BRPI0618705B1 - Anticorpos antagonistas humanizados direcionados contra peptídeo relacionado ao gene da calcitonina, composição farmacêutica e uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

anticorpos antagonistas direcionados contra peptídeo relacionado ao gene da calcitonina, composição farmacêutica e uso dos mesmos. a presente invenção refere-se a métodos para prevenir ou para tratar distúrbios associados a cgrp, tais como sintomas vasomotores, incluindo dores de cabeça (por exemplo, enxaqueca, grupo de dor de cabeça, e dor de cabeça por tensão) e febres, pela administração de um anticorpo antagonista anti-cgrp. o anticorpo antagonista g1 e anticorpos derivados de g1 direcionados a cgrp são também descritos.

Description

(54) Título: ANTICORPOS ANTAGONISTAS HUMANIZADOS DIRECIONADOS CONTRA PEPTÍDEO RELACIONADO AO GENE DA CALCITONINA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DOS MESMOS (51) Int.CI.: A61K 39/395; A61P 5/24 (30) Prioridade Unionista: 14/11/2005 US 60/736,623 (73) Titular(es): RINAT NEUROSCIENCE CORPORATION (72) Inventor(es): JOERG ZELLER; KRISTIAN TODD POULSEN; YASMINA NOUBIA ABDICHE; JAUME PONS; SIERRA JONES COLLIER; ARNON ROSENTHAL

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para

ANTICORPOS ANTAGONISTAS HUMANIZADOS DIRECIONADOS CONTRA PEPTÍDEO RELACIONADO AO GENE DA CALCITONINA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DOS MESMOS.

Este pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente U.S. N° 60/736.623, depositado em 14 de novembro de 2005, que é aqui incorporado por referência.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao use de anticorpos antagonistas de anti-CGRP para a prevenção, melhora, ou tratamento de sintomas vasomotores, tais como dores de cabeça relacionadas à CGRP (por exemplo, enxaqueca), e febres.

Antecedentes da Invenção

CGRP (peptídeo relacionado ao gene calcitonina) é um neuropeptídeo de 37 aminoácidos, que pertence a uma família de peptídeos que inclui calcitonina, adrenomedulina e amilina. Nos seres humanos, duas formas de CGRP (α-CGRP e β-CGRP) existem, e têm atividades similares. Elas variam por três aminoácidos, e exibem distribuição diferencial. Pelo menos dois subtipos de receptor de CGRP podem também contar como atividades diferenciais. O CGRP é um neurotransmissor no sistema nervoso central, e tem sido mostrado para ser um vasodilatador potente na periferia, onde os neurônios contendo CGRP estão intimamente associados com os vasos sangüíneos. A vasodilatação mediada por CGRP é também associada com inflamação neurogênica, como parte de uma cascata de eventos que resulta no extravazamento de plasma e vasodilatação da microvasculatura, e está presente na enxaqueca.

O CGRP tem sido notado por sua possível ligação aos sintomas vasomotores (Wyon et al. Scand. J. Urol. Nephrol. 35: 92-96 (2001); Wyon et al. Menopause 7(1):25-30 (2000)). Os sintomas vasomotores (VMS), tais como febres e suadores noturnos, são os sintomas mais comuns associados com menopausa, ocorrendo em 60% a 80% de todas as mulheres em seguida a menopausa natural ou cirurgicamente induzida. As febres são, do

11/10/2017, pág. 9/17 i' mesmo modo, para serem uma resposta adaptiva do sistema nervoso central (CNS) para declinar os esteróides sexuais (Freedman Am. J. Human Biol. 13:453-464 (2001)). Até aqui, as terapias mais eficazes para febres são tratamentos baseados em hormônio, incluindo estrogênios e/ou algumas progestinas. Os tratamentos hormonais podem ser eficazes para aliviar febres, mas não são apropriados para todas as mulheres. Os sintomas fisiológicos e emocionais observados, tais como nervoso, fadiga, irritabilidade, insônia, depressão, perda de memória, dor de cabeça, ansiedade, nervosismo, ou inabilidade para se concentrar, são considerados por serem causa10 dos pela perda do sono, em seguida a febre e suadores noturnos (Kramer et al., In: Murphy et al., 3.sup.rd lnt'l Symposium on Recent Advances in Uroiogical Cancer Diagnosis and Tratamento-Proceedings, Paris, France?SCI: 3^7 (1992)).

Os homens também experimentam febres em seguida a retirada de hormônio de esteróide (andrógeno). Isto é verdadeiro nos casos de declínio de andrógeno associado à idade (Katovich, et al., Proceedings of the Society for Experimentai Biology & Medicine, 1990, 193(2): 129-35), bem como em casos extremos de perda de hormônio associada com tratamentos de câncer de próstata (Berendsen, et al., European Journal of Pharmacology,

2001, 419(1): 47-54). Mais de um terço destes pacientes experimentarão sintomas persistentes e freqüentes severos bastantes para causar desconforto e inconveniência significantes.

O CGRP é um vasodilatador potente que tem sido implicado na patologia de outros sintomas vasomotores, tais como todas as formas de dor de cabeça vascular, incluindo enxaquecas (com ou sem aura) e grupo de dor de cabeça. Durham, N. Engl. J. Med. 350:1073-1075, 2004. Os níveis de soro de CGRP na veia jugular externa são elevados em pacientes durante dor de cabeça de enxaqueca. Goadsby et al., Ann. Neurol. 28:183-7, 1990. A administração intravenosa de α-CGRP humano induz dor de cabeça e enxa30 queca em pacientes que sofrem de enxaqueca sem aura, sugerindo que o CGRP tem um papel causativo na enxaqueca. Lassen et al., Cephalalgia 22:54-61,2002.

1.

ί

Ο possível envolvimento do CGRP na enxaqueca tem sido a base para o desenvolvimento e teste de um número de compostos que inibem liberação de CGRP (por exemplo, sumatriptan), antagonizam no receptor de CGRP (por exemplo, derivado de dipeptídeo BIBN4096BS (Boerhringer Ingelheim); CGRP(8-37)), ou interagem com uma ou mais proteínas associadas a receptor, tais como, proteína de membrana de atividade de receptor (RAMP), ou proteína de componente de receptor (RCP), ambas das quais afetando a ligação de CGRP a seus receptores. Brain, S. et al., Trends in Pharmacological Sciences 23:51-53, 2002. Subtipos de Alfa-2 adrenoceptor e receptores de adenosina A1 também controlam (inibem) a liberação de CGRP e ativação trigeminal (Goadsby et al., Brain 125:1392-401, 2002). O agonista de receptor adenosina A1 GR79236 (metrafadil), que foi mostrado para inibir vasodilatação neurogênica e nocicepção trigeminal em seres humanos, pode também ter atividade antienxaqueca (Arulmani et ai., Cephalalgia 25:1082-1090, 2005; Giffin et al., Cephalalgia 23:287-292, 2003.)

Confundindo esta teoria está a observação que tratamento com compostos que inibem exclusivamente inflamação neurogênica (por exemplo, antagonistas de receptor taquicinin NK1), ou ativação trigeminal (por exemplo, agonistas de receptor de 5HTid), têm sido mostrados para ser relativamente ineficientes como tratamentos agudos para enxaqueca, conduzindo alguns investigadores a questionar se a inibição da liberação de CGRP é o mecanismo primário de ação de tratamentos eficazes antienxaqueca. Arulmani et al., Eur. J. Pharmacol. 500:315-330, 2004.

A enxaqueca é uma condição neurológica complexa comum que é caracterizada por ataques episódicos severos de dor de cabeça e características associadas, que podem incluir náusea, vômito, sensibilidade à luz, som ou movimento. Em alguns pacientes, a dor de cabeça é precedida por ou acompanhada por uma aura. A dor de cabeça pode ser severa e pode também ser unilateral em certos pacientes.

Os ataques de enxaqueca são disruptivos a vida diária. Nos Estados Unidos e Europa Ocidental, o predomínio total dos que sofrem de enxaqueca é 11% da população geral (6% homens; 15-18% mulheres). Além disso, a freqüência média de ataques em um indivíduo é 1,5/mês. Enquanto existe um número de tratamentos disponível para aliviar ou reduzir os sintomas, a terapia preventiva é recomendada para aqueles pacientes tendo mais do que 3-4 ataques de enxaqueca por mês. Goadsby et al. New Engl. J.

Med, 346(4): 257-275, 2002.

A variedade de intervenções farmacológicas que têm sido usadas para tratar enxaqueca e a variabilidade em respostas entre pacientes é um testamento para a natureza diversa desta enfermidade. Desse modo, tais fármacos relativamente não-seletivos como alcalóides de ergotina (por e10 xemplo, ergotamina, dihídroergotamina, metisergída), que exibem atividade ___ serotonérgica, bem como adrenérgica, noradrérgica e dopaminérgica, têm sido usadas a cerca de oitenta anos para tratar enxaqueca. Outros tratamentos incluem opiatos (por exemplo, oxicodona) e antagonistas β-adrenérgicos (por exemplo, propranolol). Alguns pacientes, usualmente aqueles com sin15 tomas mais suaves, são capazes de controlar seus sintomas com remédios sem prescrição, tais como um ou mais agentes antiinflamatórios nãoesteroidais (NSAIDs), tal como uma combinação de aspirina, acetaminofeno e cafeína (por exemplo, Excedrin® Enxaqueca).

Mais recentemente, alguns pacientes com enxaqueca têm sido tratados com topiramato, um anticonvulsivo que bloqueia os canais de sódio dependentes de voltagem, e certos receptores de glutamatos (AMPAcainato), que potencializam a atividade do receptor GABA-A, e bloqueiam anidrase carbônica. O sucesso relativamente recente de serotonina 5HT1B/1D e/ou agonistas de receptor de 5HT-la, tal como sumatriptano, em alguns pacientes, tem conduzido os pesquisadores a proporem uma etioiogia serotonérgica da enfermidade. Infelizmente, enquanto alguns pacientes respondem bem a este tratamento, outros são relativamente resistentes a estes efeitos.

Tem sido postulado que uma disfunção de um canal de íon no núcleo aminérgico da haste do cérebro leva a uma enfermidade, contudo, a patofisiologia precisa de enxaqueca não é ainda bem compreendida. Uma forma de enxaqueca, enxaqueca hemiplágica familial, tem sido mostrada estar associada com mutações sem sentido na subunidade at do canal de cálcio tipo P/Q de porta de voltagem, e é pensado do mesmo modo que outras mutações de canal de íon também serão encontradas em outras populações de pacientes. Enquanto a dilatação dos vasos sangüíneos está asso5 ciada com e exacerbam os sintomas de dor da enxaqueca, tais eventos neurovasculares são agora pensados serem um resultado de preferivelmente do que causativa da condição. A disfunção total das trajetórias de haste de cérebro que modulam entrada sensorial é considerada ser uma característica de unificação de enxaqueca. Goadsby, P.J. et al., New Engl. J. Med. 346(4):

257-275,2002.

____ Através de todo este pedido, várias publicações (incluindo patentes e pedidos de patente) são referenciadas. As descrições destas publicações em suas totaiidades são, desse modo, incorporadas por referência. Breve Sumário da Invenção

A invenção aqui revelada se refere a anticorpos antagonistas de anti-CGRP e a métodos de uso de anticorpos antagonistas de anti-CGRP para tratar ou prevenir sintomas vasomotores, tais como dores de cabeça, tal como enxaqueca com ou sem aura, enxaqueca hemiplégica, cluster de dores de cabeça, neuralgia de enxaqueca, dores de cabeça crônicas, dores de cabeça por tensão, e dores de cabeça resultantes de outras condições médicas (tais como infecção ou pressão aumentada na cabeça devido a um tumor). Outros sintomas vasomotores incluem febres.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método para tratar ou prevenir pelo menos um sintoma vasomotor em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP.

Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método para tratar ou prevenir dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca e grupo de dor de cabeça) em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para melhorar, controlar, reduzir incidência de, ou retardar o desenvolvimento ou t

progressão de dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca e grupo de dor de cabeça) em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP.

Em uma concretização adicional, a invenção proporciona méto5 dos para melhorar, controlar, reduzir incidência de, ou retardar o desenvolvimento ou progressão de dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca e grupo de dor de cabeça) em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP em combinação com pelo menos um agente adicionai útil para tratar dor de cabeça.

Tais agentes adicionais incluem agonistas similares a 5-HT1 (e agonistas ________gue agem em outros locais de 5-HT1), e fármacos antiinflamatórias nãoesteroidais (NSAIDs).

Exemplos de agonistas de 5-HT1 que podem ser usados na combinação com um anticorpo anti-CGRP incluem uma classe de compos15 tos conhecidos como triptanos, tais como sumatriptano, zolmitriptano, naratriptano, rizatriptano, eletriptano, almotriptan, e frovatriptano. Ergotina alcalóides e compostos relacionados são também conhecidos na técnica por terem atividade agonista de 5-HT, e têm sido usados para tratar dor de cabeça, tal como enxaqueca. Incluídos entre estes compostos estão ergotamina tartrato, ergonovina maleato, e mesilatos ergolóides (por exemplo, dihidroergocornina, dihidroergocristina, dihidroergocriptina, e dihidroergotamina mesilato (DHE 45)).

Exemplos de NSAIDs que podem ser usados em combinação com um anticorpo anti-CGRP incluem naproxeno, flurbiprofeno, cetoprofeno, oxaprozino, etodolac, indometacino, cetorolac, nabumetona, ácido mefanâmico, e piroxicano. NSAIDs adicionais incluem inibidores de ciclooxigenase2 (COX-2). Membros deste grupo incluem: celecoxib; rofecoxib; meloxicam; JTE-522; L-745,337; NS398; e sais farmaceuticamente aceitáveis destes.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para me30 Ihorar, controlar, reduzir incidência de, ou retardar o desenvolvimento ou progressão de febres em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP.

Ί

Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para melhorar, controlar, reduzir incidência de, ou retardar o desenvolvimento ou progressão de febres em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP em combi5 nação com pelo menos um agente adicional útil para tratar febres. Tais agentes adicionais úteis incluem, mas não estão limitados a, tratamentos baseados em hormônio, incluindo estrogenios e/ou progestinas.

Em uma concretização, o anticorpo antagonista anti-CGRP usado em qualquer dos métodos descritos acima é qualquer dos anticorpos con10 forme aqui descritos.

__ Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP reconhece um CGRP humano. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP se liga a ambos α-CGRP e β-CGRP humanos. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP se liga a CGRP humano e de rato. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista antiCGRP se liga a fragmentos de terminal C tendo 25-37 aminoácidos de CGRP. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP se liga ao epítopo de terminal C com 25-37 aminoácidos de CGRP.

Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP é um anticorpo monoclonal. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP é humanizado. Em algumas concretizações, o anticorpo é humano. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP é anticorpo G1 (conforme aqui descrito). Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP compreende um ou mais CDR(s) (tais como um, dois, três, quatro, cinco ou, em algumas concretizações, todos o seis CDRs) de anticorpo G1 ou variantes de G1 mostrados na Tabela 6. Em ainda outras concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP compreende a seqüência de aminoãcido da região variável de cadeia pesada mostrada na Figura 5 (SEQ ID NO: 1), e a seqüência de aminoácido da região variável de cadeia leve mostrada na Figura 5 (SEQ ID NO: 2).

Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma região constante modificada, tal como uma região constante que é imunologi8 camente inerte (incluindo pareialmente imunologicamente inerte), por exemplo, não dispara lisis mediado por complemento, não estimula citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), não ativa microglia, ou tendo reduzida uma ou mais destas atividades. Em algumas concretizações, a região constante é modificada conforme descrito em Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; Pedido PCT Ν^ρ PCT/GB99/01441; e/ou Pedido de Patente UK Ν^ρ 9809951.8. Em outras concretizações, o anticorpo compreende uma região constante lgG2 de cadeia pesada humana compreendendo as seguintes mutações: A330P331 a S330S331 (numeração de aminoácido com referência à seqüência de lgG2 tipo selvagem). Eur. J. Immunol. (1999) ______29:2613-2624. Em algumas concretizações, a região constante de cadeia pesada do anticorpo é uma cadeia pesada humana de IgG 1 com qualquer das seguintes mutações: 1) A327A330P331 a G327S330S331; 2) E233L234L235G236 a P233V234A235 com G236 retirado; 3)

E233L234L235 a P233V234A235; 4) E233L234L235G236A327A330P331 a

P233V234A235G327S330S331 com G236 retirado; 5) E233L234L235A327A330P331 a P233V234A235G327S330S331; e 6) N297 to A297, ou qualquer outro aminoácido exceto N. Em algumas concretizações, a região constante de cadeia pesada do anticorpo é uma cadeia pesa20 da de lgG4 humana com qualquer das seguintes mutações: E233F234L235G236 a P233V234A235 com G236 retirado; E233F234L235 a P233V234A235; e S228L235 a P228E235.

Em ainda outras concretizações, a região constante é aglicosilatada para glicosilação N-igante. Em algumas concretizações, a região cons25 tante é aglicosilatada para glicosilação N-igante por mutação do resíduo de fixação de oligossacarídeo (tal como Asn297), e/ou flanqueamento de resíduos que são parte da seqüência de reconhecimento de N-glicosilação na região constante. Em algumas concretizações, a região constante é aglicosilada para glicosilação N-igante. A região constante pode ser aglicosilatada para glicosilação N-igante enzimaticamente, ou por expressão em uma célula hospedeira deficiente de glicosilação.

A afinidade de ligação(K_D) de um anticorpo antagonista antiti ί

CGRP para CGRP (tal como α-CGRP humano conforme medido por ressonância de plasmon de superfície a uma temperatura apropriada, tal como 25 ou 37°C) pode ser cerca de 0,02 a cerca de 200 nM. Em algumas concretizações, a afinidade de ligação é qualquer de cerca de 200 nM, cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 20 pM, cerca de 15 pM, cerca de 10 pM, cerca de 5 pM, ou cerca de 2 pM. Em algumas concretizações, a afinidade de ligação é menor do que qualquer de cerca de 250 nM, cerca de 200 nM, cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, ou cerca de 50 pM.

O anticorpo antagonista anti-CGRP pode ser administrado antes de, durante e/ou após a dor de cabeça. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP é administrado antes do ataque da dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca e grupo de dor de cabeça). A administração de um anticorpo antagonista anti-CGRP pode ser por qualquer meio conhecido na técnica, incluindo: oralmente, intravenosamente, subcutaneamente, intra-arterialmente, intramuscularmente, intracardialmente, intraespinhalmente, intratoraxicamente, intraperitonealmente, intraventricularmente, sublingualmente, transdermalmente, e/ou via inalação. A administra20 ção pode ser sistêmica, por exemplo, intravenosamente, ou localizada.

Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP pode ser administrado em conjunto com um outro agente, tal como outro agente para tratar dor de cabeça.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uso de um anticorpo antagonista anti-CGRP para a manufatura de um medicamento para uso em qualquer dos métodos descritos aqui, por exemplo, para tratar ou prevenir dor de cabeça.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca e grupo de dor de cabeça) compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP, em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um kit para uso em qualquer dos métodos descritos aqui. Em algumas concretizações, o kit compreende um recipiente, uma composição compreendendo um anticorpo antagonista anti-CGRP descrito aqui, em combinação com um veículo far5 maceuticamente aceitável, e instruções para uso da composição em qualquer dos métodos descritos aqui.

A presente invenção também proporciona anticorpos antagonistas de anti-CGRP e polipeptídeos derivados a partir do anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6. Conseqüentemente, em um aspecto, a invenção é um anticorpo G1 (permutavelmente denominado G1) que é produzido por vetores de expressão tendo N^es de Acesso ATCCPTA-6866 e PTA-6867. Por exemplo, em uma concretização está um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada produzida pelo vetor de expressão com N- de Acesso ATCC PTA-6867. Em uma concretização adicionai está um anticorpo compreendendo uma cadeia leve produzida pelo vetor de expressão N- de Acesso ATCC PTA-6866. As seqüências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de G1 são mostradas na Figura 5. As porções de região de determinação de complementaridade (CDR) do anticorpo G1 (incluindo CDRs de Chothia e Kabat) são também mostradas na

Figura 5. É compreendido que referência a qualquer parte de ou região total de G1 envolve seqüências produzidas pelos vetores de expressão tendo N-s de Acesso ATCCPTA-6866 e PTA-6867, e/ou as seqüências representadas na Figura 5. A invenção também proporciona variantes de anticorpo de G1 com seqüências de aminoácido representadas na Tabela 6.

Em um aspecto, a invenção é um anticorpo compreendendo um domínio de V_H que é peto menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97% pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% i30 dêntico na seqüência de aminoácido para SEQ ID NO: 1.

Em outro aspecto, a invenção é um anticorpo compreendendo um domínio de V_L que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos

87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97% pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntico na seqüência de aminoácido para SEQ ID NO: 2.

Em outro aspecto, a invenção é um anticorpo compreendendo um fragmento ou uma região do anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6. Em uma concretização, o fragmento é uma cadeia leve do anticorpo G1. Em outra concretização, o fragmento é uma cadeia pesada do anticorpo G1. Em ainda outra concretização, o fragmento contém uma ou mais regiões variáveis a partir de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada __ do anticorpo G1. Em ainda outra concretização, o fragmento contém uma ou mais regiões variáveis a partir de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada mostrada na Figura 5. Em ainda outra concretização, o fragmento contém um ou mais CDRs a partir de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo G1.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (que podem ou não podem ser um anticorpo) compreendendo um V_H CDR3 conforme colocado em SEQ ID NO: 5, ou uma seqüência que difere de SEQ ID NO: 5 por 1, 2, 3, 4, ou 5 substituições de aminoácido. Em uma concretiza20 ção particular, tais substituições de aminoácido são substituições conservativas.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (que podem ou não podem ser um anticorpo) compreendendo um V_L CDR3 conforme colocado em SEQ ID NO: 8, ou uma seqüência que difere de SEQ ID

NO: 8 por 1, 2, 3, 4, ou 5 substituições de aminoácido. Em uma concretização particular, tais substituições de aminoácido são substituições conservativas.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (que podem ou não podem ser um anticorpo) compreendendo qualquer um ou mais dos seguintes: a) um ou mais CDR(s) de anticorpo G1, ou suas variantes, conforme mostrados na Tabela 6; b) CDR H3 a partir da cadeia pesada de anticorpo G1, ou suas variantes, conforme mostrados na Tabela 6; c)

CDR L3 a partir da cadeia leve de anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6; d) três CDRs a partir da cadeia leve de anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6; e) três CDRs a partir da cadeia pesada de anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6; f) três

CDRs a. partir da cadeia leve e três CDRs a partir da cadeia pesada de anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6. A invenção proporciona adicionalmente polipeptídeos (que podem ou não podem ser um anticorpo) compreendendo qualquer um ou mais dos seguintes: a) um ou mais (um, dois, três, quatro, cinco, ou seis) CDR(s) derivados a partir do anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6; b) um CDR derivado de CDR H3 __ a partir da cadeia pesada de anticorpo G1; e/ou c) um CDR derivado de

CDR L3 a partir da cadeia leve de anticorpo G1. Em algumas concretizações, o CDR é um CDR mostrado na Figura 5. Em algumas concretizações, o um ou mais CDRs derivados do anticorpo G1, ou suas variantes, mostra15 dos na Tabela 6, são pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, peio menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% idênticos ao pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou pelo menos seis CDRs de G1 ou suas variantes.

Em algumas concretizações, o CDR é um CDR de Kabat. Em outras concretizações, o CDR é um CDR de Chothia. Em outras concretiza25 ções, o CDR é uma combinação de um CDR de Kabat e um CDR de Chothia (também denominado CDR combinado ou CDR estendido). Em outras palavras, para qualquer dada concretização contendo mais do que um CDR, os CDRs podem ser de Kabat, de Chothia, e/ou combinado.

Em algumas concretizações, o polipeptídeo (tal como um anti30 corpo) compreende a seqüência de aminoácido de KASKXaaVXaaTYVS, no qual Xaa na posição 5 é R, W, G, L, ou N; e no qual Xaa na posição 7 é T, A, D, G, R, S, W, ou V. Em algumas concretizações, a seqüência de aminoácí13 do de KASKXaaVXaaTYVS é CDR1 de uma cadeia leve de anticorpo.

Em algumas concretizações, o polipeptídeo (tal como um anticorpo) compreende a seqüência de aminoácido de XaaXaaSNRYXaa, no qual Xaa na posição 1 é G ou A; no qual Xaa na posição 2 é A ou H; e no qual Xaa na posição 7 é L, T, I, ou S. Em algumas concretizações, a seqüência de aminoácido de XaaXaaSNRYXaa é CDR2 de uma cadeia leve de anticorpo.

Em algumas concretizações, o polipeptídeo (tal como um anticorpo) compreende a seqüência de aminoácido de EIRSXaaSDXaaXaaAT10 XaaYAXaaAVKG, no qual Xaa na posição 5 é E, R, K, Q, ou N; no qual Xaa ______ na posição 8 é A, G, N, Ε, H, S, L, R, C, F, Y, V, D, ou P; no qual Xaa na posição 9 é S, G, T, Y, C, E, L, A, P, I, N, R, V, D, ou M; no qual Xaa na posição 12 é H ou F; no qual Xaa na posição 15 é E ou D. Em algumas concretizações, the seqüência de aminoácido de EIRSXaaSDXaaXaaATXaaYAXa15 aAVKG é CDR2 de uma cadeia pesada de anticorpo.

Em algumas concretizações, o polipeptídeo (tal como um anticorpo) compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO;1_} no qual o resíduo de aminoácido na posição 99 de SEQ ID NO:1 é L ou é substituído por A, N, S, T, V, ou R; e no qual o resíduo de aminoácidos na posição 100 de SEQ ID NO:1 é A ou é substituído por L, R, S, V, Y, C, G, T, K, ou P.

Em algumas concretizações, o anticorpo da invenção é um anticorpo humano. Em outras concretizações, o anticorpo da invenção é um anticorpo humanizado. Em algumas concretizações, o anticorpo é monoclonal. Em algumas concretizações, o anticorpo (ou polipeptídeo) é isolado. Em al25 gumas concretizações, o anticorpo (ou polipeptídeo) é substancialmente puro.

A região constante de cadeia pesada dos anticorpos pode ser de quaisquer tipos de região constante, tais como IgG, IgM, IgD, IgA, e IgE; e quaisquer isotipos, tais como IgG 1, lgG2, lgG3, e lgG4.

Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma região constante modificada conforme descrito acima.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um polínucleotídeo (que pode ser isolado) compreendendo um polinucleotídeo que codifica um fragmento, ou uma região do anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6. Em uma concretização, o fragmento é uma cadeia leve do anticorpo G1. Em outra concretização, o fragmento é uma cadeia pesada do anti5 corpo G1. Em ainda outra concretização, o fragmento contém uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo G1. Em ainda outra concretização, o fragmento contém uma ou mais (isto é, uma, duas, três, quatro, cinco, ou seis) regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anti10 corpo G1.

_______Em outro aspecto, a invenção é um polinucleotídeo (que pode ser isolado) compreendendo um polinucleotídeo que codifica para o anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6. Em algumas concretizações, o polinucleotídeo compreende qualquer ou ambos dos polinucleotí15 deos mostrados em SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 10.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polinucleotídeos que codificam quaisquer dos anticorpos (incluindo fragmentos de anticorpo), ou polipeptideos aqui descritos.

Em outro aspecto, a invenção proporciona vetores (incluindo ve20 tores de expressão e clonagem) e células hospedeiras compreendendo qualquer do polinucleotídeo aqui revelado. Em algumas concretizações, o vetor é pDb.CGRP.hFcGI tendo ATCC Ν^β PTA-6867. Em outras concretizações, o vetor é pEb.CGRP.hKGl tendo ATCC N^Q PTA-6866.

Em outro aspecto, a invenção é uma célula hospedeira compre25 endendo um polinucleotídeo que codifica quaisquer dos anticorpos aqui descritos.

Em outro aspecto, a invenção é um complexo de CGRP ligado por qualquer dos anticorpos ou polipeptideos aqui descritos. Em algumas concretizações, o anticorpo é anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na

Tabela 6.

Em outro aspecto, a invenção é uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de quaisquer dos polipeptideos (in<

eluindo anticorpos, tal como um anticorpo compreendendo uma ou mais CDRs de anticorpo G1), ou polinucleotídeos descritos aqui, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em outro aspecto, a invenção é um método de gerar anticorpo 5 G1 compreendendo cultura de uma célula hospedeira ou progenia desta sob condições que permitem produção de anticorpo G1, no qual a célula hospedeira compreende um vetor de expressão que codifica para anticorpo G1; e, em algumas concretizações, purifica o anticorpo G1. Em algumas concretizações, o vetor de expressão compreende uma ou ambas das seqüências de polinucleotídeo mostradas em SEG ID NO:9 e SEG ID NO: 10.

Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos de gerar quaisquer dos anticorpos ou polipeptídeos aqui descritos pela expressão de um ou mais polinucleotídeos que codificam o anticorpo (que podem ser separadamente expressos como uma cadeia simples leve ou pesada, ou am15 bas uma cadeia leve e pesada são expressas a partir de um vetor), ou o polipeptídeo em uma célula adequada, geralmente seguido por recuperação e/ou isolamento do anticorpo ou polipeptídeos de interesse.

O anticorpo antagonista anti-CGRP e polipeptídeos, e polinucleotídeos que codificam os anticorpos e polipeptídeos da presente invenção, podem ser usados para tratar, prevenir, melhorar, controlar ou reduzir incidência de doenças associadas com função anormal de CGRP, tal como dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca, cluster dor de cabeça, dor de cabeça crônica, e dor de cabeça por tensão), e outras condições que podem ser tratadas ou prevenidas por antagonização da atividade de CGRP.

Em outro aspecto, a invenção proporciona kits e composições compreendendo quaisquer uma ou mais das composições aqui descritas. Estes kits, geralmente em acondicionamentos adequados e providos com instruções apropriadas, são úteis para quaisquer dos métodos aqui descritos.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 é uma Tabela mostrando afinidades de ligação de 12 anticorpos de murina para fragmentos de α-CGRP a-CGRP humana substi16 tuída por alanina. As afinidades de ligação foram medidas a 25°C usando-se Biacore por escoamento Fabs através de CGRPs no chip. Os valores representam a perda na afinidade de mutantes de alanina em relação ao fragmento parenteral, 25-37 (itálico), exceto K35A, que foi derivado de um 19-37 de origem. ^a indica afinidades para 19-37, e os 25-37 fragmentos são o desvio padrão ± médio de duas medições independentes em chips de sensor diferentes. ^b indica estas interações desviadas de um modelo de interação bimolecular simples devido a uma taxa externa bifásica, desse modo suas afinidades foram determinadas usando-se um modelo de mudança conforma10 cíonal. Chave de escala cinza: branco (1,0) indica afinidade parental; cinza __claro (menos do que 0,5) indica afinidade mais alta do que de origem; cinza escuro (mais do que 2) indica afinidades mais baixa do que de origem; e preto indica que nenhuma ligação foi detectada.

As Figuras 2A e 2B mostram o efeito de administrar CGRP 8-37 (400 nmol/kg), anticorpo 4901 (25 mg/kg), e anticorpo 7D11 (25 mg/kg) no fluxo de sangue da pele medido no fluxo de célula de sangue após estimulação de pulso elétrico por 30 segundos. CGRP 8-37 foi administrado intravenosamente (iv) 3-5 minutos antes da estimulação de pulo elétrico. Os anticorpos foram administrados intraperitonealmente (IP) 72 horas antes da es20 timulação de pulso elétrico. Cada ponto nos gráficos representa AUC de um rato tratado sob as condições conforme indicadas. Cada linha nos gráficos representa AUC médias de ratos tratados sob a condição conforme indicado. AUC (área sob a curva) igual a Afluxo x Atempo. Afluxo representa a mudança de unidades de fluxo após a estimulação de pulso elétrico; e Atempo representa o período de tempo levado para o nível de fluxo de célula de sangue retornar ao nível antes da estimulação de pulso elétrico.

A Figura 3 mostra o efeito de administrar dosagem diferente de anticorpo 4901 (25 mg/kg, 5 mg/kg, 2,5 mg/kg, ou 1 mg/kg) no fluxo de sangue na pele medido como fluxo de célula sanguínea após estimulação de pulso elétrico por 30 segundos. Os anticorpos foram administrados intravenosamente (IV) 24 horas antes da estimulação de pulso elétrico. Cada ponto no gráfico representa AUC de um rato tratado sob as condições conforme indicado. A linha no gráfico representa o AUC médio tratado sob a condição conforme indicado.

As Figuras 4A e 4B mostram o efeito de administrar anticorpo 4901 (1 mg/kg ou 10 mg/kg, i.v.), anticorpo 7E9 (10 mg/kg, i.v.), e anticorpo

8B6 (10 mg/kg, i.v.) no fluxo de sangue na pele medido como fluxo de célula sanguínea após estimulação de pulso elétrico por 30 segundos. Os anticorpos foram administrados intravenosamente (i.v.), seguido por estimulação de pulso elétrico em 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, e 120 minutos após administração de anticorpo. O eixo Y representa a percentagem de AUC conforme comparada ao nível de AUC quando nenhum anticorpo foi admi___nistrado (tempo 0). O eixo X representa o período de tempo (minutos) entre a administração de anticorpos e estimulação de pulso elétrico. indica P < 0,05, e **“ indica P< 0,01, conforme comparado para tempo 0. Os dados foram analisados usando-se ANOVA de uma via com um teste de compara15 ção múltipla de Dunnett,

A Figura 5 mostra a seqüência de aminoácido da região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO:1) e região variável de cadeia leve (SEQ ID NO:2) de anticorpo G1. Os CDRs de Kabat no texto em negrito e os CDRs de Chothia são sublinhados. Os resíduos de aminoácidos para a região vari20 ável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve são numerados seqüencialmente.

A Figura 6 mostra o mapeamento de epítopo de anticorpo G1 por competição de peptídeo usando Biacore. α-CGRP humana Nbiotinilatada foi capturada no chip de sensor SA. G1 Fab (50 nM) na ausên25 cia de um peptídeo de competição ou pré-incubado por 1 hora com 10 uM de um peptídeo de competição foi escoado no chip. A ligação de G1 Fab a aCGRP humana no chip foi medida. O eixo Y representa a percentagem de ligação bloqueada pela presença do peptídeo de competição comparada com a ligação na ausência do peptídeo de competição.

