JP6815407B2

JP6815407B2 - 副甲状腺ホルモン−抗ｒａｎｋｌ抗体融合化合物

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Publication number: JP6815407B2
Application number: JP2018539096A
Authority: JP
Inventors: アンドリュー・コリトコ; ヤンフェイ・エル・マ; アミタ・ダッタ−マナン; ビクター・エイチ・オブング
Original assignee: イーライリリーアンドカンパニー
Priority date: 2016-02-01
Filing date: 2017-01-25
Publication date: 2021-01-20
Anticipated expiration: 2037-01-25
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Description

本発明は、医学の分野にある。より具体的には、本発明は、融合化合物及びその薬学的組成物に関し、ヒト副甲状腺ホルモン受容体のアゴニスト及び核因子κ−Ｂリガンドのヒト受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）に対して指向される抗体を含む。本発明の融合化合物は、骨障害の治療において、より具体的には、骨減少症、骨形成不全症、移植関連の骨喪失、自己免疫誘導性骨喪失、及び／もしくは廃用性骨喪失を含む低骨量障害の治療において、かつ／または変性腰椎すべり症もしくは変性椎間板疾患などの障害の骨治癒、ならびに脊椎融合及び骨折患者における骨治癒において有用であると予想される。

骨障害は、何百万人もの個体を侵しており、苦痛を伴い、衰弱させる症状をしばしば引き起こす。一般的な代謝性骨障害である骨粗鬆症は、骨芽細胞性骨形成に対する過剰な破骨細胞性骨吸収から少なくとも部分的に生じる骨量の進行性喪失を特徴とする。骨粗鬆症に関連する骨量の喪失は、骨折の危険性を高める。骨粗鬆症関連の骨量喪失の長期結果は、骨折、慢性疼痛、身体障害、及び／または不動状態を含む重度の身体的結果をもたらし得るとともに、骨格が体に適切な構造支持を提供できないようにし得る。

骨粗鬆症関連の骨折は、ヘルスケアシステムの主な健康懸念及び経済的負担を構成する。米国骨粗鬆症財団（ＮａｔｉｏｎａｌＯｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によると、９９０万人のアメリカ人が骨粗鬆症を有し、さらに４，３１０万人が、低骨密度に悩まされている。毎年、２００万件を超える骨折及び４０万件超の入院が、骨粗鬆症に起因している。米国公衆衛生局長官は、骨粗鬆症関連の骨折が、毎年１２０〜１８０億ドルの直接医療費をもたらすと推定している。したがって、患者にとってより良い転帰をもたらし得る代替療法が依然として必要である。好ましくは、かかる代替療法は、骨形成を増加させ、かつ骨吸収を低減する薬剤を含む。追加として、かかる代替療法は、好ましくは、骨減少症、骨形成不全症、移植関連の骨喪失、自己免疫誘導性骨喪失、及び／もしくは廃用性骨喪失などの低骨量障害の治療において、かつ／または変性腰椎すべり症もしくは変性椎間板疾患などの障害の骨治癒において有効性を示すことができる。本発明の融合化合物は、上記の必要性のうちの少なくとも１つを満たすことが予想される代替療法を提供する。

ＲＡＮＫＬは、タンパク質のＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり、骨リモデリングにおいて重要な役割を果たす。ＲＡＮＫＬは、骨芽細胞によって発現され、破骨細胞及び破骨細胞の前駆体細胞の表面上にあるその同源の受容体ＲＡＮＫに結合する。ＲＡＮＫＬのＲＡＮＫへの結合は、成熟破骨細胞の形成、活性化、及び存続、ならびに細胞内シグナル伝達カスケードの刺激を誘導して、増加した骨吸収をもたらす。ＲＡＮＫＬに対する中和抗体は、当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第６，７４０，５２２号は、唯一の認可された抗ＲＡＮＫＬ治療抗体である（更年期後の女性及び骨折の危険性が高い男性における骨粗鬆症の治療のために認可された）、Ｐｒｏｌｉａ（登録商標）という名称で市販されているデノスマブを含む抗ＲＡＮＫＬ抗体を開示している。

副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、骨リモデリングにおいて中心的役割を果たす、８４アミノ酸ペプチドである。ＰＴＨ受容体１に結合するＰＴＨは、環状ＡＭＰ及び標準的なｗｎｔシグナル伝達経路の活性化を通じて骨形成を直接誘導する。治療的ＰＴＨペプチドは、当該技術分野で既知である。例えば、国際特許公開第ＷＯ／２０００／０１０５９６号は、Ｆｏｒｔｅｏ（登録商標）として市販されている治療用ＰＴＨペプチドである、テリパラチド（ｒｈＰＴＨ（１−３４））を開示している。Ｆｏｒｔｅｏ（登録商標）は、骨粗鬆症患者における骨形成活性を増加させることが示されている、ＰＴＨの３４アミノ酸Ｎ末端断片であり、骨粗鬆症を治療するために米国において認可されている唯一の骨同化剤である。

ＲＡＮＫＬ及び治療用ＰＴＨペプチドに対する中和抗体が既知であるが、ＲＡＮＫＬの活性を阻害し、ＰＴＨの骨同化特性を促進するための併用療法は存在しない。したがって、骨減少症、骨形成不全症、移植関連の骨喪失、自己免疫誘導性骨喪失、及び／もしくは廃用性骨喪失などの低骨量障害を有する患者のための、かつ／または変性腰椎すべり症もしくは変性椎間板疾患などの障害の骨治癒、ならびに脊椎融合及び骨折患者における骨治癒を助けるための、ＰＴＨの骨同化特性を抗ＲＡＮＫＬの抗骨吸収特性と組み合わせる代替療法が依然として必要である。かかる代替療法に対する１つのアプローチは、別個の製剤の投与（それぞれ別個の活性剤を含有する）、または個々の薬剤のそれぞれを含有する単一の共製剤の投与のいずれかによる、別個の薬剤の共投与を含み得る。２つの注射が用量及び適時選択の柔軟性を許容する一方で、服薬遵守及び疼痛の両方のために、それは患者にとっては不都合である。他方で、複数の薬剤の共製剤の単一投与は便宜を提供し得るが、必要な化学的及び物理的安定性ならびに各薬剤の生物学的利用能を達成する製剤化条件を見出すことは、非常に困難であるか、または不可能である場合が多い。追加として、共投与及び共製剤化の両方は、各薬剤に関連する添加剤の開発、製造、及び調整コストを必要とする。

本発明は、骨障害を有する、より具体的には、骨粗鬆症などの低骨量障害を有する患者の代替療法の必要性に対処する。さらなる実施形態では、骨障害は、骨減少症、骨形成不全症、移植関連の骨喪失、自己免疫誘導性骨喪失、廃用性骨喪失、変性腰椎すべり症、及び／または変性椎間板疾患のうちの１つ以上である。より具体的には、本発明は、ＲＡＮＫＬの活性を阻害し、ＰＴＨの骨同化性特性を促進することができる融合化合物を提供する。本発明の融合化合物は、全身投与に好適な医薬品を提供し、これはまた、例えば骨折、及び骨量喪失または変性を含む骨障害に関連する、または起因する他の病態の治療における骨治癒のための薬剤としても有用であり得る。

本発明は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを有する化合物、より具体的には融合化合物を提供する。第１のポリペプチドは、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）ペプチド及びｍＡｂＩｇＧ重鎖（ＨＣ）を含み、ＰＴＨペプチドは、配列番号１３によって与えられるアミノ酸配列を有し、ＨＣは、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１〜３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号７によって与えられるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号８によって与えられるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号９によって与えられるアミノ酸配列を有する。第２のポリペプチドは、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１〜３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を有するｍＡｂ軽鎖（ＬＣ）を有し、ＬＣＤＲ１は、配列番号１０によって与えられるアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号１１によって与えられるアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号１２によって与えられるアミノ酸配列を有する。かかる化合物によると、ＰＴＨペプチドは、ポリペプチドリンカー（Ｌ１）を介してＨＣに結合し、Ｌ１は、ＨＣのＮ末端及びＰＴＨペプチドのＣ末端に共有結合している。

