CN105637084B

CN105637084B - 新型乳酸菌、以新型乳酸菌作为有效成分的天然免疫活化剂以及含有新型乳酸菌的饮食品

Info

Publication number: CN105637084B
Application number: CN201480054895.5A
Authority: CN
Inventors: 关水和久; 西田智
Original assignee: Nature Holdings Co ltd; University of Tokyo NUC; Genome Pharmaceuticals Institute Co Ltd
Current assignee: Nature Holdings Co ltd; University of Tokyo NUC; Genome Pharmaceuticals Institute Co Ltd
Priority date: 2013-10-17
Filing date: 2014-10-17
Publication date: 2019-08-06
Anticipated expiration: 2034-10-17
Also published as: HK1219501A1; JP6505018B2; KR20160060676A; CN105637084A; JPWO2015056770A1; KR102267879B1; WO2015056770A1

Abstract

本发明涉及一种乳酸菌，其是属于乳球菌(Lactococcus)属的乳酸菌，该乳酸菌在日本国家技术与评价研究所(NITE)的专利微生物保藏中心(NPMD)的保藏号为NITE BP‑01694；以该乳酸菌作为有效成分的天然免疫活化剂；含有该乳酸菌或该天然免疫活化剂的饮食品；以及含有乳酸菌的发酵乳，该发酵乳对于选自由甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌以及蒙氏肠球菌组成的组中的至少一种细菌具有抵抗性。

Description

新型乳酸菌、以新型乳酸菌作为有效成分的天然免疫活化剂以及含有新型乳酸菌的饮食品

【技术领域】

本发明涉及新型乳酸菌、以新型乳酸菌作为有效成分的天然免疫活化剂以及含有新型乳酸菌的饮食品。

【背景技术】

乳酸菌自古以来被用于发酵食品，产业性地用于食品、医药品、益生菌的生产。乳酸菌具有革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、不形成内生胞子、无运动性的特征。

已知乳酸乳球菌(L.lactis)是非病原性的革兰氏阳性乳酸菌，其不属于人的肠内菌丛，不在口腔、肠管内形成菌落。另外，其全基因组已被解读，此外还进行了遗传学、载体系统、基因表达系统的分析。最近，报道了重组乳酸乳球菌被用于透过动物肠表皮的细胞因子或特异性抗原的原位合成、体内输送(非专利文献1～4)。

已知在天然免疫反应中，树突细胞、巨噬细胞这样的免疫细胞对来自细菌或病毒的天然免疫活化物质发生应答而产生细胞因子，引起之后的免疫反应。天然免疫机制是生物所共同具有的感染防御机制，该机制为非特异性的，因而具有反应迅速、对多种感染源有效地发挥功能的特征。

在人等高等脊椎动物中，从感染初期的抵抗性、癌症或生活习惯病的预防、组织修复等观点出发，也认为非特异性的天然免疫占据着比感染源特异性的获得性免疫更为重要的位置。

迄今为止，本发明人开发出了在蚕中能够简便地测定天然免疫活化反应的方法(专利文献1)。另外，本发明人开发出了利用仅具有天然免疫机制的生物得到的、针对具有获得性免疫机制的生物的病原微生物感染的模型(专利文献2)。

天然免疫机制的异常成为引起各种疾病的原因，因此，希望开发出能够根据需要对这样的天然免疫机制进行调节的优异的天然免疫活化剂或活化天然免疫的饮食品。

另外，关于作为食品的使用了乳酸杆菌属或双歧杆菌属的酸奶，报道了其整肠效果，但关于其作为酸奶食用时的天然免疫的活化并未得到确认。报道了乳酸菌保加利亚乳杆菌(L.burgalitics)所分泌的多糖具有天然免疫活化作用，但并非食用酸奶的实验(非专利文献5)。

另外，作为天然免疫活化的机理研究，据称乳酸菌所具有的双链RNA经由TLR3通路促进了树突细胞的IFNβ产生(非专利文献6)。认为双链RNA是在CRISPR-Cas9通路中形成的，但从乳酸乳球菌的基因组碱基序列中并未发现CRISPR-Cas9。但是，有报道称在乳酸乳球菌中CpGDNA经由TLR9通路活化了树突细胞的IFNβ产生(非专利文献7)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开2008/126905号

专利文献2：日本特开2007-327964号公报

非专利文献

非专利文献1：Robinson K,Chamberlain LM,Schofield KM,Wells JM,Le PageRW.Nat Biotechnol.1997Jul；15(7)653-7

非专利文献2：Steidler L,Robinson K,Chamberlain L,Schofield KM,RemautE,Le Page RW,Wells JM.Infect Immun.1998Jul；66(7)3183-9

非专利文献3：Steidler L,Hans W,Schotte L,Neirynck S,Obermeier F,FalkW,Fiers W,Remaut E.Science.2000Aug 25；289(5483)1352-5

非专利文献4：Steidler L,Neirynck S,Huyghebaert N,Snoeck V,Vermeire A,Goddeeris B,Cox E,Remon JP,Remaut E.Nat Biotechnol.2003Jul；21(7)785-9

非专利文献5：Makino S,Ikegami S,Kano H,Sashihara T,Sugano H,HoriuchiH,Saito T,Oda M.J Dairy Sci.2006Aug；89(8)：2873-81

