病和糖尿病史。采用多元Cox比例风险模型计算风险比(hazard ratio,HR)和95％置信区间，用于评估单核苷酸多态位点与脑卒中患者预后风险(包括脑卒中复发事件、心血管疾病死亡和全因死亡)的相关性，并校正传统心脑血管疾病危险因素的影响，包括年龄、性别、体重指数、血压、血脂、血糖、是否吸烟、是否饮酒，以及高血压、冠心病和糖尿病史。采用Kaplan-Meier生存分析法绘制单核苷酸多态位点与脑卒中患者发生心血管疾病死亡风险的生存曲线。数据分析软件为SPSS Statistics 20.0(SPSSInc，Chicago，USA)，P<0.05为差异有统计学意义。

实施例1检测ARHGEF7基因单核苷酸多态位点与脑卒中易感性及预后风险的关系

1、脑卒中患者队列

本发明包括脑卒中患者1669例和正常对照人群1758例，来自于全国7个临床中心：北京天坛医院、西安交通大学第一医院、华中科技大学同济医院、华中科技大学协和医院、重庆市大坪高血压病研究所、兖州矿业三十七处医院、天津市胸科医院。入组时间为2000年11月到2001年11月。所有受试者均为汉族，且自愿签署知情同意书，这一研究得到伦理委员会批准。脑卒中患者包括3个亚型：动脉粥样硬化性脑梗死740例(44.3％)，腔隙性脑梗死488例(29.2％)，脑出血患者441例(26.4％)。脑卒中病例中男性占1043例(62.7％)，女性占626例(37.3％)。正常对照组：男性1004例(57.1％)，女性754例(42.9％)。

我们对脑卒中患者进行了长期随访，截止时间为2006年5月31日。随访终点事件主要包括脑卒中复发事件、心脑血管疾病事件、心脑血管疾病死亡及全因死亡。由于移民等原因，85例(5.1％)患者失访。有1584例患者被随访，其中男性患者为998例(63.0％)，女性患者为586例(37.0％)。随访时间平均为4.5年(0.1-6.0年)。随访期间，脑卒中复发事件312例(19.7％)，心脑血管事件为325例(20.5％)，总死亡患者292例(18.4％)，其中146例(9.2％)为心脑血管疾病相关的死亡，115例(7.3％)为其他原因死亡。

2、基因组DNA的提取

所有受试者均静脉采集外周血。脑卒中患者发病28天后，静脉采集过夜禁食12小时的外周血。正常对照组人群进行静脉采集过夜禁食12小时的的外周血。静脉采集的外周血4mL，迅速转入EDTA抗凝管中，颠倒1-2次混匀；小型台式离心机，2500rpm条件下离心10分钟(要求：室温条件下1小时或4℃条件下2小时内进行离心)，吸取1mL上清(血浆)分装于洁净的Eppendorf管，于-80℃保存备用，用于检测患者的生化指标。

沉淀物(白细胞)用于制备人外周血基因组DNA(Cat.#CW0544S,康为世纪生物科技有限公司，北京，中国)。具体方法如下：

(1)沉淀物(白细胞)与FG1(FlexGene 1)裂解液混合，充分上下颠倒混匀；离心机3500rpm，室温离心5～10分钟，弃上清。

(2)将蛋白酶K与FG2(FlexGene 2)裂解液按1:100混匀，配制成1％蛋白酶K溶液；在含有血球沉淀物的10ml离心管中加入0.5ml蛋白酶K溶液，并立即涡旋振荡至无团块。放入65℃水浴锅加热至溶液变绿，约1-5分钟。冷却至室温，加等体积异丙醇，颠倒至DNA白色絮状沉淀析出，用70％乙醇洗涤该沉淀。

(3)挑出DNA沉淀于新的1.5ml Eppendorf管，加入70％乙醇洗涤该沉淀；离心机12000rpm，室温条件下离心5分钟，弃上清，晾干。

(4)加入100-300μl TE(Tris-EDTA)溶液溶解DNA，用力吹打，必要时于55℃条件下加热30分钟。待DNA完全溶解，测浓度。

3、检测ARHGEF7基因单核苷酸多态位点的基因型

3.1引物设计：

ARHGEF7基因的单核苷酸多态位点rs3809340位于13号染色体核苷酸序列第111153178位，该位置的碱基T可能转变为A，影响该基因的转录和表达水平。PCR扩增反应的特异性引物组为：上游引物F:5’-ACGTTGGATGTGAGTAACCCCTGATCGTTG-3’(SEQ ID NO:1)，下游引物R:5’-ACGTTGGATGGAATAGTAACTGCGCTCTCC-3’(SEQ ID NO:2)，延伸引物的核苷酸序列：5’-ccctCGCTCTCCATGAGCCT-3’(SEQ ID NO:3)。

3.2PCR扩增反应：

发明人检测待测者ARHGEF7单核苷酸多态位点rs3809340的基因型，采用PCR扩增反应，使用引物如SEQ ID NO:1-3所示。

反应体系为5μl，包括1.8μl无酶水，0.5μl 10xPCR Buffer，0.4μl MgCL₂(25mM)，0.1μl dNTP Mix(25mM)，1μl Primer Mix(0.5μM),0.2μl HotStar Taq酶(5U/μl)(Cat.#10142，Agena Bioscience，CA，USA),1μl DNA模板(10ng/uL)。配制总反应体系，384孔板，每孔加入5μl，应用Veriti-384孔梯度PCR仪(Thermo Fisher Scientific，PA，USA)进行检测。

