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KR101348461B1 - 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법 - Google Patents

퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법 Download PDF

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KR101348461B1
KR101348461B1 KR1020110130595A KR20110130595A KR101348461B1 KR 101348461 B1 KR101348461 B1 KR 101348461B1 KR 1020110130595 A KR1020110130595 A KR 1020110130595A KR 20110130595 A KR20110130595 A KR 20110130595A KR 101348461 B1 KR101348461 B1 KR 101348461B1
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엄혜원
최수진
이한원
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씨제이제일제당 (주)
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Abstract

본 발명은 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신의 생산 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 오르니틴으로부터 아르기닌으로의 생합성 경로를 차단하고, 세포 내 글루타메이트의 양을 증가시키고, 글루타메이트로부터 오르니틴을 생산하는 생합성 경로의 활성을 강화시키며, 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase)를 외래로부터 도입함으로써 퓨트레신 생산능이 부여된 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법{Microorganisms for producing putrescine and process for producing putrescine using the same}
본 발명은 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신의 생산 방법에 관한 것이다.
폴리아민(polyamine)은 대부분의 살아있는 세포 내에 존재하는 물질이다. 폴리아민에 속하는 스퍼미딘(spermidine)이나 스퍼민(spermine)은 박테리아, 곰팡이, 동물 등 다양한 종에서 발견된다. 이러한 스퍼미딘 및 스퍼민 대사에서 전구물질인 퓨트레신(putrescine 또는 1,4-butanediamine)은 그람 음성 박테리아나 곰팡이에서 발견되며, 다양한 종에서 고농도로 존재하기 때문에 대사 경로에서 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.
퓨트레신은 아디프산 (adipic acid)과 반응하여 폴리아민 나일론-4,6을 합성하는 중요한 원료물질로, 가공 플라스틱의 중요한 원료로 사용하기 위해 주로 프로필렌(propylene)으로부터 아크릴로니트릴 (acrylonitrile) 및 숙시노니트릴(succinonitrile)을 거쳐 화학 합성법으로 생산된다. 이 화학 합성법은 에너지 소모가 많은 촉매적 산화 반응 단계, 시아나이드(cyanide) 같은 유독성 화합물을 사용하는 단계와 고압 수소를 사용하는 수소화반응단계 등을 포함하는 3단계 공정으로 이루어져 있다. 퓨트레신의 화학공정에 의한 생산은 환경친화적이지 못하며 석유자원의 고갈문제를 안고 있다. 따라서, 퓨트레신의 생산을 위해 보다 환경친화적이고 에너지소비를 절감할 수 있는 바이오매스를 활용한 방법이 요구된다.
미생물에서의 퓨트레신 생합성 경로는 글루타메이트로부터 오르니틴 합성까지는 아르기닌 생합성 경로와 동일하다. 중간 물질로 생성된 오르니틴의 디카르복실화(decarboxylation)를 통해 퓨트레신으로 합성되거나, 아르기닌(L-arginine)으로부터 아그마틴(agmatine)을 거쳐 퓨트레신을 합성하는 두 가지 경로가 알려져 있다. 이러한 두 가지 경로는 대사에 필요한 에너지를 생성하거나 산성에 대한 스트레스 내성을 부여한다. 미생물을 이용한 퓨트레신을 생산 방법으로는 대장균과 코리테박테리움을 형질전환하여 퓨트레신을 고농도로 생산하는 방법이 공개되었다. 대장균에서의 퓨트레신 생산방법은 오르니틴 디카르복실레이즈(ornithine decarboxylase)과 글루타메이트 아세틸트렌스퍼레이즈(glutamate acetyltransferase)의 발현양 증가로 이루어질 수 있으며, 퓨트레신 분해 또는 이용 경로인 스퍼미딘, 아세틸스퍼미딘(acetylspermidine) 합성경로를 결실하여 고농도 퓨트레신 생산이 가능하다(Qian. ZD. et al., Biotechnol. Bioeng. 104:4, 651-662, 2009, 국제특허공개번호 WO06/005603. 국제특허공개번호 WO09/125924). 또한 퓨트레신 합성경로를 갖고 있지 않은 코리네박테리움 속 균주에서는 대장균 유래의 오르니틴 디카복실레이즈 유전자 도입을 통해 오르니틴으로부터 퓨트레신을 생산하는 방법과 대장균 유래의 아르기닌 디카복실레이즈와 아그마티네이즈(Agamatinase) 유전자 도입을 통해 아르기닌으로부터 퓨트레신을 생산하는 방법이 있다. 실제로 아르기닌 경로보다 오르니틴 경로를 통해 약 50배 높은 퓨트레신을 생산할 수 있다(Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88:4, 859-868, 2010).
한편, 대장균은 44g/L의 퓨트레신 존재하에서 성장할 수 있고, 코리네박테리움 글루타미쿰은 66g/L의 농도에서 성장이 가능한 것으로 확인되었다. 따라서, 대장균보다 고농도의 퓨트레신의 존재 하에서 성장할 수 있는 코리네박테리움 속 미생물 균주를 이용하여 퓨트레신 생산용 균주를 개발하는 것이 효과적일 것으로 예측되고 있다.
코리네박테리움 속 균주들은 아미노산, 핵산, 효소, 및 항생제 유사물질의 생산에서 널리 이용되는 산업용 미생물이다. 코리네박테리움 속 균주에서, 아르기닌(L-arginine)은 글루타메이트로부터 argCJBDFRGH 형태로 이루어진 아르기닌 오페론(operon) 구조의 유전자로부터 발현된 효소에 의해 합성된다. 아르기닌 생합성에 가장 중요한 역할을 하는 아르기닌 오페론 유전자들은 세포 내에서 합성된 글루타메이트(L-glutamate)를 기질로 이용하여 아르기닌을 합성한다. 도 2는 코리네박테리움 속 균주에서 글루타메이트로부터 아르기닌의 합성 경로를 도시한다. 아르기닌 합성 경로에서, argJ는 글루타메이트를 N-아세틸글루타메이트(N-acetylglutamate)로 전환시키고, argB는 N-아세틸글루타메이트를 N-아세틸글루타밀 포스페이트(N-acetylglutamyl phosphate)로 전환시키며, argC는 N-아세틸 글루타밀포스페이트를 N-아세틸글루타메이트 세미알데히드(Nacetylglutamate semialdehyde)로 전환시키고, argD는 N-아세틸글루타메이트 세미알데히드를 N-아세틸 오르니틴(N-acetylornithine)으로 전환시키며, argJ는 N-아세틸 오르니틴을 오르니틴으로 전환시키고, argF는 오르니틴을 시트룰린(Lditrulline)으로 전환시키며, argG는 시트룰린을 아르기노숙시네이트(argininosuccinate)로 전환시키고, argH는 아르기노숙시네이트를 아르기닌으로 전환시키는 효소를 코딩한다고 알려져 있다.
기존에 알려진 아르기닌 생산 균주는 아르기닌 오페론에 돌연변이를 도입하거나 프로모터(promoter) 등의 변이를 통하여 아르기닌 생합성에 관련된 효소의 발현량을 증가시키는 방법으로 개발되었다. 그 중 아르기닌 오페론 유전자의 발현을 조절하고 억제하는 argR과, 아르기닌 농도에 의해 저해를 받는 argB가 아르기닌의 생산량을 증가시키기 위한 표적으로서 널리 연구되었다(대한민국 특허공개 제2010-0060909호).
