PT1108786E

PT1108786E - Nova colectina

Info

Publication number: PT1108786E
Application number: PT99938607T
Authority: PT
Inventors: Nobutaka Wakamiya
Original assignee: Fuso Pharmaceutical Ind
Priority date: 1998-08-24
Filing date: 1999-08-24
Publication date: 2007-02-28
Also published as: ES2279629T3; CN1320164A; US20070020729A1; CA2340934A1; US20110065177A1; KR20010085583A; CA2340934C; AU751173B2; WO2000011161A1; EP1108786B1; EP1108786A4; AU5305699A; ATE348158T1; DK1108786T3; JP4441118B2; DE69934415D1; DE69934415T2; US20130230918A1; EP1108786A1; KR100633221B1

Description

DESCRIÇÃO "NOVA COLECTINA" [Campo da Invenção] A presente invenção refere-se a uma nova colectina que é útil para investigar mecanismos do sistema de defesa biológico, e espera-se ser aplicada para utilização como materiais para medicamentos porque pode ter actividades fisiológicas, incluindo actividades antivirais e semelhantes.

[Técnica Anterior]

Colectina é um nome genérico de proteínas que têm a região de reconhecimento de hidratos de carbono dependente de Ca2+ (CRD) e a região de tipo colagénio, e pensa-se que o membro destas proteínas está envolvido em sistemas imunitários básicos contra um vasto espectro de microrganismos, tais como bactérias e vírus.

As colectinas que foram identificadas até agora incluem a proteína de ligação a manano (MBP), proteína A tensioactiva (SP-A), proteína D tensioactiva (SP-D) , conglutinina e semelhantes. Sabe-se que estas colectinas são constituídas de estruturas básicas (Fig. 1) compreendendo regiões únicas de: (1) domínio de reconhecimento de hidratos de carbono dependente de Ca2+ (CRD), e (2) região de tipo colagénio [Malhortra et al., Eur. J. Immunol. Vol. 22, 1437-1445, 1992], e pode-se formar uma 1 subunidade a partir das três estruturas básicas fazendo uma hélice tripla na região de tipo colagénio, além disso, essas subunidades podem formar um oligómero, e. g., trimero, tetrâmero e hexâmero.

Em vertebrados, os mecanismos envolvendo respostas imunitárias celulares e reacções especificas de anticorpo são consideradas como sistemas dominantes de defesa do hospedeiro contra inversão das bactérias patogénicas, virus e semelhantes. Recentemente, foi sugerido o envolvimento das lectinas, tais como conglutinina, em respostas imunitárias inespecificas, por exemplo, foi descrito que as lectinas podem desempenhar papéis importantes na neutralização e remoção de vários microrganismos em lactentes que têm anticorpos maternais insuficientes e sistemas de defesa específicos não desenvolvidos [Super et al., Lancet, Vol. 2, 1236-1239, 1989].

Além disso, relativamente aos papéis das lectinas nos sistemas biológicos de defesa do hospedeiro, foi descrito que o hospedeiro fica sujeito a ser infectado através de, por exemplo, uma redução da concentração de MBP no sangue devido a mutação genética do gene de MBP [Sumiya et al., Lancet, Vol. 337, 1569-1570, 1991] . O presente requerente verificou previamente que a conglutinina e a proteína de ligação a manano podem inibir a infecção e a actividade de hemoglutinação do vírus da Influenza A de Tipo Hl e H3 [Wakamiya et al., Glycoconj ugate J., Vol. 8, 235, 1991; Wakamiya et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., Vol. 187, 1270-1278, 1992].

Posteriormente, o presente requerente isolou um clone de ADNc que codifica a conglutinina, e verificou que pode existir 2 uma correlação mais estreita entre o gene da conglutinina e vários genes da proteína D tensioactiva [Suzuki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., Vol. 191, 335-342, 1993].

Assim, espera-se que a colectina seja útil na investigação de mecanismos de defesa biológica, e útil como um material clínico fisiologicamente activo. Deste modo, a descoberta de novas espécies moleculares pertencentes a esta família contribuiria grandemente para vários campos médicos, incluindo terapia de doenças infecciosas, assim como para campos biológicos.

[Divulgação da Invenção] A presente invenção foi realizada em consideração do estado da técnica mencionado acima, e um objectivo da invenção é proporcionar uma nova colectina que se espera que apresente actividades fisiológicas, tais como actividades antibacterianas, antivirais, especialmente no corpo humano.

De acordo com o exposto, a presente invenção proporciona um novo gene e proteína da colectina possuindo estruturas características das colectinas, que são distintas daquelas descritas até agora, como se segue: [1] Um polinucleótido consistindo de uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°: 2, 206-547; [2] Um polinucleótido consistindo de uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°: 2, 229-547; 3 [3] Um polinucleótido consistindo de uma sequência de nucleótidos apresentada em SEQ ID N°: 1, 670-1695; [4] Um polinucleótido consistindo de uma sequência de nucleótidos apresentada em SEQ ID N°: 1, 739-1695; [5] Um polinucleótido codificando uma proteína colectina, em que o referido polinucleótido pode hibridar sob uma condição restringente com uma sonda que é um produto de amplificação da reacção PCR conduzida utilizando iniciadores que têm as sequências de nucleótidos apresentadas em SEQ ID N°: 4 e SEQ ID N°: 5; [6] Um polinucleótido que pode hibridar sob uma condição restringente com qualquer um dos polinucleótidos descritos em [1] a [5], em que a proteína codificada pelo referido polinucleótido é uma colectina humana compreendendo (1) o domínio de reconhecimento de hidratos de carbono dependente de Ca2+ (CRD), e (2) a região de tipo colagénio; [7] Uma nova colectina codificada pelo polinucleótido de [3] a [6]; [8] Uma nova colectina compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°: 2, 206-547; [9] Uma nova colectina compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°: 2, 229-547;

Outras colectinas podem consistir das sequências de aminoácidos de [7] a [9], que compreendem delecção, substituição e/ou adição de um ou mais aminoácidos, e em que a sua sequência de aminoácidos compreende aquelas correspondentes ao (1) domínio 4 de reconhecimento de hidratos de carbono dependente de Ca2+ (CRD) , e (2) à região de tipo colagénio.

[Descrição Breve das Figuras] A Figura 1 é um desenho esquemático mostrando estruturas básicas e vistas gerais das principais colectinas descritas até agora; A Figura 2 mostra o alinhamento da primeira metade das sequências de aminoácidoss de três colectinas descritas até agora; A Figura 3 mostra o alinhamento da segunda metade das sequências de aminoácidos na Figura 2; A Figura 4 mostra cada um dos iniciadores utilizados para sequenciação da nova colectina da presente invenção, e as sequências de nucleótidos que foram recolhidas do sequenciador (b); e uma ORF da nova colectina obtida (a); A Figura 5 mostra o alinhamento da primeira metade das sequências de aminoácidoss das três colectinas descritas até agora e da nova colectina da presente invenção; A Figura 6 mostra o alinhamento da segunda metade das sequências de aminoácidoss na Figura 5; A Figura 7 mostra resultados da análise genómica de Southern com a nova colectina da presente invenção, e as enzimas de restrição utilizadas em cada uma das pistas são (1) EcoRI, (2) Xbal, (3) HindIII, (4) PstI, (5) BglII e (6) BamHI; 5 A Figura 8 mostra resultados da análise de distribuição da expressão de ARNm em: (1) cérebro, (2) coração, (3) rim, (4) baço, (5) figado, (6) intestino delgado, (7) tecido muscular, (8) testículos, (9) placenta ou (10) intestino grosso, demonstrando a distribuição tecidular da nova colectina da presente invenção; A Figura 9 mostra resultados da análise genómica de Southern de vários vertebrados, i. e., (1) ser humano, (2) macaco, (3) rato, (4) murganho, (5) cão, (6) vaca, (7) coelho e (8) galinha para elucidar a conservação inter-espécies da nova colectina da presente invenção; A Figura 10 mostra uma árvore filogenética de várias colectinas; e A Figura 11 são desenhos esquemáticos ilustrando um vector que expressa a nova colectina da presente invenção.

[Melhor Forma para Realização da Invenção]

Na forma de realização preferida da presente invenção, o polinucleótido acima mencionado em qualquer de [1] a [6] da presente invenção pode ser, de um modo preferido, ADNc. O polinucleótido no [2] acima, consistindo de uma sequência de nucleótidos codificando uma proteína que tem, pelo menos, uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°: 2, 229-547, contudo, uma sequência de nucleótidos adicional, tal como aquelas codificando uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos, tal como 226-228 ou 211-228 de SEQ ID N°: 2, ou 102-228, 91-228, 9-228, 1-228 de SEQ ID N° : 2, pode estar contida a montante do primeiro resíduo de metionina. 6

Além disso, o polinucleótido apresentado no [4] acima, pode consistir adicionalmente de uma sequência de nucleótidos de 730-738 ou 685-738, ou 358-738, 325-738, 79-738, 55-738 ou 1-738 em SEQ ID N°: 1, a montante 5' da mesma.

Adicionalmente, o polinucleótido no [3] ou [4] acima, pode consistir de uma sequência de nucleótidos de 1696-204 em SEQ ID N°:l, a jusante 3' da mesma.

Além disso, a proteína [7] a [10] da presente invenção, mencionada acima, pode ser derivada, de um modo preferido, de humano, tomando em consideração da utilidade como materiais clínicos fisiologicamente activos, porque se espera que apresentem actividades antibacterianas, antivirais e semelhantes no corpo humano. De acordo com o exposto, a presente invenção contempla uma nova colectina derivada de humano, e foi sugerida a expressão de uma nova colectina após examinação de vários tecidos humanos, que se pensa que seja útil.

Além disso, a nova colectina do [9] acima, pode consistir, de um modo preferido, de, pelo menos, uma sequência de aminoácidos de 229-547 em SEQ ID N°: 2, e uma sequência de aminoácidos, por exemplo, 226-228 ou 211-228 em SEQ ID N°: 2, ou 102-228, 91-228, 9-228, 1-228 em SEQ ID N° : 2 ou semelhante, pode ser incluída adicionalmente a montante do primeiro resíduo de metionina.

A condição restringente de hibridação nas invenções do [5] e [6] acima, pode incluir por exemplo, uma série dos seguintes passos para a hibridação: pré-hibridação numa solução de 5 x SSC (preparada por diluição de 20 x SSC (3 M de NaCl, 0,3 M de citrato de sódio)), 1% de agente de bloqueamento (Boehringer Mannheim) , 0,1% de N-lauroilsarcosina, e 0,02% de SDS, a 68 °C 7 durante uma hora; hibridação numa solução de 5 x SSC, 1% de agente de bloqueamento, 0,1% de N-lauroilsarcosina e 0,02% de SDS contendo sondas de ADNc (10 ng/mL), a 55 °C durante 16 horas; lavagem numa solução de 2 x SSC/0,1% de SDS durante 5 minutos, 2 vezes; e lavagem numa solução de 0,5 x SSC/0,1% de SDS a 55 °C durante 15 minutos, 2 vezes. Contudo, podem ser realizadas diversas modificações/alterações destas condições, tais como a concentração da solução, temperatura e tempo de incubação com base no conhecimento da técnica especializada.

Além disso, pode ser realizada delecção, substituição e/ou adição de um ou mais aminoácidos no [10] acima. Os exemplos são aqueles que não resultam em grandes alterações da natureza hidrófila/hidrófoba, ou acidica/básica dos residuos de aminoácidos da nova colectina, sem trazer muita alteração de cada uma das propriedades do (1) domínio de reconhecimento de hidratos de carbono dependente de Ca2+ (CRD) e (2) da região de tipo colagénio. Com base nas sequências de aminoácidos e nas estruturas das proteínas pertencentes à família das colectinas até agora descritas, por exemplo, pode ser permitida delecção, substituição e/ou adição de 1-10 resíduos de aminoácidos no (1) domínio de reconhecimento de hidratos de carbono dependente de Ca2+ (CRD), e 1-100, de um modo preferido, 1-15 resíduos de aminoácidos da (2) região de tipo colagénio. A presente invenção também proporciona um vector, que compreende o polinucleótido descrito acima, de um modo que permita a expressão da nova colectina. O vector em que o polinucleótido é introduzido pode ser referido como um replicão, tal como plasmídeo, fago λ, cosmídeo e semelhantes, estando o novo polinucleótido de colectina, descrito acima, aí incorporado de modo que a nova colectina possa ser replicada e expressa. Por exemplo, os vectores capazes de clonar fragmentos de ADNc mais longos do que o cosmídeo podem incluir o fago Pl, factor F e o cromossoma artificial YAC de levedura e semelhantes. Além disso, o fago λ pode incluir vector de substituição e vector de inserção, e estes podem ser seleccionados ad libitum tomando em consideração o comprimento do gene a ser introduzido. Além disso, os vectores conhecidos capazes de serem expressos em células animais incluem, por exemplo, vectores de SV40, vector do virus do papiloma bovino, vector do virus do herpes, vector de adenovirus, vector de poxvirus, vector de retrovirus e semelhantes. Os vectores comercialmente disponíveis podem incluir pUC19, pTV118N (Takara Shuzo Co., Ltd.), pUEX2 (Amersham), pGEX-4T, pKK233-2 (Pharmacia), pMAM-neo (Clontech), pGL2 (Promega), pDNA3.1+ (Invitrogen) e semelhantes. Um método de construção desses vectores pode ser realizado utilizando enzimas de restrição, ligase e semelhantes através do método convencional, sem nenhuma limitação particular.

No caso em que são utilizadas bactérias, em particular E. coli, como uma célula hospedeira que é transformada ou transfectada com o vector descrito acima, o vector pode habitualmente compreender, pelo menos, uma região promotora (contendo promotor, operador e sequência de Shine-Dalgarno), codão de iniciação, uma sequência de nucleótidos codificando a nova colectina, codão de terminação, região terminal e semelhantes. No caso em que são utilizadas leveduras ou células animais como um hospedeiro, é preferível que o vector inclua, pelo menos, promotor, codão de iniciação, sequências de nucleótidos codificando um péptido de sinal e a nova colectina, e codão de terminação. Além disso, pode também ser introduzido no vector uma sequência intensificadora, região 5' e 3' não traduzida da nova colectina, junção de splicing, sítio de poliadenilação e marcador de selecção. 9

Como um promotor incorporado num vector da presente invenção, podem ser utilizados convencionalmente os promotores bem conhecidos de SV40 (Virus Simio 40), SRa, promotor de citomegalovírus (CMV), promotor da actina, LTR (Repetições Terminais Longas) virais, por exemplo, RTL de HTLV-1, HIV-RTL, RTL do virus do sarcoma de Rous, promotor da tirosina cinase do virus herpes simplex e semelhantes, independentemente de ser um promotor forte ou um promotor fraco.

No caso em que é esperada expressão em células eucarioticas de muitos tipos celulares que variam desde células normais, tais como fibroblasto, célula nervosa, célula sanguínea, célula de parênquima e semelhantes, até células cancerígenas, o promotor geralmente utilizado pode incluir o promotor génico precoce de citomegalovírus, timidina cinase (TK), β-actina e SV40, e semelhantes. Uma vez que é geralmente combinado um intensificador com uma sequência promotora, pode ser utilizado como está.

Além disso, no caso em que foram especificadas as células e tecidos em que o gene é introduzido e expresso, pode ser seleccionado um promotor específico para a célula. Além disso, por combinação destes promotores de uma forma homóloga ou heteróloga, pode ser esperada expressão elevada, e pode ser exercido um efeito de modo que a nova colectina seja obtida estavelmente.

Por outro lado, pode ser incluído um promotor utilizado em células procarioticas, PBAD, PL, trc, T7, SP6, T3, lac e semelhantes.

Em princípio, um promotor que possa resultar em expressão elevada da nova colectina nas células de células procarioticas, pode ser seleccionado apropriadamente e utilizado como um 10 promotor da presente invenção, desde que o promotor seja compatível com o hospedeiro. Além disso, no caso em que foram especificadas as células e tecidos em que o gene é introduzido e expresso, pode ser seleccionado um promotor especifico para a célula. Além disso, por combinação destes promotores de uma forma homóloga ou heteróloga, pode ser esperada expressão elevada, e pode ser exercido um efeito de modo que a nova colectina seja obtida estavelmente.

Por outro lado, o promotor utilizado em levedura pode incluir GAL1, A0X1, CUP1, PGK e semelhantes.

Um marcador de selecção incorporado no vector descrito acima para recuperar apenas os vectores pretendidos, pode incluir o gene da di-hidrofolato reductase (aqui apresentado adiante, abreviado como DHFR), gene resistente a metotrexato, gene neo (gene resistente a G418) e semelhantes, e por exemplo, no caso em que o gene da DHFR é utilizado como um marcador de selecção utilizando células de CHO, das quais o gene de DHFR foi removido, a selecção pode ser também realizada através de um meio sem timidina. Além disso, quando o gene é expresso na célula por cultivo no meio a uma concentração mais elevada de metotrexato e seleccionando células resistentes, também pode ser obtida a estirpe celular com expressão mais elevada. A presente invenção também contempla uma célula hospedeira transformada ou transfectada com o vector assim construído, que pode expressar a nova colectina da presente invenção, por exemplo, em células animais, células de insecto e células de microrganismos (E. coli, Bacillus subtilis, levedura, e semelhantes).

As células animais utilizadas como a célula hospedeira da presente invenção podem incluir células derivadas de humanos, 11 mas não estão limitadas a essas. Por exemplo, pode ser incluída célula CHO, célula COS, célula BHK, célula Vero, célula de mieloma, célula HEK 293, célula HeLa, célula Jurkat, célula L de murganho, célula C127 de murganho, célula FM3A de murganho, fibroblasto de murganho, osteoblasto, célula de cartilagem e semelhantes. Além disso, como a célula de microrganismo, por exemplo, bactérias, tais como E. coli, Bacillus subtilis e semelhantes, e leveduras, tais como Saccharomyces cerevisiae, levedura da cerveja e semelhantes.

Além disso, de acordo com a presente invenção, é proporcionada uma sonda para rastrear uma nova espécie molecular relacionada com a colectina, incluindo o polinucleótido acima. Alternativamente, podem ser utilizados fragmentos. A nova espécie molecular relacionada com a colectina significa uma espécie molecular de uma nova colectina possuindo uma estrutura caracteristica como mostrada na FIG. 1, sem estar incluída nas colectinas conhecidas mostradas na FIG. 10. Utilizando uma sonda da presente invenção, uma nova espécie molecular relacionada com a colectina desejada pode ser adquirida por examinação de uma capacidade de hibridação entre a sonda e um gene obtido de células de tecido e semelhantes, de uma variedade de organismos, rastreando um gene codificando a nova espécie molecular relacionada com a colectina desejada por procura de um gene que possa hibridar com a sonda sob uma condição relativamente restringente. Os exemplos de fragmentos do polipéptido, aqueles compreendendo uma sequência de nucleótidos de, pelo menos, uma porção de 10 bases ou mais, de um modo preferido uma porção de 20 bases ou mais de uma sequência de 1291-1698 em SEQ ID N°: 1 que compreende uma região estrutural do domínio de reconhecimento de hidratos de carbono, ou aqueles compreendendo uma sequência de nucleótidos, pelo menos, de uma porção de 10 bases ou mais, de um modo preferido de uma porção de 20 bases ou mais de uma sequência de 796-1236 em SEQ ID N°: 1 que 12 compreende uma região de tipo colagénio, podem ser úteis como um polinucleótido para constituir a sonda em termos da sua especificidade.

