BRPI0903495B1 - microorganismos mutantes com capacidade de produzir putrescina e método para produção de putrescina utilizando os mesmos - Google Patents

Abstract

microorganismos mutantes com capacidade de produzir putrescina e método para produção de putrescina utilizando os mesmos a presente invenção está relacionada a microorganismos mutantes com capacidade de produzir putrescina, em que genes envolvidos na via de degradação ou de utilização de putrescina de microorganismos com via metabólica de produção de putrescina são inativados ou apagados; e a um método para produção de putrescina com alto rendimento através de cultura de microorganismos mutantes. os microorganismos mutantes com capacidade de produzir putrescina são úteis para a produção com alto rendimento de putrescina que é usada em uma ampla variedade de aplicações industriais.

Description

MICROORGANISMOS MUTANTE S COM CAPACIDADE DE PRODUZIR PUTRESCINA E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE PUTRESCINA UTILIZANDO OS MESMOS

CAMPO DA TÉCNICA A presente invenção está relacionada a microorganismos mutantes com capacidade de produzir putrescina e a um método para produção de putrescina usando os mesmos microorganismos e, mais particularmente, para microorganismos mutantes com capacidade de produzir putrescina em cujos genes envolvidos na via de degradação ou de utilização de putrescina são inativados ou apagados e um método para produção de putrescina com alto rendimento através de cultura de microorganismos mutantes.

ANTECENDENTES A putrescina (também conhecida como 1,4-butanodiamina) , uma matéria-prima importante para a produção de poliamida-4,6, incluindo o nylon-4,6, é principalmente produzida em escala industrial pela hidrogenação de acrilonitrila, que é produzida através da adição de cianeto de hidrogênio à acrilonitrila. Processos conhecidos para a síntese química deste composto requerem produtos petroquímicos não renováveis como matéria-prima e condições de reação relativamente severas de temperatura e pressão em um projeto de várias etapas e vários reatores, bem como o uso de sistemas catalíticos caros. Além disso, devido a estas matérias-primas serem altamente tóxicas e inflamáveis, os processos conhecidos de síntese química são desvantajosos em termos ambientais. Consequentemente, como uma alternativa ao processo de produção químico, um processo de produção de putrescina a partir de biomassa renovável derivada de fonte de carbono é requerido. A putrescina é um tipo de poliamina que é encontrada em uma variedade de organismos desde bactérias até animais e plantas. Por exemplo, a putrescina é conhecida por desempenhar um importante papel não somente na proliferação de células e crescimento celular, mas também como um mecanismo de defesa contra o estresse oxidativo (Tkachenko et al., Arch. Microbiol., 176:155-157, 2001). Ao mesmo tempo, os conteúdos intracelulares de poliaminas são rigidamente controlados por suas biossínteses, degradação, degradação, absorção e excreção (Igarashi and Kashiwagi et al., J. Bacteriol., 170(7):3131-3135, 1988). Como é conhecido na técnica, a concentração de putrescina em E. coli é tão extremamente alta quanto cerca de 2,8 g/L. Ainda, os microorganismos têm resistência potencialmente alta para altas concentrações de poliaminas. Por exemplo, Mimitsuka et al. relataram que Corynebacterium glutamicum pode crescer até mesmo na presença de mais de 30 g/L de cadaverina. Consequentemente, estudos com o uso de microorganismos para a produção de altas concentrações de poliaminas (putrescina) estão em andamento. A publicação EP 0726240 Al revela um método para produção de putrescina através de fermentação usando tanto resíduos industriais baratos quanto materiais com proteína como o principal constituinte. No entanto, devido ao fato de os materiais revelados serem muito complexos, há um problema em que várias etapas de purificação precisam ser realizadas para se obter os produtos putrescina e cadaverina. Adicionalmente, a publicação EP 1784496 Al revela um processo de síntese bioquímica de putrescina através de crescimento microbiano em meio salino mínimo contendo glicose como uma fonte de carbono. Nesta publicação para melhorar a conversão de ornitina em putrescina, a atividade da ornitina descarboxilase foi aumentada por superexpressão de um gene speC ou speF que codifica uma ornitina descarboxilase. No entanto, quando o conteúdo de putrescina é aumentado como resultado de uma ornitina descarboxilase aumentada, há alguns problemas em que a biossíntese de putrescina é reduzida e a degradação de putrescina é induzida (Igarashi and Kashiwagi et al., Biochem. J., 347:297-303, 2000).

Estudos sobre a degradação e a utilização de putrescina em microorganismos são os seguintes. Bowman et al. relataram que a espermidina sintase que é um produto do gene speE promove a biossíntese de espermidina a partir de putrescina em E. coli (Bowman et al., J. Biol. Chem. , 248:2480-2486, 1973). A espermidina sintase (EC:2.5.1.16) está presente na maior parte dos sistemas celulares para a síntese de espermidina.

Haywood et al. relataram que a levedura Candida boidinii acetila a putrescina em N-acetilputresina pela N-acetiltransferase. A espermidina acetiltransferase que é o produto do gene speG em E. coli tem alta homologia com a N-acetiltransferase da levedura e, portanto, possui putrescina acetiltransferase (Haywood and Large, Eur. J. Biochem., 148:277-283, 1985).

Além disso, Samsonova et al. relataram outra via de degradação da putrescina onde uma ação de acoplamento da putrescina transaminase YgjG da E. coli e desidrogenase YdcW resultara em conversão de putrescina em ácido γ-aminobutírico sem γ-glutamilação (Samsonova et al., BMC Microbiol., 3:2, 2003; Samsonova et al., FEBS Lett., 579:4107-4112, 2005).

Ainda, Kurihara et al. relataram que a via de degradação da putrescina, a 'via Puu' envolve intermediários γ-glutamilados de E. coli. Através da γ-glutamilação de putrescina nesta via, γ-aminobutiraldeído que é um aldeído intermediário pode ser estabilizado. A γ-glutamilputrescina sintetase que é um produto do gene puuA converte a putrescina em γ-glutamil-L-putrescina enquanto promove a primeira reação desta via. Ainda, foi revelada que a via catabólica é a via principal quando E. coli cresce em um meio contendo putrescina como a única fonte de nitrogênio. Adicionalmente, foi revelado que o importador de putrescina puuP está envolvido na via catabólica e é o principal importador de putrescina quando E. coli cresce em um meio contendo putrescina como a única fonte de nitrogênio (Kurihara et al., J. Biol. Chem., 280:4602-4608, 2005).

Consequentemente, os presentes inventores preparam microorganismos mutantes onde pelo menos um gene selecionado a partir de um gene (speE) que codifica espermidina sintase, um gene (speG) que codifica espermidina N-acetiltransferase, um gene (argl) que codifica ornitina carbamoiltransferase de cadeia monomérica I_e um gene (puuP) que codifica importador de putrescina, que estão envolvidos na via de degradação ou de utilização de putrescina de microorganismos produtores de putrescina, são inativados ou apagados. Além disso, os presentes inventores descobriram que, quando os microorganismos mutantes são cultivados, eles podem produzir putrescina com alto rendimento, completando com isso a presente invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO É um objetivo da presente invenção é fornecer microorganismos mutantes onde pelo menos um gene envolvido na via de degradação ou de utilização da putrescina é apagado e que tenham alta capacidade de produzir putrescina, e um método para preparação dos microorganismos mutantes.

Outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para a produção de putrescina com alto rendimento através da cultura de microorganismos mutantes.