いくつかの特定の実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲが配列番号５によって与えられるアミノ酸配列を有し、ＬＣＶＲが配列番号６によって与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。いくつかのより特定の実施形態では、本発明は、第１のポリペプチドが配列番号１によって与えられるアミノ酸配列を有し、第２のポリペプチドが配列番号２によって与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、Ｌ１が配列番号１４によって与えられるアミノ酸配列を有する、化合物を含む。なおもさらなる実施形態では、本発明の化合物は、２つの第１のポリペプチド及び２つの第２のポリペプチドを含む。

本発明はまた、核酸分子、及び本発明の融合化合物をコードする発現ベクターに関する。ある実施形態では、本発明は、第１のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供し、第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１である。いくつかのかかる実施形態によると、このＤＮＡ分子は、配列番号３によって与えられるポリヌクレオチド配列を有する。

ある実施形態では、本発明はまた、第２のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供し、第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は配列番号２である。いくつかのかかる実施形態によると、ＤＮＡ分子は、配列番号４によって与えられるポリヌクレオチド配列を有する。

さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号２のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子を提供する。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３によって与えられ、配列番号２のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号４によって与えられる。

本発明はまた、ＤＮＡ分子（複数可）で形質転換された哺乳動物細胞を提供し、この細胞は、本発明の第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む化合物を発現することができ、第１のポリペプチドは、配列番号１によって与えられるアミノ酸配列を有し、第２のポリペプチドは、配列番号２によって与えられるアミノ酸配列を有する。また、本発明は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む化合物を生成するためのプロセスであって、本発明の化合物が発現されるような条件下で哺乳動物細胞を培養することを含むプロセスを提供する。本発明はまた、当該プロセスによって生成される化合物を提供する。

本発明はまた、本発明の化合物、及び１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、骨障害の治療に使用することができ、かかる治療は、それを必要とする患者に治療有効量の本発明の薬学的組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、骨障害は、骨粗鬆症、骨減少症、骨形成不全症、移植関連の骨喪失、自己免疫誘導性骨喪失、及び／または廃用性骨喪失のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、骨障害は、変性腰椎すべり症及び／または変性椎間板疾患のうちの１つ以上である。

本発明はまた、治療を必要とする患者に、治療有効量の本発明の化合物を投与することを含む、骨障害の治療方法も提供する。いくつかのかかる実施形態では、骨障害は骨粗鬆症である。さらなる実施形態では、骨障害は、骨粗鬆症、骨減少症、骨形成不全症、移植関連の骨喪失、自己免疫誘導性骨喪失、及び／または廃用性骨喪失のうちの１つ以上である。さらなる実施形態では、骨障害は、変性腰椎すべり症及び／または変性椎間板疾患のうちの１つ以上である。なおもさらなる実施形態では、本発明は、脊椎融合患者及び／または骨折患者の治療方法を提供する。

本発明はまた、療法で使用するための、本発明の化合物またはその薬学的組成物を提供する。より具体的には、本発明は、骨障害の治療及び／または骨治癒に使用するための、本発明の化合物またはその薬学的組成物を提供し、骨障害は、骨粗鬆症、骨減少症、骨形成不全症、移植関連の骨喪失、自己免疫誘導性骨喪失、廃用性骨喪失、変性腰椎すべり症、及び／または変性椎間板疾患のうちの１つ以上である。

一実施形態では、本発明はまた、骨障害の治療及び／または骨治癒のための医薬品の製造における、本発明の化合物またはその薬学的組成物の使用を提供する。特定の実施形態によると、本発明は、骨粗鬆症、骨減少症、骨形成不全症、移植関連の骨喪失、自己免疫誘導性骨喪失、廃用性骨喪失、変性腰椎すべり症、及び／または変性椎間板疾患のうちの１つ以上の治療のための医薬品の製造における、本発明の化合物またはその薬学的組成物を提供する。

本明細書で言及されるように、本発明について記載するとき、「化合物」及び「融合化合物」という用語は、互換的に使用される。本発明の融合化合物は、二官能性であり、それらが２つの異なる標的と相互作用し、かつそれらの活性を調節できることを意味する。具体的には、本発明の融合化合物は、ヒトＰＴＨ受容体のアゴニストであり、またヒトＲＡＮＫＬと相互作用し、かつその活性を阻害する。ヒトＰＴＨ受容体のアゴニストとＲＡＮＫＬ抗体とを単一の化合物に組み合わせる際に、本発明の融合化合物は、患者における骨形成及び／または抗骨吸収効果を示すと考えられる。したがって、本発明の化合物、またはその薬学的組成物は、骨治癒及び／または低骨量障害、例えば骨粗鬆症、骨減少症、骨形成不全症、移植関連の骨喪失、自己免疫誘導性骨喪失、廃用性骨喪失、変性腰椎すべり症、変性椎間板疾患、骨折、及び／または脊髄融合患者の治療において有用であり得る。

また、本発明の化合物は、４つのポリペプチド鎖、２つの第１のポリペプチド、及び２つの第２のポリペプチドを含む。以下の概略で表されるように、第１のポリペプチドのそれぞれは、ポリペプチドリンカー（Ｌ１）によってｍＡｂ重鎖（ＨＣ）のＮ末端に結合した副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）ペプチドを含むように操作されている。リンカーＬ１は、典型的には、約１０〜２５アミノ酸の長さであり、グリシン、セリン、またはトレオニンアミノ酸のうちの１つ以上が豊富である。第２のポリペプチド鎖のそれぞれは、ｍＡｂ軽鎖（ＬＣ）を含み、第１のポリペプチドのうちの一方と、特に第１のポリペプチドのＨＣ内で鎖間ジスルフィド結合を形成するように操作される。各第１のポリペプチドは、他方の第１のポリペプチドと、特に第１のポリペプチドのそれぞれのＨＣ間に、鎖間ジスルフィド結合を形成するように操作される。

本発明の化合物のポリペプチド鎖は、左から右に読み取られるとき、Ｎ末端からＣ末端までのアミノ酸の配列によって描画され、各アミノ酸は、その１文字または３文字いずれかのアミノ酸省略形によって表される。本明細書で別途定めのない限り、本発明のポリペプチドの製造に使用される全てのアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。アミノ酸またはポリペプチド鎖の「Ｎ末端」（またはアミノ末端）は、アミノ酸上の遊離アミン基、またはポリペプチド鎖の第１のアミノ酸残基上の遊離アミン基を指す。同様に、アミノ酸またはポリペプチド鎖の「Ｃ末端」（またはカルボキシ末端）は、アミノ酸上の遊離カルボキシ基、またはポリペプチド鎖の最後のアミノ酸残基上の遊離カルボキシ基を指す。

本発明の化合物によると、各第１のポリペプチドのＨＣは、γとして分類され、アイソタイプを（例えばＩｇＧとして）定義する。このアイソタイプは、さらにサブクラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、及びＩｇＧ_４）に分割され得る。特定の実施形態では、本発明の化合物は、ＩｇＧ４型のｍＡｂ重鎖（ＨＣ）を含む。各ＨＣは、Ｎ末端重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）に続いて、３つのドメイン（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３）からなる定常領域（ＣＨ）、ならびにヒンジ領域からなる。

追加として、本発明の化合物によると、各ｍＡｂ軽鎖（ＬＣ）は、κまたはλとして分類され、当該技術分野で既知の特定の定常領域を特徴とする。特定の実施形態では、本発明の化合物は、κＬＣを含む。各ＬＣは、Ｎ末端軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）に続いて、軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。

各ＨＣ及びＬＣのそれぞれのＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存される領域で挟まれた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。好ましくは、本発明の化合物のフレームワーク領域は、ヒト起源または実質的にヒト起源である。本発明による化合物の各ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される。本明細書において、各ＨＣＶＲの３つのＣＤＲは、「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３」と称され、各ＬＣＶＲの３つのＣＤＲは、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３」と称される。ＣＤＲは、抗原と特異的な相互作用を形成する残基の大部分を含む。本発明の化合物が特定の抗原、例えばＲＡＮＫＬに結合する機能的能力は、ＣＤＲによって大きく影響される。

