CN105543176B - 分泌抗马铃薯y病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 - Google Patents
分泌抗马铃薯y病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种分泌抗马铃薯Y病毒(PVY)单抗杂交瘤细胞株及其单抗的应用。利用差速离心法提纯的PVY病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗PVY单抗的杂交瘤细胞株3B2，其保藏号为CGMCC No.12001。该细胞株分泌单抗腹水间接ELISA效价达10‑7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与30kDa的PVY外壳蛋白有特异反应。利用3B2单抗建立检测作物上PVY的ACP‑ELISA、dot‑ELISA和Tissue blot‑ELISA检测方法，其中ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法检测病叶的灵敏度分别达到1:81920和1:10240倍稀释(w/v,g/mL)。抗PVY单抗的制备及其检测方法的建立为该马铃薯病毒病的诊断和检测、流行病学分析及科学防控提供物质和技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗马铃薯Y病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
背景技术
马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是危害马铃薯、烟草等农作物的重要病毒之一，在全球广泛传播并造成严重经济损失。PVY是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的代表成员，1931年由Smith在马铃薯中首次发现。马铃薯Y病毒属是植物病毒中最大的属，确定和可能的种约有200个，该属的病毒能侵染茄科、藜科、豆科、葫芦科等多种植物并造成重大的经济损失。自1953年起PVY在欧洲马铃薯种植区广泛流行，20世纪70年代该病毒扩展到美洲，到上世纪90年代初该病毒在亚洲开始发生流行，目前该病毒在世界各地均有发生危害。PVY引起的症状因寄主品种和病毒株系的不同而有所差异，典型的症状包括重型花叶、叶脉坏死、垂叶条斑坏死等，可引起马铃薯产量损失高达80％。研究发现PVY的初侵染源主要是带毒种薯，病原通过种薯调运可作远距离扩散，在马铃薯田块PVY也可以通过病汁液和携毒蚜虫传播。PVY粒子为弯曲线状，无包膜，大小为730×11nm，基因组全长约10kb，5’-末端共价结合基因组连接病毒蛋白(genome-linked viral protein,VPg)，3’-末端有Ploy(A)。基因组只包含1个大的ORF，编码1个约360kDa的多聚蛋白，该多聚蛋白可裂解成11个成熟的功能蛋白，其中包括一个29.8kDa的外壳蛋白。
防治PVY主要采用抗病毒育种和生产无毒种薯的方法，而快速、准确、灵敏、特异的病毒检测技术是抗病毒育种和生产无毒种薯的关键。与常规的指示植物检测、电镜检测、分子生物学检测等方法相比，血清学方法具有简单、经济、易操作、可大规模检测等优点。目前已有关于PVY抗体制备和血清学方法的报道，但已报道的PVY抗体和血清学方法的检测灵敏度欠佳，为此，本发明以纯化的PVY病毒粒子作为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌抗PVY的特异、灵敏单抗的杂交瘤细胞株，以分泌的单抗为核心建立检测PVY的高通量的血清学方法及试剂盒，从而为我国PVY的检测和诊断、流行病学的调查、无毒种薯的生产、病毒基因组功能的分析及其科学防控体系的建立提供物质和技术支持。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗马铃薯Y病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用。
分泌抗马铃薯Y病毒单抗杂交瘤细胞株3B2，它能分泌抗马铃薯Y病毒单抗，杂交瘤细胞株3B2于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12001。
一种所述的杂交瘤细胞株分泌的抗马铃薯Y病毒单抗，抗马铃薯Y病毒单抗腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，与马铃薯Y病毒30KDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现单抗检测感染马铃薯Y病毒病叶的灵敏度分别达到1:81 920和1:10 240倍稀释(w/v,g/mL)。
抗马铃薯Y病毒单抗与感染马铃薯Y病毒的植物组织有特异性免疫反应，而与感染马铃薯A病毒、马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯卷叶病毒及健康的烟草和马铃薯叶片组织均不发生免疫反应。