Também pode ser produzido um anticorpo que reconhece uma nova colectina e/ou moléculas derivadas obtidas de acordo com a presente invenção. Como aqui referido, o termo "moléculas derivadas" pode incluir fragmentos que têm caracteristicas semelhantes com a nova colectina (por exemplo, fragmentos contendo o dominio de reconhecimento de hidratos de carbono e/ou a região de tipo colagénio), precursores da nova colectina, e polipéptidos compreendendo sequências de aminoácidos codificadas pelo ácido nucleico que pode hibridar sob a condição restringente com essa sequência de nucleótidos codificando os fragmentos, precursores e/ou sequência de ácida nucleico complementar.

Um anticorpo (por exemplo, anticorpo policlonal, anticorpo monoclonal e anticorpo peptidico) ou anti-soro para a nova colectina e/ou moléculas derivadas pode ser produzido utilizando a presente nova colectina e/ou moléculas derivadas, ou proteína de fusão contendo as mesmas, e semelhantes, como um antigénio de acordo com método conhecido para produzir o anticorpo ou anti-soro. Nomeadamente, a presente nova colectina e/ou moléculas derivadas, ou proteína da fusão contendo as mesmas, pode ser administrada como um antigénio isoladamente ou em combinação com um diluente ou veículo ao sítio em que a produção do anticorpo é permitida por administração aos animais de sangue quente. Na administração, pode ser administrado adjuvante de Freund completo ou adjuvante de Freund incompleto de modo a elevar a produção do anticorpo. A administração pode ser geralmente realizada uma vez por cada 1-6 semanas, num total de 2-10 vezes. Os animais de sangue quente utilizados podem incluir, por exemplo, macaco, coelho, cão, porquinho-da-índia, murganho, 13 rato, ovelha, cabra, galinha e semelhantes, e são preferidos o murganho e o rato. Entre ratos, são preferíveis ratos de estirpe Wistar e SD e semelhantes, e entre murganhos, são utilizados, de um modo preferido, estirpes de murganho BALB/c, C57BL/6 e ICR e semelhantes.

Quando são preparadas as células produtoras de anticorpo monoclonal, um indivíduo gue é encontrado com título de anticorpo é seleccionado do animal de sangue guente, e. g., murganho, depois o baço ou nódulo linfático é recuperado em 2-5 dias após a imunização final, seguido por fusão de células de mieloma e as células produtoras de anticorpo aí contidas para dar o hibridoma produtor de anticorpo monoclonal. A medição do título do anticorpo no anti-soro pode ser realizada através, por exemplo, da reacção do anti-soro com uma nova colectina marcada, descrita abaixo, ou a nova colectina, e posteriormente a determinação da actividade do agente marcador acoplado ao anticorpo. Uma operação para fusão pode ser realizada de acordo com os métodos conhecidos, por exemplo, o método de Kohler e Milstein (Nature, 256: 495, 1975) e um método modificado do mesmo (J. Immunol. Method. 39: 285, 1980; Eur. J. Biochem., 118: 437, 1981; Nature, 285: 446, 1980). Como agentes para promover a fusão, pode ser utilizado polietilenoglicol (PEG), vírus Sendai e semelhantes, de um modo preferido, PEG. De modo a aumentar adicionalmente a eficiência da fusão, podem ser adicionada ad libitum lectina, poli-L-lisina ou DMSO.

As células de mieloma podem incluir, por exemplo, células X-63Ag8, NS-1, P3U1, SP2/0, AP-1 e semelhantes, contudo, podem ser utilizadas, de um modo preferido, as células SP2/0. A proporção adequada entre o número de células produtoras de anticorpo (esplenócito) e o número de células de mieloma, que são utilizadas, pode ser 1:20-20:1, e a fusão celular pode ser 14 realizada eficientemente adicionando PEG (de um modo preferido PEG 1000-PEG 6000) a uma concentração de aproximadamente 10-80%, e incubando durante 1-10 minutos a 20-40 °C, de um modo preferido a 30-37 °C. Embora possa ser utilizada uma variedade de métodos para rastreio de um hibridoma produzindo o anticorpo para a nova colectina e/ou moléculas derivadas, por exemplo: um método em que o sobrenadante da cultura do hibridoma é adicionado a uma fase sólida (por exemplo, microplaca) onde o antigénio da nova colectina é absorvido directamente ou conjuntamente com um veiculo, depois é ai adicionado um anticorpo anti-imunoglobulina marcado por uma substância radioactiva, enzima ou semelhante, ou proteina A, e é detectado o anticorpo anti-nova colectina acoplado à fase sólida; pode ser adoptado um método em que o sobrenadante da cultura do hibridoma é adicionado à fase sólida onde o anticorpo da anti-imunoglobulina ou proteina A é absorvida, seguida por adição da nova colectina marcada com uma substância radioactiva, enzima ou semelhante, e detecção do anticorpo monoclonal anti-nova colectina acoplado à fase sólida; e semelhantes. A selecção e clonagem do anticorpo monoclonal para a nova colectina e/ou moléculas derivadas pode ser realizada de acordo com um método conhecido na técnica ou um método em conformidade com esta. Em geral, pode ser realizada num meio selectivo para utilização em células animais às quais é adicionado HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina). Como meio para selecção, clonagem e crescimento, pode ser utilizado qualquer meio desde que o hibridoma possa ai crescer. Por exemplo, pode ser utilizado meio RPMI contendo 1-20%, de um modo preferido, 10-20% de soro fetal de bovino, meio GIT contendo 1-10% de soro fetal de bovino, um meio sem soro para utilização em cultura de hibridoma ou semelhante. A temperatura para a cultura pode ser, de um modo preferido, cerca de 37 °C. O periodo de tempo da cultura é geralmente, desde 5 dias até 3 semanas, de um modo 15 preferido, desde 1 semana até 2 semanas. A cultura é geralmente realizada sob a presença de ar contendo 5% de dióxido de carbono gasoso. 0 titulo do anticorpo do sobrenadante da cultura do hibridoma pode ser medido de um modo semelhante ao processo de medição, descrito acima, do titulo do anticorpo anti-nova colectina no anti-soro. Especificamente, como método para a medição, pode ser utilizado o método do radioimunoensaio (RIA), método do ensaio de imunoabsorção ligado à enzima (ELISA), método do imunoensaio de fluorescência (FIA), método do ensaio de placa, método da reacção de coagulação e semelhantes, contudo, pode ser preferível o seguinte método de ELISA descrito abaixo.

Uma proteina preparada por um processo semelhante como no caso para o antigénio imune é imobilizada na superfície de cada poço da placa de ELISA. Em seguida, com a finalidade de prevenir a absorção não especifica, é imobilizada albumina de soro de bovino (BSA), albumina de soro de murganho (MSA), ovoalbumina (OVA), gelatina, leite magro ou semelhante. 0 sobrenadante da cultura do hibridoma é adicionado a estes poços respectivos, deixados a repousar durante um determinado periodo de tempo para efectuar a imunoreacção. Cada um dos poços é lavado utilizando solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou semelhante, como uma solução de lavagem. É preferível adicionar um agente tensioactivo à solução de lavagem. É adicionado um anticorpo secundário marcado com enzima e deixado a repousar durante um determinado período de tempo. Como enzima marcadora, pode ser utilizada a β-galactosidase, fosfatase alcalina, peroxidase e semelhantes. Após cada poço ser lavado com a mesma solução de lavagem, é adicionada uma solução de substrato para a enzima de marcação utilizada, e é efectuada a reacção enzimática. No caso em que o anticorpo pretendido existe no sobrenadante da cultura do hibridoma, a reacção enzimática é prosseguida, e a cor da solução de substrato é alterada. 16 A clonagem pode ser realizada geralmente por um método de agar semi-sólido, um método de cultura de diluição limite e semelhantes que são conhecidos na técnica, resumidamente, após serem determinados os poços onde o anticorpo pretendido é produzido, a clonagem é realizada para obter um clone isolado. Como método de clonagem, pode ser utilizado o método de cultura de diluição limite em que as células do hibridoma são diluídas e cultivadas, formando assim uma colónia por poço da placa de cultura. Para clonagem através do método de cultura de diluição limite, podem ser utilizadas células alimentadoras, ou pode ser adicionado factor de crescimento celular, tal como interleucina 6, a fim de aumentar a capacidade de formação de colónia. Alternativamente, a clonagem pode ser realizada utilizando FACS (citometria de fluxo activada por fluorescência) e um método de manipulação de célula isolada. 0 hibridoma clonado pode ser cultivado, de um modo preferido, num meio sem soro, e é adicionada a quantidade óptima de anticorpo ao sobrenadante. Um único hibridoma isolado assim obtido pode ser cultivado a grande escala utilizando balões ou um equipamento de cultura celular, ou caso contrário, é realizada cultura intraperitoneal num animal (J. Immunol. Meth., 53: 313, 1982), para permitir a obtenção do anticorpo monoclonal. A cultura das células num balão pode ser conduzida utilizando meio para cultura celular (IMDM, DMEM, RPMI 1640, MEM e semelhantes) contendo 0-20% de soro fetal de vitelo (FCS). Quando é realizada cultura intraperitoneal num animal, o animal da mesma espécie, da mesma estirpe do animal do qual é derivada a célula de mieloma utilizada para a fusão celular, pode ser utilizado, de um modo preferido, murganho nude atímico ou semelhante, e o hibridoma é transplantado após a administração prévia de óleos minerais, tais como pristano e semelhantes. Após 1-2 semanas, as células de mieloma cresceram peritonealmente, e pode ser recuperado o líquido ascítico contendo o anticorpo monoclonal. 17

Um anticorpo monoclonal pode ser obtido, como aquele que não apresentou reacção cruzada com as outras proteínas, por selecção daquele que reconhece um epitopo especifico para a nova colectina e/ou moléculas derivadas. Em geral, um epitopo apresentado por, pelo menos, três ou mais residuos de aminoácidos em série, desejavelmente uma sequência de aminoácidos de 7-20 aminoácidos da sequência de aminoácidos constituinte de uma proteína, é descrita como mostrando um epitopo que é inerente à proteína. Deste modo, um anticorpo monoclonal que reconhece um epitopo constituído a partir dos péptidos seleccionados das sequências de aminoácidos apresentadas em qualquer uma da nova colectina e/ou moléculas derivadas, e têm sequências de aminoácidos que consistem de, pelo menos, três residuos de aminoácidos em série, pode ser referido como um anticorpo monoclonal específico para uma nova colectina e/ou moléculas derivadas da presente invenção. Quando é seleccionada uma sequência de aminoácidos conservada entre as sequências de aminoácidos apresentadas na nova colectina e/ou moléculas derivadas, pode ser seleccionado um epitopo comum para a família da nova colectina. Alternativamente, quando é seleccionada uma região contendo uma sequência de aminoácidos específica para a sequência respectiva, pode ser seleccionado um anticorpo monoclonal capaz de distinguir as proteínas respectivas. O isolamento e purificação de um anticorpo monoclonal para as novas colectinas e/ou moléculas derivadas pode ser realizado de acordo com o método de isolamento e purificação de imunoglobulinas, similarmente aos casos dos anticorpos policlonais gerais. Como métodos de purificação conhecidos, por exemplo, pode ser realizado o método de salting-out, método de precipitação com álcool, método de precipitação de ponto isoeléctrico, método de electroforese, método de precipitação 18 com sulfato de amónio, método de absorção-desabsorção através de permutador iónico (e. g., Sepharose (dietilaminoetil) DEAE e semelhantes) , método de ultracentrifugação, método de filtração em gel, um processo de purificação especifico por recolha apenas de um anticorpo com absorvente activo, tal como fase sólida de ligação a antigénio, proteína A, proteína G ou semelhante, e dissociando a ligação para obter o anticorpo. Com a finalidade de prevenir a formação de agregados e a redução do título do anticorpo durante o processo de purificação, por exemplo, é adicionada albumina de soro humano a uma concentração de 0,05-2%. Adicionalmente, podem ser adicionados aminoácidos, tais como glicina, α-alanina e semelhantes, particularmente, aminoácidos básicos, tais como lisina, arginina, histidina e semelhantes, açúcares, tais como glucose, manitol e semelhantes, ou sais, tais como cloreto de sódio e semelhantes. O anticorpo IgM é conhecido por ser especialmente susceptível a agregar, deste modo, o tratamento podem ser conduzido com β-propionolactona e anidrido acético.

Um anticorpo policlonal pode ser produzido de acordo com os métodos conhecidos na técnica ou métodos em conformidade com esta. Por exemplo, o próprio antigénio imune (antigénio proteico), ou um complexo preparado do mesmo com uma proteína veículo, pode ser utilizado para imunizar um animal de sangue quente similarmente ao método, descrito acima, de produção de um anticorpo monoclonal, e de acordo com o exposto, o anticorpo monoclonal pode ser produzido através da recolha de um material que contém um anticorpo para uma proteína, ou seus fragmentos da presente invenção, a partir do animal imunizado, e através de isolamento e purificação do anticorpo. Relativamente ao complexo do antigénio imune e da proteína veículo utilizados para imunização do animal de sangue quente, quanto ao tipo de proteína veículo assim como à proporção de mistura do veículo e hapteno, qualquer tipo de proteína veículo pode ser reticulado 19 em qualquer proporção de mistura do veiculo e hapteno desde que o anticorpo possa ser produzido eficientemente para o hapteno reticulado e imunizado com o veiculo. Contudo, pode ser utilizado um método em que albumina de soro de bovino, tiroglobulina de bovino, hemocianina ou semelhante é acoplada com hapteno a uma proporção, em peso, de cerca de 0,1-20, de um modo preferido, cerca de 1-5 por hapteno 1. Além disso, pode ser utilizada uma variedade de agentes de condensação para o acoplamento do hapteno e veiculo, contudo, pode ser utilizado glutaraldeido ou carbodiimida, ésteres activos de maleimida, reagentes de éster activo contendo o grupo tiol ou grupo ditiopiridilo e semelhantes. O próprio produto de condensação pode ser administrado isoladamente ou em combinação com um veiculo ou diluente, a um animal de sangue quente. Na administração, pode ser administrado adjuvante de Freund completo ou adjuvante de Freund incompleto de modo a elevar a capacidade de produção de anticorpo. A administração pode ser geralmente realizada uma vez cada 2-6 semanas, no total de cerca de 3-10 vezes. Um anticorpo policlonal pode ser recolhido do sangue, liquido ascitico e semelhantes, de um modo preferido, do sangue do animal de sangue quente que foi imunizado através do método descrito acima. A medição do titulo do anticorpo policlonal no anti-soro pode ser realizada similarmente à medição do titulo do anticorpo do soro descrito acima. O isolamento e purificação do anticorpo policlonal pode ser realizado de acordo com o isolamento e método de purificação de imunoglobulinas, similarmente ao método de isolamento e purificação, descrito acima, de um anticorpo monoclonal.

Além disso, pode ser produzido um anticorpo por utilização de uma proteína de fusão compreendendo a nova colectina e/ou moléculas derivadas e outra proteína ou um fragmento de polipéptido como um imunogénio. Como outra proteína ou o polipéptido que constitui essa proteína de fusão, pode ser 20 particularmente adequada GST (glutationo-S-transferase), contudo, pode ser utilizada poli-histidina (de um modo preferido 6 residuos de histidina), péptido de ligação à calmodulina (CBP), proteina A e semelhantes.

Quando é utilizada poli-histidina, pode ser utilizada absorção a resina quelante de níquel para isolamento e purificação da proteína de fusão expressa por um processo de recombinação génica, em que adição da substância EDTA ou imidazole assim como mudança de pH pode ser adoptada para dissociação da proteína a partir da resina. Quando é utilizada CBP, a proteína de fusão expressa pode ser submetida a uma cromatografia de afinidade utilizando resina de afinidade para a calmodulina, e depois pode ser dissociada a partir da resina por adição de EGTA. Além disso, quando é utilizada proteína A, a proteína de fusão expressa pode ser submetida a uma cromatografia de afinidade utilizando sepharose de IgG (e. g., IgG Sepharose 6FF), e posteriormente pode ser dissociada a partir da resina por mudança de pH.

Além disso, outro candidato para a proteína ou o fragmento do polipéptido a ser utilizado na proteína de fusão pode incluir, por exemplo, Xpress, Tioredoxina, c-myc, V5, HA/c-myc e semelhantes, e depois de ser expressa a proteína de fusão pretendida com a nova colectina, esta pode ser isolada e purificada por uma coluna de afinidade antigénio-anticorpo utilizando um anticorpo capaz de reconhecer essa outra proteína como um epitopo.

No caso em que é obtido um anticorpo monoclonal utilizando essa proteína de fusão como um imunogénio, a nova colectina pode ser utilizada para rastrear o anticorpo, contudo, o rastreio pode ser realizado, de um modo preferido, com a proteína de fusão utilizada como um imunogénio em termos da selectividade. 21 0 imunogénio preferível mencionado acima, nomeadamente uma proteína de fusão compreendendo GST e uma nova colectina e/ou moléculas derivadas, pode ser produzido apropriadamente através de: cultivo de Escherichia coli ou células animais transformadas ou transfectadas com um vector de expressão compreendendo uma região codificante do gene da GST e uma região codificante de uma nova colectina e/ou moléculas derivadas; e depois isolando a proteína de fusão a partir do líquido e/ou células de cultura. A proteína de fusão assim obtida pode ser, de um modo preferido, ainda purificada com base na afinidade a um suporte contendo glutationo, e. g., esferas de sepharose de glutationo, e um método de eluição da proteína de fusão a partir das esferas de sepharose do glutationo pode ser realizado através do método conhecido. De acordo com o exposto, pode ser obtida a proteína de fusão purificada que é preferível como um imunogénio pretendido.