本明細書で互換的に使用される場合、「抗原結合部位」及び「抗原結合領域」は、抗原と相互作用し、化合物にそれぞれの抗原に対する特異性及び親和性を与えるアミノ酸残基を含有する、本発明の化合物の部分（複数可）を指す。本発明の化合物によると、抗原結合部位は、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対（鎖間ジスルフィド結合によって結合したＬＣ及びＨＣの）によって形成される。追加として、本発明の化合物によると、各ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対によって形成された抗原結合部位は同じである（例えば、同じ抗原、ＲＡＮＫＬに対する親和性を含む）。

「Ｋａｂａｔ番号付け」または「Ｋａｂａｔ標識付け」という用語は、本明細書では互換的に使用される。当該技術分野において認識されているこれらの用語は、ある抗体の重鎖及び軽鎖可変領域内で他のアミノ酸残基よりも可変的である（すなわち、超可変である）アミノ酸残基を番号付けするシステムを指す（Ｋａｂａｔ，ｅｔａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹＡｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−９３（１９７１）、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＦｉｆｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１−３２４２（１９９１））。

「Ｎｏｒｔｈ番号付け」または「Ｎｏｒｔｈ標識付け」という用語は、本明細書では互換的に使用される。当該技術分野において認識されているこれらの用語は、ある抗体の重鎖及び軽鎖可変領域内で他のアミノ酸残基よりも可変的である（すなわち、超可変である）アミノ酸残基を番号付けするシステムを指し、少なくとも部分的に、Ｎｏｒｔｈｅｔａｌ．，ＡＮｅｗＣｌｕｓｔｅｒｉｎｇｏｆＡｎｔｉｂｏｄｙＣＤＲＬｏｏｐＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，４０６：２２８−２５６（２０１１）に記載される多数の結晶構造との親和性伝播クラスター化に基づく。

融合化合物の操作
本発明の融合化合物を構築しようとしたとき、重大な問題に遭遇した。遭遇した問題は、骨形成の増加及び骨吸収の減少の両方に対して適合性及び／または最適な生物活性を有する単一の薬剤を操作することを含んでいた。例えば、既知のＲＡＮＫＬ抗体（例えば、米国特許第６，７４０，５２２号に記載されるようなデノスマブ）と結合したＰＴＨペプチド（例えば、国際特許公開第ＷＯ／２０００／０１０５９６号に記載されるような）を含む融合化合物は、適合性及び／または許容可能な生物活性を有する薬剤を提供しない。デノスマブは、皮下注射されるとき、およそ２５日を超える半減期（骨吸収を減少させるための）を有するが、テリパラチドの（骨形成を増加させるための）半減期は、皮下注射されるとき、およそ１時間であることが知られている。かかる異種の生物活性プロファイルは、治療有効量の送達が、急性高カルシウム血症及びより長期の低カルシウム血症の両方の危険性を均衡させなければならないという、投与に関する問題を生み出す。追加として、ＰＴＨへの持続的曝露は、望ましくない異化性骨喪失につながり得るため、既知のＲＡＮＫＬ抗体を有するＰＴＨの投与が問題である。そのようなものとして、可能性のある副作用（例えば、急性高カルシウム血症、より長期の低カルシウム血症、及び異化性骨喪失）も均衡させる、治療有効量のＰＴＨペプチド及びＲＡＮＫＬ抗体の投与を可能にする融合化合物に到達するために、薬理学的介入が必要である。

本発明の融合化合物の操作に関して上で詳述された重大な問題の結果として、低骨量障害の治療及び骨治癒での使用に許容される生物活性プロファイルを有する治療用融合化合物に到達するために、新規のＲＡＮＫＬ抗体を開発し、操作した。そのようなものとして、新規のＲＡＮＫＬｍＡｂ部分（本明細書でさらに詳細に記載される）と結合したＰＴＨ部分（テリパラチド）を含む融合化合物を操作した。本発明の操作された融合化合物は、低骨量障害の治療及び骨治癒での使用に関して、骨吸収（減少）及び骨形成（増加）のための治療上許容され、かつ適合性の生物活性プロファイルを含む。

本発明の融合化合物を構築しようとするときに遭遇する追加の問題としては、溶液中の化合物凝集、ＲＡＮＫＬｍＡｂ部分からのＰＴＨペプチド部分のクリッピング、及びＲＡＮＫＬｍＡｂ部分の低減した結合が挙げられた。例えば、本発明による融合化合物を構築することにおける最初の試みは、配列番号１５によって与えられる天然８４アミノ酸配列を有するＰＴＨペプチド、及び様々なＲＡＮＫＬ抗体（例えば、デノスマブなどの既知のＲＡＮＫＬ抗体及び新規のＲＡＮＫＬ抗体構築体）に結合する（そのＮ末端領域の）可変長の断片を利用する構築体を含んでいた。最初の構築体はまた、重鎖及び軽鎖両方のＮ末端またはＣ末端のそれぞれにおいて、様々な構成のＲＡＮＫＬｍＡｂ部分に結合されたＰＴＨペプチドを含んでいた。いくつかの構築体は、リンカーを有しないＲＡＮＫＬ抗体部分、ならびに様々な構造及びサイズのアミノ酸リンカーに結合しているＰＴＨペプチド部分を含んでいた。最初に試みられた融合化合物構築体は、上記の化学的及び／または物理的問題のうちの１つ以上を呈した。しかしながら、本発明の操作された融合化合物は、驚くべきことに、また予想外に、治療上許容される発現、安定性、及び親和性を有する化合物をもたらした。本発明の融合化合物をもたらす修飾のいずれも、当該技術分野において示唆または教示されるルーチンまたは共通の一般知識ではない。

融合化合物の発現
それらが作動可能に結合している遺伝子の発現を導くことができる発現ベクターは、当該技術分野で周知である。発現ベクターは、宿主細胞からのポリペプチドの分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチドであり得る。第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドのそれぞれは、１つのベクターにおいてそれらが作動可能に結合している異なるプロモーターから独立して発現され得るか、または代替として、第１及び第２のポリペプチドは、２つのベクター（１つは第１のポリペプチドを発現し、１つは第２のポリペプチドを発現する）においてそれらが作動可能に結合している異なるプロモーターから独立して発現され得る。本発明の融合化合物の製造に使用するための例示的な好適なベクターとしては、ｐＥＥ６．４（例えば第１のポリヌクレオチド配列を発現するため）及びｐＥＥ１２．４（例えば第２のポリヌクレオチド配列を発現するため）などのＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓから入手可能なベクターが挙げられる。

配列番号１のアミノ酸配列を有する本発明の融合化合物の例示的な第１のポリペプチド（可撓性グリシンセリンリンカーを介してＨＣのＮ末端において結合したＰＴＨペプチドを含む）をコードする特定のＤＮＡポリヌクレオチド配列は、配列番号３によって提供される（配列番号３によって提供されるＤＮＡポリヌクレオチド配列はまた、シグナルペプチドをコードする）。配列番号２のアミノ酸配列を有する本発明の融合化合物の例示的な第２のポリペプチド（ＬＣを含む）をコードする特定のＤＮＡポリヌクレオチド配列は、配列番号４によって提供される（配列番号４によって提供されるＤＮＡポリヌクレオチド配列はまた、シグナルペプチドをコードする）。

宿主細胞は、本発明の第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第１及び第２両方のポリペプチドを発現する１つ以上の発現ベクターで安定にまたは過渡的にトランスフェクト、形質転換、形質導入、または感染した細胞を含む。本発明の融合化合物を生成する宿主細胞株の作成及び単離は、当該技術分野で既知の標準的な技法を使用して達成され得る。哺乳動物細胞は、本発明の融合化合物の発現のための好ましい宿主細胞である。特定の哺乳動物細胞は、ＣＨＯ、ＮＳ０、及びＤＧ−４４である。好ましくは、融合化合物は、宿主細胞が培養される培地中に分泌され、ここから融合化合物が、従来の技法によって回収または精製され得る。例えば、培地は、従来の方法を用いて、プロテインＡまたはプロテインＧ親和性クロマトグラフィーカラム及びサイズ排除またはＣａｐｔｏマルチモーダルクロマトグラフィーに適用し、そこから溶離することができる。さらに、可溶性凝集体及び多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技術によって有効に除去することができる。生成物は、例えば−７０℃で直ちに凍結させてもよく、または凍結乾燥させてもよい。

