BRPI0912046B1 - Composições de hibridizaqao e seu uso, bem como metodo de hibridizaqao de sequencias de acido nucleico - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES DE HIBRIDIZAÇÃO E SEU USO, BEM COMO MÉTODO DE HIBRIDIZAÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO. A invenção refere-se a métodos e composições para hibridização de pelo menos uma molécula para um alvo. A invenção pode, por exemplo, eliminar o uso de, ou reduzir a dependência de formamida em hibridização. Composições para uso na invenção incluem uma composição aquosa compreendendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico e pelo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a composições aquosas para uso em hibridização, por exemplo, para uso em hibridização in situ (ISH).

[0002] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se ao campo de exame molecular de DNA e RNA. Em particular, a invenção refere-se ao campo de citologia, histologia, e biologia molecular. Em um aspecto, a presente invenção refere-se à energia (por exemplo, aquecimento e tempo de incubação) requerida durante hibridização entre ácidos nucléicos, por exemplo, em hibridização in situalvejando DNA e RNA.

ANTECEDENTE E DESCRIÇÃO

[0003] A estrutura de hélice dupla de DNA é estabilizada por ligação de hidrogênio entre bases sobre filamentos opostos quando as bases são pareadas de um modo particular (A+T ou G+C). Este pare- amento de base complementar (hibridização) é central para todos os processos que envolvem ácidos nucléicos.

[0004] Em um exemplo básico de hibridização, fragmentos ou sequências de ácido nucleico ligam-se a um fragmento ou sequência de ácido nucleico complementar. Por exemplo, a hibridização pode usar sondas de ácido nucleico, designadas ligarem-se, ou "hidridizarem-se," com um alvo, por exemplo, DNA ou RNA. Um tipo de hibridização, hibridização in situ (ISH), inclui hibridização em um alvo em um espécimen em que o espécimen pode ser in vivo, ou por exemplo, fixado ou aderido a um slide de vidro. As sondas podem ser rotuladas para fazer a identificação da sonda-híbrido alvo possível pelo uso de um esca- ner/microscópio de fluorescência ou campo de brilho. O fragmento ou sequência é tipicamente um ácido nucleico de filamento duplo ou único, tal como um DNA, RNA, ou análogos. Em algumas modalidades, o fragmento ou sequência pode ser uma sonda que pode ser rotulada usando rótulos radioativos tais como 31P, 33P, ou 32S, rótulos não- radioativos tais como digoxigenina e biotina, ou rótulos fluorescentes. Tais sondas rotuladas podem ser usadas para detectar anormalidades genéticas em uma sequência alvo, fornecendo informação valiosa, por exemplo, sobre distúrbios pré-natais, câncer, e outras doenças genéticas ou infecciosas.

[0005] A eficiência e precisão de ensaios de hibridização de ácido nucleico principalmente dependem de pelo menos um de três principais fatores: a) condições de desnaturação (isto é, separação de, por exemplo, dois filamentos de ácido nucleico), b) condições de renatura- ção (isto é, retemperamento de, por exemplo, dois filamentos de ácido nucleico), e c) condições de lavagem pós-hibridização.

[0006] Experimentos de hibridização tradicional, tais como ensaios de ISH, usam uma solução contendo formamida para desnaturar ácido nucleico de filamento duplo. Formamida é um solvente que tem um efeito de desestabilização sobre o estado helicoidal de, por exemplo, DNA, RNA, e análogos deslocando livremente e uniformemente moléculas de hidrato ligadas. Além disso, a formamida estabiliza o estado de espiral de DNA, RNA, e análogos por 'formamidação' dos sítios de ligação Watson-Crick das bases. Entretanto, a formamida é um material perigoso tóxico, submetido a regulações rigorosas para uso e excreção.

[0007] Além disso, o uso de formamida, ao mesmo tempo que adotado como a técnica padrão para hibridização é estorvado pelo longo tempo requerido para completar a hibridização, dependendo das condições e dos fragmentos ou sequências de ácido nucleico usados. Por exemplo, a etapa de desnaturação é seguida por uma etapa de hibridização demorada mais longa, que, por exemplo, em um protocolo de hibridização fluorescente tradicional in situ (FISH) demora 14 a 24 horas, e pode mesmo tomar até 72 horas. Exemplos de tempos de hibridização tradicionais são mostrados nas figuras 1 e 2,

[0008] A etapa de retemperamento (isto é, hibridização) de dois filamentos complementares de cadeias de ácido nucleico é por grande diferença o aspecto mais demorado de um ensaio usando hibridização. Até agora acredita-se que o uso de agentes caotrópicos, tais como formamida, hidrogênio de guanidínio, e ureia, que interfere com os sítios de ligação Watson-Crick de bases de ácido nucleico e desse modo atrapalha as ligações de hidrogênio entre bases de ácido nucleico complementares, foi o único meio de reduzir a temperatura de fusão (Tm) das cadeias complementares. Entretanto, embora o uso de agentes caotrópicos reduza a Tm, estes agentes parecem significan- temente prolongar o tempo de hibridização em comparação com a hibridização em uma solução aquosa sem um agente caotrópico. Além disso, além da desvantagem do longo tempo de processamento, o uso de uma alta concentração de formamida parece incorrer em destruição morfológica de estrutura celular, nuclear, e/ou cromossômica. Final-mente, a formamida é considerada uma química tóxica e perigosa para humanos.

[0009] A presente invenção fornece diversas vantagens potenciais sobre a técnica anterior, tais como tempos de hibridização mais rápidos, menores temperaturas de hibridização, e solventes de hibridização menos tóxicos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00010] É um objetivo da presente invenção fornecer composições que resultam em pelo menos uma das seguintes vantagens: procedimentos de hibridização altamente sensíveis, tecnicamente fáceis, flexíveis e seguros, e análises rápidas. Em algumas modalidades, por exemplo, uma vantagem pode ser a capacidade de adaptar o tempo de hibridização variando a temperatura da reação de hibridização para um grau muito maior do que está disponível usando métodos da técnica anterior. Por exemplo, hibridização pode ser possível em temperatura ambiente.

[00011] Em uma modalidade, as composições e métodos da invenção reduzem a energia necessária para hibridização. As composições e métodos da invenção são aplicáveis a qualquer técnica de hibridização. As composições e métodos da invenção são também aplicáveis a qualquer sistema molecular que hibridiza ou liga-se usando pareamen- to de base, tal como, por exemplo, DNA, RNA, PNA, LNA, e análogos sintéticos e naturais dos mesmos.

[00012] É um outro objetivo da invenção fornecer métodos de hibridização e composições que preservam a morfologia de uma amostra biológica. É outro objetivo da invenção fornecer uma composição e procedimento de hibridização não tóxicos. É, todavia, outro objetivo da invenção fornecer uma técnica de hibridização de baixa evaporação. Um outro objetivo da invenção é fornecer a técnica de hibridização de- tectável com uma objetiva de 20x. Todavia outro objetivo da invenção é fornecer uma composição com uma baixa concentração de sonda. É outro objetivo da invenção reduzir e/ou remover a necessidade de blo-queio de ligação não específica. As composições e métodos da invenção podem também permitir o uso de sondas heterogêneas sem a necessidade de bloquear, remover, ou de outro modo incapacitar a ligação de, por exemplo, sequências repetitivas em uma amostra biológica.

[00013] Em uma modalidade, o método de hibridização de ácido nucleico e composições da presente invenção são úteis para a análise in vivo ou in vitro de DNA genômico, cromossomas, fragmentos de cromossoma, genes, e aberrações de cromossoma tais como translo-cações, deleções, amplificações, inserções, mutações, ou inversões associadas com uma condição ou um doença normal. Além disso, os métodos e composições são úteis para a detecção de agentes infecciosos bem como mudanças em níveis de expressão de RNA, por exemplo, mRNA e seu DNA complementar (cDNA).

[00014] Outros usos incluem a análise in vivo ou in vitro de RNA mensageiro (mRNA), RNA viral, DNA virai, RNA de interferência pequeno (siRNA), RNA nuclear pequeno (snRNA), RNA de não codificação (ncRNA, por exemplo, tRNA e rRNA), RNA mensageiro de transferência (tmRNA), RNA micro (miRNA), RNA de interação de piwi (piR- NA), RNA de não codificação longa, RNA nucleolar pequeno (snoR- NA), RNA antissentido, RNA de filamento duplo (dsRNA), metilações e outras modificações de base, polimorfismos de nucleotideo único (SNPs), variações de número de cópia (CNVs), e ácidos nucléicos rotulados com, por exemplo, radioisótopos, moléculas fluorescentes, bio- tina, digoxigenina (DIG), ou antígenos, sozinhos ou em combinação com ácidos nucléicos não rotulados.

[00015] O método de hibridização de ácido nucleico e composições da presente invenção são úteis para análise in vivo ou in vitro de ácidos nucléicos usando técnicas tais como PCR, PCR in situ, Northern blot, Southern blot, citometria de fluxo, autoradiografia, microscopia por fluorescência, quimioluminescência, imunoistoquímica, cariótipo virtual, ensaio de gene, microdisposição de DNA (por exemplo, hibridização genômica comparativa de disposição (disposição CGH)), representação de expressão de gene, Gene ID, disposição Tiling, eletroforese de gel, eletroforese capilar, e hibridizações in situ tais como FISH, SISH, CISH. Os métodos e composições da invenção podem ser usados em amostras in vitro e in vivo tais como esfregaços da medula óssea, esfregaços sanguíneos, preparações de tecido embutidas em parafina, amostras de tecido enzimaticamente dissociadas, medula ós-sea, amniócitos, preparações de citospina, impressões, etc.

[00016] Em uma modalidade, a invenção fornece métodos e composições para hibridização de pelo menos uma molécula para um alvo. A invenção pode, por exemplo, eliminar o uso de, ou reduzir a dependência de formamida. Por exemplo, os métodos e composições da invenção podem reduzir a barreira de energia para hibridização sem o uso de formamida. A barreira de energia menor pode reduzir o tempo e/ou a temperatura necessária para a hibridização. Por exemplo, a invenção pode permitir a hibridização em temperaturas menores ou pode permitir rápida hibridização em temperaturas maiores. Desse modo, em alguns aspectos, a presente invenção supera uma etapa mais demorada em ensaios de hibridização.

[00017] Um aspecto da invenção é uma composição ou solução para uso em hibridização. Composições para uso na invenção incluem uma composição aquosa compreendendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico e pelo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo. Uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo é uma quantidade que possibilita hibridização. Por exemplo, um meio de testar se a quantidade de solvente aprótico polar que é eficaz para possibilitar a hibridização é para de-terminar se o solvente aprótico polar, quando usado nos métodos de hibridização e composições descritos aqui, tal como o exemplo 1, produz um sinal detectável e/ou um produto de ácido nucleico amplificado.

[00018] Exemplos não limitantes de quantidades eficazes de solventes apróticos polares include, por exemplo, cerca de 1% a cerca de 95% (v/v). Em algumas modalidades, a concentração de solvente aprótico polar é de 5% a 60% (v/v). Em outras modalidades, a concentração de solvente aprótico polar é de 10% a 60% (v/v). Em ainda ou-tras modalidades, a concentração de solvente aprótico polar é de 30% a 50% (v/v). Concentrações de 1% a 5%, 5% a 10%, 10%, 10% a 20%, 20% a 30%, 30% a 40%, 40% a 50%, ou 50% a 60% (v/v) são também adequadas. Em algumas modalidades, o solvente aprótico polar estará presente em uma concentração de 0,1%, 0,25%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, ou 5% (v/v). Em outras modalidades, o solvente aprótico polar estará presente em uma concentração de 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5%, ou 20% (v/v).

[00019] De acordo com outro aspecto da presente invenção a composição aquosa compreendendo um solvente aprótico polar tem toxicidade reduzida. Por exemplo, uma composição menos tóxica do que soluções de hibridização tradicionais pode compreender uma composição com a condição de que a composição não contenha formamida, ou com a condição de que a composição contenha menos do que 10%, ou menos do que 5%, ou menos do que 2%, ou menos do que 1%, ou menos do que 0,5%, ou menos do que 0,1%, ou menos do que 0,05%, ou menos do que 0,01% de formamida. Uma composição menos tóxica pode também compreender uma composição com a condição de que a composição não contenha sulfóxido de dimetila (DMSO), ou com a condição de que a composição contenha menos do que 10%, 5%, 2%, ou menos do que 1%, ou menos do que 0,5%, ou menos do que 0,1%, ou menos do que 0,05%, ou menos do que 0,01% DMSO.

[00020] Em um aspecto da invenção, solventes apróticos polares adequados para uso na invenção podem ser selecionados com base em seus Parâmetros de Solubilidade Hansen. Por exemplo, solventes apróticos polares adequados podem ter um parâmetro de solubilidade de dispersão entre 17,7 a 22,0 MPa1/2, um parâmetro de solubilidade polar entre 13 a 23 MPa1/2, e um parâmetro de solubilidade em ligação a hidrogênio entre 3 a 13 MPa1/2,

[00021] De acordo com um aspecto da presente invenção, solventes apróticos polares adequados para uso na invenção são compostos cíclicos. Um composto cíclico tem uma estrutura de base cíclica. Exemplos incluem os compostos cíclicos descritos aqui. Em outras modalidades, o solvente aprótico polar pode ser escolhido de fórmulas 1 a 4 abaixo :

em que X é O e R1 é alquildiila.

[00022] De acordo com outro aspecto da invenção, solventes apróticos polares adequados para uso na invenção podem ser escolhidos da fórmula 5 abaixo:

em que X é opcional e se presente, é escolhido de O ou S; em que Z é opcional e se presente, é escolhido de O ou S; em que A e B independentemente são O ou N ou S ou parte da alquildiila ou uma amina primária; em que R é alquildiila; e em que Y é O ou S ou C.

[00023] Exemplos de solventes apróticos polares adequados de acordo com a fórmula 5 são fornecidos nas fórmulas 6 a 9 abaixo:

[00024] De acordo com ainda outro aspecto da invenção, o solvente aprótico polar tem funcionalidade lactona, sulfona, nitrila, sulfito, ou carbonato. Tais compostos são distinguidos por suas constantes dielé- tricas relativamente elevadas, momentos dipolo elevados, e solubilidade em água.

[00025] De acordo com outro aspecto da invenção o solvente aprótico polar tendo funcionalidade lactona é y-butirolactona (GBL), o solvente aprótico polar tendo funcionalidade sulfona é o sulfolano (SL), o solvente aprótico polar tendo funcionalidade nitrila é acetonitrila (AN), o solvente aprótico polar tendo funcionalidade de sulfito é sulfito de glicol/sulfito de etileno (GS), e o solvente aprótico polar tendo funcionalidade de carbonato é carbonato de etileno (EC), carbonato de propileno (PC), ou tiocarbonato de etileno (ETC).

[00026] De acordo ainda com outro aspecto, a invenção descreve um método de hibridização de sequências de ácido nucleico que compreende: - fornecer uma primeira sequência de ácido nucleico, - fornecer uma segunda sequência de ácido nucleico, - fornecendo uma composição aquosa compreendendo pelo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo, e - combinar as primeira e segunda sequências de ácido nucleico e a composição aquosa durante pelo menos um período de tempo suficiente para hibridizar a primeira e segunda sequências de ácido nucleico.

[00027] Em uma modalidade, é fornecida uma quantidade suficiente de energia para hibridizar o primeiro e segundo ácidos nucleicos.

[00028] Em uma modalidade, a hibridização da primeira sequência de ácido nucleico para a segunda sequência de ácido nucleico ocorre em menos do que 8 horas, tal como, por exemplo, menos do que 6 horas, menos do que 5 horas, menos do que 4 horas, menos do que 3 horas, menos do que 2 horas, ou menos do que 1 hora.

[00029] O método pode, por exemplo, compreender: - fornecer uma primeira sequência de ácido nucleico, e - aplicar uma composição aquosa compreendendo uma segunda sequência de ácido nucleico e pelo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo para a referida primeira sequência de ácido nucleico durante pelo menos um período de tempo suficiente para hibridizar as primeira e segunda sequências de ácido nucleico.

[00030] Em uma modalidade, é fornecida uma quantidade suficiente de energia para hibridizar os primeiro e segundo ácidos nucleicos.

[00031] Em uma modalidade, a hibridização da primeira sequência de ácido nucleico para a segunda sequência de ácido nucleico ocorre em menos do que 8 horas, tal como, por exemplo, menos do que 6 horas, menos do que 5 horas, menos do que 4 horas, menos do que 3 horas, menos do que 2 horas, ou menos do que 1 hora.

