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CN102154339A - 一种产丁二酸大肠杆菌基因工程菌株的构建方法 - Google Patents

一种产丁二酸大肠杆菌基因工程菌株的构建方法 Download PDF

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CN102154339A
CN102154339A CN201110038939.3A CN201110038939A CN102154339A CN 102154339 A CN102154339 A CN 102154339A CN 201110038939 A CN201110038939 A CN 201110038939A CN 102154339 A CN102154339 A CN 102154339A
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CN
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escherichia coli
nad
succinic acid
nicotinic acid
gene
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Application number
CN201110038939.3A
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姜岷
梁丽亚
马江峰
刘嵘明
陈可泉
韦萍
欧阳平凯
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Nanjing Tech University
Original Assignee
Nanjing Tech University
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Abstract

本发明涉及一种产丁二酸大肠杆菌基因工程菌株的构建方法，具体涉及一种基于NAD(H)系统改造后的大肠杆菌菌株的构建方法，属于生物工程技术领域。本发明通过分子生物学手段改造大肠杆菌的NAD(H)生物合成途径，过量表达与该途径有关的酶的活性，有效的提高了大肠杆菌胞内NAD(H)的总量，并综合利用氧化还原电位等发酵调控手段进一步提高了胞内NAD(H)的总量并维持合适的NADH/NAD+比例，确定基于辅酶调控丁二酸的生物合成策略，大幅度提高了丁二酸的合成效率。

Description

一种产丁二酸大肠杆菌基因工程菌株的构建方法
技术领域
本发明涉及一种产丁二酸大肠杆菌基因工程菌株的构建方法，具体是一种基于NAD(H)系统改造后的大肠杆菌菌株的构建方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
丁二酸（Succinic acid）又称琥珀酸，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，作为C4平台化合物，可用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯（PBS）类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一。
丁二酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，利用微生物发酵法转化可再生资源（葡萄糖、木糖等），由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可以吸收固定CO2，能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，近年来成为研究的热点。丁二酸的生产菌株主要集中在Anaerobiospirillum succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、重组谷氨酸棒杆菌和重组大肠杆菌的研究上。利用野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。E.coli（大肠杆菌） 由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁二酸优秀菌株。
提高丁二酸的发酵产酸能力，可以有多种方法，包括重新筛选优良菌株、通过传统的物理化学方法进行菌种诱变以及用现代遗传育种技术、基因工程方法来提高菌种的产酸能力等。Soon Ho Hong等人报道了构建产琥珀酸基因工程菌的方法，原理是敲除野生大肠杆菌中的丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）和乳酸脱氢酶基因（ldhA）减少甚至不产副产物甲酸、乳酸、乙酸以及乙醇等，使更多的代谢流流向琥珀酸（Biotechnol Bioeng, 2001, 74: 89～95）。
现有产丁二酸重组大肠杆菌的构建思路主要包括失活副产物生成途径的关键酶（如丙酮酸甲酸裂解酶与乳酸脱氢酶）、增强丁二酸合成途径中酶（如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）的活性以及外源导入可以引导合成丁二酸的酶（如丙酮酸羧化酶）提高其对葡萄糖的利用率以及生产速率。其中，E. coli NZN111由于同时失活了丙酮酸甲酸裂解酶与乳酸脱氢酶，NADH不能及时再生为NAD+，引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡（NADH/NAD+比例超过2），最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖。其自发突变株E. coli AFP111由于突变了葡萄糖专性转运系统中的ptsG基因，降低了在EMP途径中NADH的产生速率，恢复了NAD(H)平衡，使得菌株在厌氧条件下能够利用葡萄糖，且产物主要为丁二酸，在有氧厌氧两阶段发酵培养AFP111过程中，丁二酸质量收率达到96%，生产强度为1.21 g L-1·h-1。因此，在高产丁二酸大肠杆菌菌株构建过程中，确保胞内辅酶NAD(H)的平衡是重组大肠杆菌高产丁二酸的关键因素之一。