非专利文献6：Kawashima T,Kosaka A,Yan H,Guo Z,Uchiyama R,Fukui R,Kaneko D,Kumagai Y,You DJ,Carreras J,Uematsu S,Jang MH,Takeuchi O,Kaisho T,Akira S,Miyake K,Tsutsui H,Saito T,Nishimura I,Tsuji NM.Immunity.2013 Jun 27；38(6)：1187-97

非专利文献7：Jounai K,Ikado K,Sugimura T,Ano Y,Braun J,Fujiwara D.PLoSOne.2012；7(4)：e32588

【发明内容】

【发明所要解决的课题】

本发明的课题在于提供具有高天然免疫活化能力的乳酸菌，另外在于提供以该乳酸菌、该乳酸菌的死菌或该乳酸菌的处理物作为有效成分的天然免疫活化剂以及含有该乳酸菌或该天然免疫活化剂的饮食品。

【用于解决课题的手段】

本发明人为了解决上述课题反复进行了深入研究，结果从猕猴桃中分离出了新型的乳酸菌。并且，使用专利文献1中公开的能够简便地测定天然免疫活化反应的方法进行了研究，结果确认到其具有比迄今已知的乳酸菌更高的天然免疫活化能力。

关于上述的具有天然免疫活化能力的乳酸菌，进行了其性状分析和16S rRNA碱基序列等的分析，结果明确了其为属于乳球菌(Lactococcus)属的新型乳酸菌株(下文中有时简称为“11/19-B1株”)。

另外，对于食用了含有上述乳酸菌的酸奶的蚕注射甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)或蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)，结果发现，感染了该细菌的蚕显示出高抵抗性，从而完成了本发明。

即，本发明提供一种乳酸菌，其属于乳球菌(Lactococcus)属，其在日本国家技术与评价研究所(NITE)的专利微生物保藏中心(NPMD)的保藏号为NITE BP-01694。

下文中，将该发明方式称为“方式1”。

另外，本发明提供一种天然免疫活化剂，其是以一种属于乳球菌属的乳酸菌、该乳酸菌的死菌或该乳酸菌的处理物作为有效成分的天然免疫活化剂，该乳酸菌以保藏号NITEBP-01694进行了保藏，该天然免疫活化剂的特征在于，上述乳酸菌的处理物为选自由乳酸菌的培养物；浓缩物；糊化物；喷雾干燥物、冷冻干燥物、真空干燥物、滚筒干燥物等干燥物；液化物；稀释物；破碎物；杀菌加工物以及来自该培养物的提取物组成的组中的至少一种处理物。

下文中，将该发明方式称为“方式2”。

另外，本发明提供一种饮食品，其含有以保藏号NITE BP-01694进行了保藏的属于乳球菌属的乳酸菌，另外提供含有上述天然免疫活化剂的饮食品。另外还提供一种饮食品，其是采用使用该乳酸菌进行发酵的工序而制造的。

下文中，将该发明方式称为“方式3”。

另外，本发明提供一种发酵乳，其是含有以保藏号NITE BP-01694进行了保藏的属于乳球菌属的乳酸菌的发酵乳，该发酵乳对于选自由甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌以及蒙氏肠球菌组成的组中的至少一种细菌具有抵抗性。

下文中，将该发明方式称为“方式4”。

【发明的效果】

根据本发明，能够提供一种具有比迄今已知的乳酸菌更高的天然免疫活化能力的新型乳酸菌。

此外，能够提供以该乳酸菌作为有效成分的天然免疫活化剂以及含有该乳酸菌或该天然免疫活化剂的饮食品。

另外，通过食用本发明的乳酸菌或含有乳酸菌的发酵乳，能够得到对于选自由甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、绿脓杆菌以及蒙氏肠球菌组成的组中的至少一种细菌的高抵抗性。

这些细菌是引起院内感染的病原菌，通过食用该发酵乳，能够预防或治疗由这些细菌所致的感染。

【附图说明】

图1(A)和图1(B)是对使蚕感染(A)绿脓杆菌以及(B)甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌时的11/19-B1酸奶的益生菌效果进行验证的曲线图。■表示食用含有11/19-B1酸奶的饵食的结果，◆表示食用常规饵食的结果。

图2(A)、图2(B)和图2(C)是对使蚕感染(A)甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌、(B)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌以及(C)蒙氏肠球菌时的11/19-B1酸奶的益生菌效果进行验证的曲线图。■表示食用含有11/19-B1酸奶的饵食的结果，◆表示食用常规饵食的结果。

图3(A)和图3(B)是对使蚕食用含有(A)11/19-B1酸奶以及(B)11/19-B1活菌粉末的饵食后感染绿脓杆菌时的益生菌效果进行验证的曲线图。■表示食用含有11/19-B1酸奶(A)或11/19-B1活菌粉末(B)的饵食的结果，◆表示食用常规饵食的结果。

图4(A)是表示通过改变饵食中含有的11/19-B1酸奶的量而带来的益生菌效果的变化的曲线图。图4(B)是表示酸奶摄取量和绿脓杆菌的LD₅₀的相关性的曲线图。

【具体实施方式】

下面对本发明进行说明，但本发明并不限于以下的具体方式，可以在技术思想的范围内任意进行变形。

<方式1>

本发明的方式1为一种乳酸菌，其属于乳球菌(Lactococcus)属，其在日本国家技术与评价研究所(NITE)的专利微生物保藏中心(NPMD)的保藏号为NITE BP-01694。

