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CN107345212B - 一株产纤维素酶和漆酶的芽孢杆菌及其在烟草薄片中的应用 - Google Patents

一株产纤维素酶和漆酶的芽孢杆菌及其在烟草薄片中的应用 Download PDF

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CN107345212B CN201611261221.XA CN201611261221A CN107345212B CN 107345212 B CN107345212 B CN 107345212B CN 201611261221 A CN201611261221 A CN 201611261221A CN 107345212 B CN107345212 B CN 107345212B
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Abstract

本发明属于微生物发酵结合烟草薄片生产技术领域，具体涉及一株产纤维素酶和漆酶的芽孢杆菌，其分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp.GYC30，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2016395。本发明筛选得到的所述芽孢杆菌菌株由醇化烟叶中筛选而得，在烟草薄片原料中生长状况良好，菌株的生存能力强，且活化率高，易于保藏，具有环境耐受力强、生长速度快、易于培养等优势。利用本发明所述菌株发酵，能够有效降解烟草薄片原料中的纤维素和木质素，并且相较于真菌发酵具有菌株生长能力强，发酵周期短，对原料破坏小的优势，具有潜在的应用价值和良好的开发前景。

Description

一株产纤维素酶和漆酶的芽孢杆菌及其在烟草薄片中的应用
技术领域
本发明属于微生物发酵结合烟草薄片生产技术领域，具体涉及一株产纤维素酶和漆酶的芽孢杆菌，并进一步公开其改善烟草薄片原料品质的用途。
背景技术
造纸法烟草薄片(Paper-Process Reconstituted Tobacco)，是一种烟草资源再生利用的产品，主要是利用烟草制造环节中的复烤和卷烟制造过程中的一些烟草废弃料、边角料，如烟梗、烟叶碎片、烟末等为原料，经过浸提、浓缩、分离、打浆、磨浆、抄造、烘干、加香工艺过程，制成接近天然烟叶的烟叶薄片，用作卷烟填充物，并再用于卷烟生产的一种先进的烟草生产技术。
造纸法烟草薄片相比其他工艺生产的烟草薄片更有利于卷烟降焦减害并改善卷烟内在品质。利用造纸法烟草薄片生产卷烟，不仅在改善烟叶产品结构强度、燃烧性能及降低卷烟的烟气烟碱和焦油量等方面具有优势，同时还能降低烟叶单耗，节约生产成本，可以说是烟草工业近期最重要的成果之一。
与烟叶相比，由于烟梗、烟末等烟草薄片原料中含有较多的有害物质前体，如纤维素、木质素、果胶等大分子物质，这些物质如果存在过量会导致烟草薄片品质低劣，致使卷烟杂气重、刺激性强和木质气强，从而大大降低卷烟口感；而且由于纤维素和果胶交联，在燃烧过程中会发生热解，生成具有强烈刺激性、有致癌作用的甲醇、甲醛等物质；另外，木质素的存在不但严重影响薄片的色泽，而且其在燃烧过程中产生的酚类化合物，也会给口腔带来辛辣感和灼热感，使口感变差；再者，造纸法烟草薄片中 糖类和氨基酸等物质受热裂解也会增加CO和巴豆醛这两种有害物质的释放。这些不利影响都限制了造纸法薄片技术的发展，影响其在卷烟产品中的使用效果。
为了改善上述主要由纤维素和木质素存在引起的问题，现有技术公开了较多利用单一酶类提高造纸烟草薄片品质的研究方法。其中多数采用添加外源酶进行性能改善。但是，使用外源酶处理烟草薄片具有成本高、反应单一、酶活难以维持、反应条件严格等技术缺陷。