治療的使用
本明細書で使用される場合、「治療」及び／または「治療する」は、本明細書に記載される障害（例えば、骨粗鬆症に関連するような骨量喪失または骨治癒を妨げる障害）の進行の減速、中断、静止、制御、または停止があり得るが、必ずしも全ての障害症状の完全排除を示すものではない全てのプロセスを指すよう意図されている。治療は、ＰＴＨの骨同化特性及び減少したＲＡＮＫＬのレベルまたは減少したＲＡＮＫＬの生物活性から利益を享受するであろう患者における疾患または病態の治療のための、本発明の化合物、またはその薬学的組成物の投与を含む。治療は、（ａ）疾患のさらなる進行を阻害すること、すなわち、骨量喪失及び／または骨治癒への障壁を止めること、及び（ｂ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患または障害の退行を引き起こすこと、または骨量喪失を引き起こす、及び／もしくは骨治癒を阻害する症状またはその合併症を軽減することを含む。本発明の化合物は、骨疾患のうちの１つ以上の治療において、例えば骨粗鬆症、骨減少症、骨形成不全症、移植関連の骨喪失、自己免疫誘導性骨喪失、及び／もしくは廃用性骨喪失などの骨量喪失疾患において、かつ／または変性腰椎すべり症及び／もしくは変性椎間板疾患などの障害の骨治癒、ならびに骨折及び脊椎融合患者における骨治癒において有用であると予想される。

本明細書において互換的に使用される「患者」、「対象」、及び「個体」という用語は、ヒトを指す。いくつかの実施形態では、患者は、骨障害の治療、骨治癒、例えば骨折修復、骨喪失もしくは変性の防止を「必要とする」、もしくは必要とする「危険性がある」と診断されたヒト、またはそれらを必要とするヒト、ならびに／または骨粗鬆症、骨減少症、骨形成不全症、移植関連の骨喪失、自己免疫誘導性骨喪失、及び／もしくは廃用性骨喪失を発症する危険性があるか、もしくはそれらのための治療を必要とすると診断されたヒトである。

薬学的組成物
本発明の化合物は、患者への投与に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。本発明の化合物は、静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内を含む非経口経路を介した投与のために意図されている。追加として、本発明の化合物は、単独で、または薬学的に許容される担体及び／もしくは希釈剤とともに単一用量もしくは複数用量で患者に投与され得る。かかる薬学的組成物は、選択された投与モードに適切であるように設計され、薬学的に許容される希釈剤、担体、及び／または賦形剤、例えば分散剤、緩衝液、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤等が適切に使用される。当該組成物は、例えば、一般に医師に知られているような製剤化技法の概略を提供する、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ１９９５に開示されている従来技法に従って設計され得る。薬学的組成物に好適な担体としては、本発明の化合物と組み合わせたとき、分子の活性を保持し、患者の免疫系と非反応性である、任意の材料が挙げられる。本発明の薬学的組成物は、化合物、及び１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む。

有効量の本発明の化合物は、所望の治療結果を達成するために必要な（投与量、及び期間、及び投与手段の）量を指す。有効量の化合物またはその薬学的組成物は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重などの因子、ならびに化合物またはその部分（複数可）が個体における所望の応答を誘発する能力により変化し得る。有効量はまた、治療上有益な効果が、化合物の任意の毒性または有害効果を上回るものでもある。

融合化合物の発現及び精製
本発明の例示的な融合化合物は、実質的に以下のように発現され、精製される。配列番号３（配列番号１の例示的な第１のポリペプチド及び翻訳後切断されたシグナルペプチドをコードする）ならびに配列番号４（配列番号２の例示的な第２のポリペプチド及び翻訳後切断されたシグナルペプチドをコードする）によって与えられるポリヌクレオチド配列を含有するグルタミン合成酵素（ＧＳ）発現ベクターを使用して、チャイニーズハムスター細胞株（ＣＨＯ、ＧＳノックアウト）を電気穿孔によってトランスフェクトする。発現ベクターは、ＳＶＥａｒｌｙ（シミアンウイルス４０Ｅ）プロモーター及びＧＳ遺伝子をコードする。ＧＳの発現は、ＣＨＯ細胞によって必要とされるアミノ酸であるグルタミンの生化学的合成を可能にする。トランスフェクション後、細胞を５０μＭＬ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）でバルク選択にかける。ＭＳＸによるＧＳの阻害は、選択のストリンジェンシーを高めるために利用される。宿主細胞ゲノムの転写活性領域への発現ベクターｃＤＮＡの組み込みを有する細胞を、ＣＨＯ野生型細胞に対して選択することができる。トランスフェクトされたプールを低密度でプレーティングして、安定した発現細胞のクローンに近い成長を可能にする。マスターウェルを、融合化合物の発現についてスクリーニングし、次いで生成に使用される無血清、懸濁培養物中でスケールアップする。

例示的な化合物が分泌された清澄化培地を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適合性緩衝液で平衡化されたタンパク質Ａ親和性カラムに適用する。カラムを洗浄して、非特異的結合構成成分を除去する。結合した融合化合物は、例えば、ｐＨ勾配によって溶出され、例えばＴｒｉｓ（ｐＨ８）緩衝液で中和される。融合化合物画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは分析的サイズ排除などによって検出され、その後プールされる。可溶性凝集体及び多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、Ｃａｐｔｏマルチモーダルクロマトグラフィー、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技法によって有効に除去することができる。融合化合物は、一般的な技法を使用して濃縮及び／または滅菌濾過される。これらのクロマトグラフィーステップ後の例示的な融合化合物の純度は、９８％超である（単量体）。融合化合物は、−７０℃で直ちに凍結され得るか、または４℃で数ヶ月間保管され得る。

実質的に上記のような手順に従って発現及び精製された本発明の例示的な融合化合物を含む様々な領域及びリンカーの関係を表１に提示する（アミノ酸の番号付けは、線形番号付けを適用し、可変ドメインへのアミノ酸の割り当ては、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇにおいて入手可能なＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（登録商標）に基づき、ＣＤＲドメインへのアミノ酸の割り当ては、表１の最後に反映されるような周知のＫａｂａｔ及びＮｏｒｔｈ番号付け規則に基づく）。

表１に提示される例示的な化合物は、配列番号１のアミノ酸配列を有する２つの第１のポリペプチド、及び配列番号２のアミノ酸配列を有する２つの第２のポリペプチドを含む。例示的な融合化合物によると、第１のポリペプチドのそれぞれは、配列番号１のシステイン残基１８４と配列番号２のシステイン残基２１４との間の第２のポリペプチドのそれぞれと鎖間ジスルフィド結合を形成し、他の第１のポリペプチドとの少なくとも２つの鎖間ジスルフィド結合は、第１の鎖間ジスルフィド結合が、第１のポリペプチドの（配列番号１の）システイン残基２７６と他の第１のポリペプチドの（配列番号１の）システイン残基２７６との間に形成し、第２の鎖間ジスルフィド結合が、第１のポリペプチドの（配列番号１の）システイン残基２７９と、他の第１のポリペプチドの（配列番号１の）システイン残基２７９との間に形成する。さらに、表１に提示される例示的な化合物は、第１のポリペプチド両方の配列番号１のアスパラギン残基３４７においてグリコシル化される。