[00032] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, a energia de hibridização é fornecida por aquecimento da composição aquosa e sequência de ácido nucleico. Desse modo, a etapa de hibridização pode incluir as etapas de aquecimento e resfriamento da composição aquosa e sequência de ácidos nucléicos.

[00033] De acordo com outro aspecto da invenção, as etapas de desnaturação e hibridização podem ocorrer separadamente. Por exemplo, a espécimen pode ser desnaturada com uma solução sem sonda e a seguir hibridizada com sonda.

[00034] Um outro aspecto da invenção compreende um método em que a etapa de fornecimento de uma quantidade suficiente de energia para hibridizar os ácidos nucléicos envolve uma etapa de aquecimento realizada pelo uso de microondas, banhos quentes, placas quentes, fio quente, elemento peltier, indução de aquecimento, ou lâmpadas quentes.

[00035] De acordo com outro aspecto a presente invenção refere-se a um método em que a hibridização leva menos do que 1 hora. Em outras modalidades, a hibridização leva menos do que 30 minutos. Em ainda outras modalidades, a hibridização leva menos do que 15 minutos. Em outras modalidades, a hibridização leva menos do que 5 minutos.

[00036] De acordo com um outro aspecto, a invenção refere-se ao uso de uma composição compreendendo entre 1 e 95% (v/v) de pelo menos um solvente aprótico polar em ensaios de hibridização.

[00037] De acordo ainda com outro aspecto, a invenção refere-se ao uso de uma composição compreendendo uma composição aquosa como descrito nesta invenção para uso em ensaios de hibridização.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00038] A figura 1 representa um curso de tempo típico para detecção de único loco com sondas FISH rotuladas primárias em porções de tecido embutidas em parafina fixada por formaldeído (espécimens histológicos). As barras representam a hibridização realizada usando uma solução tradicional (topo) e um curso de tempo típico para a hibridização realizada usando a composição da invenção (base). A primeira barra à esquerda em cada curso do tempo representa a etapa de desparafinação; a segunda barra representa a etapa de pré-tratamento térmico; a terceira barra representa a etapa de digestão; a quarta barra representa a etapa de desnaturação e hibridização; a quinta barra representa a etapa de lavagem rigorosa; e a sexta barra representa a etapa de montagem.

[00039] A figura 2 representa um curso de tempo típico para detecção de único loco com sondas FISH rotuladas primárias em espécimens citológicos. As barras representam a hibridização realizada usando uma solução tradicional (topo) e um curso de tempo típico para a hibridização realizada usando a composição da invenção (base). A primeira barra à esquerda em cada curso do tempo representa a etapa de fixação; a segunda barra representa a etapa de desnaturação e hi-bridização; a terceira barra representa a etapa de lavagem rigorosa; e a quarta barra representa uma etapa de montagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA A. Definições

[00040] No contexto da presente invenção os seguintes termos devem ser entendidos como segue:

[00041] "Amostra biológica" deve ser entendida como qualquer amostra in vivo, in vitro, ou in situ de uma ou mais células ou fragmentos celulares. Isto pode, por exemplo, ser um organismo unicelular ou multicelular, porção de tecido, amostra citológica, disseminação de cromossoma, sequência de ácidos nucleicos purificada, sequência de ácido nucleicos artificialmente preparadas, por exemplo, preparadas por um sistema ∞m base biológica ou por síntese química, microdis-posição, ou outra forma de lasca de ácido nucleico. Em uma modalidade, uma amostra é uma amostra mamífera, tal como, por exemplo, uma amostra humana, murina, de rato, felina, ou canina.

[00042] "Ácido nucleico,""cadeia de ácido nucleico," e "sequência de ácido nucleico" significa qualquer coisa que se liga ou hibridiza usando pareamento de base incluindo, oligômeros ou polímeros tendo um esqueleto formado de análogos de ácidos nucleicos e/ou nucleotí- deos de ocorrência natural compreendendo nucleobases não padrões e/ou esqueletos não padrões (por exemplo, um ácido nucleico de peptídeo (PNA) ou ácido nucleico trancado (LNA)), ou qualquer forma derivada de um ácido nucleico.

[00043] Como aqui usado, o termo "ácido nucleico de peptídeo" ou "PNA" significa um polímero sintético tendo uma estrutura de poliamida com nucleobases pendentes (de ocorrência natural e modificadas), incluindo, porém não limitado a, qualquer dos segmentos de oligômero ou polímero referente a ou reivindicado como ácidos nucleicos de peptídeo, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos Nos 5,539,082, 5,527,675, 5,623,049, 5,714,331, 5,718,262, 5,736,336, 5,773,571, 5,766,855, 5,786,461, 5,837,459, 5,891,625, 5,972,610, 5,986,053, 6,107,470, 6,201,103, 6,228,982 e 6,357,163, WO 96/04000, todas as quais são aqui incorporadas por referência, ou qualquer das referências citadas aqui. A nucleobase pendente, tal como, por exemplo, uma base purina ou pirimidina em PNA pode ser conectada ao esqueleto por meio de um ligador tal como, por exemplo, um dos ligantes ensinados no PCT/US02/30573 ou qualquer das referências citadas aqui. Em uma modalidade, o PNA tem um Esqueleto de N-(2-aminoetil)- glicina). Os PNAs podem ser sintetizados (e opcionalmente rotulados) como ensinado no PCT/US02/30573 ou qualquer das referências citadas aqui. PNAs hibridizam firmemente, e com alta especificidade de sequência, com DNA e RNA, por que o esqueleto de PNA é inalterado.Desse modo, onda curta de PNAs pode exibir especificidade comparável a sondas de DNA ou RNA mais longas. Sonda de PNAs pode também mostrar especificidade maior em ligação ao DNA e RNA complementar.

[00044] Como aqui usado, o termo "ácido nucleico trancado" ou "LNA" significa um oligômero ou polímero compreendendo pelo menos uma ou mais subunidades de LNA. Como aqui usado, o termo "Subu- nidade de LNA" significa um ribonucleotídeo contendo uma ponte de metileno que conecta o 2-oxigênio da ribose com o 4'-carbono. Veja geralmente, Kurreck, Eur. J. Biochem., 270:1628-44 (2003).

[00045] Exemplos de ácidos nucléicos e análogos de ácido nucleico também incluem polímeros de monômeros de nucleotideo, incluindo deoxiribonucleotídeos de filamento duplo e único (DNA), ribonucleotí- deos (RNA), formas a-anoméricas dos mesmos, análogos sintéticos e naturais dos mesmos, e os similares. A cadeia de ácido nucleico pode ser composta totalmente de deoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, ácidos nucléicos de peptídeo (PNA), ácidos nucléicos trancados (LNA), análogos sintéticos ou naturais dos mesmos, ou misturas dos mesmos. DNA, RNA, ou outros ácidos nucléicos como definidos aqui podem ser usados no método e composições da invenção.

[00046] "Solvente aprótico polar"refere-se a um solvente orgânico tendo um momento dipolo de cerca de 2 unidades debye ou mais, uma solubilidade em água de pelo menos cerca de 5% (volume) em ou quase na temperatura ambiente, isto é, cerca de 20°C, e que não sofre significante permuta de hidrogênio em pH aproximadamente neutro, isto é, na faixa de 5 a 9, ou na faixa de 6 a 8, Solventes apróticos polares incluem aqueles definidos de acordo com os Parâmetros de Solubilidade Hansen descritos abaixo.

[00047] "Alquildiila"refere-se a uma cadeia saturada, ou insaturada, ramificada, linear ou radical hidrocarboneto cíclico tendo dois centros de radical monovalente derivados pela remoção de um átomo de hidrogênio de cada de dois diferentes átomos de carbono de um alcano, alceno, ou alquina origem.

[00048] "Solução aquosa"deve ser entendido como uma solução contendo água, mesmo quantidades pequenas de água. Por exemplo, uma solução contendo 1 de água deve ser entendida como uma solução aquosa.

[00049] "Hibridização" deve ser entendida incorporar ambas as etapas de desnaturação e retemperamento do procedimento de hibridização a menos que de outro modo especificado.

[00050] "Composição de Hibridização" refere-se a uma solução aquosa da invenção para realizar o procedimento de hibridização, por exemplo, para ligar uma sonda a uma sequência de ácido nucleico. Composições de hibridização podem compreender, por exemplo, pelo menos um solvente aprótico polar, pelo menos uma sequência de ácido nucleico, e uma solução de hibridização. Composições de hibridização não compreendem enzimas ou outros componentes, tais como trifosfatos de deoxinucleosídeo (dNTPs), para amplificar ácidos nuclei-cos em uma amostra biológica.

[00051] "Solução de hibridização" refere-se a uma solução aquosa para uso em uma composição de hibridização da invenção. Soluções de hibridização são descritas em detalhes abaixo e pode compreender, por exemplo, agentes de tamponamento, agentes de aceleração. Agentes de quelação, sais, detergentes, e agentes de bloqueio.

[00052] "Composição PCR" refere-se a uma solução aquosa da invenção para realizar um procedimento de hibridização para amplificar a sequência de ácido nucleico. Composições PCR podem compreender, por exemplo, pelo menos um solvente aprótico polar, pelo menos uma enzima para amplificar ácidos nucleicos, uma série de iniciadores de oligonucleotídeo de ácido nucleico, uma mistura de dNTPs, e uma solução PCR.

[00053] "Solução PCR"refere-se a uma solução aquosa para uso na composição PCR da invenção. As soluções PCR podem compreender por exemplo, agentes de tamponamento, agentes de aceleração. Agentes de quelação, sais, e detergentes.

[00054] "Parâmetros de Solubilidade Hansen"e "HSP"referem-se aos seguintes parâmetros de energia de coesão (solubilidade): (1) o parâmetro de solubilidade de dispersão (δD, "parâmetro D"), que mede interações não polares derivadas de forças atômicas; (2) o parâmetro de solubilidade polar (δP, "parâmetro P"), que mede interações dipolo permanente - dipolo permanente; e (3) a ligação de parâmetro de solubilidade de hidrogênio (δH, "parâmetro H"), que mede a permuta de elétron. Os Parâmetros de Solubilidade Hansen são também definidos abaixo.

[00055] "Sequências Repetitivas" deve ser entendido como referin- do-se a rápido recozimento (aproximadamente 25%) e/ou intermedia- riamente recozendo (aproximadamente 30%) componentes de geno- mas mamíferos. Os componentes de rápido recozimento contêm pequenas (alguns nucleotídeos longos) sequências altamente repetitivas usualmente encontradas em tandem (por exemplo, DNA satélite), enquanto que os componentes de recozimento intermediário contêm DNA repetitivos entremeados. Sequências repetidas entremeadas são clarificadas como SINEs (sequências de repetição entremeadas curtas) ou LINEs (sequências de repetição entremeadas longas), ambas as quais são classificadas como retrotransposons em primatas. SINEs e LINEs incluem, porém não estão limitados a, repetições Alu, repetições Kpn, repetições de dinucleotídeo, repetições de trinucleotídeo, repetições de tetranucleotídeo, repetições pentanucleotídeo e repetições de hexanucleotídeo. Repetições Alu criam a maioria das SINEs humanas e são caracterizadas por uma sequência de consenso de aproximadamente 280 a 300 pb que consiste em duas sequências similares dispostas como um dímero da cabeça à cauda. Além disso para SINEs e LINEs, sequências de repetição também existem em telô- meros de cromossoma nas terminações de cromossomas e centromeres de cromossoma, que contêm sequências de repetição distintas que existem apenas na região central de um cromossoma. Entretanto, ao contrário de SINEs e LINEs, que são dispersas aleatoriamente em todo o genoma inteiro, sequências de repetição de telomere e centromere são localizadas dentro de uma certa região do cromossoma.

[00056] "Não tóxico" e "toxicidade reduzida" são definidos com respeito à rotulagem de toxicidade de formamida de acordo com "Directive 1999/45/EC do European Parliament e do Council de 31 de maio de 1999 com respeito à aproximação das leis, regulações e provisões administrativas do Member States com relação à classificação, empacotamento, e rotulagem de preparações perigosas"(ecb.jrc.it/legislation/1999L0045EC.pdf) ("Directive"). De acordo com a Diretiva, a toxicidade é definida usando a seguinte ordem de classificação: T+ "muito tóxico"; T "tóxico", C "corrosivo", Xn "nocivo", .Xi "irritante." Frases de Risco ("frases R") descrevem os riscos da toxicidade classificada. A formamida é listada como T (tóxica) e R61 (pode causar dano à criança não nascida). Todos os se-guintes produtos químicos são classificados como menos tóxicos do que a formamida: acetonitrila (Xn, R11, R20, R21, R22, R36); sulfolano (Xn, R22); y-butirolactona (Xn, R22, R32); e carbonato de etileno (Xi , R36, R37, R38). No momento do depósito deste pedido, tritiocarbonato de etileno e sulfito de glicol não são no momento rotulados.

B. Seleção de Solvente

[00057] Solventes apróticos polares adequados para uso na invenção podem ser selecionados com base em seus Parâmetros de Solubilidade Hansen. Métodos para experimentalmente determinar e/ou calculas o HSP para um solvente são conhecidos na técnica, e O HSP foi reportado para mais de 1200 produtos químicos.

[00058] Por exemplo, o Parâmetro D pode ser calculado com precisão razoável com base em índice refrativo, ou pode ser derivados de diagramas por comparação com solventes conhecidos de similar tamanho, forma, e composição após estabelecer uma temperatura e volume molar. O Parâmetro P pode ser estimado de momentos dipolo conhecidos (veja, por exemplo, McClellan A.L., Tabelas de Momentos Dipolo Experimentais (W.H. Freeman 1963)) usando a equação 1: Equação 1: δP = 37,4 (Momento Dipolo)/V1/2 em que V é o volume molar. Não existe nenhuma equação para calcular o Parâmetro H. Em vez disso, o Parâmetro H é geralmente determinado com base nas contribuições do grupo.

[00059] As caracterizações HSP são convenientemente visualizadas usando uma representação esférica, com o HSP de um solvente de referência adequado experimentalmente determinado no centro da esfera. O raio da esfera (R) indica a variação tolerável máxima do HSP do solvente de referência que também permite uma "boa" interação ocorrer. Bons solventes estão dentro da esfera e os ruins estão fora. A distância, Ra, entre dois solventes com base em seus respectivos va-lores HSP podem ser determinados usando a equação 2: Equação 2: (Ra)2 =4(ÓDI - 6D2)2 + (δpi - δp2)2 (δm - δH2)2 em que o subscrito 1 indica a amostra de referência, o subscrito 2 indica o produto químico teste, e todos os valores são em MPa1/2> Boa solubilidade requer que Ra seja menor do que o raio experimentalmente determinado da esfera de solubilidade Ro. A diferença de energia relativa entre dois solventes, isto é, número RED, pode ser calculada tomando-se a relação de Ra para Ro, como mostrado na equação 3, Equação 3: RED = Ra/R0

[00060] Números RED menores do que 1,0 indicam alta afinidade; números RED iguais ou próximos a 1,0 indicam condições limites; e números RED progressivamente maiores indicam afinidades progressivamente menores.

[00061] Em algumas modalidades, os parâmetros D dos solventes apróticos polares da invenção são entre 17,7 a 22,0 MPa1/2, Tais parâmetros D relativamente elevados estão geralmente associados com solventes tendo estruturas cíclicas e/ou estruturas com enxofre ou ha- logênios. Compostos lineares não são prováveis de estar entre a maioria dos solventes apróticos polares adequados para uso na invenção, podem ser considerados se seus parâmetros P e H estiverem dentro das faixas como descrito abaixo. Visto que o parâmetro D é multiplicado por 4 na Equação 2, os limites são metade de Ro. Além disso, deve ser observado que os valores D de cerca de 21 ou maiores são frequentemente característicos de um sólido.

[00062] Em algumas modalidades, os parâmetros P dos solventes apróticos polares da invenção são entre 13 a 23 MPa1/2, Tais parâmetros P excepcionalmente elevados estão geralmente associados com solventes tendo um Momento Dipolo elevado e presumivelmente também um volume molecular relativamente baixo. Por exemplo, para V próximo de 60 cc/mol, o Momento Dipolo deve ser entre 4,5 e 3,1, para V próximo de 90 cc/mol, o Momento Dipolo deve ser entre 5,6 e 3,9,

[00063] Em algumas modalidades, os parâmetros H dos solventes apróticos polares da invenção são entre 3 a 13 MPa1/2, Geralmente, solventes apróticos polares tendo um grupo álcool não são úteis nas composições e métodos da invenção, visto que os parâmetros H de tais solventes seriam bastante elevados.