反应条件：(1)94℃15分钟；(2)94℃20秒；(3)56℃30秒；(4)72℃1分钟；步骤(2)-(4)共45个循环；(5)72℃3分钟；(6)4℃，结束。

3.3碱性磷酸酶消化反应(Shrimp alkaline phosphatase,SAP)：

PCR扩增反应结束后，应用Veriti-384孔梯度PCR仪，继续将每孔PCR扩增产物用SAP进行消化。每孔加入SAP处理反应液SAP Mix 2μl，其中包括1.53μl无酶水，0.17μl SAPBuffer(10x)，0.3μl SAP Enzyme(1.7U/μl)(Cat.#10142，Agena Bioscience，CA，USA)。

反应条件：37℃40分钟,85℃5分钟,4℃，结束。

3.4单碱基延伸反应：

以消化后的PCR扩增产物为模板，应用Veriti-384孔梯度PCR仪，继续进行单碱基延伸反应。每孔加入EXTEND Mix反应体系为2μl,包括：0.2μl iplex Termination,0.94μliplex延伸引物,0.2μl iplex Buffer，0.041μl iplex Enzyme(Cat.#10142，AgenaBioscience，CA，USA)，0.619μl无酶水。

反应条件：(1)94℃30s；(2)94℃5s；(3)80℃5s，5个内部循环；步骤(2)-(3)共40个外部循环；(4)72℃3分钟；(5)4℃，结束。

3.5树脂纯化，芯片点样和MALDI-TOF质谱分析：

采用树脂(Cat:#10142，Agena Bioscience，CA，USA)纯化步骤3.4获得的PCR扩增延伸产物，继而在384-well Spectrobioarray芯片(Cat:10142Agena Bioscience,CA,USA)上进行点样，利用MALDI-TOF MassARRAY Analyzer 4.0质谱仪(AgenaBioscience，CA，USA)上进行基因型检测。检测结果用TYPER 4.0软件分析基因型并输出结果。

图1为ARHGEF7基因单核苷酸多态位点rs3809340的基因型质谱峰图。基因型依次为TT,TA,AA，其中TT为rs3809340位点的非易感基因型，TA和AA为rs3809340位点的易感基因型。

4、ARHGEF7基因单核苷酸多态与脑卒中易感性和预后风险的分析

发明人采用多元Logistic回归模型计算ORs和95％CI，用于评估单核苷酸多态位点与脑卒中患病风险的相关性，并校正传统心脑血管疾病危险因素的影响。采用多元Cox比例风险模型计算HR和95％CI，用于评估单核苷酸多态位点与脑卒中复发事件、心血管疾病死亡和全因死亡的相关性，并校正传统心脑血管疾病危险因素的影响。校正因素包括年龄、性别、体重指数、血压、血脂、血糖、是否吸烟、是否饮酒，以及高血压、冠心病和糖尿病史。采用Kaplan-Meier生存概率分析法绘制单核苷酸多态位点与脑卒中预后心血管死亡的生存曲线。结果如图2和图3所示。

图2显示ARHGEF7基因单核苷酸多态rs3809340与脑卒中患病风险和脑卒中预后风险的相关性。(A)女性待测者中，具有rs3809340-A危险等位基因时，出血性脑卒中的患病风险增加1.89倍(OR＝1.89,95％CI 1.22-2.93,P＝0.004)；(B)女性脑卒中患者中，具有rs3809340-A危险等位基因时，脑卒中后发生心血管疾病死亡的风险增加1.86倍(HR＝1.86，95％CI 1.06-3.26,P＝0.03)。

图3显示Kaplan-Meier生存概率分析。携带rs3809340-A危险等位基因的女性脑卒中患者，发生心血管疾病死亡的概率显著高于携带rs3809340-TT基因型的女性脑卒中患者(P＝0.03)。

实施例2检测单核苷酸多态位点对ARHGEF7基因启动子区转录活性的影响

发明人根据生物信息学分析，发现ARHGEF7单核苷酸多态rs3809340所在的序列是转录因子NFIC的结合位点。在本实施例中，发明人构建含有rs3809340序列的荧光素酶报告载体重组质粒(pGL3-rs3809340-T和pGL3-rs3809340-A)，并构建含有转录因子NFIC序列的真核表达重组质粒(pcDNA3.1-NFIC)，转染人脐静脉内皮细胞系，检测荧光素酶活性，阐明rs3809340-A危险等位基因对ARHGEF7基因启动子转录活性的影响。

1、构建含有rs3809340序列的荧光素酶报告载体重组质粒

1.1PCR扩增反应：

根据ARHGEF7(GenBank accession No.NC_000013.11)单核苷酸多态位点rs3809340的序列特征，设计引物，以具有rs3809340-TT或rs3809340-AA基因型的受测者DNA为模板进行PCR扩增反应，扩增ARHGEF7基因的启动子区，长度为666bp。所述引物：