퓨트레신 생합성 경로 중 글루타메이트로부터 오르니틴의 합성까지는 아르기닌 생합성 경로와 동일하고, 합성된 오르니틴으로부터 오르니틴 디카르복실라아제 (ornithine decarboxylase, ODC)에 의해 퓨트레신이 생성된다. 따라서 퓨트레신의 고생산능을 가진 균주를 만들기 위해서는 퓨트레신 전구체 물질인 오르니틴이 충분히 만들어져야 한다. 야생형 대장균 W3110의 argF와 argR이 결실된 균주에서 글루타메이트 첨가시 오르니틴 생산이 20% 증가했고, 글루타메이트에서 오르니틴으로 가는 경로 이외에 글루타메이트로부터 프롤린을 생성하는 경로의 첫 단계에 관여하는 감마글루타밀키나아제(γ-glutamylkinase)를 코딩하는 유전자 proB를 결실시켰을 때도 오르니틴이 증가한다고 알려져 있다. 이는 글루타메이트의 양을 증가시켰을 때 오르니틴 생산에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 보여준다.
오르니틴 전구체인 글루타메이트의 고수율 생산에 관한 연구는 코리네박테리움 글루타미쿰을 대상으로 오랫동안 진행되었다. 그 중 코리네박테리움 글루타미쿰의 글루타메이트 배출능은 비오틴 (biotin) 결핍조건이나 페니실린 G(penicillin G) 또는 지방산 에스테르 계면활성제 처리시 증가된다는 것이 보고되었으며, 이는 세포벽에 손상이 있을 때 글루타메이트가 세포질을 통해 보다 잘 배출된다는 것을 보여준다.
코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 균주 (Cgl 13032) 유래의 NCgl1221 단백질은 베타인 (betain) 배출을 촉진하며, 대장균의 기계수용 채널(mechanosensitive channel) 단백질인 yggB와 아미노산 서열이 유사하다고 알려져 있다(대한민국 특허공개 제2010-0017581호).
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 퓨트레신을 보다 고수율로 생산할 수 있는 균주를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 오르니틴으로부터 아르기닌으로의 생합성 경로를 차단시키고, 세포 내 글루타메이트의 양을 증가시키고, 글루타메이트로부터 오르니틴을 생산하는 생합성 경로의 활성을 강화시키며, 오르니틴으로부터 퓨트레신을 합성할 수 있는 효소인 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase)를 외래로부터 도입하여, 퓨트레신 과생산 균주를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 퓨트레신 생산능이 부여된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제 및 글루타메이트 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221)의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되고, 오르니틴 디카르복실라아제의 활성이 도입된, 퓨트레신을 생산하는 미생물을 제공한다.
본 발명의 용어 "오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제(ornithine carbamoyltransferase, OCT)"란, 카르바모일인산과 오르니틴의 반응을 매개하여 시트룰린과 인산을 생성하는 촉매활성을 나타내는 효소를 의미하는데, 요소배설성 동물의 간 뿐만 아니라 식물 및 미생물에도 존재하고, 미생물에서는 아르기닌의 합성과정에 관여한다. 상기 효소는 촉매기능부위와 조절기능부위를 포함하는데, 상기 조절기능부위에 오르니틴이 결합하면 효소의 활성이 저해된다.
대장균 K12 스트레인의 경우 두 종류(argF, argI)의 OCT를 가지며, 대장균 B 및 W 스트레인을 포함한 장내미생물의 경우 argI와 유사한 한 종류의 OCT를 갖는다. argF 및 argI에 의해 코딩되는 OCT는 아미노산 서열은 다르지만, 동일한 기능을 갖는 동위효소(isoenzyme)라고 할 수 있다 (EMBO J. (1982) 1:853-857). 코리네박테리움 속 미생물에는 argF 유전자에 의해 코딩되는 OCT만 존재한다. OCT는 오르니틴으로부터 아르기닌을 합성하는 경로에서 작용하므로, OCT의 활성을 약화시키면, 세포 내 오르니틴의 생성량을 증가시킬 수 있다.
본 발명에서는 퓨트레신 전구체인 오르니틴이 아르기닌으로 전환되는 것을 차단하기 위해 오르니틴에서 아르기닌으로 전환되는 경로가 차단된 코리네박테리움 속 미생물을 제공하며, 이를 위하여 상기 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자를 결실시킨 형질전환 균주를 제조하였다.
이때, 상기 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 28의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있다.
본 발명의 용어 "상동성"이란, 단백질을 코딩하는 유전자의 염기 서열이나 아미노산 서열의 유사한 정도를 의미하는데, 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 용어 "글루타메이트 배출에 관여하는 단백질(glutamate exporter)"이란, 세포 내에서 생성된 글루타메이트를 세포 외부로 배출하는 역할을 수행하는 단백질로서 기계수용 채널(mechanosensitive channels)의 일종을 의미한다.
본 발명에서는 퓨트레신의 생산능이 부여된 코리네박테리움 속 미생물을 제공하며, 이를 위하여 상기 퓨트레신의 전구체인 오르니틴의 합성의 원료가 되는 글루타메이트를 세포외부로 방출하는 단백질을 코딩하는 유전자를 결실시켜서, 세포내 글루타메이트의 농도를 높은 수준으로 유지할 수 있는 형질전환 균주를 제조하였다.
오르니틴의 전구체인 글루타메이트의 세포 내 함량을 증가시키면 오르니틴 생합성 경로를 촉진할 수 있는데, 본 발명에서는 NCgl1221 단백질의 활성을 약화시킴으로써 글루타메이트의 배출을 감소 또는 제거할 수 있다.
이때, 결실된 글루타메이트 배출에 관여하는 단백질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 30의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가지는 단백질일 수 있고다.
상기 단백질의 활성 약화는 1) 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전체의 결실, 2) 상기 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 유전자 서열의 변형 또는 4) 이의 조합 등을 사용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은 세균내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 상기 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 바람직하게는 1 내지 100개, 보다 바람직하게는 1 내지 50개이다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현조절 서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
아울러, 본 발명의 효소를 암호화하는, 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성을 더욱 약화하도록 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.
상기 퓨트레신의 전구체인 오르니틴을 세포내 축적하도록 변형된 미생물은 지금까지의 오르니틴 생산 균주 개발, 즉 아르기닌 생합성 경로의 전사 억제자인 argR의 기능을 없애거나 약화시켜 오르니틴 생산을 증가시키고, 추가로 오르니틴 카바모일트랜스퍼라아제(ornithine carbamoyltransferase) 유전자를 결실시키고 조절이 해제된 N-아세틸글루타메이트 신타아제(N-acetylglutamate synthase)를 도입하여 오르니틴 생산을 증가시키는 방법(대한민국 특허공개 제2010-0060909호)과는 다른 접근 방법에 의하여 제조된 미생물이다.
본 발명에서 용어, "내재적 활성"이란, 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 효소의 활성 상태를 의미하는 것으로, 본 발명에서는 미생물이 천연적으로 가지고 있는 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제 및 글루타메이트 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221)의 활성 상태를 의미하고, 본 발명에서 "내재적 활성에 비하여 약화되도록 변형" 되었다는 것은, 유전자의 결손 또는 돌연변이에 의해 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제 및 글루타메이트 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221)이 정상적으로 작용하지 않아 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제 및 글루타메이트 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221)의 활성이 약해진 상태를 의미한다.