[00064] O volume molar do solvente aprótico polar pode também ser relevante, visto que ele entra na avaliação de todos os três Parâmetros de Solubilidade Hansen. Quando o volume molar torna-se menor, os líquidos tendem a evapora-se rapidamente. Quando o volume molar torna-se maior, os líquidos tandem a entrar na região sólida na faixa de parâmetros D e P citados acima. Desse modo, os solventes apróticos polares da invenção são de preferência próximos ao limite líquido/sólido no espaço de HSP.

[00065] Em algumas modalidades, os solventes apróticos polares da invenção têm funcionalidade lactona, sulfona, nitrila, sulfito, e/ou carbonato. Tais compostos são distinguidos por suas constantes dielé- tricas relativamente elevadas, momentos dipolo elevados, e solubilidade em água. Um solvente aprótico polar exemplar com funcionalidade de lactona é y-butirolactona (GBL), um solvente aprótico polar exemplar com funcionalidade de sulfona é o sulfolano (SL; dióxido-sulfeto de tetrametileno), um solvente aprótico polar exemplar com funcionalidade de nitrila é acetonitrila (AN), um solvente aprótico polar exemplar com funcionalidade de sulfito é sulfito de glicol/sulfito de etileno (GS), e um solvente aprótico polar exemplar com funcionalidade de carbonato são carbonato de etileno (EC), carbonato de propileno (PC), ou tritio- carbonato de etileno (ETC). A estruturas destes solventes exemplares são fornecidas abaixo e seus parâmetros de Solubilidade Hansen, números RED, e volumes molares são dados na tabela 1,

[00066] Outros solventes apróticos polares adequados que podem ser usados na invenção são compostos cíclicos tal como, por exemplo, ε-caprolactona. Além disso, pirrolidinonas substituídas e estruturas relacionadas com nitrogênio em um anel de 5 ou 6 membros, e estrutu ras cíclicas com dois grupos nitrila, ou um grupo bromo e uma nitrila, podem também ser adequados para uso na invenção. Por exemplo, N- metil pirrolidinona (mostrado abaixo) pode ser um solvente aprótico polar adequado para uso em os métodos e composições da invenção.

[00067] Outros solventes apróticos polares adequados podem conter um grupo uretano de anel (NHCOO-). Entretanto, nem todos os tais compostos são adequados, visto que 1,3-dimetil-2-imidazolidinona não produz nenhum sinal quando usado nas composições de hibridização da invenção. Alguém versado na técnica pode avaliar quanto aos compostos úteis nas composições e métodos da invenção como descrito aqui. Produtos químicos exemplares que podem ser adequados para uso na invenção são mencionados nas tabelas 2 e 3 abaixo.

[00068] A tabela 2 menciona uma lista exemplar de produtos químicos potenciais para uso nas composições e métodos da invenção com base em seus Parâmetros de Solubilidade Hansen. Outros compostos, podem de fato, também atender a estes requisitos. Alguns destes pro-dutos químicos foram usados em hibridização e/ou Solução PCRs na técnica anterior (por exemplo, sulfóxido de dimetila (DMSO) foram usados em hibridização e solução PCRs, e sulfolano (SL) foram usados em Solução PCRs), porém a maioria não. Entretanto, a técnica anterior não reconheceu que estes compostos podem ser vantajosa- mene ussados para diminuir os tempos e/ou temperaturas de hibridização, como descrito neste pedido.

[00069] Nem todos os produtos químicos listados nas tabelas 2 e 3 são adequados para uso nas composições e métodos da invenção. Por exemplo, embora DMSO seja listado na tabela 2 por que seus Parâmetros de Solubilidade Hansen (HSPs) incluem-se nas faixas citadas acima, DMSO não funciona para diminuir tempos e/ou temperaturas de hibridização nas composições e métodos da invenção. Desse modo, em algumas modalidades, a composição aquosa não contém DMSO como um solvente aprótico polar. Entretanto, inclui-se bem na experiência do técnico habitual para avaliar quanto a compostos adequados usando a orientação fornecida aqui incluindo teste de um composto em um dos exemplos fornecidos. Por exemplo, em algumas modalidades, solventes apróticos polares adequados terão HSPs dentro das faixas citadas acima e uma estrutura mostrada nas fórmulas 1 a 9 acima.

C. Composições, Tampões, e Soluções (1) Soluções de hibridização

[00070] Soluções de hibridização tradicionais são conhecidas na técnica. Tais soluções podem compreender, por exemplo, agentes de tamponamento, agentes de aceleração, agentes de quelação, sais, detergentes, e agentes de bloqueio.

[00071] Por exemplo, os agentes de tamponamento podem incluir SSC, HEPES, SSPE, PIPES, TMAC, TRIS, SET, ácido cítrico, um tampão de fosfato, tal como, por exemplo, fosfato de potássio ou pirro-fosfato de sódio, etc. Os agentes de tamponamento podem estar presentes em concentrações de 0,5x a 50x. Tipicamente, os agentes de tamponamento estão presentes em concentrações de 2x a 10x.

[00072] Os agentes de aceleração podem incluir polímeros tais como FICOLL, PVP, heparina, sulfato de dextrana, proteínas tais como BSA, glicois tais como etileno glicol, glicerol, 1,3 propanodiol, propileno glicol, ou dietileno glicol, combinações dos mesmos tais como solução de Dernhardt e BLOTTO, e solventes orgânicos tais como formamida, dimetilformamida, DMSO, etc. O agente de aceleração pode estar presente em concentrações de 1% a 80% ou 0,1x a 10x. Tipicamente, a formamida está presente em concentrações de 25% a 75%, ao mesmo tempo que DMSO, sulfato de dextrana, e glicol estão presentes em concentrações de 5% a 10%.

[00073] Os agentes de quelação podem incluir EDTA, EGTA, etc. Os agentes de quelação podem estar presentes em concentrações de 0,1 mM a 10 mM. Tipicamente, os agentes de quelação estão presentes em concentrações de 0,5 mM a 5 mM.

[00074] Os sais podem incluir cloreto de sódio, fosfato de sódio, fosfato de magnésio, etc. Os sais podem estar presentes em concentrações de 1 mM a 750 mM. Tipicamente, os sais estão presentes em concentrações de 10 mM a 500 mM.

[00075] Os detergentes podem incluir Tween, SDS, Triton, CHAPS, ácido deoxicólico, etc. O detergente pode estar presente em concentrações de 0,01% a 10%. Tipicamente, os detergentes estão presentes em concentrações de 0,1% a 1%.

[00076] Os agentes de bloqueio de ácido nucleico podem incluir, tRNA de levedura, DNA de homopolímero, DNA de esperma de salmão desnaturado, DNA de esperma de arenque, DNA humano total, DNA COT 1, etc. Os ácidos nucleicos de bloqueio podem estar presentes em concentrações de 0,05 mg/mL a 100 mg/mL.

[00077] Uma grande variação existe na literatura com respeito a soluções de hibridização tradicionais. Por exemplo, uma solução de hibridização tradicional pode compreender 5x ou 6x SSC, EDTA a 0,01 M, 5x solução de Dernhardt, 0,5% de SDS, e 100 mg/mL DNA de esperma de salmão desnaturado cisalhado. Mais solução de hibridização tradicional pode compreender HEPES a 50 mM, NaCI a 0,5 M, e EDTA a 0,2 mM. Uma solução de hibridização típica para FISH em espéci- mens biológicas para detecção de RNA pode compreender, por exemplo, 2x SSC, 10% de sulfato de dextrana, complexo de vanadil- ribonucleosídeo a 2 mM, 50% de formamida, 0,02% de BSA livre de RNAse, e 1 mg/mL de tRNA de E. coli. Uma solução de hibridização típica para FISH em espécimens biológicas para detecção de DNA pode compreender, por exemplo, 2x SSC, 10% de sulfato de dextrana, 50% de formamida, e por exemplo, 0,3 mg/mL de DNA de esperma de salmão ou 0,1 mg/mL de DNA de COT1, Outras soluções de hibridização típicas podem compreender 40% de formamida, 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 30 mM, tampão de fosfato a 5 mM, Alu-PNA (PNA de bloqueio) ou DNA de COT-1, e em alguns casos 0,1 pg/pL de DNA humano total (THD).

[00078] As composições da invenção podem compreender uma solução de hibridização compreendendo quaisquer dos componentes de soluções de hibridização tradicionais citados acima em combinação com pelo menos um solvente aprótico polar. Os componentes tradicionais podem estar presentes nas mesmas concentrações como usado nas soluções de hibridização tradicionais, ou podem estar presentes em maiores ou menores concentrações, ou podem ser omitidos completamente.

[00079] Por exemplo, se as composições da invenção compreenderem sais tais como tampão de fosfato e/ou NaCI, os sais podem estar presentes em concentrações de NaCI a 0-1200 mM e/ou tampão de fosfato a 0-200 mM. Em algumas modalidades, as concentrações de sais podem ser, por exemplo, NaCI a 300 mM e tampão de fosfato a 5 mM, ou NaCI a 600 mM e tampão de fosfato a 10 mM.

[00080] Se as composições da invenção compreenderem agentes de aceleração tais como sulfato de dextrana, glicol, ou DMSO, o sulfato de dextrana pode estar presente em concentrações de 5% a 40%, o glicol pode estar presente em concentrações de 0,1% a 10%, e o DMSO pode ser de 0,1% a 10%. Em algumas modalidades, a concentração de sulfato de dextrana pode ser 10% ou 20% e a concentração de etileno glicol, 1,3 propanodiol, ou glicerol pode ser 1% a 10%. Em algumas modalidades, a concentração de DMSO pode ser 1%. Em algumas modalidades, a composição aquosa não compreende DMSO como um agente de aceleração. Em algumas modalidades, a composição aquosa não compreende formamida como um agente de aceleração, ou compreende formamida com a condição de que a composição contenha menos do que 10%, ou menos do que 5%, ou menos do que 2%, ou menos do que 1%, ou menos do que 0,5%, ou menos do que 0,1%, ou menos do que 0,05%, ou menos do que 0,01%.

[00081] Se as composições da invenção compreenderem ácido cítrico, as concentrações podem variar de 1 mM a 50 mM e o pH pode variar de 5,0 a 8,0. Em algumas modalidades a concentração de ácido cítrico pode ser 10 mM e o pH pode ser 6,2,

[00082] As composições da invenção podem compreender agentes que reduzem ligação não específica a, por exemplo, a membrana celular, tais como esperma de salmão ou pequenas quantidades de DNA humano total ou, por exemplo, elas podem compreender agentes de bloqueio para bloquear a ligação de, por exemplo, sequências de repetição ao alvo tais como maiores quantidades de DNA humano total ou DNA enriquecido por repetição ou agentes de bloqueio específicos tais como fragmentos e sequências de PNA ou LNA. Estes agentes podem estar presentes em concentrações de 0,01-100 pig/p,L ou 0,01-100 pM. Por exemplo, em algumas modalidades, estes agentes serão 0,1 pg/pL de DNA humano total, ou 0,1 pg/pL de DNA não humano, tais como esperma de arenque, esperma de salmão, ou DNA de timo de bezerro, ou 5 pM de PNA de bloqueio.

[00083] Um aspecto da invenção é uma composição ou solução para uso em hibridização. Composições para uso na invenção incluem uma composição aquosa compreendendo a sequência de ácido nucleico e pelo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo. Uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo é uma quantidade que possibilita hibridização. Por exemplo, um meio de testar se a quantidade de solvente aprótico polar que é eficaz para possibilitar a hibridização é para determinar se o solvente aprótico polar, quando usado nos métodos de hibridização e composições descritos aqui, tal como o exemplo 1, produz um sinal detectável e/ou um produto de ácido nucleico amplificado.

[00084] Exemplos não limitantes de quantidades eficazes de solventes apróticos polares incluem, por exemplo, cerca de 1% a cerca de 95% (v/v). Em algumas modalidades, a concentração de solvente aprótico polar é de 5% a 60% (v/v). Em outras modalidades, a concentração de solvente aprótico polar é de 10% a 60% (v/v). Em ainda outras modalidades, a concentração de solvente aprótico polar é de 30% a 50% (v/v). Concentrações de 1% a 5%, 5% a 10%, 10%, 10% a 20%, 20% a 30%, 30% a 40%, 40% a 50%, ou 50% a 60% (v/v) são também adequadas. Em algumas modalidades, o solvente aprótico polar estará presente em uma concentração de 0,1%, 0,25%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, ou 5% (v/v). Em outras modalidades, o solvente aprótico polar estará presente em uma concentração de 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5%, ou 20% (v/v).

[00085] Se as composições da invenção são usadas em um ensaio de hibridização, elas podem também compreender uma ou mais sondas de ácido nucleico. As sondas podem ser diretamente ou indiretamente rotuladas com compostos detectáveis tais como enzimas, cro- moforos, fluorocromos, e haptenos. As sondas de DNA podem estar presentes em concentrações de 0,1 a 100 ng/pL. Por exemplo, em algumas modalidades, as sondas podem estar presentes em concentrações de 1 a 10 ng/pL. As sondas de PNA podem estar presentes em concentrações de 0,5 a 5000 nM. Por exemplo, em algumas modalidades, as sondas podem estar presentes em concentrações de 5 a 1000 nM.

[00086] Em uma modalidade, a composição da invenção compreende uma mistura de 40% de solvente aprótico polar (v/v) (por exemplo, carbonato de etileno, "EC"), 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, e 1-10 ng/pL de sonda. Outra composição exemplar da presente invenção compreende uma mistura de 15% de EC, 20% de sulfato de dextrana, NaCI a 600 mM, tampão de fosfato a 10 mM, e 0,1 pg/pL de de DNA humano total. Ainda outra composição exemplar compreende 15% de EC, 20% de sulfato de dextrana, NaCI a 600 mM, ácido cítrico a 10 mM, pH 6,2, e 0,1 pg/pL de DNA não humano (por exemplo, esperma de arenque, esperma de salmão, ou timo de bezerro) ou 0,5% de formamida ou 1% de glicol (por exemplo, etileno glicol, 1,3 propanodiol, ou glicerol).

(2) solvente aprótico polar(s)

[00087] Diferentes solventes apróticos polares podem conferir diferentes propriedades nas composições da invenção. Por exemplo, a escolha de solvente aprótico polar pode contribuir para a estabilidade da composição, visto que certos solventes apróticos polares podem degradar-se em tempo prolongado. Por exemplo, o solvente aprótico polar carbonato de etileno esgota-se em etileno glicol, que é uma molécula relativamente estável, e dióxido de carbono, que pode interagir com água para formar ácido carbônico, alterando a acidez das composições da invenção. Sem ser ligado pela teoria, acredita-se que a mudança em pH em esgotamento de carbonato de etileno torna as composições da invenção menos eficaz para hibridização. Entretanto, a estabilidade pode ser melhorada reduzindo o pH da composição, adicionando ácido cítrico como um tampão em pH 6,2 em lugar do tampão de fosfato tradicional, que é tipicamente usado em cerca de pH 7,4, e/ou adicionando etileno glicol em concentrações, por exemplo, entre 0,1% a 10%, ou entre 0,5% a 5%, tal como, por exemplo, 1%, 2%, 3%, etc. Por exemplo, com tampão de citrato a 10 mM, as composições da invenção são estáveis a 2-8oC durante aproximadamente 8 meses. Estabilidade pode também ser melhorada se as composições forem armazenadas em baixas temperaturas (por exemplo, -20oC).

[00088] Além disso, certos solventes apróticos polares podem causar as composições da invenção separarem-se em sistemas de múltiplas fases sob certas condições. As condições sob as quais sistemas de múltiplas fases são obtidos podem ser diferentes para diferentes solventes apróticos polares. Geralmente, entretanto, quando a concentração de solvente aprótico polar aumenta, o número de fases aumenta. Por exemplo, composições compreendendo baixas concentrações de carbonato de etileno (isto é, menos do que 20%) podem existir como uma fase, ao mesmo tempo que composições compreendendo maiores concentrações de carbonato de etileno podem separarem-se em duas, ou ainda três fases. Por exemplo, composições compreendendo 15% de carbonato de etileno existem como uma fase única em temperatura ambiente, ao mesmo tempo que composições compreendendo 40% de carbonato de etileno consistem de uma fase inferior viscosa (aproximadamente 25% do volume total) e uma fase superior menos viscosa (aproximadamente 75% do volume total) em temperatura ambiente.