大肠杆菌中NAD(H)的生物合成及分解途径如图1所示，涉及其合成的基因主要有三个（pncB，nadD，nadE），涉及分解代谢的基因主要有两个（yjaD，yrfE），而NAD+和NADH相互之间的转化反应则多达300多个。相关研究表明，利用DNA 重组技术改造NAD(H)生物合成途径是提高NAD(H)总量的有效手段。San等人（Metab Eng, 2002, 4: 238～247；Metab Eng, 2002, 4: 182～192）在研究辅因子调控对大肠杆菌代谢流分布的影响过程中，通过过量表达烟酸转磷酸核糖激酶使胞内NAD(H)总量提高了41.7%；Heuser等人（Eng. Life Sci, 2007, 7: 343～353）通过过量表达烟酸转磷酸核糖激酶和NAD合成酶，或者同时表达这两个酶，使菌株胞内NAD(H)总量提高了2倍多，并将其应用到酶转化合成(R)-甲基-3-羟基丁胺过程中，使得NAD(H)的量不再成为限制因素，从而提高了酶转化的效率。众多科学实践也证明利用发酵调控手段可有效调节NAD(H)总量与NADH/NAD+比例，进而有效提高底物的利用率和产物生产水平。在利用Saccharomyces cerevisiaeTMB3001(Biotechnol Bioeng,2002,78:172～178)和Fusarium oxysporum(J Biosci Bioeng, 2004, 97: 299～-304. Enzyme Micro Technol, 2005, 36: 100～106)发酵木糖生产乙醇的过程中添加乙偶姻作为外源电子受体，有效地增加了胞内NAD+含量，提高了乙醇的产率；San等人(Metab Eng, 2002, 4: 182～192)在利用大肠杆菌生产1,2-丙二醇过程中，发现在稀释率为0.1 h-1恒化厌氧培养系统中，随着碳源还原性的增大，胞内NADH/NAD+比率从0.51(葡萄糖酸)增加到0.75(葡萄糖)和0.94(山梨醇)，并导致中心代谢流产物乙醇(消耗2 mol NADH)对乙酸(不消耗NADH)的比率分别为0.29、1和3.62。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种基于NAD(H)系统改造后的产丁二酸大肠杆菌基因工程菌株的构建方法，达到菌株的构建方法简单方便，构建得到的菌株发酵简单可行，易于工业化，产酸能力强的目的，从而大大降低了生产成本，提高经济效益。
为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案。
一种产丁二酸大肠杆菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于：
（1）纯化扩增出pncB基因，和/或纯化扩增出nadD基因，和/或纯化扩增出nadE基因后，构建得到过量表达烟酸磷酸核糖转移酶、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶、或者NAD合成酶中的一种或几种的表达质粒；
（2）将步骤（1）所述的质粒导入缺乏乳酸脱氢酶基因（ldhA），丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）活性的菌株E.coli NZN111的感受态，获得阳性转化子；
（3）利用步骤（2）的阳性转化子过量表达烟酸磷酸核糖转移酶、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶、或者NAD合成酶中的一种或几种，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，得到产丁二酸基因工程菌。
其中，上述方法的具体步骤实施起来包括下述7种方法：
A、过量表达烟酸磷酸核糖转移酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，获得产丁二酸基因工程菌株Escherichia coli LL101：
合成一对5’ 端带有酶切位点的引物，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，纯化扩增出的pncB基因后，表达质粒pTrc99a用与引物所设计的酶切位点一致的酶双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pncB；
将质粒pTrc99a-pncB导入大肠杆菌NZN111的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia coli LL101；
利用Escherichia coli LL101过量表达烟酸磷酸核糖转移酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力。
B、过量表达烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，获得产丁二酸基因工程菌株菌株Escherichia coli LL102：
合成一对5’ 端带有酶切位点的引物，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，纯化扩增出的nadD基因后，表达质粒pTrc99a用与引物所设计的酶切位点一致的酶双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-nadD；
将质粒pTrc99a-nadD导入大肠杆菌NZN111的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia coli LL102；
利用Escherichia coli LL102过量表达烟酸磷酸核糖转移酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力。