본 발명의 용어 "오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)"란, 오르니틴을 이용하여 퓨트레신을 생성하는 효소를 의미하는데, 상기 ODC는 조효소로서 피리독살 포스페이트 (Pyridoxal 5'-phosphate, PLP)를 필요로 하고 대부분의 그람음성균에 존재하며, 그람 양성균 중에서 락토바실러스(Lactobacillus)와 같은 장내 세균중의 일부에 존재할 수 있다. 대장균의 경우 ODC를 암호화하는 유전자는 두 종류가 있는데, 그 중 하나인 speC는 지속적으로 일정 농도로 발현되고, 다른 하나인 speF는 특정 조건 (오르니틴이 일정농도 이상 존재 및 낮은 pH 조건)하에서 발현이 유도되는 유전자이다. 종에 따라 대장균처럼 2종류의 ODC를 가진 종도 있고, 한가지 종류만 갖는 있는 종도 있다. 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 시겔라 속(Shigella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) 등의 종에서는 두 종류의 ODC (speC, speF)를, 여시니아 속(Yersinia sp.), 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.) 등의 균주는 한 종류의 ODC (speC)를 갖는다. 유산균의 경우 ODC가 한 종류의 유전자 (speF)에서 발현되며, 낮은 pH나 오르니틴(ornithine)과 히스티딘(histidine)이 풍부한 조건에서 발현이 유도되는 것으로 알려져 있다.
상기 ODC는 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 41의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 코딩되는 단백질일 수 있다.
상술한 바와 같이, 미생물에 오르니틴 디카르복실라아제(ODC)의 활성을 도입하는 것은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법으로 수행될 수 있는데, 예를 들어, ODC를 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 염색체에 삽입하는 방법, 상기 폴리뉴클레오티드를 벡터 시스템에 도입하여 미생물에 도입하는 방법, ODC를 코딩하는 염기서열의 상류에 개량된 활성을 나타내는 프로모터를 도입하거나 프로모터에 변이를 준 ODC를 도입하는 방법, ODC를 코딩하는 염기서열의 변이체를 도입하는 방법 등을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 ODC를 코딩하는 염기서열을 도입할 경우, 이의 발현을 조절하기 위한 프로모터로서 서열번호 42의 CJ7 프로모터를 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 퓨트레신 생산능이 부여된 코리네 박테리움 속 미생물을 제공하며, 이를 위하여 오르니틴으로부터 퓨트레신을 합성할 수 있는 오르니틴 디카르복실라아제제를 암호화하는 염기서열을 염색체내에 도입하여, 퓨트레신을 생산할 수 있는 형질전환 균주를 제조하였다.
미생물에 의해 제조된 퓨트레신은 대장균의 경우 세포 내 분해 경로에 의해, 스퍼미딘(spermidine), 아세틸 퓨트레신(acetyl putrescine), 감마 아미노뷰티릭에시드(g-aminobutyric acid, GABA) 등으로 분해되기도 한다. ODC는 대부분의 그람음성 균에는 존재하지만, 코리네박테리움 속 미생물에는 존재하지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서 코리네박테리움 속 미생물을 이용하여 퓨트레신 생산 균주를 개발할 경우 외래 종의 ODC 도입은 반드시 필요하다.
본 발명의 용어 "퓨트레신의 생산능이 부여된 미생물" 또는 "퓨트레신을 생산하는 미생물"이란, 퓨트레신의 생산능이 없는 모 균주에 퓨트레신의 생산능이 부여된 미생물을 의미하는데, 상기 퓨트레신 생산능이 부여되거나 또는 퓨트레신을 생산하는 미생물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 글루타메이트에서 오르니틴 합성까지의 생합성 경로 강화를 위해 글루타메이트를 아세틸 글루타메이트(N-acetylglutamate)로 전환하는 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 아세틸 오르니틴을 오르니틴으로 전환하는 오르니틴 아세틸 트랜스퍼라아제(ArgJ), 아세틸 글루타메이트를 아세틸 글루타밀 포스페이트(N-acetylglutamyl phosphate)로 전환하는 아세틸글루타메이트 키나아제(ArgB), 아세틸 글루타밀 포스페이트를 아세틸 글루타메이트 세미알데히드(Nacetylglutamate semialdehyde)로 전환하는 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제(ArgC), 아세틸 글루타메이트 세미알데히드를 아세틸 오르니틴(Nacetylornithine)으로 전환하는 아세틸오르니틴 아미노 트랜스퍼라아제(ArgD)의 활성을 내재적 활성에 비하여 증가시키도록 추가적으로 형질전환되어 퓨트레신의 원료로서 사용되는 오르니틴의 생산성이 향상되고, 오르니틴 디카르복실라아제(speC)를 코딩하는 유전자가 도입되도록 형질전환되어 상기 오르니틴을 이용하여 퓨트레신을 생산할 수 있는 미생물일 수 있다.
이때, 상기 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제(ArgC), 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 오르니틴 아세틸트랜스퍼라아제(ArgJ), 아세틸글루타메이트 키나아제(ArgB), 및 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라아제(ArgD)는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 각각 서열번호 33, 35, 37, 및 39의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 이들의 활성 증가는 1) 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 효소의 활성이 강화되도록 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 4) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의해 수행될 수 있다.
구체적으로, 미생물에서 단백질의 활성을 증가시키기 위해서 일반적으로 여러 가지 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 플라스미드 도입, 상동성 재조합, 접합, 전위 등을 이용한 형질 전환에 의해 폴리뉴클레오티드의 카피 수를 증가시키거나, 폴리뉴클레오티드의 발현 조절 서열을 변형시키거나, 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 조절인자를 코딩하는 유전자를 증폭하거나, 폴리뉴클레오티드의 발현을 감소시키는 조절인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 파괴 또는 약화시킴으로써 폴리뉴클레오티드의 발현량을 증가시킬 수 있다. 보다 구체적으로는, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 단편을 코리네박테리움 속 미생물 내에서 복제할 수 있는 다중 카피 벡터에 작동가능하게 연결하거나, 염색체 내로 한 개 또는 다수의 폴리뉴클레오티드 카피를 도입하거나, 폴리뉴클레오티드의 프로모터를 포함한 발현 조절 서열을 활성이 보다 개량된 것으로 대체할 수 있다.
예를 들어, 벡터 pHC139T를 사용하여 argCJBD 유전자군을 미생물에 형질전환시켜, 야생형 대비 오르니틴 생산능이 매우 향상된 미생물을 제조하거나, 또는 미생물의 염색체 내 존재하는 argCJBD 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위를 개량해서 강화하거나 더 개량된 활성을 나타내는 프로모터로 교체하여 오르니틴까지의 생합성 경로를 강화한 미생물이 될 수 있다. 특히, 프로모터 부위를 개량하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염색체 내의 프로모터 교체는 치환하고자 하는 부위의 양 말단 염기서열과 도입하고자 하는 프로모터를 염색체 내 원래 위치와 동일한 형태로 제작한 뒤, 공지된 pDZ 벡터를 사용한 유전자 결실 방법(대한민국 특허공개 제2009-0082702호)과 동일하게 수행하는 방법을 사용할 수 있다. 이때, 상기 개량된 프로모터는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 42의 염기서열을 가지는 pcj7(또는 P(CJ7)) 프로모터(대한민국 특허등록 제0620092호)를 사용함이 바람직하고, 상기 pDZ 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나 바람직하게는 도 3의 개열지도로 표시되는 벡터를 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로 서 pDZ 벡터, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pDZ 벡터 등을 사용할 수 있다.