Num método de preparação de um anticorpo monoclonal utilizando uma tal proteína de fusão como um imunogénio, pode ser utilizada uma nova colectina e/ou moléculas derivadas para rastrear o anticorpo, contudo, é mais preferível realizar o rastreio utilizando a proteína de fusão como um imunogénio em termos da especificidade. 0 anticorpo monoclonal e o anticorpo policlonal para a nova colectina e/ou moléculas derivadas podem ser utilizados para diagnóstico e tratamento de doenças relacionadas com a nova colectina. Deve ser notado que no caso em que o anticorpo é contemplado para administração particularmente a um corpo humano, pode ser utilizado, de um modo preferido tanto quanto possível, o anticorpo, tal como o anticorpo humanizado ou anticorpo quimérico, não possuindo nenhuma imunogenicidade para o ser humano ou ter imunogenicidade comprometida. Quando é 22 administrado um anticorpo monoclonal de murganho num corpo humano, podem existir diversos riscos de modo que podem ocorrer uma variedade de efeitos colaterais, porque é uma proteina heteróloga ao ser humano. Por este motivo, seria desejável anticorpo monoclonal humano, contudo, a eficiência de fusão foi fraca, e foi dificil obter um hibridoma que produzisse estavelmente o anticorpo. Contudo, as tecnologias foram até agora progredindo, assim, foi possivel no presente a produção de anticorpos monoclonais humanos ou anticorpos quiméricos. 0 termo "anticorpo quimérico" é referido como uma molécula quimérica de um anticorpo de murganho e de um anticorpo humano. É eticamente impossível produzir um anticorpo por imunização de um dado antigénio a um corpo humano. Deste modo, um murganho é imunizado, depois uma região variável (região V) de um anticorpo que pode ligar a um antigénio é removida por corte a partir de um gene do anticorpo monoclonal de murganho, e é preparado um gene quimérico através de acoplamento do mesmo a uma região constante (região C) de um gene de anticorpo derivado de células de mieloma humano. Quando este gene quimérico é expresso numa célula hospedeira, pode ser produzido um anticorpo monoclonal de humano/murganho. Uma vez que um anticorpo quimérico tem uma baixa antigenicidade ao ser humano, pode ser utilizado como um anticorpo monoclonal para ser administrado num corpo humano para tratamento, para imagiologia diagnóstica e semelhantes. Relativamente a tecnologias relacionadas conhecidas de anticorpos quiméricos, ver, Publicação da Patente Japonesa Não Examinada N°. H05-304989 (1993), Publicação da Patente Japonesa Não Examinada N°. H04-330295 (1992), WO9106649, Publicação da Patente Japonesa Não Examinada N°. S63-036786 (1988), e Publicação da Patente Japonesa N°. H06-98021 (1994) e semelhantes. 23

Contudo, foi recentemente desenvolvido um anticorpo humanizado que é descrito como sendo mais útil do que um anticorpo quimérico. 0 termo "anticorpo humanizado" é um anticorpo que é produzido através de enxertia apenas de uma sequência qénica de um sitio de liqação a antiqénio (CDR: região determinante da complementaridade) de uma molécula de anticorpo para um gene de anticorpo humano (enxerto de CDR), assim, a molécula inteira é humanizada excepto a CDR da molécula de anticorpo. Uma vez que este anticorpo tem menos porções de anticorpo de murganho do que o anticorpo quimérico humano/murganho, crê-se que tem menos antigenicidade e é mais seguro. No Japão, foi actualmente praticado um ensaio clinico de anticorpo humanizado para a leucemia da célula T de adulto. Relativamente aos métodos de preparação de anticorpo humanizado e tecnologias relacionadas do mesmo, ver, Pedidos de Patente, tais como Genentech (EUA) (documentos W09222653, W09845332, W09404679, W09837200 e WO9404679) e Celltech (UK) (documentos W0942 9451, W09429351, WO9413805, WO9306231, W09201059, W09116927, W09116928, WO9109967, WO8901974 e WO8901783) e semelhantes.

Os métodos de produção de um anticorpo monoclonal humano podem incluir: uma método em que a transformação é efectuada com o vírus de Epstein-Barr (EBV), seguido por um método de fusão das células transformadas com as células parentais; um método de preparação de um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado por utilização de engenharia genética; e semelhantes, para além do método de fusão celular. 0 anticorpo quimérico significa um anticorpo preparado através de ligação de fragmentos génicos de imunoglobulina de animais heterólogos, e o anticorpo humanizado significa um anticorpo preparado através de modificação de um anticorpo de um anticorpo heterólogo para humano, tal como aquele de murganho e semelhantes, resultando em substituição da estrutura primária com a estrutura primária correspondente de 24 humano excepto para uma região determinante da complementaridade (CDR) da cadeia H e cadeia L. Como para as células parentais para utilização na preparação de anticorpo monoclonal humano, pode ser adequadamente utilizada a estirpe SHM-D 33 (ATCC CRL 1668) ou a estirpe RF-S1, de heteromieloma de humano/murganho, para conseguir uma elevada eficiência de fusão comparável àquela de células parentais de murganho. 0 hibridoma assim obtido utilizando estas células parentais pode ser submetido a clonagem sem células alimentadoras, e pode produzir um anticorpo de tipo IgG de um modo comparativamente estável numa grande quantidade. 0 meio ERDF ao qual é adicionado 15% de FCS pode ser utilizado para a cultura de células parentais, e outros processos podem ser similarmente realizados para aqueles de murganho. Além disso, de modo a produzir anticorpo monoclonal de tipo IgG humano, é preferível que seja recolhido linfócito humano suficientemente sensibilizado com um antigénio de sangue periférico para utilização.

Quando é dificil obter linfócito que é suficientemente sensibilizado com um antigénio, pode também ser realizada sensibilização do antigénio in vitro. Um anticorpo pode ser humanizado por utilização do método descrito acima e semelhantes, e de acordo com o exposto, o anticorpo é muito útil para administração a um corpo humano. É também possivel realizar um método para obtenção de uma nova espécie molecular relacionada com a colectina, ou nova colectina e/ou moléculas derivadas, compreendendo um passo de rastreio de uma proteina utilizando o anticorpo apresentado acima para obter a nova espécie molecular relacionada com a colectina, ou nova colectina e/ou moléculas derivadas. Neste método, é rastreada uma proteina possuindo imunoreactividade, utilizando o anticorpo descrito acima de modo a isolar e obter uma nova espécie molecular relacionada com a colectina, ou nova 25 colectina e/ou moléculas derivadas, que podem estar contidas numa variedade de fluidos corporais de organismos, células de tecido e semelhantes. No passo de rastreio, pode ser utilizado, de um modo preferido, o rastreio da expressão da biblioteca de ADNc.

Também podem ser realizados métodos de determinação quantitativa de uma nova colectina e/ou moléculas derivadas, compreendendo a medição de uma quantidade da nova colectina e/ou moléculas derivadas, contidas numa amostra de teste utilizando o anticorpo apresentado acima, com base na sua propriedade de ligação imunológica.

Neste método, de modo a medir uma quantidade da nova colectina e/ou moléculas derivadas, o anticorpo descrito acima pode ser utilizado em imunotransferência, imunoprecipitação, ELISA ou semelhante, e em particular, pode ser, de um modo preferido, convenientemente realizado o método de ELISA. Além disso, pode ser utilizado para determinar a quantidade de uma nova colectina e/ou moléculas derivadas, um método de sanduíche compreendendo um passo de detecção de um complexo de sanduíche produzido por reacção de uma nova colectina e/ou moléculas derivadas com um anticorpo e anticorpo marcado acoplado a, por exemplo, um suporte insolúvel, caso contrário, um método competitivo compreendendo passos de: fazer reagir competitivamente uma nova colectina marcada e/ou moléculas derivadas com uma nova colectina e/ou moléculas derivadas numa amostra de teste com um anticorpo; e a medição da nova colectina e/ou moléculas derivadas na amostra com base na quantidade do antigénio que reagiu com o anticorpo.

Após determinação de uma quantidade de uma nova colectina e/ou moléculas derivadas através do método de sanduíche, pode ser realizado um método de dois passos, em que é primeiro 26 permitida uma imunorreacção de um anticorpo imobilizado com uma nova colectina e/ou moléculas derivadas, depois as substâncias que não reagiram são completamente removidas por lavagem, seguida por adição de um anticorpo marcado; ou um método de um passo, em que um anticorpo imobilizado, um anticorpo marcado, e uma nova colectina e/ou umas moléculas derivadas são simultaneamente misturadas. 0 suporte insolúvel utilizado para essa determinação pode incluir, por exemplo, resina sintética, tal como poliestireno, polietileno, polipropileno, vinilo policlorado, poliéster, éster de poliacrilato, nylon, poliacetal, resina contendo flúor e semelhantes; polissacáridos, tais como celulose, agarose e semelhantes; vidro; e metal etc. 0 suporte insolúvel pode estar em diversas formas, por exemplo, de tipo placa, esférico, fibroso, cilíndrico, discai, de tipo recipiente, de tipo celular, tubular e semelhantes. 0 suporte com o anticorpo absorvido pode ser armazenado num lugar frio, na presença de um agente antisséptico, tal como azida de sódio.

Para a imobilização de um anticorpo, pode ser adoptado um método de ligação química ou um método de absorção física conhecido. 0 método de ligação química pode incluir, por exemplo, um método utilizando glutaraldeído, método de maleimida, em que pode ser utilizado N-succinimidil-4-(N- maleimidometil) ciclo-hexano-l-carboxilato, N-succinimidil-2- maleimidoacetato ou semelhante, método de carbodiimida, em que pode ser utilizado cloridrato de l-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida. Além disso, pode ser incluído o método de éster de maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida, método de ácido N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propiónico, método de benzidina bisdiazotizada, método de dipalmitilisina. Alternativamente, um complexo que foi previamente formado por uma reacção de um material detectado por teste com um anticorpo 27 cujo epitopo é de um tipo diferente, pode também ser capturado após o terceiro anticorpo do referido anticorpo ser imobilizado de acordo com o método, como mencionado acima. 0 material a ser utilizado para marcar o anticorpo pode ser enzimático, material fluorescente, material luminescente, material radioactivo, quelato de metal ou semelhante. Uma enzima pode incluir, por exemplo, peroxidase, fosfatase alcalina, β-D-galactosidase, malato desidrogenase, nuclease de estafilococo, delta-5-esteróide isomerase, a-glicerolfosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, peroxidase de rábano, asparaginase, glucose oxidase, ribonuclease, urease, catalase, glucose-6-fosfato desidrogenase, glucoamilase, acetilcolina esterase, e semelhantes; e o material fluorescente pode incluir, por exemplo, isotiocianato de fluoresceina, proteina ficobilina, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, aldeído ortoftálico e semelhantes; o material luminescente pode incluir isoluminol, lucigenina, luminol, éster de acridínio aromático, imidazole, sal de acridínio e seu éster modificado, luciferina, luciferase, aquorina e semelhantes; e o material radioactivo pode incluir 125I, 127I, 131I, 14C, 3H, 32P, 35S e semelhantes, mas não limitado a isto desde que o material possa ser utilizado em métodos de determinação imunológica. Além disso, podem ser conjugados ao anticorpo haptenos de baixo peso molecular tal como a biotina, dinitrofenilo, piridoxal ou fluorescamina. De um modo preferido, a peroxidase de rábano pode ser utilizada como uma enzima marcadora. Esta enzima pode reagir com muitos substratos, quando prontamente conjugada ao anticorpo através de um método de ácido periódico.

Quando é utilizada uma enzima como um material marcador, é utilizado um substrato para medir a sua actividade, e um agente de revelação da cor. Quando é utilizada peroxidase como uma enzima, pode ser utilizado H202 como uma solução de substrato, e 28 podem ser utilizados 2,2'-azino-di-[3-etilbenzotiazolin sulfonato] de amónio (ABTS) , ácido 5-aminosalicílico, ortofenilenodiamina, 4-aminoantipirina, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina ou semelhantes, como um agente de revelação da cor; quando é utilizada fosfatase alcalina como uma enzima, o substrato pode ser ortofenilfosfato, paranitrofenilfosfato ou semelhante; alternativamente, quando é utilizada β-D-galactosidase como uma enzima, o substrato pode ser fluoresceina-di-(β-D-galactopiranósido), 4-metil-umbeliferil-D-galactopiranósido, ou semelhante.

Como um agente de reticulação, pode ser utilizada N,N'-ortofenilenodimaleimida, éster de N-succinimida de 4-(N-maleimidometil) ciclo-hexanoilo, éster de N-succinimida de 6-maleimido-hexanoilo, 4,4'-ditiopiridina, ou outros agentes de reticulação conhecidos. A reacção de um tal agente de reticulação com a enzima e o anticorpo pode ser prosseguida de acordo com métodos conhecidos, dependendo das propriedades do agente de reticulação que for utilizado.

Adicionalmente, os anticorpos a serem utilizados podem ser quaisquer fragmentos dos anticorpos, por exemplo, Fab', Fab, F(ab')2 dependendo das condições. Além disso, os anticorpos enzimaticamente marcados podem ser preparados através de utilização de um processo semelhante como quaisquer anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais. Quando o anticorpo enzimaticamente marcado que foi obtido através da utilização do agente de reticulação mencionado acima é purificado através de quaisquer métodos conhecidos, pode ser conseguido um sistema de determinação imunológica mais sensível. O anticorpo enzimaticamente marcado que foi purificado desse modo pode ser misturado com um estabilizador, tal como timerosal, glicerol ou semelhante, alternativamente, pode ser liofilizado, e depois armazenado num lugar frio e escuro. 29

As amostras de teste para medição na determinação quantitativa acima não estão limitadas desde que sejam amostras contendo uma nova colectina e/ou moléculas derivadas, ou as amostras contendo um seu precursor, que pode incluir fluidos corporais, tais como plasma, soro, sangue, urina, liquido tecidular, liquido cefalorraquidiano e semelhantes.

Além disso, pode ser feito um kit para determinação quantitativa de uma nova colectina e/ou moléculas derivadas, compreendendo o anticorpo como mencionado acima, em que uma quantidade da nova colectina e/ou moléculas derivadas numa amostra de teste é medida por método de ELISA utilizando este anticorpo. 0 kit compreende adicionalmente os reagentes requeridos para a determinação quantitativa como descrita acima, para além do anticorpo.

Pode ser realizado um método para a produção de uma nova colectina e/ou moléculas derivadas, compreendendo um passo de isolamento de uma nova colectina e/ou moléculas derivadas utilizando o anticorpo como descrito acima. De modo a isolar a nova colectina e/ou moléculas derivadas em tal método, pode ser realizada cromatografia de afinidade e/ou imunoprecipitação através de um método em coluna, um método em lote ou semelhante que compreende os passos de: permissão de interacção especifica entre antigénio e anticorpo através de contacto de uma amostra com um suporte acoplado ao anticorpo descrito acima; lavagem do suporte; e eluição da proteína acoplada pretendida. A amostra neste método pode ser, por exemplo, aquela obtida através de preparação a partir de placenta, baço e semelhantes, derivados de ser humano, ou aquela preparada por expressão a partir de um polinucleótido codificando a nova colectina descrita acima da presente invenção, contudo, pode ser 30 utilizado, de um modo preferido, um produto de expressão uma vez que pode ser fornecido estavelmente como a amostra, e de acordo com o exposto, um método compreendendo um tal passo de expressão pode ser contemplado na presente invenção.

Além disso, um aspecto adicional contemplado pela presente invenção é um método para identificar a presença de uma nova colectina e/ou moléculas derivadas moléculas derivadas em tecidos, em que é conduzida examinação imuno-histológica utilizando o anticorpo descrito acima. A examinação imuno-histológica pode ser, por exemplo, técnicas tais como coloração imuno-histológica in situ utilizando um anticorpo marcado, em que pode ser detectada uma nova colectina e/ou moléculas derivadas.

Além disso, de acordo com a presente invenção, é proporcionado um animal transgénico não humano que é introduzido estavelmente com um gene recombinante compreendendo o polinucleótido descrito acima, de acordo com a presente invenção, no cromossoma, e que pode expressar uma nova colectina. Também pode ser produzido um animal transgénico não humano em que a introdução de um gene é efectuada num animal não humano, compreendendo um homólogo da nova colectina, de acordo com a presente invenção, de um modo para modificar (por exemplo, de forma que a expressão seja inibida, promovida ou expressa sob apenas condições limitadas predeterminadas) a expressão génica do homólogo. Neste animal não humano, o nivel de expressão do gene relevante pode ser modificado artificialmente para ser aumentado ou diminuído comparativamente ao nível de expressão do gene original através da indução de mutações, tais como delecção, substituição, adição e/ou inserção em parte de diversos sítios importantes (intensificador, promotor, intrão e semelhantes) que estão normalmente a regular a expressão génica. A introdução das mutações pode ser realizada através dos métodos 31 conhecidos, (e. g., Lesley, S.A. et al., Promega Notes Magazine, 46, 6-10, 1994; Kunkel, T.A. et al., Methods Enzymol., 154, 367-382, 1987; Sayers, J.R. et al., Biotechniques, 13, 592-596, 1992; Ito W., et al., Gene, 102, 67-70, 1991; Cormack, B., Current Protocols in Molecular Biology, 8.5.1-8.5.9, 1987). Neste método, o gene pode incluir ADNc, ADN genómico ou ADN sintético. Além disso, a expressão de um gene inclui ambos os passos de transcrição e tradução.

Os animais transgénicos não humanos como descritos acima podem ser úteis para o desenvolvimento de animais modelo de doença para estudos na função, ou regulação da expressão da nova colectina e/ou moléculas derivadas, elucidação dos mecanismos envolvidos nas doenças nas quais a nova colectina e/ou moléculas derivadas são esperadas participar, e para utilização no rastreio e teste de segurança para produtos farmacêuticos. O termo "animal transgénico" significa na sua definição restrita, um animal em que um gene exógeno é introduzido artificialmente em células germinais através de recombinação génica, enquanto que na sua definição mais alargada, "animal transgénico" significa um animal em que um gene exógeno é introduzido estavelmente em cromossomas numa fase precoce do desenvolvimento do indivíduo, assim, a transmissão ao seu descendente pode resultar como uma característica herdada, incluindo animais transgénicos anti-sentido em que uma função de um gene especificado é suprimida utilizando ARN anti-sentido, animais em que um gene específico é inactivado utilizando células estaminais embrionárias (célula ES), e animais em que é introduzido ADN com mutações pontuais.

Como aqui utilizado, "animal transgénico" pode ser interpretado no seu sentido mais alargado, incluindo todos os animais vertebrados excepto humanos. Um animal transgénico como 32 descrito acima pode ser útil para o desenvolvimento de animais modelo de doença para estudos na função, ou regulação da expressão da nova colectina e/ou moléculas derivadas, elucidação dos mecanismos envolvidos nas doenças relacionadas com as células em que essas moléculas são expressas em humanos, e para utilização no rastreio e teste de segurança para produtos farmacêuticos.

Um método para produzir um animal transgénico pode incluir um método em que um gene é introduzido directamente num núcleo do óvulo na fase pronuclear utilizando uma micropipeta sob o microscópio de contraste de fase (método de microinjecção, ver, Patente US N°. 4873191), um método em que é utilizada uma célula estaminal embrionária, e semelhantes. De outra forma, foi desenvolvido um método em que um gene é introduzido num vector retroviral ou um vector adenoviral seguido por infecção em óvulos; um método do vector espermático em que um gene é introduzido num óvulo através de um espermatozóide, ou semelhante. 0 método do vector espermático é um método de recombinação génica em que um gene exógeno é ligado a um espermatozóide, ou um gene exógeno é incorporado num espermatozóide através de um método de electroporação e semelhantes, seguido por introdução através de fertilização num óvulo, resultando na introdução do gene exógeno (M. Lavitroanoet et al, Cell, 57, 717, 1989) . Alternativamente, também pode ser utilizada recombinação génica especifica do sitio in vivo pelo sistema de cre/lox P recombinase do bacteriófago Pl, sistema de FLP recombinase de Saccharomyces cerevisiae, e semelhantes. Além disso, também foi descrito um método de introdução de um transgene da proteína pretendida em animais não humanos. 33

Um método de produzir um animal transgénico através de um método de microinjecção pode ser, por exemplo, realizado como indicado abaixo.