在自然界中，纤维素酶和能降解木质素的漆酶广泛存在于植物、真菌和细菌中，利用真菌产纤维素酶和漆酶，是目前生产这两种酶类的主要方式。而利用真菌发酵处理烟草薄片的研究屡见不鲜，但是真菌发酵具有发酵周期长，对薄片品质破坏大，安全风险大等缺点，其对造纸烟草薄片性能的改善也有限。
发明内容
造纸法烟草薄片中纤维素和木质素含量高，含有较多有害前体物质。此前技术大多用真菌发酵产纤维素酶和漆酶，该技术具有发酵周期长，对薄片品质破坏大，安全风险大等缺点，其对造纸烟草薄片性能的改善也有限。为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种芽孢杆菌菌株，以解决现有技术中烟草薄片原料(主要为烟梗和烟末)中含有较多的有害物质前体、进而影响造纸烟草薄片口感较差的问题。该菌株经发酵能够有效降解烟草薄片原料中的纤维素和木质素，并且相较于真菌发酵具有菌株生长能力强，发酵周期短，对原料破坏小的优势，具有潜在的应用价值和良好的开发前景。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种芽孢杆菌菌株，其分类命名为Bacillussp.GYC30，该菌株已于2016年7月14日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2016395。保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，邮政编码430072。
本发明还提供了一种培养所述芽孢杆菌菌株的方法，即包括将所述芽 孢杆菌在适宜于纤维素酶、漆酶及果胶酶表达的培养条件下进行培养的步骤。
所述的培养方法即包括在含有如下含量组分的培养基中的培养步骤：碳源2-4g/L、氮源4-6g/L、NaCL4-6g/L、烟叶浸提液1-5g/L、其余为水，调节pH6.5-7.5。
所述烟叶浸提液按照如下方法制得：取醇化烟叶和去离子水，二者按照质量体积比(W:V)为1：50-100的比例混匀，控制温度180-200℃磁力搅拌1-1.5h，用纱布过滤并灭菌得所述烟叶浸提液。
所述碳源包括葡萄糖和/或果糖。
本发明还公开了由所述芽孢杆菌菌株编码的酶，所述酶包括纤维素酶、漆酶及果胶酶。
本发明还公开了所述的酶在烟草薄片加工领域中的应用。
本发明还公开了所述芽孢杆菌菌株在烟草薄片加工领域中的应用。
本发明还公开了一种改善烟草薄片加工原料性状的方法，包括如下步骤：
(1)取烟草废弃料加水混匀，于50-60℃进行浸提，将所得浸提物抽滤、并洗涤至洗涤液无色，烘干至恒重，备用；
(2)取所述芽孢杆菌菌株进行扩大培养；
(3)取步骤(1)中处理后的所述烟草废弃料加入步骤(2)中培养液中，35-40℃进行发酵；
(4)发酵结束后，取发酵液抽滤得固形物，并以蒸馏水洗涤、烘干，即得所需改善后的烟草废弃料。
所述烟草废弃料包括烟末和/或烟梗。
本发明还公开了一种加工烟草薄片的方法，包括按照所述方法进行烟草薄片加工原料性状改善的步骤。
本发明筛选得到的所述芽孢杆菌菌株由醇化烟叶中筛选而得，在烟草薄片原料中定殖状况良好，避免了从其它原料获得的菌株在烟草薄片上定殖能力差的问题；同时菌株的生存能力强，且活化率高，所以该菌株易于保藏，具有环境耐受力强、生长速度快、易于培养等优势。
本发明所述芽孢杆菌可同时产纤维素酶和漆酶，并将其作用于烟草薄片，目前鲜有报道。本发明所述方案不同于传统外源酶处理烟草薄片的方法，利用自行筛选的具有优异性能的芽孢杆菌自身分泌多种酶的特点，结合烟草薄片生产工艺对烟梗烟末进行发酵处理改善其性状。相较于真菌发酵，整个反应具有条件温和、成本低、酶活稳定等优势；同时，本发明所筛选芽孢杆菌菌株具有发酵周期短、降解效果好，对原料品质破坏小等优势，并可以有效保证菌种存活率，大大缩短发酵时间；同时，芽孢杆菌对烟草薄片的感官品质影响小于真菌；对提高烟草薄片品质具有积极意义和广阔的应用前景。