AFigura 7 mostra o efeito de administrar anticorpo G1 (1 mg/kg ou 10 mg/kg, i.v.), ou veículo (PBS, 0,01% de Tween 20), no fluxo de sangue na pele medido como o fluxo de célula sanguínea após estimulação de pulso elétrico por 30 segundos. O anticorpo G1 ou veículo íoi administrado intravenosamente (Lv.), seguido por estimulação de pulso elétrico de nervo em 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, e 120 minutos após administração de anticorpo. O eixo Y representa a percentagem de AUC conforme comparada ao nível de AUC guando nenhum anticorpo ou veículo (definido como 100%) foi administrado (tempo 0). O eixo X representa o período de tempo (minutos) entre a administração de anticorpos e estimulação de pulso elétrico. indica P < 0,05, e ** indica P < 0,01, conforme comparado ao veículo. Os dados foram analisados usando testes de ANOVA de duas vias e pós-teste de Bonferroni.

_____________A Figura 8A mostra o efeito de administrar anticorpo G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg ou 10 mg/kg, i.v.), ou veículo (PBS, 0,01% de Tween 20) no fluxo de sangue na pele medido como o fluxo de célula sanguínea após estimulação de pulso elétrico por 30 segundos 24 horas após dosagem. O an15 ticorpo G1 ou veículo foi administrado intravenosamente (i.v.) 24 horas antes da estimulação de pulso elétrico do nervo. O eixo Y representa a área total sob a curva (mudança no fluxo de célula sanguínea multiplicado pela mudança no tempo de estimulação até que o fluxo retorne para a linha de base, AUC). O eixo X representa a variação de doses de anticorpo G1. indica P < 0,05, e ** indica P < 0,01, conforme comparado ao veículo. Os dados foram analisados usando testes de ANOVA de uma via, e de comparação múltipla de Dunn.

A Figura 8B mostra o efeito de administrar anticorpo G1 (0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg ou 10 mg/kg, i.v.), ou veículo (PBS, 0,01% de Twe25 en 20) no fluxo de sangue na pele medido como o fluxo de célula sanguínea após estimulação de pulso elétrico por 30 segundos 7 dias após dosagem. O anticorpo G1, ou veículo, foi administrado intravenosamente (i.v.) 7 dias antes da estimulação de pulso elétrico do nervo. O eixo Y representa AUC total. O eixo X representa a variação de doses de anticorpo G1. ** indica P <

0,01, e *** indica P < 0,001, conforme comparada ao veículo. Os dados foram analisados usando teste de ANOVA de uma via, e de comparação múltipla de Dunn.

A Figura 8C é uma análise de ajuste de curva dos dados das figuras 8A e 8B. O anticorpo G1 ou veículo foi administrado intravenosamente (i.v.), ou 24 horas, ou 7 dias antes da estimulação de pulso elétrico do nervo. O eixo Y representa AUC total. O eixo X representa a variação de do5 ses de anticorpo G1 em mg/kg em uma escala logarítmica para determinar ec₅₀.

A Figura 9 mostra o efeito do anticorpo mu7E9 (10 mg/kg), BIBN4096BS ou veículo (PBS, 0,01% de Tween 20) na mudança no diâmetro da artéria meningeai média após estimulação de campo elétrico. O anti10 corpo mu7E9, B1BN4096BS ou veículo foi administrado intravenosamente ____(i.v.) no tempo 0 minuto após, uma resposta da linha de base ao estímulo elétrico ser estabelecida. O eixo Y representa a mudança no diâmetro da artéria meningeai média após estimulação do campo elétrico. O diâmetro restante corresponde a 0%. O eixo X representa tempo (minutos) de estimu15 lação de pulso elétrico, indica P < 0,05, e ** indica P < 0,01, conforme comparado ao veículo. Os dados foram analisados no teste de ANOVA de uma via e de comparação múltipla de Dunett.

A Figura 10 mostra o efeito da variação de doses de anticorpo G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg ou 10 mg/kg, i.v.), ou veículo (PBS, 0,01% de Tween

20) na mudança no diâmetro da artéria meningeai média após estimulação de campo elétrico. O anticorpo G1 ou veículo foi administrado intravenosamente (i.v.) 7 dias antes da estimulação de campo elétrico. O eixo Y representa a mudança no diâmetro da artéria meningeai média. O diâmetro restante corresponde a 0%. O eixo X representa a voltagem da estimulação.

indica P < 0,05, ** indica P < 0,01, e “*** indica P < 0,001, conforme comparado ao veículo. Os dados foram analisados usando pós-testes de ANOVA de uma via e Bonferroni.

A Figura 11A mostra o efeito do anticorpo mu4901 (10mg/kg), ou veículo (PBS, 0,01% de Tween 20), administrado intravenosamente (i.v.) 24 horas antes, na diminuição na temperatura do núcleo induzida por injeção subcutânea de naloxona (1 mg/kg) em ratos viciados em morfina. O eixo Y representa a diferença de temperatura a partir da linha de base. O eixo X / 1 tf tf representa o tempo medido a partir do ponto de injeção de naloxona.

A Figura 11B mostra o efeito do anticorpo mu4901 (10mg/kg), ou veícuio (PBS, 0,01% de Tween 20), administrado intravenosamente (i.v.) 24 horas antes, no aumento na temperatura superficial fina, induzida por injeção subcutânea de naloxona (1 mg/kg) em ratos viciados em morfina. O eixo Y representa a diferença de temperatura a partir da linha de base. O eixo X representa o tempo medido a partir do ponto de injeção de naloxona. Descrição Detalhada da Invenção

A invenção aqui revelada proporciona métodos para tratar e/ou 10 prevenir sintomas vasomotores, tais como dor de cabeça (por exemplo, en_______xagnfioa_r grupo de dor de cabeça, dor de cabeça crônica, e dor de cabeça por tensão) ou febre em um indivíduo pela administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo antagonista antiCGRP.

A invenção aqui revelada também proporciona anticorpos antagonistas de anti-CGRP e polipeptídeos derivados de G1 ou suas variantes mostrados na Tabela 6. A invenção também proporciona métodos de produzir e usar estes anticorpos e polipeptídeos.

Técnicas Gerais

A prática da presente invenção empregará, a menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro da técnica. Tais técnicas são explanadas totalmente na literatura, tais como, Clonagem Molecular: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Síntese de Oligonucleotídeo (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Biologia Celular: A Laboratory Notebook (J.E. Cellular, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (RJ. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press;

Cultura de Célula e Tecido: Laboratory Procedimentos (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. BJackweil, eds.); Gene Transfer Vetors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et at., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Anticorpos (P. Finch, 1997); Anticorpos: a practical approach (D. Catty,, ed., IRL Press, 1988-1989); Anticorpos monoclonais: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Uso de anticorpos: a labora10 tory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, _______1999); The Anticorpos (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic

Publishers, 1995).

Definições

Um anticorpo é uma molécula de imunoglobulina capaz de se 15 ligar especificamente a um alvo, tais como, um carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo, etc., através de pelo menos um local de reconhecimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Conforme aqui usado, o termo envolve não somente intactar anticorpos policlonais ou monoclonais, mas também fragmentos destes (tais como, Fab,

Fab', F(ab')₂, Fv), cadeia simples (ScFv), mutantes destes, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo (tais como anticorpos de domínio), e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um local de reconhecimento de antígeno. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tais como, IgG, IgA, ou IgM (ou subclasses destes), e o anticorpo não necessita ser de qualquer classe particular. Dependendo da seqüência de aminoácido do anticorpo do domínio constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser transferidas para classes diferentes. Existem cinco classes maiores de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias destas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de imunoglobulinas são denomimados alfa, delta, épsi22 lon, gama, e mu, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bemconhecidas.

Conforme aqui usado, anticorpo monoclonal refere-se a um 5 anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo uma população são idênticos, exceto para possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um local antigênico simples. Além disso, em contraste às preparações de anticorpo policlonal, gue_ incluem tipicamente anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um determinante simples no antígeno. O modificador monoclonal indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não é para ser construído como requerendo produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler e Milstein, 1975, Nature, 256:495, ou podem ser produzidos por méto20 dos de DNA recombinante, tais como descritos na Patente U.S. N^e 4.816.567. Os anticorpos monoclonais podem também serem isolados a partir de bibliotecas de fago gerados usando as técnicas descritas em McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554, por exemplo.

Conforme usado aqui, anticorpos humanizados se referem a anticorpos de formas de não-humano (por exemplo, murina) que são imunoglobulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobuiina, ou fragmentos destas (tais como, Fv, Fab, Fab', F(ab‘)₂, ou outras subseqüências de ligação de antígeno de anticorpos) que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobuiina não-humana. Na maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) nas quais resíduos de uma região de determinação de complementaridade (CDR) do recipiente são substituídos por resíduos de uma CDR de espécies não-humanas (anticorpo

-*. Ά ί+5 doador), tais como, camundongo, rato, ou coelho, tendo a especificidade afinidade e atividade biológica desejadas. Em alguns exemplos, resíduos de região de estrutura Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, o anticorpo humaniza5 do pode compreender resíduos que são encontrados, nem no anticorpo recipiente, nem na CDR importada ou seqüências de estrutura, mas são incluídos para adicionalmente refinar e otimizar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas das regiões de CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não-humana, e todas ou substancialmente todas das regiões de FR são aquelas de uma seqüência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado otimamente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região de imunoglobulina constante, ou domínio (Fc), tipicamente que de uma de uma imunoglobulina humana. Os anticorpos podem ter regiões Fc modificadas conforme descrito no WO 99/58572. Outras formas de anticorpo humanizados têm uma ou mais CDRs (uma, duas, três, quatro, cinco, seis), que são alteradas com relação ao anticorpo original, que são também denominadas uma ou mais CDRs derivadas de¹¹ uma ou mais CDRs a partir do anticorpo original.

Conforme usado aqui, anticorpo humano significa um anticorpo tendo uma seqüência de aminoácido correspondente àquela de um anticorpo produzido por um ser humano, e/ou tenha sido produzido usando-se quaisquer das técnicas para produção de anticorpos humanos conhecidos na técnica, ou aqui revelados. Esta definição de um anticorpo humano inclui anticorpos compreendendo pelo menos um polipeptídeo de cadeia pesada humano, ou pelo menos um polipeptídeo de cadeia leve humano. Um tal exemplo é um anticorpo compreendendo polipeptídeos de cadeia leve de mu· rina e de cadeia pesada humano. Os anticorpos humanos podem ser produ30 zidos usando-se várias técnicas conhecidas na arte. Em uma concretização, o anticorpo humano é selecionado a partir de uma biblioteca de fago, onde a biblioteca de fago expressa anticorpo humanos (Vaughan et al., 1996, Natu24 re Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:61576162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Os anticorpos humanos podem também serem produzidos pela introdução de loci de imunogiobulina humana em animais transgênicos, por exemplo, camundongos nos quais os genes de imunoglobulina endógenos foram parcialmente ou completamente inativados. Esta aproximação é descrita nas Patentes dos Estados Unidos 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016. Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado por imortalização de linfócitos B humanos que produzem um anticorpo dirigido contra um antígeno alvo (tais _ linfócitos B poderri ser recuperados de um indivíduo, ou podem ter sido imunizados in vitro). Vide, por exemplo, Cole et al., Antibody monoclonals and Câncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunok, 147(1):86-95; e Patente U.S. N² 5.750.373.

Conforme usado aqui, o termo peptídeo relacionado ao gene calcitonina'¹ e CGRP se referem a qualquer forma de peptídeo relacionada ao gene calcitonina, e variantes deste, que retém pelo menos parte da atividade de CGRP. Por exemplo, CGRP pode ser α-CGRP ou β-CGRP. Conforme usado aqui, CGRP inclui todas as espécies mamíferas de CGPR de seqüência nativa, por exemplo, humana, canina, felina, equina, e bovina.

Conforme usado aqui, um anticorpo antagonista anti-CGRP (permutavelmente denominado anticorpo anti-CGRP), se refere a um anticorpo que é capaz de se ligar a um CGRP e inibir atividade biológica de CGRP e/ou trajetória(s) a jusante(s) mediada(s) por sinalização de CGRP.

Um anticorpo antagonista anti-CGRP envolve anticorpos que bloqueiam, antagonizam, suprimem ou reduzem (incluindo significantemente) a atividade biológica de CGRP, incluindo trajetórias a jusantes medidas por sinalização de CGRP, tal como ligação de receptor e/ou extração de uma resposta celular para CGRP. Para proposta da presente invenção, será explicitamente compreendido que o termo anticorpo antagonista anti-CGRP envolve todos os termos anteriormente identificados, títulos, e estados funcionais e características, onde o próprio CGRP, uma atividade biológica de CGRP (incluin•Λ.

ί r

do, mas não limitada a sua capacidade de mediar qualquer aspecto de dor de cabeça), ou as consequências da atividade biológica, são substancialmente anuladas, diminuídas ou neutralizadas em qualquer grau significante. Em aígumas concretizações, um anticorpo antagonista anti-CGRP se liga ao

CGRP, e impede a ligação de CGRP a um receptor de CGRP. Em outras concretizações, um anticorpo anti-CGRP se liga ao CGRP e impede ativação de um receptor de CGRP. Exemplos de anticorpos antagonistas de antiCGRP são providos aqui.

Conforme usado aqui, os termos “Gl·' e anticorpo G1 são usa10 dos permutavelmente para se referirem a um anticorpo produzido por veto___________res de expressão tendo números de depósito de ATCC PTA-6867 e ATCC

PTA-6866. As seqüências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve são mostradas na Figura 5. As porções de CDR de anticorpo G1 (incluindo CDRs de Chothia e de Kabat) são diagramaticamen15 te representadas na Figura 5. Os polinucleotídeos que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve são mostrados em SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:10. A caracterização de G1 é descrita nos Exemplos.

Os termos polipeptídeo¹¹, oligopeptídeo, peptídeo e proteína são usados permutavelmente aqui para referirem-se a polímeros de a20 minoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, podendo compreender aminoácidos modificados, e pode ser interrompido por não-aminoácidos. Os termos também envolvem um polímero de aminoácido que tenha sido modificado naturalmente, ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação de disulfito, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de rotulação. Também incluídos dentro da definição estão, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não-naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica. É compreendido que, devido aos polipeptídeos desta invenção serem baseados em um anticorpo, os polipeptídeos podem ocorrer como cadeias simples ou cadeias associadas.

Polinucleotídeo, ou ácido nucléico, conforme usados permutavelmente aqui, se referem polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser deoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases, e/ou seus aná5 logos, ou qualquer substrato que pode ser incorporado em um polímero por polimerase de DNA ou RNA. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, a modificação à estrutura do nucleotídeo pode ser concedida antes ou após montagem do polímero. A seqüência de nucleotídeos pode ser inter10 rompida por componentes de não-nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser ________adicionaimente modificado após polimerização, tal como por conjugação com um componente de rotulação. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, coberturas, substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente com um análogo, modificações internucleotídeo tais como, por exemplo, aquelas com ligações não-mudadas (por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.), e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquelas contendo porções pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, ply-L-lisina, etc.), aquelas com intercaladores (por exemplo, acridina, psoralen, etc.), aquelas contendo quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidantes, etc.), aquelas contendo alquiladores, aquelas com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucléicos alfa anoméricos, etc.), bem como formas modificadas do(s) polinucleotídeo(s). Adicionaimente, qualquer dos grupos hidroxil ordinariamente presentes nos açúcares podem ser substituídos, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos de proteção padrão, ou ativados para preparar ligações adicionais para nucleotídeos adicionais, ou podem ser conjugados a suportes sólidos. O terminal OH 5' e 3' pode ser fosforilatado ou substituído com aminas ou porções de grupo de capeamento orgânico de a partir de 1 a 20 átomos de carbono. Outros hidroxis podem também serem derivatizados para grupos de proteção padrão. Os polinucleotídeos podem também conterem formas análogas de ribose ou ο ί~ açúcares de deoxirribose que são geralmente conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, 2^,-O-metil-, 2^s-O-alil, 2'-flúor- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares π-anoméricos, açúcares epiméricos, tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de fura5 nose, sedohepluJoses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeo abásico, tal como metil riboside. Uma ou mais ligações de fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem, mas não estão limitados a, concretizações nas quais fosfato é substituído por P(O)S(tioato), P(S)S (“ditioato), (O)NR₂ (amidato),

P(O)R, P(O)OR’, CO ou CH₂ (formacetal), em que cada Rou R'é indepen___ dentemente H ou alquila substituída ou não-substituída (1-20 C), opcionalmente contendo uma ligação de éter (-O-), arila, alqueniia, cicloalquila, cicloalquenila ou araldiia. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo necessitam ser idênticas. A descrição precedente se aplica a todos os polinucleotí15 deos referidos aqui, incluindo RNA e DNA.

Uma região variável de um anticorpo se refere a região variável da cadeia leve do anticorpo, ou a região variável da cadeia pesada do anticorpo, ou sozinhas ou em combinação. As regiões variáveis da cadeia pesada e leve consistem de quatro regiões de estrutura (FR) igantes por três re20 giões de determinação de complementaridade (CDRs) também conhecidas como regiões hipervariáveis. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade pelas FRs e, com as CDRs a partir da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação de antígeno de anticorpos. Existem pelo menos duas técnicas para determinar CDRs: (1) uma aproximação baseada na variabilidade de seqüência de espécie cruzada (isto é, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National institutes of Health, Bethesda MD)); e (2) uma aproximação baseada em estudos cristalográficos de complexos de antígeno-anticorpo (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Conforme usado aqui, uma CDR pode se referir a CDRs definidas por qualquer aproximação, ou por uma combinação de ambas as aproximações.

Uma região constante de um anticorpo se refere a região cons4 tante da cadeia leve do anticorpo, ou a região constante da cadeia pesada do anticorpo, ou sozinhas ou em combinação.

Um epítopo que se liga preferencialmente ou se liga especificamente (usado permutavelmente aqui) a um anticorpo, ou a um polipeptí5 deo, é o termo bem compreendido na técnica, e métodos para determinar tal (igação específica ou preferencial são também bem-conhecidos na técnica. Uma molécula é referida para exibir ligação específica ou ligação preferencial se ela reage ou se associa mais freqüentemente, mais rapidamente, com maior duração, e/ou com maior afinidade, com uma célula ou substân10 cia particular do que com células ou substâncias alternativas. Um anticorpo

----------se liga especificamente ou se liga preferencialmente a um alvo se ele se liga com maior afinidade, avidez, mais prontamente, e/ou com maior duração do que ele se liga a outras substâncias. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente ou preferencialmente a um epítopo de CGRP é um an15 ticorpo que se liga a este epítopo com maior afinidade, avidez, mais prontamente, e/ou com maior duração do que se liga a outros epítopos de CGRP ou epítopos de não-CGRP. É também compreendido pela leitura desta definição que, por exemplo, um anticorpo (ou porção ou epítopo) que se liga especificamente ou preferencialmente a um primeiro alvo pode ou não pode se ligar especificamente ou preferencialmente a um segundo alvo. Como tal, ligação específica ou ligação preferencial não requer necessariamente (embora possa incluir) ligação exclusiva. Geralmente, mas não necessariamente, referência a ligação significa ligação preferencial.

Conforme usado aqui, substancialmente puro se refere a mate25 rial que é pelo menos 50% puro (isto é, livre de contaminantes), mais preferivelmente pelo menos 90% puro, mais preferivelmente pelo menos 95% puro, mais preferivelmente pelo menos 98% puro, mais preferivelmente pelo menos 99% puro.

Uma célula hospedeira inclui uma célula individual ou cultura de célula que pode ser ou tenha sido um recipiente para vetor(es) para incorporação de insertos de polinucleotídeo. As células hospedeiras incluem progenia de uma célula hospedeira simples, e a progenia não pode necessa29 riamente ser completamente idêntica (na morfologia ou em complemento de DNA genômico) à célula fonte original, ácido, ou mutação deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com um polinucleotídeo(s) desta invenção.

O termo região Fc é usado para definir uma região de terminal

C de uma cadeia pesada de imunogiobulina. A região Fc pode ser uma região Fc de seqüência nativa, ou uma região Fc variante. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunogiobulina possam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humano é usualmente definida para esten10 der-se de um resíduo de aminoácido na posição Cys22G, ou de Pro230, para o terminal carboxila deste. A numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Imunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. A região Fc de uma imunogiobulina geralmente com15 preende dois domínios constantes, CH2 e CH3.

Conforme usado aqui, receptor Fc e FcR descreve um receptor que se liga a região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de seqüência nativa. Além disso, um FcR preferido é um que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama), e inclui receptores das subclasses

FcyRI, FcyRII, e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e alternativamente formas unidas destes receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um receptor de ativação e FcyRIIB (um receptor de inibição), que têm seqüência de aminoácidos similares que diferem principalmente nos domínios citoplásmicos destes. Os FcRs são revistos em Ravetch and Kinet, 1991,

Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capei et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; and de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin, Med., 126:330-41, O FcR também inclui receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternais para o feto (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; and Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).

Citotoxicidade dependente do complemento e CDC se referem à lisação de um alvo na presença de complemento. A trajetória de ativação de complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sis30 tema de complemento (C1q) para uma molécula (por exemplo, um anticorpo) complexado com um antígeno cognato. Para acessar a ativação de complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, conforme descrito em GazzanoSantoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996), pode ser realizado.

Uma região Fc funcional possui pelo menos uma função executora de uma região Fc de seqüência nativa. Funções executoras exemplares incluem ligação de C1q; citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente do anticorpo (ADCC); fagocitose; sub-regulação de receptores de superfície de célula (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc. Tais funções execu_________ toras geralmente requerem que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo), e podem ser acessadas usando-se vários ensaios conhecidos na técnica para avaliar tais funções executoras de anticorpo.

Uma região Fc de seqüência nativa compreende uma seqüência de aminoácido idêntica à seqüência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza. Uma região Fc variante compreende uma seqüência de aminoácido que difere daquela de uma região Fc de seqüência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, ainda re20 têm pelo menos uma função executora da região Fc de seqüência nativa. Preferivelmente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido comparada a uma região Fc de seqüência nativa, ou a região Fc de um polipeptídeo de origem, por exemplo, de cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácido, e preferivelmente de cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácido em uma região Fc de seqüência nativa, ou na região Fc do polipeptídeo de origem. A região Fc variante aqui preferivelmente possuirá pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência com uma região Fc de seqüência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo de origem, e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90% de identidade de seqüência, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% de identidade de seqüência.

Conforme usado aqui, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo e ADCC se referem a uma reação mediada por célula na qual células citotóxicas não-específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células matadoras naturais (NK), neutrófitos, e macró5 fagos) reconhecem anticorpo ligado a uma célula alvo e, subseqüentemente, causam lisis da célula alvo. A atividade de ADCC de uma molécula de interesse pode ser acessada usando-se um ensaio de ADCC in vitro, tal como aquele descrito nas Patentes dos Estados Unidos N² 5.500.362 ou 5.821.337. Células executoras úteis para tais ensaios incluem células mono10 nucleares de sangue periférico (PBMC) e células NK. Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser acessada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como aquele revelado em Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656.

Conforme usado aqui, tratamento é uma aproximação para obtenção de resultados clínicos benéficos ou desejados. Para proposta desta invenção, os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: aperfeiçoamento em qualquer aspecto de uma dor de cabeça incluindo redução da severidade, alívio de intensidade de dor, e outros sintomas associados, redução da freqüência de recorrência, aumento da qualidade de vida daqueles que sofrem de dor de cabeça, e diminuição da dose de outros medicamentos requeridos para tratar a dor de cabeça. Para enxaqueca, outros sintomas associados incluem, mas não estão limitados a, náusea, vômito, e sensibilidade à luz, som, e/ou movimento. Para cluster dor de cabeça, outros sintomas associados inclu25 em, mas não estão limitados a, inchaço sobre ou ao redor dos olhos, lágrimas excessivas, olho vermelho, rinorréia ou congestão nasal, e face enrubecída vermelha.

Redução de incidência de dor de cabeça significa qualquer de redução de severidade (que pode incluir redução da necessidade de, e/ou quantidade de (por exemplo, exposição para) outras fármacos, e/ou terapias geralmente usadas para esta condição, incluindo, por exemplo, ergotamina, dihidroergotamína, ou triptanos para enxaqueca), duração, e/ou freqüência

(incluindo, por exemplo, retardo ou aumento do tempo para o próximo ataque episódico em um indivíduo). Conforme é compreendido por aqueles técnicos no assunto, os indivíduos podem variar em termos de sua resposta ao tratamento, e, como tal, por exemplo, um método de redução de incidência de dor de cabeça em ura indivíduo reflete administrar o anticorpo antagonista anti-CGRP baseado na expectativa razoável que tai administração pode, do mesmo modo, causar tal redução na incidência naquele indivíduo particular.

Melhora da dor de cabeça ou um ou mais sintomas de dor de 10 cabeça significa uma diminuição ou aperfeiçoamento de um ou mais sinto—_____mas de dor de cabeça conforme comparado a não administrar um anticorpo antagonista anti-CGRP. Melhora também inclui diminuição ou redução na duração de um sintoma.

Conforme usado aqui, controle da dor de cabeça se refere a 15 manutenção ou redução da severidade ou duração de um ou mais sintomas de dor de cabeça, ou freqüência de ataques de dor de cabeça em um indivíduo (conforme comparado ao nível antes do tratamento). Por exemplo, a duração ou severidade de dor de cabeça, ou freqüência de ataques, é reduzida por pelo menos cerca de qualquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, ou 70% no indivíduo conforme comparado ao nível antes do tratamento.

Conforme aqui usado, retardamento do desenvolvimento de dor de cabeça significa adiar, impedir, reduzir, retardar, estabilizar, e/ou pospor a progressão da doença. Este retardo pode ser de comprimentos variados de tempo, dependendo da história da doença e/ou indivíduos sendo tra25 tados. Conforme é evidente a um técnico no assunto, um retardo suficiente ou significante pode, com efeito, envolver prevenção, em que o indivíduo não desenvolve dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca). Um método que retarda o desenvolvimento do sintoma é um método que reduz a probabilidade de desenvolvimento do sintoma em uma dada estrutura de tempo, e/ou reduz a extensão dos sintomas em uma dada estrutura de tempo, quando comparado a não usando o método. Tais comparações são tipicamente baseadas nos estudos clínicos, usando um número estatisticamente significan33 te de indivíduos.

Desenvolvimento ou progressão de dor de cabeça significa manifestações iniciais e/ou seguindo-se progressão da enfermidade. O desenvolvimento de dor de cabeça pode ser detectável e acessado usando-se técnicas clinicas padrões, bem como conhecidas na técnica. Contudo, o desenvolvimento também refere-se a progressão que pode ser não-detectável. Para proposta desta invenção, o desenvolvimento ou progressão refere-se ao curso biológico dos sintomas. Desenvolvimento’’ inclui ocorrência, recorrência e ataque. Conforme usado aqui ataque ou ''ocorrência de dor de cabeça inclui ataque inicial e/ou recorrência.

_________________Conforme usado aqui, uma dopagem eficaz ou quantidade eficaz de fármaco, composto, ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados. Para uso profilático, os resultados benéficos ou desejados incluem resultados, tais como eliminação ou redução do risco, diminuição da severidade, ou retardamento do início da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários apresentados durante desenvolvimento da doença. Para uso terapêutico, os resultados benéficos e desejados incluem resultados, tais como redução da intensidade da dor, duração, ou freqüência de ataque de dor de cabeça, e diminuindo um ou mais sintomas resultantes da dor de cabeça (bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais), incluindo suas complicações e fenótipos patológicos intermediários apresentados durante desenvolvimento da doença, aumentando a qualidade de vida daqueles que sofrem da doença, diminuindo a dose de outras medicações requeridas para tratar a doença, aumentando o efeito de outra medicação, e/ou retardando a progressão da doença de pacientes. Uma dosagem eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para proposta desta invenção, uma dosagem eficaz de fármaco, composto, ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para efetuar tratamento profilático ou terapêutico ou diretamente ou indiretamente. Conforme é compreendido no contexto clínico, uma dosagem eficaz de um fármaco, composto, ou composição farmacêuti34

ca pode ou não pode ser alcançada em conjunto com outro fármaco, composto, ou composição farmacêutica. Desse modo, uma “dosagem eficaz pode ser considerada no contexto de administrar um ou mais agentes terapêuticos, e um agente simples pode ser considerado para ser dado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável pode ser ou é alcançado.

Um indivíduo ou uma vítima é um mamífero, mais preferivelmente um humano. Os mamíferos também incluem, mas não estão limitados a, animais de fazenda, animais esportivos, animais domésticos, primatas, cavalos, cães, gatos, camundongos e ratos.

____________Conforme usado aqui, vetor significa uma construção, que é capaz de distribuir, e, preferivelmente, expressar, um ou mais gene(s) ou seqüência(s) de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos of vetores incluem, mas não estão limitados a, vetores virais, vetores de expressão de

DNA ou RNA desprotegidos, plasmídeo, vetores de cosmídeo ou fago, vetores de DNA ou RNA de expressão associados com agentes de condensação catiônicos, vetores de DNA ou RNA de expressão encapsulados nos lipossomos, e certas células eucarióticas, tais como células produtoras.

Conforme usado aqui, seqüência de controle de expressão significa uma seqüência de ácido nucléico que dirige transcrição de um ácido nucleico. Uma seqüência de controle de expressão pode ser um promotor, tal como um promotor constitutivo ou induzível, ou um intensificador. A seqüência de controle de expressão é operavelmente igante à seqüência de ácido nucléico a ser transcrita,

Conforme usado aqui, veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente farmaceuticamente aceitável·' incluem qualquer material que, quando combinado com um ingrediente ativo, permite que o ingrediente retenha atividade biológica e não-reativa com o sistema imune do indivíduo. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, qualquer dos veículos farma30 cêuticos padrões, tais como uma solução salina tamponada por fosfato, água, emulsões, tais como emulsão de óleo/água, e vários tipos de agentes de umedecimento. Diluentes preferidos para administração aerosol ou pa35

renterai são salina tamponada por fosfato ou salina normal (0,9%). As composições compreendendo tais veículos são formuladas por métodos convencionais bem-conhecidos (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Pubiishing Co., Easton, PA,

1990; and Remington, The Science and Practlce of Pharmacy 20th Ed. Mack

Pubiishing, 2000).

O termo %_η, conforme usado aqui, é pretendido para se referir a constante de taxa para associação de um anticorpo a um antígeno.

O termo koff”, conforme usado aqui, é pretendido para se referir 10 a constante de taxa para dissociação de um anticorpo a partir do anticor-_____po/complexo de antígeno.________________

O termo Kd, conforme usado aqui, é pretendido para se referir a constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpoantígeno.

Conforme usado aqui, o termo sintoma vasomotor, é pretendido para se referir às condições relacionadas a vasodilatação, e incluem, mas não estão limitados a, dor de cabeça (tal como enxaqueca, ...outras), febre (ou lampejos quentes), lampejos frios, insônia, distúrbios de sono, enfermidades de humor, irritabilidade, transpiração excessiva, suadores noturnos, suores diurnos, fadiga, e similares, causados por, entre outros, disfunção termorregulatória.

Conforme usado aqui, os termos rubor, febre e lampejo quente são termos reconhecidos na técnica que referem-se a um distúrbio episódico na temperatura do corpo tipicamente consistindo em um rubor sú25 bito da pele, usualmente acompanhado por transpiração em um indivíduo.

A. Métodos para prevenir ou tratar sintoma vasomotores

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para tratar ou prevenir pelo menos um sintoma vasomotor, tal como dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca) ou febres, em um indivíduo compreendendo adminis30 trar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista antiCGRP, ou polipeptídeos derivados do anticorpo.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para me36

Ihorar, controlar, reduzir incidência de, ou retardar o desenvolvimento ou progressão de pelo menos um sintoma vasomotor, tal como dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca) ou febres, em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP.

Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para melhorar, controlar, reduzir incidência de, ou retardar o desenvolvimento ou progressão de dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca) em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP em combinação com pelo menos um agente adicional útil para tratar dor de cabeça.

Tais agentes adicionais incluem, mas não estão limitados a, agonitas de 5-HT e NSAIDs. Por exemplo, o anticorpo e o pelo menos um agente adicional pode ser concomitantemente administrado, isto é, eles po15 dem ser dados em proximidade temporal próxima bastante para permitir que seus efeitos terapêuticos no indivíduo se sobreponham. Por exemplo, a quantidade de antagonistas de 5-HT ou NSAID administrados em combinação com um anticorpo anti-CGRP deve ser suficiente para reduzir a freqüência de dor de cabeça decorrida em pacientes, ou produzir eficácia mais lon20 ga durável comparada à administração de ou um destes agentes na ausência do outro. Este procedimento pode ser usado para tratar dores de cabeça que caem em qualquer de uma variedade de classes incluindo: enxaqueca com ou sem aura; enxaqueca hemiplégica; grupo dores de cabeça; neuralgia de enxaqueca; dores de cabeça crônicas; dores de cabeça por tensão; dores de cabeça resultantes de outras condições médicas (tais como infecção ou pressão aumentada na cabeça devido a um tumor); hemicrania paroximal crônica; variedade de dores de cabeça não-associadas com uma lesão estrutural; dor de cabeça associada com uma enfermidade intracranial nãovascular; dor de cabeça associada com a administração de uma substância ou sua retirada; dor de cabeça associada com infecção não-cefálica; dor de cabeça associada com uma enfermidade metabólica; dor de cabeça associada com uma enfermidade do crânio, pescoço, olhos, orelhas, nariz, seios, dentes, boca ou outra estrutura facial ou cranial; neuralgias craniais; e dor do tronco do nervo e dor de desaferenciação.

Aqueles técnicos no assunto serão capazes de determinar quantidades de dosagem apropriadas para agentes particulares a serem usados em combinação com um anticorpo anti-CGRP. Por exemplo, sumatriptan pode ser administrado em uma dosagem de cerca de 0,01 a cerca de 300 mg. Quando administrada não-parenteralmente, a dosagem típica de sumatriptan é de cerca de 25 a cerca de 100 mg, com cerca de 50 mg sendo geralmente preferida e, quando administrada parente ral mente, a dosagem preferida é cerca de 6 mg. Contudo, estas dosagens podem ser variadas de acordo com os métodos padrões na técnica de modo que_elas_são optimizadas para um paciente particular, ou para uma terapia de combinação particular. Adicionalmente, por exemplo, celecoxib pode ser administrada em uma quantidade de entre 50 e 500 mg.

Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para melhorar, controlar, reduzir incidência de, ou retardar o desenvolvimento ou progressão de febres em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP em combinação com pelo menos um agente adicional útil para tratar febres. Tais agentes adicionais incluem, mas não estão limitados a, tratamentos baseados em hormônio, incluindo estrogênios e/ou alguns progestinas.

Com relação a todos os métodos aqui descritos, referência a anticorpos antagonistas de anti-CGRP também inclui composições compreendendo um ou mais destes agentes. Estas composições podem adicionalmente compreender excipientes adequados, tais como excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluindo tampões, que são bem-conhecidos na técnica. A presente invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com outros métodos convencionais de tratamento.