Primeiro, deve ser preparado um transgene constituído essencialmente a partir de um promotor envolvido em regulação da expressão, uma sequência de nucleótidos codificando a nova colectina e um sinal poli A. 0 perfil de expressão e uma quantidade de expressão de uma molécula especifica podem ser afectados dependendo da actividade do promotor, e os animais transgénicos produzidos são diferentes entre as estripes dependendo do número de cópias dos transgenes introduzidos e os sitios introduzidos, deste modo, o perfil e a quantidade da expressão devem ser confirmados entre as estripes. Uma vez que é revelado que uma quantidade de expressão pode variar relativamente a uma região não traduzida assim como splicing, também pode ser introduzida uma sequência de intrão que pode ser previamente removida antecipadamente do sinal poli A. É importante que um gene utilizado para introdução num óvulo fertilizado deva ser um gene possuindo uma pureza tão elevada quanto possivel. Os animais para utilização podem incluir um murganho para a recolha de óvulos fertilizados (5-6 semanas), um murganho macho para fertilização, um murganho fêmea pseudográvida, um murganho macho submetido a vasectomia, e semelhantes.

De modo a obter eficientemente um óvulo fertilizado, a ovulação pode ser induzida por gonadotrofina e semelhantes. 0 óvulo fertilizado é recuperado, e depois um gene colocado numa pipeta de injecção é injectado num pronúcleo masculino do ovo num método de microinjecção. São preparados animais para recolherem de volta o ovo injectado numa trompa de Falópio (murganho fêmea pseudográvida e semelhantes), e são transplantados cerca de 10-15 ovos por animal. Subsequentemente, 34 para determinar se o transgene está introduzido nos murganhos quando nascem, pode ser realizada extracção de ADN genómico a partir da extremidade superior da cauda, seguida por detecção do transgene através do método de transferência de Southern ou método de PCR, ou o método de clonagem positiva em que é introduzido um gene marcador que é apenas activado quando resultou uma recombinação homóloga. Além disso, de modo a confirmar a expressão do transgene, é detectado um produto de transcrição derivado do transgene através do método de transferência de Northern ou método de RT-PCR. Alternativamente, pode ser realizado o método de transferência de Westhern com um anticorpo especifico para a proteina ou um seu fragmento.

Além disso, pode ser produzido um animal inactivado não humano, que é obtido por alteração de um gene codificando um homólogo da nova colectina mencionada acima, de acordo com a presente invenção, num animal não humano compreendendo o homólogo, de um modo a inibir a expressão do homólogo. 0 murganho inactivado pode ser tratado para deteriorar a função do gene da nova colectina e/ou moléculas derivadas. 0 "murganho inactivado" significa um murganho transgénico em que um determinado gene é destruído através de tecnologia de recombinação homóloga, resultando assim deterioração da sua função. Um murganho inactivado pode ser produzido por realização de recombinação homóloga utilizando células ES, e seleccionando uma célula estaminal embrionária em que um dos genes alélicos foi modificado/destruído. Pode ser obtido um murganho quimérico possuindo células mistas derivadas da célula estaminal embrionária e células derivadas de um embrião, por exemplo, através de injecção de uma célula estaminal embrionária com um seu gene que foi manipulado, na fase de blastocisto ou mórula do óvulo fertilizado. Quando este murganho quimérico (quimérico é referido como um único murganho individual formado com células 35 somáticas baseadas em mais de dois óvulos fertilizados) é cruzado com um murganho normal, pode ser produzido um murganho heterozigótico que tem um dos genes alélicos inteiramente modificado/destruido. Além disso, pode ser produzido um murganho homozigótico através de cruzamento dos murganhos heterozigóticos entre si. A "recombinação homóloga" significa a recombinação que ocorre entre dois genes possuindo sequências de nucleótidos idênticas ou muito semelhantes através de um mecanismo de recombinação génica. Pode ser utilizado um método de PCR para rastrear as células em que ocorreu recombinação homóloga. Pode ser realizada uma reacção em cadeia da polimerase utilizando uma porção de um gene introduzido e uma porção de uma região esperada para a inserção, como iniciadores, consequentemente, a ocorrência de recombinação homóloga nas células pode ser identificada onde resultou o produto de amplificação. Além disso, quando a recombinação homóloga é provocada num gene que é expresso numa célula estaminal embrionária, um gene de resistência à neomicina foi previamente ligado ao gene introduzido, e após introdução do gene, a selecção pode ser prontamente realizada através de, por exemplo, condução das células para serem resistentes à neomicina, ou através de quaisquer outros métodos conhecidos ou métodos modificados dos mesmos (ver, Capecchi, Science, vol. 244, pp. 1288-1299 (1989), e semelhantes). A presente invenção será descrita mais detalhadamente através dos seguintes exemplos ilustrativos, não limitativos. É pretendido que a presente invenção abranja todas as modificações e variações realizadas pelos especialistas na técnica após consideração das divulgações aqui apresentadas, e em particular daquelas formas de realização que estão no âmbito da mais 36 alargada interpretação apropriada das reivindicações e suas exigências.

Os Exemplos demonstram: a procura na base de dados EST (Exemplo 1) ; preparação da sonda para rastreio (Exemplo 2) ; rastreio da biblioteca de ADNc derivada de placenta humana (Exemplo 3) ; sequenciação da sequência de nucleótidos da nova colectina (Exemplo 4); análise genómica de Southern da nova colectina (Exemplo 5); análise de Northern da nova colectina com vários tecidos humanos (Exemplo 6); análise genómica de Southern da nova colectina com tecidos de várias espécies de animais (Exemplo 7); e estudo genético da nova colectina (Exemplo 8); produção de anticorpos monoclonais específicos para a nova colectina (Exemplo 9) ; método de ELISA utilizando o anticorpo anti-humano anti-murganho da nova colecção (Exemplo 10); produção de anticorpos com imunogenicidade diminuída para o ser humano (Exemplo 11); construção de um vector de expressão pNOWl-hCL-Pl da nova colectina (Exemplo 12); selecção de um clone expressando a nova colectina (Exemplo 13); produção de um murganho transgénico (Exemplo 14); e produção de um murganho inactivado (Exemplo 15).

Exemplo 1: Procura na Base de Dados EST

Foram procuradas regiões altamente conservadas entre moléculas de colectinas conhecidas, i. e., MBP humano, SP-A humano e SP-D humano, através de comparação das suas sequências de aminoácidos (ver Figuras 2 e 3, em que os resíduos de aminoácidos que foram reconhecidos como sendo homólogos entre essas proteínas foram colocados numa caixa de texto). Como resultado, foi sugerido que a região consistindo de 27 aminoácidos, nomeadamente do aminoácido 220 até 246 da sequência humana de MBP (mostrada na Figura 3, caracteres 37 brancos com limite a negro), foi altamente homóloga. Deste modo, foram preparadas algumas seguências de consenso correspondentes a esta região, e foram conduzidas procuras na base de dados EST (Expressed Sequence Tags) com essas sequências. Para esta procura, foi utilizada a base de dados EST publicada a 11 de Outubro de 1996, que incluía 676750 sequências.

Consequentemente, foram obtidos alguns dados compreendendo sequências de aminoácidos altamente homólogas com a sequência de 27 aminoácidos descrita acima. Foram ainda conduzidas procuras na base de dados GenBank/EST com os dados assim obtidos das sequências de aminoácidos, e deduzido se foram derivadas de genes conhecidos ou desconhecidos. Desse modo, foi confirmado que os dados, incluindo duas sequências de nucleótidos altamente homólogas mas desconhecidas (registadas como: W72977 e R74387), poderiam ser obtidas quando a seguinte sequência de aminoácidos foi utilizada como uma sequência de consenso: Glu-Lys-Cys-Val-Glu-Met-Tyr-Thr-Asp-Gly-Lys-Trp-Asn-Asp-Arg-Asn-Cys-Leu-Gln-Ser-Arg-Leu-Ala-Ile-Cys-Glu-Phe (SEQ ID N° : 3). Estas foram derivadas respectivamente de placenta e de coração fetal, e os clones indicam as porções de sequências de nucleótidos da nova colectina.

Posteriormente, o clone derivado de coração fetal (I.Μ.A.G.E.Consortium Clone ID 34472) foi adquirido à ATCC (American Type Culture Collection), e utilizado como uma sonda de rastreio para a obtenção de uma nova colectina.

Exemplo 2: Preparação da Sonda para Rastreio A sequência de nucleótidos do ADN de inserção do clone descrito acima foi determinada utilizando iniciadores (Pharmacia, M13 Universal Primer (SEQ ID N°: 7, 5'-fluoresceína- 38 cgacgttgtaaaacgacggccagt-3') e Ml3 Reverse Primer (SEQ ID N°: 8, 5'-fluoresceina-caggaaacagctatgac-3')). A partir da sequência de nucleótidos assim obtida, foi seleccionada uma grelha de leitura aberta através de emparelhamento da mesma com a sequência de aminoácidos da colectina, e foi escolhida a sequência de nucleótidos correspondente à sequência de aminoácidos que poderia ser lida a partir da grelha de leitura aberta acima. Depois, foram produzidos iniciadores para sondas de ADNc marcadas com digoxigenina (DIG) (Reverse Primer: caatctgatgagaaggtgatg (SEQ ID N°: 4) e Forward Primer: acgaggggctggatgggacat (SEQ ID N°: 5)) correspondentes às partes das sequências de nucleótidos, utilizando um DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems, 392A). A marcação com DIG foi realizada utilizando o PCR DIG Probe

Synthesis Kit (Boehringer Mannheim). A mistura da reacção continha: ADN de plasmideo (clone W72977, 50 ng/pL), 2 pL (100 ng) ; Tampão 10x5 pL; 25 mM de MgCl2, 5 pL; dNTP (PCR Labeling Mix) , 5 pL; 20 pM Reverse Primer, 2,5 pL; 20 pM Forward Primer, 5 pL; H20, 28 pL; Taq Polimerase, 0,5 pL. A reacção de PCR foi realizada utilizando Zymoreactor (ATTO Corp.) através de 35 ciclos de: 1 minuto a 92 °C, 1 minuto a 55 °C e 2 minutos a 72 °C.

Exemplo 3: Rastreio da Biblioteca de ADNc Derivada de Placenta Humana

Primeiro, a biblioteca de ADNc de fagos derivada de placenta humana foi titulada como se segue. Escherichia coli Y1090r~, 0,2 mL, que tinha sido cultivada a 37 °C durante 16 horas em meio mLB (meio LB (1 g de triptona, 0,5 g de extracto de levedura e 0,5 g de NaCl num volume total de 100 mL) contendo 10 mM de MgS04 e 0,2% de maltose) e 0,1 mL da biblioteca de ADNc 39 diluída em série com tampão SM (5,8 g de NaCl, 2 g de MgS04*7H20, 2 M de Tris-HCl (pH 7,5) 25 mL, e 5 mL de 2% de gelatina num volume total de 1 L) foram incubados a 37 °C durante 15 minutos, depois as misturas foram adicionadas a 2,5 mL de LB-TOP agarose (0,75% de agarose/meio LB) para fazer soluções homogéneas, e plaqueadas em placas de meio LB de 90 mm 0 (Iwaki Glass) , (1,5% de agar/meio LB) . As soluções adicionadas foram endurecidas à temperatura ambiente durante 15 minutos, depois incubadas durante 5 horas a 42 °C. As placas em cada uma das placas foram contadas, e foi calculado o título dos fagos. Consequentemente, o título foi calculado como sendo 2,1 x IO10 pfu/mL. O rastreio foi realizado como se segue utilizando a sonda preparada no Exemplo 2.

Escherichia coli Y1090r", 0,6 mL, que tinha sido cultivada a 37 °C durante 16 horas em meio mLB, e a biblioteca de ADNc diluída com tampão SM até 1 x 105 pfu foram incubados a 37 °C durante 15 minutos, depois a mistura foi adicionada a 7,5 mL de LB-TOP agarose (0,75% de agarose) para fazer uma solução homogénea. A solução foi plaqueada em dez placas quadradas de LB de 140 cm2 (Nissui Seiyaku), endurecidas à temperatura ambiente durante 15 minutos, depois as placas foram incubadas durante 5 horas a 42 °C. Após ser confirmada a formação de placas em cada uma das placas, foi realizada a transferência para membranas de nylon. A transferência foi realizada utilizando Nytran 13N (Schleicher e Schuell Co.). Os filtros (dimensão 12,5 cm x 9,0 cm) foram imersos em água destilada durante 10 minutos para ficarem molhados, depois foi removido o excesso de água sobre papel Whatmann 3MM, e os filtros foram colocados sobre as placas que tinham placas aí formadas. Após dois minutos de repouso, os filtros foram recuperados e secos ao ar durante 10 minutos. O ADN fágico nos filtros foi desnaturado durante 2 minutos com 0,2 M de NaOH/1,5 M de NaCl, seguido por neutralização com 0,4 M de Tris-HCl (pH 7,6)/2 x SSC durante 40 2 minutos e lavagem com 2 x SSC durante 2 minutos.

Posteriormente, o ADN fágico foi fixo na membrana através de irradiação de UV com GS GENE LINKER (BioRad). A hibridação e detecção dos sinais foram conduzidas como se segue. Os filtros foram embebidos em 2 x SSC, e o excesso de humidade foi removido utilizando papel Whatmann 3MM. Depois, os filtros foram colocados num saco de hibridação e foi realizada a pré-hibridação a 68 °C durante uma hora numa solução de hibridação (5 x SSC, 1% de agente de bloqueamento, 0,1% de N-lauroilsarcosina e 0,02% de SDS) . Subsequentemente, a solução de hibridação foi removida do saco, e foi ai adicionada a solução de hibridação contendo sonda de ADNc marcada com DIG a uma concentração de 10 ng/mL, e a hibridação foi prosseguida a 55 °C durante 16 horas. Após a hibridação ter terminado, os

filtros foram lavados numa solução de 2 x SSC/0,1% de SDS durante 5 minutos, 2 vezes; e lavados adicionalmente numa solução de 0,5 x SSC/0,1% de SDS durante 15 minutos, 2 vezes.

Depois, o SDS foi removido utilizando tampão DIG I (100 mM de

Tris-HCl, 150 mM de NaCl (pH 7,5)) durante 1 minuto, e os filtros foram bloqueados com tampão DIG II (1% de agente de bloqueamento em tampão DIG I) durante 30 minutos. Após lavagem dos filtros com tampão DIG I durante um minuto, foi adicionada uma solução de fosfatase alcalina marcada com anticorpo anti-DIG (Boehringer Mannheim) que foi diluido até 5000 vezes em tampão DIG II, e a reacção entre o antigénio e o anticorpo foi deixada durante 30 minutos à temperatura ambiente. Os filtros foram depois lavados duas vezes com tampão DIG I durante 15 minutos à temperatura ambiente. Através do tratamento subsequente dos filtros com tampão DIG III (100 mM de Tris-HCl, 100 mM de NaCl (pH 9,5), 50 mM de MgCl2) durante 3 minutos, foi aumentada a concentração de Mg2+. Foi adicionada uma solução de NBT/BCIP (WAKO Chem., Co.) em tampão DIG III para a revelação da cor, e 41 de acordo com o exposto, foram identificados 10 clones positivos.

As placas correspondentes a estes clones foram removidas das placas e colocadas em tubos contendo 1 mL de tampão SM. Após agitação durante 10 minutos, cada uma das soluções de tampão foi diluida em série com tampão SM, e 0,1 mL da solução diluida foi misturada com 0,2 mL de culturas de Escherichia coli Y1090r~ que tinham sido cultivadas em meio mLB durante 16 horas a 37 °C. A mistura foi incubada durante 15 minutos a 37 °C, e depois adicionada a 2,5 mL de LB-TOP agarose para fazer uma solução homogénea. A solução foi plaqueada em dez placas de LB de 90 mm 0, endurecidas à temperatura ambiente durante 15 minutos, depois as placas foram incubadas durante 5 horas a 42 °C. Foram obtidas várias placas, e foi realizado o rastreio secundário essencialmente de acordo com os processos do rastreio primário.

Exemplo 4: Seguenciação da Sequência de Nucleótidos da Nova Colectina A placa do clone que se esperava ser apropriado entre os clones positivos obtidos no rastreio secundário acima, foi removida das placas, e foi colocada num tubo contendo 200 pL de água destilada seguida por agitação durante 30 minutos à temperatura ambiente, depois o tubo foi centrifugado a 15000 rpm durante 5 minutos, e foi dai obtido o sobrenadante. O ADN de inserção foi amplificado através de PCR com TaKaRa LA PCR Kit Ver.2 (TAKARA Syuzo, Co.) utilizando o sobrenadante resultante como um molde. As reacções de PCR continham: o sobrenadante, 27 pL; 10 x Tampão LA PCR II (sem Mg2+) , 5 pL; 25 mM de MgCl2, 5 pL; dNTP Mix, 8 pL; 20 pM de Xgtll Reverse Primer (SEQ ID N°: 9: 5'-ttgacaccagaccaactggtaatg-3'), 2,5 pL; 42 20 μΜ de Àgtll Forward Primer (SEQ ID N°: 10: 5' -ggtggcgacgactcctggagcccg-3' ) , 1 pL; LA Tag Polimerase, 0,5 pL; e H20, para perfazer um volume final de 50 pL. A reacção de PCR foi realizada utilizando um Applied Biosystems Gene Amp PCR System 9600, com 30 ciclos de: 20 segundos a 98 °C, e 5 minutos a 68 °C. O produto de PCR foi verificado através da electroforese em 1% de gel de agarose, e purificado por remoção do gel. Para este passo de purificação, foi utilizado o Sephaglas BandPrep Kit (Pharmacia). O fragmento de ADN removido foi incorporado no vector pCR2.1 (Invitrogen, TA Cloning Kit) . O vector recombinante foi transformado em células TOP10F' incluídas no TA Cloning Kit da Invitrogen. Os transformantes foram cultivados em meio LB (contendo 100 pg/mL de ampicilina), e foram extraídos três tipos de plasmídeos através do método de SDS alcalino. O ADN assim obtido foi clivado com enzimas de restrição que se esperavam ser adequadas, e cada fragmento de ADN foi incorporado no vector pUC18 seguido por transformação em células XLl-Blue. Os transformantes foram cultivados em meio LB (contendo 100 pg/mL de ampicilina), e os plasmídeos foram extraídos através do método de SDS alcalino. CL-Pl-2-1 resultou num plasmídeo contendo o fragmento EcoRI-Hind III e fragmento Hind III-EcoRI; CL-P1-3-4 resultou num plasmídeo contendo o fragmento EcoRI-BamHI, fragmento BamRI-Smal, fragmento Smal-HindlII, fragmento KpnI-Sau3AI, fragmento Sau3AI-EcoRI, fragmento EcoRI-Kp.nl e fragmento EcoRI-Smal; CL-Pl-3-7 resultou num plasmídeo contendo o fragmento EcoRI-BamHI, fragmento BamHI-Smal, fragmento Smal-HindIII, fragmento KpnI-Sau3AI, fragmento Sau3AI-EcoRI, fragmento EcoRI-Kpnl e fragmento Kpnl-EcoRI. Os iniciadores preparados foram: M13 Universal Primer (SEQ ID N°: 5); M13 Reverse Primer (SEQ ID N°: 6) do Autoread Sequencing 43

Kit; e os seguintes iniciadores marcados com FITC (Pharmacia, Fluore Prime) que foram produzidos utilizando um DNA/RNA synthesizer seguido por sequenciação das sequências de nucleótidos das regiões inteiras com o Autoread Sequencing Kit (Pharmacia) e A.L.F. Autosequencer. HPP 1: 5'-fluoresceina-cgtgaaaatgaatggaagtgg—3' (SEQ ID N° : 11), HPP 2: 5'-fluoresceína—ttttatccattgctgttcctc-3' (SEQ ID N° : 12) , HPP 3: 5’-fluoresceína—ctggcagtccccgaggtccag-3' (SEQ ID N° : 13) , HPP 5: 5'-fluoresceína—gctggtccccccggagagcgt-3' (SEQ ID N° : 14) , 0 esboço desta estratégia da sequenciação de nucleótidos realizada é mostrado na Figura 4. Uma ORF da colectina obtida é ilustrada na Figura 4 (a) , em que G-X-Y denota uma região de tipo colagénio. Além disso, na Figura 4 (b), são ilustrados cada um dos nomes dos iniciadores e posições das sequências de nucleótidos que foram lidas a partir do sequenciador (mostrados como setas), assim como M13 Universal Primer (mostrado como U) e M13 Reverse Primer (mostrado como R).

