CN106636008B - 分泌抗大麦黄矮病毒pav株系单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 - Google Patents
分泌抗大麦黄矮病毒pav株系单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106636008B CN106636008B CN201611207954.5A CN201611207954A CN106636008B CN 106636008 B CN106636008 B CN 106636008B CN 201611207954 A CN201611207954 A CN 201611207954A CN 106636008 B CN106636008 B CN 106636008B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- strain
- monoclonal antibody
- pav
- luteovirus
- wheat
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title claims abstract description 22
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 43
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims abstract description 36
- 241000709757 Luteovirus Species 0.000 claims abstract description 23
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 25
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 14
- 241000724681 Barley yellow mosaic virus Species 0.000 claims description 9
- 241001278024 Wheat yellow mosaic virus Species 0.000 claims description 9
- 241000702302 Wheat dwarf virus Species 0.000 claims description 8
- 241001647393 Chinese wheat mosaic virus Species 0.000 claims description 7
- 241000141789 Barley yellow dwarf virus-GPV Species 0.000 claims description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims 1
- 241000709750 Barley yellow dwarf virus-PAV Species 0.000 abstract description 25
- 241000709756 Barley yellow dwarf virus Species 0.000 abstract description 24
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 5
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 abstract description 4
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 abstract description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 16
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 description 8
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 5
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Substances [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 241000125167 Rhopalosiphum padi Species 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241001124076 Aphididae Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241001425040 Cereal yellow dwarf virus-RPV Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 2
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 2
- 241000253097 Luteoviridae Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N N-Pentanol Chemical compound CCCCCO AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 241000253102 Polerovirus Species 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 241000167882 Rhopalosiphum maidis Species 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 241001429320 Wheat streak mosaic virus Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFRBMBIXVSCUFS-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitro-1-naphthol Chemical group C1=CC=C2C(O)=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C2=C1 FFRBMBIXVSCUFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001600407 Aphis <genus> Species 0.000 description 1
- 241000709752 Barley yellow dwarf virus-MAV Species 0.000 description 1