한편, 상기 미생물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 본 발명의 미생물은 퓨트레신 대사 경로를 갖지 않고, 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제 및 글루타메이트 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221)의 활성을 나타내는 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 시겔라 속(Shigella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) 여시니아 속(Yersinia sp.), 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 브레비박테리움 속(Brevibacterium sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 셀레노모나스 속(Selenomanas sp.), 또는 비브리오 속(Vibrio sp.)에 속하는 미생물을 형질전환시킨 미생물일 수 있다.
바람직하게는 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라아제의 활성을 감소시키거나 또는 불활성화시켜 오르니틴이 축적되고, 글루타메이트엑스포터(exporter)의 활성을 감소시키거나 또는 불활성화시켜 세포 내 글루타메이트 양이 증가되며, 아르기닌 생합성에 관여하는 argCJBD 유전자군의 발현량을 증가시켜 오르니틴을 과량으로 생산하고, 오르니틴을 퓨트레신으로 전환하는 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)의 활성이 외래로부터 도입되어 퓨트레신 생산능을 갖도록 형질전환된 미생물일 수 있다.
바람직하게는 코리네박테리움 속 미생물, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다. 구체적으로, 야생형 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 또는 글루타메이트 과생산 균주 KCCM-10785P (대한민국 특허공개 제2008-0034334호) 일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 KCCM-10785P 균주는 NTG 등의 변이 유발체를 통해 선별한 글루타메이트 생산균주(KFCC-11074)를 기반으로 cg2624(NCBI LOCUS ID YP_226636), cg2115(NCBI LOCUS ID YP_226173)를 결실시킨 글루타메이트 과생산 균주이다.
cg2624와 cg2115 결손에 따른 글루타메이트 과생산 기작은 상기 문헌 이전에 밝혀진 바 없으나, cg2624는 pcaR로 IclR 그룹의 조절단백질 (IclR family regulatory protein)이라 명명되어 있으며, cg2115는 sugR로 당대사기작의 발현인자 조절단백질 (transcriptional regulators of sugar metabolism)로 명명되어 있다.
도 2에 도시된 오르니틴의 합성 경로에서 알 수 있는 바와 같이, 오르니틴의 생성량을 증가시키기 위해서는 출발물질인 글루타메이트의 양을 증가시키고, 합성된 오르니틴을 아르기닌으로 전환시키는 경로를 차단하며, 오르니틴의 생합성에 관여하는 효소의 양이나 활성을 증가시키는 것이 요구된다. 이처럼 오르니틴의 생산성이 향상되고, 퓨트레신 대사 경로를 갖지 않는 미생물에 오르니틴으로부터 퓨트레신을 생합성할 수 있는 효소인 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)를 코딩하는 유전자를 도입하면, 과다하게 생성된 오르니틴을 이용하여 퓨트레신의 생산성이 부여된 형질전환된 미생물을 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, argF 유전자가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(ATCC 13032 ΔargF 및 KCCM-10785P ΔargF)(실시예 1), argF 유전자 및 NCgl1221 유전자가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 및 KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221)(실시예 2), argF 유전자 및 NCgl1221 유전자가 결실되고, argCJBD 유전자가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221/pHC139T-argCJBD(Cgl) 및 KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221/pHC139T-argCJBD(Cgl))(실시예 3-1), argF 유전자 및 NCgl1221 유전자가 결실되고, 염색체 내 argCJBD 유전자군의 프로모터를 치환시킨 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD 및 KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD)(실시예 3-2), argF 유전자 및 NCgl1221 유전자가 결실되고 오르니틴 디카르복실라아제(ODC)를 코딩하는 speC 유전자가 염색체에 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 bioAD::P(CJ7)-speC(Ec) 및 KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221 bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)), 상기 균주에 argCJBD 유전자가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 bioAD::P(CJ7)-speC(Ec) / pHC139T-argCJBD(Cgl) 및 KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221 bioAD::P(CJ7)-speC(Ec) / pHC139T-argCJBD(Cgl)) 및 argF 유전자 및 NCgl1221 유전자가 결실되고, 염색체 내 argCJBD 유전자군의 프로모터가 치환되며, speC 유전자가 염색체에 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec) 및 KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec))를 각각 제조하였다. 이들의 퓨트레신 생산성을 비교한 결과, argF 유전자 및 NCgl1221 유전자가 결실되고, 염색체 내 argCJBD 유전자군의 프로모터를가 치환되고며, speC 유전자가 염색체에 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec) 및 KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec))가 우수한 퓨트레신 생산성을 나타냄을 확인하였다(표 7 및 표 8).
이에, 본 발명자들은 퓨트레신 생산능이 우수한 것으로 확인된 퓨트레신 생산 균주를 "CC01-0064(ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec))"라 명명하고, 부다페스트 조약 하에 서울 서대문구 홍제1동 소재의 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2010년 11월 24일자로 수탁번호 KCCM11138P로 기탁하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 (ⅰ) 상기 퓨트레신 생산능이 부여된 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 배양된 미생물 또는 배양물로부터 퓨트레신을 회수하는 단계를 포함하는 퓨트레신의 생산방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행됨이 바람직하고, 배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간동안 배양함이 바람직하다. 상기 배양에 의하여 생산된 퓨트레신은 배지중으로 분비되거나 세포내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 퓨트레신 생산능이 부여된 미생물은 보다 효과적인 퓨트레신의 제조에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 퓨트레신 생합성 경로 및 관련 유전자를 보여준다.
도 2는 공지된 코리네박테리움 글루타미쿰의 아르기닌 생합성 경로를 보여준다.
도 3은 코리네박테리움 속 미생물의 염색체내 삽입용 벡터 pDZ 벡터를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: argF 유전자가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 제작
야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC 13032와, NTG 등의 변이 유발체를 통해 선별한 글루타메이트 생산균주(KFCC-11074)를 기반으로 cg2624, cg2115를 결실시킨 글루타메이트 과생산 균주 KCCM-10785P(대한민국 특허공개 제2008-0034334호)에서 오르니틴으로부터 아르기닌을 합성하는 경로를 막기 위해 argF 결실 균주를 제작하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 아르기닌 생합성 유전자들은 argCJBDFRGH 형태의 오페론 구조로 구성되고, 결실 표적인 argF 유전자(서열번호 27)가 염색체상에서 오르니틴 합성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자와 나란히 존재하기 때문에 바깥 부분에 위치한 argD와 argR의 염기서열을 바탕으로 argF 부분을 결실시키기 위한 플라스미드를 제작하고자 하였다.