上游引物F:5'-GGCCGGTACCACATTGCACCTTAATCCCAACAT-3'(SEQ ID NO:4)；

下游引物R:5’-GAAAAGCTTCCAACCCGCTCAGCCGCTGCTT-3’(SEQ ID NO:5)。

每个反应体系为50μl，包括10μl 5×Prime Start Buffer,2.0μl上游引物(5pmol/L),2.0μl下游引物(5pmol/L),4.0μl dNTP(10mmol/L),0.5μl PrimerHS聚合酶(2.5U/μl)(Cat.#R010A,宝生物工程(大连)有限公司,大连，中国),5.0μl受测者DNA模板(10ng/μl)，去离子水26.5μl。

反应条件：(1)94℃5分钟,(2)94℃30秒；(3)55℃15秒；(4)72℃15秒；步骤(2)-(4)共30个循环；(5)72℃5分钟；(6)4℃，结束。

1.2PCR扩增产物的纯化：

采用1％琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为电压120V，时间40分钟，富集目的DNA片段，然后使用DNA回收试剂盒(Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit ver 4.0，Cat.#9762，宝生物工程(大连)有限公司，大连，中国)回收PCR扩增产物，并进行浓度测定，4℃保存备用。

1.3PCR扩增产物与荧光素酶报告载体进行双酶切反应以及酶切产物的纯化

PCR扩增产物的酶切反应体系为50μl,包括1μl限制性内切酶KpnI(20U/μl)(Cat.#R3142S，New England Biolabs，MA,USA),1μl限制性内切酶HindIII(20U/μl)(Cat.#R3104S，New England Biolabs，MA，USA),5μl 10×Buffer,30μl PCR扩增产物(70ng/μl)(来自1.2步骤)，去离子水13μl。酶切反应条件为：37℃，4小时。

荧光素酶报告载体的酶切反应体系为50μl，包括1μl限制性内切酶KpnI(20U/μl)(Cat.#R3142S,New England Biolabs，MA，USA)，1μl限制性内切酶HindIII(20U/μl)(Cat.#R3104S,New England Biolabs，MA，USA)，5μl 10×Buffer,1μl pGL3-Basic载体(2.0ug/μl)(Cat.#E1751，Promega，WI，USA)，去离子水41μl。酶切反应的条件为：37℃，4小时。

酶切反应后，采用1％琼脂糖凝胶进行电泳，富集目的DNA片段及pGL3-Basic载体，使用DNA回收试剂盒(Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0，Cat.#9672,宝生物工程(大连)有限公司,大连，中国)回收、纯化，获得纯化后的目的DNA片段和pGL3-Basic载体，进行浓度测定。

1.4连接反应：

用DNA连接试剂盒(DNA Ligation Kit Ver.2.1，Cat.#6022,宝生物工程(大连)有限公司，大连，中国)连接步骤1.3获得的目的DNA片段和pGL3-Basic载体。反应体系为20μl，包括1.0μl T4DNA连接酶(20U/μl，Cat.#2011A,宝生物工程(大连)有限公司,大连，中国)，2.0μl 10×Buffer,1.0μl pGL3-Basic载体(80ng/μl),10μl目的DNA片段(60ng/μl)，去离子水6μl。反应条件：16℃40分钟,室温5分钟。

1.5热休克法转化大肠杆菌DH5α：

配制Luria-Bertani(LB)液体培养基，用于培养扩增含有外源基因质粒的大肠杆菌DH5α。液体LB培养基的配制(1L)：称取10g胰蛋白胨(Tryptone，Cat.#LP0042，ThermoFisher Scientific，MA，USA)，5g酵母提取物(Yeast extract，Cat.#LP0021,ThermoFisher Scientific，MA，USA)，10g氯化钠(NaCl，Cat.#10019318,国药集团化学试剂有限公司,北京，中国)，置于三角瓶，加去离子水950ml，搅拌溶解，用5mol/L氢氧化钠(NaOH，Cat.#10019718,国药集团化学试剂有限公司,北京，中国)调pH至7.0，最后用去离子水定容至1L。采用高压蒸汽灭菌，121℃，30分钟。冷却至室温，置于4℃备用。

配制LB固体培养基，用于倒平板、涂菌、挑取质粒转化的阳性菌落，目的是筛选质粒转化成功的大肠杆菌。

固体LB培养基的配制：100ml LB液体培养基加入1～1.5g琼脂粉(Cat.#B2064,Sigma-Aldrich，CA，USA)。高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置于55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时(手可触摸)加入100μl氨苄抗生素(100mg/ml)(Cat.#A8180，北京索莱宝科技有限公司，北京，中国))，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。倒板：在温度降下前倒于10cm无菌细胞培养皿(Cat.#430167，Corning Incorporated，NY，USA)。一般10～15ml倒1个板子。紫外线下照10～15分钟,用封口胶封边，倒置，于4℃冰箱保存，一个月内使用。

在1.5ml Eppendorf管中，加入5μl连接产物(来自步骤1.4)以及50μl DH5α感受态细胞中(Cat.#CB101-03，天根生化科技有限公司，北京，中国)，轻混，冰上放置30分钟。混合物置于42℃水浴中进行热休克60秒，再迅速置于冰中冷却2分钟；接着，加入500μl LB液体培养基混匀，至于摇床上，于37℃、150rpm条件下，培养40分钟。取200μl菌液，均匀涂在含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养16小时，观察单克隆菌落生长情况。