O anticorpo antagonista anti-CGRP pode ser administrado a um indivíduo via qualquer rota adequada. Deve ser aparente a um técnico no assunto que exemplos aqui descritos não são pretendidos como limitativos, mas para serem ilustrativos das técnicas disponíveis. Conseqüentemente, em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP é administrado a um indivíduo de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa, por exemplo, como uma massa ou por infusão contínua sobre um período de tempo, por rotas intramuscuiar, intraperitoneal, in5 tracerebroespinhai, subcutânea, intra-articular, sublingualmente, intrasinovial, via insuflação, intratecal, oral, inalação ou tópicas. A administração pode ser sistêmica, por exemplo, administração intravenosa, ou localizada. Nebulizadores comercialmente disponíveis para formulações líquidas, incluindo nebulizadores de jato e nebulizadores ultrassônicos, são úteis para adminis10 tração. Formulações líquidas podem ser diretamente nebulizadas e liofiliza_________das, pó pode ser nebulizado após reconstituição. Altemativamente, o anticorpo antagonista anti-CGRP pode ser aerosolizado usando-se uma formulação de flúorcarbono e um inalador de dose medida, ou inalada como um pó liofilizado e moído.

Em uma concretização, um anticorpo antagonista anti-CGRP é administrado via técnicas de distribuição de iocal específico ou de local alvo. Exemplos de técnicas de distribuição de local específico ou de local alvo incluem várias fontes de depósito implantáveis do anticorpo antagonista antiCGRP, ou cateteres de distribuição local, tais como cateteres de infusão, um cateter de residência, ou um cateter de agulha, enxertos sintéticos, envoltórios adventiciais, desvios e stents, ou outros dispositivos implantáveis, transportadores específicos de local, injeção direta, ou aplicação direta. Vide, por exemplo, Publicação PCT No. WO 00/53211 e Patente U.S. No. 5.981.568.

Várias formulações de um anticorpo antagonista anti-CGRP po25 dem ser usadas para administração. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP pode ser administrado limpo. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP e um excipiente farmaceuticamente aceitável podem estar em várias formulações. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na técnica, e são substâncias relati30 vamente inertes que facilitam a administração de uma substância farmacologicamente eficaz. Por exemplo, um excipiente pode dar forma ou consistência, ou agir como um diluente. Excipientes adequados incluem, mas não es39

tão limitados a, agentes de estabilização, agentes de emulsificação e agentes de umedecimento, sais para variação de osmolaridade, agentes de encapsulamc-nto, tampões, e intensificadores de penetração de pele. Excipientes, bem como formulações para distribuição de fármaco parenteral e não5 parenteral são colocad_as em Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).

Em algumas concretizações, estes agentes são formulados para administração por injeção (por exemplo, intraperitonealmente, intravenosamente, subcutaneamente, intramuscularmente, etc.). Conseqüentemente, estes agentes podem ser combinados com veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como solução de Ringer, solução de dextrose, e similares. Os regimes de dosagem particular, isto é, dose, regulação e repetição, dependerão do indivíduo particular, e da história médica do indivíduo.

Um anticorpo anti-CGRP pode ser administrado usando-se qual15 quer método adequado, incluindo por injeção (por exemplo, intraperitonealmente, intravenosamente, subcutaneamente, intramuscularmente, etc.). Os anticorpos anti-CGRP podem ser também administrados via inalação, conforme descrito aqui. Geralmente, para administração de anticorpos antiCGRP, uma dosagem candidata inicial pode ser cerca de 2 mg/kg. Para a proposta da presente invenção, uma dosagem diária típica pode variar de cerca de qualquer de 3pg/kg a 30 pg/kg a 300 pg/kg a 3 mg/kg, a 30 mg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Por exemplo, dosagem de cerca de 1 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, θ cerca de 25 mg/kg pode ser usada. Para admi25 nistrações repetidas por vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até que uma supressão desejada de sintomas ocorra, ou até que níveis terapêuticos suficientes sejam alcançados, por exemplo, para reduzir a dor. Um regime de dosagem exemplar compreende administrar uma dose inicial de cerca de 2 mg/kg, seguido por uma dose de ma30 nutenção semanal de 1 mg/kg do anticorpo anti-CGRP, ou seguido por uma dose de manutenção de cerca de 1 mg/kg toda semana. Contudo, outros regimes de dopagem podem ser úteis, dependendo do modelo de queda farmacocinético que o praticante deseja alcançar. Por exemplo, em algumas concretizações, a dosagem de uma a quatro vezes ao dia é contemplada. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais. O regime de dosagem (incluindo o(s) antagonista(s) de CGRP usado/s)) pode variar com o tempo.

Para a proposta da presente invenção, a dosagem apropriada de um anticorpo antagonista anti-CGRP dependerá do anticorpo antagonista anti-CGRP (ou composições destes).empregado, do tipo e severidade da dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca) a ser tratada, se o agente é admints10 trado para proposta preventiva ou terapêutica, terapia anterior, da história _____________clínica do paciente, e da resposta ao agente, e da discrição do médico atendente. Tipicamente, o clínico administrará um anticorpo antagonista antiCGRP, até que uma dosagem é alcançada, que alcança o resultado desejado. A dose e/ou freqüência pode variar no curso do tratamento.

Considerações empíricas, tal como a meia-vida, geralmente contribuem para a determinação da dosagem. Por exemplo, anticorpos que são compatíveis com o sistema imune humano, tais como anticorpos humanizados, ou anticorpos totalmente humanos, podem ser usados para prolongar a meia-vida do anticorpo, e para impedir o anticorpo de ser atacado pelo sis20 tema imune do hospedeiro. A freqüência de administração pode ser determinada e ajustada no curso da terapia, e é geralmente, mas não necessariamente, baseada no tratamento e/ou supressão e/ou melhora e/ou retardo de dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca). Alternativamente, formulações de liberação contínua sustentada de anticorpos antagonistas de anti-CGRP po25 dem ser apropriadas. Várias formulações e dispositivos para alcançar liberação sustentada são conhecidos na técnica.

Em uma concretização, dosagens para um anticorpo antagonista anti-CGRP podem ser determinadas empiricamente em indivíduos que foram dadas uma ou mais administração(ões) de um anticorpo antagonista anti30 CGRP. Aos indivíduos são dadas dosagens de incremento de um anticorpo antagonista anti-CGRP. Para acessar a eficácia de um anticorpo antagonista anti-CGRP, um indicador da doença pode ser seguido.

A administração de um anticorpo antagonista anti-CGRP, de acordo com o método na presente invenção, pode ser contínua ou intermitente, dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do recipiente, se a proposta da administração é terapêutica ou profilática, e outros fatores co5 nhecidos aos técnicos versados. A administração de um anticorpo antagonista anti-CGRP pode ser essenciaímente contínua sobre um período préselecionado de tempo, ou pode ser em uma série de dose espaçada, por exemplo, ou antes, durante, ou após desenvolvimento da dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca); antes; durante; antes e após; durante e após; antes e durante; ou antes, durante, e após desenvolvimento de dor de cabeça. A adrninisiração pode ser antes, durante e/ou após qualquer evento similarmente para dar ocorrência a dor de cabeça.

Em algumas concretizações, mais do que um anticorpo antagonista anti-CGRP podem estar presentes. Pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou mais anticorpos antagonistas anti-CGRP diferentes podem estar presentes. Geralmente, aqueles anticorpos antagonistas anti-CGRP podem ter atividades complementares que não afetam adversamente um outro. Um antagonista de antiCGRP pode também ser usado em conjunto com outros antagonistas de

CGRP, ou antagonistas receptores de CGRP. Por exemplo, um ou mais dos seguintes antagonistas de CGRP podem ser usados: uma molécula de antisentido dirigida a um CGRP (incluindo uma molécula de anti-sentido dirigida a um ácido nucléico que codifica CGRP), ou um composto inibitório de CGRP, um análogo estrutural de CGRP, uma mutação negativa dominante de um receptor de CGRP que se liga a um CGRP, e um anticorpo receptor de anti-CGRP. Um anticorpo antagonista anti-CGRP pode também ser usado em conjunto com outros agentes que servem para aumentar e/ou complementar a eficiência dos agentes.

Formulações terapêuticas do anticorpo antagonista anti-CGRP usadas de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento pela mistura de um anticorpo tendo o grau desejado de pureza com veículos farmaceuticamente aceitáveis opcionais, excipientes ou estabiliza42 dores (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não-tóxicos a recipientes nas dosagens e concentrações empregadas, e podem compre5 ender tampões, tais como, fosfato, citrato e os outros ácidos orgânicos; sais, tais como cloreto de sódio; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como octadecildimetilbenzil cloreto de amônia; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butil ou benzil álcool; alquil parabenos, tais como metila ou propil parabeno;

catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de —___haixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e ou15 tros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes, tal como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contadores de íon de formação de sal tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de proteína de Zn); e/ou tensoativos não-iônicos, tais como TWEEN™, PLURONICS™, ou polietileno glicol (PEG).

Lipossomas contendo o anticorpo antagonista anti-CGRP são preparados por métodos conhecidos na técnica, tais como descritos em Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); e Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomas com tempo de circulação aumentado são revelados na Patente U.S. No. 5.013.556. Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados por método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeo compreendendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada de PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrudados através de filtros de tamanho de poro definido para produzir liposso30 mas com o diâmetro desejado.

Os ingredientes ativos podem ser também presos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação, ou por polime43 rização ínterfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e poli-(metilmetacilato) microcápsulas, respectivamente, em sistemas de distribuição de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou em macroemutsões. Tais técnicas são reveladas em Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000),

Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticor10 po, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, pelícu_______Ias, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, polí(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(v nilálcool)), poiilactídeos (Patente nos Estados Unidos No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e 7 etil-L-glutamato, etileno-vinil acetato não-degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido giicólico degradáveis tal como o LUPRON DEPOT ™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido iáctico-ácido giicólico e leuprolide acetato), sacarose acetato isobutirato, e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

As formulações a serem usadas para administração in vivo de20 vem ser estéreis. Isto é prontamente efetuado por, por exemplo, filtração através de membranas de filtração estéreis. Composições terapêuticas de anticorpo antagonista anti-CGRP são geralmente colocadas em um recipiente tendo um orifício de acesso estéril, por exemplo, um saco de solução intravenosa, ou frasco tendo um parador perfurávei por uma agulha de injeção hipodérmica.

As composições de acordo com a presente invenção podem ser em formas de dosagem de unidade, tais como comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões, ou supositórios, para administração oral, parenteral ou retal, ou administração por inalação ou insuflação.

Para preparação de composições sólidas, tais como comprimidos, o ingrediente ativo principal é misturado com um veículo farmacêutico, por exemplo, ingredientes de formação de comprimido convencionais, tais

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X como amido, lactose, sacarose, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio, fosfato de dícálcio ou gomas, e outros diluentes farmacêuticos, por exemplo, água, para formar uma composição de pré-formulação sólida contendo uma mistura homogênea de um composto da presente invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável não-tóxico deste. Quando se referem a estas composições de pré-formulação como homogêneas, é significativo que o ingrediente ativo seja disperso constante mente através da composição de modo que a composição pode ser prontamente subdividida em formas de dosagem de unidade igualmente eficazes como comprimidos, pílulas e cáp10 sulas. Esta composição de pré-formulação sólida é então subdividida em ____________formas de dosagem de unidade do tipo descrito acima contendo de 0,1 a cerca de 500 mg do ingrediente ativo da presente invenção. Os comprimidos ou pílulas da nova composição podem ser revestidos ou, de outro modo, compostos para proporcionar uma forma de dosagem que proporciona a vantagem de ação prolongada. Por exemplo, os comprimidos ou pílulas podem compreender um componente de dosagem interna e um componente de dosagem externa, o último sendo na forma de um envelope sobre o primeiro. Os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir a desintegração no estômago, e permitir que o componente interno passe intacto no duodeno, ou seja retardado na liberação. Uma variedade de materiais pode ser usada para tais camadas entéricas ou revestimentos, tais materiais incluindo um número de ácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com tais materiais como shellac, cetil álcool e acetato de celulose.

Agentes tensoativos adequados incluem, em particular, agentes não-iônicos, tais como polioxietilenossorbitanos (por exemplo, Tween™ 20, 40, 60, 80 ou 85), e outros sorbitanos (por exemplo, Span™ 20, 40, 60, 80 ou 85). Composições com um agente tensoativo compreenderão convenientemente entre 0,05 e 5% de agente tensoativo, e podem estar entre 0,1 e

2,5%. Será apreciado que outros ingredientes podem ser adicionados, por exempio, manitol ou outros veículos farmaceuticamente aceitáveis, se necessário.

Emulsões adequadas podem ser preparadas usando-se emulsões graxas comercialmente disponíveis, tais como Intralipid™, Liposyn™, Iníonutrol™, Lipofundin™ e Lipiphysan™ O ingrediente ativo pode ser, ou dissolvido em uma composição de emulsão pré-misturada, ou alternativa5 mente pode ser dissolvido em um óleo (por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de semente de algodão, óleo de gergelim, óleo de milho, ou óleo de amêndoa), e uma emulsão formada após mistura com um fosfolipídeo (por exemplo, fosfolipídeos de ovo, fosfolipídeos de soja, ou iectin de soja) e água. Será apreciado que outros ingredientes podem ser adiciona10 dos, por exemplo, glicerol ou glicose, para ajustar a tonicidade da emulsão.

__________Emulsões adequadas conterão tipicamente até 20% de óleo, por exemplo, entre 5 e 20%. A emulsão graxa pode compreender gotículas de gordura entre 0,1 e 1,0 Im, particularmente 0,1 e 0,5 Im, e tem um pH na faixa de 5,5 a 8,0.

As composições de emulsão podem ser aquelas preparadas peta mistura de um anticorpo antagonista anti-CGRP com Intralipid™, ou os componentes deste (óleo de soja, fosfolipídeos de ovo, glicerol e água).

Composições para inalação ou insuflação incluem soluções e suspensões em solventes orgânicos ou aquosos farmaceuticamente aceitá20 veis, ou misturas destes, e pós. As composições líquidas ou sólidas podem conter excipientes farmaceuticamente aceitáveis conforme colocado acima. Em algumas concretizações, as composições são administradas pela rota respiratória oral ou nasal para efeito local ou sistêmico. As composições em solventes farmaceuticamente aceitáveis preferivelmente estéreis podem ser nebulizadas pelo uso de gases. As soluções nebulizadas podem ser respiradas diretamente a partir do dispositivo de nebulização, ou o dispositivo de nebulização pode estar fixado a uma máscara de face, dreno ou máquina de respiração de pressão positiva intermitente. Solução, suspensão ou composições de pó podem ser administradas, preferivelmente oralmente ou nasal30 mente, de dispositivos que distribuem a formulação em uma maneira apropriada.

A diagnose ou avaliação da dor de cabeça é bem estabelecida ί

na técnica. A avaliação pode ser realizada baseada em medidas subjetivas, tais como caracterização dos sintomas do paciente. Por exemplo, a enxaqueca pode ser diagnosticada baseada nos seguintes critérios; 1) ataques episódicos de dor de cabeça durando de 4 a 72 horas; 2) com dois dos se5 guintes sintomas: dor unilateral, palpitação, agravação no movimento, e dor de intensidade moderada ou severa; e 3) um dos seguintes sintomas: náusea ou vômito, e fotofobia ou fonofobia. Goadsby et al., N. Engl. J. Med. 346:257-270, 2002.

A eficácia do tratamento pode ser avaliada por métodos bem10 conhecidos na técnica. Por exemplo, o alívio da dor pode ser avaliado. Conseqüentemente, em algumas concretizações, o alívio da dor é subjetivamente observado após 1, 2, ou umas poucas horas após administrar um anticorpo anti-CGRP. Em algumas concretizações, a freqüência de ataques de dor de cabeça é subjetivamente observada após administrar um anticorpo anti15 CGRP.

B. Anticorpos antagonistas de anti-CGRP

Os métodos da invenção usam um anticorpo antagonista antiCGRP, que se refere a qualquer molécula de anticorpo que bloqueia, suprime ou reduz (incluindo significantemente) atividade biológica de CGRP, in20 cluindo trajetórias a jusante mediadas por sinalização de CGRP, tal como ligação de receptor e/ou eiicitação de uma resposta celular a CGRP.

Um anticorpo antagonista anti-CGRP deve exibir qualquer uma ou mais das seguintes características: (a) se ligar a CGRP; (b) bloquear CGRP de ligação a seu(s) receptor(es); (c) bloquear ou diminuir ativação de receptor de CGRP (incluindo ativação de cAMP); (d) inibir atividade biológica de CGRP ou trajetórias a jusantes mediadas pela função de sinalização de CGRP; (e) prevenir, melhorar ou tratar qualquer aspecto de dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca); (f) aumentar folga de CGRP; e (g) inibir (reduzir) síntese de CGRP, produção ou liberação. Anticorpos antagonistas de anti30 CGRP são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Tan et al., Clin. Sei. (Lond). 89:565-73, 1995; Sigma (Missouri, US), produet number C7113 (clone número 4901); Plourde et al., Peptides 14:1225-1229, 1993.

i

Para proposta desta invenção, o anticorpo reage com CGRP em uma maneira que inibe CGRP e/ou trajetórias a jusantes mediadas pela função de sinalização de CGRP. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP reconhece CGRP humano. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP se liga a ambos α-CGRP humano e βCGRP. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP se liga a CGRP humano e de rato. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP se liga a fragmento de terminal C tendo 25-37 aminoácidos de CGRP. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista antiCGRP se liga a um epitopo de terminal C dentro de 25-37 aminoácidos de CGRP,

Os anticorpos úteis na presente invenção podem envolver anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, Fab', F(abj2, Fv, Fc, etc.), anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos heteroconjugados, cadeia simples (ScFv), mutantes destes, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo (por exemplo, um anticorpo de domínio), anticorpos humanizados, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um local de reconhecimento de antigeno da especificidade requerida, incluindo variantes de glicosilação de anticorpos, variantes de seqüência de aminoácido de anticorpos, e anticorpos covalentemente modificados. Os anticorpos podem ser de murina, de rato, de humano, ou qualquer outra origem (incluindo quimérico ou anticorpos humanizados).

Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP é um anticorpo monoclonal. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP é humanizado. Em algumas concretizações, o anticorpo é humano. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP é anticorpo G1 (conforme descrito aqui). Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP compreende um ou mais CDR(s) (tais como uma, duas, três, quatro, cinco, ou, em algumas concretizações, todas as seis CDRs) de anticorpo G1, ou variantes de G1, mostradas na Tabela 6. Em ainda outras concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP compreende £

a seqüência de aminoácido da região variável de cadeia pesada mostrada na Figura 5 (SEQ ID NO:1), e a seqüência de aminoácido da região variável de cadeia leve mostrada na Figura 5 (SEQ ID NO:2).

Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma regi5 ão constante modificada, tal como a região constante que é imunologicamente inerte aqui descrita. Em algumas concretizações, a região constante é modificada conforme descrito em Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; Pedido PCT No. PCT/GB99/01441; e/ou Pedido de Patente do reino Unido No. 9809951.8. Em outras concretizações, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada humana lgG2 compreendendo as seguintes mutações; A330P331 a S330S331 /numeração de aminoácido com referência a seqüência lgG2 tipo selvagem). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624. Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma região constante de lgG4 compreendendo as seguintes mutações: E233F234L235 a

P233V234A235. Em ainda outras concretizações, a região constante é aglicosilatada para glicosilação N-igante. Em algumas concretizações, a região constante é aglucosilatada para glicosilação N-igante por mutação do resíduo de fixação de oligossacarídeo (tal como Asn297) e/ou resíduos de flanqueamento que são parte da seqüência de reconhecimento da N20 glicosilação na região constante. Em algumas concretizações, a região constante é aglicosilatada para glicosilação N-igante. A região constante pode ser aglicosilatada para glicosilação N-igante enzimaticamente, ou por expressão em uma célula hospedeira deficiente de glicosilação.

A afinidade de ligação(Ko) de um anticorpo antagonista anti25 CGRP para CGRP (tal como α-CGRP humano) pode ser cerca de 0,02 a cerca de 200 nM. Em algumas concretizações, a afinidade de ligação é qualquer de cerca de 200 nM, cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 20 pM, cerca de 15 pM, cerca de 10 pM, cerca de 5 pM, ou cerca de 2 pM. Em algumas concretizações, a afinidade de ligação é menor do que qualquer de cerca de 250 nM, cerca de 200 nM, cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, ou cerca de 50 pM.

Um modo de determinar a afinidade de ligação de anticorpos para CGRP é pela medição da afinidade de ligação de fragmentos monofuncionais de Fab do anticorpo. Para se obter fragmentos monofuncionais de

Fab, um anticorpo (por exemplo, IgG) pode ser clivado com papaína, ou expresso recombinantemente. A afinidade de um fragmento anti-CGRP Fab de um anticorpo pode ser determinada por ressonância de plasmon de superfície (sistema de ressonância de plasmon de superfície (SPR) Biacore3000™, Biacore, INC, Piscataway NJ) equipado com chips de sensor de streptavidin pré-imobílizados (SA) usando-se tampão de operação HBS-EP (0,01 M de _________HEPES, pH 7,4, 0,15 de NaCl, 3mM de EDTA, 0,005% v/v de Tensoativo

P20). CGRP humano biotinilatado (ou qualquer outro CGRP) pode ser diluído em tampão HBS-EP a uma concentração de menos do que 0,5 ug/mL, e injetado através dos canais de chip do indivíduo usando-se tempos de conta15 to variáveis para alcançar duas faixas de densidade de antígeno, ou 50-200 unidades de resposta (RU) para estudos cinéticos detalhados, ou 800-1.000 RUs para ensaios de classificação. Estudos de regeneração têm mostrado que 25mM de NaOH em 25% v/v de etanol remove efetivamente a ligação Fab, enquanto mantêm a atividade de CGRP no chip para cerca de 200 inje20 ções. Tipicamente, diluições em série (concentrações rotativas de 0,1-10x estimam Kd) de amostras purificadas de Fab são injetadas por 1 minuto a 100 pL/minuto e tempos de dissociação de até 2 horas são permitidos. As concentrações das proteínas Fab são determinadas por ELISA e/ou eletroforese de SDS-PAGE usando uma Fab de concentração conhecida (conforme determinado por análise de aminoácido) como um padrão. Taxas de associação (Κ,η) θ taxas de dissociação (kotf) cinéticas são obtidas simultaneamente pelo ajuste dos dados globalmente para um modelo de ligação Langmuir 1:1 (Kartsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) usando o programa BIAavaliação. Os valores da constante de dissociação de equilíbrio (K_D) são calculados como koff/kon- Este protocolo é adequado para uso na determinação da afinidade de ligação de um anticorpo para qualquer CGRP, incluindo CGRP humano, CGRP de ou50 tro mamífero (tal como CGRP de camundongo, CGRP de rato, CGRP de primata), bem como formas diferentes de CGRP (tais como formas α e β). A afinidade de ligação de um anticorpo é geralmente medida a 25°C, mas pode também ser medida a 37°C.

Os anticorpos antagonistas de anti-CGRP podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica. A rota e tabela de imunização do animal hospedeiro estão geraimente em manutenção com técnicas estabelecidas e convencionais para estimulação do anticorpo e produção, conforme adicionalmente descrito aqui. Técnicas gerais para produção de anticorpos humano e de camundongo são conhecidas na técnica e são aqui descritas, _____________É contemplado que qualquer indivíduo mamífero incluindo humanos ou células de produção de anticorpo a partir destes pode ser manipulado para servir como a base para produção de mamífero, incluindo linhas de célula de hibridoma humano. Tipicamente, o animal hospedeiro é inocu15 lado intraperitonealmente, intramuscularmente, oralmente, subcutaneamente, intraplantar, e/ou intradermalmente com uma quantidade de imunógeno, incluindo conforme descrito aqui.

Os hibridomas podem ser preparados a partir de linfócitos e células de mieloma imortalizadas usando-se a técnica de hibridização de célula somática geral de Kohler, B. e Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497, ou conforme modificada por Buck, D. W., et al., In vitro, 18:377-381 (1982). Linhas de mieloma disponíveis, incluindo, mas não limitadas a X63-Ag8.653, e aquelas de Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA, podem ser usadas na hibridização. Geralmente, a técnica envolve fusão de células de mieloma e células de linfóide usando um fusogen, tal como polietileno glicol, ou por meios elétricos bem-conhecidos àqueles versados na técnica. Após a fusão, as células são separadas do meio de fusão, e desenvolvidas em um meio de crescimento, tal como meio de hipoxantinaaminopterin-timidina (HAT), para eliminar células de origem não30 hibridizadas. Qualquer meio aqui descrito, suplementado com ou sem soro, pode ser usado para cultivar hibridomas que secretam anticorpos monoclonais. Como outra alternativa à técnica de fusão de célula, células B imortaliα ε

zadas EBV podem ser usadas para produzir os anticorpos anti-CGRP monoclonais da invenção objeto. Os hibridomas são expandidos e subclonados, se desejado, e os sobrenadantes são ensaiados para atividade antiimunógeno por procedimentos de imunoensaio convencionais (por exemplo, radioimunoensaio, imunoensaio de enzima, ou imunoensaio de fluorescência).

Os hibridomas que podem ser usados como fonte de anticorpos envolvem todas as células de progenia derivadas dos hibridomas de origem que produzem anticorpos monoclonais específicos para CGRP, ou uma porção destes.

Os hibridomas que produzem tais anticorpos podem ser desenvolvidos in vitro ou in vivo usando-se procedimentos conhecidos. Os anticorpos monoclonais podem ser isolados do meio de cultura ou fluidos corpóreos, por procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais, tais como precipitação de sulfato de amônia, eletroforese de gel, diálise, cromatografia, e ultrafiltração, se desejado. A atividade não-desejada se presente, pode ser removida, por exemplo, pelo curso da preparação sobre adsorventes produzidos do imunógeno fixado a uma fase sólida, e eluindo ou liberando os anticorpos desejados fora do imunógeno. A imunização de um animal hospedeiro com um CGRP humano, ou um fragmento contendo a seqüência alvo de aminoácido conjugada a uma proteína que é imunogênica nas espécies a serem imunizadas, por exemplo, hemocianina de lapa, albumina de soro, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja usando um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo, maleimidobenzoil sulfossuccinimida éster (conjugação através de resíduos de cisteína), Nhidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2, ou R1N=C=NR, onde R e R1 são grupos alquila diferentes, pode produzir uma população de anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais).

Se desejado, o anticorpo antagonista anti-CGRP (monoclonal ou policlonal) de interesse pode ser seqüenciado, e a seqüência de polinucleotídeo pode então ser clonada em um vetor para expressão ou propagação. A seqüência que codifica o anticorpo de interesse pode ser mantida no vetor em uma célula hospedeira, e a célula hospedeira pode, então, ser expandida e congelada para uso futuro. Em uma alternativa, a seqüência de polinucleotídeo pode ser usada para manipulação genética para humanizar o anticorpo ou aperfeiçoar a afinidade, ou outras características do anticorpo. Por exemplo, a região constante pode ser projetada para mais regiões constantes humanas mais assemelhadas para evitar resposta imune se o anticorpo é usado em ensaios clínicos e tratamentos em humanos. Pode ser desejável manipular-se geneticamente a seqüência de anticorpo para obter-se maior afinidade para CGRP, e maior eficácia na inibição de CGRP. Será aparente a um técnico no assunto que uma ou mais mudanças de polinucleotídeo po_____ dem ser feitas ao anticorpo antagonista anti-CGRP, e ainda manter sua capacidade de ligação ao CGRP.

Existem quatro etapas gerais para humanizar um anticorpo monoclonal. Estas são: (1) determinação do nucleotídeo e seqüência de amino15 ácido prognosticada dos domínios variáveis leves e pesados do anticorpo de partida, (2) designação do anticorpo humanizado, isto é, decidindo qual região de estrutura de anticorpo usar durante o processo de humanização, (3) as técnicas/metodologias de humanização atuais, e (4) a transfecção e expressão do anticorpo humanizado. Vide, por exemplo, Patentes dos Estados

Unidos Nos. 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; 6.331.415; 5.530.101; 5.693.761; 5.693.762; 5.585.089; e 6.180.370.

Um número de molécutas de anticorpo humanizadas compreendendo um local de ligação de antígeno derivado de uma nãoimunoglobulina humana foi descrito, incluindo anticorpos quiméricos tendo regiões de roedor ou de roedor modificado V, e suas regiões de determinação de complementaridade associada (CDRs) fundidas para domínios constantes humanos. Vide, por exemplo, Winter et al. Nature 349:293-299 (1991), Lobuglío et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538 (1987), e Brown et al. Câncer Res. 47:3577-3583 (1987). Outras referências descrevem CDRs de roedores enxertadas em uma região de estrutura de suporte humana (FR) antes da fusão com um domínio constante humano de anticorpo apropriado. Vide, por exemplo,

Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988), e Jones et al, Nature 321:522-525 (1986). Outra referência descreve CDRs de roedor suportadas por regiões de estrutura de roedor recombinantemente embutidas. Vide, por exemplo, Publicação de Pa5 tente Européia No, 0519596. Estas moléculas humanizadas são designadas para minimizar resposta imunológica não-desejada em direção a moléculas humanas de antianticorpo de roedor que limitam a duração e eficiência de aplicações terapêuticas daquelas porções em recipientes humanos. Por exemplo, a região constante do anticorpo pode ser projetada tal que ela seja imunologicamente inerte (por exemplo, não dispara lisis de complemento). ___ Vide, por exemplo, Publicação PCT No. PCT/GB99/01441; Pedido de Patente do Reino Unido No. 9809951.8. Outros métodos de humanização de anticorpos que também podem ser utilizados são revelados por Daugherty et ai., Nucl. Ácidos Res. 19:2471-2476 (1991), e nas Patentes do Estados Unidos

Nos. 6.180.377; 6.054.297; 5.997.867; 5.866.692; 6.210.671; e 6,350,861; e na Publicação PCT No. WO 01/27160.

Em ainda outra alternativa, anticorpos totalmente humanos podem ser obtidos usando-se camundongos comercialmente disponíveis que foram projetados para expressarem proteínas humanas de imunogiobulina específicas. Os animais transgênicos que são designados para produzir uma resposta imune mais desejável (por exemplo, anticorpos totalmente humanos), ou uma resposta mais robusta, podem também serem usados para geração de anticorpos humanizados ou humanos. Exemplos de tal tecnologia são Xenomouse™ de Abgenix, Inc. (Fremont, CA) e HuMAb-Mouse® e

TC Mouse™ de Medarex, Inc. (Princeton, NJ).

Em uma alternativa, os anticorpos podem ser produzidos recombinantemente e expressos usando-se qualquer método conhecido na técnica. Em outra alternativa, os anticorpos podem ser produzidos recombinantemente por tecnologia de revelação da fago. Vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.565.332; 5.580.717; 5.733.743; e 6.265.150; e Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994): Alternativamente, a tecnologia de revelação de fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) pode ser usada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo in vitro, de repertórios de gene de domínio (V) variáveis de imunoglobulina de doadores não-imunizados. De acordo com esta técnica, os genes de domínio V de anticorpo são cíonados na estrutura interna em ou um maior ou menor gene de proteína de revestimento de um bacteriófago f(lamentoso, tal como M13 ou fd, e revelado como fragmentos de anticorpo funcionais na superfície da partícula de fago. Devido a partícula filamentosa conter uma cópia de DNA de trançado simples do genoma de fago, seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe aquelas propriedades. ___Desse modo, o fago imita algumas das propriedades da célula B. A revelação do fago pode ser realizada em uma variedade de formatos; para revisão, vide, por exemplo, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Várias fontes de segmentos de gene15 V podem ser usadas para revelação de fago. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) isolou um arranjo diverso de anticorpos de antioxazolona de uma biblioteca combinatorial aleatória pequena de genes V derivados dos baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V de doadores humanos não-imunizados pode ser construído, e anticorpos para um arranjo diverso de antígenos (incluindo autoantígenos) podem ser isolados essencialmente seguindo as técnicas descritas por Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Em uma resposta imune natural, os genes de anticorpo acumulam mutações em uma alta taxa (hipermutação somática). Algumas das mudanças introduzidas con25 ferem alta afinidade, e células B revelando imunoglobulina de superfície de alta afinidade são preferencialmente replicadas e diferenciadas durante competição subseqüente de antígeno. Este processo natural pode ser imitado pelo emprego da técnica conhecida como mistura de cadeia. Marks, et al., BioTTechnol. 10:779-783 (1992)). Neste método, a afinidade de anticor30 pos humanos primários obtidos por revelação de fago pode ser aperfeiçoada pela substituição seqüencialmente dos genes de região V de cadeia pesada e leve com repertórios de variantes que ocorrem naturalmente (repertó55 rios) de genes de domínio V obtidos de doadores não-imunizados. Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos com afinidades na faixa pM-nM. Uma estratégia para produção de repertórios de anticorpo de fago muito grandes (também conhecida como as bibliotecas mãe de todos) foi descrita por Waterhouse et al., Nucl. Ácidos Res. 21:22652266 (1993). A mistura de gene pode também ser usada para derivar anticorpos humanos de anticorpos de roedor, onde o anticorpo humano tem afinidades similares e especificidades ao anticorpo de roedor de partida. De acordo com este método, que é também referido como impressão de epíto10 po, o gene de domínio V de cadeia pesada ou leve de anticorpos de roedor _______obtido pela técnica de revelação de fago é substituído com um repertório de genes V humanos de domínio, criando quimeras de roedor-humano. A seleção no antígeno resulta no isolamento de regiões humanas variáveis capazes de restaurar um local de ligação de antígeno funcional, isto é, o epítopo que regula (impressões) a escolha do co-participante. Quando o processo é repetido de modo a substituir o domínio V de roedor remanescente, um anticorpo humano é obtido (vide Publicação PCT No. WO 93/06213, publicada em 01 de abril de 1993). A humanização tradicional diferente de anticorpos de roedor por enxerto de DR, esta técnica proporciona anticorpos completa20 mente humanos, que não têm estrutura ou resíduos de CDR de origem de roedor.

É aparente que embora a discussão acima pertença a anticorpos humanizados, os princípios gerais discutidos são aplicáveis a construção de anticorpos para uso, por exemplo, em cães, gatos, primata, eqüinos e bovi25 nos. É adicionalmente aparente que um ou mais aspectos da humanização de um anticorpo aqui descrita pode ser combinada, por exemplo, com enxerto de CDR, mutação de estrutura e mutação de CDR.