- 241000331054 Barley yellow dwarf virus-PAS Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000331055 Cereal yellow dwarf virus-RPS Species 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 241001141491 Eumorpha elisa Species 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000258937 Hemiptera Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 241000445170 Maize yellow dwarf virus-RMV Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000168713 Metopolophium dirhodum Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000180219 Sitobion avenae Species 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000045272 Wheat yellow dwarf virus Species 0.000 description 1
- 241001192672 Wheat yellow dwarf virus-GPV Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006757 chemical reactions by type Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 108010081495 driselase Proteins 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- NFJCQBGAUBIGKV-UHFFFAOYSA-N nitro dihydrogen phosphate Chemical compound OP(O)(=O)O[N+]([O-])=O NFJCQBGAUBIGKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/35—Valency
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系单抗杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用提纯的大麦黄矮病毒(BYDV)PAV株系病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗BYDV PAV的单抗杂交瘤细胞株24G4，其保藏号为CGMCC No.13298。该杂交瘤细胞株分泌的单抗腹水间接ELISA效价达到10‑9，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链。利用单抗24G4为核心建立检测小麦植物中BYDV PAV的ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法，这两种方法检测病叶的灵敏度分别达到1:81 920和1:1 280倍稀释(w/v,g/mL)。杂交瘤细胞株24G4及其单抗的获得和血清学检测方法的建立为该病毒病的检测、诊断及科学防控提供了物质和技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
背景技术
由大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruses,BYDVs)引起的小麦黄矮病(Wheat yellow dwarf disease)是小麦上重要的病毒病害之一。该病害最早由Oswald和Houston于1951年在美国加利福尼亚州的大麦上发现。目前，小麦黄矮病毒在世界各地均有分布。1960年，BYDVs首次出现在我国西北地区，受到BYDVs侵染的小麦一般减产40％，严重的可达70％以上，因此BYDVs又被称为“小麦癌症”、“黄色瘟疫”。自首次发现以来，小麦黄矮病在20世纪60-80年代又大规模爆发流行了数次，给我国小麦生产和粮食安全带来了重大威胁。
BYDVs在小麦秋苗期和春季返青后均可侵染植株，典型症状是新叶从叶尖开始发黄，植株变矮，叶片颜色为金黄色到鲜黄色，黄化部分约占全叶的1/3-1/2。秋苗期感病的植株矮化明显，分蘖减少，一般不能安全越冬。即使能越冬存活，一般也不能抽穗。穗期感病的植株一般只旗叶发黄，呈鲜黄色，植株矮化不明显，能抽穗，但千粒重减少，根系浅，易拔起。
BYDVs寄主范围较广，目前已知至少可以侵染150多种禾本科作物和杂草，其主要寄主作物既包括小麦、玉米和水稻世界三大粮食作物，也包括大麦、燕麦和黑麦等具有较高经济价值的粮食作物。虽然BYDVs寄主范围广泛，但都集中在单子叶植物范围内，在自然条件下尚未发现能够被BYDVs侵染的双子叶植物。根据寄主范围、对寄主的毒性、蚜虫传播特异性与反应类型等特点，Rochow等将美国的BYDVs分为MAV、PAV、RPV、RMV和SGV 5个株系。在中国，周广和等筛选鉴定出了4个BYDVs株系，即PAV、RMV、GPV和GAV。BYDVs属黄症病毒科(Luteoviridae)，是一种+ss RNA病毒。病毒粒子由正单链RNA和外壳蛋白组成，呈正二十面体(T＝3)，无包膜。目前，根据国际病毒分类委员会关于病毒的分类，BYDVs分布于黄症病毒科(Luteoviridae)的2个属8个种，且还有2个种未被划分到属。在10个种中，BYDV PAV、BYDVPAS、BYDV MAV、BYDV ker II和BYDV ker III这5个种属于黄症病毒属(Luteovirus)；原RPV株系被升级为Cereal yellow dwarf virus-RPV(CYDV RPV)，并和CYDV RPS和MYDV RMV这2个种一起被划分到马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)中；另外，BYDV GPV和BYDV SGV两个种未归类。这些引起大麦黄矮病的各种病毒株系间的核酸同源性非常的低，其实是完全不同的病毒，由于命名的习惯现在还叫大麦黄矮病毒。
据统计，全世界至少有25种蚜虫可以传播BYDVs。而在中国，禾谷缢管蚜(R.padi)、麦长管蚜(S.avenae)、麦二叉蚜(S.graminum)和玉米蚜(R.maidis)是BYDVs的主要传播介体。BYDVs在蚜虫体内以循回型非增殖方式传播。
目前田间常常根据症状观察判断小麦黄矮病的发生情况，但相比真菌病害和细菌病害，病毒病的症状特点并不明显，常与其他病毒病害相混淆，出现错误判断的情况，而且通过症状并不能判断病毒具体是哪个株系。电镜观察需要昂贵的设备和专业人员，不适合基层应用。RT-PCR等分子生物学方法虽然灵敏度高，但往往受仪器的限制，仅适用于实验室少样品的检测。相比较而言，血清学方法简单易操作、快速、灵敏，成本较低，是目前植物病毒理想的检测手段，但血清学方法必须依赖于特异、灵敏的优质抗体。因此，本发明专利主要针对大麦黄矮病毒PAV株系单克隆抗体的制备及其检测应用开展工作，利用常规杂交瘤技术制备了1株能分泌抗BYDV PAV单抗杂交瘤细胞24G4，并用其分泌的单抗建立了检测该病毒的血清学方法和检测试剂盒，从而为我国大麦黄矮病毒PAV株系的检测、诊断和科学指导防控提供物质和技术支持。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
分泌抗大麦黄矮病毒(BYDV)PAV株系单抗杂交瘤细胞株24G4，它能分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系的特异性单抗,杂交瘤细胞株24G4于2016年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13298。