本明細書における別段の記載を除いて、実施例全体で言及される例示的な融合化合物は、表１に提示される本発明の例示的な化合物を指す。

ＲＡＮＫＬに対する融合化合物の結合親和性
ヒト及びマウスＲＡＮＫＬに対する例示的な融合化合物の結合親和性及び結合性化学量論は、ＨＢＳ−ＥＰ＋（１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４＋１５０ｍＭＮａＣｌ＋３ｍＭＥＤＴＡ＋０．０５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０）走行緩衝液でプライムされたＢｉａｃｏｒｅ２０００機器上で、２５℃に設定された分析温度で表面プラズモン共鳴アッセイを使用して決定される。４つ全てのフローセル（Ｆｃ）上の（標準ＮＨＳ−ＥＤＣアミンカップリングを使用して生成された）固定化タンパク質Ａを含有するＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、品番ＢＲ−１００５３０）を使用して、補足方法を用いる。融合化合物試料は、走行緩衝液への希釈によって２μｇ／ｍＬで製造される。ヒト及びマウスＲＡＮＫＬ試料はそれぞれ、５ｎＭで開始する最終濃度で、各サイクルに２倍連続希釈（走行緩衝液中）を使用して製造される。

各分析サイクルは、（１）別個のフローセル（Ｆｃ２及びＦｃ３）上で抗体試料を捕捉すること、（２）全てのＦｃにわたって１００μＬ／分で１５０秒間の、各ヒト及びマウスＲＡＮＫＬ濃度それぞれの注入に続いて、１８００秒間の緩衝液フローに戻り、解離相を監視すること、（３）全てのセルにわたって５μＬ／分で１２０秒間、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシンの注入によるチップ表面の再生、及び（５）ＨＢＳ−ＥＰ＋の１０μＬ（６０秒）注入によるチップ表面の平衡化からなる。データを、標準的な二重参照を用いて処理し、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、バージョン２．０．３を用いて１：１結合モデルに適合させて、会合速度（ｋ_ｏｎ、Ｍ^−１ｓ^−１単位）、解離速度（ｋ_ｏｆｆ、ｓ^−１単位）、及びＲ_ｍａｘ（ＲＵ単位）を決定する。Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの関係から平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を計算し、これはモル単位によるものである。結果を表２に提供する。

表２に提供される結果は、本発明の例示的な融合化合物が、２５℃で高い親和性でヒト及びマウスＲＡＮＫＬに結合することを示す。

インビトロでのＲＡＮＫＬ誘導性ＮＦ−ｋＢ駆動型ルシフェラーゼ活性の中和
ヒトＲＡＮＫ及びＮＦ−ｋＢ駆動型ルシフェラーゼレポーターを安定に共発現するＨＥＫ２９３細胞を使用して、表１に提示される例示的な融合化合物がＲＡＮＫＬ活性を中和する能力を評価する。上述のＨＥＫ２９３細胞モデルにおいて、ＲＡＮＫは、ヒトＲＡＮＫＬが結合すると、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達を誘導してルシフェラーゼ発光をもたらす。例示的な融合化合物によるＲＡＮＫへのＲＡＮＫＬ結合の中和は、ルシフェラーゼ発光の低減によって測定される。

ＨＥＫ２９３細胞は、７００μｇ／ｍＬＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＨｙＣｌｏｎｅ、品番ＳＶ３００６９．０１）の選択的圧力の下で、慣例通りに培養する。２５，０００細胞／ウェルを、アッセイ培地（０．５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、品番１００８２−１４７）、２０ｎＭＨｅｐｅｓ（ＨｙＣｌｏｎｅ、品番ＳＨ３０２３７．０１）、１倍ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ、品番３５０５０−６１）及び１倍ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ、品番ＳＶ３００１０）を含有する、（５０μＬＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：３）培地（Ｇｉｂｃｏ、品番９３０１５２ＤＫ））中、９６ウェルの組織培養プレートのウェルに添加する（ＢｅｎｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、品番３５４６２０）。細胞を３７℃で（５％ＣＯ_２及び９５％湿度で）一晩インキュベートする。

１ｎＭ及び１０ｎＭ濃度のヒトＲＡＮＫＬを含むアッセイ培地は、ａ．）例示的な融合化合物、及びｂ．）ＲＡＮＫＬ中和抗体（例示的な融合化合物のｍＡｂ部分と同じＨＣ及びＬＣアミノ酸配列を有するＩｇＧ４ＲＡＮＫＬｍＡｂ）のそれぞれについて、１０ｎＭ〜０．００５ｎＭ（１：３連続希釈で）の用量範囲を製造するために使用される。アッセイ培地は、「培地のみ」対照のために使用される。全ての処理群を、室温で１５分間インキュベートする。その後、５０μＬの各処理群を、培養細胞を含有する５０μＬの培地に添加する。処理群と培養細胞との混合物を、３７℃で一晩インキュベートする。

一晩のインキュベーション後、既存の成長培地を除去し、１Ｌの１％ＴｒｉｔｉｏｎＸ−１００溶解緩衝液（３０ｍＬＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｆｉｓｈｅｒ、品番ＢＰ１５１−５００）、３ｍＬのＭｇＣｌ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｍ９２７２）、１０８．１５ｍＬの１ＭＴｒｉｚｍａＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｔ−３２５３）、４１．８５ｍＬの１ＭＴｒｉｚｍａＢａｓｅ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｔ−１５０３）、及び８１７ｍＬのＨ２Ｏ））中の５０μＬのＢｕｇＬｉｔｅ（２．２９６ｇＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｄ０６３２）、１．１５２ｇのコエンザイムＡ（Ｓｉｇｍａ、品番Ｃ−３０１９）、０．２４８ｇＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ、品番Ａ７６９９）中に細胞を懸濁する。細胞を次いで、プレートシェーカーで５〜１０分間、穏やかに撹拌しながら溶解させる。細胞溶解後、発光を、プレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー）上で測定する。全ての処理群のＩＣ_５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いる３パラメータロジスティック回帰モデルを使用して計算し、表３に提示する。

表３に提示される結果は、本発明の例示的な融合化合物が、ヒトＲＡＮＫＬ誘導性ＮＦ−ｋＢ駆動型ルシフェラーゼ発光を中和することを示す。この阻害は、陽性対照ＲＡＮＫＬ抗体で観察されたものと同等であった。培地対照は、試験したいずれの濃度でも、ＨＥＫ２９３細胞モデルにおいてヒトＲＡＮＫＬ誘導型のＮＦ−ｋＢ主導型ルシフェラーゼ発光を中和しなかった。これらの結果は、本発明の例示的な融合化合物が、ＲＡＮＫＬを有効に中和することを示す。

インビトロでのＰＴＨＲ１受容体誘導性ルシフェラーゼ活性の活性化
ＰＴＨ受容体を内因的に発現し、ｐＴｒａｎｓｌｕｃｅｎｔＣＲＥ（１）ルシフェラーゼレポーターベクター（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、品番ＬＲ００９３）及びｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で安定に共トランスフェクトされた（ＲｏｃｈｅＦｕｇｅｎｅ６試薬を使用して）ラット骨肉腫ＵＭＲ−１０６細胞（ＡＴＣＣ、品番ＣＲＬ−１６６１）を使用して、表１に提示される例示的な融合化合物が、ＰＴＨＲ１受容体を活性化する能力を評価する。ＰＴＨ受容体のＰＴＨ結合（ＵＭＲ−１０６細胞によって発現される）は、ＣＲＥ調節ルシフェラーゼ発光を誘導する。例示的な融合化合物によるＰＴＨＲ１受容体の活性化は、ルシフェラーゼ発光の定量化を通して測定される。

共トランスフェクトされたＵＭＲ−１０６細胞は、３７℃及び１０％ＣＯ_２で、ＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳ、１０％ＦＢＳ、１倍ペニシリン、ストレプトマイシン、及びグルタミン、ならびに２ｍｇ／ｍＬのＧ４１８中で成長させる。ＵＭＲ−１０６細胞（５０，０００細胞／ウェルの濃度で）を、不透明な白色プレートに添加し、３７℃で（１０％ＣＯ_２で）一晩インキュベートする。インキュベーション後、０ｎＭ〜１２５０ｎＭの用量範囲の、ａ．）例示的な融合化合物、ｂ．）ＲＡＮＫＬ中和抗体（例示的な融合化合物のｍＡｂ部分と同じＨＣ及びＬＣアミノ酸配列を有するＩｇＧ４ＲＡＮＫＬｍＡｂ、ならびにｃ．）ＰＴＨペプチド（３８アミノ酸副甲状腺ホルモンペプチド）のうちの１つを、播種プレートに添加し、プレートを３７℃で（１０％ＣＯ_２で）４〜６時間インキュベートする。その後、５０μＬのＢｕｇＬｉｔｅを各プレートに添加し、発光をプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー）上で測定する。全ての処理群のＥＣ_５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍまたはＪＭＰを用いる３パラメータロジスティック回帰モデルを使用して計算し、表４に提示する。