抗马铃薯Y病毒单抗在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法及免疫学试剂盒。
本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株能大量稳定分泌抗PVY特异、灵敏的单抗，以分泌的单抗为核心建立的ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissueblot-ELISA等血清学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏地检测植物中的马铃薯Y病毒；2)利用本发明所制备的单抗检测PVY，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本发明所制备的单抗，可有效地用于田间植物中PVY的检测和诊断，也可用于该病毒病的流行病学调查、病毒基因组功能分析、脱毒种薯生产、抗性育种、科学防控等方面。
附图说明
图1dot-ELISA方法检测马铃薯Y病毒的特异性分析。
图2dot-ELISA方法检测PVY的灵敏度分析。
图3dot-ELISA方法检测田间植物样品中PVY的结果。
图4RT-PCR方法对检测田间植物样品中PVY的结果。
图5Tissue blot-ELISA方法田间检测植物样品中PVY的结果。
生物保藏
杂交瘤细胞株3B2于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCCNo.12001,分类命名为分泌抗马铃薯Y病毒(PVY)单抗杂交瘤细胞。
具体实施方式
分泌抗马铃薯Y病毒单抗杂交瘤细胞株3B2，它能分泌抗马铃薯Y病毒单抗，杂交瘤细胞株3B2于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12001。
一种所述的杂交瘤细胞株分泌的抗马铃薯Y病毒单抗，抗马铃薯Y病毒单抗腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，与马铃薯Y病毒30KDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现单抗检测感染马铃薯Y病毒病叶的灵敏度分别达到1:81 920和1:10 240倍稀释(w/v,g/mL)。
抗马铃薯Y病毒单抗与感染马铃薯Y病毒的植物组织有特异性免疫反应，而与感染马铃薯A病毒、马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯卷叶病毒及健康的烟草和马铃薯叶片组织均不发生免疫反应。
抗马铃薯Y病毒单抗在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法及免疫学试剂盒。
本发明提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗PVY单抗，且该细胞株分泌的单抗特异性强、效价高、稳定性好、灵敏度高。以该单抗为核心建立检测PVY的高通量的血清学方法可成功应用于田间植物中PVY的检测，从而为我国马铃薯Y病毒病检测和诊断、脱毒种薯的生产、科学防控提供物质和技术支持。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备
1.免疫原及检测抗原的制备
用下面的操作步骤提纯病毒粒子：
1)将组织匀浆器在冰上预冷；
2)称取感染PVY的烟草组织200g，每100g组织加入200mL 0.5M磷酸盐缓冲液即PB缓冲液(含0.01M Na-EDTA和0.1％巯基乙醇，pH 7.5)，在组织匀浆器中匀浆5-10min，使烟草组织充分匀浆，用双层棉纱布过滤匀浆液，滤液6 000rpm离心20min去除植物残渣；
3)所得的离心上清液在搅拌中加至终浓度为2.5％Triton X-100、4％PEG(分子量为6 000)和0.1M NaCl，然后4℃搅拌4h以上；
4)11 000rpm离心15min去上清；
5)用10mL pH 7.5的0.5M PB(含0.01M MgCl2和0.5M脲)将沉淀充分悬浮，6000rpm离心15min后将上清收集于烧杯中,放置于4℃，沉淀再悬浮、离心，重复3次；
6)将上述离心上清液合并，33 000rpm超速离心100min；
7)所得沉淀用0.5M PB悬浮后8 000rpm离心15min，收集上清液，沉淀再悬浮、离心，重复3次；
8)将合并上清液加到超离管中，用注射器针头吸取20mL 30％蔗糖加到超离管的底部形成蔗糖垫，33 000rpm超速离心100min；
9)所得沉淀用适量pH 7.5的0.01M PB(含0.01M MgCl2)悬浮，33 000rpm超速离心100min，去上清；
10)所得沉淀用0.01M PB悬浮，所得悬浮液即为病毒提纯液；
11)病毒提纯液经3％磷钨酸(pH 6.7)负染后，置于JEOL JEM-1200EX电镜下观察发现大量高纯度的PVY粒子。
2.免疫动物
