CH647245A5

CH647245A5 - Desoxycytidin-verbindungen, deren herstellung und diese enthaltende pharmazeutische zubereitung.

Info

Publication number: CH647245A5
Application number: CH7181/80A
Authority: CH
Inventors: Albert Stanley Jones; Richard Thomas Walker; Clercq Erik De; Gabriel Albert Verhelst
Original assignee: Univ Birmingham; Stichting Rega V Z W
Priority date: 1979-10-03
Filing date: 1980-09-25
Publication date: 1985-01-15
Also published as: FR2466472B1; GB2060604A; NL8005336A; GB2060604B; FR2466472A1; BE885415A; JPS5695198A; SE8006669L; DE3036131C2; DE3036131A1; JPS637199B2; IT1209758B; US4382925A; SE445740B; CA1173438A; IT8009551A0

Description

Die Erfindung betrifft neue Desoxycytidin-Verbindungen, die zur Bekämpfung von Virus-Erkrankungen geeignet sind, und bezieht sich auch auf Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen sowie zu deren Verwendung in pharmazeutischen Zubereitungen.

Es sind bereits einige von Desoxycytidin abgeleitete Verbindungen und mehrere von Desoxyuridin abgeleitete Verbindungen bekannt, die Wirkung gegen Viren haben. Ein Überblick über die bekannten Verbindungen findet sich bei E. De Clercq u. Mitarb. in J. Carbonydrates-Nucleosides, Nucleotides, 5 (3), 187-224(1978); dort können Einzelheiten dazu entnommen werden. Die antivirale Aktivität der meisten dieser bekannten Verbindungen ist nicht sehr spezifisch, denn sie wirken gegen unterschiedliche DNS-Viren, wie beispielsweise Pocken-Virus und Herpes simplex-Virus, etwa gleich stark. Weiterhin ist nachteilig, dass die Toxizität der meisten dieser bekannten Verbindungen, und speziell der gebräuchlichen Standardverbindung 5-Jod-2'-Desoxyuridin, beachtlich ist. Kürzlich wurde zwar schon berichtet, dass E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxyuridin und E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxyuridin spezifische antivirale Aktivität gegen das Virus des Herpes simplex haben und auch eine vergleichsweise niedrige Toxizität in Zellkulturen zeigen, vergi. E. De Clercq u. Mitarb. in Proceedings National Academy of Science USA, 76, No. 6,2947-2951 (1979), aber es besteht Bedarf an Wirkstoffen zur Bekämpfung von Viruserkrankungen, die bei mindestens gleich guter spezifischer Wirkung geringere Toxizität aufweisen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue chemische Verbindungen zu schaffen, die sowohl eine hohe spezifische antivirale Aktivität gegen das Virus des Herpes simplex haben und gleichzeitig niedrige Toxizität aufweisen, so dass sie als Wirkstoff in pharmazeutischen Zubereitungen besonders gut geeignet sind und sich hervorragend bei der Bekämp-

30

worin Hai ein Halogenatom bedeutet.

E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin, das sich auch als E-5-(2-Bromvinyl)-1 -(2' -Desoxy-ß-D-erythro-pentofura-nosyl)-4-amino-l,2-dihydropyrimidin-2-on bezeichnen lässt, 35 entspricht der zuvor angegebenen Strukturformel (1), worin Hai Brom bedeutet, und E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin, das auch als E-5-(2-Jodvinyl)-l-(2'-Desoxy-ß-D-erythro-pen-tofuranosyl)-4-amino-1,2-dihydropyrimidin-2-on bezeichnet werden kann, entspricht der vorstehenden Strukturformel 40 (1), worin Hai Jod bedeutet. In der Formel (1) sind die an der Doppelbindung der Halogenvinyl-Seitengruppe ansitzenden Reste in trans- oder E-Konfiguration angeordnet, und der Pyrimidin-Kern befindet sich in beta-Stellung zu dem Pento-furanosyl-Rest.

45 Die chemische Synthese von Verbindungen der Formel (1) kann in verschiedener Weise vorgenommen werden. Vorteilhaft ist es, wenn so gearbeitet wird, dass ein 2-Halogenvinyl-rest als E-5-(2-Halogenvinyl)-Seitenkette in das 2'-Desoxycytidin eingeführt wird. Dazu kann man sich vorteilhaft einer so dreistufigen Verfahrensweise bedienen, wie sie nachfolgend formelmässig veranschaulicht ist:

NH-

55

O K

nA/1901

Ethylacrylat LizPdCU

■>

3

647 245

NH

2 /COOC2H5

-H

»

