CN104404000B

CN104404000B - 分泌抗烟草花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

Info

Publication number: CN104404000B
Application number: CN201410627312.5A
Authority: CN
Inventors: 吴建祥; 周雪平; 谢艳
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-11-10
Filing date: 2014-11-10
Publication date: 2017-08-04
Anticipated expiration: 2034-11-10
Also published as: CN104404000A

Abstract

本发明公开了一种分泌抗烟草花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用纯化的烟草花叶病毒（TMV）的病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗TMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株3A7，其保藏号为CGMCC No.9338。该杂交瘤细胞株分泌的单抗腹水间接ELISA效价达10^‑8，抗体类型及亚类为IgG1，kappa链。该株单抗与TMV有特异性反应。利用3A7单抗建立的检测烟草等植物中TMV的dot‑ELISA检测病毒。该杂交瘤细胞株3A7及其单抗的获得和相关血清学检测方法的建立为该病毒病的诊断、检测及科学防控提供技术和物质支撑。

Description

分泌抗烟草花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗烟草花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus ，TMV)是植病毒中较重要的病毒之一．也是烟草花叶病毒属的模式种。它是一种RNA病毒，病毒粒体为棒状，长度为300～310 nm、直径18 nm；TMV基因组为单链正义RNA，病毒基因组长6.3～6.6kb，其基因组5’端含有帽子结构，有70个核苷酸左右的非编码区(UTR)；3’端的UTR长200～400nt，能折叠成类似tRNA状结构。基因组至少编码4种蛋白，靠5’端的124~132kDa及181～189kDa两个蛋白与病毒的复制有关，其中181～189kDa蛋白是由124～132kDa蛋白终止子通读产生。另外两个蛋白分别为28～31lkDa的移动蛋白(MP)和17~18kDa的外壳蛋白(CP)，这两个蛋白分别由不同的亚基因组RNA表达产生。

TMV的寄主范围非常广，可侵染十字花科、茄科、菊科、藜科及苋科等36科150多个属350种植物，包括烟草、番茄、茄子、辣椒、菠菜等，导致烟草和番茄等作物的严重危害。全世界每年因TMV而造成的经损失就超过l亿美元。烟草业在我国经济中占据着重要的地位，而烟草花叶病严重危害烟叶的产量和质量，成为影响优质烟叶生产的关键因素，使烟叶出口所面临的挑战，同时给我国造成巨大的经济损失。不同条件下同种病毒的症表现状有很大差异，而不同病毒在烟叶上表现为相似的症状，因此建立烟草花叶病毒病检测体系对于烟叶病毒病的防治有重要意义。

为了掌握烟草花叶病毒（TMV）病害在我国的发病危害状况，强化我国烟草花叶病毒病早期监测和预警，科学指导防控，急需建立检测烟草花叶病毒病的高通量检测方法，而目前没有这种高通量的检测方法，仅用低效率的电镜观察、RT-PCR方法、核酸电泳等方法进行小样本检测。本发明提纯的TMV病毒为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌抗TMV的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞3A7，以制备的单抗为核心可建立检测TMV的高通量的血清学方法及其试剂盒，从而为我国烟草花叶病毒病检测、早期监测和预警、科学指导防控提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗烟草花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

分泌抗烟草花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株3A7，它能分泌抗烟草花叶病毒的特异性单克隆抗体, 杂交瘤细胞株3A7于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 9338。

抗烟草花叶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-8，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与烟草花叶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，该单克隆抗体检测病叶的灵敏度达到1:81920倍稀释。

抗烟草花叶病毒的单克隆抗体仅与烟草花叶病毒有特异性免疫反应，而与番茄花叶病毒、齿兰环斑病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、小西葫芦黄化花叶病毒、黄瓜花叶病毒、瓜类褪绿黄化病毒、菜豆普通花叶病毒、水稻黑条矮缩病毒、芜菁花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒、油菜花叶病毒、番茄斑萎病毒、建兰花叶病毒均不发生免疫反应。