Para atingir os objetivos acima, a presente invenção fornece um microorganismo mutante com capacidade de produzir putrescina onde pelo menos um gene selecionado a partir de um grupo que consiste de um gene (spe£) que codifica espermidina sintase, um gene (speG) que codifica espermidina N-acetiltransferase, um gene (argl) que codifica ornitina carbamoiltransferase de cadeia monomérica I_e um gene (puuP) que codifica importador de putrescina, que estão envolvidos na via de degradação ou de utilização de putrescina de microorganismos produtores de putrescina, são inativados ou apagados, e um método para a produção do microorganismo mutante. A presente invenção também provê um microorganismo mutante com capacidade de produzir putrescina onde pelo menos um gene selecionado a partir do grupo que consiste de um gene (speE) que codifica espermidina sintetase, um gene (speG) que codifica espermidina N-acetiltransferase, um gene (argl) que codifica ornitina carbamoiltransferase cadeia de monômero I e um gene (puuP) que codifica importador de putrescina, que estão envolvidos na via de degradação ou utilização da putrescina, são inativados ou apagados; e onde o promotor de pelo menos um gene selecionado a partir do grupo que consiste de um gene (argECBH) que codifica um operon para a biossíntese de arginina, um gene (argD) que codifica acetilornitina aminotransferase, e um gene (speF-potE) que codifica ornitina descarboxilase induzível e o antiportador putrescina/ornitina são substituídos por um promotor forte, e um método para produção do microorganismo mutante. A presente invenção também provê um microorganismo mutante com capacidade de produzir putrescina onde pelo menos um gene selecionado a partir do grupo que consiste de um gene (spe£) que codifica espermidina sintetase, um gene (speG) que codifica espermidina N-acetiltransferase, um gene (argl) que codifica ornitina carbamoiltransferase cadeia de monômero I e um gene (puuP) que codifica importador de putrescina, que estão envolvidos na via de degradação ou utilização da putrescina, são inativados ou apagados; onde o promotor de pelo menos um gene selecionado a partir do grupo que consiste de um gene (argECBH) que codifica um operon para a biossíntese de arginina, um gene (argD) que codifica acetilornitina aminotransferase, e um gene (speF-potE) que codifica ornitina descarboxilase induzível e o antiportador putrescina/ornitina são substituídos por um promotor forte; e onde o gene (specC) que codifica ornitina descarboxilase é introduzido ou amplificado, e um método para produção do microorganismo mutante. A presente invenção também provê um método para a produção de putrescina, sendo que este método compreende a cultura do microorganismo mutante mencionado para produzir putrescina e, em seguida, a coleta de putrescina a partir do caldo de cultura.

Outras características e aspectos da presente invenção serão mais evidentes a partir da descrição detalhada a seguir e das reivindicações anexadas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. 1 é um diagrama esquemático mostrando uma via para a síntese de putrescina a partir de glicose. A FIG. 2 é um diagrama gráfico que mostra a produção de putrescina a partir das células XQ37/pKKSpeC em fermentação de batelada alimentada usando glicose. A FIG. 3 é um diagrama gráfico que mostra a produção de putrescina a partir das células XQ39 em fermentação de batelada alimentada usando glicose. A FIG. 4 é um diagrama gráfico que mostra a produção de putrescina a partir das células XQ43 em fermentação de batelada alimentada usando glicose. A FIG. 5 é um diagrama que mostra a produção de putrescina a partir das células XQ39/pl5SpeC em fermentação de batelada alimentada usando glicose.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como utilizado neste relatório, o termo "inativado" significa incluir mutação, substituição ou deleção de parte do gene de interesse, ou introdução de uma ou mais bases no gene, para reduzir a atividade de uma enzima, que é expressa pelo gene, bloqueando, portanto, parte ou uma parte substancial da via biossintética onde a enzima do gene está envolvida.

Como utilizado neste relatório, o termo "apagado" significa incluir mutação, substituição ou deleção de parte ou todos os genes de interesse, ou introdução de uma ou mais bases no gene, para que este gene não seja expresso ou não exiba atividade enzimática, mesmo que expresso, bloqueando, portanto, a via biossintética onde o gene está envolvido.

Como utilizado neste relatório, o termo "amplificado" significa incluir mutação, substituição ou deleção de parte do gene de interesse, ou introdução de uma ou mais bases no gene, ou introdução de um gene de outra origem microbiana que codifica a mesma enzima, para aumentar a atividade da enzima correspondente. A FIG. 1 é um diagrama esquemático mostrando uma via para a síntese de putrescina a partir de glicose. Como mostrado na FIG. 1, na presente invenção, descobriu-se que, quando genes (speE, speG, artl e puuP) envolvidos na via de degradação ou de utilização de putrescina de um microorganismo com capacidade de produzir putrescina foram inativados ou apagados, o microorganismo mutante pode produzir putrescina com alto rendimento. Atividades reduzidas dos genes (speE, speG, argl e puuP) envolvidos na via de degradação ou de utilização de putrescina puderam ser confirmadas por reduzida eficiência i transcricional e translacional como comparados àquelas de respectivos genes tipo selvagens.

No capítulo Exemplos do presente relatório, os inventores preparam microorganismos mutantes onde pelo menos um gene selecionado a partir de um gene (speE) que codifica espermidina sintase, um gene (speG) que codifica espermidina N-acetiltransferase, um gene (argl) que codifica ornitina carbamoiltransferase de cadeia monomérica I e um gene (puuP) que codifica importador de putrescina, que estão envolvidos na via de degradação ou de utilização de putrescina, foram inativados ou apagados. Descobriu-se que os microorganismos mutantes preparados tiveram uma capacidade melhorada de produzir putrescina.

Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção está relacionada a um microorganismo mutante com capacidade de produzir putrescina onde pelo menos um gene selecionado a partir do grupo que consiste de um gene (speE) que codifica espermidina sintase, um gene (speG) que codifica espermidina N-acetiltransferase, um gene (argl) que codifica ornitina carbamoiltransferase de cadeia monomérica I e um gene (puuP) que codifica importador de putrescina, que estão envolvidos na via de degradação ou de utilização de putrescina, são inativados ou apagados, e um método para a produção do microorganismo mutante.

No microorganismo mutante da presente invenção, pelo menos um gene selecionado a partir do grupo que consiste de um gene (puuA) que codifica γ-glutamilputrescina sintase, um gene (ygjG) que codifica putrescina transaminase e um gene (argF) que codifica ornitina carbamoiltransferase de cadeia de monômero F pode adicionalmente ser inativado ou apagado. 0 gene (argF) que codifica ornitina carbamoiltransferase de cadeia de monômero F é uma isoenzima do gene (argl) que codifica ornitina carbamoiltransferase de cadeia de monômero I, e o gene (puuA) que codifica γ-glutamilputrescina sintase é um gene vizinho do gene (puuP) que codifica importador de putrescina. Ainda, o gene (ygjG) que codifica putrescina transaminase é um gene que está envolvido na degradação de putrescina.

No microorganismo mutante da presente invenção, um gene (lacl) que codifica um operon lac repressor pode também adicionalmente ser apagado para que a expressão dos genes que codificam as enzimas que estão envolvidas na biossíntese de putrescina seja aumentada. Exemplos de genes que codificam enzimas que estão envolvidas na biossíntese de putrescina incluem gdhA, argA, argB, argC, argD, argE, etc.

No microorganismo mutante da presente invenção, um gene (speC) que codifica ornitina descarboxilase também pode adicionalmente ser introduzido ou amplificado. 0 gene (speC) que codifica ornitina descarboxilase é introduzido na forma de um vetor de expressão contendo um promotor forte. 0 promotor forte pode ser selecionado a partir de um grupo que consiste de um promotor trc, um promotor tac, um promotor lac, um promotor T7 e um promotor trp.

Como o microorganismo da presente invenção, qualquer microorganismo pode ser usado sem limitação particular, desde que produza putrescina a partir da glicose. Exemplos de microorganismos incluem Bacillus sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp., Pichia sp., Pseudomonas sp., Saccharomyces sp., etc.