1.6单克隆重组质粒的提取与鉴定：

使用质粒纯化试剂盒TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0(Cat.#9760,宝生物工程(大连)有限公司,大连，中国)提取、纯化步骤1.5中获得的单克隆重组质粒。采用测序法鉴定单克隆质粒是否含有目的DNA片段(步骤1.3)。测序鉴定后，采用无内毒素质粒提取试剂盒QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi Kit(Cat.#12362,QIAGEN，Germany)进一步提取、纯化步骤1.5中获得的单克隆重组质粒。

重组质粒1(pGL3-rs3809340-T)表示将含有ARHGEF7基因多态rs3809340-T的启动子区序列正确插入pGL3-Basic荧光素酶报告载体的重组质粒(图4)；

重组质粒2(pGL3-rs3809340-A)表示将含有ARHGEF7基因多态rs3809340-A的启动子区序列正确插入pGL3-Basic荧光素酶报告载体的重组质粒(图5)。

2、构建含有转录因子NFIC序列的真核表达重组质粒

2.1 PCR扩增反应：

根据转录因子NFIC(GenBank accession No.NM_005597.3)的序列特征，设计引物，以HUVECs cDNA(10ng/μl)为模板进行PCR扩增反应，扩增产物长度为1291bp。所述引物：

上游引物F：5’-GATGGAATTCGGATGTATTCGTCCCCGCTCT-3’(SEQ ID NO:6)；

下游引物R：5’-GGAACTCGAGCTTTGCTATCCCAGATACCAGG-3’(SEQ ID NO:7)。

每个反应体系为50μl，包括10μl 5×Prime Start Buffer，2.0μl上游引物(5pmol/L)，2.0μl下游引物(5pmol/L)，4.0μl dNTP(10mmol/L)，0.5μl PrimeHS聚合酶(2.5U/μl)(Cat.#R010A,宝生物工程(大连)有限公司,大连，中国)，5.0μl HUVECs cDNA模板(10ng/μl)，去离子水26.5μl。反应条件：(1)94℃5分钟；(2)94℃30秒；(3)55℃15秒；(4)72℃15秒；步骤(2)-(4)共30个循环；(5)72℃5分钟；(6)4℃，结束。

2.2 PCR扩增产物的纯化：

方法同步骤1.2。

2.3 PCR扩增产物与真核表达载体pcDNA3.1进行双酶切反应以及酶切产物的纯化：

PCR扩增产物的酶切反应体系为50μl,包括1μl限制性内切酶EcoRI(20U/μl)(Cat.#R3101V,New England Biolabs,MA，USA)，1μl限制性内切酶XhoI(20U/μl)(Cat.#R0146V,New England Biolabs,MA，USA)，5μl 10×Buffer,30μl PCR扩增产物(80ng/μl)(来自步骤2.2)，去离子水13μl。酶切反应的条件为：37℃，4小时。

真核表达载体的酶切反应体系为50μl，包括1μl限制性内切酶EcoRI(20U/μl)(Cat.#R3101V，New England Biolabs，MA，USA)，1μl限制性内切酶XhoI(20U/μl)(Cat.#R0146V，New England Biolabs，MA，USA)，5μl 10×Buffer，1μl pcDNA3.1真核表达载体(2.0μg/μl)(Cat.#79020,Thermo Fisher Scientific，MA，USA)，去离子水41μl。酶切反应的条件为：37℃，4小时。

酶切反应后，采用1％琼脂糖凝胶进行电泳，富集目的DNA片段NFIC以及pcDNA3.1载体，使用DNA回收试剂盒DNA回收试剂盒Takara MiniBEST Agarose Gel DNA ExtractionKit Ver 4.0(Cat.#9672,宝生物工程(大连)有限公司,大连，中国)回收、纯化，获得纯化后的目的DNA片段NFIC和pcDNA3.1载体，进行浓度测定。

2.4连接反应：

采用DNA连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver.2.1(Cat.#6022,宝生物工程(大连)有限公司,大连，中国)连接步骤2.3获得的目的DNA片段NFIC和pcDNA3.1载体。

反应体系为20μl，包括1.0μl T4DNA连接酶(2.5U/μl，Cat.#2011A,宝生物工程(大连)有限公司,大连，中国)，2.0μl 10×Buffer,0.5μl pcDNA3.1载体(2μg/μl)，10μl目的DNA片段(60ng/μl)，去离子水6.5μl。反应条件：16℃40分钟，室温放置5分钟。

2.5热休克法转化大肠杆菌DH5α：

方法同步骤1.5。

2.6单克隆重组质粒的提取与鉴定：

方法同步骤1.6。

重组质粒3(pcDNA3.1-NFIC)表示将转录因子NFIC正确插入真核表达载体(pcDNA3.1)中的重组质粒(图6)。

3、培养脐静脉内皮细胞

本实施例中，采用脐静脉内皮细胞系(Human umbilical vein endothelialcell，HUVECs)(Cat.#6100，China Infrastructure of Cell Line Resources，北京，中国)进行荧光素酶活性检测。细胞培养基：ECM培养基(Endothelial Cell Medium，Cat.#1001，ScienCell，CA，USA)，并加入5％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)(Cat.#1099-141C，Invitrogen，CA，USA)以及1％青霉素(10000U/ml)/链霉素(10mg/ml)(Cat.#0503，ScienCell，CA，USA)。