[00089] Por outro lado, alguns solventes apróticos polares podem existir em duas fases em temperatura ambiente mesmo em baixas concentrações. Por exemplo, sulfolano, y-butirolactona, tritiocarbonato de etileno, sulfito de glicol, e carbonato de propileno existem como duas fases em concentrações de 10, 15, 20, ou 25% (20% de sulfato de dextrana, NaCI a 600 mM, tampão de citrato a 10 mM) em temperatura ambiente.

[00090] Pode também ser possível alterar o número de fases ajustando a temperatura das composições da invenção. Geralmente, quando a temperatura aumenta, o número de fases diminui. Por exemplo, a 2-8oC, composições compreendendo 40% de carbonato de etileno podem separarem-se em um sistema de três fases.

[00091] Pode também ser possível alterar o número de fases ajustando a concentração de sulfato de dextrana e/ou sal na composição. Falando de modo geral, diminuindo a concentração de sulfato de dextrana (concentração tradicional é 10%) e/ou concentração de sal pode- se reduzir o número de fases. Entretanto, dependendo do solvente aprótico polar particular e sua concentração na composição, fases únicas podem ser produzidas mesmo com maiores concentrações de sal e sulfato de dextrana. Por exemplo, a composição compreendendo baixas quantidades de EC (por exemplo, 15%, 10%, ou 5%) podem trabalhar bem aumentando o sulfato de dextrana e concentração de sais, ao mesmo tempo que ainda mantendo um sistema de uma fase. Em uma modalidade particular, composições compreendendo uma sonda de DNA de gene HER2, uma sonda de PNA de CEN7, 15% de EC, 20% de sulfato de dextrana, NaCI a 600 mM, e tampão de fosfato a 10 mM são congeladas a -20oC. Em outras modalidades, as composições são líquidas a -20oC.

[00092] Alguns solventes apróticos polares podem produzir sinais mais fortes em uma fase ou outra. Por exemplo, 40% de sulfito de glicol produzem sinais fortes na fase inferior e nenhum sinal na fase superior. Similarmente, certos tipos de sondas podem produzir sinais mais fortes em uma fase ou outra. Por exemplo, sondas de PNA tendem a mostrar sinais mais fortes na fase inferior do que na fase superior.

[00093] Consequentemente, os sistemas de múltiplas fases da invenção podem ser usados para convenientemente examinar diferentes aspectos de uma amostra. Por exemplo, um sistema de duas fases pode ser usado para separar amostras rotuladas com sondas de PNA de amostras rotuladas com sondas de DNA. Outros usos incluem iso- lação de uma fase específica exibindo, por exemplo, certas vantagens de hibridização tal que a fase isolada pode ser usada como um sistema de fase única. A sonda e/ou amostra pode ser adicionada antes de, ou após isolação de uma fase particular.

[00094] As hibridizações podem ser realizadas com uma composição da invenção de uma fase, com fases individuais da composição da invenção de múltiplas fases, ou com misturas de qualquer uma ou mais das fases em uma composição da invenção de múltiplas fases. Por exemplo, em um sistema de uma fase, um volume da amostra pode ser extraído para uso na hibridização. Em um sistema de múltiplas fases, alguém pode extrair um volume de amostra da fase de interesse (por exemplo, a fase superior, inferior, ou média) para uso na hibridização. Alternativamente, as fases em um sistema de múltiplas fases podem ser misturadas antes de extrair um volume da amostra misturada para uso na hibridização. Entretanto, o sistema de múltiplas fases pode produzir forte e irregular manchamento de base local dependendo da composição. Ao mesmo tempo que, a adição de baixas quanti-dades de formamida reduzirá a base em um sistema de uma fase, ela tem pequeno efeito em um sistema de múltiplas fases com altas concentrações (por exemplo, 40%) de um solvente aprótico polar. Além disso, quando a concentração de formamida aumenta, maiores concentrações de sonda e/ou maior tempo de hibridizações são requeridos para manter forte intensidade de sinal.

(3) Otimização para Pedidos Particulares

[00095] As composições da invenção podem ser variadas a fim de otimizar resultados para um pedido particular. Por exemplo, a concentração de solvente aprótico polar, sal, agente de aceleração, agente de bloqueio, e/ou íons de hidrogênio (isto é, pH) pode ser variada a fim de melhorar resultados para um pedido particular.

[00096] Por exemplo, a concentração de solvente aprótico polar pode ser variada a fim de melhorar intensidade de sinal e manchamento de base. Geralmente, quando a concentração de solvente aprótico polar aumenta, intensidade de sinal aumenta e manchamento de base diminui. Por exemplo, composições compreendendo 15% de EC tendem a mostrar sinais mais fortes e menos base do que composições compreendendo 5% de EC. Entretanto, intensidade de sinal pode ser melhorada para composições tendo baixas concentrações de solvente aprótico polar (por exemplo, 0% a 20%) se as concentrações de sal e/ou sulfato de dextrana são aumentadas. Por exemplo, sinais fortes podem ser observados com 5% a 10% de EC quando a concentração de sal é elevada aproximadamente 8 a 16 vezes a concentração tradicional de sais (isto é, aproximadamente NaCI a 1200 mM, tampão de fosfato a 20 mM). Igualmente, quando menores concentrações de solvente aprótico polar são usadas, maiores concentrações de sulfato de dextrana são geralmente requeridas para manter bom sinal e intensidade de base.

[00097] Consequentemente, as concentrações de sal e sulfato de dextrana podem também ser variadas a fim de melhorar intensidade de sinal e manchamento de base. Geralmente, quando as concentrações de sal e sulfato de dextrana aumentam, a intensidade de sinal aumenta e a base diminui. Por exemplo, concentrações de sal que são aproximadamente duas a quatro vezes concentrações tradicionais (isto é, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM) produzem sinais fortes e baixa base. Surpreendentemente, entretanto, hibridização ocorre usando as composições da invenção mesmo na ausência completa de sal. As intensidades de sinal podem ser melhoradas sob condições de nenhum sal aumentando as concentrações de agente de aceleração e/ou solvente aprótico polar.

[00098] Igualmente, intensidade de sinal aumenta quando concentração de sulfato de dextrana aumenta de 0% a 20%. Entretanto, bons sinais podem ainda ser observados em concentrações de sulfato de dextrana de 0%. A intensidade de sinal pode ser melhorada sob baixas condições de sulfato de dextrana aumentando o solvente aprótico polar e/ou concentrações de sal.

[00099] Além disso, os tipos de sondas usados nas composições da invenção podem ser variados para melhorar os resultados. Por exemplo, em alguns aspectos da invenção, combinações de sondas de DNA/DNA podem mostrar menos base do que combinações de sondas de DNA/PNA nas composições da invenção ou vice versa. Por outro lado, sondas de PNA tendem a mostrar sinais mais fortes do que sondas de DNA sob baixas concentrações de sal e/ou solvente aprótico polar. De fato, sondas de PNA também mostram sinais quando nenhum solvente aprótico polar está presente, enquanto que sondas de DNA mostram fraco ou nenhum sinal sem o solvente aprótico polar.

D. Aplicações, Métodos, e Usos (1) Amostras analíticas

[000100] Os métodos e composições da invenção podem ser usados totalmente ou parcialmente em todos os tipos de aplicações de hibridização nos campos de citologia, histologia, ou biologia molecular. De acordo com uma modalidade, a primeira ou a segunda sequência de ácido nucleico nos métodos da invenção está presente em uma amostra biológica. Exemplos de tais amostras incluem, por exemplo, amostras de tecido, preparações celulares, preparações de fragmento celular, e isoladas e enriquecidas preparações de componente celular. A amostra pode originar de vários tecidos tal como, por exemplo, mama, pulmão, colorretal, próstata, pulmão, cabeça & pescoço, estômago, pâncreas, esôfago, fígado, e bexiga, ou outros tecidos relevantes e neoplasia dos mesmos, qualquer suspensão celular, amostra de sangue, aspiração por agulha fina, fluido de ascites, esputo, lavagem de peritôneo, lavagem de pulmão, urina, fezes, esfoladura celular, esfre- gaço celular, citospina ou células citoprep.

[000101] A amostra pode ser isolada e processada usando protocolos padrão. Preparações de fragmento celular podem, por exemplo, ser obtidas por homogeneização celular, tratamento de congelamento- descongelamento ou lise celular. A amostra isolada pode ser tratada de muitas diferentes maneiras dependendo do propósito de obtenção da amostra e dependendo da rotina no sítio. Frequentemente, a amostra é tratada com vários reagentes para preservar o tecido para posterior análise da amostra, alternativamente a amostra pode ser analisada diretamente. Exemplos de métodos amplamente usados para preservar amostras são fixados por formalina seguidos por embutimento em parafina e criopreservação.

[000102] Para amplitude de metafase, culturas celulares são geral- mente tratadas com colcemid, ou outro agente de rompimento de polo de fuso adequado, para parar o ciclo celular em metafase. As células são então fixadas e manchadas sobre slides de microscópio, tratadas com formaldeído, lavadas, e desidratadas em etanol. Sondas são então adicionadas e as amostras são analisadas por quaisquer das técnicas como descrito abaixo.

[000103] Citologia envolve a examinação de células individuais e/ou disseminações de cromossomos da amostra biológica. Examinação citológica da amostra inicia-se com obtenção de um espécimen de células, que pode tipicamente ser feita por raspagem, esfregação ou es- covação de uma área, como no caso de espécimens cervicais, ou coletando fluidos corporais, tais como aqueles obtidos da cavidade torá- xica, bexiga, ou coluna espinhal, ou por aspiração por agulha fina ou biópsia por agulha fina, como no caso de tumores internos. Em uma preparação citológica manual convencional, a amostra é transferida para um material de suspensão líquido e as células no fluido são então transferidas diretamente ou por etapas de processamento com base em centrifugação em um slide de microscópio de vidro para observação. Em uma preparação citológica automatizada típica, uma monta-gem de filtro é colocada na suspensão líquida e a montagem de filtro tanto dispersa as células quanto captura as células no filtro. O filtro é então removido e colocado em contato com um slide de microscópio. As células são então fixadas no slide de microscópio antes de análise por quaisquer das técnicas como descrito abaixo.

[000104] Em um experimento de hibridização tradicional usando uma amostra citológica, slides contendo o espécimen são imersos em um tampão de formaldeído, lavados, e então desidratados em etanol. As sondas são então adicionadas e o espécimen é coberta com uma lamínula. O slide é incubado em uma temperatura suficiente para desnaturar qualquer ácido nucleico no espécimen (por exemplo, 5 minutos a 82oC) e então incubado em uma temperatura suficiente para permitir hibridização (por exemplo, durante a noite a 45oC). Após hibridização, as lamínulas são removidas e os espécimens são submetidos a uma lavagem de alta rigorosidade (por exemplo, 10 minutos a 65oC) seguidas por uma série de lavagens de baixa rigorosidade (por exemplo, 2 x 3 minutos em temperatura ambiente). As amostras são então desidratadas e montadas para análise.

[000105] Histologia envolve a examinação de células em fatias finas de tecido. Para preparar uma amostra de tecido para examinação histológica, pedaços do tecido são fixados em um fixador adequado, tipicamente um aldeído tal como formaldeído ou glutaraldeído, e então embutidos em cera de parafina derretida. O bloco de cera contendo a amostra de tecido é então cortado em um microtome para produzir fatias finas de parafina contendo o tecido, tipicamente de 2 a 10 microns de espessura. A fatia de espécimen é então aplicada a um slide de microscópio, secada a ar, e aquecida para fazer o espécimen aderir ao slide de vidro. Parafina residual é então dissolvida com um solvente adequado, tipicamente xileno, tolueno, ou outros. Estes assim chamados solventes de desparafinização são então removidos com um reagente do tipo desidratação por lavagem antes de análise da amostra por quaisquer das técnicas descritas abaixo. Alternativamente, fatias podem ser preparadas de espécimens de congelamento, brevemente fixadas em 10% de formalina ou outro fixador adequado, e então infundidas com reagente de desidratação antes de análise da amostra.

[000106] Em um experimento de hibridização tradicional usando uma amostra histológica, espécimens de tecido embutidas em parafina fixadas por formalina são cortadas em seções de 2-6 jim e coletadas em slides. A parafina é derretida (por exemplo, 30 a 60 minutos a 60oC) e então removida (desparafinada) por lavagem com xileno (ou um substituto de xileno), por exemplo, 2x5 minutos. As amostras são reidratadas, lavadas, e então pré-tratadas (por exemplo, 10 minutos a 95-100oC). Os slides são lavados e então tratados com pepsina ou outro permeabilizante adequado, por exemplo, 3 a 15 minutos a 37oC. Os slides são lavados (por exemplo, 2x3 minutos), desidratados, e a sonda é aplicada. Os espécimens são cobertos com uma lamínula e o slide é incubado em uma temperatura suficiente para desnaturar qualquer ácido nucleico em um espécimen (por exemplo 5 minutos a 82oC), seguido por incubação em uma temperatura suficiente para permitir hibridização (por exemplo, durante a noite a 45oC). Após hibridização, as lamínulas são removidas e os espécimens são submetidos a uma lavagem de alta rigorosidade (por exemplo, 10 minutos a 65oC) seguidas por uma série de lavagens de baixa rigorosidade (por exemplo, 2x3 minutos em temperatura ambiente). As amostras são então desidratadas e montadas para análise.

(2) Técnicas de Hibridização

[000107] As composições e métodos da presente invenção podem ser usados totalmente ou parcialmente em todos os tipos de técnicas de hibridização de ácido nucleico conhecidas na técnica para amostras citológicas e histológicas. Tais técnicas incluem, por exemplo, hibridização in situ (ISH), hibridização fluorescente in situ (FISH; incluindo FISH multi cores, Fibra-FISH, etc.), hibridização cromogênica in situ (CISH), hibridização de prata in situ (SISH), hibridização de genoma comparativo (CGH), pinturas de cromossomo, e disposições in situ.

[000108] Sondas moleculares que são adequadas para uso nas hi- bridizações da invenção são descritas, por exemplo, na Publicação de Patente dos Estados Unidos No. 2005/0266459, que é incorporada aqui por referência. Em geral, sondas podem ser preparadas por síntese química ou amplificando uma sequência de DNA específica clo- nando, inserindo o DNA em um vetor, e amplificando o vetor uma inserção em células hospedeiras apropriadas. Vetores comumente usados incluem plasmídeos bacterianos, cosmídeos, cromossomas artificiais bacterianos (BACs), cromossomas artificiais desviados de Pl (PACs), ou cromossomas artificiais de levedura (YACs). O DNA amplificado é então extraído e purificado para uso como uma sonda. Méto- dos para preparar e/ou sintetizar sondas são conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito no PCT/US02/30573,

[000109] Em geral, o tipo de sonda determina o tipo de aspecto que alguém pode detectar em um ensaio de hibridização. Por exemplo, sondas de DNA genômico ou nuclear totais podem ser usadas como uma sonda específica de espécies. Pinturas de cromossomo são coleções de sequências de DNA derivadas de um tipo de cromossomo simples e podem identificar que tipo de cromossomo específico em núcleos de metafase e interfase, contar o número de um certo cromossoma, mostrar translocações, ou identificar fragmentos extra cro- mossômicos de cromatina. Diferentes tipos cromossômicos também têm sequências repetidas únicas que podem ser alvejadas por hibridização de sonda, para detector e contra cromossomas específicos. Grandes sondas de inserção podem ser usadas para alvejar sequências de simples cópia única. Com estas sondas grandes, a eficiência de hibridização é inversamente proporcional ao tamanho da sonda. Sondas menores podem também ser usadas para detectar aberrações tais como deleções, amplificações, inversões, duplicações, e aneuploi- dia. Por exemplo, sondas específicas do loco diferentemente coloridas podem ser usadas para detectar translocações por meio de hibridização de sinal de divisão in situ.

[000110] Em geral, a capacidade de discriminar entre sequências intimamente relacionadas é inversamente proporcional ao comprimento da sonda de hibridização por que a diferença em estabilidade térmica diminui entre complexos tipo selvagem e mutantes quando o comprimento da sonda aumenta. Sondas maiores do que 10 pb de comprimento são geralmente requeridas para obter a diversidade de sequência necessária para corretamente identificar um único organismo ou condição clínica de interesse. Por outro lado, diferenças de sequência tão sutis quanto uma base única (mutação de ponto) em oli- gômeros muito curtos (<10 pares de base) podem ser suficientes para possibilitar a discriminação de hibridização para sequências alvo de ácido nucleico complementar quando comparado com sequências não alvo.