OH

Hydrolyse

NH,

\=c/

COOH H

O'^^-N

HO

J

H L

Halogenierung

25

35

NH

Hai

45

50

In der ersten Verfahrensstufe wird 5-Quecksilber(II)-chlorid-2'-desoxycytidin der Formel (2) in Anwesenheit eines 60 Lithiumpalladiumchlorid-Katalysators mit einem Alkyl-acrylat, wie Ethylacrylat, umgesetzt. Dabei wird das E-5-(2-Carbethoxyvinyl)-2'-Desoxycytidin der Formel (3) gebildet. Diese Reaktion lässt sich glatt bei Zimmertemperatur oder etwas erhöhter Temperatur in einem geeigneten Lösungs- 65 mittel, wie trockenem Methanol, durchführen. Es können auch andere Lösungsmittel, beispielsweise Acetonitril,

anstelle von Methanol benutzt werden. Das Reaktionsgemisch wird entsprechend aufgearbeitet, beispielsweise durch Behandlung mit einem Reduktionsmittel, wie H2S oder NaHB4, und anschliessender Ausfällung der reduzierten Palladium- und Quecksilbersalze. Man erhält in guter Ausbeute das gewünschte Produkt, das, wie in Formel (3) veranschaulicht, eine trans- oder E-Konfiguration hat. Wenn man anstelle von Ethylacrylat den entsprechenden Methylester oder ein sonstiges Alkylacrylat mit niedrigem Alkylrest einsetzt, lässt sich die Reaktion in gleicher Weise durchführen.

Diese erste Reaktionsstufe verläuft analog der Reaktionsstufe, die für die Herstellung von 2'-Desoxyuridin-Derivaten bei Bergstrom und Ogawa in J.A.C.S., 100,8106 (1978), beschrieben ist. Das Ausgangsmaterial der Formel (2) ist als solches bekannt und wurde von Bergstrom und Ruth in J. Carbohydrates-Nucleosides, Nucleotides, 4 (5), 257-269 (1977), beschrieben.

Als zweite Reaktionsstufe wird das E-5-(2-Carbethoxy-vinyl)-Derivat gemäss Formel (3) hydrolysiert, und man erhält das entsprechende E-5-(2-Carboxyvinyl)-Derivat der Formel (4). Man kann die Hydrolyse unter alkalischen oder sauren Bedingungen durchführen. Es empfiehlt sich jedoch, möglichst nicht unter sauren Bedingungen zu arbeiten, damit jegliches Risiko von unerwünschten Nebenreaktionen (zum Beispiel Abtrennung des Substituenten in der 5-Stellung oder Abtrennung des Zucker-Restes) vermieden wird. Die Hydrolyse unter alkalischen Bedingungen kann man mit unterschiedlichen basischen Reagentien, zum Beispiel KOH, NaOH, K2CO3, Na2C03, vornehmen; zweckmässig benutzt man KOH.

In der dritten Verfahrensstufe wird das E-5-(2-Carboxy-vinyl)-Derivat der Formel (4) zu dem als Endprodukt gewünschten E-5-(2-Halogenvinyl)-Derivat der Formel (1) umgesetzt. Dazu wird unter solchen Bedingungen haloge-niert, dass die Carboxylgruppe entfernt wird. Zu diesem Zweck kann man beliebige Halogenierungsmittel benutzen, beispielsweise elementares Halogen, Halogenwasserstoffe, Halogen als Sauerstoffsäure oder organische Halogenierungsmittel, zum Beispiel N-Halogensuccinimide. Bevorzugt werden von diesen Halogenierungsmitteln Halogenwasserstoffe und N-Halogensuccinimide, weil damit bisher die besten Ergebnisse erzielt wurden. Man kann als Reaktionsmedium ein geeignetes Lösungsmittel, beispielsweise Wasser, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, benutzen.

Die Auswahl des Halogenierungsmittels und des Reaktionsmediums trifft man im Einzelfall unter Berücksichtigung der Löslichkeit und Stabilität des Halogenierungsmittels und der Löslichkeit des eingesetzten Ausgangsmaterials in dem Lösungsmittel. So lässt sich beispielsweise N-Brom-succinimid mit guten Ergebnissen in wässrigen Medien verwenden, aber vorzugsweise arbeitet man unter wasserfreien Bedingungen, zum Beispiel in trockenem Dimethylformamid mit N-Jodsuccinimid oder auch mit elementarem Brom oder elementarem Jod. Zwar hat das Carboxyvinyl-Derivat, das als Ausgangssubstanz eingesetzt wird, eine relativ niedrige Löslichkeit in Wasser, aber man kann dieses Problem dadurch beheben, dass man diese Substanz zunächst mit wässrigem Kaliumacetat behandelt und das leicht lösliche Kaliumsalz bildet, oder dadurch, dass man als Ausgangsmaterial direkt eine wässrige Lösung einsetzt, die in der vorangehenden Verfahrensstufe der Hydrolyse angefallen ist. Die Löslichkeit des Einsatzmaterials in Dimethylformamid ist etwas besser als diejenige in Wasser. Trotzdem sollte man in diesem Fall bevorzugt mit einer Kombination von Kaliumacetat und Halogenierungsmittel arbeiten.

Als Endprodukt dieser dreistufigen Synthese erhält man das gewünschte E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidin in guter Ausbeute. Dieses Endprodukt ist ein beta-Anomer, weil die gewünschte beta-Stellung des Pyrimidin-Kerns zu dem

647245

Zucker-Rest schon in dem Ausgangsmaterial vorhanden war. Infolge der gewählten Synthesemethode enthält das Produkt den Halogenrest und den Pyrimidinkern in E-Konfiguration an der Vinyl-Doppelbindung. Aus diesen beiden Gründen ist es vorteilhaft, für die Herstellung erfindungsgemässer Verbindungen die vorstehende dreistufige Methode zu benutzen.