下面对该新型乳酸菌株(11/19-B1株)进行详细说明。

形态：该11/19-B1株是革兰氏阳性杆菌，未见鞭毛，无运动性。该菌株是以果实作为分离源而分离出的。

在培养基中的生长状况：

(1)在GAM和MRS琼脂培养基上形成白色菌落。未观察到扩散性色素。

(2)在加入有碳酸钙的MRS琼脂培养基上，伴随着乳酸的生成，观察到透明带的形成。

生理学性质：该11/19-B1株的生理学、化学分类学性质如下。

(1)对氧的态度：厌氧

(2)过氧化氢酶：-

(3)碱性磷酸酶：-

(4)酯酶：-

(5)酯酶脂肪酶：-

(6)脂肪酶：-

(7)亮氨酸芳基酰胺酶：-

(8)缬氨酸芳基酰胺酶：-

(9)胱氨酸芳基酰胺酶：-

(10)胰蛋白酶：-

(11)α-胰凝乳蛋白酶：-

(12)酸性磷酸酶：+

(13)萘酚-AS-BI-磷酸水解酶：+

(14)α-半乳糖苷酶：-

(15)β-半乳糖苷酶：-

(16)β-葡糖醛酸苷酶：-

(17)α-葡糖苷酶：-

(18)β-葡糖苷酶：-

(19)N-乙酰基-β-氨基葡糖苷酶：-

(20)α-甘露糖苷酶：-

(21)α-岩藻糖苷酶：-

(22)由下述糖类等生成酸和气体的能力

甘油(Glycerol)：-

赤藓糖醇(Erythritol)：-

D-阿拉伯糖(D-Arabinose)：-

L-阿拉伯糖(L-Arabinose)：+

D-核糖(D-Ribose)：+

D-木糖(D-Xylose)：+

L-木糖(L-Xylose)：-

D-核糖醇(D-Adonitol)：-

甲基-β-D-吡喃木糖(methyl-β-D-xylopyranoside)：-

D-半乳糖(D-Galactose)：±

D-葡萄糖(D-Glucose)：+

D-果糖(D-Fructose)：+

D-甘露糖(D-Mannose)：+

L-山梨糖(D-Sorbose)：-

L-鼠李糖(L-Rhamnose)：-

半乳糖醇(Dulcitol)：-

肌醇(Inositol)：-

D-甘露醇(D-Mannitol)：+

D-山梨糖醇(D-Sorbitol)：-

甲基-α-D-吡喃甘露糖苷(methyl-α-D-mannopyranoside)：-

甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷(methyl-α-D-glucopyranoside)：-

N-乙酰基葡糖胺(N-Acetyl glucosamine)：+

扁桃苷(Amygdalin)：±

熊果苷(Arbutin)：+

七叶苷(Esculin)：+

水杨苷(Salicin)：+

D-纤维二糖(D-Cellobiose)：-

D-麦芽糖(D-Maltose)：+

D-乳糖(D-Lactose)：+

D-蜜二糖(D-Melibiose)：-

D-蔗糖(D-Sucrose)：+

D-海藻糖(D-Trehalose)：+

胰岛素(Insulin)：-

D-松三糖(D-Melezitose)：-

D-棉子糖(D-Raffinose)：-

淀粉(Starch)：-

糖原(Glycogen)：-

木糖醇(Xylitol)：-

龙胆二糖(Gentiobiose)：+

D-松二糖(D-Turanose)：-

D-来苏糖(D-Lyxose)：-

D-塔格糖(D-Tagatose)：-

D-岩藻糖(D-Fucose)：-

L-岩藻糖(L-Fucose)：-

D-阿拉伯糖醇(D-Arabitol)：-

L-阿拉伯糖醇(L-Arabitol)：-

葡萄糖酸盐(Gluconate)：±

2-酮基-葡萄糖酸盐(2-Keto-gluconate)：-

5-酮基-葡萄糖酸盐(5-Keto-gluconate)：-

分子生物学分析结果：与作为分子生物学系统分类指标使用的16S rRNA相关的11/19-B1株的分析结果如下。

利用PCR由11/19-B1株的基因组DNA扩增出16S rRNA区域的碱基序列，利用测序仪进行分析，结果发现了相当于16S rRNA的大致全长(除了5’末端侧、3’末端侧的几个碱基以外)的碱基序列。该碱基序列在序列表的序列号1中示出。由于序列表的序列号1的碱基序列并非为16S rRNA的全长，因而称为16S rRNA“区域”。

利用NCBI的BLAST对该碱基序列进行同源性检索的结果是，11/19-B1株的16SrRNA区域的碱基序列与作为乳球菌属的乳酸乳球菌乳亚种IL1403、乳酸乳球菌霍氏亚种NCDO 2181、乳酸乳球菌乳亚种NCDO 604株的碱基序列(NR_103918、NR_040956、NR_040955)显示出99％的相同率。但是，并不完全一致，因而它们与11/19-B1株是不同的。

将上述11/19-B1株的性质与基于伯杰氏系统细菌学手册(Bergey’s Manual ofSystematic Bacteriology,vol.3 1989)的分类及其他文献的记载内容对照，进而考虑16SrRNA分析的结果来综合地进行判断，结果判断11/19-B1株为属于乳球菌(Lactococcus)属的微生物。

另外，将下述情况包括在内进行了综合判断：具有与11/19-B1株的16S rRNA区域的碱基序列一致的16S rRNA区域的碱基序列的微生物并不存在；与属于乳酸乳球菌的已知菌株相比，该11/19-B1株显示出高天然免疫活化能力；等等，结果判断11/19-B1株为新型微生物株。