C、过量表达NAD合成酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，获得产丁二酸基因工程菌株菌株Escherichia coli LL103：
合成一对5’ 端带有酶切位点的引物，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，纯化扩增出的nadE基因后，表达质粒pTrc99a用与引物所设计的酶切位点一致的酶双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-nadE；
将质粒pTrc99a-nadE导入大肠杆菌NZN111的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia coli LL103；
利用Escherichia coli LL103过量表达烟酸磷酸核糖转移酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力。
D、共过量表达烟酸磷酸核糖转移酶和烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，获得产丁二酸基因工程菌株菌株Escherichia coli LL104：
合成一对5’ 端带有相同酶切位点的引物，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，纯化扩增出的nadD基因后，已构建的重组质粒pTrc99a-pncB用与引物所设计的酶切位点一致的酶单酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pncB-nadD；
将质粒pTrc99a-pncB-nadD导入大肠杆菌NZN111的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia coli LL104；
利用Escherichia coli LL104同时过量表达烟酸磷酸核糖转移酶和烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力。
E、共过量表达烟酸磷酸核糖转移酶和NAD合成酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，获得产丁二酸基因工程菌株菌株Escherichia coli LL105：
合成一对5’ 端带有相同酶切位点的引物，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，纯化扩增出的nadE基因后，已构建的重组质粒pTrc99a-pncB用与引物所设计的酶切位点一致的酶单酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pncB-nadE；
将质粒pTrc99a-pncB-nadE导入大肠杆菌NZN111的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia coli LL105；
利用Escherichia coli LL105同时过量表达烟酸磷酸核糖转移酶和NAD合成酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力。
F、共过量表达烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶和NAD合成酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，获得产丁二酸基因工程菌株菌株Escherichia coli LL106：
合成一对5’ 端带有相同酶切位点的引物，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，纯化扩增出的nadE基因后，已构建的重组质粒pTrc99a-nadD用与引物所设计的酶切位点一致的酶单酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-nadD-nadE；
将质粒pTrc99a-nadD-nadE导入大肠杆菌NZN111的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia coli LL106；
利用Escherichia coli LL106同时过量表达烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶和NAD合成酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力。
F、共过量表达烟酸磷酸核糖转移酶、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶和NAD合成酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，获得产丁二酸基因工程菌株菌株Escherichia coli LL107：
合成一对5’ 端带有相同酶切位点的引物，以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，纯化扩增出的nadE基因后，已构建的重组质粒pTrc99a-pncB-nadD用与引物所设计的酶切位点一致的酶单酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pncB -nadD-nadE；
将质粒pTrc99a-pncB -nadD-nadE导入大肠杆菌NZN111的感受态，获得的阳性转化子即为Escherichia coli LL107；
利用Escherichia coli LL107同时过量表达烟酸磷酸核糖转移酶、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶和NAD合成酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力。