Eine weitere Synthesemethode für die Herstellung erfindungsgemässer Verbindungen besteht darin, dass man ein eine reaktive Gruppe tragendes Derivat von 2-Desoxy-D-ery-thro-pentofuranose, dessen Hydroxylgruppen Schutzgruppen tragen, mit einem Trialkylsilylderivat von E-5-(2-Halogenvinyl)-cytosin kondensiert und danach die Schutz-5 gruppen von den Hydroxylgruppen entfernt. Diese zweite Synthesemethode, die sich durch nachstehendes Formelschema veranschaulichen lässt, ist möglich, jedoch weniger vorteilhaft:

NH'

CR)3SiO

C=C

6

V

^Hal

In diesen Formeln bedeutet R eine Alkylgruppe, vorzugsweise eine Methylgruppe, R1 ist ein leicht austauschbarer Rest, vorzugsweise zum Beispiel ein Methoxyrest oder ein Chloratom, R2 und R3 sind Schutzgruppen für die Hydroxylgruppen, vorzugsweise beispielsweise p-Toluoylreste; Hai steht für ein Halogenatom, beispielsweise Brom oder Jod, und ~ bezeichnet alpha- und/oder beta-Konfiguration.

Es wird eine Kondensationsreaktion zwischen den Verbindungen der Formel (5) und (6) durchgeführt.

Die Kondensationsreaktion verläuft gut in Anwesenheit eines Lewissäure-Katalysators, beispielsweise einem Molekularsieb, Zinn(IV)- oder Quecksilber(II)-chlorid oder -bromid, oder Trimethylsilylperfluoralkylsulfonat. Es kann gewünsch-tenfalls auch ein gegenüber den Reaktionskomponenten und dem Endprodukt inertes Lösungsmittel vorhanden sein, vorzugsweise ein solches Lösungsmittel, in dem die Reaktionskomponenten und der Katalysator ausreichend löslich sind. Als Beispiele für geeignete Lösungsmittel können benannt werden Acetonitril, Benzol, Toluol, Dichlormethan, 1,2-Dichlorethan und Tetrachlorkohlenstoff. Um die Gefahr einer Hydrolyse des Trialkylsilyl-Derivats (Formel 5) sicher auszuschliessen, sollte man die Reaktion möglichst in trok-kener Atmosphäre durchführen. Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch; in den meisten Fällen wird man bei Zimmertemperatur oder bei darunter liegender Temperatur arbeiten.

Nachdem die Reaktion vollständig abgelaufen und das Reaktionsgemisch aufgearbeitet worden ist, kann man mit so üblichen Methoden, beispielsweise durch Hydrolyse oder Alkoholyse, die Schutzgruppen entfernen.

Bei dieser letztgenannten Art der chemischen Synthese erhält man in der Regel ein Gemisch von alpha- und beta-Anomeren. Dieses Gemisch sollte man auftrennen, da nur ss das beta-Anomer das gewünschte Produkt ist. Besonders wirksam lässt sich die Trennung durchführen, bevor die Schutzgruppen an den Hydroxylgruppen entfernt sind. Man kann dazu fraktioniert kristallisieren und/oder an Silikagel chromatografieren. Da diese Trennoperationen meist wenig 60 bequem und relativ aufwendig sind, ist das beschriebene zweite Syntheseverfahren weniger bevorzugt.

Die dafür als Ausgangssubstanz verwendete Verbindung der Formel (6) ist ein bekanntes früher bereits beschriebenes Produkt, das man beispielsweise aus 2-Desoxy-D-erythro-65 pentofuranose durch Methylierung der 1-Hydroxylgruppe, Einarbeitung von Schutzgruppen an den Hydroxylgruppen in 3- und 5-Stellung und erforderlichenfalls durch Austausch der 1-Methoxygruppe durch ein Chloratom herstellen kann

5

647 245

[vergi. z.B. C.C. Bath in Synthetic Procédures in Nucleic Acid Chemistry, von R.S. Tipson und W.W. Zorbach, eds, Interscience, Bd. 1, 521-522(1968)].

Die als weiteres Ausgangsmaterial benötigte Verbindung der Formel (5) kann man durch Silierung von E-5-(2-Halo-genvinyl)-cytosin mit einem Silierungsmittel wie beispielsweise Hexamethyldisilazan oderTrimethylchlorsilan oder Mischungen dieser Substanzen herstellen [vergi, bei A.S.