抗大麦黄矮病毒PAV株系的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-9，抗体类型及亚类为IgG1、Kappa链，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现该单抗检测感染大麦黄矮病毒PAV株系的小麦病叶的灵敏度分别达到1:81 920和1:1 280倍稀释(w/v,g/mL)。
抗大麦黄矮病毒PAV株系的单克隆抗体仅与大麦黄矮病毒PAV株系有特异性免疫反应，而与小麦矮缩病毒、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GPV株系和GAV株系以及健康小麦植物组织均不发生任何免疫反应。
抗大麦黄矮病毒PAV株系的单克隆抗体在大麦黄矮病毒PAV株系检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。
本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株24G4分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA和ACP-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏地检测大麦黄矮病毒PAV株系；2)利用本发明所制备的单抗检测大麦黄矮病毒PAV株系，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本发明所制备的单抗可有效地用于田间小麦样品中大麦黄矮病毒PAV株系的检测。
附图说明
图1是dot-ELISA方法检测小麦BYDV PAV的灵敏度分析。
图2是dot-ELISA方法检测BYDV PAV的特异性分析：第1列上下2个点为2个感染BYDV PAV的小麦样品，第2列上下2个点为2个感染小麦黄花叶病毒的样品，第3列上下2个点为2个感染中国小麦花叶病毒的样品，第4列上下2个点为2个感染大麦黄矮病毒GAV株系的样品，第5列上下2个点为2个感染大麦黄矮病毒GPV株系的样品，第6列上下2个点为感染小麦矮缩病毒的样品，第7列上下2个点为感染大麦黄花叶病毒的样品，第8列上下2个点为健康小麦植物组织样品。
图3是dot-ELISA方法检测小麦田间样品中BYDV PAV的代表性结果。
生物保藏
杂交瘤细胞株24G4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日为2016年11月30日，保藏号为CGMCC No.13298。
具体实施方式
分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系单抗的杂交瘤细胞株24G4于2016年11月30日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13298，它能分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系的单克隆抗体。
抗大麦黄矮病毒PAV株系的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-9，抗体类型及亚类为IgG1、Kappa链，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现该单抗检测感染大麦黄矮病毒PAV株系的小麦病叶的灵敏度分别达到1:81 920和1:1 280倍稀释(w/v,g/mL)。
抗大麦黄矮病毒PAV株系单克隆抗体仅与大麦黄矮病毒PAV株系有特异性免疫反应，而与小麦矮缩病毒、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GPV株系和GAV株系以及健康小麦植物组织均不发生任何免疫反应。
抗大麦黄矮病毒PAV株系的单抗在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。
本发明提供的杂交瘤细胞株24G4能大量分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系的单抗，且其分泌的单抗效价高、特异性强、灵敏度高、稳定性好。以该单抗为核心建立的检测BYDVPAV的高通量的血清学方法及其检测试剂盒可成功应用于田间BYDV PAV的检测，从而为我国大麦黄矮病毒PAV株系的检测、预警和科学防控提供物质和技术支持。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
一、杂交瘤细胞的获得及其单克隆抗体的制备
1.免疫原及检测抗原的制备
用下面的操作步骤提纯病毒粒子：
1)将大研钵和组织搅拌器预冷；
2)将500g感染BYDV PAV的小麦病叶于液氮中研磨成粉末；
3)加入含1％(v/v)巯基乙醇和2.5g崩溃酶的0.1M磷酸盐缓冲液(PB缓冲液)1000mL，组织搅拌器中剧烈搅拌60s混匀。以后每隔15min，搅拌30s，匀浆3h以上；
4)加入Triton X-100至终浓度为0.5％(v/v)，室温搅拌30min；
5)4到6层纱布过滤，滤液体积1100mL，加入220mL氯仿:正戊醇(2:1,v/v)，4℃搅拌30min；
6)8 000rpm离心15min，取上清；
7)所得上清加入NaCl至终浓度为0.25M，然后缓慢加入PEG(分子量6000)至终溶度为10％(w/v,g/mL)，溶解后冰浴放置90-120min；
8)10 000rpm离心20min后弃上清，将沉淀用30mL 0.1M PB悬浮，4℃搅拌过夜；
9)5 000rpm离心10min后弃沉淀，上清加到50mL厚壁离心管的30％的蔗糖(溶于0.1M PB中)垫上，蔗糖垫体积15mL；
10)Beckman Ti55型转头44 000rpm超速离心2h；
11)弃上清，沉淀溶于1.5mL无菌水中，4℃搅拌悬浮过夜，悬浮液即为病毒提纯粒子；
12)用电子显微镜观察提纯样品，发现大量高纯度的大麦黄矮病毒粒子。
2.免疫动物
用提纯的BYDV PAV株系的病毒粒子免疫六周龄BALB/c雌性小鼠。即病毒粒子提纯液50μL/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后经背腹部皮下多点注射0.1mL/只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.1mL/只，再过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。
3.细胞融合
取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5:1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1 500rpm离心5min去除培养基，用50％PEG(分子量1 500)作为融合剂，在37℃水浴中加入1mL，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔细胞板中，并置于37℃含5％CO2的细胞培养箱中培养。
4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆
细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第11天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10-40％时，以感染BYDVs PAV株系的小麦组织粗提液为抗原包被ELISA板，用常规间接ELISA方法筛选分泌单抗的阳性孔，共获35个阳性孔。选择3个呈强阳性反应的细胞孔，进行3次有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗BYDV PAV特异性单抗的杂交瘤细胞株24G4。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。