4、检测荧光素酶活性分析rs3809340对ARHGEF7基因启动子区转录水平的影响

4.1野生型或突变型rs3809340重组质粒转染HUVECs：

(1)培养HUVECs细胞成长稳定后，按照每孔1.2×10⁴个细胞的密度种于96孔细胞培养板(Cat.#3596，Corning Incorporated，NY，USA)，每孔加入细胞培养基的体积为100μl。每个实验分组设置8个复孔。培养12小时后，待细胞融合度达到70-80％时，换液，加入50μl ECM培养基(含5％FBS)，转染重组质粒pGL3-rs3809340-T和pGL3-rs3809340-A(步骤1.6获得)。

(2)实验分组：空白对照载体pGL3-basic；阳性对照载体pGL3-control；野生基因型重组质粒pGL3-rs3809340-T；突变基因型重组质粒pGL3-rs3809340-A。

(3)转染体系：每孔转染试剂包括A液与B液，

A液：25μl OPTI-MEM培养基(Cat.#31985-070，Invitrogen，CA，USA)+0.25μlLipofectamine 3000^TMReagent转染试剂(Cat.#L3000015，Invitrogen，CA，USA)；

B液：25μl OPTI-MEM培养基+1μl(20ng/μl)上述实验分组描述的质粒以及1μl海肾荧光素酶报告载体(1ng/μl)(Cat.#E2241，Promega，WI，USA)。

A液与B液等体积混合为50μl，室温静置5分钟，然后加入HUVECs中，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养48小时。收集细胞，用于检测荧光素酶活性。

4.2野生型或突变型rs3809340重组质粒与转录因子NFIC重组表达质粒共转染HUVECs：

(1)培养HUVECs细胞成长稳定后，按照每孔1.2×10⁴个细胞的密度种于96孔细胞培养板，每孔加入细胞培养基的体积为100μl。每个实验分组均为8个复孔。培养12小时后，待细胞融合度达到70-80％时，换液，加入50μl ECM培养基(含5％FBS)，转染重组质粒pGL3-rs3809340-T和pGL3-rs3809340-A(步骤1.6获得)以及pcDNA3.1-NFIC(步骤2.6获得)。

(2)实验分组包括：

空白对照组:pGL3-basic；

阳性对照组:pGL3-control；

实验组-1:pGL3-rs3809340-T和pcDNA3.1共转染；

实验组-2：pGL3-rs3809340-A和pcDNA3.1共转染；

实验组-3:pGL3-rs3809340-T和pcDNA3.1-NFIC共转染；

实验组-4：pGL3-rs3809340-A和pcDNA3.1-NFIC共转染；

(3)转染体系：每孔转染试剂包括A液与B液，

A+B等体积混合，室温静置5分钟，每孔加入50μl混合物。

A液：25μl OPTI-MEM培养基(Cat.#31985-070，Invitrogen，CA，USA)+0.25μlLipofectamine 3000^TMReagent转染试剂(Cat.#L3000015，Invitrogen，CA，USA)；

B液：25μl OPTI-MEM培养基+1μl(20ng/μl)上述实验分组的质粒以及1μl海肾荧光素酶报告载体(1ng/μl)(Cat.#E2241，Promega，WI，USA)。

A液与B液等体积混合为50μl，室温静置5分钟，然后加入HUVECs中，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养48小时。收集细胞，用于检测荧光素酶活性。

4.3检测荧光素酶活性：

使用双萤光素酶报告基因检测系统(Dual-Reporter Assay System(Cat.#E1910,Promega,WI,USA)检测萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性，分析单核苷酸多态位点对ARHGEF7基因启动子区转录活性的影响。检测仪器为Infinite M200Pro多功能酶标仪(Tecan，Zurich，Switzerland)。以海肾荧光素酶活性作为内参，计算相对荧光素酶活性(Relative luciferase activity，RLU)，RLU＝(重组质粒荧光素酶活性-空白对照载体荧光素酶活性)/(海肾荧光素酶活性-空白对照载体荧光素酶活性)。

4.4实验结果分析：

与rs3809340-T比较，rs3809340-A危险等位基因显著降低荧光素酶的表达活性约40％(P＝0.001)，提示rs3809340-A抑制ARHGEF7基因启动子区转录活性(图7A)。进一步的共转染实验，结果表明rs3809340-A危险等位基因通过增强ARHGEF7启动子区序列与转录因子NFIC的结合作用，抑制ARHGEF7基因启动子区的转录活性(图7B)。

实施例3转录因子NFIC对ARHGEF7基因表达的影响

1、培养脐静脉内皮细胞系(HUVECs)

培养方法见实施例2。培养细胞成长稳定后，按照每孔2.5×10⁵个细胞的密度种于12孔细胞培养板(Cat.#3513，Corning Incorporated，Corning，NY，USA)，加入细胞培养基的体积为1ml。每个实验分组设置3个复孔。培养12小时后，待细胞融合度达到70-80％时，换液，加入800μl ECM培养基(含5％FBS)，转染重组质粒pcDNA3.1-NFIC(步骤2.6获得)。

实验分组：阴性对照pcDNA3.1空白载体，以及pcDNA3.1-NFIC重组质粒。

2、转染体系

转染体系：每孔转染试剂包括A液与B液，

A+B等体积混合，室温静置5分钟，每孔加入50μl混合物。

A液：100μl OPTI-MEM培养基(Cat.#31985-070，Invitrogen，CA，USA)+2μlLipofectamine 3000^TMReagent转染试剂(Cat.#L3000015，Invitrogen，CA，USA)；