表４に提供される結果は、本発明の例示的な融合化合物が、ＰＴＨＲ１受容体に結合するとともに、インビトロで下流ＰＴＨＲ１シグナル伝達カスケードを活性化することを示す。結果が示すように、例示的な融合化合物がＰＴＨＲ１シグナル伝達を活性化する能力は、ＰＴＨペプチド単独に比肩する。

無傷のマウスモデルにおけるインビボ有効性分析
骨量密度に対するインビボでの効果を、無傷の雌マウスモデルを使用して評価する。２０〜２２週齢のＣ５７／Ｂ６無傷雌マウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）を、１２時間の明／暗サイクルで、２２℃で食餌（０．７２％Ｃａ及び０．６１％Ｐ、Ｖｉｔ．Ｄ０．９９ＩＵ／ｇを含むＴＤ２０１４、Ｔｅｋｌａｄ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））及び水への自由なアクセスにより維持する。

マウスを、治療群またはＰＢＳビヒクル対照群に分割する。各治療群のマウスは、ａ．）３ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇの例示的な融合化合物、ｂ．）１０ｍｇ／ｋｇのＲＡＮＫＬ中和抗体（例示的な融合化合物のｍＡｂ部分と同じＨＣ及びＬＣアミノ酸配列を有するＩｇＧ４ＲＡＮＫＬｍＡｂ）、またはｃ．）１０ｍｇ／ｋｇのＲＡＮＫＬ中和抗体及び３ｍｇ／ｋｇのＰＴＨペプチド（３８アミノ酸副甲状腺ホルモンペプチド）の共投与のうちの１つの、週１回の皮下注射を受ける。４週間目にマウスを屠殺する。

遠位及び中位大腿骨の骨量密度（ＢＭＤ）を、ＡｌｏｋａＬａＴｈｅｔａＬＴＣ−１００モデルＣＴ走査装置を使用する定量的コンピュータ断層撮影法（ｑＣＴ）によって監視する。結果を表５に提供する（ダネット検定を使用し、Ｐ＜０．０５の有意レベルでビヒクル対照と比較した平均差％として提示されるデータ）。

表５に提示される結果は、週１回投与された本発明の例示的な融合化合物が、遠位及び中位大腿骨の両方において、ＲＡＮＫＬ抗体のみで治療されたマウス及びＲＡＮＫＬ抗体とＰＴＨペプチドの共投与で治療されたマウスを超える、ＢＭＤの用量依存的増加を示すことを示す。

卵巣摘出されたマウスモデルにおけるインビボ有効性分析
骨量密度に対するインビボでの効果を、卵巣摘出したマウスモデルを使用して評価する。２０週齢の雌Ｃ５７／Ｂ６マウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を卵巣摘出し（または偽手術した対照群）、１２時間の明／暗サイクルで、２２℃で食餌（０．７２％Ｃａ及び０．６１％Ｐ、Ｖｉｔ．Ｄ０．９９ＩＵ／ｇを含むＴＤ２０１４、Ｔｅｋｌａｄ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））及び水への自由なアクセスにより維持する。骨減少症は、卵巣摘出したマウスを６週間にわたって骨量を喪失させることによって、マウスにおいて確立される。

６週間の骨減少症確立期間に続いて、マウスを治療群またはビヒクルＰＢＳ対照基に分割する。各治療群のマウスは、ａ．）１ｍｇ／ｋｇもしくは３ｍｇ／ｋｇの例示的な融合化合物、ｂ．）３ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇのＲＡＮＫＬ中和抗体（例示的な融合化合物のｍＡｂ部分と同じＨＣ及びＬＣアミノ酸配列を有するＩｇＧ４ＲＡＮＫＬｍＡｂ）、またはｃ．）１０ｍｇ／ｋｇのＲＡＮＫＬ中和抗体及び１０ｍｇ／ｋｇのＰＴＨペプチド（３８アミノ酸副甲状腺ホルモンペプチド）の共投与うちの１つの、週１回の皮下注射を受ける。４週間目にマウスを屠殺する。

第５椎骨の骨格骨量密度（ＢＭＤ）を、屠殺後に、ＡｌｏｋａＬａＴｈｅｔａＬＴＣ−１００モデルＣＴ走査装置を使用する定量的コンピュータ断層撮影法（ｑＣＴ）によって評価する。結果を表６に提供する（ダネット検定を使用し、Ｐ＜０．０５の有意レベルで偽手術した対照群と比較した平均差％として提示されるデータ）。

表６に提示される結果は、週１回投与された本発明の例示的な融合化合物が、ＲＡＮＫＬ抗体のみで治療されたマウス及びＲＡＮＫＬ抗体とＰＴＨペプチドとの共投与で治療されたマウスを超える、椎骨の骨量密度の用量依存的増加を示すことを示す。

精巣摘出したマウスモデルにおけるインビボ有効性分析
骨量密度及び骨塩含量に対するインビボでの効果を、精巣摘出したマウスモデルを使用して評価する。１６週齢の雌Ｃ５７／Ｂ６マウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を精巣摘出し（またはビヒクル対照群、ｎ＝６）、１２時間の明／暗サイクルで、２２℃で食餌（０．７２％Ｃａ及び０．６１％Ｐ、Ｖｉｔ．Ｄ０．９９ＩＵ／ｇを含むＴＤ２０１４、Ｔｅｋｌａｄ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））及び水への自由なアクセスにより維持する。骨減少症は、マウスを６週間にわたって骨量を喪失させることによって、精巣摘出したマウスにおいて確立される。

６週間の骨減少症確立期間に続いて、マウスを治療群またはビヒクルＰＢＳ対照基に分割する。マウスの各治療群は、週１回または週２回のいずれかで（以下の表７に概説されるように）、ａ．）１週間当たり０．５ｍｇ／ｋｇもしくは２．０ｍｇ／ｋｇの例示的な融合化合物、ｂ．）週２回の０．５ｍｇ／ｋｇもしくは２．０ｍｇ／ｋｇの例示的融合化合物、ｃ．）週２回の２ｍｇ／ｋｇのＲＡＮＫＬ中和抗体（例示的な融合化合物のｍＡｂ部分と同じＨＣ及びＬＣアミノ酸配列を有するＩｇＧ４ＲＡＮＫＬｍＡｂ）、ｄ．）１日１回の５μｇ／ｋｇＰＴＨペプチド（３８アミノ酸副甲状腺ホルモンペプチド）、またはｅ．）週２回の２ｍｇ／ｋｇのＲＡＮＫＬ中和抗体と１日１回の５ｍｇ／ｋｇのＰＴＨペプチドの共投与のうちの１つの皮下注射を受ける。２週間目にマウスを屠殺する。

遠位大腿骨の骨量密度（ＢＭＤ）及び腰椎の骨塩含量（ＢＭＣ）を、ＡｌｏｋａＬａＴｈｅｔａＬＴＣ−１００モデルＣＴ走査装置を使用する定量的コンピュータ断層撮影法（ｑＣＴ）によって評価する。結果を表７に提供する（ダネット検定を使用し、Ｐ＜０．０５の有意レベルでビヒクル対照マウスと比較した平均差％として提示されるデータ）。

表７に提示される結果は、本発明の例示的な融合化合物が、ＲＡＮＫＬ抗体のみ及びＰＴＨペプチドのみで治療されたマウスを超える、ＢＭＤ（遠位大腿骨の）及びＢＭＣ（腰椎の）両方の用量依存的増加を示し、ＲＡＮＫＬ抗体及びＰＴＨペプチドの共投与で治療されたマウスに比肩することを示す。