用提纯的PVY病毒粒子免疫8周龄体重BALB/c雌性小鼠：PVY病毒粒子100μL/只与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后，经腹部皮下多点注射0.2mL每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2mL每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3d后取脾细胞进行融合。
3.细胞融合
取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5:1的比例在无血清的RPMI-1640(Gibco)培养基中混匀，1 500rpm离心5min后去除培养基，含有细胞的离心管在37℃水浴中加入1mL 50％PEG(分子量1500)融合剂，融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1 500rpm离心5min，吸去上清后沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔细胞板中，37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。
4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆
细胞培养箱中培养5d后用HAT培养基换液一次，第10d用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5％-20％时，以感染PVY的马铃薯病叶粗提液为包被抗原用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获298个阳性孔。对298个孔进行特异性和灵敏度分析，筛选出8个特异和灵敏的细胞孔，进行细胞有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗PVY的特异、灵敏单抗的杂交瘤细胞株3B2。经4个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于单抗腹水制备和液氮保存。
5.单克隆抗体腹水制备及纯化
8周龄左右BALB/c小鼠腹腔注射0.3mL降植烷，7-10d后腹腔注入7×105个杂交瘤细胞，7-10d后可见小鼠腹部明显膨大，用针头采取腹水，8 000rpm离心3min，收集上清液即为单抗腹水。
取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，室温下边加边搅拌加辛酸(30μl/mL腹水)，4℃澄清1h，1 2000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2h，3 000rpm离心20min，沉淀用2倍腹水体积的PBS溶液溶解，在4℃透析24h后即获纯化的单抗，-70℃保存。
6.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定
将纯化的单抗与Sigma公司的标准抗BALB/c小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM抗体进行DAS-ELISA检测，检测结果表明，3B2单抗类型及亚类为IgG1、kappa轻链。以提纯的PVY病毒粒子为抗原，用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，分析结果表明单抗腹水效价达10-7。
7.单克隆抗体的特异性检测
用感染马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯S病毒(PVS)和马铃薯卷叶病毒(PLRV)的病叶粗提液包被ELISA板，以健康的烟草、马铃薯叶片粗提液作阴性对照，以感染PVY的烟草病叶粗提液为阳性对照，用常规ACP-ELISA方法分析单抗的特异性。特异性分析结果发现，3B2单抗对感染PVY病叶组织有特异性免疫反应，而与感染PVA、PVX、PVS和PLRV的病叶和健康烟草、马铃薯组织粗提液均无任何反应。
二、检测PVY免疫学方法及其试剂盒的建立
1.检测PVY的ACP-ELISA方法
1.1ACP-ELISA方法的步骤：
1)病叶和健康叶片分别称重后放入研钵中，按1:20的比例(w/v,g/mL)加入ELISA包被液后研磨、匀浆；匀浆液5 000rpm离心3min；离心上清100μL/孔包被聚苯乙烯板，以感染PVY的烟草组织作为阳性对照，以健康的烟草、马铃薯组织作阴性对照，37℃2h或；4℃过夜
2)PBST洗板3次，每次3min，每孔加入250μL含3％脱脂奶粉的PBST封闭液，37℃封闭0.5h；
3)PBST洗涤3次后用封闭液适当稀释的单抗腹水100μL/孔，37℃1-2h；
4)PBST洗涤3次后加入适当稀释的AP标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma)100μL/孔，37℃1-2h；
5)PBST洗涤4次后加PNPP底物于室温显色30-60min，肉眼观察底物颜色变，显色成黄绿色孔的样品为阳性，或2M氢氧化钠终止反应后，用680型酶联免疫检测仪测405nm的OD值，以P/N>2.1作为阳性判断标准。