B液：100μl OPTI-MEM培养基+1.5μl pcDNA3.1-NFIC质粒(1.0μg/μl)。

A液与B液等体积混合为200μl，室温静置5分钟，然后加入HUVECs中，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养，12小时后换液，加入ECM培养基(含5％FBS和1％青霉素/链霉素)。继续培养48小时后，收集细胞，提取细胞的总RNA和总蛋白，分别检测ARHGEF7基因的mRNA表达和蛋白表达水平。

3、检测ARHGEF7基因的mRNA表达水平

3.1提取HUVECs细胞的总RNA：

采用TRIzol试剂(Cat.#15596-026，Invitrogen，CA，USA)提取HUVECs细胞的总RNA。

(1)均化样本：12孔板中的HUVECs细胞，用PBS洗两次；每孔加1.0ml TRIzol试剂，用移液器吹打，分别移入无RNA酶的1.5ml Eppendorf管中，室温静置5分钟；

(2)相的分离：每管加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置3分钟，12,000g、4℃离心30分钟；将上层水相转移至新的1.5ml Eppendorf管中，注意吸取时不要将中间层及下层有机相吸出；

(3)RNA沉淀：加入500μl异丙醇，颠倒混匀，室温静置10分钟；12,000g、4℃离心10分钟，弃上清；

(4)RNA洗涤：用DEPC(Diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理的去离子水配制75％乙醇，洗涤RNA，然后12,000g、4℃离心5分钟，弃液体，干燥RNA5～10分钟；

(5)RNA重悬：用30～40μl不含RNA酶的去离子水吹打RNA 2～3次，使其重悬；

(6)总RNA浓度测定：取2μl上述提取的总RNA，以DEPC处理的去离子水为空白对照，使用NanoDrop 2000超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific,MA,USA)测定总RNA浓度。

3.2总RNA逆转录为cDNA：

采用反转录试剂盒PrimeScript Reverse Transcriptase assay(Cat.#RR036A，宝生物工程(大连)有限公司,大连，中国)将总RNA逆转录成cDNA。反应体系为20μl，包括4μl5×PrimeScript mix，1μg总RNA(步骤3.1获得)，DEPC水补至20μl。反应条件：37℃20分钟(反转录反应)，85℃5秒(反转录反应的失活反应)。最后，用去离子水以1：10的比例稀释cDNA，于-20℃保存。

3.3采用实时荧光定量PCR方法检测ARHGEF7基因的mRNA表达水平：

(1)特异性扩增引物如下：

ARHGEF7：上游引物5’-GAAGCCTGTGTCTCCCAAATCA-3’(SEQ ID NO:8),

下游引物5’-GCCGTAGGTACGTTGAAAGCAC-3’(SEQ ID NO:9)；

GAPDH：上游引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3’(SEQ ID NO:10),

下游引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(SEQ ID NO:11)。

(2)采用ABI ViiA7Realtime PCR扩增仪384孔板模块(Applied Biosystems，CA，USA)检测基因表达水平。每孔的反应体系为10μl：包括1.0μl上游引物(5pmol/L)，1.0μl下游引物(5pmol/L)，5.0μl 2×SYBR Green qPCR Mix(Cat.#11202ES08，上海翊圣生物科技有限公司，上海，中国)，3.0μl cDNA模板(10ng/μl，步骤3.2获得)。每个样本设置3个复孔。

反应条件：(1)94℃3分钟；(2)94℃15秒；(3)56℃1分钟；步骤(2)-(3)共40个循环；(4)72℃10分钟；(5)4℃，结束。

(3)结果分析：以GAPDH为内参基因，ΔΔCt(Cycle threshold，循环阈值)法计算ARHGEF7基因的相对表达量，方法如下所述：

首先，对所有的受测样本和校准样本，用内参基因的Ct值归一目标基因的Ct值：

ΔCt(ARHGEF7)＝Ct(ARHGEF7)–Ct(GAPDH)

其次，用校准样本的ΔCt(ARHGEF7)归一受测样本的ΔCt(ARHGEF7)值：

ΔΔCt＝受测样本ΔCt(ARHGEF7)-校准样本ΔCt(ARHGEF7)

最后，计算ARHGEF7基因的相对表达水平：2^-ΔΔCt。

实验结果显示：过表达转录因子NFIC后，ARHGEF7基因mRNA的表达水平显著降低约27％(P＝0.02)(图8A)。

4、检测ARHGEF7基因的蛋白表达水平

4.1提取HUVECs细胞的总蛋白：

(1)配制蛋白裂解液：每10ml RIPA裂解液(Cat.#P0013B，上海碧云天生物技术有限公司，上海，中国)加入1粒蛋白酶抑制剂(Cat.#04693159001，Roche，Mannheim，Germany)。

(2)提取细胞蛋白：12孔细胞培养板，每孔加入100μl上述细胞裂解液，放置于冰上，裂解15分钟。4℃，8,000～10,000rpm离心5分钟，取上清。

(3)测定细胞蛋白浓度：使用BCA蛋白定量试剂盒(Pierce BCA Protein AssayKit，Cat.#23227，Invitrogen，CA，USA)测定上述提取的细胞总蛋白浓度，并将蛋白浓度调至10μg/μl。取40μl，加入10μl 5×Loading Buffer(Cat.#P0015,上海碧云天生物技术有限公司，上海，中国)，100℃煮沸5分钟,放置于-20℃保存。