Na presente invenção, descobriu-se que, no caso do microorganismo mutante onde o gene envolvido na via de degradação ou de utilização da putrescina foi apagado, quando o promotor de um gene (argECBH) foi selecionado a partir de um grupo que consiste de um gene que codifica um operon para a biossíntese de arginina, um gene (argD) que codifica acetilornitina aminotransferase, e um gene (speF-potE) que codifica ornitina descarboxilase induzível e antiportador de putrescina/ornitina foi substituído com um promotor forte, o microorganismo mutante resultante pode produzir putrescina com rendimento maior.

No capítulo Exemplos do relatório, baseados no microorganismo mutante em cujos genes (speE, speG, argl e puuP) envolvidos na via de degradação ou de utilização da putrescina e o gene (lacl) que codifica o operon repressor lac foram apagados, os seguintes microorganismos foram preparados: um microorganismo (XQ33) onde o promotor de um gene (argECBH) que codifica um operon para a biossíntese de arginina foi substituído por um promotor forte (trc); um microorganismo (XQ37) onde os promotores do gene argECBH e um gene (speF-potE) que codificam ornitina descarboxilase induzível e antiportador de putrescina/ornitina foram substituídos por um promotor forte trc; um microorganismo mutante (XQ39) onde o gene argECBH, o gene speF-potE e o gene (argD) que codificam acetilornitina aminotransferase foram substituídos por um promotor forte trc; e um microorganismo mutante (XQ43) onde os promotores de gene argECBH, o gene speF-potE, o gene argD e o gene (speC) que codificam ornitina descarboxilase foram substituídos por um promotor forte (trc). Descobriu-se que as capacidades destes microorganismos de produzir putrescina foram abruptamente aumentadas.

Consequentemente, em outro aspecto, a presente invenção está relacionada a um microorganismo mutante com capacidade de produzir putrescina onde pelo menos um gene selecionado a partir do grupo que consiste de um gene (speE) que codifica espermidina sintetase, um gene (speG) que codifica espermidina N-acetiltransferase, um gene (argl) que codifica ornitina carbamoiltransferase cadeia de monômero I e um gene (puuP) que codifica importador de putrescina, que estão envolvidos na via de degradação ou utilização da putrescina, é inativado ou apagado; e onde o promotor de pelo menos um gene selecionado a partir do grupo que consiste de um gene (argECBH) que codifica um operon para a biossíntese de arginina, um gene (argD) que codifica acetilornitina aminotransferase, e um gene (speF-potE) que codifica ornitina descarboxilase induzível e o antiportador putrescina/ornitina são substituídos por um promotor forte, e um método para produção do microorganismo mutante.

Na presente invenção, o gene (argECBH) que codifica o operon para a biossíntese de arginina é um operon divergente flanqueado por dois promotores convergentes (argEp e argCBHp) e contém um operador. Os dois promotores são reprimidos pela arginina (Charlier and Glansdorff, 2004). Portanto, quando o promotor nativo do operon argECBH é substituído por um promotor forte, o fluxo metabólico para ornitina pode ser aumentado. O gene argE é um gene que codifica N-acetilornitinase, o gene argC é um gene que codifica N-acetilglutamilfosfatase redutase, o gene argB é um gene que codifica N-acetilglutamato quinase e o gene argH é um gene que codifica argininosuccinase. 0 gene (speF-potE) que codifica ornitina descarboxilase induzível e antiportador de putrescina/ornitina, que é induzido em pH baixo, codifica ornitina descarboxilase induzível e antiportador de putrescina/ornitina. Portanto, quando o promotor nativo do operon speF-potE é substituído pelo promotor forte, o operon speF-potE pode ser expresso constitutivamente, e, portanto, a capacidade de produzir putrescina pode ser aumentada. 0 promotor do gene (argD) que codifica acetilornitina aminotransferase é reprimido pela arginina (Charlier and Glansdorff, 2004). Portanto, quando o promotor nativo do operon argD é substituído por um promotor forte, o fluxo metabólico para ornitina pode ser aumentado.

Como descrito acima, no microorganismo mutante da presente invenção, pelo menos um gene selecionado a partir do grupo que consiste de um gene (puuA) que codifica γ-glutamilputrescina sintase, o gene (ygjG) que codifica putrescina transaminase e um gene (argF) que codifica ornitina carbamoiltransferase de cadeia de monômero F pode adicionalmente ser inativado ou apagado.

No microorganismo mutante com capacidade de produzir putrescina, o gene (lacl) que codifica o operon lac repressor pode adicionalmente ser apagado.

Na presente invenção, o gene (speC) que codifica ornitina descarboxilase é preferencialmente introduzido na forma de um vetor de expressão contendo um promotor forte.

Na presente invenção, o promotor forte que é usado em substituição ao gene promotor e a introdução do gene (speC) que codifica ornitina descarboxilase é preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste de um promotor trc, um promotor tac, um promotor T7, um promotor lac e um promotor trp. 0 exemplo preferencial do microorganismo mutante de acordo com a presente invenção pode ser um microorganismo mutante com capacidade de produzir putrescina onde pelo menos um gene selecionado a partir do grupo que consiste de um gene (speE) que codifica espermidina sintetase, um gene (speG) que codifica espermidina N-acetiltransferase, um gene (argl) que codifica ornitina carbamoiltransferase cadeia de monômero I e um gene (puuP) que codifica importador de putrescina, que estão envolvidos na via de degradação ou utilização da putrescina, são inativados ou apagados, e onde o promotor de pelo menos um gene selecionado a partir do grupo que consiste de um gene (argECBH) que codifica um operon para a biossíntese de arginina, um gene (argD) que codifica acetilornitina aminotransferase, e um gene (speF-potE) que codifica ornitina descarboxilase induzível e o antiportador putrescina/ornitina é substituído por um promotor forte, e onde um gene (speC) que codifica ornitina descarboxilase são introduzidos ou amplificados.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção está relacionada a um método para a produção de putrescina, sendo que este método compreende a cultura do microorganismo mutante mencionado para produzir putrescina, e em seguida, a coleta de putrescina a partir do caldo de cultura.

Na presente invenção, os processos de cultura do microorganismo mutante e a coleta da putrescina a partir do caldo de cultura podem ser conduzidos usando um método de cultura convencional (cultura em batelada ou cultura em batelada alimentada, conhecido nos processos de fermentação anteriores, e um método para isolamento e purificação da putrescina, conhecidos na técnica).

Na presente invenção, a produção biossintética de putrescina pode ser conduzida in vivo ou in vitro.

Exemplos A seguir, a presente invenção será descrita em maiores detalhes com referência aos exemplos. Deve ser entendido, no entanto, que estes exemplos são apenas para propósito ilustrativo e não devem ser interpretados como limite do escopo da presente invenção.

Particularmente, embora somente tipos específicos de vetores para remoção de genes para a presente invenção, e microorganismos produtores de putrescina de Escherichia sp. que servem como células hospedeiras, foram ilustrados nos exemplos a seguir, ficará também clara para um especialista no assunto a possibilidade de outros tipos de vetores e microorganismos produtores de putrescina.