5.单克隆抗体腹水制备及纯化
取8周龄左右BALB/c小鼠，腹腔注射0.3mL降植烷(Sigma)，7-10d后腹腔注入6×105个杂交瘤细胞，注射后7-10d可见小鼠腹部明显膨大，针头采取腹水，3 000rpm离心3min，收集上清液即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加入2倍体积0.06M pH4.8醋酸缓冲液稀释，室温下边搅边加辛酸(30uL/mL腹水)，4℃澄清1h，12 000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2h，3 000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶解，在4℃冰箱中流动透析24h后即获纯化的单抗，-70℃保存。
6.单克隆抗体的类型及亚类鉴定和腹水效价测定
将纯化的单抗与Sigma公司的标准抗BALB/c小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、κ、λ抗体进行DAS-ELISA分析，结果显示，24G4单抗亚类为IgG1、Kappa链，以提纯病毒为包被抗原用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果表明24G4单抗腹水效价达到10-9。
7.单克隆抗体的特异性检测
用感染小麦矮缩病毒、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GPV株系和GAV株系的病叶粗提液包被ELISA板，以小麦的健康叶片粗提液作阴性对照，以感染大麦黄矮病毒PAV株系的病叶粗提液为阳性对照，用ACP-ELISA方法测定单抗的特异性。ACP-ELISA方法的具体步骤为：上述病毒感染的病叶用液氮在研钵中研磨成粉末，按1:30(w/v,g/mL)加入包被缓冲液继续研磨匀浆3min，5 000rpm离心3min后取上清，100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃ 2h，使其吸附于ELISA聚苯乙烯板孔；PBST洗涤3次后用3％的脱脂奶粉封闭30-60min；加入适当稀释的单抗100μL/孔，37℃ 1-2h；PBST洗涤3次后加入适当稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记的羊抗鼠IgG二抗(Sigma)100μL/孔，37℃ 1-2h；PBST洗涤4次后用PNPP底物显色，2M氢氧化钠终止反应后用酶标仪读取OD405的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，24G4单抗只对BYDV PAV有特异性反应，而与小麦矮缩病毒、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GPV株系和GAV株系以及健康小麦植物组织均不发生任何免疫反应。
二、检测BYDV PAV的免疫学方法及其试剂盒的建立
1.检测BYDV PAV的ACP-ELISA方法
1.1ACP-ELISA方法的步骤：
1)植物组织称重后用液氮在研钵中研磨成粉末，按1:30比例(w/v,g/mL)加入0.05M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)继续研磨匀浆3min，5 000rpm离心3min，上清100μL/孔加入ELISA板中，以BYDV PAV病叶为阳性对照，健康小麦叶为阴性对照，37℃ 2h或4℃过夜；
2)PBST洗涤3次后用3％脱脂奶粉封闭30min；
3)加入适当稀释后的单抗腹水，100μL/孔，37℃孵育1h；
4)PBST洗涤3次后加入适当稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记的羊抗鼠IgG二抗(Sigma)，100μL/孔，37℃孵育1h；
5)用PBST洗涤后加入PNPP硝基磷酸盐底物100μL/孔，室温放置30min；
6)用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色的孔为阳性；或用2M氢氧化钠终止反应后，用酶联免疫检测仪测OD405，以P/N>2.1作为阳性判断标准。
1.2ACP-ELISA方法检测灵敏度和特异性的确定
用常规方阵试验确定ACP-ELISA方法中单抗和酶标二抗的最适工作浓度，即ELISA板横向加用封闭液倍比稀释的单抗，纵向加用封闭液倍比稀释AP标记的羊抗鼠IgG二抗进行ACP-ELISA。试验表明24G4单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5 000和1:8 000倍稀释，以抗体的最适工作浓度建立检测BYDV PAV的ACP-ELISA方法。对BYDV PAV病叶粗提液从1:160至655 360倍比稀释，分别以相应稀释度的小麦健叶粗提液作阴性对照，分析ACP-ELISA方法的检测灵敏度。结果表明ACP-ELISA方法对1:1:81 920倍稀释(w/v,g/mL)的病叶粗提液仍呈阳性反应，即对病叶的检测灵敏度可达到1:1:81 920倍稀释(w/v,g/mL)，表明ACP-ELISA方法具有很高的灵敏度。用建立的ACP-ELISA方法检测BYDV PAV、大麦黄矮病毒GPV株系、大麦黄矮病毒GAV株系、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒和健康小麦植物组织，检测结果表明，建立的ACP-ELISA方法检测BYDV PAV呈强阳性反应，而与小麦矮缩病毒、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GPV株系和GAV株系以及健康小麦植物组织均呈阴性反应，且阴阳性结果对比差异极显著，说明该方法的特异性很好。
2.dot-ELISA方法的建立及田间检测应用
2.1dot-ELISA方法检测植物中BYDV PAV的操作步骤
将小麦植物样品的叶片称重后用液氮在研钵中研磨成粉末，按1:30的比例(w/v,g/mL)加入0.01M PBS(pH7.4)后研磨、匀浆3min；匀浆液5 000rpm离心3min；取2.5μL上清点到硝酸纤维素膜(NC)上，同时设置健康和感染BYDV PAV的小麦叶片分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20min；NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01MPBS)封闭液中室温封闭30min；NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60min；用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入适度稀释的AP酶标记的羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；PBST洗膜4-5次，每次3min；66μL NBT和33μL BCIP底物(Promega)加入到10ml底物缓冲液(0.1mol/L Tris Cl、0.1mol/L NaCl、0.025mol/L MgCl、pH9.5)中混匀，膜放入底物液中反应，显色10-20min，肉眼观察结果，待阳性对照显色明显紫色，而阴性对照没有任何显色时，在自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。