本发明的有益效果在于：
（1）厌氧发酵过程中产大量诸如乙酸等对菌株有毒害作用的副产物，因此在利用本发明所述的基因工程菌发酵生产丁二酸时，考虑两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段进行产酸发酵。也可以选择性地采用膜分离技术，达到分离菌体的目的，再进而用于厌氧发酵。具体步骤如下：采用两阶段发酵模式，划线-80℃冻存管保藏的菌液到含有氯霉素、硫酸卡那霉素和氨苄青霉素的平板，挑取平板上长出的单菌落到5 mL LB培养基的试管，1%（v/v）接种量接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.8～1.0左右时用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵；
发酵结果表明，新构建的和大肠杆菌NAD(H)生物合成途径有关的基因工程菌Escherichia coli LL101、Escherichia coli LL102、Escherichia coli LL103、Escherichia coli LL104、Escherichia coli LL105、Escherichia coli LL106、Escherichia coli LL107恢复了氧化还原平衡，同时恢复了厌氧条件下代谢葡萄糖的能力。
（2）本发明采用分子生物学手段，调控表达大肠杆菌NAD(H)合成途径中的一个或多个基因，以有效提高大肠杆菌胞内NAD(H)总量及NADH/NAD+，结合发酵调控手段，实现微观与宏观两种调控手段的合理结合，从而大量提高丁二酸的产量及生产能力的方法未见公开，而这种应用将大大推进丁二酸产业的进步和发展。
附图说明
图1 大肠杆菌中NAD(H)的生物合成及分解途径。
图2 重组质粒pTrc99a-pncB的构建图谱。
图3重组质粒pTrc99a-nadD的构建图谱。
图4重组质粒pTrc99a-nadE的构建图谱。
图5重组质粒pTrc99a-pncB-nadD的构建图谱。
图6重组质粒pTrc99a-pncB-nadE的构建图谱。
图7重组质粒pTrc99a-nadD-nadE的构建图谱。
图8重组质粒pTrc99a-pncB-nadD-nadE的构建图谱。
图9 PCR产物pncB的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图10 PCR产物nadD的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图11 PCR产物nadE的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图12重组质粒pTrc99a-pncB的单双酶切鉴定图。
图13重组质粒pTrc99a-nadD的单双酶切鉴定图。
图14重组质粒pTrc99a-nadE的单双酶切鉴定图。
图15重组质粒pTrc99a-pncB-nadD的单双酶切鉴定图。
图16重组质粒pTrc99a-pncB-nadE的单双酶切鉴定图。
图17重组质粒pTrc99a-nadD-nadE的单双酶切鉴定图。
图18重组质粒pTrc99a-pncB-nadD-nadE的单双酶切鉴定图。
具体实施方式
本发明所述的大肠杆菌K12的来源是：购自中国科学院北京微生物研究所。
本发明所述的表达质粒用pTrc99a的来源是：购自Introvegen公司。
本发明所述的E.coli NZN111的来源是：Biotechnol Bioeng, 2001,74:89～95。
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
实施例1
本实施例说明纯化扩增出pncB基因，以构建过量表达烟酸磷酸核糖转移酶的表达质粒，恢复重组菌株在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，得到产丁二酸基因工程菌菌株Escherichia coli LL101的方法。
1、  构建过量表达烟酸磷酸核糖转移酶的表达质粒，其过程包括：
（1）    合成带有Nco I 和Hind III酶切位点的引物，
上游引物：5’- CATGCCATGGATGACACAATTCGCTTCTCCTG-3’
下游引物：5’-CCCAAGCTTCACTTGTCCACCCGTAAATGG-3’
（2）        以大肠杆菌K12系列为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的pncB基因后，表达质粒用pTrc99a分别用Nco I 和Hind III双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pncB。
2、  将质粒pTrc99a-pncB导入E.coli NZN111的感受态，获得的阳性转化子为新构建菌株，命名为Escherichia coli LL101。
实施例2
本实施例说明纯化扩增出nadD基因，以构建过量表达烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶的表达质粒，恢复重组菌株在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，得到产丁二酸基因工程菌株Escherichia coli LL102的方法。
1、  构建过量表达烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶的表达质粒，其过程包括：
（1）    合成带有Nco I 和Hind III酶切位点的引物，
上游引物：5’- CATGCCATGGGGCGGACGTATTTATCGACGGTTGA -3’
下游引物：5’- CCCAAGCTTCAGATTTTGCGCTTGCTCAATACCG -3’