Exemplo 1: Preparação de um microorganismo mutante cujos genes envolvidos na via de degradação ou de utilização são apagados Na presente invenção, a deleção de genes (puuA, puuP, ygjG, speE, speG, argF, e argl) nos cromossomos foi realizada por recombinação homóloga de duplo cruzamento (Datsenko, K.A., & Wanner, B.L. Proc. Natl. Acad. Sei., 97:6640-6645, 2000). Um marcador cloranfenicol-lox71 (CmR)-lox66 cassete foi preparado usando primers de PCR contendo 50 nucleotídeos homólogos para as regiões de upstream e downstream do gene alvo. pECmulox (Kim, J.M., Lee, K.H. & Lee, S. Y., FEMS Microbiol. Lett. , 278: 78-85, 2008) compreendendo o cassete Ιοχ-71-CmR foi usado como um modelo nas reações PCR. Os produtos de PCR foram transformados em células eletrocomponentes contendo λ recombinase. As colônias foram selecionadas em placas de ágar Luria-Bertani (LB) contendo 34 pg/ml de cloranfenicol (Cm) (Sambrook, J., Fritsch E.F., & Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000). A substituição com sucesso dos genes com CmR foi confirmada por PCR de colônia direta. O antibiótico marcador foi eliminado por um plasmídeo helper pJW168 com uma origem de replicação sensível à temperatura e expressando a cre recombinase induzível por IPTG (Palmeros et al., Gene, 247(1):255-264, 2000). 1-1: Preparação da cepa WL3110 0 PCR foi realizado usando o plasmídeo pECmulox como modelo e primers de SEQ ID NOS: 1 e 2, obtendo, portanto, um produto de PCR onde o gene lacl foi apagado. Em seguida, o produto de PCR obtido foi eletroporado na E. coli (W3110) eletrocompetente contendo λ recombinase, preparando, então, a cepa WL3110 (W3110AlacJ).

SEQ ID NO: 1: 5'-GTGAAACCAGTAACGTTATACGATRTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTC TTAGATTGGCAGCATTACACGTCTTG-3' SEQ ID NO: 2: 5'-TCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTA ATGCACTTAACGGCTGACATGGG-3' 1-2: Preparação da cepa XQ08 0 PCR foi realizado usando o plasmídeo pECmulox como modelo e primers de SEQ ID NOS: 3 e 4, obtendo, portanto, um produto de PCR onde o gene speE foi apagado. Em seguida, o produto de PCR obtido foi eletroporado na cepa WL3110 preparada no Exemplo 1-1, preparando, portanto, a cepa XQ08 (W3110 ElacI EspeE).

SEQ ID NO: 3: 5’-CGCCTGAATAATTTCGGTTGAGAGATGGCGTAAGGCGTCGTTATCTGT CGGACACTATAGAACGCGGCCG-3' SEQ ID NO: 4: 5'-ATGTTGCGCCCTTTTTTTACGGGTGTTAACAAAGGAGGTATCAACCCA TGCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3' 1-3: Preparação da cepa XQ17 0 PCR foi realizado usando o plasmídeo pECmulox como modelo e primers de SEQ ID NOS: 5 e 6, obtendo, portanto, um produto de PCR onde o gene puuA foi apagado. Em seguida, o produto de PCR obtido foi eletroporado na cepa WL3110 preparada no Exemplo 1-1, preparando, portanto, a cepa XQ17 (W3110 AlacI EpuuA).

SEQ ID NO: 5: 5'-GATGAAACAACCCCGCAAGGGGTATTACGCGTTTTTCAACATCCACTC AAG ACACTATAGAACGCGGCCG-3' SEQ ID NO: 6: 5'-CGAGCGGAAAACAAACCAAAGGCGAAGAATCATGGAAACCAATATCGT TGCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3' 1-4: Preparação da cepa XQ22 O PCR foi realizado usando o plasmídeo pECmulox como modelo e primers de SEQ ID NOS: 6 e 7, obtendo, portanto, um produto de PCR onde o gene puuP foi apagado. Em seguida, o produto de PCR obtido foi eletroporado na cepa XQ17 (W3110 AlacI EpuuA) preparada no Exemplo 1-3, preparando, portanto, a cepa XQ22 (W3110 ElacI EpuuP ApuuA).

SEQ ID NO: 6: 5'-CGAGCGGAAAACAAACCAAAGGCGAAGAATCATGGAAACCAATATCGT TGCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3' SEQ ID NO: 7: 5'-TCACCATCATACAACGGCACTTTGCGATAGCGGCGGATCAGATACCA TAAGACACTATAGAACGCGGCCG-3' 1-5: Preparação da cepa XQ23 0 PCR foi realizado usando o plasmídeo pECmulox como modelo e primers de SEQ ID NOS: 8 e 9, obtendo, portanto, um produto de PCR onde o gene speE foi apagado. Em seguida, o produto de PCR obtido foi eletroporado na cepa WL3110 preparada no Exemplo 1-1, preparando, portanto, a cepa XQ23-1 (W3110 klacl &speE).

SEQ ID NO: 8: 5'-CGCCTGAATAATTTCGGTTGAGAGATGGCGTAAGGCGTCGTTATCTG TCGGACACTATAGAACGCGGCCG-3'SEQ ID NO: 9: 5'- ATGTTGCGCCCTTTTTTTACGGGTGTTAACAAAGGAGGTATCAACCC ATGCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3 ' 0 PCR foi realizado usando o plasmídeo pECmulox como modelo e primers de SEQ ID NOS: 10 e 11, obtendo, portanto, um produto de PCR onde o gene speG foi apagado. Em seguida, o produto de PCR obtido foi eletroporado na cepa XQ23-1 (W3110 AlacI AspeE), preparando, portanto, a cepa XQ23-2 (W3110 AlacI AspeE AspeG) .

SEQ ID NO: 10: 5' -GAATGTAAGGACACGTTATGCCAAGCGCCCACAGTGTTAAGCTACG CCCGGACACTATAGAACGCGGCCG-3' SEQ ID NO: 11: 5'-CTATTGTGCGGTCGGCTTCAGGAGAGTCTGACCCGGTGTTTTGTGCT CTGCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3' O PCR foi realizado usando o plasmídeo pECmulox como modelo e primers de SEQ ID NOS: 12 e 13, obtendo, portanto, um produto de PCR onde o gene argl foi apagado. Em seguida, o PCR foi realizado usando o produto de PCR obtido como um modelo e primers de SEQ ID NOS: 14 e 15, obtendo, portanto, um produto final de PCR. O produto final de PCR obtido foi eletroporado na cepa XQ23-2 (W3110 AlacI AspeE AspeG), preparando, portanto, uma cepa XQ23 (W3110 AlacI AspeE AspeG AargI).

SEQ ID NO: 12: 5'-TAATGTGATGCCGGGATGGTTTGTATTTCCCGGCATCTTTATAGCGA TAGGACACTATAGAACGCGGCCG-3' SEQ ID NO: 13: 5'-CCATATAAATTGAATTTTAATTCATTGAGGCGTTAGCCACAGGAGGG ATCCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3' SEQ ID NO: 14: 5'-ATAGCAATAGAACACTTTGGGTGGAAGAATAGACCTATCACTGCATA AAATAATGTGATGCCGGGATGGTT-3' SEQ ID NO: 15: 5'-CCACCTTTGTGACAAAGATTTATGCTTTAGACTTGCAAATGAATAAT CATCCATATAAATTGAATTTTAA-3' 1-6: Preparação da cepa XQ26 O produto de PCR preparado no Exemplo 1-3, onde o gene puuA foi apagado e o produto de PCR preparado no Exemplo 1-4, onde o gene puuP foi apagado foi eletroporado na cepa XQ23 (W3110 ElacI EspeE EspeG EargI) , obtendo, portanto, uma cepa XQ26 (W3110 ElacI EspeE EspeG EargI EpuuP EpuuA). 1-7: Preparação da cepa XQ27 0 PCR foi realizado usando o plasmídeo pECmulox como modelo e primers de SEQ ID NOS: 16 e 17, obtendo, portanto, um produto de PCR onde o gene ygiG foi apagado. Em seguida, o produto de PCR obtido foi eletroporado na cepa XQ23-2 (W3110 ElacI EspeE EspeG), preparado no Exemplo 1-5, preparando, portanto, a cepa XQ27-1 (W3110 ElacI EspeE EspeG EygiG). Em seguida, o produto de PCR preparado no Exemplo 1-3, onde o gene puuA foi apagado e o produto de PCR preparado no Exemplo 1-4, onde o gene puuP foi apagado foi eletroporado na cepa XQ27-1 (W3110 ElacI EspeE EspeG EygiG) , obtendo, portanto, uma cepa XQ27 (W3110 ElacI EspeE EspeG EygiG EpuuP EpuuA).