11/19-B1株在千叶县木更津市上总镰足2-5-8、日本国家技术与评价研究所(Natural Institute of Technology and Evaluation，下文简称为“NITE”)的专利微生物保藏中心(NPMD)进行了日本国内保藏，是以保藏号：NITE P-01694(保藏日：2013年8月20日)进行了保藏的微生物。

关于“11/19-B1”，之后向千叶县木更津市上总镰足2-5-8、日本国家技术与评价研究所(NITE)的专利微生物保藏中心(NPMD)提交了原保藏申请书，进行了由日本国内保藏(原保藏日：2013年8月20日)转移为基于布达佩斯条约的保藏的转移请求(受理日：2014年10月15日、受理号“NITE ABP-01694”)。

关于细菌的一般性状，由于其作为菌株的性质容易发生变异，因而11/19-B1株也可能不限于前面示出的生理学性状的范围内。另外，该“变异”当然包括自然变异和人工变异这两种情况。

下面对11/19-B1株的培养方法进行记载。11/19-B1株的培养方法按照针对乳球菌属微生物进行的一般培养方法来进行即可。

培养优选在厌氧条件下进行。作为培养基中的碳源，例如可使用L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-甘露醇、N-乙酰基葡糖胺、扁桃苷、熊果苷、七叶苷、水杨苷、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-乳糖、D-海藻糖、龙胆二糖、葡萄糖酸盐、D-葡萄糖、D-果糖、蔗糖、糖蜜、水饴、油脂类等有机碳化合物，作为氮源，可以使用肉提取物、酪蛋白、蛋白胨、酵母提取物、干燥酵母、胚芽、大豆粉、尿素、氨基酸、铵盐等有机/无机氮化合物。

另外，关于盐类，可以根据需要适当添加钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、磷酸盐、铁盐、铜盐、锌盐、钴盐等无机盐类。此外，从增加目标物的产生量的方面考虑，优选添加生物素、维生素B1、胱氨酸、油酸甲酯、猪油等生长促进物质。

另外，可以添加硅油、表面活性剂等消泡剂。作为制备完成的培养基，优选使用例如MRS培养基、GAM培养基等。

关于培养条件，如上文所述，按照针对乳球菌属微生物进行的一般培养条件来进行即可。若为液体培养法，则优选静置培养。若为小规模培养，则可以使用利用带盖玻璃瓶的静置培养法。培养温度优选保持在25℃～37℃之间，更优选在37℃附近进行。关于培养pH，优选在pH7附近进行。培养时间是根据所使用的培养基组成、培养温度等而变动的因素，在11/19-B1株的情况下，在通常为12～48小时左右、优选为12～24小时左右的短时间内能够确保充分量的目标物。

<方式2>

本发明的方式2为一种天然免疫活化剂，其是以方式1的乳酸菌、该乳酸菌的死菌或该乳酸菌的处理物作为有效成分的天然免疫活化剂，其特征在于，

上述乳酸菌的处理物为选自由乳酸菌的培养物、浓缩物、糊化物、喷雾干燥物、冷冻干燥物、真空干燥物、滚筒干燥物等干燥物、液化物、稀释物、破碎物、杀菌加工物以及来自该培养物的提取物组成的组中的至少一种处理物。

即，本发明的方式2是以方式1的乳酸菌、该乳酸菌的死菌或该乳酸菌的处理物作为有效成分的天然免疫活化剂。

本发明的天然免疫活化剂可以以各种状态含有方式1的乳酸菌，例如可以举出乳酸菌悬浮液、乳酸菌培养物(菌体、培养上清液(包含培养基成分))。

本发明的天然免疫活化剂可以直接含有方式1的乳酸菌，或者也可以以对方式1的乳酸菌实施了某些处理后的乳酸菌处理物的形式含有。

作为在本发明的天然免疫活化剂中使用的乳酸菌处理物，具体地说，例如可以举出：乳酸菌的培养物；浓缩物；糊化物；喷雾干燥物、冷冻干燥物、真空干燥物、滚筒干燥物等干燥物；液化物；稀释物；破碎物；杀菌加工物；来自该培养物的提取物；等等。

作为乳酸菌，可以适当地使用活菌体、湿菌、干燥菌等。

另外，也可以为实施了杀菌即加热杀菌处理、放射线杀菌处理、破碎处理等而得到的死菌。

作为本发明的天然免疫活化剂中的有效成分的乳酸菌、该乳酸菌的死菌、该乳酸菌的处理物相对于天然免疫活化剂整体的含量没有特别限制，可以根据目的适当选择，在将天然免疫活化剂整体设为100质量份时，以乳酸菌、该乳酸菌的死菌、该乳酸菌的处理物的总量计，优选以0.001质量份～100质量份的含量来混配，更优选以0.01质量份～99质量份、特别优选以0.1质量份～95质量份、进一步优选以1质量份～90质量份的含量来混配。

另外，上述有效成分可以单独使用任意1种，也可以合用2种以上。在合用2种以上的情况下，对于上述天然免疫活化剂中的各有效成分的含有比也没有特别限制，可以根据目的适当选择。

