CN115340964B - 一种具有膨胀素活性的芽孢菌属菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有膨胀素活性的芽孢菌属菌株及其应用，其发酵液具有极高的膨胀素蛋白活性。该菌株为芽孢菌属菌株CFFSH013，原始菌株分离于烟叶表面，经过16srDNA鉴定为芽孢菌属菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心编号为CCTCCNO：M2020635。
Description
技术领域
本发明涉及一种菌株，具体为一种具有膨胀素活性的芽孢菌属菌 株，属于菌株技术领域。
发明背景：
膨胀素(Expansin，也称作扩张素或扩张蛋白)是一种引起植物 细胞壁松弛的蛋白质，在植物细胞伸展以及一系列涉及细胞壁修饰的 生命活动中起着关键作用。膨胀素由多基因家族编码，研究表明膨胀 素超家族由四个基因亚家族构成。
细胞壁在各种细胞活动中起着至关重要的作用，例如分化、运输 和通讯、衰老、脱落、植物-病原体相互作用以及最终的植物生长。 它既提供植物所需的机械强度，又提供植物组织和器官发育所需的可 塑性。虽然膨胀素的生化工作机制尚不完全清楚，但普遍认为膨胀素 对细胞壁的作用带，来了这种急需的可塑性，其本身虽然不是酶，但 是膨胀素可以松弛细胞壁，使得细胞壁拉伸强度的持续降低，随后导 致细胞膨胀。
膨胀素最早由S McQueen-Mason在黄瓜中发现(DOI: 10.1105/tpc.4.11.1425)，之后其在被发现普遍存在于各类植物中， 包括拟南芥、烟草、水稻、玉米、大豆等等。但是植物来源的膨胀素 其存在表达产量不高，难以规模化生产的目的。
除了植物来源，现有技术发现了部分从定植于植物表面的微生 物，同样具有分泌与产生微生物膨胀素蛋白的能力。包括来自盘基网 柄菌的扩展蛋白样蛋白(Kawata等，2015)，来自枯草芽孢杆菌的 BsExlx1(Kerff等人，2008年)，来自海洋细菌Hahellachejuensis (Lee等人，2010年)的HcExlx2，来自植物致病菌的PcExlx2细 菌Pectobacterium carotovorum(Olarte-Lozano等人，2014年) 和来自担子菌属真菌Schizophylum科的ScExlx1(Tovar-Herrera 等人，2015年)。这些微生物扩展蛋白已被证明具有多种能力，可 用于使微生物附着和定植植物。此外，一些研究人员正在评估这些微 生物扩展蛋白在用于生物燃料生产的纤维素生物质转化中的潜在用途，作为分解纤维素结构的一种手段(Georgelis等人，2015年)。
膨胀素虽然本身并不水解纤维素分子内的糖苷键，但具有类似纤 维素酶的CBD结合结构域和类似植物膨胀素的序列，可以对纤维素与 细胞壁的起到膨胀和崩解效应，提高纤维素酶的作用效率。膨胀素通 过与纤维素酶等生物质降解酶之间的协同作用，在有效转化木质纤维 素类生物质底物，提高发酵生产的经济效益方面。
专利申请真菌来源的膨胀素蛋白及其基因和应用 (CN201710269769.7)公开了一种来源于Talaromyces leycettanus 菌的膨胀素蛋白。但该蛋白的生产依然需要通过毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞或多型 汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞重组进行表达。
便宜快速的规模化生产膨胀素蛋白，是其工业化应用的重要条 件。芽孢菌属菌株自身生长迅速，蛋白表达量高，同时是重要的益生 菌，安全性高，非常适合于规模化生产膨胀素蛋白。同时芽孢菌属自 身本身是很多植物的益生菌，2008年最早在枯草芽孢杆菌中发现其能够生产细菌膨胀素蛋白BsExlx1。寻找高产细胞细菌膨胀素蛋白的 菌株是现有技术中所缺少的关键技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有膨胀素活性的芽孢菌属菌株，其发 酵液具有极高的膨胀素蛋白活性。该菌株为芽孢菌属菌株CFFSH013， 原始菌株由发明人分离于烟叶表面，经过16srDNA鉴定为芽孢菌属菌 株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉 大学；分类命名：芽孢杆菌CFFSH013(Bacillus sp.CFFSH013)；保藏中心编号为CCTCC NO：M2020635；保藏日期为：2020年10月26 日。该培养物的存活性本保藏中心于2020年11月10日检测完毕， 结果为存活。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
一种具有膨胀素活性的芽孢菌属菌株，所述的菌株为保藏编号为 CCTCC NO：M2020635的菌株。
一种具有膨胀素活性的产品，该产品为含有芽孢菌属菌株 CFFSH013、芽孢菌属菌株CFFSH013的发酵液、芽孢菌属菌株CFFSH013 的发酵液上清液、芽孢菌属菌株CFFSH013的发酵提取物、芽孢菌属 菌株CFFSH013的蛋白产物中的任一种。
一种加快生物质降解过程的方法，是将芽孢菌属菌株CFFSH013 (保藏编号为CCTCC NO：M2020635)与其他生物质降解酶配合使用。