抗烟草花叶病毒单克隆抗体在抗烟草花叶病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1）提供的杂交瘤细胞株3A7分泌抗烟草花叶病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA和ACP-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测烟草花叶病毒；2）利用本发明所制备的单克隆抗体检测烟草花叶病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3）利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间作物中的烟草花叶病毒的检测。

附图说明

图1是dot-ELISA方法检测TMV的灵敏度分析。

具体实施方式

分泌抗烟草花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株3A7于2014年7月3日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCC No. 9338，它能分泌抗烟草花叶病毒的单克隆抗体。

抗烟草花叶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明提供的杂交瘤细胞株3A7能大量分泌抗烟草花叶病毒单抗，且其分泌的单抗特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立的检测TMV的高通量的血清学方法及其检测试剂盒可成功应用于田间TMV的检测，从而为我国烟草花叶病毒病早期监测和预警、检测和科学指导防控提供物质和技术支持。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、杂交瘤细胞的获得及其单克隆抗体的制备

1.免疫原及检测抗原的制备

用下面的操作步骤提纯病毒粒子：

1)将大研钵和组织搅拌器预冷；

2)称取500g烟草病叶，每100g病叶中加入 pH 7.5的0.5M磷酸盐缓冲液(即 PB缓冲液）200ml（含0.01M Na-EDTA和0.1%巯基乙醇），匀浆2分钟后用双层尼龙纱布过滤，滤液离心（6000r/min, 20min）去植物组织残渣；

3)所得上清液边搅拌边滴加2.5% Triton X-100, 4% PEG（分子量为6000）和0.1mol/L NaCl, 4℃搅拌4h以上；

4)离心（11000r/min, 15min）得沉淀；

5)沉淀用pH 7.5的0.5M PB (含0.01M MgCl₂和0.5M脲)充分洗涤，离心（6000r/min, 15min）后吸出上清置于离心管，沉淀再洗涤，离心反复3次；

6)合并上清液，超速离心（33000r/min，100min）所得沉淀悬浮后离心（8000r/min, 15min）；

7)合并上清液再超离心（33000r/min，100min），离心管底部加有20%-30%蔗糖垫；

8)所得沉淀用pH 7.5的0.5M PB (含0.01M MgCl₂）悬浮，悬浮液即为病毒提纯液；

9）用电子显微镜观察提纯样品，发现大量高纯度的烟草花叶病毒粒子。

2.免疫动物

用TMV提纯病毒免疫四周龄体重18-20g BALB/C 雌性小鼠。即TMV提纯病毒粒子35µL/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按6：1的比例，在无血清的RPMI-1640（Gibco）培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50 % PEG（Sigma，分子量1500）作为融合剂，在37℃下水浴下加入1ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5 % CO2的细胞培养箱中培养。

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-30%时，以感染TMV病毒的烟草叶片和提纯病毒为抗原包被，用常规间接ELISA方法筛选分泌单抗的阳性孔，共获130个阳性孔。选择15个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗TMV的特异性单抗的杂交瘤细胞株3A7。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5. 单克隆抗体的特异性检测

用感染番茄花叶病毒、齿兰环斑病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、小西葫芦黄化花叶病毒、黄瓜花叶病毒、瓜类褪绿黄化病毒、菜豆普通花叶病毒、水稻黑条矮缩病毒、芜菁花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒、油菜花叶病毒、番茄斑萎病毒、建兰花叶病毒、烟草花叶病毒的病叶汁包被ELISA板，以相应的健叶提取液作阴性对照，以感染烟草花叶病毒的病叶汁液为阳性对照，用ACP-ELISA法测定单抗的特异性反应。ACP-ELISA方法具体为：上述病毒感染的病叶用液氮研磨成粉末，按1: 30（w/v, g /mL）加入ELISA包被液研磨后100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2小时，使其吸附于ELISA聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1-10％的脱脂奶粉或1-3％ BSA或3-6％牛血清封闭30-60min；加入适当稀释的单抗100ul/孔，37℃ 1-2 小时；PBST洗涤三次后加入10000倍稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记羊抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃ 1-2小时，PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色，2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD₄₀₅的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，3A7单抗对TMV有特异性反应，而与番茄花叶病毒、齿兰环斑病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、小西葫芦黄化花叶病毒、黄瓜花叶病毒、瓜类褪绿黄化病毒、菜豆普通花叶病毒、水稻黑条矮缩病毒、芜菁花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒、油菜花叶病毒、番茄斑萎病毒、建兰花叶病毒和健康植物均无特异性反应。