（2）        以大肠杆菌K12系列为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 48s，35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的nadD基因后，表达质粒用pTrc99a分别用Nco I 和Hind III双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-nadD。
2、  将质粒pTrc99a-nadD导入E.coli NZN111的感受态，获得的阳性转化子为新构建菌株，命名为Escherichia coli LL102。
实施例3
本实施例说明纯化扩增出nadE基因，以构建过量表达NAD合成酶的表达质粒，恢复重组菌株在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，得到产丁二酸基因工程菌株Escherichia coli LL103的方法。
1、  构建过量表达NAD合成酶的表达质粒，其过程包括：
（1）    合成带有Nco I 和Hind III酶切位点的引物，
上游引物：5’-CATGCCATGGCGCTTGTCGTTTCAGTAGCAACGGG-3’
下游引物：5’-CCCAAGCTTCGCATCCGGCGTGAACAAATTACTC-3’
（2）        以大肠杆菌K12系列为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，64℃ 45 s，72℃ 57s，35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的nadE基因后，表达质粒用pTrc99a分别用Nco I 和Hind III双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-nadE。
2、  将质粒pTrc99a-nadE导入E.coli NZN111的感受态，获得的阳性转化子为新构建菌株，命名为Escherichia coli LL103。
实施例4
本实施例说明利用pncB基因和nadD基因构建共表达烟酸磷酸核糖转移酶和烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶的质粒，恢复重组菌株在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，得到产丁二酸基因工程菌株Escherichia coli LL104的方法。
1、  构建过量表达共表达烟酸磷酸核糖转移酶和烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶的表达质粒，其过程包括：
（1）合成两端都带有Hind III酶切位点的引物，
上游引物：5’- CCCAAGCTTGGCGGACGTATTTATCGACGGTTGA -3’
下游引物：5’- CCCAAGCTTCAGATTTTGCGCTTGCTCAATACCG -3’
（2）以大肠杆菌K12系列为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 48s， 35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的nadD基因后，表达质粒pTrc99a-pncB（实施例1中得到）用Hind III双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pncB-nadD。
2、将质粒pTrc99a-pncB-nadD导入E.coli NZN111的感受态，获得的阳性转化子为新构建菌株，命名为Escherichia coli LL104。
实施例5
本实施例说明利用pncB基因和nadE基因构建共表达烟酸磷酸核糖转移酶和NAD合成酶的质粒，恢复重组菌株在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，得到产丁二酸基因工程菌株Escherichia coli LL105的方法。
1、  构建过量表达共表达烟酸磷酸核糖转移酶和NAD合成酶的表达质粒，其过程包括：
（1）合成两端都带有Hind III酶切位点的引物，
上游引物：5’-CCCAAGCTTCGCTTGTCGTTTCAGTAGCAACGGG-3’
下游引物：5’-CCCAAGCTTCGCATCCGGCGTGAACAAATTACTC-3’
（2）以大肠杆菌K12系列为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，64℃ 45 s，72℃ 57s， 35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的nadE基因后，表达质粒pTrc99a-pncB（实施例1中得到）用Hind III双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pncB-nadE。
2、将质粒pTrc99a-pncB-nadE导入E.coli NZN111的感受态，获得的阳性转化子为新构建菌株，命名为Escherichia coli LL105。
实施例6
本实施例说明利用nadD基因和nadE基因构建共表达烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶和NAD合成酶的质粒，恢复重组菌株在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，得到产丁二酸基因工程菌株Escherichia coli LL106。
1、  构建过量表达共表达烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶和NAD合成酶的表达质粒，其过程包括：
（1）合成两端都带有Hind III酶切位点的引物，
上游引物：5’-CCCAAGCTTCGCTTGTCGTTTCAGTAGCAACGGG-3’
下游引物：5’-CCCAAGCTTCGCATCCGGCGTGAACAAATTACTC-3’