[000111] Em uma modalidade, pelo menos um grupo das sondas de hibridização in situ pode compreender uma ou mais sondas de PNA, como definido acima e como descrito na Patente dos Estados Unidos No. 7,105,294, que é incorporada aqui por referência. Métodos para sintetizar sondas de PNA são descritos no PCT/US02/30573, Alternativamente, ou além disso, pelo menos um grupo das sondas de hibridização em qualquer das técnicas descritas acima pode compreender uma ou mais sondas de ácido nucleico trancado (LNA), como descrito no WO 99/14226, que é incorporado aqui por referência. Devido à ligação por ponte adicional entre os carbonos 2' e 4', o esqueleto de LNA é pré-organizado para hibridização. As interações LNA/DNA e LNA/RNA são mais fortes do que as correspondentes interações DNA/DNA e DNA/RNA, como indicado por uma temperatura de fusão mais elevada. Desse modo, as composições e métodos da invenção, que diminuem a energia requerida para hibridização, são particular- mente úteis para hibridizações com sondas de LNa.

[000112] Em uma modalidade, as sondas podem compreender um rótulo detectável (uma molécula que fornece um sinal analiticamente identificável que permite a detecção do híbrido alvo-sonda), como descrito na Publicação de Patente dos Estados Unidos No 2005/0266459, que é incorporada aqui por referência. O rótulo detectável pode ser diretamente ligado a uma sonda, ou indiretamente ligado a uma sonda, por exemplo, usando um ligante. Qualquer método de rotulagem conhecido por aqueles na técnica, incluindo processos enzimáticos e químicos, pode ser usado para rotular sondas usadas nos métodos e composições da invenção. Em outras modalidades, as sondas não são rotuladas.

[000113] Em geral, técnicas de hibridização in situ tais como CGH, FISH, CISH, e SISH, empregam sondas grandes, principalmente ines- pecíficas de ácido nucleico que hibridizam com rigorosidade variável para genes ou fragmentos de gene nos cromossomas celulares. O uso de sondas grandes torna a técnica de hibridização in situ muito sensível. Entretanto, o uso bem sucedido de sondas genômicas grandes em ensaios tradicionais de hibridização depende do bloqueio do manchamento indesejado de base derivadas de, por exemplo, sequências repetitivas que estão presentes em todo o genoma. Tais etapas de bloqueio são demoradas e caras. Como descrito abaixo, os métodos e composições da invenção vantajosamente reduzem e/ou eliminam a necessidade de tais etapas de bloqueio. Entretanto, em uma modalidade, sequências repetitivas podem ser suprimidas de acordo com os métodos conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito no PCT/US02/30573,

[000114] Sondas ligadas podem ser detectadas em amostras citoló- gicas e histológicas diretamente ou indiretamente com fluorocromos (por exemplo, FISH), cromógenos orgânicos (por exemplo, CISH), partículas de prata (por exemplo, SISH), ou outras partículas metálicas (por exemplo, hibridização por fluorescência facilitada por ouro in situ, GOLDFISH). Desse modo, dependendo do método de detecção, populações celulares obtidas de uma amostra a ser testada podem ser visualizadas por meio de microscopia por fluorescência ou microscopia de luz de campo brilhante convencional.

[000115] Ensaios de hibridização em amostras citológicas e histológicas são ferramentas importantes para a determinação do número, tamanho, e/ou localização de sequências específicas de DNA. Por exemplo, em CGH, genomas totais são manchados e comparados com genomas de referência normais para a detecção de regiões com número de cópia aberrante. Tipicamente, DNA de tecido objeto e de tecido de controle normal é rotulado com diferentes sondas coloridas. Os lagos de DNA são misturados e adicionados a uma disseminação de metafase de cromossomas normais (ou a uma lasca de microdis- posição, para CGH de disposição ou matriz). As relações de cores são então comparadas para identificar regiões com número de cópia aberrante.

[000116] FISH é tipicamente usado quando imageamento de múltiplas cores é requerido e/ou quando o protocolo reúne a quantificação de sinais. A técnica geralmente vincula a preparação de uma amostra citológica, sondas de rotulagem, cromossomas alvo desnaturantes e a sonda, hibridização da sonda para a sequência alvo, e detecção do sinal. Tipicamente, a reação de hibridização fluorescentemente mancha as sequências alvejadas de modo que sua locação, tamanho, ou número possa ser determinado usando microscopia por fluorescência, citometria de fluxo, ou outra instrumentação adequada. Sequências de DNA variando de genomas inteiros até diversos quilobases podem ser estudadas usando FISH. FISH pode também ser usado em amplitude de núcleos de metafase e interfase.

[000117] FISH foi usado bem sucedidamente para mapear sequências de DNA repetitivas e de única cópia em cromossomas de metafase, núcleos de interfase, fibras de cromatina, e moléculas de DNA nuas, e para identificação de cromossoma e análise de cariótipo por meio da localização de grandes famílias repetidas, tipicamente os DNAs ri- bossômicos e famílias de disposição tandem maiores. Uma das mais importantes aplicações para FISH foi na detecção de sequências de DNA de única cópia. Em particular genes relacionados com doença em seres humanos e outras espécies de modelo eucariótico, e a detecção de agentes infecciosos. FISH pode ser usado para detectar, por exemplo, aneuploidia cromossômica em diagnósticos pré-natais, cân- ceres hematológicos, e tumores sólidos; anormalidades de gene tais como amplificações de oncogene, deleções de gene, ou fusões de gene; anormalidades estruturais cromossômicas tais como transloca- ções, duplicações, inserções, ou inversões; síndromes de gene contíguas tais como síndrome de microdeleção; os efeitos genéticos de várias terapias; ácidos nucleicos virais em células somáticas e sítios de integração virai em cromossomas; etc. Em multicores de FISH, cada cromossoma é manchado como uma cor separada, possibilitando alguém determinar os cromossomas normais dos quais os cromossomas anormais são derivados. Tais técnicas incluem FISH multiplex (m- FISH), cariotipagem espectral (SKY), rotulagem de relação binária combinada (COBRA), cariotipagem por mudança de cor, faixa de cor de espécies cruzadas, faixa multicor de alta resolução, multiplex FISH telomérico (TM-FISH), FISH de Sinal de divisão(ssFISH), e fusion- Sinal FISH de sinal de fusão.

[000118] CISH e SISH podem ser usados para muitas das mesmas aplicações como FISH, e têm a vantagem adicional de prover a análise da morfologia de tecido subjacente, por exemplos em aplicações de histopatologia. Se FISH for realizado, a mistura de hibridização pode conter grupos de pares distintos e equilibrados de sondas, como descrito na Patente dos Estados Unidos No 6,730.474, que é incorporada aqui por referência. Para CISH, a mistura de hibridização pode conter pelo menos uma série de sondas configuradas para a detecção com um ou mais cromógenos orgâncios convencionais, e para SISH, a mistura de hibridização pode conter pelo menos uma série de sondas configuradas para a detecção com partículas de prata, como descrito in Powell RD e outro, "Metallographic hibridização in situ," Hum. Pathol., 38:1145-59 (2007).

[000119] As composições da invenção podem também ser usadas totalmente ou parcialmente em todos os tipos de técnicas de biologia molecular envolvendo hibridização, incluindo manchamento e sondagem (por exemplo, Southern, northern, etc.), disposições, e técnicas de amplificação incluindo PCR tradicional, RT-PCR, PCR mutacional, PCR assimétrico, PCR de partida quente, PCR inversa, PCR multiplex, PCR aninhada, PCR quantitativa, e PCR in situ, PCR in situ é uma reação de cadeia de polimerase que ocorre dentro de uma célula sobre um slide, por exemplo, as amostras de citologia e histologia descritas acima. Tipicamente, após aderir a amostra a um slide de microscópio, as células são reidratadas e permeabilizadas, e então combinadas com uma mistura apropriada de reagentes PCR incluindo polimerase, dNTPs, e iniciadores. A PCR pode ser realizada em um instrumento dedicado, tais como o GeneAmp PCR in situ System 1000 (Perkin Elmer Biosystems, Foster City, CA), e o produto amplificado pode ser detectado usando sondas rotuladas ou incorporando dNTPs rotuladas durante a amplificação. As composições da invenção melhorará a eficiência de análise de PCR tradicional e in situ por exemplo, reduzindo as temperaturas de desnaturação e hibridização e/ou o tempo requerido a fim de conduzir os ciclos de amplificação.

(3) Condições de Hibridização

[000120] O método da presente invenção envolve o uso de solventes apróticos polares em hibridização de cadeias de ácido nucleico. As composições da presente invenção são particularmente úteis no referido método.

[000121] Os métodos de hibridização usando as composições da invenção podem envolver a aplicação das composições a uma amostra compreendendo uma sequência alvo de ácido nucleico, mais provavelmente em uma forma de filamento duplo. Habitualmente, a fim de assegurar o acesso para a sonda hibridizar com a sequência alvo, a amostra e composição são aquecidas para desnaturar os ácidos nu- cleicos-alvos. Durante a desnaturação o solvente aprótico polar intera- ge com a sequência e facilita a desnaturação do alvo e o retempera- mento da sonda para o alvo. Os solventes apróticos polares especificados na presente invenção aceleram este processo consideravelmente ereduzem a severidade e toxicidade das condições de hibridização em comparação com a formamida.

[000122] Hibridizações usando as composições da invenção podem ser realizadas usando a mesma metodologia de ensaio como para as hibridizações realizadas com composições tradicionais. Entretanto, as composições da invenção permitem tempo mais curto de hibridizações. Por exemplo, o pré-tratamento térmico, etapas de digestão, desnaturação, hibridização, lavagem, e montagem podem usar as mesmas condições em termos de volumes, temperaturas, reagentes e tempos de incubação como para composições tradicionais. Uma grande variação existe nos protocolos de hibridização tradicionais conhecidos na técnica. Por exemplo, alguns protocolos especificam uma etapa de desnaturação separada de nucleotídeos de filamento duplo potenciais sem sonda presente, antes da seguinte etapa de hibridização. As composições da invenção podem ser usadas em qualquer dos protocolos de hibridização tradicionais conhecidos na técnica.

[000123] Alternativamente, ensaios usando as composições da invenção podem ser mudados e otimizados a partir de metodologias tradicionais, por exemplo, diminuindo o tempo de hibridização, aumentando ou diminuindo as temperaturas de desnaturação e/ou hibridização, e/ou aumentando ou diminuindo os volumes de hibridização.

[000124] Por exemplo, em algumas modalidades, as composições da invenção produzirão sinais fortes quando a temperatura de desnaturação for de de 60 a 100oC e a temperatura de hibridização é de 20 a 60oC. Em outras modalidades, as composições da invenção produzirão sinais fortes quando a temperatura de desnaturação for de de 60 a 70oC, 70 a 80oC, 80 a 90oC ou 90 a 100oC, e a temperatura de hibri- dização é de 20 a 30oC, 30 a 40oC, 40 a 50oC, ou 50 a 60oC. Em outras modalidades, as composições da invenção produzirão sinais fortes quando a temperatura de desnaturação for de 72, 82, ou 92oC, e a temperatura de hibridização é de 37, 40, 45, ou 50oC.

[000125] Em outras modalidades, as composições da invenção produzirão sinais fortes quando o tempo de desnaturação for de 0 a 10 minutos e o tempo de hibridização for de 0 minuto a 24 horas. Em outras modalidades, as composições da invenção produzirão sinais fortes quando o tempo de desnaturação for de 0 a 5 minutos e o tempo de hibridização for de 0 minuto a 8 horas. Em outras modalidades, as composições da invenção produzirão sinais fortes quando o tempo de desnaturação for de 0, 1, 2, 3, 4, ou 5 minutos, e o tempo de hibridização for de 0 minuto, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 180 minutos, ou 240 minutos. Será entendido por aqueles versados na técnica que em alguns casos, por exemplo, detecção de RNA, a etapa de desnaturação não é requerida.

[000126] Consequentemente, hibridizações usando as composições da invenção podem ser realizadas em menos do que 8 horas. Em outras modalidades, a hibridização é realizada em menos do que 6 horas. Em ainda outras modalidades, a hibridização é realizada dentro de 4 horas. Em outras modalidades, a hibridização é realizada dentro de 3 horas. Em ainda outras modalidades, a hibridização é realizada dentro de 2 horas. Em outras modalidades, a hibridização é realizada dentro de 1 hora. Em ainda outras modalidades, a hibridização é realizada dentro de 30 minutos. Em outras modalidades, a hibridização pode ocorrer dentro de 15 minutos. A hibridização pode ainda ocorrer dentro de 10 minutos ou em menos do que 5 minutos. As figuras 1 e 2 ilustram um curso de tempo típico para hibridizações realizadas em amostras histológicas e citológicas, respectivamente, usando as composições da invenção em comparação com hibridizações usando uma composição tradicional.

[000127] Quando o tempo de hibridização muda, a concentração de sonda pode também ser variada a fim de produzir sinais fortes e/ou reduzir a base. Por exemplo, quando o tempo de hibridização diminui, a quantidade de sonda pode ser aumentada a fim de melhorar intensidade de sinal. Por outro lado, quando o tempo de hibridização diminui, a quantidade de sonda pode ser diminuída a fim de melhorar o manchamento de base.

[000128] As composições da invenção surpreendentemente eliminam a necessidade de uma etapa de bloqueio durante a hibridização melhorando a intensidade de sinal e de base bloqueando a ligação de, por exemplo, sequências repetitivas ao alvo DNA. Desse modo, não existe nenhuma necessidade de usar DNA humano total, PNA de bloqueio , DNA de COT-1, ou DNA de qualquer outra fonte como um agente de bloqueio. Entretanto, os níveis de base podem ser também reduzidos adicionando-se agentes que reduzem a ligação não específica, tal como a uma membrana celular, tal como pequenas quantidades de DNA humano total ou DNA de origem não humana (por exemplo, DNA de esperma de salmão) para uma reação de hibridização usando as composições da invenção.

[000129] As composições aquosas da invenção também fornecem a possibilidade de consideravelmente reduzir a concentração de sequência de ácido nucleicos incluída na composição. Geralmente, a concentração de sondas pode ser reduzida de 2 a 8 vezes em comparação com as concentrações tradicionais. Por exemplo, se as sondas HER2 de DNA e sondas CEN17 de PNA são usadas nas composições da invenção, suas concentrações podem ser reduzidas em % e Vz, respectivamente, em comparação com suas concentrações em composições de hibridização tradicionais. Este aspecto, juntamente com a ausência de qualquer requisito para bloqueio de DNA, tal como PNA de bloqueio ou COT1, permite um volume de sonda aumentado em sistemas de instrumento automatizados, em comparação com o tradicional volume de 10 pL usado em sistemas de composições tradicionais, que reduz a perda devido à evaporação, como descrito em maiores detalhes abaixo.

[000130] A redução da concentração de sonda também reduz a base. Entretanto, a redução da concentração de sonda está inversamente relacionada com o tempo de hibridização, isto é, quando menor a concentração, maior o tempo de hibridização requerido. Apesar disso, mesmo quando concentrações de sonda extremamente baixas são usadas com as composições aquosas da invenção, o tempo de hibridização for ainda mais curto do que com composições tradicionais.

[000131] As composições da invenção frequentemente permitem melhores relações de sinal para ruído do que as composições de hibridização tradicionais. Por exemplo, com certas sondas, uma hibridização de uma hora com as composições da invenção produzirão base similar e sinais mais fortes do que uma hibridização durante a noite em uma composição tradicional. A base não é observada quando nenhuma sonda é adicionada.

[000132] Métodos de ensaio tradicionais podem também ser mudados e otimizados quando usando as composições da invenção dependendo de se o sistema é manual, semiautomatizado, ou automatizado. Por exemplo, um sistema semi- ou automatizado beneficiar-se-á do curto tempo de hibridizações obtido com as composições da invenção. O curto tempo de hibridização pode reduzir as dificuldades encontradas quando composições tradicionais são usadas em tais sistemas. Por exemplo, um problema com sistemas semi- e automatizados é que significante evaporação da amostra pode ocorrer durante a hibridização, visto que tais sistemas requerem pequenos volumes de amostra (por exemplo, 10 a 150 pL), temperaturas elevadas, e tempos de hibri- dização prolongados (por exemplo, 14 horas). Desse modo, as proporções dos componentes em composições de hibridização tradicionais são razoavelmente invariáveis. Entretanto, visto que as composições da invenção permitem hibridizações mais rápidas, a evaporação é reduzida, permitindo flexibilidade aumentada nas proporções dos componentes em composições de hibridização usadas em sistemas semi- e automatizados.