Os anticorpos podem ser produzidos recombinantemente primeiro pelo isolamento dos anticorpos e células de produção de anticorpo de a30 nimaís hospedeiros, obtendo-se a seqüência de gene, e usando-se a seqüência de gene para expressar o anticorpo recombinantemente em células hospedeiras (por exemplo, células de CHO). Outro método que pode ser empregado é expressar a seqüência de anticorpo em plantas (por exemplo, tabaco), ou leite transgênico. Métodos para expressar anticorpos recombinantemente em plantas ou leite foram revelados. Vide, por exemplo, Peeters, et al. Vaccine 19:2756 (2001); Lonberg, N. and D. Huszar

Intftev.lmmunol 13:65 (1995); e Poüock, et al., J Immunol Métodos 231:147(1999). Métodos para produção de derivados de anticorpos, por exemplo, humanizados, de cadeia simples, etc., são conhecidos na técnica.

Imunoensaios e técnicas de classificação de citometria de fluxo, tal como classificação de célula ativada de fluorescência (FACS), podem também serem empregadas para isolar anticorpos que são específicos para --------CGRP.----------------------------Os anticorpos podem estar ligados a muitos transportadores diferentes. Os transportadores podem ser ativos e/ou inertes. Exemplos de transportadores bem-conhecidos incluem polipropileno, poliestireno, polieti15 leno, dextrano, náilon, amilases, vidro, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetita. A natureza do transportador pode ser ou solúvel ou insolúvel para proposta da invenção. Aqueles versados na técnica saberão de outros transportadores adequados para ligação dos anticorpos, ou serão capazes de determinarem tais transportadores usando experimen20 tação de rotina. Em algumas concretizações, o transportador compreende uma porção que tem como alvo o miocárdio.

O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é prontamente isolado e seqüenciado usando-se procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesada e leve dos anticorpos monoclonais). As células de hibridoma servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão (tais como vetores de expressão revelados na Publicação PGT No. WO 87/04462), que são, em seguida, transfectados em células hospe30 deiras, tais como células de E. coli, células de COS de símio, células (CHO) de ovário de hamster chinês, ou células de mieloma que não produzem, de outro modo, proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Vide, por exemplo, Publicação PCT No. WO 87/04462. O DNA também pode ser modificado, por exemplo, pela substituição da seqüência de codificação para domínios constantes de cadeia pesada e leve no lugar das seqüências homólogas de murina, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851 (1984), ou pela união covalentemente a seqüência de codificação de imunoglobuiina toda ou parte da seqüência de codificação para um polipeptídeo de não-imunoglobulina. Desta maneira, anticorpos quiméricos ou híbridos” são preparados, que têm a especificidade de ligação de um anticorpo anti-CGRP monoclonal a10 qui.

______________Os anticorpos antagonistas de anti-CGRP e polipeptídeos derivados dos anticorpos podem ser identificados ou caracterizados usando-se métodos conhecidos na técnica, pelo que redução, melhora ou neutralização de uma atividade biológica de CGRP é detectada e/ou medida. Por exemplo, anticorpo antagonista anti-CGRP pode também ser identificado pela incubação de um agente candidato com CGRP, e monitorando-se qualquer um ou mais das seguintes características: (a) ligar-se ao CGRP; (b) bloquear o CGRP de se ligar a seu(s) receptor(es); (c) bloquear ou diminuir a ativação de receptor de CGRP (incluindo ativação de cAMP); (d) inibir a atividade bio20 lógica do CGRP ou trajetórias a jusantes mediadas por funções de sinalização de CGRP; (e) prevenir, melhorar ou tratar qualquer aspecto de dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca); (f) aumentar a folga de CGRP; e (g) inibir (reduzir) a síntese, produção ou liberação de CGRP. Em algumas concretizações, um anticorpo antagonista anti-CGRP ou polipeptídeo é identificado pela incubação de um agente candidato com CGRP, e monitorando-se a ligação e/ou redução auxiliar ou neutralização de uma atividade biológica de CGRP. O ensaio de ligação pode ser realizado com polipeptídeo(s) de CGRP purificados, ou com células que expressam naturalmente, ou transfectadas para expressar polipeptídeo(s) de CGRP. Em uma concretização, o ensaio de ligação é um ensaio de ligação competitivo, onde a capacidade de um anticorpo candidato competir com um antagonista anti-CGRP conhecido para ligação de CGRP é avaliada. O ensaio pode ser realizado em vários b i í

formatos, incluindo o formato ELISA. Em outras concretizações, um anticorpo antagonista anti-CGRP é identificado por incubação de um agente candidato com CGRP, e monitorando-se a ligação e inibição auxiliar de ativação de receptor de CGRP expresso na superfície de uma célula.

Em seguida a identificação iniciai, a atividade de um anticorpo antagonista anti-CGRP candidato pode ser adicionalmente confirmada e refinada por bioensaios, conhecidos por testar as atividades biológicas alvos. Alternativamente, os bioensaios podem ser usados para classificar candidatos diretamente. Por exemplo, o CGRP promove um número de mudanças mensuráveis em células responsivas. Estas incluem, mas não estão limíta—------das a, estimulação de cAMP na célula (por exemplo, células SK-N-MC). A atividade antagonista pode também ser medida usando-se modelos de animal, tal como medição da vasodilatação da pele induzida por estimulação do nervo safenoso do rato. Escott et al., Br. J. Pharmacol. 110: 772-776, 1993.

Modelos de animal de dores de cabeça (tal como, enxaqueca) podem adicionalmente serem usados para eficácia de teste de anticorpos antagonistas ou polipeptídeos. Reuter, et al., Functional Neurology (15) Suppl.3, 2000. Alguns dos métodos para identificação e caracterização de anticorpo antagonista anti-CGRP ou polipeptídeo são descritos em detalhes nos Exemplos.

Os anticorpos antagonistas de anti-CGRP podem ser caracterizados usando-se métodos bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, um método é identificar o epítopo ao qual ele se liga, ou mapeamento de epítopo. Existem muitos métodos conhecidos na técnica para mapeamento e caracterização da localização de epítopos nas proteínas, incluindo dissolver25 se a estrutura de cristal de um complexo de anticorpo-antígeno, ensaios de competição, ensaios de expressão de fragmento de gene, e ensaios baseados em peptídeo sintético, conforme descrito, por exemplo, no Capítulo 11 de Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. Em um e30 xemplo adicional, o mapeamento do epítopo pode ser usado para determinar a seqüência a qual um anticorpo antagonista anti-CGRP se liga. O mapeamento de epítopo é comercialmente disponível de várias fontes, por exem59

plo, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands). O epítopo pode ser um epítopo linear, isto é, contido em um trecho simples de aminoácidos, ou um epítopo conformacional formado por uma interação tridimensional de aminoácidos que não pode necessariamente θεό tar contido em um trecho simples. Os peptídeos de comprimentos variados (por exemplo, pelo menos 4-6 aminoácidos de comprimento) podem ser isolados ou sintetizados (por exemplo, recombinantemente), e usados para ensaios de ligação com um anticorpo antagonista anti-CGRP. Em outro exemplo, o epítopo ao qual o anticorpo antagonista anti-CGRP se üga pode ser determinado em uma classificação sistemática pelo uso de sobreposição de

---------peptírifios derivados a partir da seqüência de CGRP, e determinando-se a ligação pelo anticorpo antagonista anti-CGRP. De acordo com os ensaios de expressão de fragmento de gene, a estrutura de leitura aberta que codifica CGRP é fragmentada, ou aleatoriamente, ou por construções genéticas βει 5 pecíficas, e a reatividade dos fragmentos expressos de CGRP com o anticorpo a ser testado é determinada. Os fragmentos de gene podem, por exemplo, serem produzidos por PCR e, em seguida, transcritos e transladados em proteína in vitro, na presença de aminoácidos radioativos. A ligação do anticorpo aos fragmentos de CGRP radioativamente rotulados é, em se20 guida, determinada por imunoprecipitação e eietroforese de gei. Certos epítopos podem também serem identificados pelo uso de grandes bibliotecas de seqüências de peptideo aleatórias na superfície das partículas de fago (bibliotecas de fago). Altemativamente, uma biblioteca definida de sobreposição de fragmentos de peptideo pode ser testada para ligação ao anticorpo de teste em ensaios de ligação simples. Em um exemplo adicional, a mutagênese de um domínio de ligação de antígeno, experimentos de troca de domínio, e mutagênese de varredura de alanina, podem ser realizadas para identificar resíduos requeridos, suficientes e/ou necessários para ligação de epítopo. Por exemplo, experimentos de troca de domínio podem ser realiza30 dos usando-se um CGRP mutante no qual vários fragmentos do polipeptídeo de CGRP foram substituídos (trocados) com seqüências de uma proteína proximamente relacionada, mas antigenicamente distinta (tal como outro

ç membro da família de proteína neurotrofina). Pela avaliação da ligação do anticorpo ao CGRP mutante, a importância do fragmento de CGRP particular para ligação do anticorpo pode ser avaliada.

Ainda outro método que pode ser usado para caracterizar um 5 anticorpo antagonista anti-CGRP é usar ensaios de competição com outros anticorpos conhecidos para se ligar ao mesmo antígeno, isto é, vários fragmentos no CGRP, para determinar se o anticorpo antagonista anti-CGRP se liga ao mesmo epítopo como outros anticorpos. Ensaios de competição são bem-conhecidos àqueles versados na técnica.

Um vetor de expressão pode ser usado para dirigir expressão de um anticorpo antagonista anti-CGRP. Um versado na técnica é familiar com a administração de vetores de expressão par obter expressão de uma proteína exógena in vivo. Vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.436.908; 6.413.942; e 6.376.471. A administração de vetores de expressão inclui administração local ou sistêmica, incluindo injeção, administração oral, canhão de partícula, ou administração cateterizada, e administração tópica. Em outra concretização, o vetor de expressão é administrado diretamente ao tronco simpático ou gânglio, ou em uma artéria coronária, átrio, ventrical, ou pericárdio.

A distribuição alvo de composições terapêuticas contendo um vetor de expressão, ou polinucleotídeos subgenômicos, pode também ser usada. As técnicas de distribuição de DNA mediada por receptor são descritas em, por exemplo, Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutícs: Methods And Applications Of Direct Gene Trans25 fer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et aí., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338. As composições terapêuticas contendo um polinucleotídeo são administradas em uma faixa de cerca de 100 ng a cerca de 200 mg of DNA para administração local em um protocolo de terapia de gene. Faixas de concentração de cerca de 500 ng a cerca de 50 mg, cerca de 1 pg a cerca de 2 mg, cerca de 5 pg a cerca de 500 pg, e cerca de 20 pg a cerca de 100 pg of DNA podem também se61

rem usadas durante um protocolo de terapia de gene. Os polinucleotídeos terapêuticos e polipeptideos podem ser distribuídos usando-se veículos de distribuição de gene. O veículo de distribuição de gene pode ser de origem viral ou não-viral (vide, gera,mente, Jolly, Câncer Gene Therapy (1994) 1:51;

Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelty, Human Gene Therapy (1995) 1:185; and Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). A expressão de tais seqüências de codificação pode ser induzida usando-se promotores de mamífero endógeno ou heterólogo. A expressão da seqüência de codificação pode ser ou constitutiva ou regulada.

Vetores de base vira, para distribuição de um polinucleotídeo ____________desejado e expressão em uma céluia desejada são conhecidos na técnica.

Veículos de base vira, exemplares incluem, mas não estão limitados a, retrovírus recombinantes (vide, por exemplo, Publicação PCT Nos. WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO

93/10218; WO 91/02805; Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.219.740 e

4.777.127; Patente GB No. 2.200.651; e Patente EP No. 0 345 242), vetores baseados em alfavírus (por exemplo, vetores de vírus Sindbis, vírus de floresta Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), vírus Ross River (ATCC VR373; ATCC VR-1246) e vírus de encefalite eqüínea da Venezuelan (ATCC

VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), e vetores de vírus associados a adeno (AAV) (vide, por exemplo, Publicação PCT Nos. WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655). A administração de DNA ligado a adenovírus morto, conforme descrita em Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147, pode também ser em25 pregada.

Veículos de distribuição não-virais e métodos podem também serem empregados, incluindo, mas não limitado a, DNA policatiônico condensado ligado ou não-ligado a adenovírus morto sozinho (vide, por exemplo, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); DNA ligado a ligante (vide, por exemplo, Wu, J. Bioi. Chem. (1989) 264:16985); células de veículos de distribuição de célula eucariótica (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.814.482; Publicação PCT Nos. WO 95/07994; WO 96/17072; WO

95/30763; e WO 97/42338), e neutralização ou fusão de carga nucléica com membranas celulares. DNA desprotegido pode também ser empregado. Métodos de introdução de DNA desprotegido exemplar são descritos na Publicação PCT No. WO 90/11092 e Patente U.S. No. 5.580.859. Os lipossomas que agem como veículos de distribuição de gene são descritos na Patente U.S. No. 5.422.120; Publicação PCT Nos. WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; e EP 0524968. Aproximações adicionais são descritas em Philip, Mol. Célula Biol. (1994) 14:2411, e em Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994)91:1581.

C. Anticorpo G1 anticorpos relacionados, polipeptídeos, polinucleotídeos, vetores e células hospedeiras

Esta invenção envolve composições, incluindo composições farmacêuticas compreendendo anticorpo G1 e suas variantes mostrados na Tabela 6, ou polipeptídeo derivado de anticorpo G1 e suas variantes mostra15 dos na Tabela 6; e polinucleotídeos compreendendo seqüências que codificam G1 e suas variantes, ou o polipeptídeo. Conforme usado aqui, as composições compreendem um ou mais anticorpos ou polipeptídeos (que pode ou não pode ser um anticorpo) que se liga a CGRP, e/ou um ou mais polinucleotídeos compreendendo seqüências que codificam um ou mais anticorpos ou polipeptídeos que se ligam a CGRP. Estas composições podem adicionalmente compreender excipientes adequados, tais como excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluindo tampões, que são bem-conhecidos na técnica.

Os anticorpos antagonistas de anti-CGRP e polipeptídeos da invenção são caracterizados por qualquer (uma ou mais) das seguintes características: (a) se ligar a CGRP; (b) bloquear CGRP de ligação a seu(s) receptor(es); (c) bloquear ou diminuir ativação de receptor de CGRP (incluindo ativação de cAMP); (d) inibir atividade biológica de CGRP ou trajetórias a jusantes mediadas por função de sinalização de CGRP; (e) impedir, me30 Ihorar, ou tratar qualquer aspecto de dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca); (f) aumentar folga de CGRP; e (g) inibir (reduzir) síntese, produção ou liberação de CGRP.

C

Conseqüentemente, a invenção proporciona qualquer do seguinte, ou composições (incluindo composições farmacêuticas) compreendendo qualquer do seguinte: (a) anticorpo G1 ou suas variantes mostrados na Tabela 6; (b) um fragmento ou uma região de anticorpo G1, ou suas variantes mostrado na Tabela 6; (c) uma cadeia leve de anticorpo G1, ou suas variantes mostrados na Tabela 6; (d) uma cadeia pesada de anticorpo G1, ou suas variantes mostrados na Tabela 6; (e) uma ou mais região(ões) variável(is) de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada de anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6; (f) uma ou mais CDR(s) (uma, duas, três, qua10 tro, cinco ou seis CDRs) de anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6; (g) CDR H3 a partir da cadeia pesada de anticorpo G1; (h) CDR L3 a partir da cadeia leve de anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6; (i) três CDRs a partir da cadeia leve de anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6; (j) três CDRs a partir da cadeia pesada of an15 ticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6; (k) três CDRs a partir da cadeia leve e três CDRs a partir da cadeia pesada de anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6; e (I) um anticorpo compreendendo qualquer uma de (b) a (k). A invenção também proporciona polipeptídeos compreendendo qualquer um ou mais dos acima.

As porções de CDR de anticorpo G1 (incluindo CDRs de Chothia e de Kabat) são diagramaticamente representadas na Figura 5. A determinação de regiões de CDR está bem dentro dos versados na técnica. É compreendido que, em algumas concretizações, CDRs podem ser uma combinação da CDR de Kabat e de Chothia (também denominada CDRs combi25 nadas ou CDRs extendidas). Em algumas concretizações, as CDRs são as CDRs de Kabat. Em outras concretizações, as CDRs são as CDRs de Chothia. Em outras palavras, em concretizações com mais do que uma CDR, as CDRs podem ser qualquer CDR de Kabat, de Chothia, combinação de CDRs, ou combinações destas.

Em algumas concretizações, a invenção proporciona um polipeptídeo (que pode ou não ser um anticorpo) que compreende pelo menos uma CDR, pelo menos duas, pelo menos três, ou pelo menos quatro, pelo

C><\ menos cinco, ou todos as seis CDRs que são substancialmente idênticas a pelo menos uma CDR, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou todas as seis CDRs de G1 ou suas variantes, mostrados na Tabela 6. Outras concretizações incluem anticorpos que têm pelo menos duas, três, quatro, cinco, ou seis CDR(s) que são substancialmente idênticas a pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs de G1 ou derivado de G1. Em algumas concretizações, as pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDR(s) são pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idênticas a pelo menos u10 ma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs de G1 ou suas variantes, mosirados na Tabela 6. É compreendido que para a proposta desta invenção, a especificidade de ligação e/ou atividade total é geralmente retida, embora a extensão da atividade possa variar comparada a G1 ou suas variantes, mostrado na Tabela 6 (pode ser maior ou menor).

A invenção também proporciona um polipeptídeo (que pode ou não ser um anticorpo) que compreende uma seqüência de aminoácido de G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6 que tem qualquer do seguinte: pelo menos 5 aminoácidos contíguos, pelo menos 8 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 10 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de

15 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 20 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 25 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 30 aminoácidos contíguos de uma seqüência of G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6, no qual pelo menos 3 dos aminoácidos são de uma região variável de G1 (Figura 5), ou suas variantes, mostrados na Tabela 6. Em uma concretização, a região variável é de uma cadeia leve de G1. Em outra concretização, a região variável é de uma cadeia pesada de G1. Um polipeptídeo exemplar tem aminoácido contíguo (comprimentos descritos acima) de ambas as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve de G1. Em outra concretização, os 5 (ou mais) aminoácidos contíguos são de uma regi30 ão de determinação de complementaridade (CDR) de G1 mostrada na Figura 5. Em algumas concretizações, os aminoácidos contíguos são de uma região variável de G1.

A afinidade de ligação(K_D) de um anticorpo antagonista antiCGRP e polipeptídeo para CGRP (tal como α-CGRP humano) pode ser cerca de 0,06 a cerca de 200 nM. Em algumas concretizações, a afinidade de ligação é qualquer de cerca de 200 nM, 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 20 pM, cerca de 15 pM, cerca de 10 pM, cerca de 5 pM, ou cerca de 2 pM. Em algumas concretizações, a afinidade de ligação é menor do que qualquer de cerca de 250 nM, cerca de 200 nM, cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, ou cerca de 50 pM.

A jnvenção também proporciona métodos de produção de qualquer destes anticorpos ou polipeptídeos. Os anticorpos desta invenção podem ser produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Os polipeptídeos podem ser produzidos por proteolítico ou outra degradação dos anticorpos, por métodos recombinantes (isto é, polipeptídeos simples ou de fusão) conforme descrito acima ou por síntese química. Os polipeptídeos dos anticorpos, especialmente polipeptídeos mais curtos até cerca de 50 aminoácidos, são conveníentemente produzidos por síntese química. Métodos se síntese química são conhecidos na técnica e são comercialmente disponíveis. Por exemplo, um anticorpo pode ser produzido por um sintetizador automático de polipeptídeo que emprega o método de fase sólida. Vide, também, Patentes dos Estados Unidos N^es 5.807.715; 4.816.567; e 6.331.415.

Em outra alternativa, os anticorpos podem ser produzidos recombinantemente usando-se procedimentos que são bem-conhecidos na técnica. Em uma concretização, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica as regiões variáveis de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de anticorpo G1 mostrada em SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 10. Em outra concretização, os polinucleotídeos compreendendo uma seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO:9 e SEQ ÍD NO:10 são clonados em um ou mais vetores para expressão ou propagação. A seqüência que codifica o anticorpo de interesse pode ser mantida em um vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode, em seguida, ser expandida e congelada ί

para uso futuro. Os vetores (incluindo vetores de expressão) e células hospedeiras são adicíonalmente descritos aqui.

A invenção também envolve fragmentos de região variável de cadeia simples (scFv) de anticorpos desta invenção, tal como G1. Os fragmentos de região variável de cadeia simples são produzidos pela ligação de regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada usando-se um peptídeo de ligação curta. Bird et al. (1988) Science 242:423-426. Um exemplo de um peptídeo de ligação é (GGGGS)3 que liga aproximadamente 3,5 nm entre o terminal carbóxi de uma região variável e o terminal amino da outra região variável. Ligadores de outras seqüências foram designados e usados. Bird et al. (1988). Os ligadores podem, por sua vez, serem modificados para funções de adição, tal como fixação de fármacos ou fixação a suportes sólidos. As variantes de cadeia simples podem ser produzidas ou recombinantemente ou sinteticamente. Para produção sintética de scFv, um sintetizador auto15 mático pode ser usado. Para produção recombinante de scFv, um plasmídeo adequado contendo polinucleotídeo que codifica o scFv pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada, ou eucariótica, tal como células de levedura, planta, inseto ou mamífero, ou procariótica, tal como E. coli. Os polinucleotídeos que codificam o scFv de interesse podem ser produzidos por manipulações de rotina, tal como ligação de polinucleotídeos. O scFv resultante pode ser isolado usando-se técnicas de purificação de proteína padrões conhecidas na técnica.

Outras formas de anticorpos de cadeia simples, tais como diacorpos, são envolvidas. Os diacorpos são anticorpos bivalentes biespecíficos nos quais domínios de VH e VL são expressos em uma cadeia de polipeptídeo simples, mas usando-se um ligador que é muito curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando, desse modo, os domínios a emparelharem com os domínios complementares de outra cadeia, e criando dois locais de ligação de antígeno (vide, por exem30 plo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J„ et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

Por exemplo, anticorpos biespecíficos, anticorpos monoclonais

que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes, podem ser preparados usando-se os anticorpos aqui descritos. Os métodos para produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210).

Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos baseada na co-expressão de dois pares de imunoglobulina de cadeia pesadacadeia leve, com as duas cadeias pesadas tendo especificidades diferentes (Miilstein and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539).

De acordo com a aproximação para produzir anticorpos biespe10 cíficos, os domínios variáveis do anticorpo com as especificidades de ligação desejadas_(locais de combinação anticorpo-antígeno) são fundidos em seqüências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão preferivelmente é com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte da articulação, regiões CH2 e CH3. É preferido ter15 se a primeira região constante de cadeia pesada (CH1), contendo um local necessário para ligação de cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores separados de expressão, e são co-transfectados em um organismo hos20 pedeiro adequado. Isto proporciona maior flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeo nas concretizações quando razões desiguais das três cadeias de polipeptídeo usadas na construção proporcionam os rendimentos ótimos. É, contudo, possível inserir as seqüências de codificação ou todas as três cadeias de polipeptídeo em um vetor de expressão quando a expressão de peto menos duas cadeias de polipeptídeo em razões iguais resulta em altos rendimentos, ou quando as razões são de significância não particular.

Em uma aproximação, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira es30 pecificidade de ligação em um braço, e um par de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. A estrutura assimétrica, com uma cadeia leve de imu7 <L noglobulina em somente uma metade da molécula biespecífica, facilita a separação do composto biespectfico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina tndesejadas. Esta aproximação é descrita na Publicação PCT No. WO 94/04690, publicada em 3 de março de 1994.

Anticorpos heteroconjugados, compreendendo dois anticorpos covalentemente unidos, estão também dentro do escopo da invenção. Tais anticorpos têm sido usados para células de sistema imune alvos para células indesejadas (Patente U.S. N² 4.676.980), e para tratamento de infecção de HIV (Publicações de Pedidos PCT N²s WO 91/00360 e WO 92/200373; EP

03089). Os anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos usando-se _______quaisquer métodos de reticulação convenientes. Agentes e técnicas de ligação adequados são bem-conhecidos na técnica, e são descritos na Patente

U.S. N² 4.676.980.

Anticorpos quiméricos e híbridos também podem ser preparados in vitro usando-se métodos conhecidos de química de proteína sintética, incluindo aqueles envolvendo agentes de reticulação. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídas usando-se uma reação de troca de dissulfito, ou pela formação de uma ligação de tioéter. Exemplos de reagentes adequados para esta proposta incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato.

Anticorpo humanizado compreendendo uma ou mais CDRs de anticorpo G1, ou suas variantes, mostradas na Tabela 6, ou uma ou mais CDRs derivadas de anticorpo G1, ou suas variantes, mostradas na Tabela 6, pode ser produzido usando-se quaisquer métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, quatro etapas gerais podem ser usadas para humanizar um anticorpo monoclonal.

A invenção envolve modificações ao anticorpo Gl, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6, incluindo funcionalmente anticorpos equivalentes que não afetam significantemente suas propriedades e variantes que tem atividade e/ou afinidade aumentada ou diminuída. Por exemplo, a se30 qüência de aminoácido de anticorpo G1, ou suas variantes, mostradas na Tabela 6, podem sofrer mutação para obter um anticorpo com a afinidade de ligação desejada para CGRP. A modificação de polipeptídeos é prática de rotina na técnica, e não necessita ser descrita em detalhes aqui. A modificação de polipeptídeos é exemplificada nos Exemplos. Os exemplos de polipeptídeos modificados incluem polipeptídeos com substituições conservativas de resíduo de aminoácidos, uma ou mais retiradas ou adições de ami5 noácidos que não mudam significantemente danosamente a atividade funcional, ou uso de análogos químicos.

As inserções de seqüência de aminoácido incluem fusões de amino- e/ou carboxil-terminal variando em comprimento de um resíduo para polipeptídeos contendo uma centena ou mais de resíduos, bem como inser10 ções de intra-seqüência de resíduo simples ou múltiplo de aminoácidos. E_ xemplos de inserções terminais incluem um jinticorpo com um resíduo metionil N-terminal, ou o anticorpo fundido a uma etiqueta epítopo. Outras variantes insercionais da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal Nou C- do anticorpo de uma enzima, ou um polipeptídeo que aumenta a meia15 vida de soro do anticorpo.

As variantes de substituição têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo removida, e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os locais de maior interesse para mutagênese substitucional incluem regiões hipervariáveis, mas alterações de Fr são também con20 templadas. As substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 sob uma parte superior de substituições conservativas. Se tais substituições resultam em uma mudança na atividade biológica, então mais mudanças substanciais, denominadas substituições exemplares na Tabela 1, ou conforme adicionalmente descrito abaixo em referência às classes de aminoáci25 do, podem ser introduzidas e os produtos classificados.

Tabela 1. Substituições de aminoácido

Resíduo Original	Substituições Conservativas	Substituições Exemplares
Ala (A)	Vai	Vai; Leu; lie
Arg (R)	Lys	Lys; Gin; Asn
Asn (N)	Gin	Gin; His; Asp, Lys; Arg
Asp (D)	Glu	Glu; Asn
Cys (C)	Ser	Ser; Ala

£

Resíduo Original	Substituições Conservativas	Substituições Exemplares
Gin (Q)	Asn	Asn; Glu
Glu (E)	Asp	Asp; Gin
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Arg	Asn; Gin; Lys; Arg
He (I)	Leu	Leu; Vai; Met; Ala; Phe; Norleucina
Leu (L)	He	Norleucina; lie; Vai; Met; Ala; Phe
Lys (K)	Arg	Arg; Gin; Asn
Met (M)	Leu	Leu; Phe; lie
Phe (F)	Tyr	Leu; Vai; He; Ala; Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr	Tyr; Phe
Tyr (Y)	Phe	Trp; Phe; Thr; Ser
Vai (V)	Leu	lie; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina

Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são providas pela seleção de substituições que diferem significantemente em seu efeito na manutenção (a) da estrutura do suporte de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma chapa ou conforma5 ção helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) a massa da cadeia lateral. Naturalmente, resíduos ocorrentes são divididos em grupos baseados nas propriedades de cadeia lateral comuns:

(1) Não-polar: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie;

(2) Polar sem carga: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;

(3) Acídico (negativamente carregado: Asp, Glu;

(4) Básico (positivamente carregado): Lys, Arg;

(5) Resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e (6) Aromático: Trp, Tyr, Phe, His.

Substituições não-conservativas são produzidas pela troca de 15 um membro de uma destas classes para outra classe.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação correta do anticorpo também pode ser substituído, geralmente £7 com serina, para aperfeiçoar a estabilidade oxidante da molécula e impedir reticulação aberrante. Inversamente, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para aperfeiçoar sua estabilidade, particularmente onde o é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fv.

As modificações de aminoácido podem variar de mudança ou modificação de um ou mais aminoácidos para completar o redesenho de uma região, tal como a região variável. As mudanças na região variável podem alterar a afinidade e/ou especificidade da ligação. Em algumas concretizações, não mais do que uma a cinco substituições conservativas de ami10 noácido são produzidas dentro de um domínio de CDR. Em outras concreti_ zações, não mais do que uma a três substituições conservativas de aminoácido são produzidas dentro de um domínio de CDR. Em ainda outras concretizações, o domínio de CDR é CDR H3 e/ou CDR L3.

As modificações também incluem polipeptídeos glicosilatados e não-glicosilatados, bem como polipeptídeos com outras modificações póstranslacionais, tais como, por exemplo, glicosilação com açúcares diferentes, acetilação e fosforilação. Os anticorpos são glicosilatados em posições conservadas em regiões constantes (Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TíbTECH 15:26-32). As cadeias la20 terais de oligossacarídeo das imunoglobulinas afetam a função da proteína (Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180), e a interação intramolecular entre porções da glicoproteína, que pode afetar a conformação e a superfície tridimensional apresentada da glicoproteína (Hefferis and Lund, supra; Wyss and Wagner,

1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Os oligossacarídeos podem também servir como alvo de uma dada glicoproteína para certas moléculas baseadas nas estruturas de reconhecimento específico. A glicosilação de anticorpos foi também reportada para efetuar a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC). Em particular, células de CHO com expressão regu30 lada por tetraciclina de p(1,4)-N-acetilglícosaminiltransferase Iii (GnTIlI), uma glicosiltransferase que catalisa a formação de GlcNAc disecante, foram reportadas para ter atividade aperfeiçoada de ADCC (Umana et al., 1999, Mau t c

ture Biotech. 17:176-180).

A glicosilação de anticorpos é tipicamente ou N-igante ou 0igante. N-igante se refere à fixação da porção de carboidrato para a cadeia iateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeo asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina, e asparagina-X-cisteína, onde X é aminoácido exceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para fixação enzimática da porção de carboidrato para a cadeia lateral de asparagina. Desse modo, a presença de qualquer destas seqüências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um local de glicosilação potential. A glicosilação Oigante se refere à fixação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose ajjm ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina podem também serem usadas.

A adição de locais de glicosilação ao anticorpo é convenientemente acompanhada pela alteração da seqüência de aminoácido tal que ela contenha um ou mais das seqüências de tripeptídeo acima descritas (para locais de glicosilação N-igante). A alteração pode também ser produzida pela adição de, ou substituição por um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo original (para locais de glicosilação O-igante).

O modelo de glicosilação de anticorpos pode também ser alterado sem se alterar a seqüência de nucleotídeo subjacente. A glicosilação depende grandemente da célula hospedeira usada para expressar o anticorpo. Desde que o tipo de célula usada para expressão de glicoproteínas recombinantes, por exemplo, anticorpos, como terapêuticos potenciais, seja raramente a célula nativa, variações no modelo de glicosilação dos anticorpos podem ser esperadas (vide, por exemplo, Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070).

Em adição a escolha de células hospedeiras, fatores que afetam a glicosilação durante produção de recombinante de anticorpos incluem modo de crescimento, formulação média, densidade de cultura, oxigenação, pH, esquemas de purificação, e similares. Vários métodos foram propostos para alterar o modelo de glicosilação alcançado em um organismo hospedeiro particular incluindo introdução ou sobreexpressão de certas enzimas en73

‘U volvidas na produção de oligossacarídeo (Patentes dos Estados Unidos N^gs 5.047.335; 5.510.261 e 5.278.299). A glicosilação, ou certos tipos de gticosilação, podem ser enzimaticamente removidas a partir da glicoproteína, por exemplo, usando-se endoglicosidase H (Endo H), N-glicosidase F, endogli5 cosidase F1, endoglicosidase F2, endoglicosidase F3. Em adição, a célula hospedeira recombinante pode ser geneticamente projetada para ser defectiva no processamento de certos tipos de polissacarídeos. Estas e outras técnicas similares são bem-conhecidas na técnica.

Outros métodos de modificação incluem usar técnicas de aco10 plamento conhecidas na técnica, incluindo, mas não limitadas a, meios enzimáticos, substituiçãoj)xidante e quelação. Modificações podem ser usadas, por exemplo, para fixação de rótulos para imunoensaio. Polipeptídeos G1 modificados são produzidos usando-se procedimentos estabelecidos na técnica, e podem ser classificados usando-se ensaios padrões conhecidos na técnica, alguns dos quais são descritos abaixo e nos Exemplos.

Em algumas concretizações da invenção, o anticorpo compreende uma região constante modificada, tal como uma região constante que é imunologicamente inerte, ou parcialmente inerte, por exemplo, não dispara lisis mediados por complemento, não estimulada citotoxicidade mediada por célula dependente do anticorpo (ADCC), ou não ativada microglia; ou tem atividades reduzidas (comparada ao anticorpo não-modificado) em qualquer um ou mais dos seguintes: disparo de lisis mediados por complemento, estimulação de citotoxicidade mediada por célula dependente do anticorpo (ADCC), ou ativação de microglia. Modificações diferentes da região cons25 tante podem ser usadas para alcançar nível ótimo e/ou combinação de funções realizadoras. Vide, por exemplo, Morgan et al., Immunology 86:319-324 (1995); Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969 (1996); Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184 (2000); Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601 (1989); e Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998). Em algumas concretizações, a região constante é modificada conforme descrito em Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; Pedido PCT No. PCT/GB99/01441; e/ou Pedido de Patente UK No. 9809951.8. Em outras concretizações, o anticorpo compreende uma região constante lgG2 de cadeia pesada humana compreendendo as seguintes mutações: A330P331 a S330S331 (numeração de aminoácido com referência a seqüência igG2 tipo selvagem ). Eur. J. Immunoi. (1999) 29:2613-2624. Em ainda outras concretizações, a região constante é aglicosilatada para glicosifação N-igante. Em algumas concretizações, a região constante é aglicosilatada para glicosilação N-igante por mutação do resíduo glicosilatado de aminoácido ou resíduos de fianqueamento que são parte da seqüência de reconhecimento de N-glicosilação na região constante. Por exemplo, o local de N-glicosilação N297 pode sofrer mutação para A, Q, K, ou H. Vide, Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601 (1989); e Jefferis et ai., Immunological Reviews 163:5976 (1998). Em algumas concretizações, a região constante é aglicosilatada para giicosilação N-igante. A região constante pode ser aglicosilatada para glicosiiação N-igante enzimaticamente (tai como remoção de carboidrato por enzima PNGase), ou por expressão em uma célula hospedeira deficiente de giicosilação.