2.2dot-ELISA方法检测灵敏度和特异性的确定
用常规方阵试验确定dot-ELISA方法中BYDV PAV的单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明24G4单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5 000和1:7 000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测BYDV PAV的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当感染BYDVPAV小麦病叶稀释到1:1 280倍(w/v,g/mL)时，以24G4单抗建立的dot-ELISA方法检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:1 280倍稀释(w/v,g/mL)(图1)。特异性分析表明，该方法检测感染BYDV PAV的小麦病叶呈强阳性反应，而检测小麦矮缩病毒、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GPV株系和GAV株系以及健康小麦植物组织均呈阴性反应(图2)。
2.3dot-ELISA方法的应用
用建立的dot-ELISA方法对2016年采自陕西省的田间疑似发病样品进行检测，结果发现，23个检测样品中有12个样品产生紫色的阳性斑点(图3)，样品同时用PCR方法进行分析，结果表明所有dot-ELISA检测到的阳性样品中均能扩增到BYDV PAV的特异性基因片段，而所有阴性样品中均未扩增到任何基因片段。PCR产物核酸测序表明dot-ELISA检测阳性样品确实感染BYDV PAV，说明该dot-ELISA方法能准确、可靠地用于植物样品中大麦黄矮病毒PAV株系的检测。
3.大麦黄矮病毒PAV株系dot-ELISA检测试剂盒
1)试剂盒主要成分：
以上试剂均保存于4℃下
硝酸纤维素膜(NC) 10张
2)检测植物样品检测的操作步骤：
a.将植物样品称重后用液氮在研钵中研磨成粉末，按1:20的比例(w/v,g/mL)加入0.01M PBS(pH7.4)后继续研磨、匀浆3min；
b.匀浆液5 000rpm离心3min；
c.取3μL上清点到NC上，同时设置健康和感染BYDV PAV的小麦植物组织粗提液分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20min；
d.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；
e.NC膜放入1:5 000倍稀释的单抗中室温孵育30-60min；
f.用PBST洗膜3-4次，每次3min，然后将NC膜放入1:6 000倍稀释的AP酶标记的羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；
g.用PBST洗膜4-5次，每次3min，66μL NBT和33μL BCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl2，pH9.5)中并混匀，膜放入底物液中显色，肉眼观察结果；
h.待阳性对照显色明显紫色，而阴性对照没有任何显色时用自来水漂洗NC膜终止反应，拍照记录结果。
3)保存及有效期
于2-8℃避光保存，有效期12个月。
4)缓冲液配方：
磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH7.4)：
加蒸馏水950mL溶解后调pH至7.4，定容至1000mL
ELISA洗涤液(0.01M PBST)：
1000mL 0.01M PBS中加0.5mL Tween-20
ELISA封闭液：
0.01M PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5％(w/v)。
Claims (3)
1. 一种分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系单克隆抗体的杂交瘤细胞株24G4，其特征在于能分泌抗大麦黄矮病毒 PAV株系的特异性单抗，杂交瘤细胞株24G4于2016年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 13298。
2. 一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株24G4分泌的抗大麦黄矮病毒 PAV株系的单克隆抗体，其特征在于该单抗腹水间接ELISA效价达10-9，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链；利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现该单抗检测感染大麦黄矮病毒PAV株系的小麦病叶的灵敏度分别达到1:81 920和1:1 280倍稀释；该单抗仅与大麦黄矮病毒 PAV株系有特异性免疫反应，而与小麦矮缩病毒、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GPV株系和 GAV株系以及健康小麦植物组织均不发生任何免疫反应。
3. 一种如权利要求2所述的抗大麦黄矮病毒 PAV株系的单克隆抗体在该病毒检测上的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611207954.5A CN106636008B (zh) | 2016-12-23 | 2016-12-23 | 分泌抗大麦黄矮病毒pav株系单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611207954.5A CN106636008B (zh) | 2016-12-23 | 2016-12-23 | 分泌抗大麦黄矮病毒pav株系单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106636008A CN106636008A (zh) | 2017-05-10 |
| CN106636008B true CN106636008B (zh) | 2019-04-09 |
Family
ID=58826902
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201611207954.5A Active CN106636008B (zh) | 2016-12-23 | 2016-12-23 | 分泌抗大麦黄矮病毒pav株系单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106636008B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5910628A (en) * | 1996-05-20 | 1999-06-08 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Cap-independent translation sequences derived from barley yellow dwarf virus |
| CN103911349A (zh) * | 2014-03-21 | 2014-07-09 | 浙江大学 | 分泌抗大麦黄矮病毒gav株系单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