[000133] Por exemplo, dois instrumentos automatizados foram usados para realizar hibridizações usando as composições da invenção. Composições compreendendo 40% de carbonato de etileno (v/v) foram usadas no aparato descrito no pedido PCT DK2008/000430, e composições compreendendo 15% de carbonato de etileno (v/v) foram usadas no HYBRIMASTER HS-300 (Aloka CO. LTD, Japão). Quando as composições da invenção são usadas no HYBRIMASTER HS-300, o instrumento pode realizar rápida hibridização FISH com água em lugar da tradicional mistura de formamida tóxica, desse modo melhorando a segurança e reduzindo a evaporação. Se faixas umectadas com água forem ligadas à tampa da parte interna da unidade de reação do instrumento Aloka (câmara de hibridização), por exemplo, como descrito no Pedido de Patente dos Estados Unidos No 11/031,514, que é incorporada aqui por referência, a evaporação é reduzida ainda mais.

[000134] Outro problema com análise de imageamento automatizado é o número de imagens necessárias, a quantidade gigantesca de local para armazenagem requerida, e o tempo requerido para fazer as imagens. As composições da invenção tratam este problema produzindo sinais muito fortes em comparação com composições tradicionais. Por causa dos sinais muito fortes produzidos pelas composições da invenção, o imageamento pode ser feito em menor magnificação do que o requerido para as composições tradicionais e pode também ser detectado e analisado, por exemplo, por algoritmos. Visto que o plano focal torna-se mais amplo com menor magnificação, as composições da invenção reduzem ou eliminam a necessidade de tomar seções seriais de uma amostra. Como um resultado, o imageamento total é muito mais rápido, visto que as composições da invenção requerem seções menos ou nenhuma secção serial e cada imagem abrange área muito maior. Além disso, o tempo total para a análise é mais rápido, visto que os arquivos de imagem totais são muito menores.

[000135] Desse modo, as composições e métodos da invenção solucionam muitos dos problemas associados com composições e métodos tradicionais de hibridização.

[000136] A descrição pode ser entendida mais claramente com o auxílio dos exemplos não limitantes que seguem, que constituem modalidades preferidas das composições de acordo com a descrição. Exceto nos exemplos, ou em que de outro modo indicado, todos os números expressando quantidades de ingredientes, condições de reação, e assim em diante, usados no relatório e reivindicações devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Consequentemente, a menos que indicado ao contrário, os parâmetros numéricos mencionados no seguinte relatório e reivindicações anexas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades pesquisadas desejadas a serem obtidas aqui. Verdadeiramente, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao escopo das reivindicações cada parâmetro numérico deve ser construído considerando o número de dígitos significantes e aproximações arredondadas habituais.

[000137] Não obstante que as faixas numéricas e parâmetros mencionando o amplo escopo são aproximações, os valores numéricos mencionados no exemplo específico são reportados tão precisamente quanto possível. Qualquer valor numérico, entretanto, inerentemente contém certos erros necessariamente resultantes do desvio padrão encontrado em suas medições de teste respectivas. Os exemplos que seguem ilustram a presente invenção e não devem de modo algum ser considerados como limitantes da invenção.

EXEMPLOS

[000138] Referência será agora feita em detalhes às modalidades específicas da invenção. Ao mesmo tempo em que a invenção será descrita em conjunto com estas modalidades, entende-se que eles não se destinam a limitar a invenção àquelas modalidades. Ao contrário, a invenção é destina-se a abranger alternativas, modificações, e equivalentes, que podem ser incluídos na invenção, como definido pelas reivindicações anexas.

[000139] Os reagentes usados nos seguintes exemplos são de Da- ko's Histologia FISH Accessory Kit (K5599) e Citologia FISH Accessory Kit (K5499) (Dako Denmark A/S, Glostrup Denmark). Os kits contêm todos os reagentes essenciais, exceto para sonda, requeridos para completar um procedimento FISH para espécimens de porção de tecido embutidas em parafina, fixadas por formalina. Todas as amostras foram preparadas de acordo com a descrição do fabricante. O Hibridi- zador Dako (S2450, Dako) foi usado para as etapas de digestão, desnaturação, e hibridização.

[000140] Avaliação de slides FISH foi realizada dentro de uma semana após a hibridização usando um microscópio de fluorescência Leica DM6000B, equipado com Filtros simples DAPI, FITC, Vermelho Texas e filtro duplo FITC/Vermelho Texas sob a objetiva de óleo de 10x, 20x, 40x, e 100x.

[000141] A avaliação de slides CISH foi realizada usando um microscópio de luz Olympus BX51, sob a objetiva de 4x, 10x, 20x, 40x, e 60x.

[000142] Nos exemplos que seguem, "sulfato de dextrana"refere-se ao sal de sódio de sulfato de dextrana (D8906, Sigma) tendo um peso molecular Mw > 500,000. Todas as concentrações de solventes apróti- cos polares são fornecidas como percentagens v/v. Tampão de fosfato refere-se a uma solução tamponada por fosfato contendo NaH2PO4„ 2H2O (di-hidrato dibásico de fosfato de sódio) e Na2HPO4, H2O (mo- noidrato monobásico de fosfato de sódio). Tampão de citrato refere-se a uma solução tamponada por citrato contendo citrato de sódio (Na3C6H5O7, 2H2O; 1,06448, Merck) e monoidrato de ácido cítrico (C6H8O7, H2O; 1,00244, Merck).

Procedimento FISH/CISH de histologia geral (Exemplos 1 a 20)

[000143] Os slides com porções de humanos (amígdalas, carcinoma de mama, rim e cólon) de múltiplas disposições de tecido embutidas em parafina fixada por formalina (FFPE) cortadas foram cozidos a 60°C durante 30 a 60 minutos, desparafinados em banhos de xileno, re-hidratados em banhos de etanol e em seguida transferidos para Tampão de Lavagem. As amostras foram em seguida pré-tratadas em Solução de Pré-tratamento em um mínimo de 95°C durante 10 minutos e lavadas 2x3 minutos. As amostras foram em seguida digeridas com Pepsin RTU a 37°C durante 3 minutos, lavadas 2x3 minutos, desidratadas em uma série de evaporações de etanol, e secadas por ar. As amostras foram em seguida incubadas com 10 pL de sonda FISH como descrito sob os experimentos individuais. As amostras foram em seguida lavadas por Lavagem Rigorosa a 65°C 10 minutos, em seguida lavadas 2x3 minutos, em seguida desidratadas em uma série de evaporações de etanol, e secadas por ar. Finalmente, os slides foram montados com 15 pL de Meio de Montagem Antidesbotamento. Quando o manchamento foi completado, observadores treinados para estimar a intensidade de sinal, morfologia, e base dos slides manchados realizaram a classificação.

Procedimento FISH de citologia geral (Exemplos 21 a 22)

[000144] Slides com preparação de metafases foram fixados em 3,7% de formaldeído durante 2 minutos, lavados 2x5 minutos, desi-dratados em uma série de evaporações de etanol, e secados por ar. As amostras foram em seguida incubadas com 10 pL de sonda FISH como descrito sob os experimentos individuais. As amostras foram em seguida lavadas por Lavagem Rigorosa a 65°C 10 minutos, em seguida lavadas 2x3 minutos, em seguida desidratadas em uma série de evaporações de etanol, e secadas por ar. Finalmente, os slides foram montados com 15 pL de Meio de Montagem Antidesbotamento. Quando o manchamento foi completado, observadores treinados para estimar a intensidade de sinal e base dos slides manchados realizaram a classificação como descrito na classificação para normas para porções de tecido.

Normas de classificação de porções de tecido

[000145] As intensidades de sinal foram avaliadas em uma escala de 0 a 3 com 0 significando nenhum sinal e 3 equiparando-se a um sinal forte. As estruturas célula/tecido são avaliadas em uma escala de 0 a 3 com 0 significando nenhuma estrutura e nenhum limite de núcleos e 3 equiparando-se à estrutura intacta e limites claros de núcleos. Entre 0 e 3 existem graus adicionais 0,5 a parte do que o observador pode estimar intensidade de sinal, estrutura de tecido, e base.

[000146] A intensidade de sinal é classificada após um sistema graduado em uma escala de 0 a 3, 0 Nenhum sinal é observado. 1 A intensidade de sinal é fraca. 2 A intensidade de sinal é moderada. 3 A intensidade de sinal é forte.

[000147] O sistema de classificação permite o uso de % graus.

[000148] A estrutura de tecido e nuclear é classificada após um sistema graduado em uma escala de 0 a 3, 4 As estruturas de tecido e limites nucleares são completamente destruídos. 1 As estruturas de tecido e/ou limites nucleares são ruins. Este grau inclui situações em que algumas áreas têm núcleos vazios. 2 As estruturas de tecido e/ou limites nucleares são observados, porém os limites nucleares não são claros. Este grau inclui situações em que alguns núcleos são vazios. 3 As estruturas de tecido e limites nucleares são intactos e claros.

[000149] O sistema de classificação permite o uso de 16 graus.

[000150] A base é classificada após um sistema graduado em uma escala de 0 a 3, 4 Pouca a nenhuma base é observada. 1 Alguma base. 2 Base moderada. 3 Base elevada. 4 sistema de classificação permite o uso de 16 graus.

Exemplo 1

[000151] Este exemplo compara a intensidade de sinal e morfologia celular de amostras tratadas com as composições da invenção ou soluções de hibridização tradicionais como uma função de temperatura de desnaturação.

[000152] Composição de sonda FISH I: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de formamida (15515-026, Invitrogen), 5 pM blocking PNAs (veja Kirsten Vang Nielsen e outro, PNA Suppression Method Combined with Fluorescence in situ Hybridisation (FISH) Technique in PRINS and PNA Technologies in Chromosomal Investigation, Capítulo 10 (Franck Pellestor ed.) (Nova Science Publishers, Inc. 2006)), 10 ng/pL de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas (RP11-1143E20, tamanho 192 kb).

[000153] Composição de sonda FISH II: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de carbonato de etileno (03519, Fluka), 5 pM de PNAs de bloqueio, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas (RP11-1143E20, tamanho 192 kb).

[000154] Fases de viscosidade diferente, se presentes, foram misturadas antes do uso. As sondas FISH foram desnaturadas como indicado durante 5 minutos e hibridizadas a 45°C durante 60 minutos. Resultados:

[000155] Sinais cassificados como "3" ficaram claramente visíveis em uma objetiva de 20x.

Exemplo 2

[000156] Este exemplo compara a intensidade de sinal e mancha- mento de base de amostras tratadas com as composições da invenção ou soluções de hibridização tradicionais como uma função de tempo de hibridização.

[000157] Composição de sonda FISH I: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de formamida, 5 pM de PNAs de bloqueio, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas.

[000158] Composição de sonda FISH II: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de carbonato de etileno, 5 pM de PNAs de bloqueio, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas.

[000159] Fases de viscosidade diferente, se presentes, foram mistu-radas antes do uso. As sondas FISH foram incubadas a 82°C durante 5 minutos e em seguida a 45°C durante 14 horas, 4 horas, 2 horas, 60 minutos, 30 minutos, 15 minutos, 0 minuto. Resultados:

[000160] Sinais classificados como "3" ficaram claramente visíveis em uma objetiva de 20x.

Exemplo 3

[000161] Este exemplo compara a intensidade de sinal de amostras tratadas com as composições da invenção tendo diferentes solventes apróticos polares ou soluções de hibridização tradicionais.

[000162] Composição de sonda FISH I: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de formamida, 5 pM de PNAs de bloqueio, 10 ng/gL de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas.

[000163] Composição de sonda FISH II: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de carbonato de etileno (EC), 5 pM de PNAs de bloqueio, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas.

[000164] Composição de sonda FISH III: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de carbonato de pro- pileno (PC) (540013, Aldrich), 5 pM de PNAs de bloqueio, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas.

[000165] Composição de sonda FISH IV: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de Sulfolano (SL) (T22209, Aldrich), 5 pM de PNAs de bloqueio, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas.

[000166] Composição de sonda FISH V: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de Aceto nitrila (AN) (C02CIIX, Lab-Scan), 5 pM de PNAs de bloqueio, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas.

[000167] Composição de sonda FISH VI: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de y-butirolactona (GBL) (B103608, Aldrich), 5 pM de PNAs de bloqueio, 7,5 ng/pL de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas.

[000168] Fases de viscosidade diferente, se presentes, foram misturadas antes do uso. As sondas FISH foram incubadas a 82°C durante 5 minutos e em seguida a 45°C durante 60 minutos. Resultados:

[000169] Sinais classificados como "3" ficaram claramente visíveis em uma objetiva de 20x.

Exemplo 4

[000170] Este exemplo compara a intensidade de sinal de amostras tratadas com as composições da invenção tendo diferentes concentrações de solvente aprótico polar.

[000171] Composição de sonda FISHs: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 10 a 60% de carbonato de etileno (como indicado), 5 pM de PNAs de bloqueio, 7,5 ng/pL de sonda de gene de DNA constante de IGK rotulada por Vermelho Texas ((CTD-3050E15, RP11-1083E8; tamanho 227 kb) e 7,5 ng/pL de sonda de DNA de gene variável por IGK rotulada por FITC (CTD- 2575M21, RP11-122B6, RP11-316G9; tamanho 350 e 429 kb).

[000172] Fases de viscosidade diferente, se presentes, foram misturadas antes do uso. As sondas FISH foram incubadas a 82°C durante 5 minutos e em seguida a 45°C durante 60 minutos.

[000173] Sinais classificados como "3" ficaram claramente visíveis em uma objetiva de 20x.

Exemplo 5

[000174] Este exemplo compara a intensidade de sinal e intensidade de base de amostras tratadas com as composições com e sem bloqueio de PNA.

[000175] Composição de sonda FISHs: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de carbonato de etileno, 7,5 ng/pL de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas.

[000176] Fases de viscosidade diferente, se presentes, foram misturadas antes do uso. As sondas FISH foram incubadas a 82°C durante 5 minutos e em seguida a 45°C durante 60 minutos.

[000177] Sinais classificados como "3" ficaram claramente visíveis em uma objetiva de 20x.

Exemplo 6

[000178] Este exemplo compara a intensidade de sinal de amostras tratadas com as composições da invenção como uma função de concentração de sonda e tempo de hibridização.

[000179] Composição de sonda FISHs: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de carbonato de etileno, e 10, 7,5, 5 ou 2,5 ng/pL de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas (como indicado).

[000180] Fases de viscosidade diferente, se presentes, foram misturadas antes do uso. As sondas FISH foram incubadas a 82°C durante 5 minutos e em seguida a 45°C durante 3 horas, 2 horas e 1 hora.

[000181] Sinais classificados como "3" ficaram claramente visíveis em uma objetiva de 20x.

Exemplo 7

[000182] Este exemplo compara a intensidade de sinal de amostras tratadas com as composições da invenção como uma função de concentrações de sal, fosfato, e tampão.

[000183] Composição de sonda FISHs: 10% de sulfato de dextrana, ([NaCI], [tampão de fosfato], [Tampão TRIS] como indicado em Resul-tados), 40% de carbonato de etileno, 7,5 ng/pL de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas.

[000184] Fases de viscosidade diferente, se presentes, foram misturadas antes do uso. As sondas FISH foram incubadas a 82°C durante 5 minutos e em seguida a 45°C durante 60 minutos.Resultados:

[000185] Sinais classificados como "3" ficaram claramente visíveis em uma objetiva de 20x.

Exemplo 8

[000186] Este exemplo compara a intensidade de sinal de amostras tratadas com as composições da invenção como uma função de concentração de sulfato de dextrana.

[000187] Composição de sonda FISHs: 0, 1,2, 5, ou 10% de sulfato de dextrana (como indicado), NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de carbonato de etileno, 5 ng/pL de sonda de DNA de gene SIL-TAL1 rotulada por Vermelho Texas (RP1-278O13; tamanho 67 kb) e 6 ng/pL de FITC SIL-TAL1 (ICRFd 12-112C1794, RP11-184J23, RP11-8J9, CTD-2007B18, 133B9; tamanho 560 kb).

[000188] Fases de viscosidade diferente, se presentes, foram misturadas antes do uso. As sondas FISH foram incubadas a 82°C durante 5 minutos e em seguida a 45°C durante 60 minutos. Nenhum bloqueio. Resultados:

NOTA: este experimento não produziu resultados classificados como "3" por que a sonda rotulada por Vermelho Texas SIL- TAL1 é apenas 67 kb e foi de uma preparação não otimizada.