本发明所述改善烟草薄片制备原料性状的方法，可同时降低烟末及烟梗烟末混合物的纤维素和木质素的含量，不同于真菌发酵通常需要8d至10d，本发明所述菌株，经发酵5d后，棕纤维素降解率均大于18％，木质素降解率均大于20％；发酵4d后发酵液还原糖含量可提高30％以上，说明本发明涉及菌株能显著降解烟草薄片原料的纤维素和木质素，同时能提高烟末提取液的品质。
具体实施方式
菌株的筛选
本发明所述能够产纤维素酶、漆酶和果胶酶的芽孢杆菌是从醇化烟叶中筛选获得，具体包括如下步骤：
(1)用粉碎机将醇化烟叶进行粉碎，过筛，并冷却至室温，备用；
(2)称取步骤(1)中粉碎后的醇化烟叶粉末，加入0.9％无菌生理盐水，在30℃下于恒温水浴摇床震荡1h以上，得到醇化烟叶提取液；
(3)用相同的无菌生理盐水将步骤(2)中提取液稀释成10-1～10-8的浓度梯度，用平板涂布法在NA(牛肉膏蛋白胨)培养基上均匀涂布，于37℃的恒温恒湿培养箱培养15-24h；
所述筛选培养基-NA(牛肉膏蛋白胨)培养基，是本技术领域熟知的细菌筛选培养基，即含有牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂15g/L，pH7.3，培养基为淡黄棕色。
(4)将步骤(3)中培养完成的平板取出，挑选形态差异较大的菌落分别划线纯化，直至出现单菌落，将所述菌株用30％甘油保藏于-20℃条件下，待用；
(5)分别将挑选的单菌落经培养72h后，接种至纤维素酶、漆酶和果胶酶定性培养基中进行定性测定，证明其可产纤维素酶、漆酶和果胶酶的能力，各定性培养基配方如下：
纤维素酶定性培养基：刚果红0.2g，KCl 0.5g，NaNO3 3.0g，KH2PO4 1.0g，CMC·Na15.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20.0g，水1000mL，pH 7.0，115℃灭菌30min；
漆酶定性培养基：愈创木酚2.5g，酵母膏10.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，水1000mL，pH 7.0，115℃灭菌30min；
果胶酶定性培养基：桔皮粉4.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，NaCl 5.0g，KH2PO41.0g，K2HPO4 0.3g，琼脂20.0g，水1000mL，pH 7.0，115℃灭菌30min。
经筛选获得一株产纤维素酶、漆酶和果胶酶性能较好的菌株，经鉴定为芽孢杆菌Bacillus sp.GYC30，并将该菌种保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC M2016395。
将所选菌株进行上述纤维素酶、漆酶和果胶酶的定性测定，并记录各定性培养基中透明圈情况(HC＝透明圈直径/菌落直径)，单位mm，记录于下表1。
表1菌株培养72h后菌落直径与产酶透明圈情况(单位：mm)
Figure BDA0001199781700000061
可见，本发明所述菌株是从醇化烟叶中筛选获得的优势菌株，该菌株可产纤维素酶、漆酶及果胶酶等多种酶类。
将上述得到的菌株Bacillus sp.GYC30进行遗传稳定性考察：将每个菌株连续转接10代，每代均接入所述发酵培养基进行培养发酵(接种量2％)，发酵培养基为NA培养基，三角瓶用八层纱布包裹，瓶中培养基体积应小于瓶容积的1/5，培养条件为发酵温度37℃，搅拌转速200rpm，于旋转式摇床恒温摇瓶发酵72小时，菌株显示了稳定的发酵性能。可见，该菌株的遗传性能较佳。
以下实施例中关于烟草薄片原料形状改善的测定参数按照如下方法进行。
