CN103320352B

CN103320352B - 一种微生物菌株及其应用

Info

Publication number: CN103320352B
Application number: CN201310182012.6A
Authority: CN
Inventors: 吕欣; 赵德学; 马玲玲; 胡喜怀; 郭志刚; 张晓妮
Original assignee: Northwest A&F University; China Tobacco Shaanxi Industrial Co Ltd
Current assignee: Northwest A&F University; China Tobacco Shaanxi Industrial Co Ltd
Priority date: 2013-05-16
Filing date: 2013-05-16
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2033-05-16
Also published as: CN103320352A

Abstract

本发明公开了一种新的微生物菌株，该微生物菌株为LBT XP01，分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.），在中国微生物菌种保藏管理委员会普通保藏中心的保藏号为CGMCC No.7495。该菌株由醇化烟叶表面分离筛选获得，是一株新的微生物菌株，该微生物菌株用于烟叶及其他各类烟草制品的发酵工艺同时降低烟叶中淀粉和蛋白质，经该微生物处理后，烟叶中淀粉和蛋白质可分别可降低33%和20%，降解效果明显。

Description

一种微生物菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种微生物菌株及其该微生物菌株用于同时降解烟叶中淀粉和蛋白质的应用。

背景技术

烟草有很多类型，如香料烟、烤烟、白肋烟等，其化学成分相似，但也有不同，使其可根据卷烟工业需要，适当选择，形成叶组，经过加香加料、卷接等工艺过程成为具备一定感官特征的卷烟产品。在烟草的各类化学成分中，淀粉和蛋白质是两种重要的大分子化合物，存在与各类型烟草中。

烟叶中淀粉的生理生化变化决定着叶片烤后内部各种化学成分之间的协调程度，包括合成、积累、分解和转化的状况，烟叶中淀粉在大田生育期间有一定积累。采收后的烟叶通过烘烤、调制等过程，其中的淀粉大部分被降解成为还原糖，但仍然有一定淀粉的残留，约1%～6%之间（王怀珠等，2005），这些残留的淀粉对烟叶的品质具有不利的影响（Weeks1985），主要影响烟叶的燃烧速率和燃烧的完全性，并且燃吸时会产生焦糊味、杂气和刺激性，对香味产生不利影响（王瑞新，2003；王东胜，2002）。美国的优质烤烟的淀粉含量在1.0%～2.0%之间，津巴布韦则规定烤烟中的淀粉含量必须控制在3.0%以下（蔡宪杰等，2005），而我国的烤烟淀粉含量大约为4%～6%（王怀珠等2004）。经过2～3年醇化的烟叶，其含有的大部分淀粉会转化为小分子碳水化合物，这些小分子的碳水化合物对烟气的芳香性与醇和性具有重要的作用，它们能够参与调节烟气中酸碱平衡（闫克玉，2003）。宫长荣（2003）和王怀珠（2004）等人通过在烟草的调制过程中，从湿度、温度上的控制以及添加外加酶的方法，来促进淀粉的转化和降解。因此降低烟叶中的淀粉含量有利于改善烟叶品质。

烟草中的蛋白质随着烟草的生长发育而逐渐累积，鲜烟叶中的蛋白质经过田间落黄、调制过程，蛋白质含量降低至6%～7%。在随后的烟叶醇化过程中，蛋白质继续缓慢降解。若烟叶蛋白质含量过高，会使烟叶燃烧时产生刺激性、辛辣味和苦味，还会产生如同烧焦羽毛的臭味，损害烟气的吸味和香气（张槐苓等，1994）。因此降低烟叶中的蛋白质含量对改善烟叶品质极为有利。

发明内容

由于烟叶中过高含量的淀粉和蛋白质对于烟叶的吸食品质有不良影响，本发明目的在于，提供一种微生物菌株及其该微生物菌株用于同时降低烟叶中淀粉和蛋白质的应用，经申请人的研究表明，采用该微生物菌株用于烟叶发酵后，可使烤烟中的淀粉和蛋白质含量明显降低33%和20%。