1.2ACP-ELISA检测方法的建立：
采用方阵试验确定抗体的工作浓度，即用1:20倍稀释的(w/v,g/mL)PVY病叶粗提液作为包被抗原包被聚苯乙烯板；ELISA板纵向从上而下分别加入用封闭液从1:100至1:12800倍比稀释的PVY单抗，横向从左到右分别加入用封闭液从1:1 000至1:512 000倍比稀释的AP标记的羊抗鼠IgG二抗，健康的烟草或马铃薯植物相应的稀释度的粗提液作为阴性对照，每个处理设3次重复，以P/N>2.1作为阳性判断标准，确定ACP-ELISA中抗体的最适工作浓度。结果显示3B2单抗以1:5 000倍稀释，而AP标记的羊抗鼠IgG二抗以1:7 000倍稀释为最适工作浓度，根据最适工作浓度建立检测PVY的ACP-ELISA方法。
1.3ACP-ELISA方法的灵敏度和特异性分析
将PVY病叶粗提液用包被液倍比稀释后用建立的ACP-ELISA方法测定，结果表明，ACP-ELISA检测病叶的灵敏度达到81 920倍稀释(w/v,g/mL)，说明制备的单抗和建立的方法具有很好的灵敏度。该方法检测PVY病叶粗提液呈很强的阳性反应，检测感染PVA、PVX、PVS和PLRV的病叶组织和健康的烟草、马铃薯组织呈阴性反应，且阴阳性结果对比差异极显著，说明该方法和单抗的特异性好。
2.dot-ELISA方法的建立及田间检测应用
dot-ELISA检测植物中PVY方法的步骤：将称重后的植物组织在研钵中研磨后按1:10-30比例(w/v,g/mL)加入0.01M PBS(pH7.4)后继续研磨、匀浆；匀浆液5 000rpm离心3min；取2.5μL上清点到硝酸纤维素(NC)上，同时设置健康和感染PVY的马铃薯叶片粗提液分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20min；NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60min；用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中，室温孵育30-60min；PBST洗膜4-5次，每次3min；66μL NBT和33μL BCIP底物(Promega)加入到10ml底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH9.5)中，混匀，膜放入底物液中显色，肉眼观察结果，待阳性对照显紫色明显而阴性对照没有任何显色时自来水漂洗膜终止反应，拍照记录结果。
用常规方阵试验确定检测马铃薯病叶的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明3B2单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5 000和1:8000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测PVY的dot-ELISA方法。特异性分析表明，该方法检测感染PVY的植物呈强阳性反应，而检测感染PVA、PVX、PVS、PLRV病叶及健康烟草和马铃薯叶片均呈阴性反应(图1)。灵敏度分析表明，当PVY病叶粗提液稀释到1:10 240倍(w/v,g/mL)时，用建立的dot-ELISA检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:10 240倍稀释(图2)。
用建立的dot-ELISA方法对2015年采自云南的田间疑似发病马铃薯样品进行检测，结果发现，30个马铃薯检测样品中有20个样品产生紫色的阳性斑点(图3)，样品同时用RT-PCR方法进行分析，结果表明所有dot-ELISA阳性样品中均扩增到PVY特异性的基因片段，而所有dot-ELISA检测阴性的样品中均未扩增到基因片段(图4)，PCR产物核酸测序表明阳性样品确实感染PVY。说明该dot-ELISA方法能准确、可靠地用于植物中PVY的检测。
3.检测PVY的Tissue blot-ELISA方法的建立及其田间样品检测
3.1Tissue blot-ELISA操作步骤:
1)样品准备：取作物的叶片或茎，将嫩叶卷成圆筒状用刀片切一个横断面，嫩茎直接切成横断面；
2)点样：将横断面在NC膜上按压3sec，同时将健康和感染PVY植物组织分别作为阴性和阳性对照，37℃烘箱干燥5min；
3)封闭：点样的NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01MPBS)封闭液中室温封闭30-60min；
4)一抗孵育：NC膜放入适当稀释的PVY单抗中室温孵育1h；
5)二抗孵育：用PBST洗膜3次后NC膜放入适当稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG中室温孵育1h；
6)PBST洗膜4-5次，每次3min；
7)加底物显色：10ml显色缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH9.5)中加入66μl NBT和33μl BCIP底物(Promega)混匀，将膜浸入显色液中进行显色反应，直至阳性显色明显、阴性对照没有背景时将膜在去离子水中漂洗终止反应，记录显色结果。