Jones u. Mitarb., Tetrahedron Letters, 28, 2459-2460 (1977), für eine vergleichbare Reaktion]. Das E-5-(2-Halogenvinyl)-cytosin kann man in einfacher Weise durch Halogenierung, zum Beispiel Bromierung oder Jodierung, von 5-Vinylcytosin und anschliessender Eliminierung des Halogenwasserstoffs, beispielsweise HBr oder HJ, durch Behandlung mit Wärme gewinnen [vergi, bei R.C. Bleakley u. Mitarb., Tetrahedron, 32,2795-2797 (1976), für eine analoge Reaktion bei 5-Vinyl-uracil]. Man kann das E-5-(2-Halogenvinyl)-cytosin jedoch auch aus 5-Formylcytosin gewinnen, wenn man 5-Formylcy-tosin mit Malonsäurezu E-5-(2-Carboxyvinyl)-cytosin umsetzt und nachfolgend Halogeniert, beispielsweise in der Weise, wie es zuvor im Zusammenhang mit der ersten Synthesemethode beschrieben wurde.

Untersuchungen haben gezeigt, dass die erfindungsge-mässen E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidine, speziell das E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin und das E-5-(2'-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin, eine gute antivirale Aktivität besitzen, die sehr spezifisch gegen das Virus des Herpes simplex wirkt. Darüber hinaus haben sie anscheinend keine Toxizität in Zellkulturen, so dass sich ein besonders günstiger antiviraler Index gegen dieses Virus ergibt und die erfin-dungsgemässen Verbindungen besonders brauchbar macht zur Bekämpfung von durch das Virus Herpes simplex verursachte Erkrankungen bei Menschen und Tieren. Verglichen mit dem Stand der Technik ist diese Eigenschaftskombination der spezifischen antiviralen Wirkung und der praktisch fehlenden Toxizität in Zellkulturen für die erfindungsge-mässen Verbindungen überraschend und war nicht vorhersehbar.

In den nachfolgenden Beispielen sind physikalische Konstanten für erfindungsgemässe Verbindungen, hergestellt gemäss der zuvor beschriebenen ersten Synthesemethode, veranschaulicht.

Im Anschluss an die Beispiele für die Herstellung erfin-dungsgemässer Verbindungen wird nachstehend über Tests berichtet, die die Wirkung gegen Viren veranschaulichen.

Beispiel 1

a) E-5-(2-Carbethoxyvinyl)-2'-Desoxycytidin (Formel 3) In einen 250 ml Rundkolben wurden 5-Chlormercuri-2'-Desoxycytidin (4,62 g, 10 mmol), (Formel 2), Ethylacrylat (6 g, 60 mmol) und 0,1 m LiîPdCh in trockenem Methanol ( 100 ml) zusammen eingefüllt, und dann wurde 24 Std. lang unter Stickstoff gerührt, wobei eine schwarze Suspension entstand. Die Suspension wurde filtriert, und der schwarze Niederschlag wurde gesammelt. Der Niederschlag wurde in Methanol ( 100 ml) erwärmt und filtriert. Die kombinierten Filtrate wurden mit NaBH4 behandelt, bis das schwarze Material vollständig ausgefällt und die Lösung farblos geworden war. Nach nochmaligem Filtrieren wurde die Lösung unter vermindertem Druck eingedampft (bis auf 30 ml), und aus dem Konzentrat kristallisierte das E-5-(2-Carbethoxyvinyl)-2'-Desoxycytidin (1,4 g, 43%) aus.

U.V. Spektrum: (Ethanol): Xmm237 nm (s 8.230) A.max268 nm (8 17.430) Xm,n297 nm (e 8.250) A.max327 nm (e 13.920) bei pH2; Ìmax221 nm (e 21.670) Xm\r2A5 nm (e 8.560) imax275 nm (e 13.730) À.min297 nm (e 8.050) Xmax326 nm (8 14.260) bei pH7. N.M.R. Spektrum: 8 (df,DMSO); 8.50 (s, 1 H, H-6), 7.57 (d,

1 H, vinylic H, J = 16 Hz) 7.42 (s, 2H, NH2) 6.21 (d, 1H, vinylic H, J = 16 Hz) 6.10(t, 1H, H-l')5.16(d, lH,CH-3') 5.14(t, 1 H, CH-5') 4.20 (m, IH, H-3') 4.13 (g, 2H, CH2-CH3) 3.79 (m, IH, H-4')3.62 (m, 2H, H-5') 2.13 (m, 2H, H-2') 1.24 (t,3H, CH2-CH3).

Das Ausgangsmaterial, 5-Chlormercuri-2'-desoxycytidin, wurde nach der von Bergstrom und Ruth, J. Carbohydrates-Nucleosides, Nucleotides, 4 (5), 257-269 (1977), beschriebenen Methode erhalten.

b) E-5-(2-Carboxyvinyl)-2' -Desoxycytidin (Formel 4)

Das wie zuvor unter a) beschrieben gewonnene Carbeth-

oxyvinyldesoxycytidin (325 mg, 1 mmol) wurde in einer 0,5 m NaOH-Lösung (40 ml) suspendiert, und es wurde 2 Std. lang bei Zimmertemperatur gerührt. Die klare Lösung wurde durch Zugabe von Ionenaustauscherharz (Dowex-50) in der H+-Form auf pH 7 neutralisiert und filtriert. Diese Lösung wurde unmittelbar für die Weiterverarbeitung zu E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin verwendet.

c) E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin (Formel 1, Hal=Br)

Eine bei der zuvor unter b) beschriebenen Hydrolyse der Carbethoxyvinyldesoxycytidin-Verbindung (325 mg, 1 mmol) erhaltene Lösung wurde mit N-Bromsuccinimid (178 mg, 1 mmol) behandelt und bei Zimmertemperatur 15 Std. lang gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel entfernt, und der Rückstand wurde an SiCh (50 g) mit CHCb-MeOH (80:20) als Eluierungsmittel gereinigt. Man erhielt das E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin (150 mg, 48%, Rf=0,32).