（2）以大肠杆菌K12系列为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，64℃ 45 s，72℃ 57s， 35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的nadE基因后，表达质粒pTrc99a-nadD（实施例2中得到）用Hind III双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-nadD-nadE。
2、将质粒pTrc99a-nadD-nadE导入E.coli NZN111的感受态，获得的阳性转化子为新构建菌株，命名为Escherichia coli LL106。
实施例7
本实施例说明利用pncB基因、nadD基因和nadE基因构建共表达烟酸磷酸核糖转移酶、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶和NAD合成酶的质粒，恢复重组菌株在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，得到产丁二酸基因工程菌株Escherichia coli LL107的方法。
1、  构建过量表达共表达烟酸磷酸核糖转移酶、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶和NAD合成酶的表达质粒，其过程包括：
（1）合成两端都带有Hind III酶切位点的引物，
上游引物：5’-CCCAAGCTTCGCTTGTCGTTTCAGTAGCAACGGG-3’
下游引物：5’-CCCAAGCTTCGCATCCGGCGTGAACAAATTACTC-3’
（2）以大肠杆菌K12系列为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，64℃ 45 s，72℃ 57s， 35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的nadE基因后，表达质粒pTrc99a-pncB-nadD（实施例4中得到）用Hind III双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pncB-nadD-nadE。
2、将质粒pTrc99a-pncB -nadD-nadE导入E.coli NZN111的感受态，获得的阳性转化子为新构建菌株，命名为Escherichia coli LL107。
实施例8
本实施例说明过量表达新构建的重组大肠菌株Escherichia coli LL101与出发菌株NZN111的NAD(H)总量及NADH/NAD+比例的比较，及两者发酵过程中耗糖及产酸能力的对比。
采用厌氧血清瓶发酵，先有氧摇瓶培养至OD600=3左右时，按接种量10%转接血清瓶厌氧发酵48 h。
厌氧血清瓶发酵用培养基为：LB+葡萄糖（20 g/L）+碱式碳酸镁0.48 g+Kan(卡那霉素30 μg/mL)+Amp(氨苄青霉素50 μg/mL)+Chl(氯霉素25 μg/mL)+0.3 mM IPTG+0.5 mM NA(烟酸)。
厌氧血清瓶培养后各种参数的测定结果见表1。
表1 厌氧血清瓶培养后各种参数的测定结果
Figure 2011100389393100002DEST_PATH_IMAGE001
大肠杆菌NZN111当导入质粒pTrc99a-pncB，过量表达烟酸磷酸核糖转移酶恢复了厌氧条件下重组菌的氧化还原平衡，NAD(H)的总量有明显的提高，同时也恢复了厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，同时主要的产物是丁二酸，无甲酸和乳酸的积累。
实施例9
本实施例说明过量表达新构建的重组大肠菌株Escherichia coli LL102与出发菌株NZN111的NAD(H)总量及NADH/NAD+比例的比较，及两者发酵过程中耗糖及产酸能力的对比。
采用厌氧血清瓶发酵，先有氧摇瓶培养至OD600=3左右时，按接种量10%转接血清瓶厌氧发酵48 h。
厌氧血清瓶发酵用培养基为：LB+葡萄糖（20 g/L）+碱式碳酸镁0.48 g+Kan(卡那霉素30 μg/mL)+Amp(氨苄青霉素50 μg/mL)+Chl(氯霉素25 μg/mL)+0.3 mM IPTG。
厌氧血清瓶培养后各种参数的测定结果见表2。
表2 厌氧血清瓶培养后各种参数的测定结果
Figure 166516DEST_PATH_IMAGE002
大肠杆菌NZN111当导入质粒pTrc99a-nadD，过量表达烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶效果不明显，没有恢复厌氧条件下重组菌的氧化还原平衡，NAD(H)的总量及NADH/NAD+的比例几乎没有变化，同时也没有恢复厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，积累了极少量的丁二酸。
实施例10
本实施例说明过量表达新构建的重组大肠菌株Escherichia coli LL103与出发菌株NZN111的NAD(H)总量及NADH/NAD+比例的比较，及两者发酵过程中耗糖及产酸能力的对比。
采用厌氧血清瓶发酵，先有氧摇瓶培养至OD600=3左右时，按接种量10%转接血清瓶厌氧发酵48 h。
厌氧血清瓶发酵用培养基为：LB+葡萄糖（20 g/L）+碱式碳酸镁0.48g+Kan(卡那霉素30 μg/mL)+Amp(氨苄青霉素50 μg/mL)+Chl(氯霉素25 μg/mL)+0.3 mM IPTG+0.5 mM NH4Cl。
厌氧血清瓶培养后各种参数的测定结果见表3。
表3厌氧血清瓶培养后各种参数的测定结果
Figure 2011100389393100002DEST_PATH_IMAGE003
大肠杆菌NZN111当导入质粒pTrc99a-nadE，过量表达NAD合成酶恢复了厌氧条件下重组菌的氧化还原平衡，NAD(H)的总量有明显的提高，也恢复了厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，同时主要的产物是丁二酸，无甲酸和乳酸的积累。
实施例11