Outras modificações de anticorpo incluem anticorpos que foram modificados conforme descrito na Publicação PCT No. WO 99/58572, publicada em 18 de novembro de 1999. Estes anticorpos compreendem, em adição a um domínio de ligação dirigido na molécula alvo, um domínio realizador tendo uma seqüência de aminoácido substancialmente homóloga a todo ou parte do domínio constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina humana. Estes anticorpos são capazes de se ligarem à molécula alvo sem disparar lisis dependente de complemento significante, ou destruição mediada por célula do alvo. Em algumas concretizações, o domínio realizador é capaz de ligar especificamente FcRn e/ou FcYRIIb. Estes são tipicamente baseados em domínios quiméricos derivados de dois ou mais domínios de Ch2 de cadeia pesada de imunoglobulina humana. Os anticorpos modificados dessa maneira são particularmente adequados para uso na terapia de anticorpo crônica, para evitar reações inflamatórias e outras reações adversas para terapia de anticorpo convencional.

A invenção inclui concretizações maturadas de afinidade. Por exemplo, anticorpos maturados de afinidade podem ser produzidos por procedimentos conhecidos na técnica (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol.,

155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9; Hawkins et al, 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896; e W02004/058184).

Os seguintes métodos podem ser usados para ajustar a afinidade de um anticorpo e para caracterização de uma CDR. Um modo de caracterizar uma CDR de um anticorpo e/ou alterar (tal como aperfeiçoar) a afini10 dade de ligação de um polipeptídeo, tal como um anticorpo, denominado mutagênese de varredura de biblioteca. Geralmente, a mutagênese de varredura de biblioteca opera conforme segue. Uma ou mais posições do aminoácido na CDR são substituídas com dois ou mais (tais como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20) aminoácidos usando-se métodos reconhecidos na técnica. Isto gera pequenas bibliotecas de clones (em algumas concretizações, uma para toda posição do aminoácido que é analisada), cada uma com uma complexidade de dois ou mais membros (se dois ou mais aminoácidos são substituídos em toda posição). Geralmente, a biblioteca também inclui um clone compreendendo o aminoácido nativo (não-substituído). Um pequeno número de clones, por exemplo, cerca de 2080 clones (dependendo da complexidade da biblioteca), de cada biblioteca, são classificados para afinidade de ligação ao polipeptídeo alvo (ou outro alvo de ligação), e candidatos com aumentada, a mesma, diminuída ou nenhuma ligação são identificados. Os métodos para determinar a afinidade de ligação são bem-conhecidos na técnica. A afinidade de ligação pode ser determinada usando-se análise de ressonância plásmon de superfície Biacore, que detecta diferenças na afinidade de ligação de cerca de 2 vezes ou maior. Biacore é particularmente útil quando o anticorpo de partida já se liga com uma afinidade relativamente alta, por exemplo, uma K_D de cerca de 10 nM ou mais baixa. A classificação usando ressonância plasmon de superfície Biacore é descrita nos Exemplos aqui.

A afinidade de ligação pode ser determinada usando-se Kinexa ι

Biocensor, ensaios de proximidade de cintilação, ELISA, imunoensaio ORIGEN (IGEN), extinção de fluorescência, transferência de fluorescência, e/ou revelação de levedura. A afinidade de ligação pode também ser classificada usando-se bioensaio adequado.

Em algumas concretizações, toda posição do aminoácido em uma CDR é substituída (em algumas concretizações, uma em um tempo) com todos os 20 aminoácidos naturais usando métodos de mutagênese reconhecidos na técnica (alguns dos quais são descritos aqui). Isto gera pequenas bibliotecas de clones (em algumas concretizações, uma para toda posição do aminoácido que é analisada), cada com uma complexidade de 20 membros (se todos os 20 aminoácidos são substituídos em toda posição).

Em algumas concretizações, a biblioteca a ser classificada compreende substituições em duas ou mais posições, que podem ser na mesma CDR, ou em duas ou mais CDRs. Desse modo, a biblioteca pode compreen15 der substituições em duas ou mais posições em uma CDR. A biblioteca pode compreender substituição em duas ou mais posições em duas ou mais CDRs. A biblioteca pode compreender substituição em 3, 4, 5, ou mais posições, referidas posições encontradas em duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs. A substituição pode ser preparada usando-se códons de baixas re20 dundâncias. Vide, por exemplo, Tabela 2 de Balint et al. , (1993) Gene 137(1):109-18).

A CDR pode ser CDRH3 e/ou CDRL3. A CDR pode ser um ou mais de CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2, e/ou CDRH3. A CDR pode ser uma CDR de Kabat, uma CDR de Chothia, ou uma CDR extendida.

Os candidatos com ligação aperfeiçoada podem ser seqüenciados, identificando, desse modo, um mutante de substituição de CDR que resulta em afinidade aperfeiçoada (também denominada uma substituição aperfeiçoada). Os candidatos que se ligam podem também serem seqüenciados, identificando, desse modo, uma substituição de CDR que retém liga30 ção.

Etapas múltiplas de classificação podem ser conduzidas. Por exemplo, candidatos (cada um compreendendo uma substituição de amino77

ácido em uma ou mais posição de uma ou mais CDR) com ligação aperfeiçoada são também úteis para o desenho de uma segunda biblioteca contendo pelo menos o aminoácido original e substituído em cada posição de CDR aperfeiçoada (isto é, posição de aminoácido na CDR na qual um mutante de substituição mostrou ligação aperfeiçoada). A preparação e classificação ou seleção desta biblioteca é discutida adicionalmente abaixo.

A mutagênese de varredura de biblioteca também proporciona um meio para caracterização de uma CDR, na medida em que a freqüência de clones com ligação aperfeiçoada, a mesma ligação, ligação diminuída, ou nenhuma ligação, também proporcionam informação relacionada a impor_ tância de cada posição de aminoácido para a estabilidade do complexo anticorpo-antígeno. Por exemplo, se uma posição da CDR retém ligação quando mudada para todos os 20 aminoácidos, esta posição é identificada como uma posição que é dite rentemente para ser requerida para ligação de antígeno. Inversamente, se uma posição de CDR retém ligação em apenas uma pequena percentagem de substituições, esta posição é identificada como uma posição que é importante para função de CDR. Desse modo, os métodos de mutagênese de varredura de biblioteca geram informação relacionada às posições nas CDRs que podem ser mudadas para muitos aminoácidos diferentes (incluindo todos os 20 aminoácidos), e posições nas CDRs que não podem ser mudadas, ou que podem somente serem mudadas para uns poucos aminoácidos.

Os candidatos com afinidade aperfeiçoada podem ser combinados em uma segunda biblioteca, que incluem o aminoácido aperfeiçoado, o aminoácido original naquela posição, e podem adicionalmente incluir substituições adicionais naquela posição, dependendo da complexidade da biblioteca que é desejada, ou permitida usando-se o método de classificação ou seleção desejado. Em adição, se desejado, a posição de aminoácido adjacente pode ser randomizada para pelo menos dois ou mais aminoácidos. A randomização de aminoácidos adjacentes pode permitir flexibilidade conformacional adicional na CDR mutante, que pode, por sua vez, permitir ou facilitar a introdução de um grande número de mutações aperfeiçoadas. A biblio78

teca pode também compreender substituição na posição que não mostra afinidade aperfeiçoada na primeira etapa de classificação.

A segunda biblioteca é cíassificada ou selecionada para membros de biblioteca com afinidade de ligação aperfeiçoada e/ou alterada u5 sando-se qualquer método conhecido na técnica, incluindo classificação usando análise de ressonância plasmon de superfície Biacore, e seleção usando-se qualquer método conhecido na técnica para seleção, incluindo revelação de fago, revelação de levedura, e revelação de ribossomo.

A invenção também envolve proteínas de fusão compreendendo 10 um ou mais fragmentos ou regiões a partir dos anticorpos (tal como G1), ou - polipeptídeos _des_ta invenção. _Em jjma concretização, um polipeptídeo de fusão é provido, que compreende pelo menos 10 aminoácidos contíguos da região de cadeia leve variável mostrada em SEQ ID NO:2 (Figura 5), e/ou pelo menos 10 aminoácidos da região de cadeia pesada variável mostrada em SEQ ID NO:1 (Figura 5). Em outras concretizações, um polipeptídeo de fusão é provido, que compreende pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, ou pelo menos cerca de 30 aminoácidos contíguos da região de cadeia leve variável mostrada em SEQ ID NO:2 (Figura 5), e/ou pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, ou pelo menos cerca de 30 aminoácidos contíguos da região de cadeia pesada variável mostrada em SEQ ID NO:1 (Figura 5). Em outra concretização, o polipeptídeo de fusão compreende uma região de cadeia leve variável e/ou uma região de cadeia pesada variável de G1, conforme mostrado em SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:1 da Figura 5. Em outra concretização, o polipeptídeo de fusão compreende uma ou mais CDR(s) de G1. Em ainda outras concretizações, o polipeptídeo de fusão compreende CDR H3 e/ou CDR L3 de anticorpo G1. Para proposta desta invenção, uma proteína de fusão G1 contém um ou mais anticorpos G1 e outra seqüência de aminoácido a qual ela não está fixada na molécula nativa, por exemplo, uma seqüência heteróloga ou uma seqüência homóloga de outra região. As seqüências heterólogas exemplares incluem, mas não estão limitadas a, uma etiqueta tal como uma etiqueta

Λ

C

FLAG ou uma etiqueta 6His. As etiquetas são bem-conhecidas na técnica.

Um poiipeptídeo de fusão G1 pode ser criado por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, sinteticamente ou recombinantemente. Tipicamente, as proteínas de fusão G1 desta invenção são produzidas pela preparação de uma expressão de um polinucleotídeo que codifica as mesmas usando-se métodos recombinantes aqui descritos, embora elas possam também serem preparadas por outros meios conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, síntese química.

Esta invenção também proporciona composições compreendendo anticorpos ou polipeptídeos derivados de G1 conjugados (por exemplo, ligados) a um agente que faciljta acopjamento a um suporte sólido (tal como biotin ou avidin). Para simplicidade, referência será feita geralmente a G1 ou anticorpos com a compreensão que estes métodos se aplicam a quaisquer das concretizações de ligação de CGRP aqui descritas. A conjugação geralmente se refere a ligação destes componentes conforme descrito aqui. A ligação (que é geralmente fixação destes componentes em associação próxima pelo menos para administração) pode ser alcançada em qualquer número de modos. Por exemplo, uma reação direta entre um agente e um anticorpo é possível quando um possui um substituinte capaz de reagir com o outro. Por exemplo, um grupo nucleofílico, tal como um grupo amino ou sulfidrila, pode ser capaz de reagir com um grupo contendo carbonila, tal como um anidrido ou um ácido haleto, ou com um grupo alquila contendo um bom grupo de saída (por exemplo, um haleto) no outro.

Um anticorpo ou polipeptídeo desta invenção pode estar ligado a um agente de etiquetamento (alternativamente denominado etiqueta), tal como uma molécula fluorescente, uma molécula radioativa, ou quaisquer outras etiquetas conhecidas na técnica. As etiquetas são conhecidas na técnica que geralmente proporcionam (ou diretamente ou indiretamente) um sinal.

A invenção também proporciona composições (incluindo composições farmacêuticas) e kits compreendendo anticorpo G1, e, conforme esta descrição torna claro, qualquer ou todos os anticorpos e/ou polipeptídeos

aqui descritos.

A invenção também proporciona polinucleotídeos isolados que codificam os anticorpos e polipeptídeos da invenção (incluindo um anticorpo compreendendo as seqüências de polipeptídeo das regiões variáveis de ca5 deia leve e de cadeia pesada mostradas na Figura 5), e vetores e células hospedeiras compreendendo o polinucleotídeo.

Conseqüentemente, a invenção proporciona polinucleotídeos (ou composições, incluindo composições farmacêuticas), compreendendo polinucleotídeos que codificam qualquer dos seguintes: (a) anticorpo G1 ou su10 as variantes, mostrados na Tabela 6; (b) um fragmento ou uma região de anticofpo-Gl-0u_suas variantes, mostrados na Tabela 6; (c) uma cadeia leve de anticorpo G1 ou suas variantes, mostradas na Tabela 6; (d) uma cadeia pesada de anticorpo G1 ou suas variantes, mostrada na Tabela 6; (e) uma ou mais regiões variável(is) de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada de anticorpo G1 ou suas variantes, mostradas na Tabela 6; (f) um ou mais CDR(s) (uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs) de anticorpo G1, ou suas variantes, mostradas na Tabela 6; (g) CDR H3 a partir da cadeia pesada de anticorpo G1; (h) CDR L3 a partir da cadeia leve de anticorpo G1 ou suas variantes, mostradas na Tabela 6; (i) três CDRs a partir da cadeia leve de anticorpo G1 ou suas variantes, mostradas na Tabela 6; (j) três CDRs a partir da cadeia pesada de anticorpo G1 ou suas variantes, mostradas na Tabela 6; (k) três CDRs a partir da cadeia leve e três CDRs a partir da cadeia pesada de anticorpo G1 ou suas variantes, mostradas na Tabela 6; e (I) um anticorpo compreendendo qualquer um de (b) a (k). Em algumas concretiza25 ções, o polinucleotídeo compreende qualquer ou ambos dos polinucleotídeo(s) mostrados em SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10.

Em outro aspecto, a invenção proporciona polinucleotídeos que codificam qualquer dos anticorpos (incluindo fragmentos de anticorpo) e polipeptídeos aqui descritos, tais como anticorpos e polipeptídeos tendo função realizadora prejudicada. Os polinucleotídeos podem ser produzidos por procedimentos conhecidos na técnica.

Em outro aspecto, a invenção proporciona composições (tais ^CK ί

como composições farmacêuticas) compreendendo quaisquer dos polinucleotídeos da invenção. Em algumas concretizações, a composição compreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo G1 conforme descrito aqui. Em outra concretização, a composição compreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica qualquer dos anticorpos ou polipeptídeos aqui descritos. Em ainda outras concretizações, a composição compreende qualquer ou ambos dos polinucleotídeos mostrados em SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:10. Vetores de expressão, e administração de composição de polinucleotídeo são adicionalmente aqui descritos.

Ern outro aspecto, a invenção proporciona um método de produzir quaisquer dos polinucleotídeos aqui descritos.

Polinucleotídeos complementares a quaisquer de tais seqüências são também envolvidos peia presente invenção. Polinucleotídeos podem ser de trançado simples (codificação ou anti-sentido), ou de trançado duplo, e podem ser moléculas de DNA (genômicas, cDNA ou sintéticas), ou moléculas de RNA. As moléculas de RNA incluem moléculas de HnRNA, que contêm introns, e correspondem a uma molécula de DNA em uma maneira uma a uma, e moléculas de mRNA que não contêm introns. Seqüências de codificação ou não-codificação podem, mas não necessário, estar presentes dentro de um polinucleotídeo da presente invenção, e um polinucleotídeo pode, mas não necessário, estar ligado a outras moléculas e/ou materiais de suporte.

Os polinucleotídeos podem compreender uma seqüência nativa (isto é, uma seqüência endógena que codifica um anticorpo, ou uma porção deste), ou podem compreender uma variante de tal seqüência. As variantes do polinucleotídeo contêm uma ou mais substituições, adições, retiradas e/ou inserções, tal que a imunorreatividade do polipeptídeo codificado não é diminuída em relação a uma molécula imunorreativa nativa. O efeito na imunorreatividade do polipeptídeo codificado pode geralmente ser avaliado conforme descrito aqui. As variantes preferivelmente exibem pelo menos cerca de 70% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% de gi identidade, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade para uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um anticorpo nativo, ou uma porção deste.

Duas seqüências de polinucleotídeo ou polipeptídeo são referi5 das para serem ''idênticas se a seqüência de nucleotídeos ou aminoãcidos nas duas seqüências é a mesma quando alinhada para correspondência máxima conforme descrito abaixo. Comparações entre duas seqüências são tipicamente realizadas pela comparação das seqüências sobre uma janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade de seqüência, Uma janela de comparação conforme usado aqui, se refere a um segmento de pelo menos_cerca de 20 posições contíguas, usualmente 30 a cerca de 75, 40 a cerca de 50, em que uma seqüência pode ser comparada a uma seqüência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas seqüências serem otimamente alinhadas.

O alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode ser conduzido usando-se o programa Megaiign na no conjunto Lasergene de bioinformatics software (DNASTAR, Inc., Madison, Wl), usando-se parâmetros de omissão. Este programa concretiza vários esquemas de alinhamento descritos nas seguintes referências: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolu20 tionary change in proteínas - Matrices for detecting distant relationships. Em Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Hig25 gins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and MullerW., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principies and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and

Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.

Preferivelmente, a percentagem de identidade de seqüência é determinada pela comparação de duas seqüências otimamente alinhadas sobre uma janela de comparação de pelo menos 20 posições, no qual a porção da seqüência de polinucleotídeo ou polipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou retiradas (isto é, folgas) de 20 por cento ou menos, usualmente 5 a 15 por cento, ou 10 a 12 por cento, conforme comparado às seqüências de referência (que não compreendem adições ou retiradas) para alinhamento ótimo das duas seqüências. A percentagem é calculada pela determinação do número de posições no qual as bases de ácido nucléico idênticas ou resíduo de aminoácido ocorrem em ambas as seqüências para produzir o número de posições equiparadas, dividindo-se o número de posições equiparadas pelo número total de posições na seqüên_ cia de referência Xisto é, o tamanho da janela), e multiplicando-se os resultados por 100 para produzir a percentagem de identidade de seqüência.

As variantes podem também, ou alternativamente, serem substancialmente homólogas a um gene nativo, ou a uma porção ou complemento deste. Tais variantes de polinucleotídeo são capazes de hibridizarem sob condições moderadamente estríngentes a uma seqüência de DNA que ocorre naturalmente que codifica um anticorpo nativo (ou uma seqüência complementar).

Condições moderadamente estringentes adequadas incluem pré-lavagem em uma solução de 5 X SSC, 0,5% de SDS, 1,0 mM de EDTA (pH 8,0); hibridização a 50°C-65°C, 5 X SSC, durante toda noite; seguido por lavagem duas vezes a 65°C por 20 minutos com cada de 2X, 0,5X e 0,2X SSC contendo 0,1 % de SDS.

Conforme usado aqui, condições altamente estringentes ou condições de alta estringência são aquelas que: (1) empregam baixa resistência iônica e alta temperatura de lavagem, por exemplo, cloreto de sódio 0,015 M/citrato de sódio 0,0015M/0,1% de sulfato de dodecil sódio a 50°C; (2) empregam durante hibridização um agente de desnaturação, tal como formamida, por exemplo, 50% (v/v) de formamida com 0,1% de albumina de soro bovino/0,1% de Ficoll/0,1 % de polivinilpirrolidona/50mM de tampão de fosfato de sódio em pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42°C; ou (3) empregam 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl &

0,75M, citrato de sódio 0.075M), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 pg/ml), 0,1% de SDS, e 10% de dextrano sulfato a 42°C, com lavagens a 42°C em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/citrato de ódio) e 50% de formamida a 55°C, seguido por uma lavagem de alta estringência consistindo em 0,1 x SSC contendo EDTA a 55°C. O técnico no assunto reconhecerá como ajustar a temperatura, resistência iônica, etc., conforme necessário para acomodar fatores tais como comprimento de sonda e similares.

Será apreciado por aqueles versados na técnica que, como um resultado da degeneração do código genético, existem muitas seqüências de nucleotídeo que codificam um polipeptídeo conforme descrito aqui. Alguns destes polinucleotídeos suportam homologia mínima para a seqüência de nucleotídeo de qualquer gene nativo. Não obstante, os polinucleotídeos que variam devido às diferenças no uso de códon são especificamente contemplados pela presente invenção. Adicionalmente, os alelos dos genes compreendendo as seqüências de polinucleotídeos aqui estão dentro do escopo da presente invenção. Os alelos são genes endógenos que são alterados como um resultado de uma ou mais mutações, tais como retiradas, adições e/ou substituições de nucleotídeos. O mRNA resultante e proteína podem, mas não necessitam, terem uma estrutura ou função alterados. Os alelos podem ser identificados usando-se técnicas padrões (tais como hibridização, amplificação e/ou comparação de seqüência de base de dados).

Os polinucleotídeos desta invenção podem ser obtidos usandose síntese química, métodos recombinantes, ou PCR. Os métodos de síntese química de polinucleotídeo são bem-conhecidos na técnica, e não necessitam serem descritos em detalhes aqui. Um. versado na técnica pode usar as seqüências aqui providas e um sintetizador de DNA comercial para produzir uma seqüência de DNA desejada.

Para preparação de polinucleotídeos usando-se métodos recombinantes, um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência desejada pode ser inserido em um vetor adequado, e o vetor, por sua vez, pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para replicação e amplifi85 cação, conforme discutido adicíonalmente aqui. Os polinucleotídeos podem ser inseridos em células hospedeiras por quaisquer meios conhecidos na técnica. As células são transformadas pela introdução de um polinucleotídeo exógeno por levantamento direto, endocitose, transfecção, união-F ou eletroporação. Uma vez introduzido, o polinucleotídeo exógeno pode ser mantido dentro da célula como um vetor não-integrado (tal como um plasmídeo), ou integrado no genoma da célula hospedeira. O polinucleotídeo assim amplificado pode ser isolado a partir da célula hospedeira por métodos bemconhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook et al. (1989).

Alternativamente, PCR permite reprodução de seqüências de DNA. A__tecnologia de PCR é bem-conhecida na técnica, e é descrita nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 e 4.683.202, bem como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston (1994).

O RNA pode ser obtido peio uso do DNA isolado em um vetor apropriado, e inserindo-o em uma célula hospedeira adequada. Quando a célula replica e o DNA é transcrito em RNA, o RNA pode então ser isolado usando-se métodos bem-conhecidos àqueles técnicos no assunto, conforme colocado em Sambrook et al., (1989), por exemplo.

Vetores de clonagem adequados podem ser construídos de acordo com técnicas padrões, ou podem ser selecionados de um grande número de vetores de clonagem disponíveis na técnica. Enquanto o vetor de clonagem selecionado pode variar de acordo com a célula hospedeira pretendida para ser usada, vetores de clonagem úteis terão geralmente a capacidade de se auto-replicarem, podem possuir um atvo simples para uma endonuclease de restrição particular, e/ou podem transportar genes para um marcador que pode ser usado na seleção de clones contendo o vetor. Exemplos adequados incluem plasmídeos e vírus bacteriais, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, CoIEl, pCR1, RP4, DNAs de fagos, e vetores de curso de ida e volta, tais como pSA3 e pAT28. Estes e muitos outros vetores de clonagem são disponíveis a partir de vendedores comerciais tais como Bio86

Rad, Strategene, e Invitrogen.

Vetores de expressão geralmente são construções de polinucleotídeo replicáveis que contêm um polinucleotídeo de acordo com a invenção. É implicado que um vetor de expressão deve ser replicável nas células hos5 pedeiras, ou como epissomas, ou como uma parte integral do DNA cromossoma!. Vetores de expressão adequados incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos, vetores virais, incluindo adenovírus, vírus adeno-associados, retrovírus, cosmídeos, e vetor(es) de expressão descritos na Publicação PCT No. WO 87/04462. Os componentes do vetor podem geralmente incluir, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: uma seqüência de _ sinal; umaorigem de replicação; um ou mais genes marcadores; elementos de controle transcricional adequados (tais como promotores, intensificadores e terminador). Para expressão (isto é, translação), um ou mais elementos de controle transcricional são também usualmente requeridos, tais como, locais de ligação de ribossomo, locais de iniciação de translação, e códons de parada.

Os vetores contendo os polinucleotídeos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer de um número de meios apropriados, incluindo eletroporação, transfecção empregando cloreto de cál20 cio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, ou outras substâncias; bombardeio de microprojétil; lipofecção; e infecção (por exemplo, onde o vetor é um agente infeccioso, tal como vírus de vacina). A escolha de vetores de introdução ou polinucleotídeos freqüentemente dependerá das características da célula hospedeira.

A invenção também proporciona células hospedeiras compreendendo quaisquer dos polinucleotídeos descritos aqui. Quaisquer células hospedeiras capazes de sobreexpressarem DNAs heterólogos podem ser usadas para a proposta de isolar os genes que codificam o anticorpo, polipeptídeo ou proteína de interesse. Exemplos não-limitativos de células hos30 pedeiras de mamífero incluem, mas não estão limitados a, células COS, HeLa, e CHO. Vide também Publicação PCT No. WO 87/04462. Células hospedeiras não-mamíferas adequadas incluem procarióticas (tais como E. coli

ί ou B. subtillis) e levedura (tais como S. cerevisae, S. pombe; ou K. lactis). Preferivelmente, as células hospedeiras expressam os cDNAs em um nível de cerca de 5 vezes mais alto, mais preferivelmente 10 vezes mais alto, ainda mais preferivelmente 20 vezes mais alto do que do anticorpo endógeno correspondente ou proteína de interesse, se presentes, nas células hospedeiras. A classificação das células hospedeiras para uma ligação específica a Az 1-40 é efetuada por um imunoensaio ou FACS. A célula que sobreexpressa o anticorpo ou proteína de interesse pode ser identificada.

D, Composições

As composições usadas nos métodos da invenção compreen- dem uma_quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP, ou um polipeptídeo derivado de anticorpo antagonista anti-CGRP aqui descrito. Exemplos de tais composições, bem como de que modo formular, são também descritos em uma seção anterior e abaixo. Em uma concretização, a composição compreende adicionalmente um antagonista de CGRP. Em outra concretização, a composição compreende um ou mais anticorpos antagonistas de anti-CGRP. Em outras concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP reconhece CGRP humano. Em ainda outras concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP é humanizado. Em ainda outra concretiza20 ção, o anticorpo antagonista anti-CGRP compreende uma região constante que não dispara um resposta imune não-desejada ou indesejável, tal como lisis mediado por anticorpo ou ADCC. Em outras concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP compreende uma ou mais CDR(s) de anticorpo G1 (tais como uma, duas, três, quatro, cinco, ou, em algumas concretizações, todas as seis CDRs de G1). Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP é humano.

É compreendido que as composições podem compreender mais do que um anticorpo antagonista anti-CGRP (por exemplo, uma mistura de anticorpos antagonistas de anti-CGRP que reconhece epítopos diferentes de

CGRP). Outras composições exemplares compreendem mais do que um anticorpo antagonista de anti-CGRP que reconhece o(s) mesmo(s) epítopo(s), ou espécies diferentes de anticorpos antagonistas de anti-CGRP que

Η } ί

V se ligam a epítopos diferentes de CGRP.

A composição usada na presente invenção pode adicionalmente compreender veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes, ou estabilizadores (Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed.

(2ÜOO) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E, Hoover.), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos aceitáveis, excipientes, ou estabilizadores são não-tóxicos a recipientes nas dosagens e concentrações, e podem compreender tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conserto vantes (tais como, octadecildimetilbenzil cloreto de amônia; cloreto de hexametônium; cloreto de benzalcônium, cloreto de benzetônium; fenol ou álcool de butila ou benzila; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidone; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextranos; agentes quelantes tal como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contadores de íons de formação de sal, tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos nãoiônicos, tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG). Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são adicionalmente descritos aqui.

O anticorpo antagonista anti-CGRP e composições deste podem também serem usados em conjunto com outros agentes que servem para aumentar e/ou complementar a eficiência dos agentes,

E. Kits

A invenção também proporciona kits para uso nos presentes métodos. Os kits da invenção incluem um ou mais recipientes compreendendo um anticorpo antagonista anti-CGRP (tal como a anticorpo humanizado), ou polipeptídeo aqui descrito, e instruções para uso de acordo com qualquer dos métodos da invenção aqui descritos. Geralmente, estas instruções com89 preendem a descrição de administração do anticorpo antagonista anti-CGRP para tratar, melhorar ou prevenir dor de cabeça (tal como enxaqueca) de acordo com qualquer dos métodos aqui descritos. O kit pode adicionalmente compreender uma descrição de seleção de um indivíduo adequado para tra5 tamento baseado na Identificação se-este indivíduo tem dor de cabeça, ou se o indivíduo está em risco de ter dor de cabeça. Em ainda outras concretizações, as instruções compreendem uma descrição de administrar um anticorpo antagonista anti-CGRP a um indivíduo em risco de ter dor de cabeça (tal como enxaqueca).

Em algumas concretizações, o anticorpo é um anticorpo huma___nizado. Em algumas concretizações, o anticorpo é humano. Em outras concretizações, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma ou mais CDR(s) de anticorpo G1 (tais como uma, duas, três, quatro, cinco, ou, em algumas concretizações, todas as seis CDRs de G1).

As instruções relacionadas ao uso de um anticorpo antagonista anti-CGRP geralmente incluem informação como para dosagem, tabela de dosagem e rota de administração para o tratamento pretendido. Os recipientes podem ser doses de unidade, acondicionamentos de massa (por exem20 pio, acondicionamentos de multi-doses), ou doses de subunidade. As instruções fornecidas nos kits da invenção são tipicamente instruções escritas em uma etiqueta ou inserto de acondicionamento (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), mas instruções legíveis de máquina (por exemplo, instruções conduzidas em um disco de armazenagem magnético ou ótico) são também aceitáveis.

A etiqueta ou inserto de acondicionamento indica que a composição é usada para tratar, melhorar e/ou prevenir dor de cabeça (tal como enxaqueca). As instruções podem ser providas para praticar qualquer dos métodos aqui descritos.

Os kits desta invenção estão em acondicionamentos adequados.

Acondicionamentos adequados incluem, mas não estão limitados a, frascos, garrafas, jarros, acondicionamento flexível (por exemplo, sacos plásticos ve90 dados ou Mylar vedados), e similares. Também contemplados são acondicionamentos para uso em combinação com um dispositivo específico, tais como um inalador, dispositivo de administração nasal (por exemplo, um atomizador), ou um dispositivo de infusão, tal como uma minibomba. Um kit pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco tendo um obturador penetrável por uma agulha de injeção hipodérmica). O recipiente pode também ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco tendo um obturador penetrável por uma agu10 lha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é _______um anticorpo antagonista anti-CGRP. O recipiente pode adicionalmente compreender um segundo agente farmaceuticamente ativo.

Os kits podem opcionalmente proporcionar componentes adicionais, tais como tampões e informação interpretativa. Normalmente, o kit 15 compreende um recipiente e uma etiqueta ou inserto(s) de acondicionamento em ou associados com o recipiente.

Os seguintes Exemplos são providos para ilustrar, mas não para limitar a invenção.

Exemplos

Exemplo 1: Geração e caracterização de anticorpos monoclonais direcionados contra CGRP

Geração de anticorpos anti-CGRP. Para gerar anticorpos antiCGRP que têm reatividade de espécie cruzada para CGRP de rato e humano, camundongos foram imunizados com 25-100 pg de α-CGRP humano ou β-CGRP conjugado a KLH em adjuvante (50 pi por almofada de pé, 100 pl total por camundongo) em vários intervalos. A imunização foi geralmente realizada conforme descrito em Geerligs HJ et al., 1989, J. Immunol. Methods 124:95-102; Kenney JS et al., 1989, J. Immunol. Methods 121:157-166; e Wicher K et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89:128-135. Os camundongos foram primeiro imunizados com 50 pg de α-CGRP humano ou β-CGRP conjugado para KLH em CFA (adjuvante de Freund completo). Após 21 dias, os camundongos foram imunizados com 25 pg de β-CGRP hu91

mano (para camundongos primeiro imunizados com ct-CGRP humano), ou um α-CGRP (para camundongos primeiro imunizados com β-CGRP humano) conjugado para KLH em IFA (adjuvante de Freund incompleto). Vinte e três dias mais tarde após a segunda imunização, a terceira imunização foi realizada com 25 gg de α-CGRP de rato conjugado para KLH em IFA. Dez dias mais tarde, os títulos de anticorpo foram testados usando ELISA. A quarta imunização foi realizada com 25 gg do peptideo (α-CGRP-KLH de rato) em IFA 34 dias após a terceira imunização. Reforço final foi realizado com 100 gg de peptideo solúvel (α-CGRP de rato) 32 dias após a quarta i10 munização.

______Esplenócitos foram obtidos a partir do camundongo imunizado e fundidos com células de mieloma NSO a uma razão de 10:1, com polietileno glicol 1500. Os híbridos foram colocados em placas de 96 cavidades em DMEM contendo 20% de soro de cavalo e seleção de 215 oxaloacetato/piruvato/insulina (Sigma), e hipoxantina/aminopterin/timidina foi começada. No oitavo dia, 100 μΙ de DMEM contendo 20% de soro de cavalo foi adicionado a todas as cavidades. Os sobrenadantes dos híbridos foram classificados pelo uso de imunoensaio de captura de anticorpo. A determinação de classe de anticorpo foi feita com segundos anticorpos de classe específica.

Um painel de linhas de célula de produção de anticorpo monoclonal foi selecionado baseado na sua ligação ao CGRP de rato e humano para caracterização adicional. Estes anticorpos e características são mostrados abaixo nas Tabelas 2 e 3.

Purificação e preparação de fragmento Fab. Os anticorpos monoclonais selecionados para caracterização adicional foram purificados de sobrenadantes de culturas de hibridoma usando cromatografia de afinidade de proteína A. Os sobrenadantes foram equilibrados para 8. Os sobrenadantes foram, em seguida, carregados para a coluna de proteína A MabSelect (Amersham Biosciences número 17-5199-02) equilibrada com PBS para pH 8. A coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de PBS, pH 8. Os anticorpos foram eluídos com 50 mM de tampão citrato-fosfato, pH 3. Os anticorpos

C eluídos neutralizados com Tampão de Fosfato 1M, pH 8. Os anticorpos purificados foram dializados com PBS, pH 7,4. As concentrações de anticorpo foram determinadas por SDS-PAGE, usando-se a curva padrão de anticorpo monoclonal de murina.

Fabs foram preparados por proteólise de papaína dos anticorpos totais usando-se kit Immunopure Fab (Pierce número 44885), e purificados por fluxo através de cromatografia de proteína A seguindo instruções do fabricante. As concentrações foram determinadas por ELISA e/ou eletroforese de SDS-PAGE usando-se um Fab padrão de concentração conhecida (de10 terminada por análise de aminoácido), e por A280 usando 1OD=0,6 mg/ml (ou equivalente teórico baseado na seqüência de aminoácido).