SEQ ID NO: 16: 5'-CTGCAATACTTAAATCGGTATCATGTGATACGCGAGCCTCCGGAGCA TATGACACTATAGAACGCGGCCG-3' SEQ ID NO: 17: 5'-CGTCGTATCGCCATCCGATTTGATATTACGCTTCTTCGACACTTACT CGCCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3' 1-8: Preparação da cepa XQ29 0 produto de PCR preparado no Exemplo 1-7, onde o gene ygiG foi apagado foi eletroporado na cepa XQ26 (W3110 AlacI EspeE AspeG EargI EpuuP EpuuA) , preparado no Exemplo 1-6, obtendo, portanto, uma cepa XQ29 (W3110 ElacI EspeE EspeG EygiG kargl EpuuP EpuuA) . 0 PCR foi realizado usando o plasmídeo pECmulox como modelo e primers de SEQ ID NOS: 1 e 2, obtendo, portanto, um produto de PCR onde o gene lacl foi apagado. Em seguida, o produto de PCR obtido foi eletroporado na E. coli (W3110) eletrocompetente contendo λ recombinase, preparando, então, a cepa WL3110 (W3110AIacJ).

Exemplo 2: Substituição do promotor Com o objetivo de melhorar a capacidade de produzir putrescina, o promotor da cepa mutante (XQ26) preparada no Exemplo 1 foi substituído por um promotor forte (trc). 2-1: Preparação da cepa XQ33 Substituição de um promotor nativo do operon argECBH com o promotor trc foi conduzida da seguinte maneira. Um fragmento de DNA do antibiótico marcador cloranfenicol-lox71 fundido gerando o marcador lox-66 através da primeira reação de PCR com primers de SEQ ID NOS: 18 e 19 usando pECmulox como um padrão.

SEQ ID NO: 18: 5'-TATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGT CAACAGCTGACACTATAGAACGCGGCCG-3 ' SEQ ID NO: 19: 5'-TATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGT CAACAGCTCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3' Com o objetivo de introduzir um promotor trc, a segunda reação de PCR foi realizada com primers de SEQ ID NOS: 20 e 21 usando o produto da primeira reação de PCR como um modelo. Com o objetivo de introduzir regiões homólogas no produto final e PCR, a terceira reação de PCR foi realizada com primers de SEQ ID NOS: 22 e 23 usando o produto da segunda reação de PCR como um modelo.

SEQ ID NO: 20: 5'-CGCTGGCACCCACAATCAGCGTATTCAACATGGTCTGTTTCCTGTGT GAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACA-3' SEQ ID NO: 21: 5'-TCTCGATAAATGGCGGTAATTTGTTTTTCATGGTCTGTTTCCTGTGT GAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACA-3' SEQ ID NO: 22: 5'-ATGTTCATATGCGGATGGCGATTTACATAGGTCACTAGCTCTGCGCC AGCGTAGCCGCTGGCACCCACAATCAGC-3' SEQ ID NO: 23: 5'-TCGAGTGCCTCTTCCGTGGCGCTTATTGAAGGTGTGGCAATCAGAGC GCGGTAAATCTCGATAAATGGCGGTAAT-3' O produto final de PCR foi eletroporado na cepa XQ26 (W3110 AlacI AspeE AspeG AargI ApuuP ApuuA) preparada no Exemplo 1-1, construindo, então, um microorganismo recombinante. Em seguida, as células do microorganismo mutante foram cultivadas em placa ágar contendo cloranfenicol, enquanto as células onde a recombinação homóloga dupla ocorreu foram selecionadas na placa ágar, preparando, então, uma cepa XQ33 (W3110 AlacI AspeE AspeG AargI ApuuP ApuuA PargECBH.: : Ptrc) . Em seguida, a substituição da cepa preparada com o promotor trc foi confirmada por análise de sequência de DNA. 2-2: Preparação da cepa XQ37 Substituição de um promotor nativo do operon speF-potE com o promotor trc foi conduzida da seguinte maneira. A primeira reação de PCR foi conduzida com primers de SEC ID NOS: 19 e 24 usando plasmídeo pECmulox como um padrão.

SEQ ID NO: 24: 5'-ACTAAGGGCACTTCAGCGTACAGGTCTTCCTGACTCTCTGTAGACAC TATAGAACGCGGCCG-3' A segunda reação de PCR foi conduzida com primers de SEC ID NOS: 25 e 26 usando o produto da primeira reação de PCR como um modelo. A terceira reação de PCR foi conduzida com primers de SEC ID NOS: 27 e 28 usando o produto da segunda reação de PCR como um modelo.

SEQ ID NO: 25: 5'-AGCTTCGACTTTCACTTCTTCAATGCCCGTTAGTCTACCGACTAAGG GCACTTCAGCGTA-3' SEQ ID NO: 26: 5'-AATCACTAACCGCAATTTTTAATTTTGACATGGTCTGTTTCCTGTG TGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACA-3' SEQ ID NO: 27: 5'-AAGGCGGACAACTCATATTATGAAGTTTGCTCATCGCAATAGCTTCG ACTTTCACTTCTT-3' SEQ ID NO: 28: 5'-CGACTTTCATTAATGTAGATACATTCTCGCTGCGTGGTAAAACAGTC CGGGCAAGAATCACTAACCGCAATTTTTAA-3' 0 produto final de PCR foi eletroporado na cepa XQ33 (W3110 ElacI EspeE EspeG EargI EpuuP EpuuA PargECBH:: Ptrc) preparada no Exemplo 2-1, construindo, então, um microorganismo recombinante. Em seguida, as células do microorganismo recombinante foram cultivadas em placa ágar contendo cloranfenicol, enquanto as células onde a recombinação homóloga dupla ocorreu foi selecionada na placa ágar, preparando, então, uma cepa XQ37 (W3110 ElacI EspeE EspeG EargI EpuuP EpuuA PargECBH::Ptrc PspeF- potE::Ptrc). A substituição com o promotor trc foi confirmada por análise de sequência de DNA. 2-3: Preparação da cepa XQ39 A substituição de um promotor nativo do operon argD com o promotor trc foi conduzida da seguinte maneira. A primeira reação de PCR foi conduzida com primers de SEC ID NOS: 19 e 29 usando plasmídeo pECmulox como um padrão.

SEQ ID NO: 29: 5'-CAACTGCTGGCTAATTTCCTGCATCGCTGATTTCTGATTGGACACTA TAGAACGCGGCCG-3 A segunda reação de PCR foi conduzida com primers de SEC ID NOS: 30 e 31 usando o produto da primeira reação de PCR como um modelo. A terceira reação de PCR foi conduzida com primers de SEC ID NOS: 32 e 33 usando o produto da segunda reação de PCR como um modelo.

SEQ ID NO: 30: 5'- GCAGTTCCATCCAGAAAGTATTCTTAGCGAACAAGGACATCAACTG CTGGCTAATTTCCT-3' SEQ ID NO: 31: 5'- CGCGTGTAATTGCTGTTTGTTCAATTGCCATGGTCTGTTTCCTGTG TGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACA-3' SEQ ID NO: 32: 5'- TTATGGGGATTCGCCATCGCCAGTGGGATCTGGAAGGTGTGCAGTT CCATCCAGAAAGTA-3' SEQ ID NO: 33: 5'- CGGAGCATAAATCGGCAGGATCACTTCATCGAAAGTCGCGCGTGTA ATTGCTGTTTGT-3' O produto final de PCR foi eletroporado na cepa XQ37 (W3110 AlacI AspeE AspeG AargI ApuuP ApuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc) , preparado no Exemplo 2-2, obtendo, portanto, uma cepa XQ39 (W3110 AlacI AspeE AspeG

AargI ApuuP ApuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc PargD::Ptrc). Em seguida, as células do microorganismo recombinante foram cultivadas em placa ágar contendo cloranfenicol, enquanto as células onde a recombinação homóloga dupla ocorreu foram selecionadas na placa ágar. A substituição com o promotor trc foi confirmada por análise de seqüência de DNA. 2-4: Preparação da cepa XQ43 A substituição de um promotor nativo do operon speC com o promotor trc foi conduzida da seguinte maneira. A primeira reação de PCR foi conduzida com primers de SEC ID NOS: 19 e 36 usando plasmídeo pECmulox como um padrão.