Exemplo 9

[000189] Este exemplo compara a intensidade de sinal de amostras tratadas com as composições da invenção como uma função de concentrações de sulfato de dextrana, sal, fosfato, e solvente aprótico polar.

[000190] Composição de sonda FISH la: 34% de sulfato de dextrana, NaCI a 0 mM, tampão de fosfato a 0 mM, 0% de carbonato de etileno, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas (tamanho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.

[000191] Composição de sonda FISH lb: 34% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 0% de carbonato de etileno, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas (tamanho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.

[000192] Composição de sonda FISH lc: 34% de sulfato de dextrana, NaCI a 600 mM, tampão de fosfato a 10 mM, 0% de carbonato de etileno, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas (tamanho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.

[000193] Composição de sonda FISH Ila: 32% de sulfato de dextrana, NaCI a 0 mM, tampão de fosfato a 0 mM, 5% de carbonato de etileno, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas (tamanho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.

[000194] Composição de sonda FISH lib: 32% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 5% de carbonato de etileno, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas (tamanho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.

[000195] Composição de sonda FISH He: 32% de sulfato de dextrana, NaCI a 600 mM, tampão de fosfato a 10 mM, 5% de carbonato de etileno, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas (tamanho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.

[000196] Composição de sonda FISH Illa: 30% de sulfato de dextrana, NaCI a 0 mM, tampão de fosfato a 0 mM, 10% de carbonato de etileno, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas (tamanho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.

[000197] Composição de sonda FISH lllb: 30% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 10% de carbonato de etileno, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas (tamanho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.

[000198] Composição de sonda FISH lllc: 30% de sulfato de dextrana, NaCI a 600 mM, tampão de fosfato a 10 mM, 10% de carbonato de etileno, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas (tamanho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.

[000199] Composição de sonda FISH IVa: 28% de sulfato de dextrana, NaCI a 0 mM, tampão de fosfato a 0 mM, 15% de carbonato de etileno, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas (tamanho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.

[000200] Composição de sonda FISH IVb: 28% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 15% de carbonato de etileno, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas (tamanho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.

[000201] Composição de sonda FISH IVc: 28% de sulfato de dextrana, NaCI a 600 mM, tampão de fosfato a 10 mM, 15% de carbonato de etileno, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas (tamanho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.

[000202] Referência V de sonda FISH: Frasconete de venda padrão de mistura de sonda PharmDx HER2 (K5331, Dako) contendo PNA de bloqueio. Hibridização durante a noite durante 20 horas.

[000203] Todas as composições estavam presentes como uma fase única. As sondas FISH foram incubadas a 82°C durante 5 minutos e em seguida a 45°C durante 60 minutos sem nenhum bloqueio, exceto para Referência V de sonda FISH, que tinha bloqueio de PNA e foi hi- bridizada durante 20 horas.

NOTA: Composição IVa forneceu fortes sinais de DNA sem nenhum sal. Isto não é possível com composições FISH padrão, em que a ligação de DNA é dependente do sal.

Exemplo 10

[000204] Este exemplo compara a intensidade de sinal de amostras tratadas com as composições da invenção como uma função de solvente aprótico polar e concentração de sulfato de dextrana sob condições de sal elevado (4x o normal).

[000205] Composição de sonda FISH I: 0% de carbonato de etileno, 29% de sulfato de dextrana, NaCI a 1200 mM, tampão de fosfato a 20 mM, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM. A composição foi uma fase única.

[000206] Composição de sonda FISH II: 5% de carbonato de etileno, 27% de sulfato de dextrana, NaCI a 1200 mM, tampão de fosfato a 20 mM, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM. A composição foi uma fase única.

[000207] Composição de sonda FISH III: 10% de carbonato de etileno, 25% de sulfato de dextrana, NaCI a 1200 mM, tampão de fosfato a 20 mM, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Ver- melho Texas e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM. A composição foi uma fase única.

[000208] Composição de sonda FISH IV (não testada): 20% de carbonato de etileno, 21% de sulfato de dextrana, NaCI a 1200 mM, tampão de fosfato a 20 mM, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM. A composição tinha duas fases.

NOTA: Composição II forneceu bons sinais de DNA com apenas 5% de EC e fortes sinais de DNA com 10% de EC.

Exemplo 11

[000209] Este exemplo compara a intensidade de sinal e base de amostras tratadas com diferentes fases das composições da invenção.

[000210] Composição de sonda FISH: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de carbonato de etileno, 8 ng/pL de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas e sonda de PNA CEN-17 rotulada com FITC a 600 nM. As sondas FISH foram incubadas a 82°C durante 5 minutos e em seguida a 45°C durante 60 minutos. Nenhum bloqueio.

Exemplo 12

[000211] Este exemplo é similar ao exemplo anterior, porém usa uma diferente sonda de DNA e GBL em lugar de EC.

[000212] Composição de sonda FISH: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% GBL, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas e sonda de PNA CEN-17 rotulada com FITC a 600 nM.

[000213] As sondas FISH foram incubadas a 82°C durante 5 minutos e em seguida a 45°C durante 60 minutos. Nenhum bloqueio.

Exemplo 13

[000214] Este exemplo examina o número de fases nas composições da invenção como uma função de solvente aprótico polar e concentração de sulfato de dextrana.

[000215] Composição de sonda FISHs: 10 ou 20% de sulfato de dextrana; NaCI a 300 mM; tampão de fosfato a 5 mM; 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30% de EC; 10 ng/pL de sonda.

NOTA: 15% de EC, 20% de sulfato de dextrana produz as intensidades de sinal elevadas mais agudas da solução de uma fase acima. Duas fases 20% de EC têm intensidades de sinal ainda maiores do que 15%. (Dados não mostrados).

Exemplo 14

[000216] Este exemplo compara a intensidade de sinal e base de amostras tratadas com diferentes composições da invenção como uma função de concentração de sonda e tempo de hibridização.

[000217] Composição de sonda FISH I: 10 ng/pL de sonda de DNA HER2 rotulada por TxRed (concentração padrão) e concentração padrão de sonda de PNA CEN7 rotulada por FITC (50 nM); 15% de EC; 20% de sulfato de dextrana; NaCI a 600 mM; tampão de fosfato a 10 mM.

[000218] Composição de sonda FISH II: 5 ng/pL de sonda de DNA HER2 rotulada por TxRed (1/2 de concentração padrão) e concentração padrão (50 nM) de sonda de PNAs CEN7 rotulada por FITC; 15% de EC; 20% de sulfato de dextrana; NaCI a 600 mM; tampão de fosfato a 10 mM.

[000219] Composição de sonda FISH III: 2,5 ng/pL de sonda de DNA HER2 rotulada por TxRed (1/4 de concentração padrão) e % da concentração padrão (25 nM) de sonda CEN7 de PNAs; 15% de EC; 20% de sulfato de dextrana; NaCI a 600 mM; tampão de fosfato a 10 mM.

[000220] Composições l-lll existiram como uma fase única. As sondas FISH foram incubadas a 82°C durante 5 minutos e em seguida a 45°C durante 3 horas, 2 horas e 1 hora. Resultados:

Sinais classificados como "3" ficaram claramente visíveis em uma objetiva de 20x. B.G.: Base.

Exemplo 15

[000221] Este exemplo compara a intensidade de sinal e base de amostras tratadas com as composições da invenção como uma função de agente de bloqueio.

[000222] Composição de sonda FISHs: 15% de EC; 20% de sulfato de dextrana; NaCI a 600 mM; tampão de fosfato a 10 mM; 2,5 ng/pL de sonda de DNA HER2 rotulada por TxRed (1/4 de concentração padrão) e % da concentração padrão (300 nM) FITC rotulada CEN17 sonda de PNA. As amostras foram bloqueadas com: (a) nothing; (b) 0,1 pg/pL de COT1 (15279-011, Invitrogen); (c) 0,3 jig/pL de COT1; ou (d) 0,1 pig/piL de DNA humano total antes da hibridização usando as composições da invenção.

[000223] Todas as amostras estavam presentes como uma fase única. As sondas FISH foram incubadas a 82°C durante 5 minutos e em seguida a 45°C durante 60 minutos.

NOTA: Os níveis de base sem bloqueio são significante- mente menores do que o que é normalmente observado por FISH padrão sem nenhum bloqueio. Ao contrário, se uma composição padrão FISH não contém um agente de bloqueio, Os sinais normalmente não podem ser lidos.

Exemplo 16

[000224] Este experimento compara diferentes modos de remover manchamento de base usando as composições da invenção.

[000225] Todas as composições continham 15% de EC, 20% de sulfato de dextrana, NaCI a 600 mM, tampão de fosfato a 10 mM, 2,5 ng/pL de sonda HER2 de DNAs (1/4 de concentração padrão), sonda CEN17 de PNA a 300 nM (1/2 de concentração padrão), e um dos seguintes agentes de redução de base: A) 5 pM de PNA de bloqueio (veja Kirsten Vang Nielsen e outro, PNA Suppression Method Combined with Fluorescence in situ Hybridisation (FISH) Technique in PRINS e PNA Technologies in Chromosomal Investigation, Capítulo 10 (Franck Pellestor ed.) (Nova Science Publishers, Inc. 2006)) B)0,1 pg/pL de COT-1 DNA C) 0,1 pg/pL de DNA humano total (THD) (THD não rotulado tratado com ondas sonoras) D) 0,1 pg/pL de DNA de esperma de salmão cisalhado (AM9680, Ambion) E) 0,1 pg/pL de DNA de timo de bezerro (D8661, Sigma) F) 0,1 pg/pL de DNA de esperma de arenque (D7290, Sigma) G) 0,5% de formamida H) 2% de formamida I) 1% de etileno glicol (1,09621, Merck) J) 1% de glicerol (1,04095, Merck) K) 1% de 1,3-propanodiol (533734, Aldrich) L) 1 % de H2O (controle)

[000226] Todas as amostras estavam presentes como uma fase única. As sondas foram incubadas a 82°C durante 5 minutos e em seguida a 45°C em porções de tecido FFPE durante 60 e 120 minutos. Resultados:

NOTA: todos os agentes de redução de base, exceto para PNA de bloqueio , mostraram um efeito em redução de base. Desse modo, bloqueio específico contra sequências de DNA repetitivas não é requerido.

Exemplo 17

[000227] Este experimento compara a intensidade de sinal das fases superior e inferior usando dois diferentes solventes apróticos polares.

[000228] Composição de sonda FISH I: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de tritiocarbonato de etileno (ET) (E27750, Aldrich), 5 pM de PNAs de bloqueio, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas.

[000229] Composição de sonda FISH II: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% sulfito de glicol (GS) (G7208, Aldrich), 5 pM de PNAs de bloqueio, 10 ng/pL de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas.

[000230] As sondas FISH foram incubadas a 82°C durante 5 minutos e em seguida a 45°C durante 60 minutos.

Exemplo 18

[000231] Este experimento examina a capacidade de vários solventes apróticos polares para formar um sistema de uma fase.

[000232] Todas as composições continham: 20% de sulfato de dextrana, NaCI a 600 mM, tampão de fosfato a 10 mM, e ou 10, 15, 20, ou 25% de um dos seguintes solventes apróticos polares: Sulfolano y-Butirolactona Tritiocarbonato de etileno Sulfito de glicol Carbonato de propileno

[000233] Resultados: todos os solventes apróticos polares em todas as concentrações examinadas produziram pelo menos um sistema de duas fases nas composições usadas. Entretanto, isto não exclui que estes compostos podem produzir um sistema de uma fase sob outras condições de composição.

Exemplo 19

[000234] Este experimento examina o uso das composições da invenção em análise (CISH) de hibridização in situ cromogênica em porções de tecido multi FFPE.

[000235] Composição de sonda FISH I: 4,5 ng/pL sonda de DNA de gene rotulado por FITC TCRAD (1/4 de concentração padrão) (RP11- 654A2, RP11-246A2, CTP-2355L21, RP11-158G6, RP11-780M2, RP11-481C14; tamanho 1018 kb); 15% de EC; 20% de sulfato de dextrana; NaCI a 600 mM; tampão de citrato a 10 mM, pH 6,0,

[000236] Composição de sonda FISH II: 4,5 ng/pL sonda de DNA de gene rotulado por FITC TCRAD (1/4 de concentração padrão) (tamanho 1018 kb); 15% de EC; 20% de sulfato de dextrana; NaCI a 600 mM; tampão de citrato a 10 mM, pH 6,0; 0,1 ug/uL de esperma de DNA de salmão cisalhado.

[000237] Composição de sonda FISH III: 300 nM de cada sonda CEN17 de PNA rotulada por FITC individual (1/2 de concentração padrão); 15% de EC; 20% de sulfato de dextrana; NaCI a 600 mM; tampão de citrato a 10 mM, pH 6,0.

[000238] Todas as amostras foram analisadas usando o protocolo DuoCISH Dako (SK108) e composições para dividir sondas, com a exceção de que a lavagem rigorosa foi conduzida durante 20 minutos em lugar de 10 minutos, e sem usar a etapa de cromógeno vermelho DuoCISH.

NOTA: As intensidades de sinal foram muito fortes. Devido aos níveis elevados de base, não foi possível discriminar se a adição de DNA de esperma de salmão na composição II reduziu a base. Os sinais foram claramente visíveis usando uma objetiva 10x, por exemplo, em amígdalas, que em geral tiveram menos base. Se tecidos possuíram base elevada, os sinais foram claramente visíveis usando uma objetiva de 20x.

Exemplo 20

[000239] Este exemplo compara a intensidade de sinal e base de porções de tecido FFPE tratada com as composições da invenção com duas sondas de DNAs.

[000240] Composição de sonda FISH I: 9 ng/pL sonda de DNA de gene rotulado por FITC IGH (RP11-151B17, RP11-112H5, RP11- 101G24, RP11-12F16, RP11-47P23, CTP-3087C18; tamanho 612 kb); 6,4 ng/pL sonda de DNA rotulada por Tx Red MYC (CTD-2106F24, CTD-2151C21, CTD-2267H22; tamanho 418 kb); 15% de EC; 20% de sulfato de dextrana; NaCI a 600 mM; tampão de citrato a 10 mM, pH 6,0.

[000241] Composição de sonda FISH II: 9 ng/pL sonda de DNA de gene rotulado por IGH FITC; 6,4 ng sonda de DNA rotulada por TxRed MYC; 15% de EC, 20% de sulfato de dextrana; NaCI a 600 mM; tampão de citrato a 10 mM, pH 6,0; 0,1 ug/uL de DNA de esperma de salmão cisalhado.

NOTA: a base elevada foi provavelmente devido ao fato de que concentrações de sonda padrão foram usadas.

Exemplo 21

[000242] Este experimento examina o uso das composições da invenção em amostras citológicas.

[000243] Composição de sonda FISH: 15% de EC; 20% de sulfato de dextrana; NaCI a 600 mM; tampão de fosfato a 10 mM; 5 ng/pL de sonda de DNA HER2 rotulada por TxRed (1/2 de concentração padrão) e !4 da concentração padrão de CEN7 (25 nM).

[000244] As sondas FISH foram incubadas em dispersões de cromossoma de metafase a 82oC durante 5 minutos, em seguida a 45oC durante 30 minutos, todas sem bloqueio.

Nenhuma associação de cromossoma (Padrão de associa- ção R) foi observada com as composições da invenção, ao contrário das soluções de ISH tradicionais, que tipicamente mostram associação R. Um baixo manchamento de base homogeneamente vermelho dos núcleos de interface e cromossomas de metafase foi observado.

Exemplo 22

[000245] Este exemplo compara a intensidade de sinal e base de sonda de DNAs em amostras de citologia, amplitude de metafase, com e sem bloqueio.

[000246] Composição de sonda FISH I: 6 ng/pL de sonda de DNA de gene rotulado TCRAD Vermelho Texas (concentração padrão) (CTP- 31666K20, CTP-2373N7; tamanho 301 kb) e 4,5 ng/pL de sonda de DNA de gene rotulado FITC (1/4 de concentração padrão); 15% de EC, 20% de sulfato de dextrana; NaCI a 600 mM; tampão de citrato a 10 mM, pH 6,0.

[000247] Composição de sonda FISH II: 6 ng/pL de sonda de DNA de gene rotulado TCRAD Vermelho Texas (concentração padrão) (tamanho 301 kb) e 4,5 ng/pL de sonda de DNA de gene rotulado FITC (1/4 de concentração padrão); 15% de EC, 20% de sulfato de dextrana; NaCI a 600 mM; tampão de citrato a 10 mM, pH 6,0; 0,1 ug/uL de DNA de esperma de salmão cisalhado.