3.2Tissue blot-ELISA最适抗体工作浓度的确定及其田间样品检测
通过常规方阵实验确定Tissue blot-ELISA中单抗和酶标二抗的最适工作浓度。选择检测灵敏度和特异性最佳的单抗和酶标二抗稀释度组合为Tissue blot-ELISA的最适工作浓度。结果发现单抗3B2和AP标记的羊抗鼠二抗分别稀释1:5000和1:8000倍时Tissueblot-ELISA方法的检测灵敏度和特异性最佳，根据抗体最适工作浓度建立Tissue blot-ELISA方法。用建立的Tissue blot-ELISA方法对2015年采自云南的田间疑似发病马铃薯样品进行检测，结果发现，30个马铃薯检测样品中有20个样品产生紫色的阳性斑点(图5)，样品同时用RT-PCR方法进行分析，结果表明所有Tissue blot-ELISA阳性样品中均扩增到PVY特异性的基因片段，而所有Tissue blot-ELISA检测阴性的样品中均未扩增到基因片段(图4)，PCR产物核酸测序表明阳性样品确实感染PVS。说明该Tissue blot-ELISA方法能准确、可靠地用于马铃薯样品中马铃薯Y病毒的检测。
4.马铃薯Y病毒dot-ELISA检测试剂盒
1)试剂盒主要成分：
以上试剂均保存于4℃
硝酸纤维素膜(NC)10张
2)检测马铃薯样品的操作步骤：
a.将称重后的植物组织在研钵中研磨后按1:10-30比例(w/v,g/mL)加入0.01MPBS(pH7.4)后继续研磨、匀浆；
b.匀浆液5 000rpm离心3min；
c.取2.5μl上清点样于NC膜上，同时设置健康和感染PVY的马铃薯组织分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20min；
d.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；
e.NC膜放入1:3 000倍稀释的单抗中室温孵育30-60min；
f.用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入1:3 000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；
g.PBST洗膜4-5次，每次3min；
h.66μl NBT和33μl BCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH9.5)中，混匀，膜放入底物液中进行显色反应，肉眼观察结果；
i.待阳性对照显色明显(紫色)，而阴性对照没有任何显色时在自来水中漂洗膜终止反应，拍照记录结果。
3)保存及有效期
于2-8℃避光保存，有效期12个月。
4)缓冲液配方：
磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)：
加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000mL
ELISA洗涤液(0.01M PBST)：1000mL 0.01M PBS中加0.5mL Tween-20
ELISA封闭液：0.01M PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5％(w/v,g/mL)。
Claims (5)
1.一种分泌抗马铃薯Y病毒单抗杂交瘤细胞株3B2，其特征在于能分泌抗马铃薯Y病毒单抗，所述的杂交瘤细胞株3B2于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12001。
2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株3B2分泌的抗马铃薯Y病毒单抗，其特征在于该单抗腹水间接ELISA效价达10-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，与马铃薯Y病毒30KDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现单抗检测感染马铃薯Y病毒病叶的灵敏度分别达到1:81920和1:10240倍稀释，单位为克/mL。
3.如权利要求2所述的抗马铃薯Y病毒单抗，其特征在于该单抗与感染马铃薯Y病毒的植物组织有特异性免疫反应，而与感染马铃薯A病毒、马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯卷叶病毒及健康的烟草和马铃薯叶片组织均不发生免疫反应。
4.一种如权利要求2所述的抗马铃薯Y病毒单抗在该病毒检测上的应用，其特征在于以所述单抗为核心建立免疫学检测方法检测该病毒。
5.一种如权利要求2所述的抗马铃薯Y病毒单抗在制备免疫学检测马铃薯Y病毒的试剂盒中的应用。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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