4.2采用Western Blot方法检测ARHGEF7基因的蛋白表达水平：

(1)配制10％SDS-PAGE凝胶(Dodecyl Sulfate,Sodium Salt[SDS]-Polyacrylamide Gel Electrophoresis[PAGE]，十二烷基硫酸酯钠盐-聚丙烯酰胺凝胶)：包括10％分离胶和5％浓缩胶。

10％分离胶，包括4.1ml去离子水，3.3ml 30％Acr-Bis(29:1)(Acrylamide-Bisacrylamide，丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液，其中acrylamide和bisacrylamide的比例为29:1)(Cat.#A1010，北京索莱宝科技有限公司，北京，中国)，2.5ml分离胶缓冲液(Cat.#B1004，北京普利莱基因技术有限公司，北京，中国)，100μl 10％过硫酸胺(Cat.#A3678，Sigma-Aldrich，CA，USA)，4.0μl TEMED(N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine，N,N,N',N'-四甲基乙二胺)(Cat.#ST728，上海碧云天生物技术有限公司，上海，中国)。

5％浓缩胶，包括2.87ml去离子水，0.83ml 30％Acr-Bis(29:1)(Cat.#A1010，北京索莱宝科技有限公司，北京，中国)，1.25ml浓缩胶缓冲液(PH6.8，含0.4％SDS)(Cat.#B1003，北京普利莱基因技术有限公司，北京，中国)，50μl 10％过硫酸胺(Cat.#A3678，Sigma-Aldrich，CA，USA)，5.0μl TEMED(Cat.#ST728，上海碧云天生物技术有限公司，上海，中国)。

(2)凝胶电泳分离ARHGEF7：将上述配制的10％SDS-PAGE凝胶，置入1×电泳液(Cat.#B1005,北京普利莱基因技术有限公司,北京，中国)，每个泳道加入5μl上述提取的蛋白溶液(10μg/μl)。连接DYY-6C电泳仪(北京六一生物科技有限公司，北京，中国)，在80V电压条件下电泳40分钟，然后将电压调至120V，继续电泳45分钟。

(3)硝酸纤维素膜转移：电泳结束后，在300mA条件下进行电转移，时间为80分钟，将分离的ARHGEF7蛋白从凝胶转移至硝酸纤维素膜上(Cat.#HATF00010，Millipore，Boston，MA，USA)。

(4)牛奶封闭：用50ml TBST溶液(含Tris-HCL buffer solution，NaCl，Tween20)(Cat.#B1009,北京普利莱基因技术有限公司,北京，中国)溶解2.5g脱脂牛奶(Cat.#232100，Becton，Dickinson and Company，NY，USA)，配制成5％的脱脂牛奶，浸泡含有目的蛋白的硝酸纤维素膜，并置于摇床，20rpm，室温条件下，封闭2小时。

(5)孵育抗体：用TBST溶液(Cat.#B1009,北京普利莱基因技术有限公司,北京，中国)稀释抗体。孵育一抗：按照1:1000的比例稀释兔多克隆抗体anti-ARHGEF7(1ug/ml)(Cat.#ab175306，Abcam，Cambridge，UK)；按照1:2000的比例稀释兔多克隆抗体anti-GAPDH(500ng/ml)(Cat.#5174，Cell Signaling Technology，MA，USA)。将含有目的蛋白的硝酸纤维素膜，置于抗体孵育盒内，加入3ml上述抗体溶液，置于摇床上，10rpm，4℃，孵育16小时。一抗孵育结束后，用TBST溶液进行一抗的洗涤，置于摇床上，55rpm，5分钟，重复洗涤4次。

孵育二抗：用TBST溶液按照1：5000的比例稀释辣根过氧化物酶标记anti-rabbit抗体(Cat.#7074P2，Cell Signaling Technology，MA，USA)，配制10ml，加入抗体孵育盒内，置于摇床上，室温，10rpm，孵育1小时。二抗孵育结束后，用TBST溶液进行二抗的洗涤，置于摇床上，55rpm，5分钟，重复洗涤4次。

(6)目的蛋白条带的显色：采用FluorChem R多功能成像分析系统(ProteinSimple，CA，USA)进行蛋白条带显色，并使用AlphaView Software(AlphaInnotech，CA，USA)进行灰度扫描并计算相对表达量。

实验结果显示，过表达转录因子NFIC后，血管内皮细胞ARHGEF7的蛋白水平显著降低约21％(P＝0.03)(图8B)。

实施例4雌激素及雌激素受体拮抗剂对ARHGEF7表达水平的影响

发明人在ARHGEF7基因多态性与脑卒中发病风险的病例-对照研究中，发现ARHGEF7多态位点rs3809340与脑卒中患病风险以及预后死亡风险之间的相关性存在性别差异，即，rs3809340-A危险等位基因显著增加女性发生出血性脑卒中的患病风险以及卒中后心血管疾病死亡的风险。本实施例中，发明人进一步明确雌激素和雌激素受体拮抗剂对ARHGEF7基因表达水平的影响。