本发明的天然免疫活化剂在奶粉等具有生物学标准的医药品和/或饮食品中也可以进行添加，可以不受医药品和/或饮食品的形态等的限制而应用于各种医药品和/或饮食品中。

另外，本发明的天然免疫活化剂中，除了作为有效成分的乳酸菌、该乳酸菌的死菌、该乳酸菌的处理物以外，还可以含有“其他成分”。

作为上述天然免疫活化剂中的上述“其他成分”没有特别限制，可以在无损于本发明效果的范围内根据目的适当选择，例如可以举出药学上可容许的载体等。

作为该载体没有特别限制，例如可以根据后述的剂型等适当选择。另外，作为上述天然免疫活化剂中的上述“其他成分”的含量也没有特别限制，可以根据目的适当选择。

作为本发明的天然免疫活化剂的剂型没有特别限制，例如可以根据后述的所期望的给药方法适当选择。

具体地说，例如可以举出口服固形剂(片剂、包覆片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等)、口服液剂(内服液剂、糖浆剂、酏剂等)、注射剂(溶剂、悬浮剂等)、软膏剂、贴剂、凝胶剂、乳膏剂、外用散剂、喷雾剂、吸入散布剂等。

作为上述口服固形剂，例如可以在上述有效成分中加入赋形剂，进一步根据需要加入粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、矫味/矫臭剂等添加剂，通过常规方法进行制造。

作为上述赋形剂，例如可以举出乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、淀粉、碳酸钙、高岭土、微晶纤维素、硅酸等。

作为上述粘合剂，例如可以举出水、乙醇、丙醇、单糖浆、葡萄糖液、淀粉液、明胶液、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、甲基纤维素、乙基纤维素、虫胶、磷酸钙、聚乙烯基吡咯烷酮等。

作为上述崩解剂，例如可以举出干燥淀粉、藻酸钠、琼脂粉末、碳酸氢钠、碳酸钙、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、乳糖等。

作为上述润滑剂，例如可以举出精制滑石、硬脂酸盐、硼砂、聚乙二醇等。

作为上述着色剂，例如可以举出二氧化钛、氧化铁等。

作为上述矫味/矫臭剂，例如可以举出白糖、橙皮、柠檬酸、酒石酸等。

作为上述口服液剂，例如可以在上述有效成分中加入矫味/矫臭剂、缓冲剂、稳定剂等添加剂，通过常规方法进行制造。

作为上述矫味/矫臭剂，例如可以举出白糖、橙皮、柠檬酸、酒石酸等。作为上述缓冲剂，例如可以举出柠檬酸钠等。作为上述稳定剂，例如可以举出黄芪胶、阿拉伯胶、明胶等。

作为上述注射剂，例如可以在上述有效成分中添加pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂、局部麻醉剂等，通过常规方法制造皮下用、肌肉内用、静脉内用等的注射剂。

作为上述pH调节剂和上述缓冲剂，例如可以举出柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钠等。作为上述稳定剂，例如可以举出焦亚硫酸钠、EDTA、巯基乙酸、硫代乳酸等。作为上述等渗剂，例如可以举出氯化钠、葡萄糖等。作为上述局部麻醉剂，例如可以举出盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因等。

作为上述软膏剂，例如可以在上述有效成分中混配公知的基剂、稳定剂、湿润剂、防腐剂等，通过常规方法混合来进行制造。

作为上述基剂，例如可以举出液体石蜡、白色凡士林、白蜂蜡、辛基十二烷基醇、石蜡等。作为上述防腐剂，例如可以举出对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯等。

作为上述贴剂，例如可以将作为上述软膏剂的乳膏剂、凝胶剂、糊剂等通过常规方法涂布到公知的支撑体上来进行制造。作为上述支撑体，例如可以举出由棉、人造纤维、化学纤维构成的机织布、无纺布、软质氯乙烯、聚乙烯、聚氨酯等的膜、发泡体片等。

本发明的天然免疫活化剂例如可以通过对需要活化天然免疫机制的个体(例如，需要进行健康维持或疲劳恢复的个体；需要进行癌或生活习惯病的预防或治疗的个体；感染了细菌、真菌、病毒等的个体；等等)进行给药来使用。

作为本发明的天然免疫活化剂的给药对象动物没有特别限制，例如可以举出：人；小鼠；大鼠；猴；马；牛、猪、山羊、鸡等家畜；猫、狗等宠物；等等。

另外，作为上述天然免疫活化剂的给药方法没有特别限制，例如可以根据上述天然免疫活化剂的剂型等适当选择，可以举出口服给药、腹腔内给药、向血液中注射、向肠内注入等。

另外，作为上述天然免疫活化剂的给药量没有特别限制，可以根据作为给药对象的个体的年龄、体重、所期望的效果程度等来适当地选择，例如，成人1天的给药量以有效成分的量计优选为1mg～30g、更优选为10mg～10g、特别优选为100mg～3g。

另外，作为上述天然免疫活化剂的给药时期也没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可以预防性给药，也可以治疗性给药。

<方式3>

本发明的方式3涉及一种含有上述本发明的乳酸菌或上述本发明的天然免疫活化剂的饮食品。

含有上述乳酸菌或上述天然免疫活化剂的饮食品(以下有时简称为“本发明的饮食品”)中的乳酸菌或天然免疫活化剂的含量没有特别限制，可以根据目的或饮食品的方式(种类)来适当选择，在将饮食品整体设为100质量份时，以上述天然免疫活化剂的总量计优选含有0.001质量份～100质量份，更优选为0.01质量份～100质量份、特别优选为0.1质量份～100质量份的含量。