为了实现上述任务，本发明采用以下技术方案得以实现：

一种微生物菌株，其特征在于，该微生物菌株为LBT XP01，分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.），在中国微生物菌种保藏管理委员会普通保藏中心的保藏号为CGMCC No.7495。

上述芽孢杆菌（Bacillus sp.）的16S rRNA基因序列如下（GenbankAccession number：KF017201）：

GTTGCCGGGCGGCGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAAGGAATTGACGGGGGGCCCGCACAAGCCGTTGGAGCATGTGGTTTAATTCAAAGCAACGCGAAAGAACCTTTACCAGGTCTTTGACATTCC。

经申请人的试验表明，上述微生物菌株用于烟叶及其他各类烟草制品的发酵工艺的应用，以同时降低烟叶中淀粉和蛋白质。

所述的微生物菌株是固态和液态的种子，经发酵液体培养基得到的发酵液、或经固态发酵培养基发酵培养的菌体以及固态培养基与菌体的混合物菌体，并进一步制成斜面、悬浮液、湿菌体、粉剂或冻干粉。

所述的发酵液的制备方法是，将保藏的芽孢杆菌（Bacillus sp.）从LB固体斜面接种2环至100mL的LB液体培养基中，于25℃～45℃，100～180rpm恒温摇床振荡培养6h～48h，得到芽孢杆菌（Bacillus sp.）LBT XP01的发酵液；

LB液体培养基主要成分为：胰化蛋白胨：1%，酵母提取物：0.5%，NaCl：1%，蒸馏水；

LB固体培养基主要成分为：胰化蛋白胨：1%，酵母提取物：0.5%，NaCl：1%，琼脂：2%。

将所得到的发酵液在4℃、4500r/min～12000r/min条件下离心2min～25min，弃上清液得到湿菌体；用1mL～15mL无菌去离子水将湿菌体重悬后，均匀喷洒到烟叶上，以等量无菌去离子水为对照，将喷好湿菌体的烟叶置于20℃～50℃，相对湿度20%～90%条件下发酵8h～60h；

发酵完成后，烟叶烘干和水分平衡过程为：在25℃～180℃条件下烘干2s～48h，再经过恒温恒湿条件下平衡后测定烟叶中淀粉和蛋白质含量。

本发明得到的可微生物菌株，是一株新的微生物菌株，具有易培养、降低烟叶中淀粉和蛋白质效果好、发酵速度快等优点。

具体实施方式

申请人从自然醇化3年以上的烟叶表面，经分离、筛选，获得了一株菌株，该微生物菌株为LBT XP01，分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.）该芽微生物菌株LBT XP01除了在学校相关的实验室保藏外，并于2013年04月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通保藏中心（简称CGMCC），经检测为存活，在该中国微生物菌种保藏管理委员会普通保藏中心的保藏号为CGMCC No.7495，自2013年04月19日起保存30年。

以下是申请人采用该微生物菌株用于同时降低烟叶中淀粉和蛋白质的试验，经申请人的研究表明，采用该微生物菌株用于烟叶发酵后，可使烤烟中的淀粉和蛋白质含量明显降低33%和20%。

1）微生物菌株LBT XP01菌种的筛选：

微生物菌株LBT XP01，是申请人从烟叶表面分离筛选得到，具体步骤是：

（1）微生物菌株的分离与筛选：

先用无菌生理盐水与1g自然醇化3年以上的烟叶混合后，用无菌取样的方法取1mL混合液加入到9mL灭菌生理盐水中制成10^－1菌悬液，然后逐级稀释，取10^－2、10^－3、10^－4、10^－5、10^－6、10^－7六个稀释度的菌悬液0.2mL涂布到淀粉固体培养基上，37℃恒温培养24h，挑取长势良好，水解圈大，菌落饱满均匀，且稀释度适宜的平板的单菌落，镜检。若为纯培养单一菌株，则接种于LB斜面固体培养基，37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱。

所述的淀粉固体培养基主要成分组成：蛋白胨：10g/L，牛肉膏：3g/L，NaCl：5g/L，可溶性淀粉：20g/L，琼脂粉：20g/L，pH=7。

若为混合菌株，则再次在淀粉固体培养基平板上进行划线分离，直至镜检为菌株纯培养物后，接种LB斜面固体培养基，37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱。