本实施例说明过量表达新构建的重组大肠菌株Escherichia coli LL104与出发菌株NZN111的NAD(H)总量及NADH/NAD+比例的比较，及两者发酵过程中耗糖及产酸能力的对比。
采用厌氧血清瓶发酵，先有氧摇瓶培养至OD600=3左右时，按接种量10%转接血清瓶厌氧发酵48 h。
厌氧血清瓶发酵用培养基为：LB+葡萄糖（20 g/L）+碱式碳酸镁0.48 g+Kan(卡那霉素30 μg/mL)+Amp(氨苄青霉素50 μg/mL)+Chl(氯霉素25 μg/mL)+0.3 mM IPTG+0.5 mM NA(烟酸)。
厌氧血清瓶培养后各种参数的测定结果见表4。
表4厌氧血清瓶培养后各种参数的测定结果
大肠杆菌NZN111当导入质粒pTrc99a-pncB-nadD，过量共表达烟酸磷酸核糖转移酶和烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶恢复了NZN111厌氧条件下的氧化还原平衡，同时也恢复了厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，同时主要的产物是丁二酸，无甲酸和乳酸的积累。
实施例12
本实施例说明过量表达新构建的重组大肠菌株Escherichia coli LL105与出发菌株NZN111的NAD(H)总量及NADH/NAD+比例的比较，及两者发酵过程中耗糖及产酸能力的对比。
采用厌氧血清瓶发酵，先有氧摇瓶培养至OD600=3左右时，按接种量10%转接血清瓶厌氧发酵48 h。
厌氧血清瓶发酵用培养基为：LB+葡萄糖（20 g/L）+碱式碳酸镁0.48 g+Kan(卡那霉素30 μg/mL)+Amp(氨苄青霉素50 μg/mL)+Chl(氯霉素25 μg/mL)+0.3 mM IPTG+0.5 mM NA(烟酸) + 0.5 mM NH4Cl。
厌氧血清瓶培养后各种参数的测定结果见表5。
表5厌氧血清瓶培养后各种参数的测定结果
Figure 2011100389393100002DEST_PATH_IMAGE005
大肠杆菌NZN111当导入质粒pTrc99a-pncB-nadE，过量共表达烟酸磷酸核糖转移酶和NAD合成酶恢复了NZN111厌氧条件下的氧化还原平衡，同时也恢复了厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，同时主要的产物是丁二酸，无甲酸和乳酸的积累。实施例13
本实施例说明过量表达新构建的重组大肠菌株Escherichia coli LL106与出发菌株NZN111的NAD(H)总量及NADH/NAD+比例的比较，及两者发酵过程中耗糖及产酸能力的对比。
采用厌氧血清瓶发酵，先有氧摇瓶培养至OD600=3左右时，按接种量10%转接血清瓶厌氧发酵48 h。
厌氧血清瓶发酵用培养基为：LB+葡萄糖（20 g/L）+碱式碳酸镁0.48 g+Kan(卡那霉素30 μg/mL)+Amp(氨苄青霉素50 μg/mL)+Chl(氯霉素25 μg/mL)+0.3 mM IPTG + 0.5 mM NH4Cl。
厌氧血清瓶培养后各种参数的测定结果见表6。
表6厌氧血清瓶培养后各种参数的测定结果
大肠杆菌NZN111当导入质粒pTrc99a-nadD-nadE，过量共表达烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶和NAD合成酶恢复了NZN111厌氧条件下的氧化还原平衡，同时也恢复了厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，同时主要的产物是丁二酸，无甲酸和乳酸的积累。
实施例14
本实施例说明过量表达新构建的重组大肠菌株Escherichia coli LL107与出发菌株NZN111的NAD(H)总量及NADH/NAD+比例的比较，及两者发酵过程中耗糖及产酸能力的对比。
采用厌氧血清瓶发酵，先有氧摇瓶培养至OD600=3左右时，按接种量10%转接血清瓶厌氧发酵48 h。
厌氧血清瓶发酵用培养基为：LB+葡萄糖（20 g/L）+碱式碳酸镁0.48 g+Kan(卡那霉素30 μg/mL)+Amp(氨苄青霉素50 μg/mL)+Chl(氯霉素25 μg/mL)+0.3 mM IPTG + 0.5 mM NH4Cl。
厌氧血清瓶培养后各种参数的测定结果见表7。
表7厌氧血清瓶培养后各种参数的测定结果
Figure 2011100389393100002DEST_PATH_IMAGE007
大肠杆菌NZN111当导入质粒pTrc99a-pncB-nadD-nadE，过量共表达烟酸磷酸核糖转移酶、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶和NAD合成酶恢复了NZN111厌氧条件下的氧化还原平衡，同时也恢复了厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，同时主要的产物是丁二酸，无甲酸和乳酸的积累。

Claims (1)

1.一种产丁二酸大肠杆菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于：
（1）纯化扩增出pncB基因，和/或纯化扩增出nadD基因，和/或纯化扩增出nadE基因后，构建得到过量表达烟酸磷酸核糖转移酶、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶、或者NAD合成酶中的一种或几种的表达质粒；
（2）将步骤（1）所述的质粒导入缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的菌株E.coliNZN111的感受态，获得阳性转化子；
（3）利用步骤（2）的阳性转化子过量表达烟酸磷酸核糖转移酶、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶、或者NAD合成酶中的一种或几种，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，得到产丁二酸基因工程菌。
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