SEQ ID NO: 36: 5'-TTTGCCCGATGCACGCCATCTCCTTACATTCTCTCGCTTATCGCCG TTTCGACACTATAGAACGCGGCCG-3 A segunda reação de PCR foi conduzida com primers de SEC ID NOS: 37 e 38 usando o produto da primeira reação de PCR como um modelo. A terceira reação de PCR foi conduzida com primers de SEC ID NOS: 39 e 40 usando o produto da segunda reação de PCR como um modelo.

SEQ ID NO: 37: 5'-TGCCATGATTGCGCGAATTTTCTCCTCTCTGTACGGAGTTTGCCCG ATGCACGCCAT-3' SEQ ID NO: 38: 5'- TACTGGCGGCAATATTCATTGATTTCATGGTCTGTTTCCTGTGTGA AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAT-3' SEQ ID NO: 39: 5'- GATGGCTTGTTTGTTCGCAAAGTCCTGGCTTGCACGCTTTAGCGAA AGGTGCCATGATTGCGCGAATTT-3' SEQ ID NO: 40: 5'- ATCTCCCAACGCCACCACGCGACGATGAGAAGAAAGTCGGGATACC AGTTCACTACTGGCGGCAATATTCATTGA-3' O produto final de PCR foi eletroporado na cepa XQ39 (W3110 AlacI AspeE AspeG AargI ApuuP ApuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE::Ptrc PargD::Ptrc) , preparado no Exemplo 2-3, obtendo, portanto, uma cepa XQ43 (W3110 AlacI AspeE AspeG AargI ApuuP ApuuA PargECBH::Ptrc PspeF-potE:: Ptrc PargD::Ptrc PspeC::Ptrc). Em seguida, as células do microorganismo recombinante foram cultivadas em placa ágar contendo cloranfenicol, enquanto as células onde a recombinação homóloga dupla ocorreu foram selecionadas na placa ágar. A substituição com o promotor trc foi confirmada por análise de seqüência de DNA.

Exemplo 3: Produção de putrescina usando microorganismos mutantes Cada uma das cepas mutantes (E. coli K12 WL3110 mutantes) da Tabela 1, preparada nos Exemplos 1 e 2, foi cultivada em um frasco com meio salino mínimo contendo 4 g/L de (NH4)2HPO4 13,5 g/L de KH2PO4, 1,7 g/L de ácido cítrico, 0,7 g/L de MgSO4-7H2O e 0,5% (v/v) de solução metal traço (Lee, S.Y. & Chang, H.N., Biotechnol. Lett., 15: 971-974, 1993) . A solução metal traço continha (por litro): 5 M HCI, 10 g FeSO4-7H2O, 2,25 g ZnSO4-7H2O, 1 g CuSO4-5H2O, 0,5 g MnSO4-5H2O, 0,23 g Na2B4O7· 10H2O, 2 g CaCl2-2H2O, e 0,1 g (NH4) 6Mo7024 . Uma solução contendo glicose (100 g/1) foi esterilizada separadamente e adicionada ao meio estéril até uma concentração final de 10 g/1. 100 pL de cada uma das culturas de células ativadas em meio LB foram inoculados em um meio mínimo e em seguida cultivado a 30°C a 220 rpm por 24 horas, até OD6oo máximo atingir 5. Em seguida, 1 ml do caldo de cultura foi adicionado em um frasco de 350 mL com saliências no fundo contendo 50 mL do mesmo meio, e em seguida foi cultivado a 30°C a 220 rpm por 15 horas. As células foram separadas por centrifugação e o sobrenadante foi analisado por HPLC. As aminas contidas no sobrenadante foram detectadas por derivação de oftaldialdeído (OPA) em um sistema Hewlett Packard 1100 Series (230 nm) usando uma coluna C18 de fase reversa (tampão A: 45% 0,1 M de acetato de sódio, pH 7,2; tampão B: metanol) A análise foi conduzida nas seguintes condições: 1-6 min 100% tampão A equilibrado, 6-10 min de gradiente linear de 0 a 30% de tampão B, 10-15 min de gradiente de 30% a 50% de tampão B, 15-19 min de gradiente de 50% a 100% de tampão B, 19-23 min de gradiente a 100% de tampão B e 23-25 min de gradiente de 100% a 30% de tampão B, 25-28 min de 30% B a 100% A com uma taxa de fluxo de 0,8 ml/min). Neste, um padrão foi usado para calibração, e as concentrações medidas de putrescina são mostradas na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1 Como pode ser observado na Tabela 1, nos microorganismos mutantes em cujos genes (puuP, puuA, speE, speG, e argl) envolvidos na via de degradação ou de utilização de putrescina foram apagados, as capacidades de os microorganismos mutantes de desenvolver putrescina foram aumentadas dependendo do tipo e número de genes apagados. Ainda, pode ser observado que as capacidades de os microorganismos mutantes de produzir putrescina foram também aumentadas quando os promotores do gene (argECBH) que codifica um operon para a biossíntese de arginina, o gene (speF-potE) que codifica ornitina descarboxilase induzível e antiportador de putrescina/ornitina e o gene (speC) que codifica ornitina descarboxilase foram substituídos por um promotor forte.

Exemplo 4: Amplificação do gene (speC) que codifica ornitina descarboxilase 4-1: Preparação do plasmídeo pKKSpeC A ornitina descarboxilase que codifica o gene speC da E. coli W3110 biossintética constitutiva foi clonada no vetor de expressão pKK223-2 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) que usa o promotor tac para expressão gênica. PCR foi realizado com primers de SEQ ID NOS: 34 e 35 usando o DNA genômico de E. coli W3110 (derivada da E. coli K-12, λ", F", prototrófica) como um modelo, preparando, então o fragmento speC (2156 bp). SEQ ID NO: 34: 5'-CAGCGAATTCATGAAATCAATGAATATTGCC-3' SEQ ID NO: 35: 5'-CATTCTGCAGTTACTTCAACACATAACCGTA-3' Em seguida, o fragmento speC preparado (2156 bp) e o plasmídeo pKK223-3 foram tratados com enzimas de restrição (EcoRI e PstI) e em seguida com DNA T4 ligase e o fragmento speC e o plasmídeo pKK223-3 digeridos com as enzimas de restrição, foram fundidas uma à outra, preparando, então, um vetor plasmídeo recombinante pKKSpeC de alto número de cópia.

4-2: Preparação do plasmídeo p!5SpeC A ornitina descarboxilase que codifica o gene speC da E. coli W3110 biossintética constitutiva foi clonada no vetor de expressão pTacl5K (origem pl5A, cópias baixas, KmR; estoque KAISTMBEL) que usa o promotor tac para expressão gênica. PCR foi realizado com primers de SEQ ID NOS: 34 e 35 usando o DNA genômico de E. coli W3110 (derivada da E. coli K-12, λ", F", prototróf ica) como um modelo, preparando, então o fragmento speC (2156 bp).

Em seguida, o fragmento speC preparado (2156 bp) e o plasmídeo pTacl5K foram tratados com enzimas de restrição (EcoRI e PstI) e em seguida com DNA T4 ligase e o fragmento speC e o plasmídeo pTacl5K digeridos com as enzimas de restrição, foram fundidas uma à outra, preparando, então, um vetor plasmídeo recombinante pl5SpeC de baixo número de cópia.