Determinação das Afinidades de Fabs. As afinidades dos anticorpos monoclonais anti-CGRP foram determinadas em ou 25°C ou 37°C usando-se sistema de ressonância plasmon de superfície Biacore3000® (S15 PR) (Biacore, INC, Piscataway NJ) com tampão operando do próprio fabricante, HBS-EP (10 mM de HEPES, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005% v/v de pol isso rbato P20). A afinidade foi determinada por captura de peptídeos CGRP N-terminalmente biotinilatados (prática ordenada de GenScript Corporation, New Jersey or Global Peptídeo Services, Colorado), via streptavidin pré-imobilizada em chip AS, e medindo cinéticas de ligação de anticorpo Fab tituladas através da superfície de CGRP. O CGRP biotinilatado foi diluído em HBS-EP e injetado sobre o chip à uma concentração de menos do que 0,001 mg/ml. Usando-se tempo de fluxo variável através dos canais de chip do indivíduo, duas faixas de densidade de antígeno foram alcançadas: <50 de unidades de resposta (RU) para estudos cinéticos detalhados, e cerca de 800 RU para estudos de concentração e classificação. Diluições de duas a três séries tipicamente em giros de concentrações 1 μΜ - 0,1 nM (objetivado a 0,1-10x estimado K_D) de fragmentos de Fab purificados foram injetados por 1 minuto a 100 gLVmin, e tempos de dissociação de

10 minutos foram permitidos. Após cada ciclo de ligação, as surperfícies foram regeneradas com 25 mM de NaOH em 25% v/v de etanol, que foi tolerado sobre centenas de ciclos. Taxa de associação cinética (ko_n) e taxa de

V dissociação (k_Gi;) foram obtidas simultaneamente pelo ajuste dos dados para modelo de ligação Langmuir 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) usando-se o programa BIAevaluation. As constantes de dissociação de equilíbrio globais (K_D) ou afinidades foram calculadas a partir da razão K_D - koff/kon· As afinidades dos fragmentos de Fab de murina são mostradas nas Tabelas 2 e 3.

Mapeamento de epítopo dos anticorpos de murina anti-CGRP. Para determinar o epítopo que anticorpos anti-CGRP se ligam em a-CGRP humano, as afinidades de ligação dos fragmentos de Fab para vários fragmentos de CGRP foram medidas conforme descrito acima pela captura de fragmentos de CGRP N-terminalmente biotinilatados de 19-37 aminoácidos e 25-37 aminoácidos em um chip de sensor SA. A Figura 1 mostra suas afinidades de ligação medidas a 25°C. Conforme mostrado na Figura 1, todos os anticorpos, exceto o anticorpo 4901, se ligam a fragmentos de a-CGRP humano 19-37 e 25-37 com afinidade similar a sua afinidade de ligação de comprimento total de a-CGRP (1-37) humano. O anticorpo 4901 se liga a um fragmento de α-CGRP humano 25-37 com afinidade seis vezes inferior do que ligação a fragmento de α-CGRP humano de comprimento total, devido principalmente a uma perda na taxa externa. Os dados indicam que estes anticorpos anti-CGRP geralmente se ligam à extremidade C-terminal de CGRP.

O escaneamento de alanina foi realizado para caracterizar adícionalmente aminoácidos em α-CGRP humano envolvido na ligação de anticorpos anti-CGRP. Variantes diferentes de α-CGRP humano com substituições de alanina simples foram geradas por síntese de peptídeo. Suas seqüências de aminoácido são mostradas na Tabela 4 junto com todos os outros peptídeos usados na análise Biacore. As afinidades de fragmentos Fab dos anticorpos anti-CGRP para estas variantes foram determinadas usandose Biacore conforme descrito acima. Conforme mostrado na Figura 1, todos os 12 anticorpos que têm como alvo um epítopo de terminal-C, com aminoácido F37 sendo o resíduo mais crucial. A mutação de F37 para alanina abaixa significantemente a afinidade, ou mesmo elimina completamente ligação dos anticorpos anti-CGRP ao peptídeo. O próximo resíduo mais importante de aminoácido é G33; contudo, somente anticorpos de alta afinidade (7E9,

8B6, 10A8, e 7D11) foram afetados por substituição de alanina nesta posição. O resíduo de aminoácido S34 também desempenha um papel signifi5 cante, mas menor, na ligação destes quatro anticorpos de alta afinidade.

Tabela 2. Características da ligação de anticorpos monoclonais anti-CGRP a α-CGRP humano e sua atividade antagonista

Anti- corpos	KD para a-CGRP humano a 25°C XnM)__	KD para a-CGRP humano a 37°C __(nM)	Ligação de a-CGRP humano de bloqueio baseado em célula a seu receptor a 25°C .(medida por ativação de cAMP)	IC5o (locais de ligação nM) a 25°C (temp. ambiente) medidos em locais de ligação radioligantes.
7E9	1,0	0,9	Sim	2,5
8B6	1,1	1,2	Sim	4,0
10A8	2,1	3,0	Sim	n.d.
7D11	4,4	5,4	Sim	n.d.
6H2	9,3	42	Sim	12,9
4901	61	139	Sim	58
14E10	80	179	Sim	n.d.
9B8	85	183	Não	n.d.
13C2	94	379	Não	n.d.
14A9	148	581	Não	n.d.
6D5	210	647	Não	n.d.
1C5	296	652	Não	n.d.

Nota: Anticorpo 4901 é comercialmente disponível (Sigma, Product No. C7113).

n.d. = não determinado

Tabela 3. Características da ligação monoclonal de anticorpo anti-CGRP para α-CGRP de rato e atividade antagonista

Anticorpos	KD para aCGRPde rato a 37°C (nM)	Ligação de α-CGRP de rato de bloqueio baseado em célula a seu receptor a 25°C (medida por ativação dê cAMP)	Bloqueio in vivo no ensaio de nervo safe- noso
4901	3,4	Sim	Sim
7E9	47	Sim	Sim
6H2	54	Não	Não
8B6	75	Sim	Sim
7D11	218	Sim	Sim
10A8	451	Não	n.d.
9B8	876	Não	n.d.
14E10	922	Não	n.d.
13C2	> 1000	Não	n.d.
14A9	> 1000	Não	n.d.
6D5	> 1000	Não	n.d.
1C5	> 1000	Não	n.d.

n.d. indica que nenhum teste foi realizado para o anticorpo.

Tabela 4. Seqüência de aminoácidos de fragmentos de α-CGRP humano 5 (SEQ ID NOS:15-40) e peptídeos relacionados (SEQ ID NOS:41-47). Todos os peptídeos são C-terminalmente amidatados, exceto SEQ ID NOS:36-40.

Os resíduos em negrito indicam mutações de ponto.

CGRP	Seqüência de aminoácido	SEQ ID NO
1-37 (WT)	ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF	15
8-37	VTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF	16
19-37	SGGVVKNNFVPTNVGSKAF	17
P29A (19-37)	SGGVVKNNFVATNVGSKAF	18
K35A (19-37)	SGGVVKNNFVPTNVGSAAF	19
K35E (19-37)	SGGVVKNNFVPTNVGSEAF	20
K35M (19-37)	SGGVVKNNFVPTNVGSMAF	21
K35Q (19-37)	SGGVVKNNFVPTNVGSQAF	22
F37A (19-37)	SGGVVKNNFVPTNVGSKAA	23
25-38A	NNFVPTNVGSKAFA	24
25-37	NNFVPTNVGSKAF	25
F27A (25-37)	NNAVPTNVGSKAF	26

CGRP	Seqüência de aminoácido	SEG ID NO
V28A (25-37)	NNFAPTNVGSKAF	27
P29A (25-37)	NNFVATNVGSKAF	28
T30A (25-37)	NNFVPANVGSKAF	29
. N31A ¢25-37)	NNFVPTAVGSKAF	30
V32A (25-37)	NNFVPTNAGSKAF	31
G33A (25-37)	NNFVPTNVASKAF	32
S34A (25-37)	NNFVPTNVGAKAF	33
F37A (25-37)	NNFVPTNVGSKAA	34
26-37	NFVPTNVGSKAF	35
19-37-COOH	SGGVVKNNFVPTNVGSKAF	36
19-36-COOH	SGGWKNNFVPTNVGSKA	37
1-36-COOH	ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKA	38
V19-COOH —	ACDTATCVTHRLAGLLSRS — —	-39
1-13-COOH	ACDTATCVTHRLA	40
rat α (1-37)	SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSEAF	41
rato α (19-37)	SGGVVKDNFVPTNVGSEAF	42
humano β (1-37)	ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF	43
rato β (1-37)	SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSKAF	44
Humano calcitonina (1-32)	CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP	45
Humano amilina (1-37)	KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY	46
Humano adrenomedulin (1-52)	YRGSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDK DKDNVAPRSKISPQGY	47

Exemplo 2: Classificação de anticorpos antagonistas de anti-CGRP usando ensaios in vitro.

Anticorpos de murina anti-CGRP foram adicionalmente classificados para atividade antagonista in vitro usando ensaio de ativação de cAMP baseado em célula, e ensaio de ligação.

A atividade antagonista medida por ensaio de cAMP. Cinco microlitros de α-CGRP humano ou de rato (concentração final 50 nM) na presença ou ausência de um anticorpo anti-CGRP (concentração final 1-3000 nM), ou α-CGRP de rato ou α-CGRP humano (concentração final 0,1 nM-10 μΜ; como um controle positivo para ativação de c-AMP) foi dispensado em uma placa de 384 cavidades (Nunc, Cat. No. 264657). Dez microlitros de células (SK-N-MC humano se α-CGRP humano é usado, ou L6 de rato de

ATCC se α-CGRP de rato é usado) na estimulação de tampão (20 mM de HEPES, pH 7,4, 146 mM de NaCí, 5 mM de KCI, 1 mM de CaCÍ2, 1 mM de MgCb, θ 500 uM de 3-lsobutil-1-metilxantina(IBMX)) foram adicionados às cavidades da placa. A placa foi incubada à temperatura ambiente por 30 mi5 nutos.

Após a incubação, a ativação de cAMP foi realizada usando-se Ensaio de Complementação de Fragmento de Enzima xHitHunter® (Applied Biosystems) seguindo as instruções do fabricante. O ensaio é baseado em uma enzima β-galactosidase geneticamente projetada que consiste em dois fragmentos denominados Aceitante de Enzima (EA) e Doador de Enzima (ED). Quando os dois fragmentos são separados, a enzima é inativa. Quando os fragmentos estão juntos, eles podem recombinar espontaneamente para formar enzima ativa por um processo denominado complementação. A plataforma de ensaio EFC utiliza um peptídeo ED-cAMP conjugado no qual cAMP é reconhecido por anti-cAMP. Este fragmento de ED é capaz de reassociação com EA para formar enzima ativa. No ensaio, anticorpo anti-cAMP é otimamente titulado para se ligar a ED-cAMP conjugado e inibir formação de enzima. Níveis de cAMP em amostras de lisato de célula competem com ED-cAMP conjugado para ligação ao anticorpo anti-cAMP. A quantidade de

ED livre conjugado no ensaio é proporcional à concentração de cAMP. Portanto, cAMP é medido pela formação de enzima ativa que é quantificada pelo rodízio de substrato iuminescente de β-galactosidase. O ensaio de ativação de cAMP foi realizado pela adição de 10 μΙ de tampão lisis e anticorpo anti-cAMP (razão 1:1), seguido por incubação à temperatura ambiente por

60 minutos. Em seguida, 10 μΙ de reagente de ED-cAMP foi adicionado em cada cavidade, e incubado por 60 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, 20 μΙ de reagente de EA e mistura de CL (contendo o substrato) (razão 1:1) foi adicionado em cada cavidade, e incubado por 1-3 horas, ou durante toda noite à temperatura ambiente. A placa foi lida em 1 segun30 do/cavidade em instrumento PMT, ou 30 segundos/lugar na imagem. Os anticorpos que inibem ativação de cAMP por α-CGRP foram identificados (referidos como sim) nas Tabelas 2 e 3 acima. Os dados nas Tabelas 2 e 3 inί c

dicam que anticorpos que demonstram atividade antagonista no ensaio geralmente têm alta afinidade. Por exemplo, anticorpos tendo K_D (determinada a 25°C) de cerca de 80 nM ou menos para α-CGRP humano, ou tendo K_D (determinada a 37°C) de cerca de 47 nM ou menos para α-CGRP de rato, mostrara_m atividade antagonista neste ensaio.

Ensaio de ligação de radioligante. O ensaio de ligação foi realizado para medir o IC₅o de anticorpo anti-CGRP no bloqueio do CGRP de ligação ao receptor conforme descrito anteriormente. Zimmermann et al., Peptídeos 16:421-4, 1995; Mallee et al., J. Biol. Chem. 277:14294-8, 2002.

Membranas (25 pg) de células de SK-N-MC foram incubadas por 90 minutos à temperatura ambiente em tampão de incubação (50 mM de Tris-HCL, pH 7,4, 5 mM de MgCL₂, 0,1% de BSA) contendo 10 pM ¹²⁵l de α-CGRP humano em um volume total de 1 mL. Para determinar concentrações de inibição (IC₅o), anticorpos ou CGRP não-rotulados (como um controle), de cerca de solução de estoque 100 vezes mais alta, foram dissolvidos em concentrações variadas no tampão de incubação e incubados ao mesmo tempo com membranas e 10 pM ¹²⁵l de α-CGRP humano. A incubação foi terminada por filtração através de um filtro de microfibra de vidro (GF/B, 1pm) que foi bloqueado com 0,5% de polietilemimina. Curvas de resposta de dose foram plotadas e valores K, foram determinados pelo uso da equação: Kj = IC5o/(1+([llgante]/K_D); onde a constante de dissociação de equilíbrio K_D = 8 pM para α-CGRP humano para receptor de CGRP1 conforme presente em células de SK-N-MC, e B_max = 0,025 pmol/mg proteína. O valor de IC₅₀ reportado (em termos de moléculas de IgG) foi convertido em locais de ligação (pela multiplicação por 2), de modo que ele pode ser comparado com as afinidades (K_D) determinadas por Biacore (vide Tabela 2).

A Tabela 2 mostra o IC50 de anticorpos de murina 7E9, 8B6, 6H2 e 4901. Os dados indicam que a afinidade do anticorpo geralmente se correlaciona com IC50: anticorpos com afinidade mais alta (valores de K_D inferio30 res) têm IC50 inferior no ensaio de ligação de radioligante.

Exemplo 3: Efeito de anticorpos antagonistas de anti-CGRP na vasodilatação de pele induzida por estimulação de nervo safenoso de rato

Para testar atividade antagonista de anticorpos anti-CGRP, o efeito dos anticorpos na vasodilatação da pele por estimulação de nervo sa5 fenoso de ralo foi testado usando-se um modelo de rato descrito anteriormente. Escott et al., Br. J. Pharmacol. 110:772-776, 1993. Neste modelo de rato, estimulação elétrica de nervo safenoso induz liberação de CGRP das extremidades do nervo, resultando em um aumento no fluxo sanguíneo da pele. O fluxo sangüíneo na pele do pé de ratos machos Sprague Dwaley (170-300 g, de Charles River Hollister) foi medido após estimulação do nervo safenoso. Os ratos foram mantidos sob anestesia com 2% de isoflurano. Tosilato de bretílio (30 mg/kg, administrado i.v.) foi dado no começo do experimento para minimizar a vasoconstrição devido a estimulação concomitante de fibras simpatéticas do nervo safenoso. A temperatura do corpo foi manti15 da a 37°C pelo uso de uma sonda retal termostaticamente igante a uma almofada de aquecimento de temperatura controlada. Os compostos incluindo anticorpos, controle positivo (CGRP 8-37), e veículo (PBS, 0,01% de Tween 20) foram dados intravenosamente através da veia femoral direita, exceto para o experimento mostrado na Figura 3, o composto teste e o controle fo20 ram injetados através da veia final, e para os experimentos mostrados nas Figuras 2A e 2B, os anticorpos 4901 e 7D11 foram injetados intraperitonealmente (IP). Composto de controle positivo CGRP 8-37 (antagonista de vasodilatação), devido a sua meia-vida curta, foi dado 3-5 minutos antes da estimulação do nervo a 400 nmol/kg (200 μΙ). Tan et al., Clin. Sci. 89:656-73,

1995. Os anticorpos foram dados em doses diferentes (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, mg/kg, 10 mg/kg, e 25 mg/kg).

Para experimentos mostrados nas Figuras 2A e 2B, anticorpo 4901 (25 mg/kg), anticorpo 7D11 (25 mg/kg), ou controle de veículo (PBS com 0,01% de Tween 20) foram administrados intraperitonealmente (IP) 72 horas antes da estimulação de pulso elétrico. Para o experimento mostrado na Figura 3, anticorpo 4901 (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, ou 25 mg/kg), controle de veículo (PBS com 0,01% de Tween 20) foram administrados in100

travenosamente 24 horas antes da estimulação de puiso elétrico. Após administração dos anticorpos, ou controle de veículo, o nervo safenoso do membro direito foi exposto cirurgicamente, cortado proximalmente, e coberto com envoltório plástico para prevenir secagem. Uma sonda Doppler de laser foi colocada sobre o lado médio-dorsal na pele, que é a região inervada pelo nervo safenoso. O fluxo sanguíneo da pele, medido como fluxo de célula sangüínea, foi monitorado com um medidor de fluxo Doppler de laser. Quando um fluxo de linha de base estável (menos do que 5% de variação) foi estabelecido por pelo menos 5 minutos, o nervo foi colocado sobre eletrodos bipolares de platina, e eletricamente estimulado com 60 pulsos (2 Hz, 10 V, 1 ms, por 30 segundos) e então novamente 20 minutos mais tarde. Mudança cumulativa no fluxo sanguíneo da pele foi estimada pela área sob a curva de fluxo-tempo (AUC, que é igual a mudança no fluxo multiplicada pela mudança no tempo) para cada resposta de fluxo a estimulação de pulso elétrico. A média da resposta de fluxo sanguíneo às duas estimulações foi tomada. Os animais foram mantidos sob anestesia por um período de uma a três horas.

Conforme mostrado na Figura 2A e Figura 2B, o aumento do fluxo sanguíneo estimulado pela aplicação de pulsos eletrônicos no nervo safenoso foi inibido pela presença de CGRP 8-37 (400 nmol/kg, administra20 dos i.v.), anticorpo 4901 (25 mg/kg, administrados ip), ou anticorpo 7D11 (25 mg/kg, administrados ip), conforme comparado ao controle. CGRP 8-37 foi administrado 3-5 minutos antes da estimulação do nervo safenoso; e anticorpos foram administrados 72 horas antes da estimulação do nervo safenoso. Conforme mostrado na Figura 3, o aumento do fluxo sanguíneo estimu25 lado pela aplicação de pulsos eletrônicos no nervo safenoso foi inibido pela presença de anticorpo 4901 em doses diferentes (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, e 25 mg/kg) administradas intravenosamente em 24 horas antes da estimulação do nervo safenoso.

Para experimentos mostrados nas Figuras 4A e 4B, o nervo sa30 fenoso foi exposto cirurgicamente antes da administração de anticorpo. O nervo safenoso do membro direito foi exposto cirurgicamente, cortado proximalmente, e coberto com envoltório plástico para prevenir secagem. Uma

101

sonda Doppler de laser foi colocada sobre o lado médio-dorsal da pele, que está na região inervada pelo nervo safenoso. O fluxo sangüíneo da pele, medido como fluxo de célula sangüínea, foi monitorado com um medidor de fluxo Doppler de laser. Trinta a quarenta e cinco minutos após injeção de tosilato de bretílic. quando um fluxo de linha de base estável (menos do que 5% de variação) foi estabelecido por pelo menos 5 minutos, o nervo foi colocado sobre eletrooos bipolares de platina e eletricamente estimulados (2Hz, 10V, 1 ms, por 30 segundos), e novamente 20 minutos mais tarde. A média da resposta de fluxo sangüíneo a estas duas estimulações foi usada para estabelecer respoda de linha de base (tempo 0) à estimulação elétrica. Anticorpo 4901_(J mg/kg ou 10 mg/kg), anticorpo 7E9 (10 mg/kg), anticorpo 8B6 (10 mg/kg), ou veículo (PBS com 0,01% de Tween 20) foram então administrados intravenosamente (i.v.). O nervo foi subseqüentemente estimulado (2Hz, 10V, 1 ms, por 30 segundos) a 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos e

120 minutos após administração de anticorpo ou veículo. Os animais foram mantidos sob anestesia por um período de aproximadamente três horas. Mudança cumulativa no fluxo sangüíneo da pele foi estimada pela área sob a curva de fluxo-tempo (AUC, que é igual à mudança no fluxo multiplicada pela mudança no tempo) para cada resposta de fluxo para estimulações de pulso elétrico.

Conforme mostrado na Figura 4A, o aumento do fluxo sangüíneo estimulado pela aplicação de pulsos eletrônicos no nervo safenoso foi significantemente inibido pela presença de anticorpo 4901 1 mg/kg administrado i.v., quando estimulação de pulso eletrônico foi aplicada a 60 minutos, 90 minutos e 120 minutos após a administração do anticorpo, e aumento do fluxo sangüíneo estimulado pela aplicação de pulsos eletrônicos no nervo safenoso foi significantemente inibido pela presença de anticorpo 4901 10 mg/kg administrados i.v., quando estimulação de pulso eletrônico foi aplicada em 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos e 120 minutos após a administra30 ção de anticorpo. A Figura 4B mostra que aumento do fluxo sangüíneo mostra que o aumento do fluxo sangüíneo estimulado pela aplicação de pulsos eletrônicos no nervo safenoso foi significantemente inibido pela presença de

102 anticorpo 7E9 (10 mg/kg, administrados i.v.) quando estimulação de pulso eletrônico em 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos e 120 minutos após administração de anticorpo, e pela presença de anticorpo 8B6 (10 mg/kg, administrados i.v.) quando estimulação de pulo eletrônico foi aplicada em 30 mi5 nutos após administração de anticorpo.

Estes dados indicam que anticorpos 4901,7E9, 7D11, e 8B6 são eficazes no bloqueio da atividade de CGRP conforme medido por vasodilatação da pele induzida por estimulação do nervo safenoso de rato.

Exemplo 4. Caracterização de anticorpo G1 anti-CGRP e suas variantes

Seqüências de aminoácido para região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve de anticorpo Gl anti-CGRP são mostradas na Figura 5. Os seguintes métodos foram usados para expressão e caracterização de anticorpo G1 e suas variantes.

Vetor de expressão usado. A expressão do fragmento de Fab dos anticorpos estava sob controle de um promotor lacZ induzível IPTG similar àquele descrito em Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press pg 2.10. Vetor pComb3X); contudo, modificações incluem adição e expressão dos seguintes domínios adicionais: o domínio constante de cadeia leve Kappa humano e o domínio constante CH1 de imunoglobulina humana lgG2, região C de cadeia Ig gama-2, número de acesso de proteína P01859; Imunoglobulina kappa de cadeia leve (homosapiens), número de acesso de proteína CAA09181.

Preparação de Fab em pequena escala. De E. Coli transformada (ou usando células TG1 de eletroporação competente, ou células Top 10 quimicamente competentes) com uma biblioteca Fab, colônias simples foram usadas para inocular ambas uma placa principal (agar LB + carbemicilina (50 ug/mL) + 2% de glicose) e uma placa de operação (2 mL/cavidade, 96 cavidades/placa) onde cada cavidade continha 1,5mL LB + carbemicilina (50 ug/mL) + 2% de glicose. Uma vedação adesiva permeável à gás (ABgene, Surrey, UK) foi aplicada à placa. As placas foram incubadas a 30°C por 1216 horas; a placa de operação foi sacudida vigorosamente. A placa principal

103

foi armazenada a 4°C até necessário, enquanto as células a partir da placa de operação foram peletizadas (4000 rpm, 4°C, 20 minutos) e ressuspensas em 1,0 mL LB + carbemicilina (50 ug/mL) + 0,5 mM de IPTG para induzir expressão de Fabs por sacudimento vigoroso por 5 horas a 30°C. As células induzidas foram centrifugadas a 4000 rpm, 4°C por 20 minutos e xessuspensas em 0,6 mL de tampão de ΗΒ-SEP Biacore (10 mM de Hepes, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005% v/v de P20). Lisis de células ressuspensas de ΗΒ-SEP foi efetuada por congelamento (-80°C) e, em seguida, descongelamento a 37°C. Lisatos de célula foram centrifugados a 4000 rpm, 4°C por 1 hora para separar os resíduos a partir dos sobrenadantes contendo Fab_L que foram subseqüentemente filtrados (0,2 um) usando-se um Sistema de Ensaio Millipore MultiScreen de Placa de Filtração de 96 Cavidades e gabarito de vácuo. Biacore foi usado para analisar sobrenadantes filtrados pela injeção dos mesmos através dos CGRPs no chip de sensor. Os clones selecionados por afinidade que expressam Fabs foram resgatados a partir da placa principal, que proporcionou DNA de gabarito para PCR, seqüenciamento, e preparação de plasmídeo.

Preparação de Fab em grande escala. Para obter-se parâmetros cinéticos, Fabs foram expressos em uma escala maior conforme segue.

Frascos Erlenmeyer contendo 150 mL de LB + carbemicilina (50 ug/mL) + 2% de glicose foram inoculados com 1 mL de um iniciador de cultura durante a noite de um Fab de afinidade selecionada expressando clone de E. Coli. O restante da cultura iniciadora (~3 mL) foi usado para preparar DNA de plasmídeo (QIAprep mini-prep, kit Qiagen) para seqüenciamento e mani25 pulação adicional. A cultura maior foi incubada a 30°C com sacudimento vigoroso até que um OD₆oonm de 1,0 foi alcançado (tipicamente 12-16 horas). As células foram peletizadas por centrifugação a 4000 rpm, 4°C por 20 minutos, e ressuspensas em 150 mL LB + carbemicilina (50 ug/mL) + 0,5 mM de IPTG. Após 5 horas de expressão a 30°C, as células foram peletizadas por centrifugação a 4000 rpm, 4°C por 20 minutos, ressuspensas em 10 mL de tampão de HBS-EP Biacore, e lisadas usando-se um ciclo de congelamento simples (-80°C)/descongelamento (37°C). Os lisatos de célula foram pelota104

dos por centrifugação a 4000 rpm, 4°C por 1 hora, e o sobrenadante foi coletado e filtrado (0,2 um). Os sobrenadantes filtrados foram carregados em colunas de sefarose de superfluxo Ni-NTA (Qiagen, Valencia. CA) equilibradas com PBS, pH 8, em seguida lavados com 5 volumes de coluna de PBS, pH 8. Fabs individuais eluídos em frações diferentes com PBS (pH 8) + 300 mM de imidazol. As frações contendo Fabs foram reunidas e dializadas em PBS, em seguida quantificadas por ELISA antes da caracterização de afinidade.

Preparação de anticorpo total. Para expressão de anticorpos totais, regiões variáveis de cadeia pesada e leve foram clonadas em vetores de mamífero de expressão e transfectadas jjsando lipofectamina em células HEK 293 para expressão transiente. Os anticorpos foram purificados usando proteína A que usa métodos padrões.

Vetor pDb.CGRP.hFcGI é um vetor de expressão compreendendo a cadeia pesada do anticorpo G1, e é adequado para expressão transiente ou adequada da cadeia pesada. Vetor pDb.CGRP.hFcGI tem seqüências de nucleotídeo correspondentes às seguintes regiões: a região promotora de citomegaiovírus murina (nucleotídeos 7-612); um intron sintético (nucleotídeos 613-1679); a região de codificação DHFR (nucleotídeos 688-1253); peptídeo de sinal de hormônio de crescimento humano (nucleotídeos 18991976); região variável de cadeia pesada de G1 (nucleotídeos 1977-2621); região constante lgG2 de cadeia pesada humana contendo as seguintes mutações: A330P331 a S330S331 (numeração de aminoácido com referência à seqüência lgG2 tipo selvagem; vide Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624). Vetor pDb.CGRP.hFcGI foi depositado no ATCC em 15 de julho de 2005, e foi cedido o No. de Acesso ATCC PTA-6867.

Vetor pEb.CGRP.hKGI é um vetor de expressão compreendendo a cadeia leve do anticorpo G1, e é adequado para expressão da cadeia leve. Vetor pEb.CGRP.hKGI tem seqüências de nucleotídeo correspondentes às seguintes regiões: a região promotora de citomegaiovírus murina (nucleotídeos 2-613); intron EF-1 humano (nucleotídeos 614-1149); peptídeo de sinal de hormônio de crescimento (nucleotídeos 1160-1237); região variável

105

de cadeia leve de anticorpo G1 (nucleotídeos 1238-1558); região constante de cadeia kappa humana (nucleotídeos 1559-1882). Vetor pEb.CGRP.hKGI foi depositado no ATCC em 15 de julho de 2005, e foi cedido o No. de Acesso ATCC PTA-6866.

Ensaio Biacore para determinação de afinidade. As afinidades de anticorpo monoclonal G1 e suas variantes foram determinadas em ou 25°C ou 37°C usando-se o sistema de ressonância plasmon de superfície Biacore3000® (SPR) (Biacore, INC, Piscataway NJ). A afinidade foi determinada pela captura de CGRP N-terminalmente biotinilatado ou fragmentos, via streptavidin pré-imobilizada (chip de sensor SA), e medindo-se as cinéticas de ligação de fragmentos Fab de anticorpo G1, ou variantes tituladas através do CGRP ou fragmento no chip. Todos os ensaios Biacore foram conduzidos em tampão de operação de HBS-EP (10 mM de HEPES, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005% v/v de polissorbato P20). As su15 perfícies de CGRP foram preparadas por diluição do CGRP N-biotinilatado a uma concentração de menos do que 0,001 mg/mL em tampão de HBS-EP, e injetando-o através do chip de sensor SA usando-se tempos de contato variáveis. Superfícies de baixa capacidade, correspondentes a níveis de captura <50 de unidades de resposta (RU) foram usados para estudos cinéticos de alta resolução, onde superfícies de alta capacidade (cerca de 800 RU de CGRP capturados) foram usadas para estudo de concentração, classificação e determinações de afinidade de solução. Os dados cinéticos foram obtidos por diluição do anticorpo G1 Fab em série em incrementos de duas ou três vezes para concentrações girando 1uM-0.1nM (objetivadas em 0,1-10x Kp estimada). As amostras foram tipicamente injetadas por 1 minuto a 100 gL/min, e tempos de dissociação de pelo menos 10 minutos foram permitidos. Após cada ciclo de ligação, as superfícies foram regeneradas com 25mM de NaOH em 25% v/v de etanol, que foi tolerado sobre centenas de ciclos. Uma série de titulação total (tipicamente gerada em duplicata) foi glo30 balmente ajustada para um modelo de ligação de Langmuir de 1:1 usando o programa BIAevaluation. Este retornou um único par de constante de taxa cinética de associação e dissociação (respectivamente, ko_n e ko«) para cada

/.|Ç

106 interação de ligação, cuja razão deu a constante de dissociação de equilíbrio (K_D = kotAon)· As afinidades (valores de K_D) determinadas desse modo estão listadas nas Tabelas 6 e 7.

Análise de alta resolução de interações de ligação com taxas 5 extremamente lentas. Para interações com taxas extremamente lentas (em particular, ligação de anticorpo G1 Fab -CGRP humano no chip a 25°C), as afinidades foram obtidas em duas partes de experimento. O protocolo acima descrito foi usado com as seguintes modificações. A constante de taxa de associação (kon) foi determinada por injeção de uma série de titulação 2 ve10 zes (em duplicata) girando 550 nM-1 nM por 30 segundos a 100 uL/min, e permitindo somente uma fase de dissociação de 30 segundos. A constante de taxa de dissociação (k^) foi determinada por injeção de três concentrações (alta, média e baixa) da mesma série de titulação em duplicata por 30 segundos, e permitindo uma fase de dissociação de 2 horas. A afinidade (Kd) de cada interação foi obtida pela combinação dos valores de Κ>_η θ koff obtidos nos tipos de experimentos, conforme mostrado na Tabela 5.

Determinação da afinidade da solução por Biacore. A afinidade da solução de anticorpo G1 para Z-CGRP de rato e F37A (19-37) Z-CGRP humano foi medida por Biacore a 37°C. Uma superfície de chip de CGRP de alta capacidade foi usada (o Z-CGRP humano de alta afinidade foi escolhido para proposta de detecção) e tampão de operação HBS-EP foi escoado a 5 uIVmin. O fragmento Fab de anticorpo G1 a uma concentração constante de 5 nM (objetivado para estar em ou abaixo do K_D esperado da interação baseada na solução) foi pré-incubado com peptídeo de competição, ou z25 CGRP de rato ou F37A (19-37) z-CGRP humano, em concentrações finais girando 1 nM a 1 uM em diluições em série 3 vezes. As soluções Fab de anticorpo G1 na ausência ou presença de peptídeo de competição baseado na solução, foram injetadas através de CGRP no chip, e a depleção de respostas de ligação detectadas na superfície do chip como um resultado de com30 petição de solução foi monitorada. Estas respostas de ligação foram convertidas em concentrações de Fab livres usando-se uma curva de calibração, que foi construída pela titulação do anticorpo G1 Fab sozinho (5, 2,5, 1,25,

107

0,625, 0,325 e 0 nM) através do CGRP no chip. Concentrações de Fab livres foram plotadas contra a concentração de peptídeo baseado em solução de competição usada para gerar cada ponto de dado, e se ajustar a um modelo de afinidade de solução usando o software BIAevaluation. As afini5 dades de solução determinadas (tndiretamente) desse modo são mostradas nas Tabelas 5 e 7, e foram usadas para validarem as afinidades obtidas quando Fabs são injetados diretamente através de CGRPs biotinilatados em um chip de SA. O acordo fechado entre as afinidades determinadas por estes dois métodos confirma que amarrando-se uma versão N-biotinilatada do

CGRP ao chip não se altera sua atividade de ligação de solução nativa.

A Tabela 6 abaixo mosira as afinidades_de ligação de anticorpo

G1 a α-CGRP humano, β-CGRP humano, α-CGRP de rato e β-CGRP de rato, determinados por Biacore, pelo escoamento de fragmentos de Fab através de CGRPs N-biotinilatados em um chip de SA. Para melhor resolver as afinidades de interações de ligação com taxas extremamente lentas, as afinidades foram também determinadas em um experimento de duas partes para complementar esta orientação de ensaio, a afinidade da solução da interação de α-CGRP de rato foi também determinada (conforme descrito acima). O acordo fechado das afinidades medidas nas orientações de ensaio confirma que a afinidade de ligação do α-CGRP de rato nativo na solução não é alterada quando ele é N-biotinilatado, e se liga a um chip de SA.