对筛选所得的所有纯培养菌株按照（3）中所述烟叶发酵方法用于烟叶发酵，并根据降低烟叶中淀粉的效果，筛选和确定烟叶淀粉降解菌株。

然后，将烟叶淀粉降解菌株，在蛋白固体培养基上划线，筛选烟叶淀粉降解菌株（水解圈）。再将筛选而得的菌株按照以下步骤（3）中所述烟叶发酵方法进行发酵，根据烟叶中淀粉和蛋白质降解效果，最终确定微生物菌株LBT XP01。

所述的蛋白固体培养基主要成分组成：酪蛋白：10g/L，Na₂HPO₄：2g/L，NaCl：5g/L，琼脂粉：20g/L，pH=10。

LB液体培养基主要成分组成（w/v）：胰化蛋白胨：1%，酵母提取物：0.5%，NaCl：1%，蒸馏水。

LB斜面固体培养基主要成分组成（w/v）：胰化蛋白胨：1%，酵母提取物：0.5%，NaCl：1%，琼脂粉：2%。

（2）微生物菌株LBT XP01的培养：

将保藏的微生物菌株LBT XP01从LB固体斜面培养基接种2环至100mL的LB液体培养基中，于37℃，120rpm恒温摇床振荡培养6h～36h得到LBT XP01新鲜发酵液。

LB液体培养基主要成分为：胰化蛋白胨：1%，酵母提取物：0.5%，NaCl：1%，蒸馏水。

（3）微生物菌株LBT XP01用于烟叶的发酵：

将上述步骤（2）所得到的发酵液在4℃11000r/min离心10min，弃上清液得到湿菌体。用5mL无菌去离子水将湿菌体重悬后，分别均匀喷洒到55g烟叶上，以等量无菌去离子水为对照，将喷好的烟叶置于37℃，相对湿度80%条件下发酵48h。

（4）烟叶烘干、水分平衡和淀粉、蛋白质测定：

发酵结束后，在25℃～180℃条件下烘干2s～48h，经过水分平衡后，测定烟叶中淀粉和蛋白质含量，测定结果如表1所示。

表1：喷施LBT XP01菌株后烟叶淀粉和蛋白质变化

Claims

1.一种微生物菌株，其特征在于，该微生物菌株命名为芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT XP01，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通保藏中心的保藏号为CGMCC No.7495。

2.如权利要求1所述的微生物菌株，其特征在于，所述的芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT XP01的16S rRNA基因序列如下：

3.权利要求1所述的微生物菌株在烟叶及其他各类烟草制品的发酵工艺中降低烟叶中淀粉和蛋白质的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述的微生物菌株经液体培养发酵培养得到的发酵液、或经固态发酵培养基发酵培养得到的菌体、或固态培养基与菌体的混合物菌体，进一步制成湿菌体、粉剂或冻干粉。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的发酵液的制备方法是，将保藏的芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT XP01从LB固体斜面培养基接种2环至100mL的LB液体培养基中，于25℃～45℃，100rpm～180rpm恒温摇床振荡培养6h～48h，得到芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT XP01的发酵液；

LB液体培养基主要成分为：胰化蛋白胨：1％，酵母提取物：0.5％，NaCl：1％，蒸馏水；

LB固体斜面培养基主要成分为：胰化蛋白胨：1％，酵母提取物：0.5％，NaCl：1％，琼脂：2％。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，将所得到的发酵液在4℃、4500r/min～12000r/min条件下离心2min～25min，弃上清液得到湿菌体；用1mL～15mL无菌去离子水将湿菌体重悬后，均匀喷洒到烟叶上，以等量无菌去离子水为对照，将喷好湿菌体的烟叶置于20℃～50℃，相对湿度20％～90％条件下发酵8h～60h；

发酵完成后，经烟叶烘干和水分平衡，过程为：在25℃～180℃条件下烘干2s～48h，再经过恒温恒湿条件下平衡后测定烟叶中淀粉和蛋白质含量。