4-3: Preparação da cepa WL3110/pKKSpeC 0 vetor pKKSpeC preparado no Exemplo 4-1 foi introduzido na cepa WL3110 preparada no Exemplo 1-1, preparando, então, a cepa WL3110/pKKSpeC. Em seguida, a cepa preparada foi cultivada em meio ágar sólido contendo ampicilina, enquanto os microorganismos mutantes recombinantes foram selecionados.

4-4: Preparação da cepa XQ17/pKKSpeC 0 vetor pKKSpeC preparado no Exemplo 4-1 foi introduzido na cepa XQ17 preparada no Exemplo 1-3, preparando, preparando, então, a cepa XQ17/pKKSpeC. Em seguida, a cepa preparada foi cultivada em meio ágar sólido contendo ampicilina, enquanto os microorganismos mutantes recombinantes foram selecionados.

4-5: Preparação da cepa XQ22/pKKSpeC 0 vetor pKKSpeC preparado no Exemplo 4-1 foi introduzido na cepa XQ22 preparada no Exemplo 1-4, preparando, então, a cepa XQ22/pKKSpeC,. Em seguida, a cepa preparada foi cultivada em meio ágar sólido contendo ampicilina, enquanto os microorganismos mutantes recombinantes foram selecionados.

4-6: Preparação da cepa XQ26/pKKSpeC 0 vetor pKKSpeC preparado no Exemplo 4-1 foi introduzido na cepa XQ26 preparada no Exemplo 1-6, preparando, então, a cepa XQ26/pKKSpeC. Em seguida, a cepa preparada foi cultivada em meio ágar sólido contendo ampicilina, enquanto os microorganismos mutantes recombinantes foram selecionados.

4-7: Preparação da cepa XQ33/pKKSpeC 0 vetor pKKSpeC preparado no Exemplo 4-1 foi introduzido na cepa XQ33 preparada no Exemplo 2-1, preparando, preparando, então, a cepa XQ33/pKKSpeC. Em seguida, a cepa preparada foi cultivada em meio ágar sólido contendo ampicilina, enquanto os microorganismos mutantes recombinantes foram selecionados.

4-8: Preparação da cepa XQ37/pKKSpeC 0 vetor pKKSpeC preparado no Exemplo 4-1 foi introduzido na cepa XQ37 preparada no Exemplo 2-2, preparando, então, a cepa XQ37/pKKSpeC. Em seguida, a cepa preparada foi cultivada em meio ágar sólido contendo ampicilina, enquanto os microorganismos mutantes recombinantes foram selecionados.

4-9: Preparação da cepa XQ39/pKKSpeC 0 vetor pKKSpeC preparado no Exemplo 4-1 foi introduzido na cepa XQ39 preparada no Exemplo 2-3, preparando, então, a cepa XQ39/pKKSpeC. Em seguida, a cepa preparada foi cultivada em meio ágar sólido contendo ampicilina, enquanto os microorganismos mutantes recombinantes foram selecionados.

4-10: Preparação da cepa XQ43/pKKSpeC O vetor pKKSpeC preparado no Exemplo 4-2 foi introduzido na cepa XQ43 preparada no Exemplo 2-4, preparando, então, a cepa XQ43/pKKSpeC. Em seguida, a cepa preparada foi cultivada em meio ágar sólido contendo ampicilina, enquanto os microorganismos mutantes recombinantes foram selecionados.

Exemplo 5: Produção de putrescina usando microorganismo mutante em cujo gene (speC) que codifica ornitina descarboxilase foi amplificado Cada uma das cepas mutantes preparadas no Exemplo 4 foi cultivada em frasco de agitação contendo o mesmo meio descrito no Exemplo 3. 100 pL de cada uma das culturas de células ativadas em meio LB foram inoculados em um meio mínimo e em seguida cultivada a 30°C a 220 rpm por 30 horas, até OD600 máximo atingir 5. Em seguida, 1 ml do caldo de cultura foi adicionado em um frasco de 350 mL com saliências no fundo contendo 50 mL do mesmo meio, e em seguida foi cultivado a 30°C a 220 rpm por 27 horas. As células foram separadas por centrifugação e o sobrenadante foi analisado por HPLC nas mesmas condições descritas no Exemplo 3. Os resultados da análise são mostrados na Tabela 2.

Tabela 2 Como pode ser observado na Tabela 2, as capacidades de produção de putrescina nos microorganismos mutantes (WL3110/pKKSpeC, XQ17/pKKSpeC, XQ22/pKKSpeC, XQ26/pKKSpeC, XQ33/pKKSpeC, XQ37/pKKSpeC, XQ39/pKKSpeC e XQ43/pl5SpeC) com reduzidas atividades de degradação e de utilização de putrescina foram significativamente aumentadas comparadas àquelas dos microorganismos mutantes (WL3110, XQ17, XQ22, XQ26, XQ33, XQ37, XQ39 e XQ43) da Tabela 1 onde nem pKKSpeC ou pl5SpeC foram introduzidos, quando eram co-expressos com ornitina descarboxilase speC.

Exemplo 6: Preparação de putrescina através de cultura alimentada em batelada da cepa XQ37/pKKSpeC

0 potencial da atividade reduzida de degradação e de utilização de putrescina foi analisado junto com a atividade de descarboxilase em fermentação alimentada em batelada. A fermentação alimentada em batelada foi realizada em um fermentador de 6,6 litros (Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ) após adição de 10 g/1 de glicose a 2 litros de meio R mínimo. 1 ml da cultura XQ37/pKKSpeC ativada em meio LB foi inoculado em um frasco de 350 mL com saliências no fundo contendo 50 mL do mesmo meio, e em seguida foi cultivado a 30°C a 220 rpm por 24 horas até atingir um ODgoo de 5. 200 ml da pré-cultura foi subsequentemente usado para inoculação no fermentador. O oxigênio dissolvido no caldo fermentado foi mantido com 20% de ar saturado por aumento automático na velocidade de agitação de 850 rpm. Quando o pH do caldo fermentado foi aumentado em cerca de 0,2 unidades de pH até um pH fixo de 6,8 como resultado da exaustão de glicose, a solução contendo glicose foi automaticamente adicionada com o objetivo de aumentar a concentração de glicose para mais do que 3 g/1. A solução contendo glicose continha 500 g/1 de glicose e 200 g/1 de (NH4)2SO4. Ao longo do período completo de fermentação exceto por um período curto de tempo quando o pH estava aumentando devido à exaustão de glicose, o pH do caldo fermentado foi mantido em pH 6,8 pela adição de solução de amônia 28% (v/v). O caldo fermentado foi amostrado e centrifugado para separar as células e o sobrenadante foi analisado por HPLC da mesma maneira como descrito no Exemplo 3. Os resultados da análise são mostrados na FIG. 2. Como mostrado na FIG. 2, a cepa XQ37/pKKSpeC produziu 14,3 g/1 de putrescina durante 55,8 horas após a inoculação e a produtividade máxime de putrescina foi de 0,28 g L_1 h_1 após 47 horas após a inoculação.

Exemplo 7: Preparação de putrescina através de cultura alimentada em batelada da cepa XQ39 A fermentação em batelada alimentada foi conduzida da mesma maneira como descrita no Exemplo 6, exceto que a cepa XQ39 foi usada no lugar da XQ37/pKKSpeC. O caldo fermentado foi analisado por HPLC e os resultados da análise são mostrados na FIG. 3. Como mostrado na FIG. 3, a cepa XQ39 produziu 14,7 g/1 de putrescina durante 36 horas após a inoculação e a produtividade máxima de putrescina foi de 0,42 g L-l h_1 após 31 horas após a inoculação.