U.V. Spektrum: (Wasser): A,max244 nm (e 16.090) A,min280 nm (8 5.260) A.max302 nm (e 7.610) bei pH2; Xmax250 nm (e 15.830) À.min286 nm (e 6.390) imax292 nm (e 6.590) bei pH7; A,max249 nm (8 17.360) Ui„283 nm (e 7.300) A.max292 nm (e 7.660) bei pHl 1. N.M.R. Spektrum: 8 (dóDMSO); 8.10 (s, IH, H-6) 7.21 (br, 2H, NH2) 7.05 (d, 1H, vinyl - H, J = 13Hz) 6.70 (d, 1H, vinyl - H, J = 13 Hz) 6.10 (t, 1 H, H-1 ' ) 5.05 (br, 2H, OH-3 ' und OH-5') 4.10 (m, 1H, H-3') 3.75 (m, 1H, H-4') 3.60 (m, 2H, H-5') 2.10 (m,2H, H-2').

Beispiel 2

a) Es wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel la) beschrieben E-5-(2-Carbethoxyvinyl)-2'-Desoxycytidin hergestellt.

b) Durch Hydrolyse, in gleicher Weise wie im Beispiel 1b) beschrieben, wurde E-5-(2-Carboxyvinyl)-2'-Desoxycytidin gewonnen, jedoch mit dem Unterschied, dass nach der Neutralisation und dem Filtrieren das Lösungsmittel im Vakuum aus der Lösung entfernt und der Rückstand über P2O5 getrocknet wurde.

c) E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin(Formel l,Hal=J)

Der aus der vorstehend beschriebenen Verfahrensstufe 2b)

resultierende Rückstand wurde in trockenem DMF (20 ml) suspendiert, und es wurde N-Jodsuccinimid (225 mg, 1 mmol) hinzugegeben. Das Gemisch wurde 4 Std. lang bei Zimmertemperatur gerührt und dann in üblicher Weise aufgearbeitet, und es resultierte das E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin (105 mg, 28%).

U.V. Spektrum: (Ethanol): ?imax258 nm (s 17.282) Xsh200 nm (8 7.504) bei pH7; A,max256 nm (s 15.160) A.mi„293 nm (e 4.700) A.max315 nm (e 6.216) bei pH2.

N.M.R. Spektrum: 8 (dsDMSO); 8.06 (s, 1H, H-6) 7.26 (d, 1H, vinyl - H, J = 14 Hz) 7.20 (br, 2H, NH2) 6.64 (d, 1H, vinyl -H, J = 14 Hz) 6.08 (t, IH, H-l') 5.11 (d, 1H, OH-3') 5.03 (t, 1H, OH-5') 4.20 (m, 1H, H-3') 3.76 (m, 1H, H-4') 3.58 (m, 2H, H-5') 2.08 (m, 2H, H-2').

5

10

15

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30

35

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55

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65

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Biologische Tests

Nachstehend wird über einige biologische Testreihen berichtet, aus denen die spezifische antivirale Aktivität, die niedrige Toxizität und der hohe antivirale Index der erfin-dungsgemässen Verbindungen gezeigt und ersichtlich ist.

Bei diesen Tests wurde die Wirkung von E-5-(2-Halogen-vinyl)-2'-Desoxycytidin und ähnlichen Vergleichsverbindungen auf das Wachstum und die Ausbeute von Viren in Zellkulturen gemessen.

Die folgenden Verbindungen wurden getestet: E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin und E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin als erfindungsgemässe Verbindungen.

E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxyuridin und E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxyuridin und 5-Jod-2'-desoxyuridin (von Ludeco, Brüssel, erhalten) als Vergleichsverbindungen.

Alle Verbindungen waren ß-Anomere.

Die Verbindungen wurden gegen das Vaccinia-Virus und gegen drei Stämme von Herpes simplex-1-Virus (Stamm KOS, Stamm Mclntyre und Stamm F) getestet. Die Viren wurden in Zellkulturen aus Kaninchennierenzellen (primären Zellen) (PRK) und Fibroblasten der menschlichen Haut (HSF) gezüchtet. Die Technik der Ermittlung des Virenwachstums in den Zellkulturen, die angewendet wurde, ist beschrieben bei De Clercq u. Mitarb., Biochem. Pharmacol., 24,523-527 (1975).

Test 1

In diesem Test wurde die Inhibierungsaktivität von E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidinen und den Vergleichsverbindungen gegen Vaccinia- und Herpes simplex-1-Viren in PRK- und HSF-Zellkulturen gemessen. Man Hess die Zellen sich vermehren, bis sie in Plastik-Mikroplatten zusammengewachsen waren.