6.单克隆抗体腹水制备及纯化

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。

7.单克隆抗体的类型及亚类鉴定和腹水效价测定

将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG₁、 IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果显示，3A7单抗亚类为IgG1、kappa链。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果为上述单抗腹水效价达到10^－8。

二、病毒免疫学检测方法及其试剂盒

1.以单抗为核心建立抗原包被ELISA（ACP-ELISA）方法检测病毒

ACP-ELISA方法的操作步骤：

（1）用0.05M碳酸盐缓冲液（pH9.6）按1: 30（w/v, g /mL）倍稀释的病叶汁液100ul/孔加入ELISA板，以TMV病叶为阳性对照，健叶为阴性对照，37℃ 2h，或4℃过夜；

（2）PBST洗涤后用5%脱脂奶粉封闭30min；

（3）单抗腹水5000倍稀释后100ul/孔，37℃ 1h；

（4）PBST洗涤后加入10000倍稀释的碱性磷酸脂酶（AP）标记的羊抗鼠IgG二抗（Sigma），100ul/孔，37℃，1h；

（5）用PBST洗涤后加入硝基磷酸盐底物100ul/孔，室温30min；

（6）用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，或用2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用酶联免疫检测仪测OD405，以P/N> 2.1作为阳性判断标准。

检测结果发现该单抗建立的上述ACP-ELISA方法能很好地检测植物样品中的TMV病毒。

ACP-ELISA方法进行灵敏度检测：

单抗腹水工作浓度为5000倍稀释，对病叶从1：20至40960作倍比稀释分别以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述ACP-ELISA方法检测。结果表明ACP-ELISA方法对1：40960倍稀释的病叶汁液检测仍呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1：40960，表明ACP-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。

2. dot-ELISA方法的建立及田间检测应用

2.1 dot-ELISA检测植物中TMV方法的建立及其田间样品检测

将病叶称重后用液氮研磨成粉末，按1:10-30（w/v, g /mL）加入0.01 mol/L PBS（pH7.4）后研磨；病汁液 5000 rpm离心3 min; 取3 μl上清点到硝酸纤维素膜（NC）上，同时设置健康和感病病叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min； NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60 min；用PBST洗膜3-4次，每次3 min；NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60 min; PBST洗膜4-5次，每次3 min; 66 μL NBT和33 μL BCIP底物(Promega)加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果。待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

用方阵试验确定检测病叶的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明3A7单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5000和1:8000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测TMV的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当烟草叶片稀释到1:20480倍（w/v, g/mL）时，以3A7单抗建立的dot-ELISA 检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:20480倍稀释（图1）。

用建立的dot-ELISA方法对2014年采自浙江温岭田间疑似发病样品进行检测，结果发现，89个检测样品中有51个样品产生紫色的阳性斑点，阳性样品进一步用PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到TMV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染TMV。说明该dot-ELISA方法能准确、可靠地用于植物样品中烟草花叶病毒的检测。

3.检测TMV的TAS-ELISA检测方法

TAS-ELISA 方法的操作流程：

1) 1:5000倍稀释的抗TSWV的兔抗血清（由纯化的TSWV粒子免疫兔子制备）100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，过夜；

2)PBST洗涤三次后加1-10％的脱脂奶粉或1-3％ BSA或3-6％牛血清封闭200ul/孔于37℃封闭30-60min

3)加入检测样品100ul/孔。以TMV病叶为阳性对照，以相应的健康样品为阴性对照，37℃ 1-2h；

4)洗涤后用封闭液稀释5000倍的单抗腹水100ul/孔，37℃ 1-2h

5)PBST洗涤后加入10000倍稀释的AP标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma）100ul/孔，37℃1-2h