カニクイザルモデルにおけるインビボでの薬力学的効果
血清カルシウム、骨形成バイオマーカーＰ１ＮＰ、骨吸収バイオマーカーＣＴｘ、及び動脈圧に対するインビボでの薬力学的効果を、以下で詳細に記載されるように、カニクイザルモデルを使用して評価する。以下に提示されるデータは、例示的な融合化合物が、ＲＡＮＫＬｍＡｂのみで治療された動物とは異なり、血清骨形成バイオマーカーＰ１ＮＰの（ベースラインに対する）増加を刺激し、ＲＡＮＫＬｍＡｂのみで治療された動物において見られるものと同様のレベルで骨吸収バイオマーカーＣＴｘの（ベースラインに対する）減少を刺激し、対照治療群に対して血清カルシウム濃度に影響を与えず、治療後少なくとも最初の８時間は１０ｍｍＨｇを超える治療群と未治療群との間の動脈圧の平均差を刺激しないことを示す。

カニクイザルモデルにおける血清カルシウム効果
カニクイザルモデルを使用して、血清カルシウムに対する効果を評価する。５〜６歳齢の雌カニクイザルは、０．１ｍｇ／ｋｇの例示的な融合化合物もしくはＰＢＳビヒクル対照、または１．０ｍｇ／ｋｇの例示的な融合化合物もしくはＰＢＳビヒクル対照のいずれかの単一皮下注射を受ける。追加として、２〜３歳齢の雄カニクイザルは、０．１ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇの例示的な融合化合物またはＰＢＳビヒクル対照のいずれかの単一皮下注射を受ける。

血液試料は、投与前、その後１週間は２４時間間隔で各サルの大腿静脈から収集される。収集された各試料の血清カルシウム濃度は、ＲｏｃｈｅＰ８００モジュラー化学分析器（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して分析する。結果を表８に提示する。

表８に提示される結果は、例示的な融合化合物が、対照投与動物に対して、いずれの投与濃度でも雌カニクイザルにおける血清カルシウムレベルに影響を及ぼさないことを示す。表８に提示される結果はまた、例示的な融合化合物が、対照投与動物に対して、０．１ｍｇ／ｋｇで雄カニクイザルにおける血清カルシウムレベルに影響を及ぼさないことを示す。１．０ｍｇ／ｋｇの例示的な融合化合物の濃度で投与されたサルは、対照投与動物に対して、７日目にのみ血清カルシウムの減少を示す（しかしながら８日目に、血清カルシウムレベルは、対照投与動物と同等のレベルに戻っていた）。

カニクイザルモデルにおける骨形成バイオマーカーＰ１ＮＰ効果
血清骨形成バイオマーカーＰ１ＮＰに対する効果を、カニクイザルモデルを使用して評価する。５〜６歳齢の雌カニクイザルは、０．１ｍｇ／ｋｇの例示的な融合化合物もしくはＰＢＳビヒクル対照、または１．０ｍｇ／ｋｇの例示的な融合化合物もしくはＰＢＳビヒクル対照のいずれかの単一皮下注射を受ける。追加として、２〜３歳齢の雄カニクイザルは、０．１ｍｇ／ｋｇもしくは１．０ｍｇ／ｋｇの例示的な融合化合物、０．１ｍｇ／ｋｇもしくは１．０ｍｇ／ｋｇのＲＡＮＫＬ中和抗体（例示的な融合化合物のｍＡｂ部分と同じＨＣ及びＬＣアミノ酸配列を有するＩｇＧ４ＲＡＮＫＬｍＡｂ）、またはＰＢＳビヒクル対照のいずれかの単一皮下注射を受ける。

血液試料は、投与前、その後１週間は２４時間間隔で各サルの大腿静脈から収集される。収集された各試料の血清Ｐ１ＮＰ濃度を、ＵｎｉＱＰ１ＮＰＲＩＡアッセイ（ＯｒｉｏｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して分析する。結果を、ベースラインＰ１ＮＰ濃度（例えば、０日目のＰ１ＮＰ濃度）からの平均変化％として表９に提示する。

表９に提示される結果は、０．１ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇの単一投与後、例示的な融合化合物が（ＲＡＮＫＬｍＡｂのみで治療された動物とは異なり）、対照治療動物に対して、雄サル及び雌サルの両方において、血清Ｐ１ＮＰレベルの用量依存性増加を刺激することを示す。ＲＡＮＫＬｍＡｂのみで治療された動物は、対照治療動物に対して、雄サル及び雌サルの両方における血清Ｐ１ＮＰレベルの減少を示す。

カニクイザルモデルにおける骨吸収バイオマーカーＣＴｘ効果
血清骨吸収バイオマーカーＣＴｘの効果を、カニクイザルモデルを使用して評価する。２〜３歳齢の雄カニクイザルは、０．１ｍｇ／ｋｇもしくは１．０ｍｇ／ｋｇの例示的な融合化合物、０．１ｍｇ／ｋｇもしくは１．０ｍｇ／ｋｇのＲＡＮＫＬ中和抗体（例示的な融合化合物のｍＡｂ部分と同じＨＣ及びＬＣアミノ酸配列を有するＩｇＧ４ＲＡＮＫＬｍＡｂ）、またはＰＢＳビヒクル対照のいずれかの単一皮下注射を受ける。追加として、５〜６歳齢の雌カニクイザルは、０．１ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇいずれかの例示的な融合化合物の単一皮下注射を受ける。

血液試料は、投与前、その後１週間は２４時間間隔で各サルの大腿静脈から収集される。収集された各試料の血清ＣＴｘ濃度を、ＥＬＩＳＡ方法を使用し、製造元（ＩｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）の指示に従って分析する。結果を、血清ＣＴｘ濃度のベースライン（例えば、０日目のＣＴｘ濃度）からの平均変化％として表１０に提示する。

表１０に提示される結果は、０．１ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇのいずれかの例示的な融合化合物の単一投与後、雄サル及び雌サルの両方において、血清ＣＴｘレベルが対照治療サルに対して低減する（及びＲＡＮＫＬｍＡｂのみの治療群と同様のレベルまで低減する）ことを示す。

カニクイザルモデルにおける動脈圧効果
動脈圧に対する効果を、雌カニクイザルモデルを使用して評価する。５〜６歳齢の雌カニクイザルは、０．１ｍｇ／ｋｇもしくは１．０ｍｇ／ｋｇの例示的な融合化合物、またはＰＢＳビヒクル対照のいずれかの単一皮下注射を受ける。平均動脈圧を、注射後の最初の８時間は１時間間隔で各動物について測定する。各動物のベースライン動脈圧を、０時点で測定する。治療群と対照群との間のｍｍＨｇの平均差（ベースライン補正のために調整された）を含む、結果を表１１に提示する。

表１１に提示される結果は、０．１ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇの例示的な融合化合物の単一投与が、治療後最初の８時間は１０ｍｍＨｇを超える治療群と未治療群との間の動脈圧の平均差を刺激しないことを示す（後次の試験は（データ図示せず）、治療群と未治療群との間の平均動脈圧が、投与後少なくとも６９時間は１０ｍｍＨｇを超えないことを示す）。

融合化合物の物理的及び化学的特性分析
融合化合物の溶解度分析
例示的な融合化合物の溶解度を、４週間のインキュベーション期間後、４℃で分析する。溶解度は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ遠心分離フィルターデバイス（品番＃ＵＦＣ８０３０２４）を使用して、１００〜１５０ｍｇ／ｍＬに濃縮された融合化合物で評価する。試料を、３つの緩衝液、（ａ）ｐＨ６．０の１０ｍＭクエン酸塩、（ｂ）ｐＨ６．０の１０ｎＭクエン酸塩＋１５０ｍＭＮａＣｌ、及び（ｃ）ｐＨ７．４のＰＢＳ中で製剤化する。例示的な融合化合物は、全ての製剤について、１１０ｍｇ／ｍＬを超える溶解度を呈した。製剤（ｂ）、ｐＨ６．０の１０ｎＭクエン酸塩＋１５０ｍＭＮａＣｌは、１５０ｍｇ／ｍＬを超える溶解度を呈した。