另外，可以单独使用乳酸菌或天然免疫活化剂中的任意1种，也可以合用2种以上。在合用2种以上的情况下，对于上述饮食品中的各物质的含量比没有特别限制，可以根据目的适当选择。

本发明的方式3的饮食品具有天然免疫活化作用。

本发明的饮食品除了含有本发明方式2的天然免疫活化剂以外，还可以进一步含有“其他成分”。

作为该具有天然免疫活化作用的本发明的饮食品中的上述“其他成分”没有特别限制，可以根据目的在无损于本发明效果的范围内适当选择，例如可以举出各种食品原料等。另外，“其他成分”的含量没有特别限制，可以根据目的适当选择。

作为上述饮食品的种类没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可以举出：果冻、糖果、巧克力、饼干等点心类；绿茶、红茶、咖啡、冷饮等嗜好饮料；发酵乳、酸奶、冰激凌等乳制品；蔬菜饮料、果实饮料、果酱类等蔬菜/果实加工品；汤等液体食品；面包类、面类等谷物加工品；各种调味料；等等。其中优选酸奶、发酵乳等乳制品。

作为这些饮食品的制造方法没有特别限制，例如可以根据通常的各种饮食品的制造方法适当地制造。

另外，上述饮食品例如可以以片剂、颗粒剂、胶囊剂等口服固形剂或内服液剂、糖浆剂等口服液剂的形式来制造。上述口服固形剂、口服液剂的制造方法没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可以模仿上述药剂的口服固形剂、口服液剂的制造方法进行制造。

上述饮食品作为以活化天然免疫机制为目的的功能性食品、健康食品等被认为是特别有用的。

上述11/19-B1株是从猕猴桃中人为分离出的新型乳酸菌。除了猕猴桃以外，在自然界中，11/19-B1株不以分离的形态存在。因此，人为分离出的11/19-B1株本身并非为自然界中存在的物质。因此，含有该11/19-B1株的天然免疫活化剂、含有该11/19-B1株的饮食品也均不属于自然产物。

况且，在自然界中，上述11/19-B1株并不与乳接触，上述菌株也不以饮食品的形式存在，因而本发明的发酵乳和饮食品在自然界中并不存在，因此它们也均不属于自然产物。

在将本发明的乳酸菌或天然免疫活化剂用于饮食品的制造的情况下，制造方法可以利用本领域技术人员公知的方法来进行。本领域技术人员可以将使本发明的乳酸菌的菌体或处理物与其他成分混合的工序、成形工序、杀菌工序、发酵工序、烧制工序、干燥工序、冷却工序、造粒工序、包装工序等适当组合来制作目标饮食品。

另外，在将本发明的乳酸菌用于各种发酵乳的制造的情况下，可以使用本领域技术人员公知的方法进行制造。例如可以举出采用在发酵乳中添加需要量的死菌形式的本发明的乳酸菌的工序而制造的饮食品、采用使用本发明的乳酸菌作为乳酸菌发酵剂进行发酵的工序而制造的饮食品。

在使用本发明的乳酸菌作为乳酸菌发酵剂进行发酵的情况下，可以利用与本发明的乳酸菌的培养条件同样的条件等来进行。

<方式4>

本发明的方式4涉及一种发酵乳，其为含有上述本发明的乳酸菌的发酵乳，其特征在于，该发酵乳对于选自由甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌以及蒙氏肠球菌组成的组中的至少一种细菌具有抵抗性。

发酵乳是利用乳酸菌或酵母使牛等的乳发酵而得到的乳制品，例如可以举出酸奶等。

在实施例4～6的结果中示出了，含有上述本发明的乳酸菌的发酵乳对于甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus(MSSA))、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA))、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)以及蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)中的任一种细菌均具有抵抗性。

关于上述发酵乳的接种对象，从提高针对各种感染症的抵抗力的含义来看，健康人当然也是摄取对象，具有各种感染症的人也不限定于伴有天然免疫功能降低的患者，可以出于活化全身天然免疫功能的目的而用于具有大部分疾病的人。此外，对于动物，也可以以饲料或动物用药品等各种形态来应用。

上述发酵乳优选用于甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌以及蒙氏肠球菌所致的感染的预防或治疗，特别优选用于绿脓杆菌感染的预防或治疗。

【实施例】

下面基于实施例和研究例更详细地说明本发明，但本发明并不限定于下述实施例等的具体范围。

实施例中使用的“11/19-B1株”是如上所述从猕猴桃中分离出的。作为属于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的乳酸菌11/19-B1株，被保藏在日本国家技术与评价研究所专利微生物保藏中心(NPMD)(千叶县木更津市上总镰足2-5-8)(保藏号：NITE P-01694、保藏日：2013年8月20日)。

实施例1

<天然免疫活化活性的测定>

将在GAM培养基中培养了一夜的11/19-B1株在121℃灭菌处理20分钟后，将50μL注射至5龄蚕的断头肌肉标本中，基于缓慢性肌收缩(緩行性筋収縮)测定天然免疫活化活性。

基于缓行性肌收缩的天然免疫活化活性的测定按照Ishii K.,Hamamoto H.,Kamimura M.,Sekimizu K.,J.Biol.Chem.Jan.25；283(4)：2185-91(2008)中记载的方法来进行。