烟草薄片原料(烟末组和烟梗烟末组)中总纤维素的测定：样品按GB/T 2677.1《造纸原料分析试样的采取》规定方法取样，即选取粉碎机中能全部通过40目筛但不能通过60目筛的细末，烘干至恒重，按GB/T 2677.1《造纸原料总纤维素含量的测定》测定总纤维素含量。
烟草薄片原料(烟末组和烟梗烟末组)中木质素的测定：样品按GB/T 2677.1《造纸原料分析试样的采取》规定方法取样，即选取粉碎机中能全部通过40目筛但不能通过60目筛的细末，烘干至恒重，按GB/T 2677.8《造纸原料酸不溶木素含量测定》和GB/T 10337《造纸原料和纸浆酸溶木素的测定》分别测定发酵后薄片原料木质素含量，加和得原料总木质素百分比。
发酵液中菌液浓度的测定：将试管编号，每管加入9ml PBS后灭菌，取1ml发酵液加入其中一管，混合均匀，再取此管液体加入下一管，将菌液依次稀释成10-1～10-8，从10-6～10-8的试管中分别取100μl菌液，均匀涂 布于含有扩培培养基的培养皿上，37℃培养24h后取出，统计该菌落数量，计算菌液浓度(单位：cfu/ml)。
测定发酵液中还原糖含量的方法：取1ml发酵液，5000rpm下离心3min，取上清液0.4ml，依次加入0.6ml蒸馏水和1ml DNS，在沸水中煮2min，置于冰水中冷却，再加入8ml蒸馏水，混合均匀，在560nm测定溶液吸光度，用葡萄糖标准曲线计算液体中还原糖含量，从而折算出发酵液中的还原糖含量。
经测定，本发明下述实施例中使用的烟末原料总纤维素含量为27.68％、木质素含量为3.07％，烟梗和烟末混物原料总纤维素含量为35.02％、木质素含量为3.61％。
以下实施例1-4和比较例1-2中，菌株活化所采用的液体活化培养基为NA培养基(无需添加烟叶浸提液)，其组分包括：蛋白胨5g/L、牛肉粉1.5g/L、氯化钠5g/L、pH7.3。
实施例1：
准确称取6.0g烟末，按1:10(w/v)加水混匀，于50℃搅拌浸提2h，将所得浸提物抽滤、并洗涤至洗涤液无色，烘干至恒重，备用；
配制含有葡萄糖的液体发酵培养基，配方如下：葡萄糖组培养基：葡萄糖3g/L、蛋白胨5g/L、烟叶浸提液3g/L、NaCl 5g/L，pH7.0；
所述液体发酵培养基中添加的烟叶浸提液按照如下方法制得：取醇化烟叶和去离子水，二者按照质量体积比(W:V)为1：80的比例混匀，控制温度180-200℃磁力搅拌1-1.5h，用纱布过滤并灭菌得所述烟叶浸提液；
将所述菌株按2％的接种量接种于含有所述液体活化培养基的试管中，活化15h后按2％接种量接种于含有100ml上述葡萄糖组液体发酵培养基的三角瓶中，同时加入上述浸提后的烟末，用八层纱布包裹，于37℃，200rpm下恒温摇瓶发酵。
每隔24h取出适量发酵液测定菌浓度及还原糖含量，取出适量烟末烘 干至恒重，测定总纤维素和木质素含量，结果如下表2所示。
表2烟末组样品在葡萄糖组培养基中发酵各成分变化情况
Figure BDA0001199781700000081
可见，本发明所述芽孢杆菌菌株可有效降低烟草粉末废弃料中的纤维素、木质素含量。
实施例2：
准确称取6.0g烟末，按1:10(w/v)加水混匀，于50℃搅拌2h浸提，将所得浸提物抽滤、并洗涤至洗涤液无色，烘干至恒重，备用；
配制含有果糖的液体发酵培养基，配方如下：果糖组培养基：果糖3g/L、蛋白胨5g/L、烟叶浸提液3g/L、NaCl 5g/L，pH7.2；
所述液体发酵培养基中添加的烟叶浸提液按照如下方法制得：取醇化烟叶和去离子水，二者按照质量体积比(W:V)为1：50的比例混匀，控制温度180-200℃磁力搅拌1-1.5h，用纱布过滤并灭菌得所述烟叶浸提液；
将所述芽孢杆菌菌株按2％接种量接种于含有所述液体活化培养基的试管中，活化15h后按2％接种量接种于含有100ml上述果糖组液体发酵培养基的三角瓶中，同时加入所述浸提后的烟末，用八层纱布包裹，于37℃，200rpm下恒温摇瓶发酵。