구체적으로, 상기 ATCC 13032 균주의 argD 및 argR의 염기서열에 기초하여, argF의 N-말단 외부 부분의 상동 재조합(homologous recombination) 단편 및 argF의 C-말단 외부 부분의 상동 재조합 단편을 수득하였다. 이때, argF의 N-말단 외부 부분의 단편은 ATCC 13032 균주로부터 수득된 게놈 DNA를 주형으로 하고 프라이머(서열번호 1 및 2)를 이용한 PCR을 수행함으로써(94℃ 30초 denaturation, 55℃ 30초 annealing 및 72℃ 30초 extension, 28cycle) 수득하고, argF의 C-말단 외부 부분의 단편은 ATCC 13032 균주로부터 수득된 게놈 DNA를 주형으로 하고 프라이머(서열번호 3 및 4)를 이용한 동일한 조건에서 PCR을 수행함으로써 수득하였다(표 1).
argF 결실 균주(ΔargF) 제작을 위한 프라이머
명칭 서열번호 서열(5'-3')
argF-del-F1_BamHI
argF-del-R1_SalI
argF-del-F2_SalI
argF-del-R2_XbaI		 1
2
3
4		 CGGGATCCTGGCCGTACCGGCGATTTCT
CGCGTCGACAAGTTTGAGTCCTTTATGCG
CGCGTCGACGACATGTCCCTTGGCTCAAC
TGCTCTAGAAGTAATTCACCTAGTTCTTTACC
상기 수득한 argF의 N-말단 외부 부분의 상동 재조합 단편을 BamHI 및 SalI로 처리하여 절단하고, 상기 argF의 C-말단 외부 부분의 상동 재조합 단편을 SalI 및 XbaI으로 처리하여 절단하여 각각의 단편을 수득하였으며, 이들 절단된 각 단편을 BamHI 및 XbaI으로 처리하여 절단된 pDZ 벡터에 도입하여, 플라스미드 pDZ-argF(K/O)를 수득하였다.
상기 수득한 플라스미드 pDZ-argF(K/O)를 ATCC 13032 균주와 KCCM-10785P 균주에 도입하고, 도입된 균주를 카나마이신(25㎍/㎖)과 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolin-β-D-galactoside)이 함유된 BHIS 평판배지(Braine heart infusion 37g/ℓ, 소르비톨 91g/ℓ, 아가 2%)에 도말하여 배양함으로써 콜로니를 형성시켰으며, 상기 형성된 콜로니 중에서 푸른색을 나타내는 콜로니를 선택함으로써, 상기 플라스미드 pDZ-argF(K/O)이 도입된 균주를 선발하였다.
상기 선발된 균주를 CM배지(glucose 10g/ℓ, polypeptone 10g/ℓ, yeast extract 5g/ℓ, beef extract 5g/ℓ, NaCl 2.5g/ℓ, urea 2g/ℓ, pH 6.8)에서 진탕 배양(30℃, 8시간)하고, 각각 10- 4 부터 10-10까지 순차적으로 희석하여, X-gal을 포함하고 있는 고체배지에 도말하고 배양하여 콜로니를 형성시켰다. 형성된 콜로니 중에서 상대적으로 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선택하여, argF가 결실된 균주를 선발하였다.
상기 선발된 균주로부터 수득한 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 4의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, 상기 선발된 균주에 상기 플라스미드 pDZargF(K/O)가 도입되었음을 확인하여, 상기 선발된 균주가 argF가 결실된 균주(ATCC 13032 ΔargF, KCCM-10785P ΔargF)임을 알 수 있었다.
실시예 2: argF 유전자 및 NCgl1221 유전자가 결실된 코리네박테리움 글루타 미쿰 균주 제작
상기 실시예 1에서 수득한 ATCC 13032 ΔargF 균주와 KCCM-10785P ΔargF 균주에서 글루타메이트 엑스포터 유전자인 NCgl1221 유전자를 추가로 결실시킴으로써, 오르니틴 전구체인 글루타메이트의 세포 내 함량을 증가시켰다.
구체적으로, 상기 ATCC 13032 균주의 NCgl1221의 염기서열(서열번호 29)에 기초하여, NCgl1221의 N-말단 외부 부분의 상동 재조합 단편 및 NCgl1221의 C-말단 외부 부분의 상동 재조합 단편을 수득하였다. 이때, NCgl1221의 N-말단 외부 부분의 단편은 ATCC 13032 균주로부터 수득된 게놈 DNA를 주형으로 하고 프라이머(서열번호 5 및 6)를 이용한 PCR을 수행함으로써 수득하고, NCgl1221의 C-말단 외부 부분의 단편은 ATCC 13032 균주로부터 수득된 게놈 DNA를 주형으로 하고 프라이머(서열번호 7 및 8)를 이용한 상기 실시예 1과 동일한 조건에서 PCR을 수행함으로써 수득하였다(표 2).
NCgl1221 결실 균주 제작을 위한 프라이머
명칭 서열번호 서열(5'-3')
NCgl1221-del-F1_BamHI
NCgl1221-del-R1_SalI
NCgl1221-del-F2_SalI
NCgl1221-del-R2_XbaI		 5
6
7
8		 CGGGATCCGTCCAAGCCAAGCCGATTTCAAC
ACGCGTCGACCCACTCGGCGCTTGATAATAC
ACGCGTCGACCTGGAACAAGAACTCTCCAGC
CTAGTCTAGA GGTTGGTGCTTCCACTGCTG
상기 수득한 NCgl1221의 N-말단 외부 부분의 상동 재조합 단편을 BamHI 및 SalI로 처리하여 절단하고, 상기 NCgl1221의 C-말단 외부 부분의 상동 재조합 단편을 SalI 및 XbaI으로 처리하여 절단하여 각각의 단편을 수득하였으며, 이들 절단된 각 단편을 BamHI 및 XbaI으로 처리하여 절단된 pDZ 벡터에 도입하여, 플라스미드 pDZ-NCgl1221(K/O)를 수득하였다.
상기 수득한 플라스미드 pDZ-NCgl1221(K/O)를 ATCC 13032 ΔargF 균주와 KCCM-10785P ΔargF 균주에 도입하고, 도입된 균주를 카나마이신(25㎍/㎖)과 X-gal이 함유된 BHIS 평판배지에 도말하여 배양함으로써 콜로니를 형성시켰으며, 상기 형성된 콜로니 중에서 푸른색을 나타내는 콜로니를 선택함으로써, 상기 플라스미드 pDZ-NCgl1221(K/O)이 도입된 균주를 선발하였다.
상기 선발된 균주를 CM배지에서 진탕 배양(30℃, 8시간)하고, 각각 10-4 부터 10-10까지 순차적으로 희석하여, X-gal을 포함하고 있는 고체배지에 도말하고 배양하여 콜로니를 형성시켰다. 형성된 콜로니 중에서 상대적으로 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선택하여, NCgl1221가 결실된 균주를 선발하였다.
상기 선발된 균주로부터 수득한 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 5 및 8의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, 상기 선발된 균주에 상기 플라스미드 pDZ-NCgl1221(K/O)가 도입되었음을 확인하여, 상기 선발된 NCgl1221이 결실된 균주를 각각 ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 및 KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221라 명명하였다.
실시예 3: argCJBD 유전자가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 제작
실시예 3-1: argCJBD 유전자의 클로닝 및 형질전환체 제조
글루타메이트로부터 오르니틴을 합성하는 경로에 관여하는 효소를 코딩하고 있는 argCJBD 오페론(프로모터 부위를 포함, 서열번호 31)의 카피수를 증가시켜 오르니틴 생성 경로를 강화시키기 위해, argC, argJ, argB, argD 유전자(각각 서열번호 32, 34, 36 및 38)가 도입된 벡터를 제조하고, 이를 도입한 형질전환체를 제조하였다.