[000248] As sondas FISH foram incubadas em amplitude de metafase a 82°C durante 5 minutos, em seguida a 45°C durante 60 minutos.

[000249] Novamente, nenhuma associação de cromossoma (Padrão de associação R) foi observada com as composições da invenção. Além disso, nenhum manchamento de base dos núcleos de interface ou cromossomas de metafase foram observados.

OUTRAS MODALIDADES

[000250] Modalidade 1. Uma composição de hibridização que compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico, pelo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo, e uma solução de hibridização, em que o solvente aprótico polar não é sulfóxido de dimetila (DMSO).

[000251] Modalidade 2. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 1, em que a concentração de solvente aprótico polar é de de cerca de 1 % a 95% (v/v).

[000252] Modalidade 3. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que a concentração de solvente aprótico polar é de 5% a 10% (v/v).

[000253] Modalidade 4. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que a concentração de solvente aprótico polar é de 10% a 20% (v/v).

[000254] Modalidade 5. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que a concentração de solvente aprótico polar é de 20% a 30% (v/v).

[000255] Modalidade 6. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, em que o solvente aprótico polar é não tóxico.

[000256] Modalidade 7. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 6, com a condição de que a composição não contenha formamida.

[000257] Modalidade 8. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 6, com a condição de que a composição contenha menos do que 10% de formamida.

[000258] Modalidade 9. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 8, com a condição de que a composição contenha menos do que 2% de formamida.

[000259] Modalidade 10. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 9, com a condição de que a composição contenha menos do que 1% de formamida.

[000260] Modalidade 11. A composição de hibridização de acordo com qualquer das modalidades 1 a 10, em que o solvente aprótico polar tem funcionalidade lactona, sulfona, nitrila, sulfito, e/ou carbonato.

[000261] Modalidade 12. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 11, em que o solvente aprótico polar tem um parâmetro de solubilidade de dispersão entre 17,7 a 22,0 MPa1/2, um parâmetro de solubilidade polar entre 13 a 23 MPa1/2, e um parâmetro de solubilidade em ligação a hidrogênio entre 3 a 13MPa1/2.

[000262] Modalidade 13. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 12, em que o solvente aprótico polar tem uma estrutura de base cíclica.

[000263] Modalidade 14. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 13, em que o solvente aprótico polar é selecionado do grupo que consiste em:

em que X é opcional e se presente, é escolhido de O ou S, em que Z é opcional e se presente, é escolhido de O ou S, em que A e B independentemente são O ou N ou S ou parte da alquildiila ou uma amina primária, em que R é alquildiila, e em que Y é O ou S ou C.

[000264] Modalidade 15. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 14, em que o solvente aprótico polar é selecionado do grupo que consiste em: acetanilida, acetonitrila, N-acetil pirrolidona, 4-amino piridina, benzamida, benzimidazol, 1,2,3-benzotriazol, butadienodióxido, carbonato de 2,3-butileno, y- butirolactona, caprolactona (épsilon), anidrido cloro maleico, 2- clorociclo-hexanona, carbonato de cloroetileno, cloronitrometano, anidrido citracônico, crotonlactona, 5-ciano-2-tiouracila, ciclopropilnitrila, sulfato de dimetila, dimetil sulfona, 1,3-dimetil-5-tetrazol, 1,5-dimetil tetrazol, 1,2-dinitrobenzeno, 2,4-dinitrotolueno, Difenil sulfona, 1,2- dinitrobenzeno, 2,4-dinitrotolueno, Difenil sulfona, épsilon-caprolactam, etanossulfonilcloreto, fosfinato de etil etila, N-etil tetrazol, carbonato de etileno, tritiocarbonato de etileno, sulfato de etileno glicol, sulfito de glicol, furfural, 2-furonitrila, 2-imidazol, isatina, isoxazol, malononitrila, benzonitrila de 4-metóxi, 1-metoxi-2-nitrobenzeno, alfa bromo tetronato de metila, 1-metil imidazol, N-metil imidazol, 3-metil isoxazol, N-metil morfolina-N-óxido, metil fenil sulfona, N-metil pirrolidinona, metil sulfo- lano, metil-4-toluenossulfonato, 3-nitroanilina, nitrobenzimidazol, 2- nitrofurano, 1-nitroso-2-pirrolidinona, 2-nitrotiofeno, 2-oxazolidinona, 9,10-fenantrenoquinona, N-fenil sidnona, anidrido ftálico, picolinonitrila (2-cianopiridina), 1,3-propano sultona, β-propiolactona, propileno carbonato, 4H-piran-4-tiona, 4H-piran-4-ona (y-pirona), piridazina, 2- pirrolidona, sacarina, succinonitrila, sulfanilamida, sulfolano, 2,2,6,6- tetraclorociclo-hexanona, óxido de tetraidrotiapirano, tetrametileno sulfona (sulfolano), tiazol, 2-tiouracila, 3,3,3-tricloro propeno, 1,1,2-tricloro propeno, 1,2,3-tricloro propeno, dióxido-sulfeto de trimetileno, e sulfito de trimetileno.

[000265] Modalidade 16. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 14, em que o solvente apróti co polar é selecionado do grupo que consiste em:

[000266] Modalidade 17. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 14, em que o solvente aprótico polar é:

[000267] Modalidade 18. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 17, também compreendendo pelo menos um componente adicional selecionado do grupo que consiste em: agentes de tamponamento, sais, agentes de aceleração, agentes de quelação, detergentes, e agentes de bloqueio.

[000268] Modalidade 19. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 18, em que o agente de aceleração é sulfato de dextrana e os sais são tampão de fosfato e/ou NaCI.

[000269] Modalidade 20. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 19, em que o sulfato de dextrana está presente em uma concentração de 5% a 40%, o NaCI está presente em uma concentração de 0 mM a 1200 mM, e/ou o tampão de fosfato está presente em uma concentração de 0 mM a 50 mM.

[000270] Modalidade 21. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 20, em que o sulfato de dextrana está presente em uma concentração de 10% a 30%, o NaCI está presente em uma con centração de 300 mM a 600 mM, e/ou o tampão de fosfato está presente em uma concentração de 5 mM a 20 mM.

[000271] Modalidade 22. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 18, em que o agente de aceleração é selecionado do grupo que consiste em: formamida, glicerol, propileno glicol, 1,2- propanodiol, dietileno glicol, etileno glicol, glicol, e 1,3 propanodiol, e o agente de tamponamento é tampão de ácido cítrico.

[000272] Modalidade 23. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 22, em que a formamida está presente em uma concentração de 0,1 a 5%, o glicerol, propileno glicol, 1,2-propanodiol, dietileno glicol, etileno glicol, glicol, e 1,3 propanodiol estão presentes em uma concentração de 0,1% a 10%, e o tampão de ácido cítrico está presente em uma concentração de 1 mM a 50 mM.

[000273] Modalidade 24. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 18, em que o agente de bloqueio é selecionado do grupo que consiste em: DNA humano total, DNA de esperma de arenque, DNA de esperma de salmão, e DNA de timo de bezerro.

[000274] Modalidade 25. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 24, em que o DNA humano total, DNA de esperma de arenque, DNA de esperma de salmão, e DNA de timo de bezerro estão presentes em uma concentração de 0,01 a 10 pg/pL.

[000275] Modalidade 26. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 25, compreendendo 40% de pelo menos um solvente aprótico polar, 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, e tampão de fosfato a 5 mM.

[000276] Modalidade 27. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 25, compreendendo 15% de pelo menos um solvente aprótico polar, 20% de sulfato de dextrana, NaCI a 600 mM, tampão de fosfato a 10 mM, e 0,1 pg/pL de DNA humano total.

[000277] Modalidade 28. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 25, compreendendo 15% de pelo menos um solvente aprótico polar, 20% de sulfato de dextrana, NaCI a 600 mM, tampão de ácido cítrico a 10 mM, pH 6,2, e 0,1 pg/pL de DNA de esperma de arenque, ou DNA de esperma de salmão, ou DNA de timo de bezerro, ou 0,5% de formamida, ou 1% etileno glicol, ou 1% 1,3 propanodiol.

[000278] Modalidade 29. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 28, compreendendo mais do que uma fase em temperatura ambiente.

[000279] Modalidade 30. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 29, compreendendo duas fases em temperatura ambiente.

[000280] Modalidade 31. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 29, compreendendo três fases em temperatura ambiente.

[000281] Modalidade 32: Um Método de hibridização de sequências de ácido nucleico que compreende: - fornecer uma primeira sequência de ácido nucleico, - fornecer uma segunda sequência de ácido nucleico, - fornecer uma composição de hibridização que compreende pelo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotideo de filamento duplo, e - combinar a primeira e a segunda sequências de ácido nu-cleico e a composição de hibridização durante pelo menos um período de tempo suficiente para hibridizar a primeira e segunda sequências de ácido nucleico, em que o solvente aprótico polar não é sulfóxido de dimetila (DMSO).

[000282] Modalidade 33. Um método de hibridização de sequências de ácido nucleico que compreende: - fornecer uma primeira sequência de ácido nucleico in an in situamostra biológica, e - aplicar uma composição de hibridização que compreende uma segunda sequência de ácido nucleico e pelo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo para a referida primeira sequência de ácido nucleico durante pelo menos um período de tempo suficiente para hibridizar a primeira e segunda sequências de ácido nucleico, em que o solvente aprótico polar não é sulfóxido de dimetila (DMSO).

[000283] Modalidade 34. Um método de hibridização de sequências de ácido nucleico que compreende: - fornecer uma primeira sequência de ácido nucleico, - fornecer uma segunda sequência de ácido nucleico, - fornecer uma composição de hibridização de acordo com qualquer das modalidades 1 a 31, e - combinar as primeira e segunda sequências de ácido nucleico e a composição de hibridização durante pelo menos um período de tempo suficiente para hibridizar a primeira e segunda sequências de ácido nucleico.

[000284] Modalidade 35: Um método de hibridização de sequências de ácido nucleico que compreende: - fornecer uma primeira sequência de ácido nucleico, e - aplicar uma composição de hibridização de acordo com qualquer das modalidades 1 a 31 à referida primeira sequência de ácido nucleico durante pelo menos um período de tempo suficiente para hibridizar a primeira e segunda sequências de ácido nucleico.

[000285] Modalidade 36. Método de acordo com as modalidades 30 ou 31, em que o solvente aprótico polar é definido de acordo com qualquer das modalidades 2 a 6 ou 11 a 17,

[000286] Modalidade 37. Método de acordo com qualquer das modalidades 30 a 36, em que é fornecida uma quantidade suficiente de energia para hibridizar o primeiro e segundo ácidos nucléicos .

[000287] Modalidade 38. Método de acordo com a modalidade 37, em que a energia é fornecida por aquecimento da composição de hibridização e sequência de ácido nucleico.

[000288] Modalidade 39. Método de acordo com a modalidade 38, em que a etapa de aquecimento é realizada pelo uso de microondas, banhos quentes, placas quentes, fio quente, elemento peltier, indução de aquecimento ou lâmpadas quentes.

[000289] Modalidade 40. Método de acordo com qualquer uma das modalidades 32 a 39, em que a primeira sequência de ácido nucleico é de filamento duplo e o segundo ácido nucleico é de filamento único.

[000290] Modalidade 41. Método de acordo com qualquer uma das modalidades 32 a 40, em que as etapas de desnaturação e hibridização ocorrem separadamente.

[000291] Modalidade 42. Método de acordo com qualquer uma das modalidades 32 a 41, em que a etapa de hibridização inclui as etapas de aquecimento e resfriamento da composição de hibridização e sequência de ácido nucléicos.

[000292] Modalidade 43. Método de acordo com qualquer uma das modalidades 32 a 42, em que a etapa de hibridização leva menos do que 8 horas.

[000293] Modalidade 44. Método de acordo com a modalidade 43, em que a etapa de hibridização leva menos do que 1 hora.

[000294] Modalidade 45. Método de acordo com a modalidade 44, em que a etapa de hibridização leva menos do que 30 minutos.

[000295] Modalidade 46. Método de acordo com a modalidade 45, em que a etapa de hibridização leva menos do que 15 minutos.

[000296] Modalidade 47. Método de acordo com a modalidade 46, em que a etapa de hibridização leva menos do que 5 minutos.

[000297] Modalidade 48. Método de acordo com qualquer uma das modalidades 32 a 47, em que a etapa de resfriamento leva menos do que 1 hora.

[000298] Modalidade 49. Método de acordo com a modalidade 48, em que a etapa de resfriamento leva menos do que 30 minutos.

[000299] Modalidade 50. Método de acordo com a modalidade 49, em que a etapa de resfriamento leva menos do que 15 minutos.

[000300] Modalidade 51. Método de acordo com a modalidade 50, em que a etapa de resfriamento leva menos do que 5 minutos.

[000301] Modalidade 52. Método de acordo com qualquer uma das modalidades 32-51, em que a primeira sequência de ácido nucleico é em uma amostra biológica.

[000302] Modalidade 53. Método de acordo com a modalidade 52, em que a amostra biológica é uma amostra de citologia ou histologia.

[000303] Modalidade 54. Método de acordo com qualquer uma das modalidades 32-53, em que a composição de hibridização compreende uma fase em temperatura ambiente.

[000304] Modalidade 55. Método de acordo com qualquer uma das modalidades 32-53, em que a composição de hibridização compreende múltiplas fases em temperatura ambiente.

[000305] Modalidade 56. Método de acordo com a modalidade 55, em que a composição de hibridização compreende duas fases em temperatura ambiente.

[000306] Modalidade 57. Método de acordo com a modalidade 55 ou 56, em que as fases da composição de hibridização são misturadas.

[000307] Modalidade 58. Método de acordo com qualquer uma das modalidades 32-57, também compreendendo uma etapa de bloqueio.

[000308] Modalidade 59. Uso de uma composição de hibridização que compreende entre 1 e 95% (v/v) de pelo menos um solvente aprótico polar em ensaios de hibridização.

[000309] Modalidade 60. Uso de uma composição de acordo com a modalidade 59, em que a composição de hibridização é de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 31,

Claims (14)

1. Método de hibridização de sequências de ácido nucleico in situ,caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer uma primeira sequência de ácido nucleico de fita dupla em uma amostra citológica ou histológica; fornecer uma segunda sequência de ácido nucleico, fornecer uma composição de hibridização que compreende pelo menos um solvente aprótico polar, desnaturar a primeira sequência de nucleotídeos de fita dupla com a composição de hibridação que compreende o solvente aprótico polar, combinar a primeira e a segunda sequências de ácido nucleico e a composição de hibridização, hibridizar a primeira e a segunda sequências de ácidos nucléicos, e em que o solvente aprótico polar é selecionado do grupo que consiste em:

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição de hibridização compreende a segunda sequência de ácido nucleico.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que as etapas de desnaturação e hibridização ocorrem separadamente.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a etapa de hibridização leva menos que 8 horas, menos que 1 hora, menos do que 30 minutos, menos do que 15 minutos, menos do que 5 minutos.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um agente de aceleração que é uma composição de hibridização.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o agente de aceleração é sulfato de dextrana.

7. Composição de hibridização para o método de hibridização de sequências de ácido nucleico in situ,como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico de 1% (v/v) a 95% (v/v) de um solvente aprótico polar possuindo uma estrutura base cíclica em uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de fita dupla e uma solução de hibridização, e em que o solvente aprótico polar é selecionado do grupo que consiste em:

8. Composição de hibridização, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pela condição de que a composição contém menos de 10% de formamida, preferencial mente não contém formamida.

9. Composição de hibridização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizada pelo fato de que o solvente aprótico polar apresenta um parâmetro de solubilidade de dispersão entre 17,7 a 22,0 MPa1/2, um parâmetro de solubilidade polar entre 13 a 23 MPa1/2, e um parâmetro de solubilidade da ligação de hidrogênio entre 3 a 13 MPa1/2.

10. Composição de hibridização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agente de aceleração.

11. Composição de hibridização, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o agente de aceleração é sulfato de dextrana.

12. Composição de hibridização, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o sulfato de dextrana está presente em uma concentração de 10% a 30%.

13. Composição de hibridização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizada pelo fato de que compreende 15% de pelo menos um solvente aprótico polar, 20% de sulfato de dextrana, NaCI a 600 mM, tampão de ácido cítrico a 10 mM pH 6,2.

14. Uso de uma composição de hibridização, como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 13, caracterizado pelo fato de que é em ensaios de hibridização in situ,como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

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