Exemplo 8: Preparação de putrescina através de cultura alimentada em batelada da cepa XQ43 A cepa XQ43 foi cultivada em um frasco contendo 50 ml de R/2 minimo (contendo 2 g/L (NH4)2HPO4, 6,75 g/L KH2PO4, 0,85 g/L de ácido cítrico, 0,7 g/L MgSO4*7H2O, 0,5% (v/v) de solução metal traço) (Qian et al., Biotechnol. and Bioeng, 101(3): 587-601, 2008) complementado com 3 g/L de (NH4)2SO4. A solução metal traço continha (por litro): 5 M HCI, 10 g FeSO4*7H2O, 2,25 g ZnSO4-7H2O, 1 g CuSO4-5H2O, 0,5 g MnSO4-5H2O, 0,23 g Na2B4O7· 10H2O, 2 g CaCl2-2H2O, e 0,1 g (NH4) 6Mo7024. Uma solução contendo glicose (100 g/1) foi esterilizada separadamente e adicionado ao meio estéril até uma concentração final de 10 g/1. 1 ml da cultura XQ43 ativada em meio LB foi adicionada a um frasco de 350 mL com saliências no fundo contendo 50 mL do meio descrito acima, e em seguida foi cultivado a 37°C a 220 rpm por 24 horas até atingir um Οϋβοο de 3,3. 200 ml da pré-cultura foi subsequentemente usada para inoculação no fermentador. O oxigênio dissolvido no caldo fermentado foi mantido com 20% de ar saturado por aumento automático na velocidade de agitação de 1000 rpm. A fermentação alimentada em batelada da cepa XQ43 foi realizada em um fermentador de 6,6 litros (Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ) após adição de glicose 10 g/1. Quando o pH do caldo fermentado foi aumentado em cerca de 0,01 unidade de pH até um pH fixo de 6,8 como resultado da exaustão de glicose, uma solução contendo glicose foi automaticamente adicionada com o objetivo de aumentar a concentração de glicose para mais do que 2 g/1. A solução contendo glicose continha 522 g/1 de glicose e 8 g/L de MgSO4 e 170 g/L de (NH4)2SO4. Ao longo do período completo de fermentação exceto por um período curto de tempo quando o pH estava aumentando devido à exaustão de glicose, o pH do caldo fermentado foi mantido em pH 6,8 pela adição de solução de KOH 10 Μ. O caldo fermentado foi amostrado e centrifugado para separar as células e o sobrenadante foi analisado por HPLC da mesma maneira como descrito no Exemplo 3. Os resultados da análise são mostrados na FIG. 4. Como mostrado na FIG. 4, a cepa XQ43 produziu 18,0 g/1 de putrescina durante 30 horas após a inoculação e a produtividade máxime de putrescina foi de 0,63 g L-l h-1 após 28 horas após a inoculação.Exemplo 9: Preparação de putrescina através de cultura alimentada em batelada da cepa XQ43/pl5SpeC A fermentação em batelada alimentada foi conduzida da mesma maneira como descrita no Exemplo 8, exceto que a cepa XQ43/pl5SpeC foi usada no lugar da XQ43. O caldo fermentado foi analisado por HPLC e os resultados da análise são mostrados na FIG. 5. Como mostrado na FIG. 5, a cepa XQ43/pKKSpeC produziu 21,7 g/1 de putrescina durante 37 horas após a inoculação e a produtividade máxime de putrescina foi de 0,58g L-l h'1 após 37 horas após a inoculação.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

Como descrito em detalhe acima, a presente invenção provê microorganismos mutantes com capacidade de produzir putrescina. Estes microorganismos mutantes são úteis para produzir putrescina com alto rendimento que é usada em uma ampla variedade de aplicações industriais.

Enquanto a presente invenção é descrita com referência às realizações ilustrativas particulares, não deve ser restritiva pelas realizações, mas somente pelas reivindicações anexadas. Deve ser entendido que especialistas no assunto podem alterar ou modificar as realizações sem se afastar do escopo e espirito da presente invenção.

REIVINDICAÇÕES

Claims (5)

1. MICROORGANISMO MUTANTE COM CAPACIDADE DE PRODUZIR PUTRESCINA, sendo dito microorganismo mutante do Escherichia coli, caracterizado pelo fato de que pelo menos um gene selecionado a partir do grupo que consiste de um gene speE que codifica espermidina sintase, um gene speG que codifica espermidina N-acetiltransferase, um gene argl que codifica ornitina carbamoiltransferase cadeia de monômero I e um gene puuP que codifica importador de putrescina, que estão envolvidos na via de degradação ou utilização da putrescina, é inativado ou apagado e onde um promotor de pelo menos um gene selecionado a partir do grupo que consiste de um gene argECBH que codifica um operon para a biossíntese de arginina, um gene argD que codifica acetilornitina aminotransferase, e um operon speF-potE que codifica ornitina decarboxilase induzível e o antiportador putrescina/ornitina é substituído por um promotor selecionado dentre o grupo que consiste de um promotor trc, um promotor tac, um promotor T7, um promotor lac e um promotor trp, onde pelo menos um gene selecionado do grupo que consiste de um gene puuA que codifica y-glutamilputrescina sintase, um gene ygiG que codifica putrescina transaminase e um gene argF que codifica ornitina carbamoiltransferase cadeia de monômero F, é inativado ou apagado, e onde um gene lad que codifica um operon repressor lac é apagado para aumentar a expressão de genes que codificam enzimas envolvidas na biossíntese de putrescina.

2. MICROORGANISMO MUTANTE de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um gene speC que codifica ornitina decarboxilase é adicionalmente introduzido na forma de um vetor de expressão contendo um promotor selecionado dentre o grupo que consiste de um promotor trc, um promotor tac, um promotor T7, um promotor lac e um promotor trp.

3. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UM ORGANISMO MUTANTE COM CAPACIDADE DE PRODUZIR PUTRESCINA, como definido na reivindicação 1, a partir de Escherichia coli, caracterizado pelo fato de compreender: a) inativação ou deleção de pelo menos um gene selecionado a partir do grupo que consiste de um gene speE que codifica espermidina sintase, um gene speG que codifica espermidina N-acetiltfransferase, um gene argl que codifica ornitina carbamoiltransferase cadeia de monômero I e um gene puuP que codifica importador de putrescina, que estão envolvidos na via de degradação ou utilização de putrescina, a partir de um microorganismo que possui a via de produção de putrescina, inativação ou deleção de pelo menos um gene escolhido a partir do grupo que consiste de um gene puuA que codifica y-glutamilputrescina sintase, um gene ygjG que codifica putrescina transaminase e um gene argF que codifica ornitina carbamoiltransferase cadeia F-monômero, e onde um gene lacl que codifica um operon repressor de lac é apagado para aumentar a expressão de genes que codificam enzimas envolvidos na biossíntese de putrescina; e b) substituição de um promotor de pelo menos um gene selecionado a partir do grupo que consiste de um gene argECBH que codifica um operon para biossíntese de arginina, um gene argD que codifica acetilornitina aminotransferase e um operon speF-pot-E que codifica ornitina decarboxilase induzível e o antiporter putrescina/ /ornitina por um promotor selecionado a partir do grupo que consiste de um promotor trc, um promotor tac, um promotor T7, um promotor lac e um promotor trp.

4. MÉTODO de acordo com a reivindicação 3, compreendendo adicionalmente a introdução ou amplificação de um gene speC que codifica ornitina decarboxilase antes da etapa (a) , depois da etapa (b) e entre as etapas (a) e (b) , caracterizado pelo fato de que o gene speC que codifica ornitina decarboxilase é introduzido na forma de um vetor de expressão contendo um promotor selecionado a partir do grupo que consiste de um promotor trc, um promotor tac, um promotor T7, um promotor lac e um promotor trp.

5. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PUTRESCINA, como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender a cultura do microorganismo mutante de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 para produzir putrescina e a recuperação de putrescina a partir do caldo de cultura.