우선, argCJBD 유전자를 얻기 위해, ATCC 13032 균주의 염색체를 주형으로 하고, 프라이머(서열번호 9 및 10)를 이용한 PCR을 수행하여(95℃ 40초 denaturation, 55℃ 40초 annealing 및 72℃ 150초 extension, 30cycle), 4,900bp 크기의 유전자 단편을 수득하였다.
ATCC 13032의 argCJBD 유전자 단편을 얻기 위한 프라이머
명칭 서열번호 서열(5'-3')
P_argC-5-KpnI
argD-3_XbaI		 9
10		 CGGGGTACCCTCCTCCAGCAGCTCTAGCTC
TGCTCTAGAAAGTTTGAGTCCTTTATGCG
상기 수득한 유전자 단편을 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리시키고, 용리된 밴드에 제한효소인 KpnI 및 XbaI를 처리하여 단편을 수득하였으며, 상기 수득한 단편을 pHC139T-gfp 벡터(대한민국특허공개 제2008-0074286호)에 클로닝하여, 발현벡터 pHC139T-argCJBD(Cgl)를 제조하였다.
다음으로, 균주 내 오르니틴 생성량을 증가시키기 위해 상기 제조한 발현벡터 pHC139T-argCJBD(Cgl)를 ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 균주와 KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221 균주에 전기 천공법을 이용하여 도입하고, 25㎍/㎖ 카나마이신이 함유된 BHIS 평판배지에 도말하여 형질전환체를 선발하고, 상기 선발된 각 형질전환체를 ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221/pHC139T-argCJBD(Cgl) 및 KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221/pHC139T-argCJBD(Cgl)라 명명하였다.
실시예 3-2: 염색체 내 argCJBD 유전자군의 프로모터 치환
글루타메이트로부터 오르니틴을 합성하는 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 argCJBD 유전자의 조절 해제를 통해 발현량을 증가시키기 위해, 염색체내 argCJBD 자체 프로모터를 본 출원인이 신규 개발한 CJ7 프로모터로 교체하고자 하였다.
우선, CJ7 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터의 양끝 말단 부위는 염색체상의 원래의 서열을 갖는 상동 재조합 단편을 수득하였다.
구체적으로, CJ7 프로모터의 5'-말단 부위는 ATCC 13032 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고 프라이머(서열번호 11 및 12)를 이용한 PCR을 수행하여(94℃ 30초 denaturation, 55℃ 30초 annealing 및 72℃ 30초 extension, 28cycle) 수득하였고, CJ7 프로모터의 부위는 프라이머(서열번호 13 및 14)를 이용한 동일한 조건에서 PCR을 수행하여 수득하였으며, CJ7 프로모터의 3'-말단 부위는 프라이머(서열번호 15 및 16)를 이용한 동일한 조건에서 PCR을 수행하여 수득하였다.
argCJBD 유전자 프로모터 치환을 위한 프라이머
명칭 서열번호 서열(5'-3')
argC-L-5-BamHI
argC-L-3-EcoRI
CJ7-5-EcoRI
CJ7-3-XbaI
argC-R-5-XbaI
argC-R-3-SalI		 11
12
13
14
15
16		 CGGGATCCGCAACGCTTGCGGTGAGAGA
CCGGAATTCCTGGAAGTGGTCGAAGAAGA
CCGGAATTCGCCGGCATAGCCTACCGATG
TGCTCTAGAGATATCAGTGTTTCCTTTCG
TGCTCTAGAATGATAATGCATAACGTGTA
ACGCGTCGACGCTTTCCGGAGGTGTTGTAC
상기 수득한 프로모터의 5'-말단 부위(argC-L)를 제한효소 BamHI과 EcoRI로 처리하고, CJ7 프로모터 부위를 제한효소 EcoRI과 XbaI로 처리하였으며, 프로모터의 3'-말단 부위(argC-R)를 제한효소 XbaI과 SalI로 처리하고, 이들 제한효소로 처리된 각 PCR 산물을 BamHI 및 SalI로 처리된 pDZ 벡터에 클로닝하여 프로모터가 치환된 발현벡터 pDZ-CJ7(arg)를 제조하였다.
상기 제조된 발현벡터 pDZ-CJ7(arg)를 ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 및 KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221 균주에 전기 천공법을 이용하여 형질전환체를 제조하였다. 상기 제조된 형질전환체를 CM배지에서 진탕 배양(30℃, 8시간)하고, 상기 배양물을 10- 4 부터 10-10까지 순차적으로 희석하여, 25㎍/㎖ 카나마이신과 X-gal이 함유된 BHIS 평판배지에 도말하여 배양함으로써 콜로니를 형성시켰다.
대부분의 콜로니가 푸른색을 나타내는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차에 의해 최종적으로 arg 프로모터가 CJ7으로 치환된 균주를 선발하고, 상기 균주로부터 수득한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머(서열번호 13 및 16)를 이용한 PCR을 수행하여(94℃ 30초 denaturation, 55℃ 30초 annealing 및 72℃ 60초 extension, 28cycle), 상기 도입된 발현벡터 pDZ-CJ7(arg)에 의하여 염색체내 argCJBD 프로모터가 치환되었는지를 확인하였으며, 상기 확인된 균주를 ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD 및 KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD이라 명명하였다.
실시예 4: speC 유전자가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주
오르니틴에서 퓨트레신을 합성하는데 사용되는 대장균의 오르니틴 디카르복실라아제(ODC)를 코딩하는 speC 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 염색체 내에 있는 불활성화된 비오틴 합성 관련 유전자 내에 도입하였다.
실시예 4-1: ODC 의 유전자 단편을 포함하는 발현벡터의 제조
대장균 유래의 speC 유전자(서열번호 40)를 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로 도입시키기 위하여, 서열번호 42의 CJ7 프로모터를 이용하여 발현되도록 클로닝하였다.
우선, CJ7 프로모터 부위를 p117-CJ7-gfp(대한민국 특허등록 제10620092호)를 주형으로 하고 프라이머(서열번호 17 및 18)를 이용한 PCR을 수행하여(94℃ 40초 denaturation, 55℃ 40초 annealing 및 72℃ 60초 extension, 30cycle) 수득하고, speC 유전자의 코딩 부위를 야생형 대장균 W3110 균주의 염색체를 주형으로 하고 프라이머(서열번호 19 및 20)를 이용한 PCR을 동일한 조건으로 수행하여 수득하였다.
P(CJ7)-speC 유전자 단편을 얻기 위한 프라이머
명칭 서열번호 서열(5'-3')
CJ7-5-KpnI
CJ7-3
speC(Ec)-5
speC(Ec)-3_XbaI		 17
18
19
20		 CGGGGTACCGCCGGCATAGCCTACCGATG
p-GATATCAGTGTTTCCTTTCG
p-ATCATGAAATCAATGAATATTGCCG
TGCTCTAGATTACTTCAACACATAACCGTACAAC
상기 수득한 CJ7 프로모터 부위와 speC 유전자의 코딩 부위를 제한효소인 KpnI 및 XbaI으로 처리하고, KpnI 및 XbaI 처리된 pHC139T-gfp 벡터에 클로닝하여, 상기 CJ7 프로모터 뒤에 ODC 코딩부위가 연결된 유전자를 포함하는 발현벡터 pHC139T-P(CJ7)-speC(Ec)를 제조하였다.