即，向5龄蚕的断头肌肉标本中进行上述试样0.05mL的血液内给药，在C值为最大时(约10分钟后)测定体长，由注射前的体长减去注射后的体长，用该值除以注射前的体长，所得到的值为所测定的C值(收缩值，Contraction Value)。

比较例1

将在GAM培养基中培养了一夜的保加利亚乳杆菌OLL1073株在121℃灭菌处理20分钟后，将50μL注射至断头蚕中，基于肌收缩测定天然免疫活化活性。

比较例2

将在GAM培养基中培养了一夜的干酪乳杆菌YIT9029株在121℃灭菌处理20分钟后，将50μL注射至断头蚕中，基于肌收缩测定天然免疫活化活性。

比较例3

将在GAM培养基中培养了一夜的乳酸乳球菌JCM5805株在121℃灭菌处理20分钟后，将50μL注射至断头蚕中，基于肌收缩测定天然免疫活化活性。

将实施例1和比较例1～3的结果示于表1。将C值＝0.15定义为1(U)单位。

【表1】

No.		比活性(U/mg)
			实施例1	乳酸乳球菌	105±5
比较例1	保加利亚乳杆菌	24
			比较例2	干酪乳杆菌	5.6
比较例3	乳酸乳球菌	17

比较例1～3的乳酸菌为市售发酵乳的制造中实际使用的乳酸菌。

如表1所示可知，与比较例1～3相比，实施例1的乳酸菌具有更高的天然免疫活化能力。

由于11/19-B1株及其死菌的天然免疫活化能力高，因而暗示11/19-B1株有望作为活化天然免疫的“发酵乳等饮食品”的生产菌。

研究例1

<16S rRNA分析>

通过PCR法从基因组DNA中扩增出11/19-B1株的16S rDNA的碱基，利用测序仪对扩增出的DNA片段进行分析，确定了相当于序列号1所示的16S rRNA区域的大致全长(除5’末端侧、3’末端侧的几个碱基以外)的碱基序列。

以该碱基序列为基础，使用NCBI的BLAST进行与现有菌株的同源性检索。其结果，11/19-B1株与现有的乳酸乳球菌IL1403株显示出99％的同源性，因而认为其是属于乳球菌(Lactococcus)属的微生物。

<关于11/19-B1株的新颖性>

11/19-B1株在糖的发酵能力和化学性质方面与现有的乳酸乳球菌的相似点多，在944株细菌的基于api web v5.1数据库(sysmex-biomerieux)的分析中，与乳酸乳球菌乳亚种1显示出77.2％的同一性，与短乳杆菌1显示出21.9％的同一性，在这一点上是完全不同的。这一点是与现有菌株有很大区别的一点。需要说明的是，11/19-B1株的革兰氏染色图像为革兰氏阳性球菌，由此排除了其为短乳杆菌的可能性。因此，根据上述结果判定11/19-B1株是属于乳球菌(Lactococcus)属的新型微生物。

实施例2

<天然免疫活化剂的制造>

<<片剂>>

将培养后的11/19-B1株在121℃灭菌处理20分钟后，进行浓缩。将该浓缩的11/19-B1株的培养液20.0mg、乳糖40mg、淀粉20mg以及低取代度羟丙基纤维素5mg均匀混合后，以羟丙基甲基纤维素8质量％水溶液作为粘合剂，利用湿式造粒法制造压片用颗粒。向其中加入提供润滑性所需要的硬脂酸镁0.5mg～1mg后，使用压片机进行压片，制成片剂。

<<液剂>>

将上述浓缩后的11/19-B1株的培养液10.0mg溶解在2质量％的2-羟丙基-β-环糊精水溶液10mL中，制成注射用液剂。

实施例3

<发酵乳的制造>

将牛乳在95℃杀菌5分钟后，冷却至40℃，加入0.001质量份11/19-B1株。然后，在37℃发酵72小时，得到发酵乳。将该发酵乳在10℃以下进行冷却后，确认风味和物性。

其结果，风味和物性均极为良好。

实施例4

<11/19-B1酸奶的益生菌效果>

在生物体外的实验中，在11/19-B1株的培养液、培养上清以及使用11/19-B1株制造的酸奶中未发现抗菌活性(未图示)。

对使用11/19-B1株制造的酸奶的益生菌效果(利用活菌改善肠内平衡、提高抵抗力和免疫力的效果)进行了验证。

<<蚕菌感染模型的制作>>

将在LB培养基中培养了一夜的绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1)或甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus MSSA1)的培养液利用灭菌后的0.9质量％NaCl溶液进行稀释，分别向5龄第2日的蚕幼虫(平均体重2g)进行各50μL的血液内注射。

<<酸奶的制作>>

将乳酸菌(11/19-B1株)粉末50mg悬浮在生理盐水(灭菌后的0.9质量％NaCl溶液)1mL中，将悬浮液50μL混合到含有0.267质量％葡萄糖和0.025质量％酪蛋白氨基酸的牛乳200mL中，在灭菌后的玻璃瓶中于37℃保温3天。下文中将所制作的酸奶简称为“11/19-B1酸奶”。

<<验证方法>>

给蚕投喂一夜含有11/19-B1酸奶的饵食或作为对照的常规饵食后，使蚕感染细菌。作为常规饵食，使用人工饲料Silk Mate 2S(日本农产工业)。此处，“含有11/19-B1酸奶的饵食”是在常规饵食中混合有11/19-B1酸奶的饵食。