Além disso, uma sequência de nucleótidos em torno da região da extremidade 5' compreendendo um sitio de iniciação da transcrição foi determinada utilizando ADNc de Cap site.

Primeiro, a PCR foi realizada com ADNc de Cap Site, de Figado Humano (NIPPON GENE) utilizando TGP1 Primer (5'-tcttcagtttccctaatccc-3' (SEQ ID N°: 16)) que foi sintetizado com 1RC2 Primer (5'-caaggtacgccacagcgtatg-3' (SEQ ID N°: 15)) ligado e ο 392A DNA Synthesizer (Applied Biosystems). A mistura de reacção utilizada continha LA PCR Buffer II (sem Mg2+), 2,5 mM 44 de MgCl2, 200 μΜ de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP (os quais são todos produzidos pela TAKARA Syuzo, Co.)r 1 pL; ADNc de Cap Site de Figado Humano; 0,5 P P 1RC2 Primer (ambos os quais são produzidos pela NIPPON GENE) , e 0,5 pM de TGP1 Primer, num volume total de 50 pL • A PCR foi realizada utilizando um programa compreendendo 35 ciclos de: desnaturação pelo calor durante 20 segundos a 95 °C, emparelhamento durante 20 segundos a 60 °C, extensão durante 20 segundos a 72 °C, com desnaturação pelo calor durante 5 minutos a 95 °C antes da reacção repetida e extensão final durante 10 minutos a 72 °C. Após terminação da primeira PCR, foi conduzida PCR interna. A reacção foi realizada utilizando 1 pL do primeiro produto de PCR como um molde, com iniciadores 2RC2 Primer (5'-gtacgccacagcgtatgatgc-3' (SEQ ID N°: 17)) ligado e TGP2 Primer sintético (5'-cattcttgacaaacttcatag-3' (SEQ ID N° : 18)) que foi sintetizado similarmente ao TGP1 Primer, e com os mesmos componentes de reacção e programa (excepto que o número de ciclos foi 25) como na primeira PCR. A reacção de PCR foi realizada com TaKaRa PCR Thermal Cycler 480. Após o produto de PCR assim obtido ser confirmado em electroforese em gel de agarose, a banda foi removida do gel, seguida por congelamento a -80 °C durante 10 minutos, centrifugação a 15000 rpm, durante 10 minutos, e depois o sobrenadante foi purificado através de precipitação por etanol. O fragmento de ADN purificado foi incorporado no Vector pT7Blue (Novagen), e o vector foi transformado em células XLl-Blue competentes. Os transformantes foram cultivados em meio LB (contendo 100 pg/mL de ampicilina), e os plasmideos foram extraídos através do método de SDS alcalino, seguido por sequenciação da sequência de nucleótidos com o Autoread Sequencing Kit (Pharmacia) e A.L.F. DNA Sequencer. Os iniciadores utilizados foram M13 Universal Primer (SEQ ID N°: 7) 45 e Ml3 Reverse Primer (SEQ ID N°: 8) ligados ao Autoread Sequencing Kit.

Como um resultado, foi confirmado que o clone de ADNc da nova colectina que foi obtido no Exemplo 3 continha 2024 bases compreendendo a ORF (grelha de leitura aberta) de 1026 bases codificando 342 aminoácidos apresentados em SEQ ID N°: 2.

Em seguida, os resultados de procuras de homologia da sequência de ADN e aminoácidos na base de dados GenBank revelaram que a sequência de aminoácidos da proteina obtida é distinta daquelas das colectinas identificadas previamente e deriva de uma nova proteina.

Além disso, a sequência de aminoácidos da nova colectina da presente invenção foi comparada com aquelas de três proteínas colectinas descritas até agora. O alinhamento é mostrado nas Figuras 5 e 6. Similarmente às Figuras 2 e 3, os resíduos de aminoácidos homólogos foram colocados numa caixa de texto. Este alinhamento sugere que a nova proteína obtida compartilha de homologia com colectinas conhecidas e pertence à família das colectinas.

Exemplo 5: Análise Genómica de Southern da Nova Colectina A Análise Genómica de Southern foi realizada de modo a esclarecer se o gene da nova colectina, compreendendo a sequência de ADNc verificada no Exemplo 4, era um gene de cópia única ou um gene de cópias múltiplas.

Quatro pg de ADN genómico (Promega) derivado de sangue humano foram digeridos com qualquer uma das enzimas de restrição, (1) EcoRl, (2) Xbal, (3) HindIII, (4) PstI, (5) BglII 46 ou (6) BamRI, seguido por electroforese em 0,8% de gel de agarose a 100 mA, durante 3 horas. Após a electroforese ter terminado, o ADN foi transferido para uma membrana de nylon (Nytran 13N) para preparar uma membrana para a análise.

Para o passo de transferência, o gel submetido a electroforese foi primeiro imerso em 100 mL de 0,25 N de HC1 durante 10 minutos, lavado três vezes com água destilada, depois imerso duas vezes em 100 mL de uma solução desnaturante (1,5 M de NaCl, 0,5 M de NaOH) durante 15 minutos, e imerso em 100 mL de uma solução neutralizante (0,5 M de Tris-HCl, 3 M de NaCl (pH 6,8)) durante 30 minutos de modo que fossem realizadas depurinação, desnaturação e neutralização. Posteriormente, o ADN foi transferido utilizando um Vacuum Blotting System (Toyobo Engineering, VB-30). Neste passo, foi utilizada a membrana que tinha sido pré-tratada por imersão em 2 x SSC durante 5 minutos e em 20 x SSC durante 5 minutos, com uma almofada que tinha sido embebida com 20 x SSC. Após a transferência ter terminado, a fixação do ADN foi realizada por irradiação de UV. A sonda de hibridação utilizada para a análise de Southern foi uma sonda de ADN para uma porção da ORF da sequência de ADNc da nova colectina obtida no Exemplo 4: gaagacaagt cttcacatct tgttttcata aacactagag aggaacagca atggataaaa aaacagatgg tagggagaga gagccactgg atcggcctca cagactcaga g (SEQ ID N°: 21), que foi marcada utilizando o PCR DIG Probe Synthesis Kit mencionado acima, com iniciadores: 5'—gaagacaagtcttcaactcttg-3' (SEQ ID N°: 19) e 5'—ctctgagtctgtgaggccgatc-3' (SEQ ID N°: 20). Antes da hibridação, a sonda foi fervida durante 10 minutos, e congelada rapidamente com gelo seco/etanol durante 5 minutos.

Primeiro, a membrana que foi submetida ao passo de transferência foi imersa em 2 x SSC durante 5 minutos, depois a 47 pré-hibridação foi realizada em ExpressHyb Hybridization Solution (Clonetech), 10 mL a 65 °C durante 30 minutos. Subsequentemente, a sonda congelada acima foi diluida até 10 ng/mL em ExpressHyb Hybridization Solution, e foram utilizados 2 mL desta solução para hibridação a 65 °C durante uma hora.

Depois da hibridação, a membrana foi lavada por: agitação em 2 0 mL de solução de 2 x SSC à temperatura ambiente durante 5 minutos duas vezes, depois em 20 mL de solução de 0,2 x SSC, 0,1% de SDS a 65 °C durante 15 minutos duas vezes. Em seguida, a membrana foi lavada duas vezes com 50 mL de tampão DIG I (100 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl (pH 7,5)) à temperatura ambiente durante um minuto de modo a remover o SDS, e depois bloqueada em 50 mL de tampão DIG II' (1,5% de agente de bloqueamento em tampão DIG I) à temperatura ambiente durante uma hora. Posteriormente, a membrana foi tratada com 10 mL de fosfatase alcalina marcada com anticorpo anti-DIG que tinha sido diluida 5000 vezes em tampão DIG I contendo 0,2% de Tween20 durante 30 minutos, seguida por lavagem duas vezes através de agitação em 50 mL de tampão DIG I contendo 0,2% de Tween20 à temperatura ambiente durante 20 minutos. Após embeber a membrana duas vezes em 10 mL de tampão DIG III à temperatura ambiente durante 3 minutos, foi colocada num saco de hibridação, e foi ai adicionado CSPD (marca registada, Boehringer Mannheim: substrato de quimioluminescência) que tinha sido diluido 100 vezes em tampão DIG III de modo que a solução pudesse espalhar-se sobre a membrana. Subsequentemente, a membrana foi exposta sobre Instant Film T612 (Polaroid).

Consequentemente, foi especulado que o gene da nova colectina obtida era um gene de cópia única, porque apenas um ou dois sinais podiam ser detectados a partir do respectivo ADN 48 genómico que foi digerido com cada uma das enzimas de restrição como mostrado nas pistas da Figura 7.

Exemplo 6: Análise da Distribuição da Expressão Específica de Tecido Humano da Nova Colectina

De modo a examinar a expressão do ARNm da nova colectina em vários tecidos humanos, a análise foi realizada através de RT-PCR.

Foi realizada RT-PCR utilizando o RNA LA PCR Kit (AMV) Ver.1.1 (TAKARA Syuzo, Co.) com cada ARN derivado de diversos tecidos humanos ((1) cérebro, (2) coração, (3) rim, (4) baço, (5) fígado, (6) intestino delgado, (7) músculo, (8) testículos, (9) placenta, ou (10) cólon (OriGene Technologies, Inc.)) como um molde. Primeiro, a reacção de transcrição reversa foi conduzida na seguinte mistura de reacção. A mistura de reacção continha 5 mM de MgCl2, 1 x RNA PCR Buffer, 1 mM de dNTP Mixture, 1 U/pL inibidor de Rnase, 0,25 U/pL transcriptase reversa, 0,125 pM de Oligo dT-Adaptor Primer, 1 pg de ARN, e foi ajustada para um volume total de 20 pL com água destilada sem RNase. Ao mesmo tempo, uma mistura de reacção sem transcriptase reversa foi também preparada para o controlo negativo. A mistura de reacção foi colocada num tubo de 0,2 mL, e submetida a PCR com TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL (TAKARA Syuzo, Co.) através de 1 ciclo de: 30 minutos a 42 °C, 5 minutos a 99 °C, e 5 minutos a 5 °C. O produto de PCR assim resultante foi utilizado subsequentemente para LA PCR com a seguinte mistura de reacção; 2,5 mM de MgCl2, 1 x LA PCR Buffer II (sem Mg2+) , 2 U de TaKaRa LA Taq, adicionada com dois tipos de iniciadores a 0,2 pM (RT-PCR Primer U: 5'-gtgcccctggccctgcagaatg-3' (SEQ ID N°: 22) e RT-PCR Primer R: 5'-gcatatcaccctggggaacattttag-3' (SEQ ID N°: 23) que poderia amplificar uma sequência de ADNc cobrindo 49 desde a região de pescoço até ao domínio de reconhecimento de hidratos de carbono da nova colectina, que foi ajustada para um volume total de 80 pL com água destilada estéril. O produto de reacção foi separado por electroforese em 1% de gel de agarose, seguida por coloração com solução de brometo de etídio (0,1 pg/mL), verificação do perfil electroforético com transiluminador, e identificação do tecido expresso.

Além disso, de modo a comparar a quantidade expressa em cada um dos tecidos, foi realizada RT-PCR para amplificar uma parte da β-actina com cada um dos tecidos, e a quantidade de ARN foi corrigida. A RT-PCR foi realizada similarmente ao processo acima com reacção de transcriptase reversa, reacção de PCR, e identificada utilizando electroforese em 1% de gel de agarose como descrita acima. A mistura de reacção da transcrição reversa continha 5 mM de MgCl2, 1 x RNA PCR Buffer, 1 mM de dNTP Mixture, 1 U/pL de inibidor de RNase, 0,25 U/pL de transcriptase reversa, 2,5 pM de 9-ómero aleatório, 10 ng de ARN, que foi ajustada para um volume total de 60 pL com água destilada sem RNase. A PCR foi realizada através de 1 ciclo de: 10 minutos a 30 °C, 15 minutos a 42 °C, 5 minutos a 99 °C e 5 minutos a 5 °C. O produto de PCR assim resultante foi utilizado subsequentemente para PCR com a seguinte mistura de reacção; 1 x LA PCR Buffer II (sem Mg2+) , 2 U de TaKaRa LA Taq, 0,25 pM de iniciador de sentido da β-actina humana 5'-caagagatggccacggctgct-3' (SEQ ID N°: 24), 0,25 pM de iniciador de anti-sentido da β-actina humana 5'-tccttctgcatcctgtcggca-3' (SEQ ID N°: 25), que foi ajustada para um volume total de 40 pL com água destilada estéril. A PCR foi realizada através de 30 ciclos de: 15 segundos a 94 °C, e 30 segundos a 68 °C.

Os resultados são mostrados na Figura 8, sugerindo que o ARNm da nova colectina da presente invenção foi expresso na 50 placenta (pista 9), baço (pista 4) e rim (pista 3). É claramente sugerida expressão extremamente elevada na placenta.

Exemplo 7: Análise Genómica de Southern da Nova Colectina de Vários Animais

De modo a elucidar a conservação do gene da colectina da presente invenção nas outras espécies de animais, foi realizada análise através de hibridação genómica de Southern. A sonda de hibridação utilizada para esta análise foi a sonda de ADN marcada com DIG correspondente à sequência de ADNc da ORF da nova colectina como descrita acima, que foi marcada utilizando o PCR DIG Probe Synthesis Kit (Boehringer Mannheim) descrito acima. A membrana utilizada foi preparada por tratamento de cada 5 pg de ADNs genómicos de (1) humano (Promega), (2) macaco (Clonetech), (3) rato (Promega), (4) murganho (Promega), (5) cão (Clonetech), (6) vaca (Promega), (7) coelho (Clonetech) e (8) galinha (Promega) com a enzima de restrição EcoRI, electroforese em gel de agarose, transferência para membrana Nytran 13N e fixação através de irradiação de UV.

Utilizando a sonda e membrana, a hibridação foi realizada de acordo com os seguintes processos. Primeiro, a membrana foi imersa em 2 x SSC durante 5 minutos, depois a pré-hibridação foi realizada em 10 mL de ExpressHyb Hybridization Solution a 65 °C durante 30 minutos. Subsequentemente, a sonda que tinha sido congelada, como descrito acima, foi diluída em ExpressHyb Hybridization Solution para estar a 10 ng/mL, e foram utilizados 2 mL da solução de sonda assim diluída para hibridação a 65 °C durante uma hora. 51

Depois da hibridação, a membrana foi lavada através de: agitação em 20 mL de 2 x SSC, 0,1% de SDS à temperatura ambiente durante 5 minutos duas vezes, e depois agitação em 20 mL de 0,2 x SSC, 0,1% de SDS a 68 °C durante 15 minutos duas vezes. Em seguida, a membrana foi lavada duas vezes com tampão DIG I à temperatura ambiente durante um minuto, de modo a remover o SDS, e foi bloqueada em 50 mL de tampão DIG II' à temperatura ambiente durante uma hora. Posteriormente, a membrana foi tratada com 10 mL de fosfatase alcalina marcada com anticorpo anti-DIG que tinha sido diluida 5000 vezes em tampão DIG I contendo 0,2% de Tween20 durante 30 minutos, seguida por lavagem duas vezes com agitação em 50 mL de tampão DIG I contendo 0,2% de Tween20 à temperatura ambiente durante 20 minutos. Após embeber a membrana duas vezes em 10 mL de tampão DIG III à temperatura ambiente durante 3 minutos, foi colocada num saco de hibridação, e foi ai adicionado CSPD que tinha sido diluído 100 vezes em tampão DIG III, de modo que a solução pudesse-se espalhar sobre a membrana. Subsequentemente, a membrana foi exposta a Instant Film T612. O resultado desta análise é mostrado na Figura 9, em que podem ser encontrados sinais de ADN em todas as pistas, excepto para a pista 8 que foi carregada com ADN de galinha. Deste modo, foi demonstrado que o gene da nova colectina da presente invenção tem sido conservado entre as espécies de mamíferos.

Exemplo 8: Análise Genética da Nova Colectina

Para elucidar a relevância posicionai genética da presente colectina entre as colectinas conhecidas, foi realizada análise com base na sequência de ADN da nova colectina como obtida, e foi produzida uma árvore filogenética. 52

As colectinas seleccionadas como objectos para a análise foram de diversos tipos de proteínas pertencentes à família das colectinas, mostrada na Figura 10 (na Figura 10, CL-L1 designa uma colectina derivada de fígado humano, que foi recentemente isolada pelo presente requerente (ver, Pedido de Patente Japonesa N° . Hei 10-11281)). Cada uma das sequências de aminoácidos foi extraída da base de dados GenBank, e depois foram produzidos alinhamentos múltiplos através do método clustalw utilizando as regiões contendo domínios de lectina dos dados obtidos para produzir a árvore filogenética utilizando o método N-J (ligação-vizinho) com o programa do pacote Phylip Version 3.57c.

Consequentemente, como mostrado na Figura 10, embora SP-D, colectina-43 de bovino e conglutinina de bovino constituíssem o único aglomerado, adicionalmente MBP e SP-A constituíram, respectivamente, aglomerados separados, enquanto o gene da colectina da presente invenção não pertenceu a nenhum destes aglomerados similarmente a CL-L1. Além disso, foi especulado que a colectina da presente invenção pode constituir um aglomerado distinto que é geneticamente distinto daqueles das colectinas até agora descritas, incluindo CL-L1.