(PRK, HSF). Wenn die Platten ausgefüllt waren, wurden die Zellen mit 100 CCIDso an entweder Vaccinia-Virus oder Herpes simplex-1-Virus beimpft. Eine CCIDso oder «Zell-s kultur-Infektionsdosis-50» ist die Dosis an Virus, die erforderlich ist, um 50% der Zellkultur zu infizieren. Eine Stunde nach dem Beimpfen mit dem Virus wurden die zu testenden Verbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen (im Bereich von 0,001 (xg/ml bis 100 ug/ml) zugesetzt. Für jedes io Virus-Zell-System wurde die IDso bestimmt. Die IDso oder «Inhibierungsdosis-50» ist diejenige Konzentration an Verbindung, die erforderlich ist, um den zytopathogenen Effekt auf den Virus auf 50% zu unterdrücken. Der zytopathogene Effekt (CPE) wurde aufgezeichnet, sobald er in den unbehan-is delten Virus-infizierten Zellkulturen Kompletion erreicht hatte (im allgemeinen 3 Tage, nachdem die Zellen mit dem Virus beimpft worden waren). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt; die darin angegebenen Daten sind Mittelwerte aus drei gesondert durchgeführten Experimenten. 20 Aus Tabelle 1 ist zu ersehen, dass die E-5-(2-Halogen-vinyl)-2'-Desoxycytidine, die zwar etwas weniger aktiv sind als die Vergieichsverbindungen E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxyuridin und E-5-(2-Jodvinyl)-2' -Desoxyuridin, mindestens gleiche Aktivität haben oder sogar stärker aktiv sind 25 gegen Herpes simplex-1 im Vergleich zu der Standard-Vergleichsverbindung 5-Jod-2'-desoxyuridin. Man erkennt weiterhin, dass im Gegensatz zu der Standard-Vergleichsverbin-dung die erfindungsgemässen E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidine eine antivirale Aktivität aufweisen, die sehr 30 spezifisch ist gegen das Virus des Herpes simplex-1. Diese spezifische Wirkung ist etwa die gleiche wie die der E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxyuridin-Vergleichsverbindungen.

Tabelle 1

Antivirale Aktivität von E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidinen und Vergleichsverbindungen in PRK- und HSF-Zellkulturen

Verbindung(+) IDso (ug/ml)

Nr.

Vaccinia

Herpes simplex-1

(PRK)

(HSF)

Stamm KOS

Stamm Mclntyre

Stamm F

(PRK)

(HSF)

(PRK)

1

10

2

0,07

0,1

2

7

0,7

0,007

0,01

3

10

7

0,1

0,07

0,2

4

10

1

0,01

0,02

0,01

5

0,02

0,2

0,1

0,2

0,15

0,2

Es waren Verbindung Nr. 1 = E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin Verbindung Nr. 2 = E-5-(2-BromvinyI)-2'-Desoxyuridin Verbindung Nr. 3 = E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin Verbindung Nr. 4 = E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxyuridin Verbindung Nr. 5 = 5-Jod-2'-desoxyuridin

Test 2

Es wurde der Inhibierungs-Effekt von E-5-(2-Halogen-vinyl)-2'-Desoxycytidinen und einer Vergleichsverbindung auf die Virus-Multiplikation von Herpes simplex-1-Virus (Stamm KOS) in PRK-Zellkulturen gemessen.

Nach Ausbildung von einschichtigen Zellrasen aus PRK-Zellen in Petrischalen aus Plastik (Durchmesser: 55 mm) wurde mit Herpes simplex-1 (4,5 logioPFU/0,5 ml/Petrischale) 1 Std. lang bei 37°C beimpft, und unmittelbar danach wurden 0,1 ug/ml von einer der zu untersuchenden Verbindungen zur Einwirkung gebracht. Dann wurden die Zellkulturen über verschiedene Zeiträume (1,2 oder 3 Tage lang) bei 37°C bebrütet. Am Ende der Inkubationszeit wurden die 60 Zellen auf -70° tiefgefroren, und die Zellhomogenate wurden durch Plaque-Bildung in VERQ-Zellkulturen auf ihren Gehalt an Virus untersucht (VERO = eine kontinuierliche Zelllinie auf unbehandelten Affenzellen) (VERO = a continuous cell line of green monkey cells). Die Ergebnisse 65sind in Tabelle 2 in Form der Differenzen an Virus-Ausbeute zwischen den behandelten mit Virus infizierten Zellkulturen und den unbehandelten mit Virus infizierten Zellkulturen angegeben. «PFU» bedeutet Einheiten der Plaque-Bildung.

7

647 245

Tabelle 2

Inhibierungs-Effekt von E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidinen gegen Multiplikation des Virus Herpes simplex-1 (Stamm KOS) in PRK-Zellkulturen

Verbindung Dosis Reduktion an Virus-Ausbeute (log,0 g PFU/ml), verglichen

(Ug/ml) mit Kontroll-Zellkulturen (Virus-infiziert, unbehandelt)

Tage nach Infektion 1 2 3

E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin 10 3,8 2,9 2,2

E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin 10 4,3 2,8 2,0

5-Jod-2'-desoxyuridin 10 4,0 2,6 1,9

Aus Tabelle 2 ist zu ersehen, dass die durch E-5-(2-Halo-genvinyl)-2'-Desoxycytidine bewirkte Reduktion an Virus-Ausbeute vergleichbar ist mit derjenigen, die die Standard-Vergleichsverbindung 5-Jod-2'-desoxyuridin bringt.