追加として、製剤化された試料を（ａ〜ｃ、上述の通り）、ＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＳＷ３０００（ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、品番１８６７５）カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、％高分子量（％ＨＭＷ）可溶性凝集体について分析する。試料を、１００ｍｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬの両方でアッセイする。ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎを使用してクロマトグラムを分析し、全ＡＵＣに対する、モノマーピーク前に溶出したピークのＡＵＣの比を用いて％高分子量（ＨＭＷ）を算出する。製剤（ａ）及び（ｂ）の両方は、１００ｍｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬ両方の濃度で、ＨＭＷ可溶性凝集体形成の５％未満の増加を呈した。

低濃度凍結／融解分析
例示的な融合化合物の低濃度凍結／融解分析を、１ｍｇ／ｍＬで濃縮され、１０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ６．０）中で製剤化された融合化合物で、１５０ｍＭのＮａＣｌを有する場合と有しない場合、及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０（それぞれｐＨ５．５及びｐＨ６．０）を有する場合と有しない場合で評価した。３回の凍結／融解サイクル（単一サイクルは、−７０℃で少なくとも４時間のインキュベーション、続いて周囲温度での融解、次いで穏やかな混合を含む）を行い、各試料の粒子成長を、ＨＩＡＣ粒子カウンター（ＰａｃｉｆｉｃＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、品番９７０３）を使用して評価する。％高分子量（％ＨＭＷ）可溶性凝集体もまた、ＳＥＣを使用して評価する。両方の製剤の粒子数（０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０を含有する場合としない場合）は、４００未満である。０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０を有する製剤は、粒子数の低減を示した。追加として、全ての製剤は、ＨＭＷ可溶性凝集体形成の５％未満の増加を呈する。これらの結果は、本発明の例示的な融合化合物が、低濃度条件下で、複数の凍結／融解サイクル後に安定していることを示す。

高濃度物理的安定性分析
例示的な二重特異性抗体の高濃度凍結／融解分析は、５０ｍｇ／ｍＬで濃縮され、１０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ６．０）と１５０ｍＭのＮａＣｌ、または１０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ６．０）、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０と１５０ｍＭのＮａＣｌのいずれかで製剤化された二重特異性抗体で評価する。試料を、４週間、４℃、２５℃でインキュベートするか、または３回の凍結／融解サイクルに供する（単一サイクルは、−７０℃で少なくとも４時間のインキュベーション、続いて周囲温度での融解、次いで穏やかな混合を含む）。それぞれのインキュベーションまたは凍結融解期間に続いて、試料を、ＨＩＡＣ粒子カウンターを使用して粒子成長について、またはＳＥＣを使用して％ＨＭＷ可溶性凝集体について分析する。全ての治療条件下での両方の製剤の粒子数は、１０００未満である。追加として、全ての製剤は、ＨＭＷ可溶性凝集体形成の６．５％未満の増加を呈した。これらの結果は、本発明の例示的な融合化合物が、低濃度条件下で、様々な条件下でのインキュベーション及び複数の凍結／解凍サイクル後に安定していることを示す。

配列

配列番号１−例示的な第１のポリペプチド（表１の例示的な融合化合物の）
ＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＮＹＹＩＥＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＶＩＮＰＧＷＧＤＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＴＡＨＧＹＹＡＬＤＰＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ

配列番号２−例示的な第２のポリペプチド（表１の例示的な融合化合物の）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＷＤＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

配列番号３−例示的な第１のポリペプチド（配列番号１）及びシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列
ＡＧＣＧＴＧＴＣＣＧＡＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＴＧＣＡＣＡＡＣＣＴＣＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＴＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＧＣＧＴＣＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＧＡＡＧＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＴＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＧＣＴＡＣＧＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＴＡＴＡＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＣＡＡＣＣＣＣＧＧＣＴＧＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＣＧＣＧＡＴＡＣＧＧＣＴＣＡＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＣＴＴＧＡＴＣＣＧＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＧＡ

配列番号４−例示的な第２のポリペプチド（配列番号２）及びシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列
ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＴＧＴＧＧＧＣＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣＴＡＡ

配列番号５−例示的なＨＣＶＲ（表１の例示的な融合化合物の）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＮＹＹＩＥＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＶＩＮＰＧＷＧＤＴＮＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＴＡＨＧＹＹＡＬＤＰＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

配列番号６−例示的なＬＣＶＲ（表１の例示的な融合化合物の）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＷＤＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ

配列番号７−例示的なＨＣＤＲ１（表１の例示的な融合化合物の）
ＧＹＡＦＴＮＹＹＩＥ

配列番号８−例示的なＨＣＤＲ２（表１の例示的な融合化合物の）
ＶＩＮＰＧＷＧＤＴＮＹＮＥＫＦＫＧ

配列番号９−例示的なＨＣＤＲ３（表１の例示的な融合化合物の）
ＲＤＴＡＨＧＹＹＡＬＤＰ

配列番号１０−例示的なＬＣＤＲ１（表１の例示的な融合化合物の）
ＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡ

配列番号１１−例示的なＬＣＤＲ２（表１の例示的な融合化合物の）
ＳＡＳＹＲＹＳ

配列番号１２−例示的なＬＣＤＲ３（表１の例示的な融合化合物の）
ＱＱＹＷＤＹＰＬＴ

配列番号１３−表１の例示的な融合化合物の例示的なＰＴＨペプチド
ＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ

配列番号１４−表１の例示的な融合化合物の例示的なリンカー
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ

配列番号１５−完全長ヒト副甲状腺ホルモン
ＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦＶＡＬＧＡＰＬＡＰＲＤＡＧＳＱＲＰＲＫＫＥＤＮＶＬＶＥＳＨＥＫＳＬＧＥＡＤＫＡＤＶＮＶＬＴＫＡＫＳＱ

Claims

第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む化合物であって、
ａ）前記第１のポリペプチドが、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）ペプチド及びｍＡｂＩｇＧ重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＰＴＨペプチドが、配列番号１３によって与えられるアミノ酸配列を有し、前記ＨＣが、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１〜３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を有し、ＨＣＤＲ１が、配列番号７によって与えられるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２が、配列番号８によって与えられるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３が、配列番号９によって与えられるアミノ酸配列を有し、
ｂ）前記第２のポリペプチドが、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１〜３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含むｍＡｂ軽鎖（ＬＣ）を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号１０によって与えられるアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２が、配列番号１１によって与えられるアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３が、配列番号１２によって与えられるアミノ酸配列を有し、
前記ＰＴＨペプチドが、ポリペプチドリンカー（Ｌ１）を介して前記ＨＣに結合し、Ｌ１が、ＨＣのＮ末端及び前記ＰＴＨペプチドのＣ末端に共有結合しており、
ここで前記化合物がＲＡＮＫＬに結合する、化合物。
前記ＨＣＶＲが、配列番号５によって与えられるアミノ酸配列を有し、前記ＬＣＶＲが、配列番号６によって与えられるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の化合物。
Ｌ１が、配列番号１４によって与えられるアミノ酸配列を有する、請求項１または２のいずれかに記載の化合物。
前記第１のポリペプチドが、配列番号１によって与えられるアミノ酸配列を有し、前記第２のポリペプチドが、配列番号２によって与えられるアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
２つの第１のポリペプチド及び２つの第２のポリペプチドを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
請求項６に記載のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を発現することができる、哺乳動物細胞。
前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項７に記載の哺乳動物細胞。
骨粗鬆症、骨減少症、骨形成不全症、移植関連の骨喪失、自己免疫誘導性骨喪失、廃用性骨喪失、変性腰椎すべり症、または変性椎間板疾患のうちの少なくとも１つの治療のための医薬品の製造のための、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物の使用。
請求項１〜５のいずれかに記載の化合物、ならびに１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。