每1组中蚕的总数设定为7只，在接种绿脓杆菌或甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌2天后判断生死，由生存曲线计算出LD₅₀(50％半数致死量)。阴性对照使用0.9质量％NaCl溶液。结果示于图1。

图1中，纵轴表示生存率(生存％)，横轴表示感染2天后的生存率下的细菌的用量依赖性(OD₆₀₀)。

另外，使用同样的方法使蚕感染作为革兰氏阳性细菌的甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(S.aureus MSSA1)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(S.aureus MRSA4)、或者蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii 12/5-1)，对益生菌效果进行验证。结果示于图2。

根据图1和图2的结果，对于感染至蚕中的绿脓杆菌(P.aeruginosa PAO1)、甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(S.aureus MSSA1)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(S.aureusMRSA4)和蒙氏肠球菌，通过使蚕食用含有11/19-B1酸奶的饵食，蚕对任一种细菌均显示出高抵抗性。

由以上的结果确认了11/19-B1酸奶的益生菌效果。特别是在感染了绿脓杆菌时(图1(A))确认到很强的效果，由此暗示出其预防绿脓杆菌感染的可能性。

实施例5

<11/19-B1酸奶和11/19-B1活菌粉末在蚕绿脓杆菌感染模型中的效果的比较>

接着，对感染绿脓杆菌时显示出强效果的主要原因进行了验证。

以10升的规模培养11/19-B1株，制作活菌粉末。下文中将所制作的活菌粉末简称为“11/19-B1活菌粉末”。

利用与实施例4同样的方法，给蚕投喂一夜含有11/19-B1酸奶(8×10⁷cfu/g、0.5g/个体)的饵食、含有11/19-B1活菌粉末(4×10⁸cfu/g、0.1g/个体)的饵食、或者常规饵食，之后使蚕感染绿脓杆菌(P.aeruginosa PAO1)。

结果示于图3和表2。

【表2】

另外，根据图3和表2的结果，对于感染至蚕中的绿脓杆菌(P.aeruginosa PAO1)，确认到由11/19-B1活菌粉末产生的益生菌效果。

另外，11/19-B1酸奶和11/19-B1活菌粉末为同等的效果，因而暗示出，由11/19-B1带来的预防绿脓杆菌感染死亡的效果可能是由菌本身所含有的成分产生的益生菌效果。

实施例6

<蚕绿脓杆菌感染模型中的11/19-B1酸奶摄取量与LD₅₀的相关性>

利用与实施例4同样的方法，给蚕投喂一夜相对于饵食整体分别含有6质量％、11质量％、20质量％、33质量％的11/19-B1酸奶的饵食、或者作为对照的常规饵食，之后使蚕感染绿脓杆菌(P.aeruginosa PAO1)。

结果示于图4。图4B是示出酸奶摄食量与绿脓杆菌(P.aeruginosa PAO1)的LD₅₀的相关性的曲线图。在图4B中，纵轴为LD₅₀比((给予含有11/19-B1酸奶的饵食的情况下的LD₅₀值)/(给予不含有11/19-B1酸奶的常规饵食的情况下的LD₅₀值))，横轴为酸奶相对于饵食整体的比例(质量％)。

由图4的结果可知，酸奶摄食量与LD50具有相关性。

【工业实用性】

本发明的新型乳酸菌具有高天然免疫活化能力。因此，能够提供利用了本发明的乳酸菌的活化天然免疫的天然免疫活化剂或饮食品，能够广泛用于食品业界及医药品业界等。

本申请基于2013年10月17日提交的日本专利申请特愿2013-216517，将该申请的全部内容引用至此，作为本发明说明书的公开内容并入本文中。

【保藏号】

NITE BP-01694

【序列表自由文本】

序列号1是与属于乳球菌(Lactococcus)属的未知菌株的16S rRNA的大致全长相当的碱基序列。

Claims

1.一种乳酸菌，其属于乳球菌(Lactococcus)属，其在日本国家技术与评价研究所(NITE)的专利微生物保藏中心(NPMD)的保藏号为NITE BP-01694。

2.如权利要求1所述的乳酸菌，其中，具有序列表的序列号1所表示的16S rRNA区域的碱基序列。

3.一种天然免疫活化剂，其是以权利要求1或权利要求2所述的乳酸菌、该乳酸菌的死菌或该乳酸菌的处理物作为有效成分的天然免疫活化剂，其特征在于，

所述乳酸菌的处理物为选自由乳酸菌的培养物、浓缩物、糊化物、干燥物、液化物、稀释物、破碎物、杀菌加工物以及来自该培养物的提取物组成的组中的至少一种处理物。

4.一种饮食品，其含有权利要求1或权利要求2所述的乳酸菌。

5.一种饮食品，其含有权利要求3所述的天然免疫活化剂。

6.一种饮食品，其是采用使用权利要求1或2所述的乳酸菌进行发酵的工序而制造的。

7.如权利要求6所述的饮食品，其中，所述饮食品为发酵乳。

8.一种发酵乳，其是含有权利要求1或权利要求2所述的乳酸菌的发酵乳，其特征在于，

该发酵乳对于选自由甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌以及蒙氏肠球菌组成的组中的至少一种细菌具有抵抗性。

9.一种天然免疫活化剂，其为权利要求3所述的天然免疫活化剂，其特征在于，

该天然免疫活化剂对于选自由甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌以及蒙氏肠球菌组成的组中的至少一种细菌具有抵抗性。