실시예 4-2: 형질전환체의 제조
코리네박테리움 속 미생물은 비오틴 합성 관련 유전자의 일부가 결실되어 있기 때문에, 대장균 유래의 speC 유전자를 비오틴 합성 유전자 중 bioA와 bioD 사이에 도입하고자 하였다.
구체적으로, 상기 실시예 4-1에서 제조한 발현벡터 pHC139T-P(CJ7)-speC(Ec)에 포함된 P(CJ7)-speC(Ec) 유전자 단편의 양끝 말단 부위를 코리네박테리움 속 미생물 염색체의 상동재조합 부위로 사용할 수 있도록 상기 양끝 말단이 각각 bioA 및 bioD 염기서열을 갖도록 클로닝하였다. 이를 위하여, ATCC 13032 균주의 게놈을 주형으로 하고 프라이머(서열번호 21 및 22)를 이용한 PCR을 수행하여(94℃ 40초 denaturation, 55℃ 30초 annealing 및 72℃ 60초 extension, 28cycle) bioA 유전자 단편을 수득하고, 동일한 주형과 프라이머(서열번호 25 및 26)을 이용한 PCR을 동일한 조건으로 수행하여 bioD 유전자 단편을 수득하였으며, 상기 발현벡터 pHC139T-P(CJ7)-speC(Ec)를 주형으로 하고 프라이머(서열번호 23 및 24)를 이용한 PCR을 동일한 조건으로 수행하여 P(CJ7)-speC(Ec) 유전자 단편을 수득하였다.
P(CJ7)-speC 유전자 단편을 염색체 내(bioA, bioD) 도입하기 위한 프라이머
명칭 서열번호 서열(5'-3')
bioA-5-BamHI
bioA-3-ScaI
P(CJ7)-5-ScaI
speC(Ec)-3-EcoRI
bioD-5-EcoRI
bioD-3-XbaI		 21
22
23
24
25
26		 CGGGATCCTGCGCGAGCTTGATCACCGA
AAAAGTACTGCCTTGCCCACACACATGAT
AAAAGTACTGCCGGCATAGCCTACCGATG
CCGGAATTCTTACTTCAACACATAACCGTACAAC
CCGGAATTCGCTGTTTTGGCGGATGAGAG
TGCTCTAGACGCAAAAAGGCCATCCGTCA
상기 수득한 bioA 유전자 단편을 제한효소 BamHI과 ScaI으로 처리하고, P(CJ7)-speC(Ec) 유전자 단편을 제한효소 ScaI과 EcoRI으로 처리하였으며, bioD 유전자 단편을 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 처리하고, 이들 제한효소로 처리된 각 PCR 산물을 BamHI 및 XbaI으로 처리된 pDZ 벡터에 클로닝하여 speC 유전자를 염색체 내에 도입하기 위한 발현벡터 pDZ-bioAD-P(CJ7)-speC(Ec)를 제조하였다.
상기 제조된 발현벡터 pDZ-bioAD-P(CJ7)-speC(Ec)를 ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 균주, ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD, KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221 및 KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD 균주에 각각 전기천공법을 이용하여 도입함으로써 각각의 형질전환체를 제조하였다.
상기 제조된 각각의 형질전환체를 CM배지에서 진탕 배양(30℃, 8시간)하고, 상기 배양물을 10- 4 부터 10-10까지 순차적으로 희석하여, 25㎍/㎖ 카나마이신과 X-gal이 함유된 BHIS 평판배지에 도말하여 배양함으로써 콜로니를 형성시켰다.
대부분의 콜로니가 푸른색을 나타내는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차에 의해 P(CJ7)-speC가 염색체 내로 도입된 균주를 각각 선발하였다. 상기 선발된 각 균주로부터 수득한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머(서열번호 21 및 26)을 이용한 PCR을 수행하여(94℃ 30초 denaturation, 55℃ 30초 annealing 및 72℃ 120초 extension, 28cycle), 상기 도입된 발현벡터 pDZ-bioAD-P(CJ7)-speC(Ec)에 의하여 염색체내 bioA와 bioD 사이에 P(CJ7)-speC 유전자 단편이 삽입되었음을 확인하였으며, 상기 확인된 균주를 각각 ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 bioAD::P(CJ7)-speC(Ec), ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec), KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221 bioAD::P(CJ7)-speC(Ec) 및 KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)로 명명하였다.
아울러, 실시예 3-1에서 제조한 pHC139T-argCJBD(Cgl) 벡터를 ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 bioAD::P(CJ7)-speC(Ec) 균주 및 KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221 bioAD::P(CJ7)-speC(Ec) 균주에 도입하여 제조한 형질전환체를 각각 ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 bioAD::P(CJ7)-speC(Ec) / pHC139T-argCJBD(Cgl) 및 KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221 bioAD::P(CJ7)-speC(Ec) / pHC139T-argCJBD(Cgl)로 명명하였다.
실시예 5: argF 및 NCgl1221 유전자 결실 및 argCJBD 발현양 강화 및 speC 유전자 도입에 의한 퓨트레신 생산성 향상 효과
실시예 5-1: ATCC 13032 코리네박테리움 글루타미쿰 기반의 퓨트레신 생산능 확인
ATCC 13032 코리네박테리움 글루타미쿰 기반 균주에서 argF 결실, NCgl1221 유전자 결실, argCJBD 발현량 강화 및 speC 도입이 퓨트레신의 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2 내지 4에서 제조한 각 균주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2 내지 4에서 제조된 각 균주(ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221(실험군 1), ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221/pHC139T-argCJBD(Cgl)(실험군 2), ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD(실험군 3), ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)(실험군 4), ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)/HC139T-argCJBD(Cgl)(실험군 5) 및 ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)(실험군 6))를 1.8%(w/v) agar를 포함하는 CMA 평판배지에 도말하여 37℃에서 24시간동안 배양하고, 상기 배양된 각 균주를 1mM 아르기닌을 포함하는 25㎖ 역가배지(2%(w/v) glucose, 1%(w/v) polypeptone, 0.5%(w/v) yeast extract, 0.5%(w/v) (NH4)2SO4, 0.15%(w/v) urea, 0.4%(w/v) KH2PO4, 0.8%(w/v) K2HPO4, 0.05%(w/v) MgSO4, 100㎍/ℓ biotin and 1㎎/ℓ thiamine)에 접종한 다음 30℃에서 200rpm으로 72시간 동안 진탕배양하였으며, 각 배양물로부터 생산된 오르니틴과 퓨트레신의 농도를 측정하고 비교하였다(표 7). 이때, 대조군으로는 유전적으로 변형되지 않은 균주 ATCC 13032를 사용하였다.
ATCC 13032 균주에서 유래된 각 균주에서 퓨트레신의 생산성 비교
실험군 오르니틴(g/L) 퓨트레신(g/L)
대조군
1
2
3
4
5
6		 0.0
6.0
6.4
7.7
0.1
0.1
0.2		 0.0
0.0
0.0
0.0
5.2
6.2
8.1
상기 표 7에서 보듯이, argF 및 NCgl1221 유전자가 결실되거나 또는 argF 및 NCgl1221 유전자가 결실되고 argCJBD 유전자의 발현량이 증가될 경우에 오르니틴을 생산되었으나, 퓨트레신은 생산되지 않음을 확인하였다. 이는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주내에 오르니틴으로부터 퓨트레신을 합성하는 효소인 오르니틴 디카르복실라아제(ODC)를 코딩하는 speC 유전자가 존재하지 않기 때문인 것으로 분석되었다.