Exemplo 9: Produção de Anticorpos Monoclonais para a Nova Colectina

Uma solução de 100 pg da nova colectina dissolvida em 100 pL de PBS (-) (PBS, sem ião cálcio e ião magnésio) e 100 pL de adjuvante de Freund completo são misturadas para preparar uma emulsão, e a emulsão é injectada intraperitonealmente em dois murganhos BALB/c (macho, 8 semanas). Após três semanas, a segunda imunização é conduzida similarmente. Contudo, é utilizado desta vez adjuvante de Freund incompleto em vez de 53 adjuvante de Freund completo. Após mais duas semanas, o soro é recuperado e é medido o título do anticorpo no mesmo. É seleccionado um murganho que tem o título do anticorpo mais elevado, e após uma semana, é conduzida a imunização final similarmente à segunda imunização. Após 5 dias da imunização final, o baço é removido, e é preparado uma suspensão celular líquida. A fusão celular é realizada por mistura de 2 x 107 células de mieloma NS-1 e 1 x 108 células de baço preparadas. Após centrifugação da mistura a 1600 rpm durante 6 minutos à temperatura ambiente, o sobrenadante é removido, depois as células restantes são soltas, e é aí adicionado 1 mL de polietilenoglicol (PEG) durante um período de tempo de um minuto, seguido por agitação durante um minuto à temperatura ambiente. Subsequentemente, é adicionado, gota a gota, 1 mL de meio de cultura (meio de Iscove, contendo 15% de FCS, 2 mM de solução de L-glutamina, 0,05 mM de 2-mercaptoetanol) previamente incubado a 37 °C durante um período de tempo de um minuto com mistura moderada. Depois de repetir este processo, é então realizado um processo semelhante com 8 mL do mesmo, durante um período de tempo de 3 minutos. Subsequentemente, o PEG é removido por centrifugação a 1000 rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente. O precipitado é solto, ao qual são adicionados 100 mL de 5 x 106 células de suspensão líquida de timócitos (para utilização como células alimentadoras aumentando a velocidade de formação do hibridoma, que é suspensa em meio de crescimento de hibridoma, incluindo HAT), para preparar uma suspensão líquida. Esta suspensão líquida é plaqueada numa placa de 96 poços, com 0,1 mL por poço, depois cultivada a 37 °C e 5% de C02 numa incubadora de C02. A selecção do hibridoma é realizada como se segue. Após um dia do início da cultura, são adicionados 150 pL de meio HAT (meio de crescimento de hibridoma contendo HAT), seguido por cultura durante os dois dias subsequentes. Após dois dias, o 54 meio é substituído por remoção de 150 pL de meio, e adicionando aí 150 pL de meio HAT, nos seguintes 3 e 7 dias de cultura, o meio é substituído similarmente. Após quatro dias, são recolhidos 100 pL de sobrenadante da cultura, depois é realizado 0 rastreio com a medição do título do anticorpo para a nova colectina. Em seguida, as células positivas para o anticorpo são transferidas da placa de 96 poços para uma placa de 24 poços, utilizando uma pipeta de Pasteur. Nesta ocasião, foram adicionados previamente a cada poço 0,5 mL de meio HT (meio de crescimento de hibridoma contendo hipoxantina e timidina). Após cultivo de 3 dias, é recolhida uma porção de meio, e o seu título do anticorpo é novamente medido, consequentemente as células capazes de serem determinadas como positivas para o anticorpo são clonadas e congeladas para armazenamento. Para a clonagem, as células positivas são submetidas a diluição limite na suspensão líquida de timócitos para ajustar para 1 célula/mL, cada 0,2 mL são plaqueados numa placa de 96 multi-poços. Após cultivo de 10 dias, é medido o título do anticorpo do poço que forma uma única colónia por poço, e são seleccionadas as duas colónias indicando os títulos do anticorpo mais elevados. Estes dois clones são submetidos a reclonagem. O método de clonagem é realizado similarmente ao método da primeira clonagem. Subsequentemente, é conduzida a cultura extensiva da célula positiva ao anticorpo. Primeiro, após transferência da célula para uma placa de 24 multi-poços, a célula é cultivada durante 3 dias, seguida por transferência para um balão de 25 cm2, cultivando mais 3 dias, e transferindo novamente para 225 cm2, e cultivando 3 dias, e de acordo com o exposto, é preparado um anticorpo monoclonal por recuperação do sobrenadante da cultura.

Além disso, para produzir um anticorpo monoclonal a partir de líquido ascítico, o hibridoma clonado é ajustado para 1 x 107 células/mL, e é depois injectado intraperitonealmente 1 mL por murganho. Após uma semana, o murganho com abdómen 55 aumentado é anestesiado com éter, e é recolhido o liquido ascitico. 0 liquido ascitico é transferido para um tubo de centrifugação de tipo promotor de coagulação, adicionado com agente de separação de soro, seguido por repouso durante 30 minutos à temperatura ambiente, e centrifugação a 3000 rpm durante 5 minutos. O liquido ascitico da porção superior é recuperado, e depois o liquido é adicionalmente purificado por fraccionamento com sulfato de amónio para obter um anticorpo.

Exemplo 10: Método de ELISA Utilizando Anticorpo Anti-humano Anti-murganho da Nova Colectina

O anticorpo anti-humano anti-murganho da nova colectina é diluído em tampão de revestimento (50 mM de tampão carbonato -bicarbonato, pH 9,6) até 10 pg/mL, e o líquido de anticorpo é dispensado em 100 pL por poço numa placa de ELISA de 96 poços. Subsequentemente, a placa é incubada a 4 °C de um dia para o outro. Os poços foram lavados três vezes com 300 pL de um líquido de lavagem (líquido TBS/T (25 mM de Tris-HCl, 0,14 M de NaCl, 5 mM de KC1, 0,05% de Tween 20, pH 7,4)). Daqui adiante, a lavagem pode ser realizada similarmente. São respectivamente dispensados trezentos pL de líquido TBS/T/5% de leite magro nos poços, e deixados repousar a 37 °C durante uma hora. Após lavagem, são aí dispensados 100 pL de uma amostra de teste e um padrão da nova colectina, e a placa é deixada repousar a 37 °C durante uma hora. Nesta ocasião, a amostra de teste é correctamente diluída, e é utilizada uma diluição em série de duas vezes até à concentração mais elevada de 0,02 pg/mL para o padrão. Após lavagem, são aí dispensados 100 pL de anticorpo anti-humano anti-coelho da nova colectina biotinizado a 1 pg/mL, e a placa é deixada repousar a 37 °C durante 30 minutos. Após lavagens adicionais, são aí dispensados 100 pL de solução de estreptavidina biotina, e a placa é deixada repousar a 37 °C 56 durante 30 minutos. Após lavagens adicionais, são dispensados 100 pL de solução de 3,3' , 5,5'-tetrametilbenzidina, e a placa é deixada repousar à temperatura ambiente durante 30 minutos, seguida por adição de 100 pL de ácido fosfórico a 1 N, terminação da reacção, e medição da absorvência a 450 nm de comprimento de onda. É produzida uma curva de calibração com o padrão utilizando este método, e é realizada a determinação quantitativa da nova colectina.

Exemplo 11: Produção de Anticorpos com Imunogenicidade Diminuída para o Ser Humano

Primeiro, é preparado ARNm a partir do hibridoma de murganho obtido no método descrito no Exemplo 9, é preparada uma biblioteca de ADNc com um vector fágico, e depois é realizada a clonagem de ADNc. Um ADNc de anticorpo de murganho é clonado utilizando ADNc de uma região constante como uma sonda, seguida por análise do ADNc introduzido com enzimas de restrição, e depois é sequenciada a sequência de nucleótidos do ADNc do anticorpo.

Em seguida, é expresso um anticorpo quimérico, e a presença ou ausência de uma mutação no gene do anticorpo clonado é confirmada a partir da actividade de ligação do anticorpo, embora possa ser utilizado como um controlo positivo para estudar a actividade de ligação do anticorpo humanizado expresso. Quando o anticorpo quimérico é expresso, pode ser utilizado um vector de expressão de tipo cassete em que é clonado um gene de uma região constante da cadeia L e cadeia H de anticorpo humano num único vector. É determinada a actividade de ligação do anticorpo quimérico, resultando na confirmação de 57 que o gene é indubitavelmente o gene de anticorpo de murganho clonado, depois é construído um gene de anticorpo humanizado. No caso da preparação de um anticorpo humanizado, deve ser concebido um gene para construção, uma vez que é diferente do caso do método de produção do anticorpo quimérico. Com base na sequência de nucleótidos determinada do gene da região variável de anticorpo de murganho, é procurada uma sequência de aminoácidos de uma região variável de anticorpo humano que seja altamente homóloga por utilização de uma base de dados. São encontradas sequências que têm 70-80% de homologia, diferente da sequência de CDR, posteriormente é enxertada uma sequência de CDR de anticorpo de murganho para a região em que é removida a sequência de CDR da região variável de anticorpo humano assim seleccionada (região estrutural), e de acordo com o exposto, é realizada modelação molecular através de um software de análise de estrutura proteica. Alguns aminoácidos da cadeia H e L respectiva numa sequência da região estrutural humana são retornados àqueles do tipo de murganho de modo que as configurações num total de 6 CDRs na cadeia H e cadeia L que se ligam a um antigénio através de modelação se tornam mais próximas daqueles do anticorpo monoclonal de murganho original relativamente à estrutura tridimensional. Num tal caso, é desejável retornar o menor número de aminoácidos de tipo murganho, porque pode resultar num anticorpo mais próximo do anticorpo humano. De acordo com a modelação desta molécula, mais de 10 tipos de versões de genes de anticorpo humanizado foram concebidas, expressas e as suas actividades devem ser comparadas, porque seria baixa a probabilidade de que o anticorpo humanizado iniciado de um modelo pode reproduzir uma actividade de 100%, equivalente àquela do anticorpo monoclonal de murganho.

Após estar terminada concepção do gene, é realmente realizada a construção do gene. Um vector de expressão de tipo 58 cassete, incluindo um gene da região constante das cadeias H, L de um anticorpo humanizado é clonado, depois é realizada uma expressão transitória com células COS e semelhantes, assim é determinada a actividade do anticorpo do sobrenadante do meio de cultura através do método de ELISA. São seleccionados diversos tipos que têm actividades fortes, e são estabelecidas as células de expressão estável através da utilização dos vectores de expressão respectivos para expressão estável e células hospedeiras, tais como células COS, para preparar o anticorpo purificado a partir do sobrenadante do meio de cultura.

Exemplo 12; Construção de um Vector de Expressão pNOWl-hCL- P1 da Nova Colectina

Primeiro, uma sequência abarcando desde o codão de iniciação até ao codão de terminação das novas colectinas, apresentada na SEQ ID N°: 1 é amplificada utilizando um iniciador que consiste da sequência de nucleótidos: aaggaaaaaa gcggccgcat gcaacaagat ttgatgagg (SEQ ID N°: 26), e um iniciador que consiste da sequência de nucleótidos gctctagatt ataatgcaga tgacagtac (SEQ ID N°: 27) com Zymoreactor (ATTO Corp.,). 0 ADNc da nova colectina obtida é digerido com enzimas de restrição NotI e XbaI, produzindo uma porção de ADNc correspondente a 670-1698 pb de ADNc da nova colectina, que pode ser uma inserção.

Em seguida, o vector de expressão pNOW/CMV-A (ver, Publicação da Patente Japonesa Não Examinada N°. H10-179169 (1998)) é digerido com as enzimas de restrição Not I e Xbal, depois a inserção acima é introduzida a jusante do promotor de citomegalovirus (pCMV) , nomeadamente, entre Pcmv (promotor precoce do antigénio principal de citomegalovirus) e BGP poli A 59 (sinal de poliadenilação da hormona do crescimento de bovino), utilizando um kit de ligação de ADN (Takara Shuzo Co., Ltd.)· 0 vector de expressão assim obtido é designado como plasmideo pNOWl-hCL-Pl (hCL-Pl: uma sequência de nucleótidos codificando a nova colectina), e um desenho esquemático da sua estrutura é mostrado na Figura 11.

Exemplo 13: Selecção de um Clone Expressando a Nova Colectina (1) Introdução do vector de expressão pNOWl-hCL-Pl em células de ovário de hamster Chinês (CHO) deficiente em di-hidrofolato reductase (dhfr~) É preparado Meio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM, GIBCO) que é adicionado com 10% de soro fetal de vitela (FCS, GIBCO) (sem hipoxantina e timidina), ao qual a estirpe de células CHO DG44 deficientes no gene DHFR (dhfr”) é misturada para produzir 1 x 105 células/mL, que é inoculado numa placa de 60 mm de diâmetro, e cultivado a 37 °C durante 24 horas sob uma condição de 5% de dióxido de carbono (C02) . O sobrenadante do meio de cultura é rejeitado, e por sua vez é adicionado IMDM contendo 100 pL de solução, separadamente e previamente obtida por mistura de 5 pg de ADN (vector de expressão pNOWl-hCL-Pl) com solução de lipofectina (DOTAP: Liposomal Transfection Reagent; Boeringer Mannheim) com 10% de FCS para ser 6 mL, adicionalmente, é ai adicionada hipoxantina (concentração final de 10 nM) (GIBCO) e timidina (concentração final de 100 nM) (GIBCO), seguida por cultivo durante 16 horas, para introduzir o vector de expressão pNOWl-hCL-Pl nas células hospedeiras CHO dhfr". Posteriormente, o sobrenadante do meio de cultura é rejeitado, seguido por adição de 6 mL de IMDM adicionado com 10% 60 de FCS, hipoxantina e timidina, e adicionalmente cultivado durante 24 horas. (2) Aquisição de células CHO resistentes à neomicina (G418)

Após as células, em que o vector de expressão pNOWl-hCL-Pl é incorporado, serem cultivadas durante 24 horas, que são submetidas a tripsinização e recuperadas da placa, o número das células é contado, e posteriormente a mistura em que aquelas células são suspensas em IMDM contendo neomicina (G418) a uma concentração de 400 pg/mL com 10% de FCS, é inoculada (dispensada) em dez microplacas de 96 poços numa quantidade de 0,1 mL/poço. As placas são cultivadas a 37 °C sob uma condição de 5% de dióxido de carbono (C02) , e após duas semanas, as células sobreviventes são adquiridas como células resistentes a G418 (clone).

Estes clones resistentes a G418 são identificados pela capacidade de produzir hCL-Pl. São seleccionados diversos clones entre os clones em que a produção de hCL-Pl é confirmada, e depois cada um dos clones seleccionados é inoculado num balão de cultura de 25 cm2. A cultura é realizada até as células se tornarem confluentes (aproximadamente 3 x 106 células/balão de cultura de 25 cm2) . O sobrenadante do meio de cultura de cada balão de cultura é rejeitado, depois são ai adicionados 2 mL de IMDM contendo 10% de FCS idêntica à composição descrita acima, seguida por cultura durante quatro dias, e recuperação do sobrenadante do meio de cultura. É medida a quantidade produzida de hCL-Pl (rhCL-Pl: nova colectina humana recombinante) no sobrenadante do meio de cultura recuperado. Deve ser notado de que a quantidade produzida de hCLPl pode ser quantitativamente determinada de acordo com o método de Suzuki et al. (Y. Suzuki, et al., "Characterization of Recombinant Bovine Conglutinin 61

Expressed in a Mammalian Cell", Biochem. Biophys. Res. Commun., 238:856-863 (1997)) utilizando um anticorpo policlonal anti-coelho para hCL-Pl, dominio de reconhecimento de hidratos de carbono (CRD) e região de pescoço das colectinas (expressa em E. coli utilizando um método semelhante), que é expresso em E. coli utilizando o método de Suzuki, et al.r supra, assim como hCL-Pl (referência quantitativa) como um controlo. (3) Aquisição de células CHO resistentes a metotrexato

Após repicagem adicional da cultura e estabilização do clone produtor de hCL-Pl obtido no Exemplo 13 descrito acima (2), é adicionada concentração baixa de metotrexato (MTX) ao meio, e é efectuada amplificação do gene.

Primeiro, cada clone celular seleccionado é misturado em IMDM contendo 5 nM de MTX, 400 pg/mL de G418 com 10% de FCS previamente dializado (JRH Bioscience), é inoculado (dispensado) em dez microplacas de 96 poços a 0,1 mL/poço. As células são cultivadas a 37 °C sob uma condição de 5% de dióxido de carbono (C02) , e após duas semanas, as células sobreviventes são adquiridas como células resistentes a 5 nM de MTX (clone).

Estes clones resistentes a 5 nM de MTX são identificados pela capacidade de produzir hCL-Pl. São seleccionados diversos clones opcionalmente entre os clones em que é confirmada a produção de hCL-Pl, e depois cada um dos clones seleccionados é inoculado num balão de cultura de 25 cm2, seguida por cultura de duas semanas até as células se tornarem confluentes. O sobrenadante do meio de cultura é rejeitado, depois são ai adicionados 2 mL de IMDM contendo 10% de FCS idêntica à composição descrita acima, seguida por cultura durante quatro dias, recuperação do sobrenadante do meio de cultura, e depois é 62 medido o nível de produção de hCL-Pl. Deve ser notado que a determinação quantitativa da quantidade produzida de hCLPl pode ser realizada de acordo com o método de ELISA descrito no Exemplo 10.

Exemplo 14: Produção de um Murganho Transgénico

Crê-se que as colectinas têm papéis importantes na imunidade básica. Adicionalmente, uma vez que se concebe que a nova colectina da presente invenção forma um aglomerado geneticamente independente das colectinas convencionais, é produzido um animal não humano transgénico desta nova colectina de modo a obter novo conhecimento sobre a imunidade e para proporcionar ferramentas importantes para a elucidação dos mecanismos de acção da nova colectina. É construído um plasmídeo, que é capaz de expressar a nova colectina derivada de ser humano da presente invenção num murganho. Primeiro, é removido um fragmento de 2,3 kb por digestão com Sal I/Pst I de um vector de expressão de animal mamífero compreendendo um promotor da β-actina de galinha e um intensificador de citomegalovírus a montante do promotor da β-actina (Niwa, H. et al., Gene, 108:193-200, 1991), que é introduzido no sítio Sal I/Pst I de um vector de clonagem pBluescript (Stratagene), resultando na construção do vector pBsCAG-2. Neste fragmento de 2,3 kb, estão contidos o intensificador/promotor descrito acima e uma porção do gene da β-globina de coelho (o segundo intrão, o terceiro exão, e a região 3' não codificante). O ADNc de hCL-Pl (SEQ ID N°: 1, 670-1698) é introduzido num sítio Eco RI do terceiro exão descrito acima, e é construído um plasmídeo ρβΑ/hCL-Pl para utilização em expressão num murganho transgénico. 63

Em seguida, é preparada uma grande quantidade de plasmídeo ρβΑ/hCL-Pl através de um método SDS-alcalino, e o plasmideo é purificado através do método de ultracentrifugação em gradiente de densidade de CsCl em equilíbrio. Um gene é isolado através de digestão de ρβΑ/hCL-Pl com Sal I/Bam Hl, assim a porção do vector é removida. Subsequentemente, o gene é separado do fragmento de ADN do através de electroforese em gel de agarose, e é removido do gel o fragmento de ADN introduzido, seguido por purificação do fragmento ADN utilizando o GeneClean II Kit. Após precipitação com etanol, o fragmento de ADN é dissolvido em solução de ADN para injecção (10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 0,25 mM de EDTA), seguido por centrifugação a 15000 rpm durante 5 minutos e é recuperado o sobrenadante. A concentração de ADN é calculada através da medição da absorvência utilizando um espectrofotómetro, e após ajuste da concentração a 500 moléculas de ADN/pL, a solução é dispensada para 50 mL, e armazenada a -20 °C até o ADN ser introduzido no embrião da primeira fase de um murganho.