6) PBST洗涤后加PNPP底物于室温显色50min，肉眼观察底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用680型酶联免疫检测仪测405nm的OD值，以P/N>2.1作为阳性判断标准。。

TAS-ELISA 检测方法最适条件的确定：

采用TAS-ELISA 方阵试验进行，即横向分别加用包被缓冲液从1﹕100至1﹕102400倍比稀释的兔抗TMV血清；加入TMV 病叶汁；纵向分别加用封闭液从1﹕5至1﹕2048000倍比稀释单抗腹水；AP标记的兔抗鼠IgG二抗按Sigma公司说明书稀释，1﹕10000倍；按TAS-ELISA方法流程进行操作。结果为TMV的兔抗血清及单抗的最适稀释度分别为1﹕5000、1﹕8000。

TAS-ELISA 方法检测灵敏度的确定

在兔抗血清和单抗腹水最适工作浓度下，将TMV病叶汁用PBS倍比稀释后进行TAS-ELISA测定，结果为：TAS-ELISA 检测病叶的灵敏度达到1:81920倍稀释（w/v, g /mL），说明本方法具有很好的灵敏度。

4.烟草花叶病毒dot-ELISA检测试剂盒

1）试剂盒主要成分：

TMV 单克隆抗体1管 0.2 ml

AP标记羊抗鼠IgG二抗 1管 0.1 ml

NBT/BCIP底物各1瓶分别为2 ml和1ml

阳性对照1（含TMV叶片汁液） 1管 2 ml

阴性对照1（健康烟草叶片汁液）1管 2 ml

抗体稀释液（10X） 1瓶 80ml

以上试剂均保存于4℃下

硝酸纤维素膜(NC)10张

2）检测的操作步骤：

a.将植物叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10～30（w/v, g /mL）加入0.01mol/L PBS（pH7.4）后研磨；

b.病汁液 5000 rpm离心3 min;

c. 取3 μl上清点到NC上，同时设置健康和感病烟草叶汁分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20 min;

d. NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min；

e. NC膜放入1:2000倍稀释的单抗中室温孵育30-60 min；

f. 用PBST洗膜3-4次，每次3 min； NC膜放入1:3000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60 min;

g. PBST洗膜4-5次，每次3 min; 66 μL NBT和33 μL BCIP底物加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果；

h. 待阳性对照显色明显（紫色），而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

3）保存及有效期于2～8℃避光保存，有效期12个月。

4）缓冲液配方：

磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH7.4）：

NaCl 8 g

KCl 0.2 g

KH₂PO₄ 0.2 g

Na₂HPO₄12H₂O 3g

叠氮化钠 0.2 g

加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000 ml

ELISA洗涤液（0.01 mol/L PBST）：

1000 ml 0.01mol/L PBS中加0.5 ml Tween-20

ELISA封闭液：

0.01 mol/L PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5%（W/V）。

Claims

1.一种分泌抗烟草花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株3A7，其特征在于能分泌抗烟草花叶病毒的特异性单克隆抗体, 杂交瘤细胞株3A7于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9338。

2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株3A7分泌的抗烟草花叶病毒的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-8，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与烟草花叶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，该单克隆抗体检测病叶的灵敏度达到1:81920倍稀释。

3.如权利要求2所述的杂交瘤细胞株3A7分泌的抗烟草花叶病毒的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体仅与烟草花叶病毒有特异性免疫反应，而与番茄花叶病毒、齿兰环斑病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、小西葫芦黄化花叶病毒、黄瓜花叶病毒、瓜类褪绿黄化病毒、菜豆普通花叶病毒、水稻黑条矮缩病毒、芜菁花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒、油菜花叶病毒、番茄斑萎病毒、建兰花叶病毒均不发生免疫反应。

4.一种如权利要求2所述的抗烟草花叶病毒单克隆抗体在烟草花叶病毒检测上的应用，其特征在于应用于以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。