Test 3

Es wurde die antimetabolische Aktivität von E-5-(2-Halo-genvinyl)-2'-Desoxycytidinen und Vergleichsverbindungen in PRK-Zellkulturen gemessen.

Dazu wurden die Inkorporation von bestimmten radiomarkierten DNS-Precursoren in DNS der Zellen und die Wirkung von E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidinen sowie Vergleichsverbindungen darauf untersucht. Die Untersuchungsmethode ist beschrieben worden von De Clercq u. Mitarb. in Biochemical Pharmacology, 26, 794-797 (1977),

sowie von De Clercq u. Mitarb. in Molecular Pharmacology, 14,422-430(1978).

Als DNS-Precursoren wurden (MethyPH) (2'-Desoxythy-midin) (TdR) und (2-'4C) (2'-Desoxyuridin) (UdR) benutzt. 20 Die Zellen wurden in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen der zu untersuchenden Verbindungen (im Bereich von 1 bis 200 |ig/ml) 16 Stunden lang der Einwirkung von 0,12 p.Ci:0,01 nmol (MethyPH)TdR (je 105 Zellen) oder 14 uCi/250 nmol (2-14C)UdR (je 105 Zellen) ausgesetzt. Dann 25 wurde die Inkorporation des radiomarkierten Precursors wie beschrieben gemessen, und es wurde der IDso-Wert bestimmt. Der IDso-Wert entspricht der Inhibierungsdosis-50, das heisst derjenigen Konzentration an Verbindung, die erforderlich ist, die Inkorporation von entweder (Methyl-3H)TdR oder 30 (2-l4C)UdR um 50% zu inhibieren.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Antimetabolische Aktivität von E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidinen und Vergleichsverbindungen in PRK-Zellkulturen

Verbindung IDso (|xg/ml)

(Methyl- 'H lTdR Incorporation in (2-MC)UdR Incorporation in Zell-DNS Zell-DNS

E-5-(2-Bromvinyl)-2'-desoxycytidin >200 >200

E-5-(2-Bromvinyl)-2'-desoxyuridin 100(70) 100(70)

E-5-(2-Jodvinyl)-2'-desoxycytidin >200 >200

E-5-(2-Jodvinyl)-2'-desoxyuridin 80(70) 150(70)

5-Jod-2'-desoxyuridin (2,5) (1,2)

N.B. Die in Klammern stehenden Zahlenwerte wurden in gesonderten Experimenten, wie von De Clercq und Mitarb. in Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 76,2947-2951 (1979), berichtet, gewonnen.

Man erkennt aus Tabelle 3, dass keines der E-5-(2-Halo-genvinyl)-2'-Desoxycytidine eine Inhibierung der Inkorporation von (Methyl-3H)TdR oder (2-MC)UdR in zellulare DNS verursacht, sogar dann nicht, wenn die Verbindung in so hoher Konzentration wie 200 ug/ml, die höchste untersuchte Konzentration, verwendet wurde.

Test 4

Es wurde noch der antivirale Index von E-5-(2-Halogen-vinyl)-2'-Desoxycytidinen und Vergleichsverbindungen in PRK Zellkulturen aus den bei den zuvor beschriebenen Tests gewonnenen Messergebnissen bestimmt.

Der Antiviral-Index wurde als das Verhältnis des IDso-Wertes für die (2-l4C)UdR-Inkorporation in Zell-DNS zu dem IDso-Wert für die Herpes simplex-1-(Stamm KOS)-Virus-Replikation (vergleiche Tabellen 1 und 3) ermittelt.

Die Resultate sind in Tabelle 4 angegeben.

Tabelle 4

Antiviral-Index von

E-5-(2-Halogenvinyl)-2 ' -Desoxycytidinen und ss Vergleichsverbindungen in PRK-Zellkulturen

Verbindung

Antiviral-Index

E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin

> 3 000

E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxyuridin

14300(10 000)

E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin

> 2 000

E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxyuridin

15 000 (7000)

5-Jod-2'-desoxyuridin

(12) .

N.B. Vergleiche Fussnote zu Tabelle 3 für die in Klammern angegebenen Zah-lenwerte.

647 245

Aus Tabelle 4 ist ersichtlich, dass der Antiviral-Index für die erfindungsgemässen E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycy-tidine auf (viel) höher als 2000-3000 ansteigt.

Diese Verbindungen zeigten bei der höchsten untersuchten Konzentration (200 (ig/ml) keine Toxizität, der genaue Antiviral-Index konnte nicht exakt berechnet werden.