Em seguida, são preparados óvulos fertilizados de murganho para a injecção de ADN. Primeiro, de modo induzir superovulação num murganho fêmea para utilização como recolha de óvulos fertilizados, são administrados intraperitonealmente 5 IU/corpo de gonadotrofina de soro de égua grávida (PMSG) e gonadotrofina coriónica humana (hCG) em intervalos de 48 horas, e o murganho fêmea é submetido a co-habitação com um murganho macho. A cavidade abdominal do murganho fêmea é aberta, no qual é formado rolhão vaginal, depois a trompa de Falópio é eviscerada, lavada com meio BWW-Hepes (contendo 102,2 mM de NaCl, 4,78 mM de KC1, 1,19 mM de KH2P04, 1,17 mM de CaCl2, 1,19 mM de MgS04, 4, 7 6 mM de NaHC03, 15 mM de Hepes, 25 mM de lactato de sódio, 0,25 mM de piruvato de sódio, 5,56 mM de glucose, 4 mg/mL de BSA, 0,1 mM de EDTA e 0,00025% de vermelho fenol), posteriormente, colocada em meio BWW-Hepes incluindo 300 mg/mL de hialuronidase. A ampola da 64 trompa de Falópio é cortada por uma pinça de relojoeiro sob um microscópio estereoscópico, depois o óvulo fertilizado é desalojado no meio, recolhido com uma pipeta de vidro, e lavado cinco vezes em meio BWW-Hepes. Posteriormente, o óvulo fertilizado é colocado numa gota de meio de BWW coberto por óleo mineral, e cultivado a 37 °C sob uma condição de 5% de C02 numa incubadora.

Subsequentemente, o ADN é injectado no pronúcleo do óvulo fertilizado. Numa placa de petri de 60 mm, é produzida uma gota de meio BWW-Hepes e solução de ADN (500 moléculas de ADN /pL) , coberta com óleo mineral. Utilizando injectores equipados respectivamente com uma pipeta de injecção e uma pipeta de suporte, o óvulo fertilizado entra na gota através do meio BWW-Hepes. A solução de ADN é aspirada na pipeta de injecção, e o injector é ajustado para estar a pressão ligeiramente positiva, de modo que a solução de ADN seja deixada fluir continuamente da ponta. O óvulo fertilizado é sugado pela pipeta de suporte de modo que o pronúcleo masculino seja posicionado no lado da pipeta de injecção, e depois a ampliação da lente objectiva é alterada para 40 vezes por focagem do pronúcleo, a posição da ponta da pipeta de injecção é ajustada ao mesmo plano do pronúcleo.

Subsequentemente, a ponta da pipeta de injecção é penetrado no pronúcleo, e a solução de ADN é injectada. Após ser confirmada a dilatação do núcleo, a pipeta é removida rapidamente, depois o óvulo injectado é movido para a gota inferior, e manipulado de modo a ser evitada a mistura com óvulos não tratados. Cerca de 30 óvulos são submetidos a uma injecção, subsequentemente movidos para uma gota de meio BWW, e cultivados a 37 °C sob uma condição de 5% de C02 numa incubadora. 65

Após cultivo, é realizada a transplantação dos óvulos fertilizados para a trompa de Falópio. 0 líquido de injecção nembutal é diluído 10 vezes por um diluente (a uma concentração final de 5 mg/mL) , e 0,01 mL da solução são administrados intraperitonealmente por 1 kg de peso, para anestesiar um murganho pseudográvida. Cerca de 30 óvulos são injectados numa abertura uterina da trompa de Falópio, utilizando uma pipeta de transferência que previamente sugou os óvulos aí para dentro conjuntamente com o menos possível de meio (0,5-1,0 mL). O ovário e a trompa de Falópio são retornados para dentro do corpo, e a abertura é suturada. Subsequentemente, a procriação é continuada, e aproximadamente 19 dias mais tarde, nasce um recém-nascido. O rastreio do murganho transgénico é realizado por hibridação por transferência em gota como se segue. O recém-nascido obtido é desmamado quatro semanas após o nascimento, do qual a cauda é cortada a cerca de 1 cm do topo sob anestesia, e o pedaço é colocado num tubo Eppendorf de 1,5 mL. É adicionado tampão STE (50 mM de Tris-HCl, 100 mM de EDTA (pH 7,5), 0,5% (p/v) de SDS) contendo 0,5 mg/mL de proitenase K a 0,5 mL para o tubo, que é submetido a agitação a 55 °C numa incubadora, de um dia para o outro. Cem pL da solução do pedaço da cauda são transferidos para um novo tubo, depois são aí adicionados 200 pL de fenol saturado com TE e 110 pL de tampão TE, seguido por submissão ao misturador de vórtice durante 5 minutos, e a mistura foi centrifugada a 15000 rpm (20000 x g) durante 5 minutos à temperatura ambiente. Duzentos pL da camada aquosa assim resultante são transferidos para um novo tubo, e são aí adicionados 200 pL de fenol/clorofórmio, seguido por submissão ao misturador de vórtice durante 5 minutos, e a mistura é centrifugada a 15000 rpm (20000 x g) durante 5 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante é transferido para um novo tubo, são aí adicionados 20 pL de acetato de sódio a 3 M e 500 66 pL de etanol, depois a mistura é suficientemente agitada para misturar até que possa ser observada visualmente a precipitação filamentosa de ADN, posteriormente submetido a centrifugação a 15000 rpm (20000 x g) a 4 °C durante 5 minutos. Após remoção do sobrenadante, seguido por lavagens com 70% de etanol, e secagem durante 5 minutos, o precipitado de ADN é dissolvido em 100 pL de solução de 2 M de NaCl, 0,1 M de NaOH. Após aquecimento durante 5 minutos num banho de água fervente, o ADN é rapidamente arrefecido em água gelada, resultando assim em desnaturação do ADN. Após o colector de 96 poços estar montado, o ADN é gotejado numa membrana de nylon, depois a membrana é seca ao ar, e aquecida a 80 °C durante 2 horas. A hibridação é realizada através de um método convencional utilizando como uma sonda, uma porção sem uma sequência derivada de murganho entre o ADN introduzido. Como resultado, o indivíduo em que o sinal pode ser confirmado é identificado como murganho transgénico.

Quando a manipulação da injecção génica é assim realizada nos óvulos fertilizados, cerca de 90% dos óvulos fertilizados sobrevivem. Todos estes óvulos sobreviventes são transplantados em receptores a aproximadamente 25 óvulos por animal, de modo que as receptoras se tornem grávidas, e a cerca do 19° dia de gravidez, pode ser obtido um recém-nascido. É realizada análise genética deste murganho recém-nascido, e é confirmada a existência do gene introduzido. Além disso, é obtido o murganho F1 a partir destes murganhos transgénicos, e é também examinada a taxa de transmissão do transgene.

Exemplo 15: Produção de um murganho inactivado

Primeiro, a construção do ADN para direccionamento é conduzida por incorporação de um gene resistente à neomicina, que é um gene marcador de selecção, numa porção de exão de uma 67 parte do gene objectivo codificando um homólogo de murganho de uma nova colectina da presente invenção, em células ES derivadas da estirpe de murganho C57BL/6J. Em seguida, é realizada electroporação do ADN nas células ES como se segue. 0 meio das células ES numa fase de crescimento logarítmico (uma placa de petri de 90 mm) é mudado para um meio de ES fresco (80% de meio DMEM contendo 20% de FCS, 1 mM de solução de ácido pirúvico, 0,1 mM de solução de aminoácidos não essenciais e 1 mM de 2-mercaptoetanol), seguida por cultura adicional durante 4 horas, depois, após remoção do meio e lavagens suficientes com PBS (-), as células são tratadas com 0,1% de tripsina durante 3 minutos. As células são adicionadas com 1 mL de meio, depois dispersas em células isoladas, centrifugadas a 600 rpm a 4 °C durante 5 minutos, depois, após rejeitar o sobrenadante, as células são suspensas em 5 mL de PBS (-) , e é contado número de células. Novamente, as células são centrifugadas a 600 rpm a 4 °C durante 5 minutos, e o sobrenadante é rejeitado, posteriormente as células são suspensas em PBS(-) para estarem a 1,1 x 107 células/mL. Da suspensão a 1,1 x 107 células/mL, são transferidos 0,9 mL para uma cuvete, que foi adicionada com 25 pL (25 pg) de solução de ADN a 1 pg/pL (para direccionamento), e deixada a repousar à temperatura ambiente durante 5 minutos. A electroporação é realizada utilizando um pulsador génico sob uma condição de 500 pF e 230 V, seguido por repouso durante 5 minutos, as células são suspensas em meio de ES (-G418), e cada porção de 1/4 inoculada em quatro placas de petri (90 mm) que foram plaqueadas com células alimentadoras. Após a electroporação ter terminado, seguido por cultura durante 24 horas, o meio é mudado para meio de ES contendo 150 pg/mL de G418 (tipo activo) , e o meio é mudado todos os dias seguintes. Sete dias mais tarde, a clonagem é realizada como se segue. O meio é removido da placa de petri de 90 mm em que a colónia apareceu, e são dispensados 10 mL de PBS (-) . As colónias 68 com boas formas, observadas sob um microscópio estereoscópico, são raspadas com uma ponta, sugadas, e cada uma das colónias é respectivamente transferida para uma placa de 96 poços, em que foram previamente colocados 70 pL de solução de tripsina a 0,1%. A placa é deixada repousar a 37 °C durante 4-5 minutos como está, seguida por tripsinização, e após a pipetagem ser suficientemente conduzida utilizando uma 8 Channel Pipetman, as células são inoculadas em quatro poços de uma placa de 24 poços (com células alimentadoras adsorvidas) em que foi previamente colocado 0,8 mL de meio de ES contendo 75 pg/mL de G418. Após cultura durante 24 horas, o meio é mudado para meio de ES contendo 75 pg/mL de G418. Três dias mais tarde, são adicionados 100 pL de 0,1% de tripsina ao clone numa fase de crescimento logarítmico, e depois são ai adicionados 100 pL de meio de ES seguido por pipetagem, e o clone é transferido para uma placa de 96 poços de fundo redondo. Quando todos os 48 clones são tratados, são removidos 20 pL para cultura, enquanto que os restantes 180 pL são utilizados para PCR.

Depois do clone para PCR, na placa de 96 poços, ser centrifugado a 1200 rpm, a 4 ° C durante 5 minutos , o meio é removido, e as células são lavadas três vezes com PBS (-) . São adicionados ao clone cem pL da solução dissolvente (100 mM de

Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM de EDTA, 0,2% (p/v) de SDS, 100 mM de

NaCl, 100 pg/mL de proteinase K) utilizando uma 8 Channel Pipetman, assim o tratamento com proteinase K é realizado a 55 °C durante 1 hora. A placa é selada com uma fita aderente em torno da placa, e incubada adicionalmente a 95 °C durante 15 minutos para inactivação completa da proteinase K. A placa é arrefecida a 4 °C durante 5 minutos, são recolhidos 2-3 pL da solução como uma amostra para PCR, e utilizados para o primeiro rastreio (a solução restante é armazenada a -20 °C) . A amostra pode ser um grupo consistindo de 4 clones, e a PCR é realizada utilizando um iniciador com sentido (atgcaacaagatttgatgagg (SEQ 69 ID N°: 28) e um iniciador anti-sentido (cctacccggtagaattgacc (SEQ ID N°: 29), seguido por identificação dos grupos positivos através de determinação do gene objectivo através do método da electroforese. Entre as amostras restantes que foram conservadas a -20 °C, cada clone pertencente aos grupos positivos é similarmente submetido a PCR, e são identificados os clones positivos. Em seguida, é realizado o rastreio dos clones para utilização na cultura. São inoculados vinte pL do clone para cultura em quatro poços/linha de uma placa de 24 poços (com as células alimentadoras adsorvidas), e quando todos os poços estão cheios, a placa é colocada numa incubadora de C02 e cultivada, depois numa fase final, um clone é dividido em três poços e sucessivamente inoculado num placa de 6 poços (com as células alimentadoras adsorvidas). A produção de um murganho quimérico de linha germinal é realizada através de um método de sanduíche onde uma massa de células ES, em que um gene é introduzido, é ensanduichada entre dois pedaços de embriões com 2,5 dias (embrião na fase de 8 células) de um murganho, que são preparados como descrito abaixo. A preparação do embrião com 2,5 dias é conduzida como se segue. São administrados intraperitonealmente cinco IU de PMSG (gonadotrofina de soro de égua grávida) num murganho fêmea da estirpe C57BL 6J para utilização na recolha de óvulos, 6 dias antes de ser conduzida a adesão com as células ES de 2,5 dias. Nos 4 dias antes são adicionalmente administrados intraperitonealmente 5 IU de hCG (gonadotrofina coriónica humana), e o murganho é conduzido a acasalamento com um macho. Nos 3 dias antes, o acasalamento é confirmado pelo rolhão vaginal, e um murganho fêmea como pseudográvida estando naturalmente no cio é conduzido o acasalamento com murganho macho submetido a vasoctomia. O acasalamento é confirmado por 70 formação do rolhão vaginal, assim o murganho fêmea é identificado como um murganho pseudográvida. No dia da adesão, o murganho fêmea para recolha de óvulos é submetido a eutanásia por deslocamento das vértebras cervicais, e são removidos o útero e a trompa de Falópio. O útero e a trompa de Falópio são submetidos a refluxo com meio BWW-Hepes, são recolhidos embriões com 2,5 dias (embriões na fase de 8 células, ou embriões em mórula) , transferidos para uma gota de meio BWW, e cultivados numa incubadora de C02 (5% de C02, 37 °C) . Os óvulos são recolhidos, e os embriões com 2,5 dias são transferidos para uma gota de uma solução acidica de Tyrode (200 pL), deixados repousar durante 1-2 minutos, posteriormente, quando a zona clara é dissolvida, os óvulos são imediatamente lavados seis vezes com meio BWW-Hepes e são utilizados para adesão com as células ES. A preparação de células ES é conduzida como se segue. No dia da adesão, as células ES cultivadas sobre células alimentadoras são lavadas duas vezes com PBS(-), submetidas a tripsinização com tripsina liquida a 0,05% durante 2 minutos, e raspadas da placa de petri produzindo uma massa de diversas dezenas de células. É adicionado meio de ES (-G418) às células para inactivar a tripsina, e após centrifugação, as células são suspensas em meio de ES. São inoculadas num placa de petri coberta com 0,1% de gelatina, e deixadas repousar durante 15 minutos numa incubadora de C02. São recolhidas as células não aderidas à placa, e estas células são utilizadas para a preparação de um quimérico agregado. A adesão entre os embriões com 2,5 dias e as células ES é realizada como se segue. Primeiro, são feitos poços no fundo de uma placa de petri, para cultura bacteriana, utilizando uma agulha. O poço é coberto com uma gota de 2 0 pL de meio BWW, e 71 coberto adicionalmente com óleo mineral. Depois, a placa é colocada numa incubadora de C02, e o meio é assim equilibrado às condições. As massas consistindo de 10-20 células ES possuindo uma boa forma são seleccionadas sob um microscópio estereoscópico. Aquelas massas de células ES são colocadas nos poços preparados como acima, um a um. Os embriões com 2,5 dias, dos quais foram removidas as zonas claras, são colocados nos poços a 2 embriões por poço para conseguir adesão à massa de células ES. A placa é cultivada de um dia para o outro numa incubadora de C02, e resultou num blastocisto que tem um tamanho quase equivalente àquele de 2 pedaços.

Em seguida, os embriões com 3,5 dias são transplantados no útero. É administrado intraperitonealmente uma solução parentérica de nembutal (50 pg por 1 g de peso corporal) a um murganho pseudográvida (2,5 dias após acasalamento) para anestesiamento. O lado dorsal do murganho anestesiado é dissecado, e o útero é extraido agarrando a massa gorda. Os blastocistos ou mórulas preparados por cultivo de um dia para o outro são sugados conjuntamente com uma pequena quantidade de meio (0,5-1,0 pL) em 10-15 pedaços cada, numa pipeta, posteriormente, aqueles embriões são transplantados num útero furando a parede uterina numa parte perto da trompa de Falópio com uma agulha de seringa, e introduzindo uma pipeta através da abertura seguido por injecção. O útero é retornado para dentro do corpo, e a abertura é suturada, subsequentemente, aproximadamente 18 dias mais tarde, nasce um recém-nascido.

Após ser confirmada a transmissão à linha germinal, os murganhos que são heterólogos entre si são cruzados para resultar em homogeneização, e de acordo com o exposto, é obtido um murganho inactivado objectivo que não expressa um homólogo de uma nova colectina da presente invenção. 72 [Aplicabilidade Industrial]

Como apresentado acima, é proporcionado pela presente invenção uma nova colectina e um gene codificando a nova colectina possuindo estruturas caracteristicas das colectinas que demonstraram apresentar actividades antibacterianas, antivirais, que são diferentes das colectinas até agora descritas. A informação de sequência apresentada pela presente invenção é útil para investigar mecanismos de sistemas de defesa biológicos, e pode proporcionar ferramentas médicas, experimentais, em que são utilizadas as actividades biológicas da nova colectina. Por exemplo, podem ser proporcionados vectores que podem expressar a nova colectina, células hospedeiras compreendendo o vector com praticabilidade de expressão, anticorpos para a nova colectina, assim como sondas para rastrear as espécies moleculares relacionadas da nova colectina.