Tabela 5. Afinidades de ligação de anticorpo G1 Fabs titulados através de CGRPs no chip

CGRP no chip	Temp. (°C)	k™ (1/Ms)	kotf (1/s)	KD (nM)
α-CGRP humano	25	1,86 x 105	7,80 x 10 ®	0,042 (7%, n=4)*
α-CGRP humano	37 ;	5,78 x 10s	3,63x10’5	0,063 (4%, n=2)*
β-CGRP humano	37	4,51 x 106	6,98 x 10'5	0,155
α-CGRP de rato	25	5,08 x 104	6,18 x 10'5	1,22(12%, n=2)‘
α-CGRP de rato	37	1,55 x 10s	3,99 x 104	2,57* (Solução KD=10 (50%, n=4)**
β-CGRP de rato	37	5,16x 106	7,85 x 10'5	0,152

Μ

108 * Afinidades para α-CGRPs (rato e ser humano) foram determinadas em experimento de duas partes de alta resolução, em que a fase de dissociação foi monitorada por 2 horas (os valores para ko_n, Μ, θ K_D representam a média de n experimentos replicados com o desvio padrão expresso como uma diferença de percentagem). As afinidades para β-CGRPs (rato e ser humano) foram determinadas pela análise global usando somente uma fase de dissociação de 20 minutos, que não foi precisa bastante para quantificar suas taxas extremamente (suas taxas são similarmente mais lentas do aqui citado e, portanto, suas afinidades são, do mesmo modo, ainda mais altas).

O anticorpo Gl Fab dissociado extremamente lento de todos os CGRPs (exceto α-CGRP de rato) com taxas que se aproximam do limite de resolução do ensaio de Biacore (especialmente a 25°C).

**Afinidade de solução determinada pela medição da depleção de repostas de ligação detectadas no CGRP no chip para anticorpo G1 Fab pré-incubado com competidor de α-CGRP de rato baseado na solução.

A Tabela 6 abaixo mostra anticorpos tendo a variação de seqüência de aminoácido conforme comparada a anticorpo G1 e suas afinidades para ambos α-CGRP de rato e α-CGRP humano. Todas as substituições de aminoácido das variantes mostradas na Tabela 6 são descritas em rela20 ção a seqüência de G1. As afinidades de ligação de fragmentos Fab foram determinadas por Biacore escoando-os através do CGRPs em um chip de SA.

•US

109 ^C

Tabela 6. Seqüência de aminoácidos e dados de afinidade de ligação para variantes¹ de anticorpo G1 determinadas a 37°C por Biacore.

O § Ξ ε s 2 O F σ

0,063

COI

3

0,43

0,20

0,83

1,52

0,58

0,06

o ε v Zi s= F o

in Ô X CO CO co'

ò X co r-

tí b Tí co'

Tf b cm'

IO b r— X LO CD CD

Ifi o X CM CM CO

-q- o X co ω

Μ- b X co cm'

m O X O CM b

m b T— X O o v—

o ? ω S rs ° σ

kl cm!

OOl ml

Sl

00

CO s

CD co' M-

o T— vo

~Ó c

o 3= σ

3,99x10“

co Ó X O

CO b X co cm'

9 O X o cm'

CO O X CM in

T o X LO CO r-G

7 O M- 00

'ί- Ο T— X 00 b

b X LO ’Μ’

d' c

HC-FW3

_J o o <

L99A A100R

L99A A100S

L99A A100V

L99A I A100Y , _I

Z CD CD

L99N A100C

L99N A100G

L99N A100Y

CM X

CM _l

Zj

Clone

δ

CM 2

co

2

LO Z>

CO

r-

00 2

CD 2

/8

110

Continuação

α-humano KD (nM)	00 o		0,63	1,16	0,06	0,10	1,03	CO	0,44
o -C CO £0 ü: E — 3 5= -C O • ν' D	1,73x10“*	ί- -b X co 00 ci	1,01x10“*	O X co 00	Lfi b V X O CD	m -b X 00 LO	o X m cq v—	'ί- Ο X LO co	7,03x10’5
11	83,9 i	co co~ co CM	107,8	102,2	•q c	63,9	55,3	114,4	67,8
a-rato koff (1/s)	σ> Ô X in	o b co cq	1,94x10'3	co O t— xr oo	Ό C	co b X LO	9,96x10“*	2,06x10'3 í	1,22x10'3 _:_i
HC-FW3	L99S A100S	! L99S A100T	L99S A100V	L99T A100G	L99T A100K	L99T A100P	L99T A100S	L99T A100V	L99V A100G
CM I
L2
Clone 1--—-	o	5	M12	co		LO s	, 911Λ1		00

Continuação

α-humano KD (nM)	0,06	LO CO o”	d	0,73	0,81	0,93	3	0,93	2,23	0,62
a-humano koff (1/s)	IO Ò o o	e Ò X CD CO	O X CM	't ο- χ CD	o X o cq	1,48x10'4	Tf ô		1,48x10'4	3,57x10’4	to _Ò X CD CD CD
j- a-rato KD (nM)	q c	' 80,0	CM ΙΌ t—	I 61,1		57,8	COI	co LO	189,4	69,4
a-rato koff (1/s)	q c	1,44x10‘3	Ύ O X m CD <b	« Ò X O	7,99x10'4	CT ó t— X 'V o	rt ò X q		o T— X CM CD	rt Ó T“ X Tt CO	ω o X LO CM
HC-FW3	L99V A100R	L99R A100L	L99S	L99T	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V
CM u-								A57G		E54R A57N
Zj		R28W	R28W	R28W	O CO CM cr	R28L	R28N	R28N	R28N T30A	R28N T30D
Clone	M19	M20	M21	CM CM 2	M23	M24	LO CM 2	M26	M27	M28

I

112

Continuação

α-humano KD (nM)	2,38	3,69	r- CM	1,69	4,69	4,04	2,12	1,49
a-humaho koff (1/s)	3,80x10	5,90x1 Ò'4	τΤ ò X xr CO	2,71x10’4	7,50x104	b X CD co”	Tf b X CD co CO	O ’χ 05 CO cm”
a-rato KD (nM)	199,4	354,4	200,6	164,4	512,2 ι	120,6	l\ CM CM	266,1
a-rato koff (1/s)	3,59x10'3	CO Ò 00 CO cd	CO Ò X £ cd	2,96x10'3 '	CO Ò X CM CM O)	CO b X Γ- cm”	CO b X 05 05 cd	CO O X o>
HC-FW3	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T | A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V
H2		E54K A57E	E54K A57G	E54K A57H	E54K A57N S58G	2 f— fr r- oo io ío m lu < ω	E54K A57S
CM _l
□	R28N T30G	R28N T30G	R28N T30G	R28N T30G	R28N T30G	R28N T30G	R28N T30G	R28N T30R
Clone	M29	M30	M31	M32	M33	M34 i	M35	M36

113 <L

Continuação

a-humano KD (nM)		1,36	2,66	8,00	1,31	2,61	1,64
o C tfl E D	2,26x10'4	Vt- -b X 00 CM	4,25x104	co -b X 00 CM	2,10x10 4	M- b X F- 'í	. b X co CD CM
a-rato KD (nM)	80,6	283,9	552,8	20000,0	251,7	417,8	251,7
a-rato koff (1/s)	CO O X m	9 O ΙΌ	co Ò Ίχ ΙΌ σ> σ>	0,36 !	co b co m Tf	9 o X CM m K	co b co m
HC-FW3	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T i A100V	L99T A100V	L99T A100V
CM I	A57G		Α57Ν S58Y	E54K ί A57L	E54K A57N E64D	E54K A57N H61F	z O 'M- r- co LO LO VO ω < ω
CM -J			G50A L56T	G50A L56T	G50A L56T	G50A L56T	G50A L56T
L	R28N T30S	R28N T30W	ζ 00 CM cc	z 00 CM CE	z 00 CM X	R28N	R28N
Clone	M37	M38	Μ39	M40	5	M42 .	M43

114

Continuação

a-humano KD (nM)	2,05		1,85		3,37	00 o cq	5,26
a-humano koff (1/s)	Tf o X o cm'		Tf b X cm'		Tf b X 05 CD LD	3,32x10’4	Tf o X CM Tt 00
a-rato KD (nM)	443	259	163,3	CM K LD	1905,6
a-rato koff (1/s)	TO Ô Zx CO CD		TO O r- X 00 ID LD		TO b X M- 05 CM	8,23x10'3 ' i	0,0343 !
HC-FW3	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V
H2	E54K A57N S58E	E54K A57N S58E E64D	2 LU LL N o° r; ID ID in co UJ < C0 X	E54K A57N S58G	E54K A57N S58L
CM	G50A L56T	G50A L56T	G50A L56T	G50A ' L56T	G50A L56T
Zj	R28N	z 00 CM cr	R28N	R28N	R28N
Clone	M44	M45	M46		5 2

115

Continuação

α-humano KD (nM)	3,72	2,54	0,82	I 1,76	2,34	cn
a-humano koff (1/s)	5,95x10“	4,06x10’4	1,31x10“	ό CO cú	'ί- Ο. X Γ- οο	C9 _o X cn Γ—
ο Σ 75 S Sg	822,2	294,4	65,6	127,2	CD O	120,0
a-rato koff (1/s)	0,0148	co Ó X O co LO	CO Ò X 00 T—	m Ô X cn 04 04	CO ô X S>	2,16x10'3 ! i I
HC-FW3	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V
04 X	Z > Ur- oo TLO lD w <o Lu < ω x	E54K A57R	E54K A57G	E54K A57N S58A |	E54K A57N S58G	E54K A57N S58P
04	G50A L56T i	G50A L56T	L56I	L56I j	CO in —I	G50A
L	z co 04 X	z 00 04 X	z 00 04 X	R28N l	R28N	R28N T30A
Clone	M49	M50	M51	M52	CO m	M54

116

Continuação

α-humano KD (nM)	2,99	2,99	3,08	12,19	3,28
a-humaho koff (1/s)	'j- ò V— X CO r- M7	4,79x10“	•Ί- Ο, X CM CM co’		CQ Ò X LO σ>	V g X C4 LO
a-rato KD (nM)	325,0	σ> LO	O O CM		n,d,	683,3
a-rato koff (1/s)	CQ Ò X LO co LO	CQ o X LO co CF>	M- O O ó		tò & o ICO Ε o φ ω	0,0123 1 1
HC-FW3	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V
CM I	E54K A57N S58E E64D	E54K A57N H61F	E54K A57N S58E	E54K A57N S58I H61F	E54K A57N S58N H61F
CM	L56S	L56S	L56S	L56S i	co CO ΰ
Lj	R28N T30A	R28N T30D	R28N T30D	R28N T30D	R28N T30D
Clone	M55	M56	M57	M58	M59

117

Continuação

α-humano ί KD (nM)	5,69	γ- οο of	5,86	00 00 cn	8,25	5,02	3,25
α-humano koff (1/s)	O X v— σ>	4,59x10'4 I	Ί- ο X Γ- ιο to'		CO b X o to	ra b X co	b X co O co	Ί- Ο X o OJ_ to
a-rato KD (nM)	LO	289,4	242	147,2 |	1300,0	226,1	283,9
a-rato koff (1/s)	0,0272	w b ^x 04 io	O X IS LO		o b X LO CO of	5 04 o *< o	4,07x10’3 I	- ! e.0W‘S
HC-FW3	L99T A100V	L99T A100V I	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V
H2	Y Z 1 LL U co to ιο io <£ LU < co X	E54Q A57N H61F	E54K A57N S58E	E54K A57N S58T	2 > τΐ- Γ- 00 LO LO to ω < ω	E54K A57C	E54K A57E
OJ _l	L56S	A51H	A51H L56T	G50A	< s o	G50A L56I	L56I
Σ5	R28N T30D	R28N T30G	R28N T30G	R28N T30G	R28N T30G	R28N T30G	R28N T30G
Clone	09ΙΛΙ	M61	M62	M63	M64	M65	M66

118

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Continuação

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119

Continuação

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α-humano koff (1/s)	5,97x10’4	m O X to	3,64x10'4	4,77x10'4	m Ò X cõ	co Ô X O) CM	co Ò Õ< O) O cm	4,90x10'4
a-rato ! KD (nM)	' 335,0 I	1038,9	I 64,4	794,4	9277,8	10555,6	5516,7	238,3
a-rato koff (1/s)	CO Ò X co O tO	CM O X Γ- ΟΟ	co Ò X to	0,0143	0,167	0,19	0,0993 , I	CO Ò X O) CM
HC-FW3	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T ί A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V
H2	E54K A57S	E54K A57V	A57G	E54K A57D	E54K A57N S58T	E54K A57P	E54K A57N S58V	E54K A57N S58E
CM _J	L56S	L56S	G50A L56T	< ΙΟ to to in O -i	G50A L56T	G50A L56T	L56l	L56S
Σϊ	R28N T30G	R28N T30G	R28N T30S	R28N T30S	R28N T30S	R28N T30S	R28N T30S	R28N T30S
Clone	M74	M75	9ΖΙΛΙ	r- r—	M78	6ΖΙΛΙ	08ΙΛΙ	M81

120

Continuação

o !i fe	00 in	5,83	6,75
a-humano koff (1/s)	ò X r- oo	9,33x104	CO © X 00 o
o 5 5 s	388,3	n,d, I i	, 977,8
a-rato koff (1/s)	to Ô X CD © to	Sem ligação	CM ô X (D
HC-FW3	L99T A100V	L99T A100V	L99T A100V
C\J X	A57N	E54K A57N S58M H61F	E54N A57N
L2 i—	A51H L56T	A51H L56T	A51H L56T
Zj	R28N T30V	R28N T30V	R28N T30V
Clone	M82	M83	M84

121

Todas as CDRs incluindo ambas CDRs de Kabat e de Chothia. Os resíduos de aminoácidos são numerados seqüencialmente (vide Figura 5). Todos os clones têm seqüências L3+H1+H3 idênticas a G1.

K_D = kotf/kon- Todos os valores de kow foram determinados em um 5 modo de classificação, exceto aqueles que são sublinhados, gue foram obtidos por análise global de uma série de concentração de Fab (G1 foi analisado em um modo de alta resolução). Os valores K_D sublinhados foram, portanto, determinados experimentalmente pela medição de ko_n. Outros valores de kon foram estimados como sendo o mesmo como M25.

n.d, = não determinado ________________________ Para determinar o epítopo em α-CGRP humano que é reconhecido pelo anticorpo G1, ensaios de Biacore descritos acima foram usados, aCGRP humano foi comprado como uma versão N-biotinilatada para capacitar sua captura de alta afinidade, via chips de sensor de SA. A ligação de fragmento Gt Fab ao α-CGRP humano no chip na ausência ou presença de um peptideo de CGRP foi determinada. Tipicamente, uma solução de 2000:1 mol de peptídeo/Fab (por exemplo, 10 uM de peptideo em 50nM G1 Fab) foi injetada através do α-CGRP humano no chip. A Figura 6 mostra a percentagem de ligação bloqueada por peptideo de competição. Os dados mostrados na Figura 6 indicam que os peptídeos que bloqueiam 100% de ligação de G1 Fab em α-CGRP humano são 1-37 (WT), 8-37, 26-37, P29A (19-37), K35A (19-37), K35E (19-37), e K35M (19-37) de α-CGRP humano; 1-37 de βCGRP (WT); 1-37 de α-CGRP de rato (WT); e 1-37 de β-CGRP de rato (WT). Todos estes peptídeos são amidados no terminal C. Peptídeos F37A (19-37) e 19-37 (o último não amidatado no terminal C) de α-CGRP humano também bloqueia cerca de 80% a 90% de ligação de G1 Fab a α-CGRP humano. Peptideo 1-36 (não amidatados no terminal C) de α-CGRP humano bloqueia cerca de 40% de ligação de G1 Fab a α-CGRP humano. Fragmento de peptideo 19-36 (amidatado no terminal C) de α-CGRP humano; fragmen30 tos de peptideo 1-13 e 1-19 de α-CGRP humano (nenhum dos quais são amidatados no terminal C); e amilina humana, calcitonina, e adrenomedulina (todas amídatadas no terminal C) não competem com ligação de G1 Fab a

122

α-CGRP humano no chip. Estes dados demonstram que G1 tem como alvo um epítopo de terminal C de CGRP, e que ambas a indentidade do resíduo mais terminal (F37) e sua amidação são importantes para ligação.

As afinidades de ligação de G1 Fab para variantes de a-CGRP 5 humano (a 37°C) foram também determinadas. A Tabela 7 abaixo mostra as afinidades conforme medidas diretamente por titulação de G1 Fab através de α-CGRP humano N-biotinilatado e variantes no chip. Os dados na Tabela 7 indicam que o anticorpo G1 se liga a um epítopo de terminal C com F37 e G33 sendo os resíduos mais importantes. G1 não se liga a CGRP quando um resíduo extra de aminoácido (alanina) é adicionado ao terminal C (que é amidatado).

Tabela 7. Afinidades de ligação de G1 Fab para α-CGRP humano e variantes medidos a 37°C (vide Tabela 4 para sua seqüência de aminoácidos)

CGRP no chip	kon (1/Ms)	koH (1/S)	KD (nM)
1-37 (WT)	4,68x105	7,63x10®	0,16 (Kd de alta resolução = 0,06)
19-37	4,60x105	7,30x10®	0,16
25-37	3,10x10®	8,80x10®	0,28
F27A (25-37)	3,25x10®	1,24x10'“	0,38
V28A (25-37)	3,32x10®	9,38x10'®	0,28
P29A (25-37)	2,26x10®	1,78x10'“	0,79
T30A (25-37)	1,79x10®	8,41x10'®	0,47
N31A(25-37)	2,17x10®	1,14x10'“	0,53
V32A (25-37)	2,02x10®	3,46x10“	171
G33A (25-37)	2,07x10®	0,0291	141
S34A (25-37)	2,51x10®	7,64x10“	3,04
K35A (19-37)	2,23x10®	2,97x10“	1,33
K35E (19-37)	5,95x10“	5,79x10'“	9,73
K35M (19-37)	2,63x10®	1,34x10'“	0,51
K35Q (19-37)	1,95x10®	2,70x10'“	1,38
F37A (25-37)	8,90x10“	8,48x10'3	95 (solução KD = 172 nM)
38A (25-38A)	-	-	Nenhuma ligação detectada

Os dados acima indicam que o epítopo que o anticorpo G1 se

123 liga está na extremidade do terminal C de α-CGRP humano, e aminoácidos 33 e 37 no α-CGRP humano são importantes para ligação do anticorpo G1. Também, a amidação do resíduo F37 é importante para ligação.

Exemplo 5: Efeito de anticorpo antagonista anti-CGRP G1 na vasodilatação de pele induzida por estimulação de nervo safenoso de rato

Para testar atividade antagonista de anticorpo G1 anti-CGRP, o efeito do anticorpo na vasodilatação da pele pela estimulação de nervo safenoso de rato foi testado usando um modelo de rato descrito no Exemplo 3. Brevemente, os ratos foram mantidos anestesiados com 2% de isoflurano.

Tosilato de bretílio (30 mg/kg, administrado i.v.) foi dado no começo do experimento para minimizar vasoconstrição devido a estimulação concomitante de fibras simpatéticas do nervo safenoso. A temperatura do corpo foi mantida a 37°C pelo uso de uma sonda retal termostaticamente igante a uma blanqueta de aquecimento de temperatura controlada. O nervo safenoso do membro direito foi exposto cirurgicamente, cortado proximalmente, e coberto com envoltório plástico para prevenir secagem. Uma sonda Doppler de laser foi colocada sobre o lado médio-dorsal da pele, que é a região inervada pelo nervo safenoso. O fluxo sangüíneo da pele, medido como fluxo de célula sangüínea, foi monitorado com um medidor de fluxo Doppler a laser. Nos experimentos para determinar os efeitos de anticorpo dentro de duas horas de injeção trinta a quarenta e cinco minutos após injeção de tosilato de bretílio, quando fluxo de linha de base adequado (menor do que 5% de variação) foi estabelecido para pelo menos 5 minutos, o nervo foi colocado sobre eletrodos bipolares de platina e eletricamente estimulado (2Hz, 10V, 1 ms, por

30 segundos), e novamente 20 minutos mais tarde. A média de resposta de fluxo de fluxo sangüíneo para estas duas estimulações foi usada para estabalecer a resposta de linha de base (tempo 0) para estimulação elétrica. Anticorpo G1 (1 mg/kg ou 10 mg/kg), ou veículo (PBS com 0,01% de Tween 20 de volume igual a 10 mg/kg G1) foram então administrados intravenosamen30 te (i.v.). O nervo foi subseqüentemente estimulado (2Hz, 10V, 1 ms, por 30 segundos) em 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, e 120 minutos após a administração de anticorpo. Os animais foram mantidos sob anestesia por

124

ν

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um período de aproximadamente três horas. A mudança cumulativa no fluxo sangüíneo da pele foi estimada pela área sob a curva fluxo-tempo (AUC, que é igual a mudança no fluxo multiplicada pela mudança no tempo) para cada resposta de fluxo para estimulações de pulsos elétricos.

Conforme mostrado na Figura 7, o aumento do fluxo sangüíneo estimulado por aplicação de pulsos eletrônicos no nervo safenoso foi significantemente inibido pela presença de anticorpo Gt em 1 mg/kg (administrado i.v.), conforme comparado ao veículo, quando o nervo safenoso foi eletricamente estimulado a 90 minutos após administração de anticorpo. O aumento de fluxo sangüíneo estimulado pela aplicação de pulsos eletrônicos no nervo safenoso foi significantemenle inibido pela presença de anticorpo G1 em 10 mg/kg (administrados i.v.), conforme comparado ao veículo, quando o nervo safenoso foi eletricamente estimulado a 90 minutos e 120 minutos após administração de anticorpo.

Nos experimentos para determinar os efeitos dos anticorpos em pontos de tempo mais longos no ensaio safenoso, ratos foram submetidos a i.v. com as doses indicadas de anticorpo 24 horas ou 7 dias antes da preparação do animal para estimulação do nervo safenoso conforme descrito acima. Nestes experimentos foi impossível estabelecer uma resposta de linha de base em ratos individuais para estimulação de pulso elétrico antes da dosagem, de modo que os grupos tratados foram comparados aos animais dosados com veículo (PBS, 0,01% de Tween 20) em 24 horas ou 7 dias.

Conforme mostrado nas Figuras 8A e 8B, o aumento do fluxo sangüíneo na pele dorso-medial evocado pela estimulação do nervo safeno25 so foi significantemente inibido nos grupos de animais dosados com ou 10 mg/kg ou 3 mg/kg G1 em ou 24 horas ou 7 dias antes da estimulação conforme comparado a grupos de veículo dosados nos mesmos pontos de tempo.

A Figura 8C representa uma análise de ajuste de curva aplicada aos dados de resposta de dose representados nas Figuras 8A e 8B para determinar a dose requerida para 50% de efeito máximo (EC₅₀). O EC₅₀ em 24 horas é 1,3 mg/kg, e o EC₅o em 7 dias é levemente inferior (0,8mg/kg).

125

Exemplo 6: Efeito agudo de anticorpo antagonista anti-CGRP G1 em um ensaio de artéria durai (janela cranial fechada)

Modelo de Janela Cranial Fechada: A proposta deste experimento foi determinar o efeito agudo de anticorpos antagonistas de anti-CGRP e 5 compará-lo com o efeito agudo do receptor antagonista de CGRP

BIBN4096BS. Os experimentos foram efetuados conforme anteriormente descrito (Williamson et al., Cephalalgia 17(4):518-24 (1997)) com as seguintes modificações. Ratos Sprague Dawley (300-400g) foram anestesiados com 70mg/kg i.p. de pentobarbital. A anestesia foi mantida com 20mg/kg/hr

i.v. de pentobarbital. Os ratos foram canulados através da veia jugular para distribuição de todos os fármacos. A pressão sangüínea foi monitorada com uma sonda (mikro-tip catheter, Millar Instruments) rosqueado através da artéria femoral na aorta abdominal. Os ratos foram traqueotomizados e a respiração do rato foi mantida a 75 respirações por minuto em um volume de 3,5 mL. Após fixação da cabeça em um instrumento estereotático e remoção do escalpe, uma janela de 2x6mm na área parietal esquerda imediatamente lateral à sutura sagital foi produzida pelo adelgaçamento do osso com uma broca dental. Usando-se um micromanipulador, um eletrodo bipolar de platina foi abaixado na superfície e coberto com óleo mineral pesado. Lateral à janela de eletrodo, outra janela de 5x6 mm foi criada e enchida com óleo mineral pesado através da qual o diâmetro de um ramo da artéria meningeal média (MMA) foi continuamente monitorado com uma câmara de CCD e um analisador de dimensão de vídeo (Living Systems). Os ratos foram repousados por não menos do que 45 minutos após a preparação. Uma resposta de linha de base a estimulação elétrica foi estabelecida (15 V, 10 hz, 0,5 ms pulsos, 30 segundos) e então os ratos foram dosados i.v. com composto experimental (10mg/kg mu7E9, 300Zg/kg BIBN4096BS ou PBS 0,01% de Tween 20). Estimulações elétricas adicionais foram feitas em 5 (BIBN4096BS), 30, 60, 90 e 120 minutos após dosagem. Todos os dados registrados usando-se software de mapa (ADInstruments).

Conforme mostrado na Figura 9, mu7E9 em 10mg/kg significantemente bloqueia dilatação de MMA evocada por estimulação de campo elé126

trico dentro de 60 minutos após dosagem, e mantém o efeito através de toda a duração do ensaio (120 minutos). Por comparação, BIBN4096BS bloqueia diíatação de MMA dentro de 5 minutos de dosagem, mas o efeito desapareceu completamente por 90 minutos. A grandeza do bloco é comparável entre

BIBN4096BS e mu7H9.

Exemplo 7: Efeito crônico de anticorpo antagonista anti-CGRP G1 em um ensaio de artéria durai (janela cranial fechada)

A proposta deste experimento foi determinar se o anticorpo anti

CGRP pode ainda bloquear eletricamente diíatação de MMA estimulada 7 dias após dosagem. A preparação dos ratos foi idêntica ao experimento a- - .gudo acima descrito (Exemplo 6) com as seguintes exceções. Os ratos foram injetados i.v. (10mg/kg, 3mg/kg ou 1mg/kg G1) 7 dias antes da criação da janela cranial fechada e estimulação. É impossível estabelecer uma resposta de diíatação de linha de base a estimulação elétrica antes da dosagem como no experimento agudo de modo que os grupos de anticorpos foram comparados a diíatação do MMA em grupo de controle dosado de veículo (PBS, 0,01% de Tween 20). Após os ratos serem permitidos repousar por pelo menos 45 minutos, a dura foi eletricamente estimulada em intervalos de 30 minutos. Estimulações foram em 2,5V, 5V, 10V, 15V e 20V, todos em

10hz, 0,5 ms pulsos por 30 segundos.

Conforme mostrado na Figura 10, G1 em 10 mg/kg e 3 mg/kg significantemente bloqueiam diíatação de MMA evocada por estimulação elétrica na faixa de 10 a 20 volts. Estes dados demonstram que G1 pode bloquear eletricamente diíatação de MMA estimulado até 7 dias após dosa25 gem.

Exemplo 8: Modelo de febre de retirada de morfina

O modelo de rato de retirada de morfina é um modelo de roedor estabelecido para mecanismos de febre menopausal (Sipe et al., Brain Res. 1028(2):191-202 (2004); Merchenthaler et al., Maturitas 30:307-316 (1998);

Katovich et al., Brain Res. 494:85-94 (1989); Simpkins et al., Life Sciences 32:1957-1966 (1983)). Basicamente os ratos são viciados em morfina pela implantação de péletes de morfina sob a pele. Após vício, os animais são

127 injetados com naioxona (antagonista opióide) que os envia na retirada imediatamente. Esta retirada é efetuada por um aumento de temperatura da pele, uma diminuição na temperatura de corpo de núcleo, um aumento na taxa de coração, e um aumento no hormônio de luteinização de soro. Estes são todos simtfares em grandeza e -regulação ao o que ocorre na febre humana (Simpkins et ak, Life Sciences 32:1957-1966 (1983)). Além disso, se ratos são tratados com estradiol antes da indução de retirada, os sintomas de febre são reduzidos (Merchenthaler et al., Maturitas 30:307-316 (1998)). Isto é porque o modelo de retirada de morfina é acreditado imitar febre clínica.

Ratos ovarioctomizados foram encomendados de Charles River

Laboratories. Não menos do que 7 jdias_pós ovarioçtomia, d_ependênçia de morfina foi criada pela implantação de um pélete de morfina (75 mg de base de morfina) subcutaneamente. Dois dias mais tarde, 2 mais péletes foram implantados. No dia seguinte os ratos foram injetados intravenosamente com ou 10 mg/kg 4901 [**] ou veículo (PBS, 0,01% de tween). Dois dias após a segunda peletização, os ratos foram anestetiziados com cetamina (90 mg/kg) e levemente restringidos. Um termoacoplador de temperatura de superfície foi colocado com fita à base da cauda e um termoacoplador retal é usado para medir a temperatura do núcleo. O dado foi registrado usando-se

Chart software (ADInstruments). Após registro de 15 minutos da temperatura de linha de base adequada, naioxona (1 mg/kg) foi injetada subcutaneamente. A temperatura foi registrada continuamente para os próximos 60 minutos. Os resultados são mostrados nas Figuras 11A e 11B.

É compreendido que os Exemplos e concretizações aqui descri25 tos são para proposta ilustrativa somente, e que várias modificações ou mudanças à luz destas serão sugeridas ao técnico no assunto, e são para serem incluídas dentro do espírito e campo de ação deste pedido. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados são desse modo incorporados por referência em sua totalidade para todas as propostas para a mesma extensão como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente fossem especificamente e individualmente para serem, desse modo, incorporados por referência.

iG

V

128

Depósito de Material Biológico

Os seguintes materiais foram depositados com a American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 201102209, USA (ATCC):

Material Anticorpo No. No. de Acesso Data de Depósito ATCC pDb.CGRP.hFcGI pEb.CGRP.hKGI cadeia pesada G1 cadeia leve G1

PTA-6867

PTA-6866 de julho de 2005 de julho de 2005

Vetor pEb.CGRP.hKGI é um polinucleotídeo que codifica a regi. ão variável de cadeia leve G_1 e a_região constante kappa de cadeia leve; e o vetor pDb.CGRP.hFcGI é um polinucleotídeo que codifica a região variável de cadeia pesada G1 e a região constante lgG2 de cadeia pesada contendo as seguintes mutações: A330P331 a S330S331 (numeração de aminoácido com referência à seqüência de lgG2 tipo selvagem; vide Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624).

Estes depósitos foram feitos sob as provisões do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para a Proposta de Procedimento de Patente e as Regulações (Tratado de

Budapeste). Isto assegura manutenção de uma cultura viável do depósito por 30 anos a partir da data de depósito. O depósito será feito disponível por ATCC sob os termos do Tratado de Budapeste, e submetido a um acordo entre Rinat Neuroscience Corp. e ATCC, que assegura disponibilidade permanente e irrestrita da progenia da cultura do depósito ao público após pu20 blicação da patente U.S. pertinente, ou sob liberação ao público de qualquer pedido de patente U.S. ou estrangeiro, qualquer que venha primeiro, e assegura disponibilidade da progenia a um determinado pelo Comissário de Patentes e Marcas dos Estados Unidos a ser intitulado de acordo com a 35 USC Seção 122 e as regras do Comissário (incluindo 37 CFR Seção 1.14 com referência particular a 886 OG 638).

O cessionário do presente pedido concorda que se uma cultura dos materiais no depósito morre ou é perdida ou destruída quando cultivada

Β ί

129 sob condições adequadas, os materiais serão prontamente substituídos na notificação com outro do mesmo. A disponibilidade do material depositado não é para ser construída como uma licença para praticar a invenção em contravenção dos direitos deferidos sob a autoridade de qualquer governo de acordo com suas leis de patente.