1、培养脐静脉内皮细胞

本实施例中，采用脐静脉内皮细胞系(Human umbilical vein endothelialcell，HUVECs)(Cat.#6100，China Infrastructure of Cell Line Resources，北京，中国)，培养方法同实施例2。在细胞培养基中分别加入雌激素和雌激素受体拮抗剂，观察它们对ARHGEF7基因表达水平的影响。雌激素β-雌二醇(β-Estradiol)(Cat.#E8875，Sigma-Aldrich，MO,USA)，浓度为10nM，刺激HUVECs 24小时。雌激素受体拮抗剂Fulvestrant(Cat.#S1191，Selleck Chemical,Houston，Texas，USA)，浓度为1000nM，刺激HUVECs 48小时。

2、检测雌激素和雌激素受体拮抗剂对ARHGEF7基因mRNA表达水平的影响

提取HUVECs细胞总RNA、RNA浓度测定、以及实时荧光定量PCR方法，见实施例3。

结果显示：雌激素β-雌二醇(β-Estradiol)显著抑制ARHGEF7基因的mRNA表达水平约38％(P＝0.01)(图9A)，雌激素受体拮抗剂氟维司群(Fulvestrant)显著上调ARHGEF7基因的mRNA表达水平约51％(P＝0.02)(图9B)。

3、检测ARHGEF7基因的蛋白表达水平

提取HUVECs细胞总蛋白、蛋白浓度测定、以及Western Blot方法，见实施例3。

结果显示：雌激素β-雌二醇(β-Estradiol)显著降低ARHGEF7的蛋白表达水平约46％(P＝0.03)(图9C)，雌激素受体拮抗剂氟维司群(Fulvestrant)显著上调ARHGEF7的蛋白表达水平约1.7倍(P＝0.03)(图9D)。

本发明的实用性的例证

1)本发明的ARHGEF7基因单核苷酸多态位点的检测方法可用于分析ARHGEF7基因rs3809340的易感基因型，应用在出血性脑卒中的辅助性诊断、以及对女性个体有多大的出血性脑卒中患病风险和脑卒中预后风险进行评估，以利于开展脑卒中的早期干预及治疗。

2)本发明阐述的ARHGEF7基因单核苷酸多态位点，作为生物标志物，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节ARHGEF7表达的活性分子，促进出血性脑卒中新药的开发。

3)本发明建立的检测ARHGEF7基因单核苷酸多态位点的核酸序列，可高灵敏度、特异性地应用于出血性脑卒中基因诊断用的试剂盒。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国医学科学院阜外医院

<120> 一种预测脑卒中易感性或预后风险的诊断系统或产品及其应用

<130> P190136

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

acgttggatg tgagtaaccc ctgatcgttg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

acgttggatg gaatagtaac tgcgctctcc 30

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ccctcgctct ccatgagcct 20

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ggccggtacc acattgcacc ttaatcccaa cat 33

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

gaaaagcttc caacccgctc agccgctgct t 31

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

gatggaattc ggatgtattc gtccccgctc t 31

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

ggaactcgag ctttgctatc ccagatacca gg 32

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

gaagcctgtg tctcccaaat ca 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

gccgtaggta cgttgaaagc ac 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

gaaggtgaag gtcggagtca 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

ggaagatggt gatgggattt c 21

Claims (10)

1.一种预测脑卒中易感性或预后风险的诊断系统，其特征在于，所述诊断系统通过测定受试者的ARHGEF7基因rs3809340位点的基因型，预测女性受试者脑卒中的易感性以及脑卒中的预后风险；所述诊断系统中含有ARHGEF7基因单核苷酸多态位点作为所述诊断系统的检测靶标，所述ARHGEF7基因单核苷酸多态位点为rs3809340。

2.一种显著增加女性出血性脑卒中的患病风险以及卒中后心血管疾病死亡风险的单核苷酸多态位点rs3809340，其特征在于，所述rs3809340含有危险等位基因rs3809340-A和非易感等位基因rs3809340-T，所述危险等位基因rs3809340-A通过增强ARHGEF7启动子序列与转录因子NFIC的结合作用，抑制ARHGEF7基因的转录活性和表达水平。

3.含有权利要求2所述单核苷酸多态位点rs3809340的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括pGL3-rs3809340-T，pGL3-rs3809340-A及pcDNA3.1-NFIC。

5.一种预测脑卒中易感性或预后风险的药物，其特征在于，ARHGEF7基因单核苷酸多态位点rs3809340。

6.一种基因多态性位点早期评估脑卒中患病和预后风险的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括ARHGEF7基因单核苷酸多态位点rs3809340的特异性引物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性引物序列如下：

rs3809340位点特异性引物组为：

上游引物F:5’-ACGTTGGATGTGAGTAACCCCTGATCGTTG-3’(SEQ ID NO:1)，下游引物R:5’-ACGTTGGATGGAATAGTAACTGCGCTCTCC-3’(SEQ ID NO:2)；延伸引物的核苷酸序列：5’-ccctCGCTCTCCATGAGCCT-3’(SEQ ID NO:3)。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒是基于SequenomMassASSAYR SNP技术用于检测受试者ARHGEF7基因单核苷酸多态位点rs3809340基因型的试剂盒，试剂盒由以下试剂组成：PCR混合缓冲液(PCR Buffer Mix)，PCR酶(PCR Enzyme),碱性磷酸酶，延伸酶(Extend Enzyme)，延伸混合缓冲液(Extend Buffer Mix)。

9.ARHGEF7基因表达水平的检测试剂在制备脑卒中检测试剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述ARHGEF7基因表达水平的检测试剂包括用于扩增ARHGEF7基因的引物对，所述引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO:8-9。