Além disso, são descritos animais transgénicos não humanos, e animais inactivados não humanos, que podem ser utilizados como animais de modelo de doença para estudos em funções, ou regulação de expressão da nova colectina e/ou das moléculas derivadas, para elucidar os mecanismos envolvidos em doenças relacionadas com as células em que essas moléculas são expressas no ser humano, e para rastreio e teste de segurança de produtos farmacêuticos. 73

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> FUSO PHARMACEUTICALS INDUSTRIES, LTD. <120> Nova Colectina

<130> 99P147WO <150> JP 10-237611 <151> 1998-08-24 <160> 29 <210> 1 <211> 2024

<212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (670)..(1695) <4 0 0> 1 gtcacgaatc tgcagcaaga taccagcgtg ctccagggca atctgcagaa ccaaatgtat 60 tctcataatg tggtcatcat gaacctcaac aacctgaacc tgacccaggt gcagcagagg 120 aacctcatca cgaatctgca gcggtctgtg gatgacacaa gccaggctat ccagcgaatc 180 aagaacgact ttcaaaatct gcagcaggtt tttcttcaag ccaagaagga cacggattgg 240 ctgaaggaga aagtgcagag cttgcagacg ctggctgcca acaactctgc gttggccaaa 300 gccaacaacg acaccctgga ggatatgaac agccagctca actcattcac aggtcagatg 360 74 420 gagaacatca ccactatctc tcaagccaac gagcagaacc tgaaagacct gcaggactta cacaaagatg cagagaatag aacagccatc aagttcaacc aactggagga acgcttccag 480 ctctttgaga cggatattgt gaacatcatt agcaatatca gttacacagc ccaccacctg 540 cggacgctga ccagcaatct aaatgaagtc aggaccactt gcacagatac ccttaccaaa 600 cacacagatg atctgacctc cttgaataat accctggcca acatccgttt ggattctgtt 660 tctctcagg atg caa caa gat ttg atg agg tcg agg tta gac act gaa gta 711 Met Gin Gin Asp Leu Met Arg Ser Arg Leu Asp Thr Glu Vai 1 5 10 gcc aac tta tca gtg att atg gaa gaa atg aag cta gta gac tcc aag 759

Ala Asn Leu Ser Vai Ile Met Glu Glu Met Lys Leu Vai Asp Ser Lys 15 20 25 30 cat ggt cag ctc ate aag aat ttt aca ata cta caa ggt cca ccg ggc 807

His Gly Gin Leu I1e Lys Asn Phe Thr Ile Leu Gin Gly Pro Pro Gly 35 40 45 ccc agg ggt cca aga ggt gac aga gga tcc cag gga ccc cct ggc cca 855

Pro Arg Gly Pro Arg Gly Asp Arg Gly Ser Gin Gly Pro Pro Gly Pro 50 55 60 act ggc aac aag gga cag aaa gga gag aag ggg gag cct gga cca cct 903

Thr Gly Asn Lys Gly Gin Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Pro Pro 65 70 75 ggc cct gcg ggt gag aga ggc cca att gga cca gct ggt ccc ccc gga 951

Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly 80 85 90 gag cgt ggc ggc aaa gga tet aaa ggc tcc cag ggc ccc aaa ggc tcc 999

Glu Arg Gly Gly Lys Gly Ser Lys Gly Ser Gin Gly Pro Lys Gly Ser 95 100 105 110 cgt ggt tcc cct ggg aag ccc ggc cct cag ggc ccc agt ggg gac cca 1047

Arg Gly Ser Pro Gly Lys Pro Gly Pro Gin Gly Pro Ser Gly Asp Pro 75 ggc ccc ccg ggc cca cca ggc aaa gag gga ctc ccc ggc cct cag ggc 1095

Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Glu Gly Leu Pro Gly Pro Gin Gly 130 133 140 cct cct ggc ttc cag gga ctt cag ggc acc gtt ggg gag cct ggg gtg 1143 Pro Pro Gly Phe Gin Gly Leu Gin Gly Thr Vai Gly Glu Pro Gly Vai 145 150 155 cct gga cct cgg gga ctg cca ggc ttg cct ggg gta cca ggc atg cca 1191

Pro Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly Vai Pro Gly Met Pro 160 165 170 ggc ccc aag ggc ccc ccc ggc cct cct ggc cca tca gga gcg gtg gtg 1239 Gly Pro Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ala Vai Vai 175 180 185 190 ccc ctg gcc ctg cag aat gag cca acc ccg gca ccg gag gac aat ggc 1287 Pro Leu Ala Leu Gin Asn Glu Pro Thr Pro Ala Pro Glu Asp Asn Gly 195 200 205 tgc ccg cct cac tgg aag aac ttc aca gac aaa tgc tac tat ttt tca 1335 Cys Pro Pro His Trp Lys Asn Phe Thr Asp Lys Cys Tyr Tyr Phe Ser 210 215 220 gtt gag aaa gaa att ttt gag gat gca aag ctt ttc tgt gaa gac aag 1383

Vai Glu Lys Glu Ile Phe Glu Asp Ala Lys Leu Phe Cys Glu Asp Lys 225 230 235 tct tca cat ctt gtt ttc ata aac act aga gag gaa cag caa tgg ata 1431

Ser Ser His Leu Vai Phe Ile Asn Thr Arg Glu Glu Gin Gin Trp Ile 240 245 250 aaa aaa cag atg gta ggg aga gag age cac tgg ate ggc ctc aca gac 1479

Lys Lys Gin Met Vai Gly Arg Glu Ser His Trp Ile Gly Leu Thr Asp 255 260 265 270 tca gag cgt gaa aat gaa tgg aag tgg ctg gat ggg aca tct cca gac 1527

Ser Glu Arg Glu Asn Glu Trp Lys Trp Leu Asp Gly Thr Ser Pro Asp 76 275 280 285 tac aaa aat tgg aaa gct gga cag ccg gat aac tgg ggt cat ggc cat lo7o

Tyr Lys Asn Trp Lys Ala Gly Gin Pro Asp Asn Trp Gly His Gly His 290 295 300 ggg cca gga gaa gac tgt gct ggg ttg att tat gct ggg cag tgg aac 1623

Gly Pro Gly Glu Asp Cys Ala Gly Leu Ile Tyr Ala Gly Gin Trp Asn 305 310 315 gat ttc caa tgt gaa gac gtc aat aac ttc att tgc gaa aaa gac agg 1671

Asp Phe Gin Cys Glu Asp Vai Asn Asn Phe Ile Cys Glu Lys Asp Arg 320 325 330 gag aca gta ctg tca tct gca tta taacggactg tgatgggatc acatgagcaa 1725

Glu Thr Vai Leu Ser Ser Ala Leu 335 340 attttcagct ctcaaaggca aaggacactc ctttctaatt gcatcacctt ctcatcagat 1785 tgaaaaaaaa aaaagcactg aaaaccaatt actgaaaaaa aattgacagc tagtgttttt 1845 taccatccgt cattacccaa agacttggga actaaaatgt tccccagggt gatatgctga 1905 ttttcattgt gcacatggac tgaatcacat agattctcct ccgtcagtaa ccgtgcgatt 1965 atacaaatta tgtcttccaa agtatggaac actccaatca gaaaaaggtt atcatcccg 2024 <210> 2 <211> 547

<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Sequência de Aminoácidos Deduzida da Nova Colectina a partir da Sequência de Nucleótidos <400> 2 77

Met Tyr Ser His Asn Vai Vai Ile Met Asn Leu Asn Asn Leu Asn Leu

15 10 IS

Thr Gin Vai Gin Gin Arg Asn Leu Ile Thr Asn Leu Gin Arg Ser Vai 20 25 30

Asp Asp Thr Ser Gin Ala Ile Gin Arg Ile Lys Asn Asp Phe Gin Asn 35 40 45

Leu Gin Gin Vai Phe Leu Gin Ala Lys Lys Asp Thr Asp Trp Leu Lys 50 55 60

Glu Lys Vai Gin Ser Leu Gin Thr Leu Ala Ala Asn Asn Ser Ala Leu 65 70 75 80

Ala Lys Ala Asn Asn Asp Thr Leu Glu Asp Met Asn Ser Gin Leu Asn 85 90 95

Ser Phe Thr Gly Gin Met Glu Asn Ile Thr Thr Ile Ser Gin Ala Asn 100 105 110

Glu Gin Asn Leu Lys Asp Leu Gin Asp Leu His Lys Asp Ala Glu Asn 115 120 125

Arg Thr Ala Ile Lys Phe Asn Gin Leu Glu Glu Arg Phe Gin Leu Phe 130 135 140

Glu Thr Asp Ile Vai Asn Ile Ile Ser Asn Ile Ser Tyr Thr Ala His 145 150 155 160

His Leu Arg Thr Leu Thr Ser Asn Leu Asn Glu Vai Arg Thr Thr Cys 165 170 175

Thr Asp Thr Leu Thr Lys His Thr Asp Asp Leu Thr Ser Leu Asn Asn 180 185 190

Thr Leu Ala Asn Ile Arg Leu Asp Ser Vai Ser Leu Arg Met Gin Gin 195 200 205

Asp Leu Met Arg Ser Arg Leu Asp Thr Glu Vai Ala Asn Leu Ser Vai 210 215 220

Ile Met Glu Glu Met Lys Leu Vai Asp Ser Lys His Gly Gin Leu Ile 78 235 230 225 230 235 240

Lys Asn Phe Thr Ile Leu Gin Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Pro Arg 245 250 255

Gly Asp Arg Gly Ser Gin Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly Asn Lys Gly 260 265 270

Gin Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu 275 280 285

Arg Gly Pro Ile Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Gly Lys 290 295 300

Gly Ser Lys Gly Ser Gin Gly Pro Lys Gly Ser Arg Gly Ser Pro Gly 305 310 315 320

Lys Pro Gly Pro Gin Gly Pro Ser Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Pro 325 330 335

Pro Gly Lys Glu Gly Leu Pro Gly Pro Gin Gly Pro Pro Gly Phe Gin 340 345 350

Gly Leu Gin Gly Thr Vai Gly Glu Pro Gly Vai Pro Gly Pro Arg Gly 355 360 365

Leu Pro Gly Leu Pro Gly Vai Pro Gly Met Pro Gly Pro Lys Gly Pro 370 375 380

Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ala Vai Vai Pro Leu Ala Leu Gin 385 390 395 400

Asn Glu Pro Thr Pro Ala Pro Glu Asp Asn Gly Cys Pro Pro His Trp 405 410 415

Lys Asn Phe Thr Asp Lys Cys Tyr Tyr Phe Ser Vai Glu Lys Glu Ile 420 425 · 430

Phe Glu Asp Ala Lys Leu Phe Cys Glu Asp Lys Ser Ser His Leu Vai 435 440 445

Phe Ile Asn Thr Arg Glu Glu Gin Gin Trp Ile Lys Lys Gin Met Vai 450 455 460 79

Gly Arg Glu Ser His Trp Ile Gly Leu Thr Asp Ser Glu Arg Glu Asn 465 470 475 480 Glu Trp Lys Trp Leu Asp Gly Thr Ser Pro Asp Tyr Lys Asn Trp Lys 485 490 495 Ala Gly Gin Pro Asp Asn Trp Gly His Gly His Gly Pro Gly Glu Asp 500 505 510 Cys Ala Gly Leu Ile Tyr Ala Gly Gin Trp Asn Asp Phe Gin Cys Glu 515 520 525 Asp Vai Asn Asn Phe Ile Cys Glu Lys Asp Arg Glu Thr Vai Leu Ser 530 535 540 Ser Ala Leu 545 <210> 3 <211> 27

<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0>

Colectinas <223> Sequência de Consenso Modificada de

Hibridável com a Nova Colectina <4 0 0> 3

Glu Lys Cys Vai Glu Met Tyr Thr Asp Gly Lys Trp Asn Asp Arg Asn 1 5 10 15

Cys Leu Gin Ser Arg Leu Ala Ile Cys Glu Phe 20 25 80 <210> 4 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de um Iniciador Reverso para Rastreio de uma

Nova Colectina <4 0 0> 4 caatctgatg agaaggtgat g <210> 5 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de um Iniciador para a Frente para Rastreio de uma Nova Colectina <4 0 0> 5 acgaggggct ggatgggaca t <210> 6 <211> 27 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de Consenso de três colectinas que foram até agora descritas 81 6 <4 Ο 0>

Glu Asp Cys Vai Leu Leu Leu Lys Asn Gly Gin Trp Asn Asp Vai Pro 1 5 10 15

Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Vai Cys Glu Phe 20 25 <210> 7 <211> 24

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência do Iniciador Universal de M13 para

Sequenciação <4 0 0> 7 cgacgttgta aaacgacggc cagt 24 <210> 8 <211> 17

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência do Iniciador Reverso de M13 para Sequenciação <4 0 0> 8 caggaaaca gctatgac 82 <210> 9 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de um Iniciador Reverso de Xgtll para

Sequenciação <4 0 0> 9 ttgacaccag accaactggt aatg <210> 10 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de um Iniciador para a Frente de Xgtll para

Sequenciação <4 0 0> 10 ggtggcgacg actcctggag cccg <210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> 83 <223> Sequência de um Iniciador para Rastreio de uma Nova

Colectina <4 0 0> 11 cgtgaaaatg aatggaagtg g 21 <210> 12 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de um Iniciador para Rastreio de uma Nova

Colectina <4 0 0> 12 ttttatccat tgctgttcct c 21 <210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de um Iniciador para Sequenciação de uma Nova

Colectina <4 0 0> 13 ctggcagtcc ccgaggtcca g 21 <210> 14 <211> 21 84

ADN <212> <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de um Iniciador para Sequenciação de uma Nova

Colectina <4 0 0> 14 gctggtcccc ccggagagcg t 21 <210> 15 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Site Sequência de um Iniciador 1RC2 para Sequenciação de Cap <4 0 0> 15 caaggtacgc cacagcgtat g <210> 16 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de um Iniciador TGP1 Sintético para

Sequenciação de Cap Site <4 0 0> 16 85 tcttcagttt ccctaatccc 20 <210> 17 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de um Iniciador 2RC2 para Sequenciação Site <4 0 0> 17 gtacgccaca gcgtatgatg c 21 de Cap <210> 18 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de um Iniciador TGP2 Sintético para

Sequenciação de Cap Site <4 0 0> 18 cattcttgac aaacttcata g <210> 19 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> 86 <223> Sequência de um Iniciador para Rastreio de uma Nova

Colectina <400> 19 gaagacaagt cttcaactct tg 22 <210> <211> <212> <213> 20 22

ADN

Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de um Iniciador para Rastreio de uma Nova

Colectina <4 0 0> 20 ctctgagtct gtgaggccga tc <210> 21 <211> Hl

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de uma Sonda para Rastreio de uma Nova

Colectina <400> 21 gaagacaagt cttcacatct tgttttcata aacactagag aggaacagca atggataaaa 60 aaacagatgg tagggagaga gagccactgg atcggcctca cagactcaga g 111 <210> 22 87 <211 > 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de um Iniciador para a Frente para Rastreio de uma Nova Colectina <4 0 0> 22 gtgcccctgg ccctgcagaa tg <210> 23 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de um Iniciador Reverso para Rastreio de uma

Nova Colectina <4 0 0> 23 gcatatcacc ctggggaaca ttttag <210> 24 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de um Iniciador Sentido para Rastreio da β-actina 88 24 <4 Ο 0> caagagatgg ccacggctgc t <210> 25 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> β-actina Sequência de um Iniciador Anti-Sentido para Rastreio <4 0 0> 25 tccttctgca tcctgtcggc a 21 <210> 26 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de um Iniciador Sentido para Amplificação Nova Colectina <4 0 0> 26 aaggaaaaaa gcggccgcat gcaacaagat ttgatgagg 39 <210> 27 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial 89 <22 0> <223> Sequência de um Iniciador Reverso para Amplificação da

Nova Colectina <4 0 0> 27 gctctagatt ataatgcaga tgacagtac 29 <210> 28 <211> 21

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência de um Iniciador Sentido para Amplificação do

Gene Inactivado <4 0 0> 28 atgcaacaag atttgatgag g 21 <210> 29 <211> 20

Gene Inactivado <400> 29 cctacccggt agaattgacc 20

Lisboa, 12 de Janeiro de 2007 90

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Nova colectina consistindo da sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 2, resíduos 206-547.
2. Nova colectina consistindo da sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 2, resíduos 229-547.
3. Nova colectina de acordo com a reivindicação 2, em que a referida nova colectina consiste ainda de uma sequência de aminoácidos a montante do primeiro resíduo de metionina (SEQ ID N°: 2, resíduo 229) seleccionado da SEQ ID N°: 2, resíduos 226-228, 211-228, 102-228, 91-228, 9-228 e 1-228.
4. Polinucleótido isolado consistindo de uma sequência de nucleótidos que codifica um proteína que tem a sequência de aminoácidos de qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Polinucleótido isolado consistindo de uma nucleótidos que tem a sequência de SEQ ID sequência de N°: 1, bases 670-1695.
6. Polinucleótido isolado consistindo de uma nucleótidos que tem a sequência de SEQ ID sequência de N°: 1, bases 739-1695.
7. Polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 6, consistindo ainda de uma sequência de nucleótidos 5' a montante da referida sequência de nucleótidos que é seleccionada de SEQ ID N°: 1, bases 730-738, 685-738, 358-738, 325-738, 79-738, 55-738 e 1-738. 1
8. Polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7 que consiste ainda da sequência de nucleótidos de SEQ ID N°: 1, bases 1696-2024 a jusante da referida sequência de nucleótidos.
9. Polinucleótido isolado codificando uma nova colectina, que híbrida com uma sonda que é um produto de amplificação de uma PCR realizada utilizando iniciadores que têm as sequências de nucleótidos de SEQ ID N°: 4 e SEQ ID N°: 5, sob as seguintes condições de hibridação: pré-hibridação numa solução de 5 x SSC, 1% de agente de bloqueamento, 0,1% de N-lauroilsarcosina, e 0,02% de SDS, a 68 °C durante uma hora; hibridação numa solução de 5 x SSC, 1% de agente de bloqueamento, 0,1% de N-lauroilsarcosina e 0,02% de SDS contendo sondas de ADNc (10 ng/mL), a 55 °C durante 16 horas; lavagem numa solução de 2 x SSC/0,1% de SDS durante 5 minutos, 2 vezes; e lavagem numa solução de 0,5 x SSC/0,1% de SDS a 55 °C durante 15 minutos, 2 vezes.
10. Polinucleótido que híbrida com qualquer um dos polinucleótidos de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, sob as seguintes condições de hibridação: pré-hibridação numa solução de 5 x SSC, 1% de agente de bloqueamento, 0,1% de N-lauroilsarcosina, e 0,02% de SDS, a 68 °C durante uma hora; hibridação numa solução de 5 x SSC, 1% de agente de bloqueamento, 0,1% de N-lauroilsarcosina e 0,02% de SDS contendo sondas de ADNc (10 ng/mL), a 55 °C durante 16 horas; lavagem numa solução de 2 x SSC/0,1% de SDS durante 5 minutos, 2 vezes; e lavagem numa solução de 0,5 x SSC/0,1% de SDS a 55 °C durante 15 minutos, 2 vezes, em que a proteína codificada pelo referido polinucleótido é uma nova colectina que compreende: (1) um domínio de reconhecimento de hidratos de carbono 2 (CDR), e (2) uma região de tipo dependente de Ca2+ colagénio.
11. Polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 10, em que o referido polinucleótido é ADNc.
12. Nova colectina consistindo da sequência de aminoácidos codificada pelo polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 11.
13. Vector que compreende o polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 11, de um modo que permita a expressão da nova colectina.
14. Célula hospedeira compreendendo o vector de acordo com a reivindicação 13, de um modo que permita a expressão da nova colectina.
15. Sonda para rastrear uma espécie molecular relacionada com a nova colectina consistindo do polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 11.
16. Animal transgénico não humano que é estavelmente introduzido com um gene recombinante compreendendo o polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 11 no cromossoma, e que pode expressar uma nova colectina. Lisboa, 12 de Janeiro de 2007 3