进一步的，所述的将芽孢菌属菌株CFFSH013(保藏编号为CCTCC NO：M2020635)与其他生物质降解酶配合使用的使用方式包括将芽 孢菌属菌株CFFSH013的发酵产物与其他其他生物质降解酶共同使 用。
一种加快生物质降解过程的菌剂，含有芽孢菌属菌株CFFSH013 (保藏编号为CCTCC NO：M2020635)。
进一步的，所述的加快生物质降解过程的菌剂中还含有其他可产 生物质降解酶的菌株。
本发明申请中概念“生物质”是指利用大气、水、土地等通过光 合作用而产生的各种有机体，即一切有生命的可以生长的有机物质通 称为生物质，括所有的植物、微生物以及以植物、微生物为食物的动 物及其生产的废弃物，例如如农作物、农作物废弃物、木材、木材废 弃物，也包括生物来源纤维素、淀粉、木质素等生物来源成分本身。
本发明申请中概念“生物质降解酶”是指纤维酶、蛋白酶、果胶 酶、漆酶等能够分解各类生物质及其成分的降解酶。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术特征。
实施例1：芽孢菌属菌株CFFSH013的培养
配置LB液体培养基(酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L)，115℃ 灭菌20min，培养基降至室温后，接入1％(v/v)筛选的芽孢菌属菌 株CFFSH013，37℃培养24h，培养完毕，发酵液于4℃保存备用。
为方便蛋白活性测定，获取不同的发酵产物，芽孢菌属菌株 CFFSH013的发酵液，做了如下处理:
(1)CFFSH013的发酵液：发酵结束后4℃保存备用，使用前摇匀；
(2)CFFSH013灭活发酵液：发酵结束后将发酵液加热至100℃，后 冷却至4℃保存备用；
(3)CFFSH013发酵上清液:发酵结束后将发酵液用冷冻离心机离心 (4℃，8000rpm)，将下层菌体弃用，收集上清液4℃保存备用。
(4)CFFSH013发酵上清冻干粉:发酵结束后将发酵液用冷冻离心机 离心(4℃，8000rpm)，将下层菌体弃用，收集上清液置于-80℃保 持12h预冻成冰，之后使用真空冷冻干燥机将发酵液升华冻干为粉， 收集粉末。
(5)CFFSH013菌体胞溶物:发酵结束后将发酵液用冷冻离心机离心 (4℃，8000rpm)，将下层菌体以蒸馏水重悬后，以超声波细胞破 碎仪破碎，收集4℃保存备用。
实施例2：生物质降解能力(菊芋粉末)
以菊芋片磨粉作为生物质降解的基质，以β-果聚糖酶(河南亿 勤生物科技有限公司产)，β-葡聚糖酶(广州佰嘉生物科技有限公 司生产)，水解之后，水解液中释放的葡萄糖和果碳含量的测定采用 高效液相色谱蒸发光散射检测分析法(HPLC-ELSD，色谱柱：菲罗门MARS MCa)进行测定。实验的空白对照(BK)是以菊粉直接加入水配 置成终浓度5％(w/w)的水溶液，直接测定其中的葡萄糖基果糖含量。实验的空白对照采用菊粉加入水配置成终浓度5％(w/w)的水溶液， 之后于40℃水浴摇床中反应30min，之后测定期葡萄糖与果糖含量。其他实验组的测定条件与处理条件如表1中所列。
结果(表1)表明单纯的CFFSH013菌株的发酵产物并无明显的降 解生物质的作用，但是当其与其他生物质降解酶复合作用时可以大幅 提高β-果聚糖酶和β-葡聚糖酶的作用效率，显示其具有类似膨胀 素的协同作用。
表.1菊芋粉的生物质降解
实施例3：生物质降解(麦秆沫)
以废弃麦秆物理粉碎成细碎沫的麦秆沫作为本实施实例的处理 基质，其处理过程如下，取200g麦秆碎沫，喷洒200g水分，之 后按照表2中所列的处理方式加入CFFSH013发酵物与其他酶剂或菌 剂后混合均匀，于30℃培养箱，湿度60％存放反应7天，之后加入0.1％HCL溶液200g于25℃摇床振荡12h浸出解离葡萄糖，之后 取浸出液，采用高效液相色谱蒸发光散射检测分析法(HPLC-ELSD，色 谱柱：菲罗门MARS MCa)进行测定葡萄糖含量。本实施实例所使用 纤维素酶采购自生工生物工程(上海)股份有限公司，漆酶采购自山东轩洋生物科技有限公司。里氏木霉来源于山东淄博沂源源康生物科技 有限公司康丰源牌里氏木霉菌剂的纯化菌株。
结果如表2所示，CFFSH013发酵物对于外加酶制剂/菌剂解离生 物质的效率有很大程度的提高。
表2.麦秆沫的生物质降解处理条件
Claims (5)
1.一种具有膨胀素活性的芽孢菌属菌株，其特征在于：所述的菌株为芽孢菌属菌株CFFSH013，其保藏编号为CCTCC NO： M2020635的菌株。
2.一种包含权利要求1所述具有膨胀素活性的芽孢菌属菌株的产品，其特征在于：该产品为含有芽孢菌属菌株CFFSH013、芽孢菌属菌株CFFSH013的发酵液中的任一种。
3.一种加快菊芋粉降解过程的方法，其特征在于：是将芽孢菌属菌株CFFSH013，其保藏编号为CCTCC NO：M2020635；与葡聚糖酶或果聚糖酶配合使用。
4.一种加快菊芋粉降解过程的菌剂，其特征在于：该菌剂中含有芽孢菌属菌株CFFSH013，其保藏编号为CCTCC NO：M2020635。
5.根据权利要求4所述的一种加快菊芋粉降解过程的菌剂，其特征在于：菌剂中还含有其他可产葡聚糖酶或果聚糖酶的菌株。
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