每隔24h取出适量发酵液测定菌浓度及还原糖含量，取出适量烟末烘干至恒重，测定总纤维素和木质素含量，结果如下表3所示。
表3烟末组样品在果糖组培养基中发酵各成分变化情况
Figure BDA0001199781700000082
Figure BDA0001199781700000091
可见，本发明所述芽孢杆菌菌株可有效降低烟草粉末废弃料中的纤维素、木质素含量。
实施例3：
准确称取3.0g烟末和3.0g烟梗，混合均匀，按1:10(w/v)加水混匀，于50℃搅拌2h浸提，将所得浸提物抽滤、并洗涤至洗涤液无色，烘干至恒重，备用；
配制含有葡萄糖的液体发酵培养基，配方如下：葡萄糖组培养基：葡萄糖3g/L、蛋白胨5g/L、烟叶浸提液3g/L、NaCl 5g/L，pH7.5；
所述液体发酵培养基中添加的烟叶浸提液按照如下方法制得：取醇化烟叶和去离子水，二者按照质量体积比(W:V)为1：100的比例混匀，控制温度180-200℃磁力搅拌1-1.5h，用纱布过滤并灭菌得所述烟叶浸提液；
将菌株按2％接种量接种于含有所述液体活化培养基的试管中，活化15h后按2％接种量接种于含有100ml上述葡萄糖组液体发酵培养基的三角瓶中，同时加入浸提后的烟末，用八层纱布包裹，于37℃，200rpm下恒温摇瓶发酵。
每隔24h取出适量发酵液测定菌浓度及还原糖含量，取出适量烟末烘干至恒重，测定总纤维素和木质素含量，结果如下表4所示。
表4烟梗烟末混合组样品在葡萄糖组培养基中发酵各成分变化情况
Figure BDA0001199781700000092
可见，本发明所述芽孢杆菌菌株可有效降低烟草和烟梗粉末废弃料中的纤维素、木质素含量。
实施例4：
准确称取3.0g烟末和3.0g烟梗，混合均匀，按1:10(w/v)加水混匀，于50℃搅拌2h浸提，将所得浸提物抽滤、并洗涤至洗涤液无色，烘干至恒重，备用；
配制含有果糖的液体培养基，配方如下：果糖组培养基：果糖3g/L、蛋白胨5g/L、烟叶浸提液3g/L、NaCl 5g/L，pH7.0；
将菌株按2％接种量接种于含有所述液体活化培养基的试管中，活化15h后按2％接种量接种于含有100ml所述果糖组液体发酵培养基的三角瓶中，同时加入浸提后的烟末，用八层纱布包裹，于37℃，200rpm下恒温摇瓶发酵。
每隔24h取出适量发酵液测定菌浓度及还原糖含量，取出适量烟末烘干至恒重，测定总纤维素和木质素含量，结果如下表所示(表5)：
表5烟梗烟末混合组样品在果糖组培养基中发酵各成分变化情况
Figure BDA0001199781700000101
比较例1：
准确称取6.0g烟末，按1:10(w/v)加水于50℃搅拌2h浸提，将所得浸提物抽滤、并洗涤至洗涤液无色，烘干至恒重，备用；
配制空白组液体培养基，即0.9％生理盐水；
将菌株按2％接种量接种于含有所述液体活化培养基的试管中，活化15h后按2％接种量接种于含有100ml空白组培养基的三角瓶中，同时加入 浸提后的烟末，用八层纱布包裹，于37℃，200rpm下恒温摇瓶发酵。
每隔24h取出适量发酵液测定菌浓度及还原糖含量，取出适量烟末烘干至恒重，测定总纤维素和木质素含量，结果汇总如下表6所示。
表6比较例1样品发酵各成分变化情况
Figure BDA0001199781700000111
比较例2：
准确称取3.0g烟末和3.0g烟梗，混合均匀，按1:10(w/v)加水于50℃搅拌2h浸提，将所得浸提物抽滤、并洗涤至洗涤液无色，烘干至恒重，备用；
配制空白组液体培养基，即0.9％生理盐水；
将菌株按2％接种量接种于含有所述液体活化培养基的试管中，活化15h后按2％接种量接种于含有100ml空白组培养基的三角瓶中，同时加入浸提后的烟末，用八层纱布包裹，于37℃，200rpm下恒温摇瓶发酵。