Seqüências de anticorpo

Região variável de cadeia pesada G1 de seqüência de aminoácido (SEQ ID

NO:1)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPG 10 KGLEWVAEIRSESDASATHYAEAVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDT

AVYYCLAYFDYGLAlQNYWGQGTLyTVSS^_______ __

Região variável de cadeia leve G1 de seqüência de aminoácido (SEQ ID

NO:2)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQA 15 PRLLIYGASNRYLGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYP

YTFGQGTKLEIK

G1 CDR H1 (CDR extendida) (SEQ ID NQ:3)

GFTFSNYWÍS

G1 CDR H2 (CDR extendida) (SEQ ID NO:4)

EIRSESDASATHYAEAVKG

G1 CDR H3ÍSEQ ID NO:5)

YFDYGLAIQNY G1 CDR L1 (SEQ ID NO:6)

KASKRVTTYVS 25 G1 CDR L2 (SEQ ID NO:7)

GASIMRYL

G1 CDR L3 (SEQ ID NO:8)

SQSYNYPYT

Região variável de cadeia pesada G1 de seqüência de nucleotídeo (SEQ ID

NQ:9)

GAAGTTCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCC

AGGTGGTTCCCTGCGTCTGTCCTGCGCTGCTTCCGGTTTCACCTTCTCC

130

AACTACTGGATCTCCTGGGTTCGTCAGGCTCCTGGTAAAGGTCTGGAAT

GGGTTGCTGAAATCCGTTCCGAATCCGACGCGTCCGCTACCCATTACG

CTGAAGCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCCCGTGACAACGCTAAGAA

CTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTT

TACTACTGCCTGGCTTACTTTGACTACGGTCTGGCTATCCAGAACTACT GGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCCTCC

Região variável de cadeia leve G1 de seqüência de nucleotídeo (SEQ ID

NOJO)

GAAATCGTTCTGACCCAGTCCCCGGCTACCCTGTCCCTGTC

CCCAGGTGAACGTGCTACCCTGTCCTGCAAAGCTTCCAAACGGGTTAC CACCTACGTTTCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGTCAGGCTCCTCGTCT GCTGATCTACGGTGCTTCCAACCGTTACCTCGGTATCCCAGCTCGTTTC TCCGGTTCCGGTTCCGGTACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGG AACCCGAAGACTTCGCTGTTTACTACTGCAGTCAGTCCTACAACTACCC

CTACACCTTCGGTCAGGGTACCAAACTGGAAATCAAA

Anticorpo de cadeia pesada total G1 de seqüência de aminoácido (incluindo lgG2 modificado conforme descrito aqui) (SEQ ID NO:11)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPG

KGLEWVAEIRSESDASATHYAEAVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDT

AVYYCLAYFDYGLAIQNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSEST AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPRE

PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK

Anticorpo de cadeia leve total G1 de seqüência de aminoácido (SEQ ID

NQ;12)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQA

PRLLIYGASNRYLGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYP YTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVG

131

WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT

HQGLSSPVTKSFNRGEC

Anticorpo de cadeia pesada total G1 de seqüência de nucleotídeo (incluindo lqG2 modificado conforme descrito aqui) (SEQ ID NO: 13)

GAAGTTCAGGTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCC

AGGTGGTTCCCTGCGTCTGTCCTGCGCTGCTTCCGGTTTCACCTTCTCC

AACTACTGGATCTCCTGGGTTCGTCAGGCTCCTGGTAAAGGTCTGGAAT

GGGTTGCTGAAATCCGTTCCGAATCCGACGCGTCCGCTACCCATTACG

CTGAAGCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCCCGTGACAACGCTAAGAA

CTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTT

----------TACTACTGCCJGGCTTACTTTGACTACGGTCTGGCTATCCAGAACTACT

GGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCCTCCGCCTCCACCAAGGGCC

CATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCA

CAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGA

CCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC CAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGA CCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAG ATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGT GTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCAT

CCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAG AACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCC AGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGC CAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGT GAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGT

ATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGA CCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCC TGCCCCCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCT GTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGT CCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCAÇÇCCTCCAATGCTGG

ACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTC

CAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGC

CCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAG

132

TAA

Anticorpo de cadeia leve total G1 de seqüência de nucleotídeo (SEQ ID

NO: 14)

GAAATCGTTCTGACCCAGTCCCCGGCTACCCTGTCCCTGTC 5 CCCAGGTGAACGTGCTACCCTGTCCTGCAAAGCTTCCAAACGGGTTAC

CACCTACGTTTCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGTCAGGCTCCTCGTCT

GCTGATCTACGGTGCTTCCAACCGTTACCTCGGTATCCCAGCTCGTTTC

TCCGGTTCCGGTTCCGGTACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGG

AACCCGAAGACTTCGCTGTTTACTACTGCAGTCAGTCCTACAACTACCC

CTACACCTTCGGTCAGGGTACCAAACTGGAAATCAAACGCACTGTGGCT GCAÇÇATCTGTCTTÇATCTTÇÇCTCÇATCTGATGAGÇAGTTGAAATCCG GAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCGCGCGAGGC CAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCA GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAG

CAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTA CGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAG CTTCAACCGCGGTGAGTGCTAA

Comparação de seqüência de aminoácido de CGRP humano e de rato (α-CGRP humano (SEQ ID NO:15); β-CGRP humano (SEQ ID

NO:43); α-CGRP de rato (SEQ ID NO:41); e β-CGRP de rato (SEQ ID

NO:44)):

nh₂-acÍtatcvthrl4Gllsrsggwk|nfvptnvgskafCONH₂ (α-CGRP humano) nh2-ac|tatcvthrlagllsrsggÍvkÍnfvptnvgskaf25 CONHz (β-CGRP humano) nh₂-1c8tatcvthrlagllsrsggwk1nfvptnvgs1afCONHs (α-CGRP rato) nh₂-|c|tatcvthrlagllsrsggvvk!nfvptnvgskafCONH₂ (β-CGRP rato)

133

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

-'HO'' Rinat Neuroscience Corp.

Zeller, Joerg

Poulsen, Krístian

Abdiche, Yasmin

Pons, Jauine

Sierra, Jones

Rosenthal, Arnon <120> ANTICORPOS ANTAGONISTAS DIRECIONADOS CONTRA PEPTÍDEO RELACIONADO

AO GENE DA CALCITONINA E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS <130> PC19499A <160> 47 <170>

<210>

<2ii>

<212>

<213>

<220>

<223>

<400>

Patentln versão 3.3

122

PRT

Listagem de Seqüência

Região variável da cadeia pesada do anticorpo humanizado

Glu

Vai

Gin

Leu

Vai

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Vai

Gin

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Asn

Tyr

20

25

30

Trp

Ile

Ser

Trp

Vai

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Vai

35

40

45

Ala

Glu

Ile

Arg

Ser

Glu

Ser

Asp

Ala

Ser

Ala

Thr

His

Tyr

Ala

Glu

50

55

60

Ala

Vai

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Ser

65

70

75

80

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Vai

Tyr

134

Tyr Cys Leu Ala Tyr Phe Asp Tyr Gly Leu Ala Ile Gin Asn Tyr Trp

100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser

115 120

<210>	2
<211>	107
<212>	PRT
<213>	Listagem de Seqüência
<220>
<223>	Região variável da cadeia leve do anticorpo	humanizado
<400>	2
Glu Ile	Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser	Pro Gly

10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Lys Arg Vai Thr Thr Tyr

25 30

Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile

40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Leu Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

70 75 80

Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr

90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210>	3
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Listagem de Seqüência
<220>
<223>	CDR H1 do anticorpo humanizado
<400>	3

JZÓ ί

135

Gly Phe	Thr	Phe	Ser	Asn	Tyr Trp Tle	Ser
1			5			10
<210>		4
<211>		19
<2Í2>		PRT
<213>		Listagem	de	Seqüência
<220>
<223>		CDR	H2 do anticorpo humanizado
<400>		4
Glu Ile	Arg	Ser	Glu	Ser	Asp Ala Ser	Ala	Thr
1			5			10
Vai Lys	Gly
<210>		5
<211>		11
<212>		PRT
<213>		Listagem	de	Seqüência
<220>
<223>		CDR	H3 do anticorpo humanizado
<400>		5
Tyr phe	Asp	Tyr	Gly	Leu	Ala Ile Gin	Asn	Tyr
1			5			10
<210>		6
<211>		11
<212>		PRT
<213>		Listagem	de	Seqüência

<220>

<223> CDR LI do anticorpo humanizado <400> 6

Lys Ala Ser Lys Arg Vai Thr Thr Tyr Vai Ser

5 <210> 7

136

V <211> 7 <212> PP.T <213> Listagem de Seqüência <220>

<223> CDR L2 do anticorpo humanizado <400> 7

Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Leu

5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Listagem de Seqüência <220>

<223> CDR L3 do anticorpo humanizado <400> 8

Ser Gin Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr Thr

5 <210> 9 <211> 366 <212> DNA <213> Listagem de Seqüência <220>

<223> Região variável da cadeia pesada do anticorpo humanizado <400> 9

gaagttcagc	tggttgaatc	cggtggtggt	ctggttcagc	caggtggttc	cctgcgtctg	60
tcctgcgctg	cttccggttt	caccttctcc	aactactgga	tctcctgggt	tcgtcaggct	120
cctggtaaag	gtctggaatg	ggttgctgaa	atccgttccg	aatccgacgc	gtccgctacc	180
cattacgctg	aagctgttaa	aggtcgtttc	accatctccc	gtgacaacgc	taagaactcc	240
ctgtacctgc	agatgaactc	cctgcgtgct	gaagacaccg	ctgtttacta	ctgcctggct	300
tactttgact	acggtctggc	tatccagaac	tactggggtc	agggtaccct	ggttaccgtt	360

366 tcctcc <210> 10

137 <211>

<212>

<213>

<220>

<223>

<400>

321

DNA

Listagem de Seqüência

Região variável da cadeia leve do anticorpo humanizado

gaaatcgttc	tgacccagtc	cccggctacc	ctgtccctgt	ccccaggtga	acgtgctacc	60
ctgtcctgca	aagcttccaa	acgggttacc	acctacgttt	cctggtacca	gcagaaaccc	120
ggtcaggctc	ctcgtctgct	gatctacggt	gcttccaacc	gttacctcgg	tatcccagct	180
cgtttctccg	gttccggttc	cggtaccgac	ttcaccctga	ccatctcctc	cctggaaccc	240
gaagacttcg	ctgtttacta	ctgcagtcag	tcctacaact	acccctacac	cttcggtcag	300
ggtaccaaac	tggaaatcaa	a			— ..	321

448

PRT

Listagem de Seqüência <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223> Cadeia pesada completa de um anticorpo humanizado <400> 11

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly

10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

25 30

Trp Ile Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai

40 45

Ala Glu Ile Arg Ser Glu Ser Asp Ala Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu

55 60

Ala Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

70 75 80

Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr

90 95

Tyr Cys Leu Ala Tyr Phe Asp Tyr Gly Leu Ala Ile Gin Asn Tyr Trp

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr

145 150 155 160

Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr

180 185 190

Vai ProSer Ser”Asn Phe”Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Vai Asp

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Thr Vai Glu Arg Lys Cys

210 215 220

Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly Pro Ser

225 230 235 240

Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Vai Vai

290 295 300

Ser Vai Leu Thr Vai Vai His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys

139

355 360 365

Leu Vai Lys	Gly	Phe	Tyr	Pro Ser 375	Asp	Ile	Ala Vai Glu Trp 380	Glu	Ser
	370
Asn	Gly Gin	Pro	Glu	Asn	Asn Tyr	Lys	Thr	Thr Pro Pro Met	Leu	Asp
385				390				395		400
Ser	Asp Gly	Ser	Phe	Phe	Leu Tyr	Ser	Lys	Leu Thr Vai Asp	Lys	Ser
			405				410		415
Arg	Trp Gin	Gin	Gly	Asn	Vai Phe	Ser	Cys	Ser Vai Met His	Glu	Ala
		420				425		430
Leu	His Asn	His	Tyr	Thr	Gin Lys	Ser	Leu	Ser Leu Ser Pro	Gly	Lys
	435				440			445
<210>	12			--·
<211>	214
<212>	PRT
<213>	Listagem de	Seqüência
<220>
<223>	Cadeia leve	completa	i de	um anticorpo humanizado
<400>	12
Glu	Ile Vai	Leu	Thr	Gin	Ser Pro	Ala	Thr	Leu Ser Leu Ser	Pro	Gly
1			5				10		15
Glu	Arg Ala	Thr	Leu	Ser	Cys Lys	Ala	Ser	Lys Arg Vai Thr	Thr	Tyr
		20				25		30
Vai	Ser Trp	Tyr	Gin	Gin	Lys Pro	Gly	Gin	Ala Pro Arg Leu	Leu	Ile
	35				40			45
Tyr	Gly Ala	Ser	Asn	Arg	Tyr Leu	Gly	Ile	Pro Ala Arg Phe	Ser	Gly
	50				55			60
Ser	Gly Ser	Gly	Thr	Asp	Phe Thr	Leu	Thr	Ile Ser Ser Leu	Glu	Pro
65				70				75		80
Glu	Asp Phe	Ala	Vai	Tyr	Tyr Cys	Ser	Gin	Ser Tyr Asn Tyr	Pro	Tyr
			85				90		95
Thr	Phe Gly	Gin	Gly	Thr	Lys Leu	Glu	Ile	Lys Arg Thr Vai	Ala	Ala

100 105 110

140 ΐ

Pro

Ser

Vai

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

115

120

125

Thr

Ala

Ser

Vai

Vai

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

130

135

140

Lys

Vai

Gin

Trp

Lys

Vai

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

145

150

155

160

Glu

Ser

Vai

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

165

170

175

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Vai

Tyr

180

185

190

Ala

Cys

Glu

Vai

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Vai

Thr

Lys

Ser

195

200

205

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210 <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

<400>

1347

DNA

Listagem de Seqüência

Cadeia pesada completa de um anticorpo humanizado

gaagttcagc	tggttgaatc	cggtggtggt	ctggttcagc	caggtggttc	cctgcgtctg	60
tcctgcgctg	cttccggttt	caccttctcc	aactactgga	tctcctgggt	tcgtcaggct	120
cctggtaaag	gtctggaatg	ggttgctgaa	atccgttccg	aatccgacgc	gtccgctacc	180
cattacgctg	aagctgttaa	aggtcgtttc	accatctccc	gtgacaacgc	taagaactcc	240
ctgtacctgc	agatgaactc	cctgcgtgct	gaagacaccg	ctgtttacta	ctgcctggct	300
tactttgact	acggtctggc	tatccagaac	tactggggtc	agggtaccct	ggttaccgtt	360
tcctccgcct	ccaccaaggg	cccatctgtc	ttcccactgg	ccccatgctc	ccgcagcacc	420
tccgagagca	cagccgccct	gggctgcctg	gtcaaggact	acttcccaga	acctgtgacc	480
gtgtcctgga	actctggcgc	tctgaccagc	ggcgtgcaca	ccttcccagc	tgtcctgcag	540
tcctcaggtc	tctactccct	cagcagcgtg	gtgaccgtgc	catccagcaa	cttcggcacc	600
cagacctaca	cctgcaacgt	agatcacaag	ccaagcaaca	ccaaggtcga	caagaccgtg	660

	141
	gagagaaagt	gttgtgtgga	gtgtccacct	tgtccagccc	ctccagtggc	cggaccatcc	720
	gtgttcctgt	tccctccaaa	gccaaaggac	accctgatga	tctccagaac	cccagaggtg	780
	acctgtgtgg	tggtggacgt	gtcccacgag	gacccagagg	tgcagttcaa	ctggtatgtg	840
	gacggagtgg	aggtgcacaa	cgccaagacc	aagccaagag	aggagcagtt	caactccacc	900
5	ttcagagtgg	tgagcgtgct	gaccgtggtg	caccaggact	ggctgaacgg	aaaggagtat	960
	aagtgtaagg	tgtccaacaa	gggactgcca	tccagcatcg	agaagaccat	ctccaagacc	1020
	aagggacagc	caagagagcc	acaggtgtat	accctgcccc	catccagaga	ggagatgacc	1080
	aagaaccagg	tgtccctgac	ctgtctggtg	aagggattct	atccatccga	catcgccgtg	1140
	gagtgggagt	ccaacggaca	gccagagaac	aactataaga	ccacccctcc	aatgctggac	1200
10	tccgacggat	ccttcttcct	gtattccaag	ctgaccgtgg	acaagtccag	atggcagcag	1260
	ggaaacgtgt	tctcttgttc	cgtgatgcac	gaggccctgc	acaaccacta	tacccagaag	1320
	agcctgtccc	tgtctccagg	aaagtaa				1347
	<210>	14
	<211>	645
15	<212>	DNA
	<213>	Listagem de Seqüência
	<220>
	<223>	Cadeia leve completa	de um anticorpo humanizado
	<400>	14
20	gaaatcgttc	tgacccagtc	cccggctacc	ctgtccctgt	ccccaggtga	acgtgctacc	60
	ctgtcctgca	aagcttccaa	acgggttacc	acctacgttt	cctggtacca	gcagaaaccc	120
	ggtcaggctc	ctcgtctgct	gatctacggt	gcttccaacc	gttacctcgg	tatcccagct	18Ό
	cgtttctccg	gttccggttc	cggtaccgac	ttcaccctga	ccatctcctc	cctggaaccc	240
	gaagacttcg	ctgtttacta	ctgcagtcag	tcctacaact	acccctacac	cttcggtcag	300
25	ggtaccaaac	tggaaatcaa	acgcactgtg	gctgcaccat	ctgtcttcat	cttccctcca	360
	tctgatgagc	agttgaaatc	cggaactgcc	tctgttgtgt	gcctgctgaa	taacttctat	420
	ccgcgcgagg	ccaaagtaca	gtggaaggtg	gataacgccc	tccaatccgg	taactcccag	480
	gagagtgtca	cagagcagga	cagcaaggac	agcacctaca	gcctcagcag	caccctgacc	540
	ctgagcaaag	cagactacga	gaaacacaaa	gtctacgcct	gcgaagtcac	ccatcagggc	600
30	ctgagttctc	cagtcacaaa	gagcttcaac	cgcggtçagt	gctaa		645
	<210>	15
	<211>	37

142 <212> PRT <213> humano <400> 15

Ala Cys

Asp

Thr Ala

Thr

Cys

Vai

Thr

His

Arg

Leu

Ala

Gly

Leu

Leu

5

1

5

10

15

Ser Arg

Ser

Gly Gly

Vai

Vai

Lys

Asn

Asn

Phe

Vai

Pro

Thr

Asn

Vai

20

25

30

Gly Ser

Lys

Ala Phe

35

10

<210>

16

<211>

30

<212>

PRT

<213>

humano

<400>

16

15

Vai Thr

His

Arg Leu

Ala

Gly

Leu

Leu

Ser

Arg

Ser

Gly

Gly

Vai

Vai

1

5

10

15

Lys Asn

Asn

Phe Vai

Pro

Thr

Asn

Vai

Gly

Ser

Lys

Ala

Phe

20

25

30

<210>

17

20

<211>

19

<212>

PRT

<213>

humano

<400>

17

Ser Gly

Gly

Vai Vai

Lys

Asn

Asn

Phe

Vai

Pro

Thr

Asn

Vai

Gly

Ser

25

1

5

10

15

Lys Ala Phe

	<210>	18
	<211>	19
30	<212>	PRT
	<213>	Listagem de Seqüência

<220>

143

<223>	variante de um fragmento de alfa-CGRP IR
<400> Ser Gly 1 Lys Ala	Gly Phe
Vai Vai Lys 5	Asn Asn Phe	Vai Ala Thr Asn Vai Gly	Ser
10	15
<210>		19
<211>		19
<212>		PRT
<213>		Listagem de	Seqüência
<220>
<22 3>		Fragmento, variante de alfa-	-CGRP humano
<400>		19
Ser Gly	θίγ	Vai Vai Lys	Asn Asn Phe	Vai	Pro Thr Asn Vai Gly	Ser
1		5		10	15
Ala Ala	Phe
<210>		20
<211>		19
<212>		PRT
<213>		Listagem de	Seqüência
<220>
<223>		Fragmento, variante de alfa-	'CGRP humano
<400>		20
Ser Gly	Gly	Vai Vai Lys	Asn Asn Phe	Vai	Pro Thr Asn Vai Gly	Ser
1		5		10	15

Glu Ala Phe <210> 21 <211> 19 <212> PRT <213> Listagem de Seqüência

144 <220>

<223> Fragmento, variante de alfa-CGRP humano <400> 21

Ser Gly Gly Vai Vai Lys Asn Asn Phe Vai Pro Thr Asn Vai Gly Ser

15

5	1 Met Ala	Phe	5
	<210>		22
	<211>		19
10	<212>		PRT
	<213>		Listagem de	Seqüência
	<22 0>		— .
	<223>		Fragmento, variante de
	<400>		22
15	Ser Gly	Gly	Vai Vai Lys	Asn Asn Ph<

Gin Ala Phe

	<210>	23
20	<211>		19
	<212>		PRT
	<213>		Listagem de	Seqüência
	<220>
	<223>		Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
25	<400>		23
	Ser Gly	Gly	Vai Vai Lys	Asn Asn Phe Vai Pro Thr Asn Vai	Gly Ser
	1		5	10	15
	Lys Ala	Ala
30	<210>		24
	<211>		14
	<212>		PRT

145

U <213> Listagem de Seqüência <22 0>

	<223>	Fragmento, variante de alfa-CGRP	humano
	<400>	24
5	Asn Asn Phe	Vai Pro Thr Asn Vai Gly Ser Lys	Ala Phe
	1	5 10
	<210>	25
	<211>	13
	<212>	PRT
10	<213>	Listagem de Seqüência
	<220>
	<223>	Fragmento de” alfa-CGRP humano	-
	<400>	25
	Asn Asn Phe	Vai Pro Thr Asn Vai Gly Ser Lys	Ala Phe
15	1	5 10
	<210>	26
	<211>	13
	<212>	PRT
	<213>	Listagem de Seqüência
20	<220>
	<223>	Fragmento, variante de alfa-CGRP	humano
	<400>	26
	Asn Asn Ala	Vai Pro Thr Asn Vai Gly Ser Lys	Ala Phe
	1	5 10
25	<210>	27
	<211>	13
	<212>	PRT
	<213>	Listagem de Seqüência
	<220>
30	<223>	Fragmento, variante de alfa-CGRP	humano

<400> 27

Asn Asn Phe Ala Pro Thr Asn Vai Gly Ser Lys Ala Phe

155 υ

146

i	3
<210>	28
<211>	13
<212>	PRT
<213>	Listagem de Seqüência
<220>

<223>	Fragmento, variante	de alfa-CGRP humano
<400>	28
Asn Asn	Phe Vai Ala Thr Asn Vai	Gly Ser Lys Ala Phe
1	5	10
<210>	29
<2Í1>	13
<212>	PRT
<213>	Listagem de Seqüência
<220>
<223>	Fragmento, variante	de alfa-CGRP humano
<400>	29
Asn Asn	Phe Vai Pro Ala Asn Vai	Gly Ser Lys Ala Phe
1	5	10
<210>	30
<211>	13
<212>	PRT
<213>	Listagem de Seqüência
<220>
<223>	Fragmento, variante	de alfa-CGRP humano
<400>	30
Asn Asn	Phe Vai Pro Thr Ala Vai	Gly Ser Lys Ala Phe

ι

	<210>	31
30	<211>	13
	<212>	PRT
	<213>	Listagem de Seqüência

147 <z2 0>

<223> Fragmento, variante de alfa-CGRP humano <400> 31

Asn Asn Phe Vai Pro Thr Asn Ala Gly Ser Lys Ala Phe

1 5 10

	<210>	32
	<211>	13
	<212>	PRT
	<213>	Listagem de Seqüência
10	<22Q>
	<223>	Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
-	<40Õ>	32
	Asn Asn	Phe Val Pro Thr Asn vai Ala Ser Lys Ala Phe
	1	5 10
15	<210>	33
	<211>	13
	<212>	PRT
	<213>	Listagem de Seqüência
	<220>
20	<223>	Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
	<400>	33
	Asn Asn	Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ala Lys Ala Phe
	1	5 10
	<210>	34
25	<211>	13
	<212>	PRT
	<213>	Listagem de Seqüência
	<220>
	<223>	Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
30	<400>	34
	Asn Asn	Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Ala

148

ί.

	<210>	3 5
	<211>	12
	<212>	PRT
	<213>	Listagem de Seqüência
5	<220>
	<223>	Fragmento de aifa-CGRP humano
	<400>	35
	Asn Phe	Vai Pro Thr Asn Vai Gly Ser Lys Ala
	1	5 10
10	<210>	36
	<211>	19
	<212>	PRT
	<213>	Listagem de Seqüência
	<220>
15	<223>	Fragmento de alfa-CGRP humano
	<400>	36
	Ser Gly	Gly Vai Vai Lys Asn Asn Phe Vai Pro
	1	5 10
	Lys Ala	Phe
20
	<210>	37
	<211>	18
	<212>	PRT
	<213>	Listagem de Seqüência
25	<220>
	<223>	Fragmento de alfa-CGRP humano
	<400>	37
	Ser Gly	Gly Vai Vai Lys Asn Asn Phe Vai Pro
	1	5 10
30	Lys Ala
	<210>	38

Phe

Thr Asn Vai Gly Ser

Thr Asn Vai Gly Ser

149

<211>	36
<212>	PRT
<2 13>	Listagem de	Seqüência
<220>
<223>	Fragmento de	alfa-CGRP humano
<400>	38
Ala Cys	Asp Thr Ala Thr	Cys Vai Thr His Arg

10 15

Ser Arg Ser Gly Gly Vai Vai Lys Asn Asn Phe Vai Pro Thr Asn Vai 10 20 25 30

Gly Ser Lys Ala

5 ’

	<210>	39
	<211>	19
15	<212>	PRT
	<213>	Listagem de Seqüência
	<220>
	<223>	Fragmento de alfa-CGRP humano
	<400>	39
20	Ala Cys	Asp Thr Ala Thr Cys Vai Thr His Arg
	1	5 10
	Ser Arg	Ser
	<210>	40
25	<211>	13
	<212>	PRT
	<213>	Listagem de Seqüência

Leu Ala Gly

Leu Leu <220>

<223> Fragmento de alfa-CGRP humano <400> 40

Ala Cys Asp Thr Ala Thr Cys Vai Thr His Arg Leu Ala

150 <210>

<211>

<212>

<2±3>

<400>

PRT

Rac

Ser Cys

Asn

Thr

Ala

Thr

Cys

Vai

Thr

His

Arg

Leu

Ala

Gly

Leu

Leu

1

5

10

15

Ser Arg

Ser

Gly

Gly Vai

Vai

Lys

Asp

Asn

Phe

Vai

Pro

Thr

Asn

Vai

20

25

30

Gly Ser

Glu

Ala

Phe

35

<210>

42

<211>

19

<212>

PRT

<213>

Listagem de

Seqüência

<220>

<223>

Fragmento de alfa-CGRP rato

<400>

42

Ser Gly

Gly

Vai

Vai

Lys

Asp

Asn

Phe

Vai

Pro

Thr

Asn

Vai

Gly

Ser

1

5

10

15

Glu Ala

Phe

<210>

43

<211>

37

<212>

PRT

<213>

Humano

<400>

43

Ala Cys

Asn

Thr

Ala

Thr

Cys

Vai

Thr

His

Arg

Leu

Ala

Gly

Leu

Leu

1

5

10

15

Ser Arg

Ser

Gly

Gly

Met

Vai

Lys

Ser

Asn

Phe

Vai

Pro

Thr

Asn

Vai

Gly Ser Lys Ala Phe

151 <210> 44 <211> 37 <212> PRT <213> Rat <400> 44

Ser Cys 1 Ser Arg

Asn Ser

Thr Ala

Thr Vai

Cys Vai

Thr His

Arg Phe

Leu Ala Gly

Leu 15 Asn

Leu Vai

Gly

5 Gly

Vai

Lys

Asp

10 Asn

Vai

Pro

Thr

10

20

25

30

Gly Ser

Lys

Ala

Phe

35

<210>

45

<211>

32

15

<212>

PRT

<213>

Humano

<400>

45

Cys Gly

Asn

Leu

Ser

Thr

Cys

Met

Leu

Gly

Thr

Tyr

Thr

Gin

Asp

Phe

1

5

10

15

20

Asn Lys

Phe

His

Thr

Phe

Pro

Gin

Thr

Ala

Ile

Gly

Vai

Gly

Ala

Pro

20

25

30

<210>

46

<211>

37

<212>

PRT

25

<213>

Humano

<400>

46

Lys Cys

Asn

Thr

Ala

Thr

Cys

Ala

Thr

Gin

Arg

Leu

Ala

Asn

Phe

Leu

1

5

10

15

Vai His

Ser

Ser

Asn

Asn

Phe

Gly

Ala

Ile

Leu

Ser

Ser

Thr

Asn

Vai

30

20

25

30

Gly Ser Asn Thr Tyr

152 í

<212> PRT <213 > Humano <400> 47

Tyr Arg Gin Ser Met Asn Asn Phe Gin Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys

10 15

Arg Phe Gly Thr Cys Thr Vai Gin Lys Leu Ala His Gin Ile Tyr Gin

25 30

Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Vai Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser 35 40 45

Pro Gin Gly Tyr

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES

1 mg/kg (N=6) » Veh(N=8)

1-19-COOH amylin calcitonin adrenomedullin

Peptídeos de Competição

1-1-3*COOH

1-37 β-rat (WT)

1-37 α-rat (WT)

1-37 β-humano (WT)

1-37 (WT) F37A 19-37* 1-36* 19-36

1 5 10 15 20 25 30 E I V L T Q s P A T L S L s P G E R A T L S C K A s K R V T 31 35 40 45 50 L2 55 60 T Y V s w Y G Q K P G Q A P R L L I Y G A S N R Y L G I P A 61 65 70 75 80 85 90 R F S G s G s G T D F T L T I S S L E P E D F A V Y Y c 91 L3 95 100 105 107 S Y N Y P Y T F G Q G T K L E I K

1 5 10 15 20 25 30 E V Q L V E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A s G F T F S Ί 1 - m Ϊ5 “5Ü - 55 H2 6Õ“ N Y W I s W V R Q A P G K G L E W V A E I R S E s D A s A T

61 65 70 75 80 85 90 H Y A E A V K G R F TISRDNAK N S L Y L Q Μ N S L R A H3 91 95 ICC ' 105 110 115 120 E D Τ A V Y Y C L A YFDYGLAI Q N Y W G Q G T L V Τ V

121 122 s s

Cadeia leve G1

LI

1/16

FIG 1

0© 00 00 t-ζ 00 00 0© © © © © © © © §

.K *Ci 0O o o ©

-H •M<3

-H

M©

-H yj©

-H

-H mc ©

> 'T, Ι'Ί

tx çS 1 1 o C^ Ή Oo CM -H 4? -H t< -tí Ό oc ©; SO ^c V t\ C o ^4 ^c

£

B ÍS cn a°2

-H ic

OO CM Tj-Ή 'T

CM

1. Anticorpo humanizado, caracterizado pelo fato de que tem uma afinidade de ligação (KD) para α-CGRP humano de 50 nM, ou menos, conforme medida por ressonância de plasmônio de superfície a 37°C e que compreende as seguintes regiões determinantes de complementariedade (CDRs):

a. CDR H1 conforme SEQ ID NO: 3;

b. CDR H2 conforme SEQ ID NO: 4;

c. CDR H3 conforme SEQ ID NO: 5;

d. CDR L1 conforme SEQ ID NO: 6;

e. CDR L2 conforme SEQ ID NO: 7; e

f. CDR L3 conforme SEQ ID NO: 8.

2/16

FIG2A

AUC

Ο í

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio V_H do anticorpo humanizado tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

3/16

FIG2B

AUO

1200001

IIOQOff

9000080000*

70000*

60000*

50000*

40000*

30000*

20000*

10000*

0^J

i

NoAb

7D11

25mg/kg IP

4901

25mg/kg IP

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido na posição 99 da SEQ ID NO: 1 é L, ou é substituído por A, N, S, T, V ou R, e em que o resíduo de aminoácido na posição 100 da SEQ ID NO: 1 é A, ou é substituído por L, R, S, V, Y, C, G, T, K ou P.

4/16

FIG 3

AUC

04 LO ^-1 CM o cc CM V) t- / 44 cc CM T™4 -H -H -H i -n íSTí -H 41 •Ή 4i O> r~- cc © CM O \C o CM wc © r- OO 04 CM CM

/—s H s ?

B 4 © Γ~- VD r~~ Cq a kj CC t © 1—^ ^—1 X cc b © st- *4 00 *4 © © X CM Tt © o r- OO © CM © 00 CM © Λ © LO < w* CM © a 00 u < Ki « a 03 © Q E © 't Ά 4 O U. r- 00 r- o Tf © ©

©

4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio V_L do anticorpo humanizado tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

5/16

FIG4A

Percentagem

Tempo pós-injeção (minuto)

5 15. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo antagonista anti-CGRP humanizado é produzido através de vetores de expressão com N°s de Acesso ATCC PTA-6867 e PTA-6866.

Petição 870170077694, de 11/10/2017, pág. 12/17 )/4 í

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio VH do anticorpo humanizado tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, e o domínio VL do anticorpo humanizado tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

6/16

FIG 4B

E

Φ

O)

TO

C

Φ í£ φ

0_

Tempo pós-injeção (minuto)

6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é uma molécula de IgG, uma molécula de IgM, uma molécula de IgE, uma molécula de IgA, ou uma molécula de IgD, ou é derivado destas.

7/16

FIG 5

Negrito = CDR de Kabat

Sublinhado = CDR de Chothia

Cadeia pesada G1

7. Anticorpo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo

8-37 (19 37) COOH COOH CONH₂

26-37

P29A (19-37)

K35A (19-37)

K35E (19-37)

K35M (19-37)

8/16 c^r

FIG 7 % c)e Ligação bloqueada

100.0

0.0

8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve produzida pelo vetor de expressão com N° de Acesso ATCC PTA-6866.

9/16

FIG 7 ^BG1 10 mg/kg OBG1 ling/kg _ CD PBS 0.01%tween

Tempo pós-injeção (minuto)

9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem uma afinidade de ligação (K_D) para α-CGRP humano de 1 nM, ou menos, conforme medida por ressonância de plasmônio de superfície a 37°C.

10 15

Voltagem Stim

10/16

30000

AUC

FIG 8A

Ensaio Safenoso 1-dia

20000

10000

Veh 1 mg/kg 3mg/kg 10mg/kg

N=31 N=15

N=16

N=5 p<0.05 p<0.01

10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido na reivindicação 1, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

11/16

FIG 8B

Ensaio Safenoso 7-dia

AUC

11/10/2017, pág. 11/17

11. Uso de um anticorpo antagonista anti-CGRP humanizado, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar pelo menos um sintoma vasomotor em um indivíduo em necessidade do mesmo, em que o anticorpo tem uma afinidade de ligação (K_D) para α-CGRP humano de 50 nM, ou menos, conforme medida por ressonância de plasmônio de superfície a 37°C e que compreende as seguintes regiões determinantes de complementariedade (CDRs):

a. CDR H1 conforme SEQ ID NO: 3;

b. CDR H2 conforme SEQ ID NO: 4;

c. CDR H3 conforme SEQ ID NO: 5;

d. CDR L1 conforme SEQ ID NO: 6;

e. CDR L2 conforme SEQ ID NO: 7; e

f. CDR L3 conforme SEQ ID NO: 8.

11/10/2017, pág. 10/17 fato de que compreende uma cadeia pesada produzida pelo vetor de expressão com N° de Acesso ATCC PTA-6867.

12/16

FIG8C

Ensaio Safenoso Anticorpo G1 Resposta de Dose

AUC

2500020000150001000050000-

EC₅₀ = 1.3 mg/kg EC₆₀ = 0.8 mg/kg veh 0.1

Dose mg/kg

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido sintoma vasomotor é uma enxaqueca com ou sem aura, enxaqueca hemiplégica, cluster de dores de cabeça, neuralgia de enxaqueca, dor de cabeça crônica ou dores de cabeça por tensão.

13/16

FIG 9

Φ

Ε <φ

ΊΟ

Ο

C φ

ο £Ζ

Φ

ΊΟ =3

Ε φ

ΊΟ <3

PBS

BIBN4096BS 300 pg/kg ▼

0 5 30 60 90 120

Tempo pós-injeção (minuto)

13. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido sintoma vasomotor é rubor.

14/16

L

FIG 10 • 10mg/kg (N-6) o 3mg/kg (N-4)

14. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo antagonista anti-CGRP humanizado compreende um domínio VH que tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, e um domínio V_L que tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

-15-10-5 0 5 101520 25303540455055

Tempo (minuto)

Veh (N=11)

-4901 (10mg/kg) (N=12)

15/16

FIG 11A

Temperatura (grau C)

16/16

FIG 11B

Superfície da cauda

Temperatura (grau C)

Tempo (minuto)

Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas.

Código de Controle

Campo 1

HiniIMUII·

A57C4C4AE13658A

Campo 2

IIIIIIIIIII

Outras Informações:

- Nome do Arquivo: LISTAGEM DE SEQUÊNCIA-7.1 RPI2428-P151877.TXT

- Data de Geração do Código: 11/10/2017

- Hora de Geração do Código: 15:32:50

- Código de Controle:

- Campo 1: BA57C4C4AE13658A

- Campo 2: A52E939585675A15

Petição 870170077694, de 11/10/2017, pág.

17/17