한편, 대장균에서 유래된 speC 유전자가 도입된 실시예 4-2에서 제조된 3종의 균주에서는 오르니틴이 거의 존재하지 않고 퓨트레신이 생산됨을 알 수 있었는데, 이는 대장균에서 유래된 speC 유전자가 도입되어 이로부터 발현된 ODC가 오르니틴으로부터 퓨트레신을 합성하였기 때문인 것으로 분석되었다.
또한, 실험군 1 내지 3의 균주에서 생산하는 오르니틴의 생산량과 상기 실험군 1 내지 3의 균주에 speC 유전자가 도입된 실험군 4 내지 6의 균주에서 생산하는 퓨트레신의 생산량을 비교하면, 퓨트레신의 생산량은 오르니틴의 생산량에 비례함을 알 수 있었다. 그리고, 외래의 argCJBD 유전자를 추가로 도입한 경우보다는, 내재적인 argCJBD 유전자의 발현수준을 증가시킨 경우에, 오르니틴과 퓨트레신의 생산량이 향상됨을 알 수 있었다.
실시예 5-2: 글루타메이트 생산 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM -10785P 균주 기반의 퓨트레신 생산능 확인
글루타메이트를 과생산하는 코리네 글루타미쿰 균주 KCCM-10785P를 기반으로 argF 결실, NCgl1221 유전자 결실, argCJBD 발현량 강화 및 speC 도입이 퓨트레신의 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2 내지 4에서 제조한 각 균주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2 내지 4에서 제조된 각 균주(KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221(실험군 1), KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221/pHC139T-argCJBD(Cgl)(실험군 2), KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD(실험군 3), KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221 bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)(실험군 4), KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221 bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)/HC139T-argCJBD(Cgl)(실험군 5) 및 KCCM-10785P ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec)(실험군 6))를 실시예 5-1과 동일한 조건에서 접종한 다음, 30℃에서 200rpm으로 48시간 동안 진탕배양하였으며, 각 배양물로부터 생산된 오르니틴의 농도를 측정하고 비교하였다(표 6). 이때, 대조군으로는 유전적으로 변형되지 않은 균주 KCCM-10785P를 사용하였다.
KCCM-10785P 균주에서 유래된 각 균주에서 퓨트레신의 생산성 비교
실험군 글루타메이트(g/L) 오르니틴(g/L) 퓨트레신(g/L)
대조군
1
2
3
4
5
6		 15.5
5.2
4.8
2.0
1.4
0.1
0.0		 0.0
7.6
7.9
9.0
1.7
1.3
0.1		 0.0
0.0
0.0
0.0
5.9
6.8
9.5
상기 표 8에서 보듯이, 글루타메이트 과생산 균주 기반에서도 argF 및 NCgl1221 유전자가 결실되거나 또는 argF 및 NCgl1221 유전자가 결실되고 argCJBD 유전자의 발현량이 증가될 경우에 오르니틴을 생산되었으나, 퓨트레신은 생산되지 않음을 확인하였다.
대장균에서 유래된 speC 유전자가 도입된 실시예 4-2에서 제조된 3종의 균주에서만 퓨트레신이 생산됨을 알 수 있었는데, 이는 대장균에서 유래된 speC 유전자가 도입되어 이로부터 발현된 ODC가 오르니틴으로부터 퓨트레신을 합성하였기 때문인 것으로 분석되었다.
실험군 1 내지 3의 균주에서 생산하는 글루타메이트와 오르니틴을 비교해보면, 균주 내 생성되는 글루타메이트 양이 감소하는 양에 비례해서 생성되는 오르니틴 양이 증가하는 현상을 보였다. 또한, 실험군 1 내지 3의 균주에서 생산하는 오르니틴의 생산량과 상기 실험군 1 내지 3의 균주에 speC 유전자가 도입된 실험군 4 내지 6의 균주에서 생산하는 퓨트레신의 생산량을 비교하면, 퓨트레신의 생산량은 오르니틴의 생산량에 비례함을 알 수 있었다. 그리고, 외래의 argCJBD 유전자를 추가로 도입한 경우보다는, 내재적인 argCJBD 유전자의 발현수준을 증가시킨 경우에, 오르니틴과 퓨트레신의 생산량이 향상됨을 알 수 있었다. 결론적으로 세포 내 생성되는 글루타메이트 양이 증가함에 따라 오르니틴 양도 증가하고, 최종적으로 퓨트레신 생성양도 증가하게 됨을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 퓨트레신 생산능이 우수한 것으로 확인된 실시예 4-2에서 제조된 균주를 "CC01-0064(ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec))"라 명명하고, 부다페스트 조약 하에 서울 서대문구 홍제1동 소재의 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2010년 11월 24일자로 수탁번호 KCCM11138P로 기탁하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위와 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11138P 20101124
서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

  1. 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제 및 글루타메이트 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221)의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되도록 변형되고, 오르니틴 디카르복실라아제(ODC)의 활성이 도입된, 퓨트레신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제는 서열번호 28의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 갖는 것인 퓨트레신을 생산하는 미생물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 글루타메이트 배출에 관여하는 단백질은 서열번호 30의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 갖는 것인 퓨트레신을 생산하는 미생물.
  4. 제1항에 있어서,
    단백질의 활성 약화는 1) 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전체의 결실, 2) 상기 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 유전자 서열의 변형 및 4) 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것인, 퓨트레신을 생산하는 미생물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 오르니틴 디카르복실라아제는 서열번호 40의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 갖는 것인 퓨트레신을 생산하는 미생물.
  6. 제1항에 있어서,
    ODC의 활성 도입은 ODC를 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 염색체에 삽입하는 방법, 상기 폴리뉴클레오티드를 벡터 시스템에 도입하여 미생물에 도입하는 방법, ODC를 코딩하는 염기서열의 상류에 개량된 활성을 나타내는 프로모터를 도입하거나 프로모터에 변이를 준 ODC를 도입하는 방법 및 ODC를 코딩하는 염기서열의 변이체를 도입하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 퓨트레신을 생산하는 미생물.
  7. 제1항에 있어서,
    추가적으로 오르니틴의 생합성에 관여하는 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제(ArgC), 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 오르니틴 아세틸트랜스퍼라아제(ArgJ), 아세틸글루타메이트 키나아제(ArgB), 및 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라아제(ArgD)의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 것인 퓨트레신을 생산하는 미생물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 ArgC, ArgJ, ArgB 및 ArgD는 각각 서열번호 33, 35, 37, 및 39의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 것인 퓨트레신을 생산하는 미생물.
  9. 제7항에 있어서,
    단백질의 활성 증가는 1) 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 효소의 활성이 강화되도록 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 4) 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것인, 퓨트레신을 생산하는 미생물.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서,
    상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인 퓨트레신을 생산하는 미생물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(KCCM11138P)인 것인 퓨트레신을 생산하는 미생물.
  13. (ⅰ) 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제 및 글루타메이트 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221)의 활성이 약화되도록 변형되고, 오르니틴디카르복실라아제(ODC)의 활성이 도입된, 퓨트레신 생산능이 부여된 코리네박테리움 속 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
    (ⅱ) 상기 배양된 미생물 또는 배양물로부터 퓨트레신을 회수하는 단계를 포함하는, 퓨트레신의 생산방법.





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