每隔24h取出适量发酵液测定菌浓度及还原糖含量，取出适量烟末烘干至恒重，测定总纤维素和木质素含量，结果汇总如下表7所示。
表7比较例2样品发酵各成分变化情况
Figure BDA0001199781700000112
由表6中数据可以看出，三组不同培养基中发酵下的烟末加入本发明所述菌株发酵后，总纤维素和木质素均被降解，总纤维素降解率均高于18％，其中葡萄糖为碳源组的总纤维降解效果最好，可达19.33％；木质素的降解率均高于20％，其中以果糖为碳源组的降解效果最好，达到31.60％；三组样品中的菌浓度在第三天均达到峰值，由于培养基中含有可直接利用的碳源，前48h葡萄糖组和果糖组菌浓度明显大于空白组；葡萄糖组和果糖组中的还原糖作为碳源在发酵中被被菌株消耗从而逐渐降低，空白组由于烟末本身含有少量还原糖，在发酵前期被菌株利用而降低，菌株在稳定期产酶量增加，纤维素和木质素分解效率提高，发酵液中还原糖含量呈上升趋势，4d到达峰值，5d时，处于衰退期的菌株产酶量降低，同时还要继续利用发酵液中的还原糖，故还原糖含量开始下降。
由表7数据可以看出，三组不同培养基中的烟梗和烟末混合物加入本发明所述菌株发酵后，总纤维素和木质素均被降解，总纤维素降解率均高于18％，其中以果糖为碳源组的总纤维降解效果最好，可达27.61％；木质素的降解率均高于20％，其中葡萄糖组的降解效果最好，达到32.69％；三组样品中的菌浓度在第三天均达到峰值，与表6中数据相似，前48h葡萄糖组和果糖组菌浓度明显大于空白组；葡萄糖组和果糖组中的还原糖逐渐降低，空白组的还原糖含量呈现先降低后增加再降低的趋势。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种芽孢杆菌菌株，其分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp.GYC30，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2016395。
2.一种培养权利要求1所述芽孢杆菌菌株的培养方法，其特征在于，包括将权利要求1所述芽孢杆菌在适宜于纤维素酶、漆酶及果胶酶表达的培养条件下进行培养的步骤。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，其包括在含有如下含量组分的培养基中的培养步骤：碳源2-4g/L、氮源4-6g/L、NaCL4-6g/L、烟叶浸提液1-5g/L、其余为水，调节pH6.5-7.5。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述烟叶浸提液按照如下方法制得：取醇化烟叶和去离子水，二者按照质量体积比(W:V)为1：50-100的比例混匀，控制温度180-200℃磁力搅拌1-1.5h，用纱布过滤并灭菌得所述烟叶浸提液。
5.根据权利要求3或4所述的培养方法，其特征在于，所述碳源包括葡萄糖和/或果糖。
6.权利要求1所述芽孢杆菌菌株在烟草薄片加工领域中的应用。
7.一种改善烟草薄片加工原料性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取烟草废弃料加水混匀，于50-60℃进行浸提，将所得浸提物抽滤、并洗涤至洗涤液无色，烘干至恒重，备用；
(2)取权利要求1所述芽孢杆菌菌株进行扩大培养；
(3)取步骤(1)中处理后的所述烟草废弃料加入步骤(2)中培养液中，35-40℃进行发酵；
(4)发酵结束后，取发酵液抽滤得固形物，并以蒸馏水洗涤、烘干，即得所需改善后的烟草废弃料。
8.一种加工烟草薄片的方法，其特征在于，包括按照权利要求7所述方法进行烟草薄片加工原料性状改善的步骤。
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