Aus der vorstehenden Beschreibung ergibt sich, dass die erfindungsgemässen E-5-(2-Halogenvinyl)-2' -Desoxycyti-dine, z.B. E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin und E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin, eine exzellente und hochspezifische antivirale Aktivität gegen das Virus des Herpes simplex haben und dass ihre Toxizität in Zellkulturen anscheinend Null ist. Verglichen mit bekannten E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxyuridinen haben sie ersichtlich eine höhere Spezifität gegen das Virus Herpes simplex und eine geringere Toxizität gegen lebende Zellen in Zellkulturen. Wenn gleich der absolute Wert ihrer antiviralen Aktivität möglicherweise etwas niedriger liegt als diejenige der bekannten 2'-Desoxyuridine, haben sie den Vorteil, dass ihnen anscheinend jegliche Toxizität in Zellkulturen fehlt, so dass die erfindungsgemässen Verbindungen wahrscheinlich therapeutische Indeces zu erreichen vermögen, die mindestens ebenso hoch oder sogar noch höher liegen als diejenigen, die die bekannten 2'-Des-oxyuridine erreichen. Erfindungsgemässe Verbindungen eignen sich daher hervorragend zur Verwendung bei der Bekämpfung von Virus-Erkrankungen bei Menschen und Tieren und zur Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen für die Behandlung von durch das Virus Herpes simplex verursachte Erkrankungen.

8

Pharmazeutische Zubereitungen, die als Wirkstoff eine erfindungsgemässe Verbindung, zum Beispiel E-5-(2-Brom-vinyl)-2'-Desoxycytidin oder E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycy-tidin enthalten, können in Form von Pulvern, Suspensionen, s Lösungen, Emulsionen oder auch als Salben oder Pasten formuliert werden; sie lassen sich für parenterale (z.B. intradermale, intramuskuläre, intrathekale) Injektionen, für orale, rektale, intravaginale oder intranasale Verabreichungen benutzen oder für topikale Applikation (z.B. bei Verlet-lo zungen der äusseren Haut, der Schleimhaut und des Auges) einsetzen. Solche pharmazeutische Zubereitungen können hergestellt werden dadurch, dass man in üblicher Weise den oder die aktiven Wirkstoffe mit pharmazeutisch verträglichen üblichen Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffen kom-is biniert. Zu solchen Träger-, Hilfs- und Zusatzstoffen gehören beispielsweise wässrige oder nicht-wässrige Lösungsmittel, Stabilisatoren, Suspensionsmittel, Dispersionsmittel, Benetzungsmittel und andere für die Formulierung von pharmazeutischen Zubereitungen dem Fachmann bekannte Sub-20 stanzen. Die pharmazeutischen Zubereitungen können gewünschtenfalls auch noch geeignete Additive, wie Poly-ethylenglykole, Farbstoffe und/oder Parfüms enthalten.

In den pharmazeutischen Zubereitungen wird der erfindungsgemässe Wirkstoff normalerweise in einer Menge von 2s wenigstens 0,1 Gew.-%/Volumen vorhanden sein. Die bestimmte Konzentration hängt im Einzelfall ab von der zu behandelnden Krankheit und der gewählten Art der Verabreichung. Im allgemeinen hält sich die Konzentration zwischen etwa 0,1 % und 100%.

B

Claims

647245

PATENTANSPRÜCHE

1. Desoxycytidin-Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidin handelt.
2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin handelt.
3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin handelt.
4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in 2'-Des-oxycytidin einen Halogenvinylrest als E-5-(2-Halogenvinyl)-Gruppe einführt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man 5-Quecksilber(II)-chlorid-2'-desoxycytidin und ein Alkylacrylat mit einem Lithiumpalladiumchlorid-Kataly-satorzur Reaktion bringt, das resultierende E-5-(2-Carbalk-oxyvinyl)-2'-Desoxycytidin hydrolysiert und das resultierende E-5-(2-Carboxyvinyl)-2'-Desoxycytidin zu dem E-5-(2-Halogenvinyl)-2' -Desoxycytidin halogeniert.
6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein in 1-Stellung eine reaktive Gruppe aufweisendes Derivat von 2-Desoxy-D-erythropentofuranose, dessen Hydroxylgruppen Schutzgruppen tragen, mit einem 2-O-Trialkylsi-lylderivat von E-5-(2-Halogenvinyl)-cytosin umsetzt und danach die Schutzgruppen von den Hydroxylgruppen entfernt.
7. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Wirkstoff und Träger-, und/oder Zusatzstoffe.

fung von durch das Herpes simplex-Virus verursachte Erkrankungen bei Menschen und Tieren eignen.

Zur Lösung dieser Aufgabe sind bei der Erfindung die in den Ansprüchen 1 bis 3 angegebenen neuen Desoxycytidin-s Verbindungen, und zwar die E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Des-oxycytidine, insbesondere das E-5-(2-Bromvinyl)-2'-Desoxycytidin und das E-5-(2-Jodvinyl)-2'-Desoxycytidin, vorgesehen. Dabei werden noch in den Ansprüchen 4 bis 6 für die Herstellung der neuen Verbindungen vorteilhafte Verfahren io beansprucht.

E-5-(2-Halogenvinyl)-2'-Desoxycytidine sind chemische Verbindungen, die durch die folgende Strukturformel (1) wiedergegeben werden können:

,Hal

:c=c

1