| WO2015144692A1 (en) * | 2014-03-24 | 2015-10-01 | Institut National De La Recherche Agronomique | Expression decrease of the gene coding for the ephrin receptor in aphids inhibits the transmission of the turnip yellow virus |
-
2016
- 2016-12-23 CN CN201611207954.5A patent/CN106636008B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5910628A (en) * | 1996-05-20 | 1999-06-08 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Cap-independent translation sequences derived from barley yellow dwarf virus |
| CN103911349A (zh) * | 2014-03-21 | 2014-07-09 | 浙江大学 | 分泌抗大麦黄矮病毒gav株系单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
| WO2015144692A1 (en) * | 2014-03-24 | 2015-10-01 | Institut National De La Recherche Agronomique | Expression decrease of the gene coding for the ephrin receptor in aphids inhibits the transmission of the turnip yellow virus |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Monoclonal antibodies to an isolate of barley yellow dwarf virus from Victoria, Australia;D.R.Hewish;《Australasian Plant Pathology》;19871231;第16卷(第1期);第1-2页，尤其是第1页摘要部分，第2页第2段、结果部分 * |
| 大麦黄矮病毒分离物间单克隆抗体的差异;H.T.Hsn等;《国外农学——麦类作物》;19851231(第6期);第44-46页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106636008A (zh) | 2017-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109897829B (zh) | 分泌抗柑橘黄龙病菌单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN104357401B (zh) | 可分泌抗ii型登革病毒ns1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用 | |
| CN105543176B (zh) | 分泌抗马铃薯y病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN104404000B (zh) | 分泌抗烟草花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN104450623B (zh) | 分泌抗番茄斑萎病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN105671001B (zh) | 分泌抗南方菜豆花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN105567646B (zh) | 分泌抗甘蔗花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN105543177B (zh) | 分泌抗柑橘黄化脉明病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN104513810B (zh) | 分泌抗黄瓜花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN105624121B (zh) | 分泌抗番茄黑环病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN106636008B (zh) | 分泌抗大麦黄矮病毒pav株系单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN108165533B (zh) | 分泌抗水稻条纹花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN103911351B (zh) | 分泌抗香蕉束顶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN102559603A (zh) | 分泌抗番茄黄化曲叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN104513811B (zh) | 分泌抗西瓜花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN110904053B (zh) | 分泌抗凤果花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN105624120B (zh) | 分泌抗马铃薯s病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN105567643B (zh) | 可分泌抗ev71病毒蛋白vp1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用 | |
| CN108486065B (zh) | 分泌抗水稻瘤矮病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN110257341B (zh) | 分泌抗马铃薯m病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN102559602B (zh) | 分泌抗南方水稻黑条矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN106636009B (zh) | 分泌抗小麦矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN104450624A (zh) | 分泌抗玉米褪绿斑驳病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN104513812B (zh) | 分泌抗鸢尾黄斑病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN104513809B (zh) | 分泌抗小西葫芦黄化花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |