BR112020018868A2 - métodos baseados em anticorpo para detectar e tratar doença de alzheimer - Google Patents

Abstract

“métodos baseados em anticorpo para detectar e tratar doença de alzheimer”. a presente invenção refere-se a anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a tau fosforilada e desfosforilada e métodos de uso na detecção e tratamento da doença de alzheimer e outras tauopatias. também estão incluídos métodos para determinar o estágio da doença de alzheimer em um objeto humano e monitorar a eficácia de uma terapia anti-tau.

Description

Relatório Descritivo da Patente de invenção para “MÉTODOS BASEADOS EM ANTICORPO PARA DETECTAR E TRATAR DOENÇA DE ALZHEIMER”.

CAMPO

[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido U.S. No. 62/649.208 depositado em 28 de março de 2018, Pedido U.S. No. 62/664.662 depositado em 30 de abril de 2018 e Pedido U.S. nº 62/703.299 depositado em 25 de julho de 2018, cada um dos que é incorporado no presente documento por referência em sua totalidade.

[002] Descritos no presente documento, são anticorpos, composições, kits e métodos para a detecção, monitoramento, prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer e outras tauopatias.

ANTECEDENTES E SUMÁRIO

[003] A doença de Alzheimer (AD) é um distúrbio neurodegenerativo progressivo que está associado à destruição de estruturas cerebrais superiores, como aquelas envolvidas na memória e cognição. A doença leva a déficits na função cognitiva e declínios na memória, aprendizagem, linguagem e na capacidade de realizar movimentos intencionais e propositados. AD também é acompanhada por deterioração concomitante de comportamento, emocional, interpessoal e social. Esses déficits cognitivos e comportamentais tornam a vida difícil (Burns et al., Alzheimer’s desease, The Lancet, vol. 360, 13 de julho de 2002). Pacientes em estágio avançado de AD geralmente são incapazes de falar, compreender a linguagem e cuidar de seus próprios cuidados pessoais básicos, eventualmente exigindo cuidados e supervisão em tempo integral, e muitas vezes dependem de familiares e casas de repouso. DA é a principal causa de demência senil, e prevê-se que aumente a prevalência à medida que a proporção de idosos na população aumenta. Prevê-se que o número total de pessoas com DA aumentará pelo menos três vezes entre 2000 e 2050, tornando a DA um problema de saúde pública mundial (Sloane et al., The Public Health Impact of Alzheimer's Disease, 2000-2050: Potential Implication of Treatment Advances, Annu. Rev. Public Health, 23: 213 a 31, 2002). A detecção clínica, o manuseio e o tratamento da DA permanecem amplamente inadequados. Ainda existe uma necessidade não atendida de métodos eficazes para detectar e tratar a DA.

[004] DA foi histologicamente caracterizada patologicamente pela análise de seções do cérebro para identificar a presença de placas extraneuronais e emaranhados neurofibrilares intracelulares e extracelulares no cérebro. As placas são compostas principalmente por β amiloide (Aβ), enquanto os emaranhados compreendem formas patológicas de tau, como conformadores de tau e seus agregados. A relação entre placas e emaranhados e o processo da doença permanece obscura, embora estudos sugiram uma ligação entre a patogênese da amiloide e da tau (Hardy et al., Genetic dissection of Alzheimer’s disease and related dementias: amyloid and its relationship to tau, Nature Neuroscience, vol 1, No. 5, 1998; Oddo et al., Aβ Immunotherapy Leads to Clearance of Early, but Not Late, Hyperphosphorylated Tau Aggregates via the Proteasome, Neuron, 43: 321 a 332, 2004; Rapoport et al., 2002; Roberson, et al., Reducing Endogenous Tau Ameliorates Amyloid β-Induced Deficits in an Alzheimer’s Disease Mouse Model, Science, 316:750, 2007; Shipton et al., Tau Protein Is Required for Amyloid β-Induced Impairment of Hippocampal Long-Term Potentiation, J. Neuroscience, 31(5):1688- 1692, 2011). Um papel central para Aβ na patologia de AD foi inicialmente proposto em uma hipótese chamada "cascata Aβ", em que a deposição de Aβ é seguida por fosforilação de tau e formação de emaranhado e, em seguida, morte neuronal (Hardy and Allsop,

Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer’s disease, TiPS, vol 12, 1991; Hardy and Selkoe, The Amyloid Hypothesis of Alzheimer’s Disease: Progress and Problems on the Road to Therapeutics, Science, vol 297, 2002; para uma revisão vide, Walsh and Selkoe, Deciphering the Molecular Basis of Memory Failure in Alzheimer’s Disease, Neuron, 44:181 a 193, 2004; também vide Seabrook et al., Beyond Amyloid the Next Generation of Alzheimer’s Disease Therapeutics, Molecular Intervention, 7(5), 2007).

[005] Consequentemente, as abordagens terapêuticas para AD geralmente se concentram em direcionamento em Aβ e tau, e muitos estudos sobre esses alvos continuam hoje. As terapias mais avançadas direcionadas à doença submetidas a ensaios clínicos em pacientes com AD incluem imunoterapias passivas, como BAN2401, ADUCANUMAB, GANTENERUMAB e CRENEZUMAB para remoção de Aβ; C2N 8E12, RO 7105705 e BIIB092 visando à proteína tau; e vacina ativa, tal como CAD106, Lu AF20513, ABvac 40, para terapia Aβ ou ACI-35 e AADvac1 para direcionar tau modificada por doença.

[006] Trabalhos recentes levaram a uma série de abordagens terapêuticas que visam direta ou indiretamente à cascata de tau em particular (para artigos de revisão, vide, por exemplo, Dickey e Petrucelli, Pharmacologic reductions of total tau levels; implications for the role of microtubule dynamics in regulating tau expression, Molecular Neurodegeneration, 1:6, 2006; Schneider e Mandelkow, Tau-Based Treatment Strategies in Neurodegenerative Disease, Neurotherapeutics, 5:443-457, 2008; Zilka et al., Chaperone-like Antibodies Targeting Misfolded Tau Protein: New Vistas in the Immunotherapy of Neurodegenerative Foldopathies, Journal of Alzheimer’s Disease, 15:169-177, 2008), incluindo compostos que previnem ou revertem agressão de tau (Wischik et al., Selective inhibition of Alzheimer’s disease-like tau aggregation by phenothiazines, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 93:11213 a 11218, 1996; Necula et al., Cyanine Dye N744 Inhibits Tau Fibrillization by Blocking Filament Extension: Implications for the Treatment of Tauopathic Neurodegenerative Diseases, Biochemistry, 44:10227-10237, 2005; Pickhardt et al., Screening for Inhibitors of Tau Polymerization, Current Alzheimer Research, 2:219-226, 2005; Taniguchi et al., Inhibition of Heparin-induced Tau Filament Formation by Phenothiazines, Polyphenols, and Porphyrins, The Journal of Biological Chemistry, 280:9, 7614-7623, 2005; Larbig et al., Screening for Inhibitors of Tau Protein Aggregation into Alzheimer Paired Helical Filaments: A Ligand Based Approach Results in Successful Scaffold Hopping, Current Alzheimer Research, 4:315-323, 2007) drogas do tipo molécula pequena que inibem tau quinases ou ativam tau fosfatases (Iqbal and Grundke-Iqbal, Inhibition of Neurofibrillary Degeneration: A Promising Approach to Alzheimer’s Disease and Other Tauopathies, Current Drug Targets, 5:495-502, 2004; Noble et al., Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo, PNAS, 102:19, 6990-6995, 2005; Iqbal and Grundke-Iqbal, Developing pharmacological therapies for Alzheimer disease, Cell.

Mol.

Life Sci., 64:2234-2244, 2007), drogas estabilizadoras de microtúbulo (Zhang et al., Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model, PNAS, 102(1): 227-231, 2005), drogas que facilitam a degradação proteolítica de proteína tau desdobradas (Dickey et al., Development of a High Throughput Drug Screening Assay for the Detection of Changes in Tau Levels-Proof of Concept with HSP90 inhibitors, Current Alzheimer Research, 2:231 a 238, 2005, Dickey et al., Pharmacologic reductions of total tau levels; implications for the role of microtubule dynamics in regulating tau expression, Molecular Neurodegeneration, 1:6, 2006), e drogas imunossupressoras (Zilka et al., Chaperon-like Antibodies Targeting Misfolded Tau Protein: New Vistas in the Immunotherapy of Neurodegenerative Foldopathies, Journal of Alzheimer’s Disease, 15:169-177, 2008), bem como estratégias imunoterapêuticas incluindo imunização ativa e passiva (Schneider e Mandelkow et al., Tau-Based Treatment Strategies in Neurodegenerative Diseases, Neurotherapeutics, 5:443-457, 2008; Zilka et al., Chaperon-like Antibodies Targeting Misfolded Tau Protein: New Vistas in the Immunotherapy of Neurodegenerative Foldopathies, Journal of Alzheimer’s Disease, 15:169-177, 2008, Tabira, T. Immunization Therapy for Alzheimer disease: A Comprehensive Review of Active Immunization Strategies. Tohoku J. Exp. Med., 220: 95-106 (2010)). Em adição, pesquisadores focaram em terapias de novos anticorpos monoclonais (mAbs) para tratar AD. Vide, por exemplo, Citron et al., Alzheimer’s disease: strategies for disease modification, Nature Reviews, 9:397, 2010, e Asuni et al., Immunotherapy Targeting Pathological Tau Conformers In a Tangle Mouse Model Reduces Brain Pathology with Associated Functional Improvements, The Journal of Neuroscience, 27(34):9115-9129, 2007, para revisão. Os anticorpos terapêuticos direcionados às formas de doença de tau representam uma abordagem promissora para o tratamento e/ou diagnóstico de AD e outras tauopatias (WO 2004/007547, US2008/0050383).

[007] Apesar deste crescente corpo de pesquisas sobre estratégias terapêuticas para o tratamento de AD e outras tauopatias, permanece uma necessidade não atendida por ferramentas de diagnóstico que possam detectar e distinguir com precisão a AD e outras tauopatias de outras patologias cerebrais em pacientes que apresentam demência, a fim de garantir decisões de tratamento apropriadamente direcionadas, particularmente nos estágios iniciais dos processos da doença Blennow e Hampel, CSF markers for incipient Alzheimer’s disease, Lancet Neurol., 2:605-613, 2003; Blennow, CSF markers for incipient Alzheimer’s disease, Lancet Neurol., 2:605-613, 2005). Esforços significativos foram feitos nas últimas duas décadas para identificar indicadores cerebrais in vivo e biomarcadores baseados em amostras para AD pré-clínica, todos sem muito sucesso. A pesquisa se concentrou principalmente no líquido cefalorraquidiano (CSF) e no sangue, mas nenhum marcador definitivo foi encontrado para detectar e distinguir com precisão os diferentes tipos de demência. Vários biomarcadores no CSF e no sangue, por exemplo, foram amplamente estudados sem melhorias adequadas na precisão da detecção. Estes incluem biomarcadores de neurodegeneração (t-tau, NFL, NSE, VLP-1), metabolismo de APP (Aβ42, Aβ40, Aβ38, sAPPα e sAPPβ), patologia de emaranhado (p- tau), e ativação glial (YKL-40, MCP-1 e GFAP) (Olsson et al., CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer’s disease: a systematic review and meta-analysis, Lancet Neurol., 7:673-84, 2016). Três biomarcadores de CSF foram relatados para uso em comprometimento cognitivo leve prodrômico (LCC e demência AD: CSF Aβ1 a 42 (Aβ1 a 42), também expresso como relação Aβ1 a 42 : Aβ1 a 40, proteínas Thr181 e Thr231 t-tau e p-tau (Cavedo et al., The Road Ahead to Cure Alzheimer’s Disease: Development of Biological Markers and Neuroimaging Methods for Prevention Trials Across all Stages and Target Populations, J. Prev. Alzheimer’s Dis., 3:181 a 202, 2014). No entanto, a detecção precisa de AD em estágio inicial e métodos para distinguir a AD de outras tauopatias ou outras causas de demência em pacientes continua a ser um desafio, particularmente para ensaios baseados no CSF.

[008] A pesquisa sugeriu que diferentes epítopos fosforilados de tau, incluindo treonina 181, treonina 181 e 231, treonina 231, treonina 231 e 235, serina 199, serina 396 e 404, podem se correlacionar com

AD, embora com alguns relatórios contraditórios. (Andreasen et al., Cerebrospinal fluid levels of total-tau, phospho-tau and A beta 42 predicts development of Alzheimer's disease in patients with mild cognitive impairment, Acta Neurol.

Scand.

Suppl., 179:47-51, 2003; Formichi et al., Cerebrospinal fluid tau, A beta, and phosphorylated tau protein for the diagnosis of Alzheimer's disease, J.

Cell Physiol., 208:39-46, 2006; Blennow e Hampel, CSF markers for incipient Alzheimer's disease, Lancet Neurol., 2:605-613, 2003). Por exemplo, foi sugerido que a avaliação repetida de p-tau181 em CSF não forneceu um biomarcador clínico útil porque era insensível à progressão da doença ao longo de um período de 2 anos (Bouwman et al., Longtitudinal changes of CSF biomarkers in memory clinic patients, Neurology, 69:1006-1011, 2007). O poder preditivo dos biomarcadores tau e Aβ no CSF e sua dinâmica ao longo do tempo, portanto, permanece controverso.

A capacidade limitada de até mesmo detectar esses biomarcadores no CSF aumenta ainda mais os desafios no diagnóstico de AD.

Vários estudos, por exemplo, descreveram alterações longitudinais dos níveis de Aβ42, t-tau e p-tau em CSF em pacientes com AD (Andersson et al., Neurobiol Aging, 29:1466-1473, 2008; Blomberg et al., Neurosci.

Lett., 214:163-166, 1996; Arai et al., JAGS, 45:1228-31, 1997; Kanai et al., Ann.

Neurol., 44:17 a 26; Kanai et al., Neurosci.

Lett., 267: 65-68, 1999; Hampel et al., Ann Neurol., 49:545 a 546, 2001; Hoglund et al., Dement.

Geriatr.

Cogn.

Disord., 19:256-265, 2005), enquanto outros não relataram mudanças significativas nestes biomarcadores de CSF ao longo do tempo (Nishimura et al., Methods Find.

Exp.

Clin.

Pharmacol., 20:227- 235, 1998; Andreasen et al., Arch.

Neurol., 56:673-680, 1999; Sunderland et al., Biol.

Psychiatry, 46:750 a 755, 1999; Tapiola et al., Neurosci.

Lett., 280:119-122, 2000; deLeon et al., Neurobiol.

Aging, 27:394-401, 2006; Mollenhauer et al., J.

Neural.

Transm., 112:933-948,

2005; Zetterberg et al., Alzheimers Res. Ther., 5(2):9, 2007; Mattsson et al., J. Alzheimers Dis., 30(4):767-778, 2012; Toledo et al., Acta Neuropathol. 125(5):659-70, 2013). A razão pela qual os biomarcadores de CSF não parecem refletir a progressão da doença em alguns pacientes ao longo do tempo não é conhecida. Uma possibilidade é que as proteínas derivadas do cérebro sejam diluídas no compartimento do CSF (deLeon et al., Longitudinal cerebrospinal fluid tau load increases in mild cognitive impairment, Neurosci Lett., 333:183-186, 2004). Outra explicação potencial é que os indivíduos mais velhos sem demência (acima de 65 anos) tendem a ter níveis de p-tau mais altos do que os mais jovens e, portanto, a elevação do biomarcador com a progressão da doença é mascarada nos indivíduos mais velhos sem demência (Bouwman et al., CSF biomarker levels in early and late onset alzheimer’s disease, Neurobiol Aging, 30:1895- 1901, 2008). Esses e outros fatores contribuem para a falta de um ensaio eficaz baseado em CSF.

[009] Os ensaios disponíveis usados para detectar biomarcadores de CSF se concentram quase exclusivamente em imunoensaios envolvendo um formato clássico de ELISA, e entre eles estão INNOTEST hTAU, INNOTEST fosfo-Tau (que reconhece fosfo- treonina 181) e INNOTEST Aβ42. A especificidade e a sensibilidade desses ensaios, no entanto, geralmente não são suficientes para prever a doença de Alzheimer, especialmente em seus estágios pré- clínicos (Wennström et al., The Inflammatory Marker YKL-40 Is Elevated in Cerebrospinal Fluid from Patients with Alzheimer's but Not Parkinson's Disease or Dementia with Lewy Bodies, 10(8): e0135458, PlosOne, 2015; Wang et al., Analysis of Cerebrospinal Fluid and [11C]PIB PET Biomarkers for Alzheimer's Disease with Updated Protocols, 52(4):1403-13, JAD 2016).

[010] Além dos ensaios de diagnóstico baseados em amostra, os avanços na imagem molecular nos últimos anos levaram ao trabalho em potenciais traçadores específicos de tau para tomografia por emissão de pósitrons (PET). Três famílias de radiotraçadores foram desenvolvidas como traçadores tau PET: os derivados de ariquinolina THK5117 e THK5351, o derivado de pirido-indol AV-1451 (também conhecido como T807 e Flortaucipir) e o derivado de fenil/piridinil- butadienil benzotiazol/benzotiazólio PBB3 (Saint-Aubert et al., Tau PET imaging: present and future directions, Mol. Neurodegener., 12:19, 2017). Uma vez que os traçadores de tau PET exibiram ligação fora do alvo, reconhecendo principalmente a enzima MAO B ou neuromelanina (Barrio et al., The Irony of PET Tau Probe Specificity, J. Nucl. Med., 59(1):115-116, 2018; Lemoine et al., Comparative binding properties of the tau PET tracers THK5117, THK5351, PBB3, and T807 in postmortem Alzheimer brains, Alzheimers Res. Ther., 9(1):96, 18 2017; Ng et al., Monoamine oxidase B inhibitor, selegiline, reduces F- THK5351 uptake in the human brain, Alzheimers Res. Ther., 9(1):25, 2017), 2ª geração de traçadores tau PET foram desenvolvidos: PI- 2620, MK-6240, GTP1 e RO6958948 (www.alzforum.org). No entanto, a ligação inespecífica a múltiplos alvos de tecido ainda está presente em alguns traçadores recentemente desenvolvidos, sugerindo espaço para técnicas aprimoradas (The 12th Human Amyloid Imaging, Miami, Flórida, EUA 2018).

[011] Os resultados de vários estudos neuropatológicos mostraram que a quantidade de patologia tau no cérebro dos pacientes está fortemente correlacionada com a progressão da AD. O padrão de localização anatômica das lesões tau pode corresponder aos domínios da cognição afetados ao longo do curso da doença de Alzheimer e ao padrão e grau de atrofia cerebral (Braak e Braak, Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes, Acta Neuropathol, 82:239-59, 1991; Murray et al., Neuropathologically defined subtypes of Alzheimer's disease with distinct clinical characteristics: a retrospective study, Lancet Neurol., (9):785-96, 2011; Nelson et al., Correlation of Alzheimer disease neuropathologic changes with cognitive status: a review of the literature, J. Neuropathol. Exp. Neurol., 71:362-81, 2012). Da mesma forma, vários estudos de imagem independentes revelaram que a distribuição do sinal de tau PET pode estar correlacionada com declínio cognitivo (Ossenkoppele et al., Tau PET patterns mirror clinical and neuroanatomical variability in Alzheimer's disease, Brain, 139:1551 a 67, 2016; Bejanin et al., Tau pathology and neurodegeneration contribute to cognitive impairment in Alzheimer's disease, Brain, 140(12):3286-3300, 2017; Mattsson et al., AV-1451 and CSF T-tau and P-tau as biomarkers in Alzheimer's disease, EMBO Mol. Med., 9:1212-1223, 2017; Mattsson et al., Comparing 18F-AV-1451 with CSF t-tau and p-tau for diagnosis of Alzheimer disease, Neurology, 5:e388-e395, 2018). Consequentemente, o desenvolvimento de reagentes e métodos melhorados para imagiologia PET de tau no cérebro podem ajudar a melhorar a precisão do diagnóstico e o monitoramento de pacientes com DA ao longo do tempo. Embora os biomarcadores de tau de CSF sejam principalmente úteis como biomarcador de estado de doença, a imagiologia de tau PET também pode ser útil no monitoramento da progressão de AD, como a transição do estágio prodrômico para demência (Mattsson et al., Comparing 18F-AV-1451 with CSF t-tau and p-tau for diagnosis of Alzheimer disease, Neurology, 5:e388-e395, 2018). Mas, dada a natureza invasiva e radioativa dos agentes de imagiologia cerebral, um ensaio não invasivo baseado em CSF com maior precisão e especificidade para AD seria benéfico.

[012] Os biomarcadores atualmente disponíveis, no entanto, exibem várias limitações no uso clínico. Foi demonstrado que os níveis de tau total, p-tau e Aβ42 no CSF se sobrepõem consideravelmente entre os casos de doença e controle (Hulstaert et al., Improved discrimination of AD patients using beta-amyloid(1–42) and tau levels in CSF, Neurology, 52:1555-1562, 1999; Hu et al., Levels of nonphosphorylated and phosphorylated tau in cerebrospinal fluid Alzheimer's disease patients: an ultrasensitive bienzyme-substrate- recycle enzyme-linked immunosorbent assay, Am. J. Pathol., 160:1269-1278, 2002). A heterogeneidade da doença é considerada a principal causa da sobreposição nos biomarcadores do CSF (Iqbal et al., Subgroups of Alzheimer's disease based on cerebrospinal fluid molecular markers, 58:748-757, 2005). Na imagem de tau PET, o desafio crítico para o desenvolvimento de novos radiotraçadores direcionados a tau é superar a ligação não específica (Barrio et al., The Irony of PET Tau Probe Specificity, J. Nucl. Med., 59:115-116, 2018; Lemoine et al. Comparative binding properties of the tau PET tracers THK5117, THK5351, PBB3, and T807 in postmortem Alzheimer brains, Alzheimers Res. Ther., 9(1):96 , 2017; Ng et al., Monoamine 18 oxidase B inhibitor, selegiline, reduces F-THK5351 uptake in the human brain, Alzheimers Res. Ther., 9(1):25. 2017). Além disso, relatórios recentes mostraram que as conformações tau patológicas são diversas, dependendo de várias tauopatias humanas, e os ligandos de tau têm afinidade de ligação diferencial para as várias entidades patológicas de tau (Choi et al., Development of tau PET Imaging Ligands and their Utility in Preclinical and Clinical Studies, 52(1):24-30, 2018). Assim, outro desafio é melhorar a potência de ligação a várias lesões patológicas de tau, a fim de utilizá-las para o diagnóstico de múltiplas tauopatias humanas.

[013] O recente desenvolvimento de tratamentos mais poderosos visando à AD enfatiza a necessidade de detectar com precisão a AD em um estágio inicial e distingui-la de outras formas de demência em pacientes. Biomarcadores eficazes, se disponíveis, também seriam úteis para estratificação do paciente e monitoramento longitudinal da progressão da doença, uma vez que a quantidade relativa de placas e emaranhados pode mostrar uma diferença marcante entre os pacientes com AD em diferentes estágios da doença. A estratificação de pacientes com base em dados de biomarcadores também pode ser uma forma de identificar subgrupos de pacientes mais propensos a responder à terapia. (Hampel et al., Perspective on future role of biological markers in clinical therapy trials of Alzheimer's disease: a long-range point of view beyond 2020, Biochem. Pharmacol., 88(4):426-46, 2014).

[014] Por conseguinte, são descritos no presente documento anticorpos, composições, kits e métodos que fornecem detecção, monitoramento, prevenção e/ou tratamento melhorados da doença de Alzheimer e outras tauopatias.

[015] Em várias modalidades, a presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode se ligar a um epítopo fosforilado em tau. Em algumas modalidades, as espécies de tau com esse epítopo fosforilado estão presentes em uma amostra (por exemplo, sangue ou CSF) de um paciente com AD em uma concentração maior do que em um paciente com outra tauopatia ou em um objeto saudável.

[016] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 8.

[017] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo no presente documento descrito pode se ligar a um epítopo na proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9), em que o epítopo é fosforilado. O epítopo pode compreender um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o epítopo compreende um ou mais dos resíduos 210- 221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). Em certas modalidades, o epítopo compreende pelo menos um resíduo fosforilado. Em certas modalidades, o epítopo compreende mais de um resíduo fosforilado. O resíduo (s) fosforilado pode compreender uma fosfo-treonina na posição 217 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, o epítopo também compreende uma serina fosforilada na posição 210, treonina na posição 212, serina na posição 214 ou treonina na posição 220 da proteína tau 2N4R ou qualquer combinação das mesmas. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode se ligar a um epítopo compreendendo ou consistindo em SRTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO: 12).

[018] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo no presente documento descrito pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o epítopo compreende um ou mais dos resíduos 210- 221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). Em certas modalidades, o epítopo compreende pelo menos um resíduo fosforilado, em que pelo menos um resíduo fosforilado pode ser uma fosfo-treonina na posição 217 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, o epítopo também compreende uma serina fosforilada na posição 210, treonina na posição 212, serina na posição 214 ou treonina na posição 220 da proteína tau 2N4R ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode se ligar a um epítopo compreendendo ou consistindo em SRTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO: 12).

[019] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo no presente documento descrito pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 151 a 188 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 13). Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode se ligar a um epítopo compreendendo um ou mais dos resíduos 163-172 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 14). O epítopo pode compreender KGQANATRIP (sequência de SEQ ID NO: 14). Em outra modalidade, o anticorpo é DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que DC2E7 é um anticorpo produzido por um hibridoma depositado sob o Depósito de Patentes do Catálogo de Culturas do Tipo Americanas No. PTA-124992.

[020] Em outra modalidade, é descrito no presente documento o anticorpo DC2E2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que DC2E2 é um anticorpo produzido por um hibridoma depositado sob o Depósito de Patentes do Catálogo de Culturas do Tipo Americanas No. PTA-124991.

[021] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento é conjugado a um segundo agente. Em algumas modalidades, o agente é pelo menos um marcador detectável ou pelo menos um agente terapêutico para AD ou outra tauopatia. Em certas modalidades, o agente é um radiomarcador.

[022] Também são descritos no presente documento métodos de tratamento, retardamento da progressão ou prevenção da progressão da AD ou outra tauopatia em um objeto. Em algumas modalidades, o método compreende administrar ao objeto uma quantidade eficaz de pelo menos um anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades descritas precedentemente. Em algumas modalidades, o método compreende a detecção de DA usando um ou mais dos anticorpos descritos ou fragmentos de ligação ao antígeno antes de administrar ou recomendar a administração de um tratamento de AD adequado. Em algumas modalidades, o método compreende administrar um tratamento de AD a um paciente que foi diagnosticado como portador de AD usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento.

[023] Em várias modalidades, um método para detectar uma tauopatia em um objeto compreende: obter uma amostra biológica do objeto; contatar a amostra do objeto com uma quantidade eficaz de uma molécula que é capaz de formar um complexo com tau (por exemplo, usando pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento que é capaz de se ligar a tau para formar um complexo tau-anticorpo); detectar a presença e/ou quantidade do complexo tau-molécula usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito, em que a presença e/ou quantidade do complexo tau-molécula indica uma tauopatia no objeto. Em algumas modalidades, a molécula que forma um complexo tau-molécula é um primeiro anticorpo que pode se ligar a tau para formar um complexo tau-anticorpo e em que a presença do complexo tau-anticorpo é detectada usando um segundo anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno, que pode ligar um epítopo diferente em tau do que o primeiro anticorpo. Em certas modalidades, o primeiro ou segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno está ligado (por exemplo, revestido covalentemente ou não covalentemente) a uma superfície sólida ou partícula. Em algumas modalidades, o primeiro ou o segundo anticorpo é conjugado a um marcador detectável. O método descrito pode compreender um ELISA clássico, ensaio ELISA digital ou outros formatos de ensaio ELISA, por exemplo, usando qualquer um ou mais dos anticorpos ou fragmentos no presente documento descritos que se ligam a tau fosforilada e podem detectar a presença e/ou quantidade de tau fosforilada na amostra, em que um nível aumentado de tau fosforilada na amostra indica que o objeto tem a doença de Alzheimer em vez de outra tauopatia. Em certas modalidades, a amostra biológica é fluido cerebroespinhal. Em certas modalidades, a amostra biológica é soro e/ou plasma.

[024] Em várias modalidades, um método para distinguir a doença de Alzheimer de outra tauopatia ou outra causa de demência em um objeto compreende: obter um fluido cerebroespinhal ou amostra de sangue de um objeto, contatar a amostra com um anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo no presente documento descrito, e detectar a presença e/ou quantidade de tau fosforilada complexada com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno na mesma amostra, em que a presença e/ou um nível elevado de tau fosforilada na amostra em relação ao nível em uma amostra de um objeto de controle saudável ou em que um nível elevado de tau fosforilada acima de um limite indica que o objeto tem doença de Alzheimer em vez de outra tauopatia ou uma causa alternativa (ou seja, outra forma de) demência ou outro distúrbio neurodegenerativo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 que é capaz de se ligar a tau fosforilada para formar um complexo tau fosforilada-anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[025] Em várias modalidades, um método para detectar doença de Alzheimer (AD) ou comprometimento cognitivo leve (LCC) em um objeto compreende: contatar uma amostra biológica do objeto com uma quantidade eficaz de uma molécula que é capaz de formar um complexo com tau (por exemplo, usando pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito que é capaz de se ligar a tau para formar um complexo tau-anticorpo); detectar a presença e/ou quantidade do complexo tau-anticorpo; e comparar a presença/quantidade de tau ligada ao anticorpo na amostra com a quantidade em uma amostra de controle ou um limite, em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de tau complexada com o anticorpo em relação à amostra de controle ou limite indica AD ou LCC no objeto. Em algumas modalidades, LCC é um precursor de AD em um paciente. Em algumas modalidades, o método distingue LCC e/ou AD de outras doenças neurológicas. Em algumas modalidades, as outras doenças neurológicas são selecionadas a partir de doença de Parkinson, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica e/ou demência frontotemporal. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende líquido cefalorraquidiano (CSF). Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende sangue. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende frações de plasma e/ou soro. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 9,3 pg/ml de tau ou cerca de 5,3 pg/ml de tau. Em algumas modalidades, o limite é entre cerca de 100- 600 pg/ml. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 300 pg/ml.

[026] Em várias modalidades, um método para detectar doença de Alzheimer (AD) ou comprometimento cognitivo leve (LCC) em um objeto compreende: obter uma amostra biológica; detectar a presença e/ou quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada pelo menos na posição treonina 217 na amostra biológica; e comparar a presença/quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada na treonina 217 com a quantidade em uma amostra de controle ou um limite, em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de proteína tau 2N4R fosforilada na treonina 217 em relação à amostra de controle ou limite indica AD ou LCC no objeto. Em várias modalidades, o LCC é um precursor de AD em um paciente. Em algumas modalidades, o método distingue LCC e/ou AD de outras doenças neurológicas. Em algumas modalidades, a outra doença neurológica é selecionada a partir de doença de Parkinson, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica e/ou demência frontotemporal. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende líquido cefalorraquidiano (CSF). Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende sangue. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende frações de plasma e/ou soro. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 9,3 pg/ml de tau. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 9,3 pg/ml de tau ou cerca de 5,3 pg/ml de tau. Em algumas modalidades, o limite é entre cerca de 100-600 pg/ml. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 300 pg/ml.

[027] Em várias modalidades, um método para distinguir a doença de Alzheimer e/ou comprometimento cognitivo leve da doença de Parkinson, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica e/ou demência frontotemporal em um objeto compreende: contatar uma amostra biológica do objeto com uma quantidade eficaz de uma molécula que é capaz de formar um complexo com tau (por exemplo, usando pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno no presente documento descrito que é capaz de se ligar a tau para formar um complexo tau-anticorpo); e detectar a presença e/ou quantidade de tau complexada com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno na mesma amostra; e comparar a presença/quantidade de tau ligada ao anticorpo na amostra com a quantidade em uma amostra de controle ou um limite, em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de tau complexada com o anticorpo em relação à amostra de controle ou limite indica doença de Alzheimer e/ou comprometimento cognitivo leve (LCC) no objeto. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende líquido cefalorraquidiano (CSF). Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende sangue. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende frações de plasma e/ou soro. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 9,3 pg/ml de tau. Em algumas modalidades, o limite é entre cerca de 100-600 pg/ml. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 300 pg/ml.

[028] Em várias modalidades, um método para distinguir a doença de Alzheimer e/ou comprometimento cognitivo leve da doença de Parkinson, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica e/ou demência frontotemporal em um objeto compreende: obter uma amostra biológica do objeto; detectar a presença e/ou quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada pelo menos na posição treonina 217 na amostra biológica; comparar a presença/quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada na treonina 217 com a quantidade em uma amostra de controle ou um limite, em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de proteína tau 2N4R fosforilada na treonina 217 em relação à amostra de controle ou limite indica doença de Alzheimer ou comprometimento cognitivo leve no objeto. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende líquido cefalorraquidiano (CSF). Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende sangue. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende frações de plasma e/ou soro. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 9,3 pg/ml de tau. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 9,3 pg/ml de tau ou cerca de 5,3 pg/ml. Em algumas modalidades, o limite é entre cerca de 100-600 pg/ml. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 300 pg/ml.

[029] Em várias modalidades, um método para prever a probabilidade de um paciente com deficiência cognitiva leve desenvolver a doença de Alzheimer compreende: contatar uma amostra biológica do objeto com uma quantidade eficaz de uma molécula que é capaz de formar um complexo com tau (por exemplo, usando pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito que é capaz de se ligar a tau para formar um complexo tau-anticorpo); e detectar a presença e/ou quantidade de tau complexada com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno na mesma amostra; e comparar a presença/quantidade de tau ligada ao anticorpo na amostra com a quantidade em uma amostra de controle ou limite, em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de tau complexada com o anticorpo em relação à amostra de controle ou limite indica um aumento da probabilidade do paciente desenvolver a doença de Alzheimer. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende líquido cefalorraquidiano (CSF). Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende sangue. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende frações de plasma e/ou soro. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 9,3 pg/ml de tau. Em algumas modalidades, o limite é entre cerca de 100-600 pg/ml. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 300 pg/ml.

[030] Em várias modalidades, um método para prever a probabilidade de um paciente com deficiência cognitiva leve desenvolver a doença de Alzheimer compreende: obter uma amostra biológica do objeto; detectar a presença e/ou quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada pelo menos na posição treonina 217 na amostra biológica; comparar a presença/quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada na treonina 217 com a quantidade em uma amostra de controle ou um limite, em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de proteína tau 2N4R fosforilada na treonina 217 em relação à amostra de controle ou limite indica uma probabilidade aumentada de o paciente desenvolver a doença de Alzheimer. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende líquido cefalorraquidiano (CSF). Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende sangue. Em algumas modalidades, a amostra biológica compreende frações de plasma e/ou soro. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 9,3 pg/ml de tau. Em algumas modalidades, o limite é entre cerca de 100-600 pg/ml. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 300 pg/ml.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[031] Os desenhos anexos, que são incorporados e constituem uma parte desta especificação, ilustram várias modalidades não limitativas da invenção e, juntamente com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção.

[032] Fig. 1. Determinação do isótipo para o anticorpo monoclonal DC2E2 usando ELISA.

[033] Figs. 2A-2D. Mapeamento de epítopos do anticorpo DC2E2 usando mutantes de deleção tau e peptídeos tau em ELISA. (Fig. 2A), Ilustração esquemática de mutantes de deleção de tau e peptídeos usados para avaliar o sítio de ligação de DC2E2 na proteína tau. (Fig. 2B) Imunorreatividade de DC2E2 para seis isoformas humanas por ELISA. (Fig. 2C), Determinação do sítio de ligação de DC2E2 usando mutantes de deleção de tau por ELISA. (Fig. 2D), Determinação do sítio de ligação de DC2E2 usando peptídeos derivados de tau por ELISA competitivo.

[034] Fig. 3. Imunorreatividade de DC2E2 a diferentes proteínas tau. Pista 1: tau insolúvel em sarcosila isolada de tecido cerebral com doença de Alzheimer humana; pista 2: tau151 a 391; pista 3: tau151 a 391 fosforilada; pista 4: tau 2N4R; pista 5: tau 2N4R fosforilada.

[035] Fig. 4. Determinação do isótipo de anticorpo monoclonal DC2E7 usando ELISA.

[036] Fig. 5A-D. As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos das regiões variáveis no anticorpo DC2E2. Fig. 5A mostra a sequência de nucleotídeos que codifica a região variável de cadeia leve. Fig. 5B mostra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve, com as sequências CDR apresentadas em negrito e sublinhado. Fig. 5C mostra a sequência de nucleotídeos que codifica a região variável de cadeia pesada. Fig. 5D mostra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada, com as sequências CDR em negrito e sublinhado. As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) foram identificadas de acordo com o sistema de numeração IMGT.

[037] Fig. 6A-D: As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos das regiões variáveis no anticorpo DC2E7. Fig. 6A mostra a sequência de nucleotídeos que codifica a região variável de cadeia leve. Fig. 6B mostra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve, com sequências de CDR em negrito e sublinhado. Fig. 6C mostra a sequência de nucleotídeos que codifica a região variável de cadeia pesada. Fig. 6D mostra a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada, com as sequências CDR em negrito e sublinhado. As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) foram identificadas de acordo com o sistema de numeração IMGT.

[038] Fig. 7. Imunorreatividade de DC2E7 a diferentes proteínas tau. Pista 1: tau 2N4R; pista 2: 2N4R fosforilada in vitro; pista 3: tau fetal; pista 4: tau insolúvel em sarcosila isolada do tecido cerebral com doença de Alzheimer humana. DC25, um anticorpo monoclonal pan tau que reconhece todas as formas de proteínas tau, foi usado como controle.

[039] Fig. 8. Ilustração esquemática de mutantes de deleção de tau usados para avaliar o sítio de ligação de DC2E7 na proteína tau.

[040] Fig. 9. Determinação do sítio de ligação de DC2E7 na proteína tau por imunoblotting usando mutantes de deleção de tau.

[041] Fig. 10. Ilustração esquemática de sítios de fosforilação potenciais em tau na região 188-227.

[042] Fig. 11. Determinação do sítio de ligação de DC2E7 na proteína tau por imunotransferência usando mutantes pontuais de tau. Mab DC25 foi usado como um controle para medir a extensão da fosforilação de mutações pontuais.

[043] Fig. 12. Determinação do epítopo DC2E7 na proteína tau por ELISA competitiva usando peptídeos derivados de tau.

[044] Fig. 13. Ligação de anticorpos DC2E7 e DC2E2 na doença de Alzheimer (hipocampo CA1), FTD - doença de Pick (giro dentado, hipocampo), CBD (núcleo caudado) e PSP (putâmen/núcleo caudato) seções cerebrais. O anticorpo monoclonal AT8 foi usado como controle. Barra de ferramentas de 100 µm.

[045] Fig. 14. Ligação dos anticorpos DC2E7 e DC2E2 em seções cerebrais de Braak estágio 1, Braak estágio 3 e Braak estágio

6. Barra de ferramentas de 100 µm.

[046] Fig. 15. Ligação de anticorpos DC2E7 e DC2E2 em seções cerebrais da doença de Alzheimer (hipocampo CA1), corpos de Pick em FTD - doença de Pick (giro dentado, hipocampo) e corpos enrolados e patologia astrocítica em CBD (núcleo caudatus). Barra de ferramentas de 20 µm.

[047] Fig. 16. Curva de calibração exemplar para o ensaio ELISA digital DC2E7.

[048] Fig. 17A-B. Experimento de recuperação de pico usando três CSFs humanos de objetos saudáveis. (Fig. 17A), Concentrações estimadas do calibrador DC2E7 incrementado no CSF humano. (Fig. 17B), Recuperação em % do calibrador DC2E7 incrementado em CSF humano.

[049] Fig. 18. Resultados do ELISA digital DC2E7 de amostras de controle e AD.

[050] Fig. 19. Resultados do ELISA digital DC2E7 de amostras de AD e outras tauopatias.

[051] Fig. 20: ligação de DC2E7 a espécies de tau insolúveis em

AD e outras tauopatias humanas.

[052] Fig. 21: Uma comparação de amostras de CSF de indivíduos com AD e FTD usando ensaios de tau pT217 e tau pT181.

[053] Fig. 22: Uma comparação de amostras de CSF de indivíduos com AD e controles usando os ensaios de tau pT217 e tau pT181.

[054] Fig. 23A-B: Uma comparação de amostras de CSF de objetos de controle, LCC e AD usando ensaios de tau pT217 (Fig. 23A). Uma comparação de amostras de CSF de indivíduos de controle, AD, PD, MS, ALS e FTD usando ensaios de tau pT217 (Fig. 23B).

[055] Fig. 24: Absorção de fragmentos de anticorpo scFV isolados derivados de DC2E7.

[056] Fig. 25A-D: Alinhamento de sequências de aminoácidos de fragmentos de anticorpo scFV derivados de DC2E7. Fig. 25A mostra os domínios variáveis de cadeia leve do anticorpo scFV em comparação com a sequência DC2E7. Fig. 25B mostra os domínios variáveis de cadeia pesada do anticorpo scFV em comparação com a sequência DC2E7. Fig. 25C mostra os domínios variáveis de cadeia leve dos fragmentos de anticorpo scFV que exibiram maior afinidade em comparação com DC2E7. Fig. 25D mostra os domínios variáveis de cadeia pesada dos fragmentos de anticorpo scFV que exibiram maior afinidade em comparação com DC2E7. Os resíduos idênticos à sequência de DC2E7 são representados por pontos. As CDRs foram identificadas de acordo com o sistema de numeração IMGT.

[057] Fig. 26: Comparação da afinidade dos anticorpos DC2E7 e DC149 para o peptídeo 2E7pep derivado de tau.

[058] Fig. 27A-B: Alinhamento de sequências de aminoácidos de DC2E7 e DC149. Fig. 27A mostra o domínio de cadeia leve variável DC149 em comparação com a sequência de cadeia leve DC2E7. Fig.

27B mostra o domínio variável de cadeia pesada DC149 em comparação com a sequência da cadeia pesada DC2E7. Os resíduos idênticos à sequência de DC2E7 são representados por pontos. As CDRs foram identificadas de acordo com o sistema de numeração IMGT.

[059] Fig. 28A-B: Alinhamento das sequências de aminoácidos de DC2E7 e DC807. Fig. 28A mostra o domínio de cadeia leve variável de DC807 em comparação com a sequência de cadeia leve de DC2E7. Fig. 28B mostra o domínio de cadeia pesada variável DC807 em comparação com a sequência da cadeia pesada DC2E7. Os resíduos idênticos à sequência de DC2E7 são representados por pontos. As CDRs foram identificadas de acordo com o sistema de numeração IMGT.

[060] Fig. 29: A distribuição de pT217 tau medida por um ensaio ELISA digital de tau pT217 em amostras da doença de Alzheimer, outras tauopatias e indivíduos de controle usando um calibrador de tau fosforilada (painel esquerdo) e calibrador de peptídeo 2E7 (2E7pep) (painel direito).

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[061] A fim de entender melhor a invenção, certas definições são fornecidas primeiro.

[062] O termo "afinidade" se refere à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A afinidade de uma molécula X por seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação de equilíbrio (KD) (ou sua constante de associação de equilíbrio inversa, KA). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles no presente documento descritos. Vide, por exemplo, Pope M.E., Soste M.V., Eyford B.A., Anderson N.L., Pearson T.W., (2009) J. Immunol. Methods. 341(1 a 2):86-96 e métodos no presente documento descritos.

[063] O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos de ocorrência natural, modificados e sintéticos, bem como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de maneira similar aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidroxiprolina, gama-carboxiglutamato e O-fosfoserina. Os análogos de aminoácidos referem-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica de um aminoácido de ocorrência natural, ou seja, um carbono alfa que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Esses análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou estruturas peptídicas modificadas, mas mantêm a mesma estrutura química básica de um aminoácido de ocorrência natural. Miméticos de aminoácidos referem-se a compostos químicos que possuem uma estrutura diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funcionam de maneira similar a um aminoácido de ocorrência natural. Os aminoácidos adequados incluem, sem limitação, ambos os isômeros D e L dos 20 aminoácidos comuns de ocorrência natural encontrados em peptídeos, bem como os aminoácidos de ocorrência natural e não natural preparados por síntese orgânica ou outras vias metabólicas. Exemplos de tais aminoácidos de ocorrência não natural incluem, mas não estão limitados a, N-acetilglucosaminil-L-serina, N- acetilglucosaminil-L-treonina e O-fosfotirosina. Os aminoácidos modificados incluem, mas não estão limitados a, hidroxiprolina,

piroglutamato, gama-carboxiglutamato, O-fosfoserina, ácido azetidinocarboxílico, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido aminopropriônico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4- aminobutírico, ácido 6-aminocapróico, ácido 2-aminoheptanóico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, butilglicina terciária, ácido 2,4-diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropriônico, N-etilglicina, N- metilglicina, N-etilasparagina, homoprolina, hidroxilisina, alo- hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo- isoleucina, N-metilalanina, N-metilglicina, metilisoleucina, N- metilpentilglicina, N-metilvalina, naftalanina, norvalina, norleucina, ornitina, pentilglicina, ácido pipecólico e tioprolina. O termo aminoácido também inclui aminoácidos de ocorrência natural que são metabólitos em certos organismos, mas não são codificados pelo código genético para incorporação em proteínas. Esses aminoácidos incluem, mas não estão limitados a, ornitina, D-ornitina e D-arginina.

[064] O termo "anticorpo" refere-se a uma imunoglobulina, seja ela geneticamente modificada, natural ou produzida total ou parcialmente sintética ou recombinantemente. Os anticorpos intactos tipicamente compreendem uma cadeia pesada e uma cadeia leve, cada uma composta por um domínio variável formando a bolsa de ligação para um antígeno e um domínio constante que contribui para a função efetora. O anticorpo, em virtude de sua cadeia pesada escolhida, pode ser um membro de qualquer classe e subclasse de imunoglobulina, incluindo qualquer uma das classes humanas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, ou um derivado ou fragmento dos mesmos. Da mesma forma, a cadeia leve do anticorpo pode derivar de qualquer espécie, tal como uma cadeia leve kapa (κ) ou lambda (λ) humana, determinada com base nas sequências de aminoácidos do domínio constante.

[065] A unidade estrutural básica do anticorpo compreende tipicamente um tetrâmero.

Em várias modalidades, o tetrâmero compreende dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 KDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50 a 70 KDa). A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento do antígeno.

A porção carbóxi-terminal de cada cadeia define uma região constante principalmente responsável pela função efetora.

As cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves kapa e lambda.

As cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa ou épsilon e definem o isótipo do anticorpo como IgM, IgD, IgA e IgE, respectivamente.

Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" de cerca de 10 ou mais aminoácidos.

Vide genericamente, Fundamental Immunology Cap. 7. (Paul, W., 2ª ed.

Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporado por referência na sua totalidade para todos os efeitos). As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam o sítio de ligação do anticorpo.

Assim, um anticorpo intacto normalmente tem dois sítios de ligação.

Exceto em anticorpos bifuncionais ou biespecíficos, os dois sítios de ligação são iguais.

Todas as cadeias exibem a mesma estrutura geral de regiões estruturais relativamente conservadas (FR) unidas por três regiões hipervariáveis, também chamadas de regiões determinantes de complementaridade ou CDRs.

As CDRs das duas cadeias de cada par são alinhadas pelas regiões estruturais, permitindo a ligação a um epítopo específico.

Do terminal N ao terminal C, ambas as cadeias leve e pesada compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos a cada domínio pode ser feita de acordo com o sistema de numeração IMGT. As definições alternativas também são conhecidas pelos versados na técnica. Vide, por exemplo, Sequências de Kabat de Proteínas de Interesse Immunológico (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou Clothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901 a 917 (1987); Clothia et al. Nature 342: 878-883 (1989).

[066] "Fragmento de anticorpo" ou "fragmento de ligação ao antígeno" compreende uma porção de um anticorpo de comprimento total, geralmente pelo menos a porção/domínio de ligação ao antígeno ou a região variável do mesmo. O termo fragmento de anticorpo é um subconjunto do termo anticorpo discutido acima. Exemplos de fragmentos de anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno incluem: Fab, Fab', F(ab')2, Fd, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, fragmento Fv, diacorpos, moléculas de anticorpo de cadeia simples, imunotoxinas e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. Além disso, os fragmentos de anticorpo compreendem polipeptídeos de cadeia simples com as características de uma cadeia VH que se liga a tau patológica, nomeadamente sendo capaz de se montar junto com uma cadeia VL ou de uma cadeia VL que se liga a tau patológica, nomeadamente sendo capaz de se montar junto com uma cadeia VH para formar uma bolsa de ligação ao antígeno funcional e, assim, fornecer a propriedade de ligação a tau. Os termos também compreendem fragmentos que per se não são capazes de fornecer funções efetoras (por exemplo, citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos ("ADCC") ou citotoxicidade dependente de complemento ("CDC"), mas fornecem esta função após serem combinados com o anticorpo apropriado domínio (s) constante (s).

[067] Um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo "capaz de se ligar a tau", tal como no presente documento utilizado, refere-se a um anticorpo ou fragmento de ligação que se liga preferivelmente a tau em relação a outros alvos de antígeno. O termo é intercambiável com um anticorpo "anti-tau" ou um "anticorpo que se liga a tau". Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação capaz de se ligar a tau pode fazê-lo com maior afinidade para aquele antígeno do que outros. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação capaz de se ligar a tau pode se ligar a esse antígeno com um KD de pelo menos cerca de 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-11, 10-12 ou maior (ou qualquer valor entre), por exemplo, como medido por ressonância plasmônica de superfície ou outros métodos conhecidos do especialista na técnica.

[068] O termo anticorpos "quiméricos" refere-se a anticorpos nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticorpo particular (por exemplo, anticorpos quiméricos humanizados, de classe trocada), enquanto o restante da cadeia (s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (Patente U.S. No. 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 a 6855 (1984)).

[069] Em uma modalidade, o termo "anticorpo quimérico" refere- se a um anticorpo monoclonal que compreende uma região variável de uma fonte ou espécie e pelo menos uma porção de uma região constante derivada de uma fonte ou espécie diferente, geralmente preparada por técnicas de DNA recombinante. Em algumas modalidades, os anticorpos quiméricos compreendem uma região variável murina e uma região constante humana. Tais anticorpos quiméricos murinos/humanos podem ser produzidos expressando genes de imunoglobulina compreendendo segmentos de DNA que codificam regiões variáveis de imunoglobulina murina e segmentos de DNA que codificam regiões constantes de imunoglobulina humana. Outras formas de "anticorpos quiméricos" podem ser aquelas em que a classe ou subclasse foi modificada ou alterada daquela do anticorpo original. Esses anticorpos "quiméricos" também são referidos como "anticorpos de troca de classe". Os métodos para a produção de anticorpos quiméricos envolvem técnicas convencionais de DNA recombinante e de transfecção de genes agora conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Morrison, S. L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851 a 6855; Patente U.S. Nos. 5.202.238 e 5.204.244.

[070] "Ligação competitiva" pode ser determinada em um ensaio no qual a imunoglobulina/anticorpo/fragmento de ligação em teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum, tal como tau (por exemplo, tau SEQ ID No 12). Numerosos tipos de ensaios de ligação competitiva são conhecidos, por exemplo: radioimunoensaio direto ou indireto em fase sólida (RIA), imunoensaio enzimático direto ou indireto em fase sólida (EIA), ensaio de competição em sanduíche (vide Stahli et al., Methods in Enzymology 9: 242 (1983)); EIA direto de biotina-avidina em fase sólida (vide Kirkland et al., J. Immunol 137: 3614 (1986)); ensaio de marcação direta em fase sólida, ensaio em sanduíche de marcação direta em fase sólida (vide Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de marcador direto em fase sólida usando marcador I125 (vide Morel et al., Mol. Immunol. 25 (1): 7 (1988): EIA biotina-avidina de fase sólida (Cheung et al., Virology 176: 546 (1990)); e RIA marcado direto. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Em algumas modalidades, tal ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células contendo qualquer um destes, uma imunoglobulina de teste não marcada e uma imunoglobulina de referência marcada. A inibição competitiva pode ser medida determinando a quantidade de marcador ligada à superfície sólida ou células na presença da imunoglobulina de teste. Em algumas modalidades, a imunoglobulina de teste está presente em excesso. Normalmente, quando um anticorpo competidor está presente em excesso, ele inibirá a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum em pelo menos 50 a 55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ou Mais.

[071] O termo "conjugado", tal como no presente documento utilizado, refere-se a uma ligação ou porção química formada a partir de uma reação química entre um grupo funcional de uma primeira molécula (por exemplo, um anticorpo) com um grupo funcional de uma segunda molécula (por exemplo, um sinal detectável ou agente terapêutico ou droga). Tais ligações incluem, mas não estão limitadas a, ligações covalentes e ligações não covalentes, enquanto tais porções químicas incluem, mas não estão limitadas a, ésteres, carbonatos, ésteres de fosfato de iminas, hidrazonas, acetais, ortoésteres, ligações peptídicas e ligações oligonucleotídicas.

[072] "Atrasar a progressão" e "prevenir a progressão" refere-se à administração de um agente terapêutico a um paciente suscetível a, ou de outra forma em risco de, uma doença específica, como a AD. A prevenção abrange a administração profilática a um objeto em risco de AD. Qualquer pessoa na população em geral está em risco de AD. Alguns indivíduos apresentam um risco aumentado de AD. Alguns indivíduos apresentam um risco genético aumentado de AD. Atrasar a progressão e prevenir a progressão pode eliminar ou reduzir o risco ou retardar o início da doença. O atraso no início ou progressão da AD pode ser medido comparando-se aos cronogramas padrão de progressão da doença em populações ou indivíduos similares. Vide Ostrowitzki et al., Alzherimers Res Ther., 9 (1): 95, 2017. Modalidades ilustrativas e exemplares específicas para atrasar a progressão são descritas abaixo.

[073] O termo "epítopo" refere-se a um sítio em um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo (ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) pode se ligar especificamente. Assim, um epítopo em tau é o sítio em tau onde uma imunoglobulina ou anticorpo (ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) pode se ligar especificamente. A ligação específica se refere, em algumas modalidades, à ligação que é mensuravelmente diferente de uma interação não específica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, determinando a ligação de uma molécula em comparação com a ligação de uma molécula de controle, que geralmente é uma molécula de estrutura similar que não tem atividade de ligação, ou por ensaio de competição com uma molécula de controle que compartilha ligação similar afinidade, mas não está rotulada. Neste caso, a ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado a uma sonda for inibida competitivamente por excesso de alvo não marcado. O termo pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula com um KD para o alvo de pelo menos cerca de 10-4 M, alternativamente pelo menos cerca de 10-5 M, alternativamente pelo menos cerca de 10-6 M, alternativamente pelo menos cerca de 10−7 M, alternativamente pelo menos cerca de 10−8 M, alternativamente pelo menos cerca de 10−9 M, alternativamente pelo menos cerca de 10−10 M, alternativamente pelo menos cerca de 10−11 M, alternativamente pelo menos cerca de 10 −12 M ou mais. Em uma modalidade, o termo "ligação específica" refere-se à ligação onde uma molécula se liga a um polipeptídeo ou epítopo particular em um polipeptídeo particular sem se ligar substancialmente a qualquer outro polipeptídeo ou epítopo.

[074] Um epítopo, como o termo é usado no presente documento, pode ser formado a partir de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos por dobramento terciário de uma proteína. Um epítopo pode incluir extensões adicionais de aminoácidos em torno de uma região central ligada por um anticorpo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 ou mais aminoácidos no terminal N e/ou C de um peptídeo de epítopo central. Epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são normalmente retidos na exposição a solventes desnaturantes, enquanto os epítopos formados por dobramento terciário são normalmente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo inclui tipicamente pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos, muitas vezes em uma conformação espacial única. Os métodos para determinar a conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo, varredura de alanina, cristalografia de raios-X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). Métodos exemplares são discutidos e usados no presente documento para os anticorpos descritos. Um "epítopo conformacional" é um epítopo ao qual o anticorpo ou fragmento de ligação a tau se liga de uma maneira específica conformacional. No caso de epítopos baseados em proteínas, a ligação pode depender da estrutura secundária, terciária ou quaternária da proteína portadora do epítopo. Por outras palavras, o anticorpo liga-se de uma forma específica de estrutura ou de uma forma específica de estrutura quaternária.

[075] Um epítopo em tau, conforme discutido no presente documento, é identificado com referência aos resíduos de aminoácidos na proteína tau 2N4R. Um especialista na técnica poderia identificar prontamente os resíduos de aminoácidos correspondentes em outras isoformas e fragmentos de tau, por exemplo, por meio de programas de alinhamento, como BLAST®. Salvo indicação em contrário, uma referência a um resíduo de aminoácido particular em tau refere-se à proteína tau 2N4R e deve ser entendida como abrangendo as posições correspondentes em outras isoformas e fragmentos de tau.

[076] Os fragmentos "Fab" podem ser produzidos por digestão de anticorpos com papaína, cada um com um único sítio de ligação ao antígeno e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar prontamente (fragmento cristalizável). O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab’)2 que tem dois sítios de ligação ao antígeno e ainda é capaz de reticular o antígeno. “Fv” é a porção da região variável de cadeia pesada que está incluída no fragmento Fab. Qualquer um desses fragmentos também pode ser produzido de forma recombinante. A porção Fc de um anticorpo está associada às funções efetoras do anticorpo, incluindo citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento ou fagocitose. Alterações (por exemplo, mutações ou alterações de glicosilação) na região Fc de um anticorpo podem ser usadas para modular qualquer uma de suas funções efetoras, bem como aumentar sua meia-vida sérica e outras propriedades farmacocinéticas.

[077] O fragmento Fab também contém o domínio constante de cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' tipicamente diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carbóxi do domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação no presente documento para Fab' em que o resíduo (s) de cisteína dos domínios constantes possuem pelo menos um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab’)2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de dobradiça entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.

[078] O termo "Fc", conforme usado no presente documento, inclui o polipeptídeo que compreende a região constante de um anticorpo, excluindo o primeiro domínio de imunoglobulina de região constante.

Assim, Fc refere-se aos dois últimos domínios de imunoglobulina de região constante de IgA, IgD e IgG, e os últimos três domínios de imunoglobulina de região constante de IgE e IgM, e o terminal N de dobradiça flexível para esses domínios.

Para IgA e IgM, Fc pode incluir a cadeia J.

Para IgG, Fc compreende domínios de imunoglobulina C gama 2 e C gama 3 (Cgama2 e Cgama3) e a dobradiça entre C gama 1 (Cgama1) e C gama 2 (Cgama2). Embora os limites da região Fc possam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida para compreender os resíduos C226 ou P230 até o seu terminal carboxila, em que a numeração é de acordo com o sistema de numeração EU (Edelman GM et al., (1969) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 63 (1); 78-85). A lisina de terminal C (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo, ou por engenharia recombinante do ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada do anticorpo.

Consequentemente, uma composição de anticorpos intactos pode compreender populações de anticorpos com todos os resíduos K447 removidos, populações de anticorpos sem resíduos K447 removidos e populações de anticorpos tendo uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447. Fc pode referir-se a esta região isolada ou a esta região no contexto de um polipeptídeo Fc, por exemplo, um anticorpo.

O Fc pode ser um Fc de sequência nativa ou um Fc variante.

As substituições de resíduos de aminoácidos na porção Fc para alterar a função efetora do anticorpo são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Winter et al., Patentes U.S.

Nos. 5.648.260 e 5.624.821). Um Fc adequado, descrito no pedido PCT WO 93/10151 (no presente documento incorporado por referência), é um polipeptídeo de cadeia única se estendendo da região de dobradiça terminal N para o terminal C nativo da região Fc de um anticorpo IgG1 humano. Outro polipeptídeo Fc útil é a muteína Fc descrita na Pat. No. 5.457.035 e em Baum et al., 1994, EMBO J. 13: 3992-4001. A sequência de aminoácidos desta muteína é idêntica à da sequência Fc nativa apresentada em WO 93/10151, exceto que o aminoácido 19 foi alterado de Leu para Ala, o aminoácido 20 foi alterado de Leu para Glu e o aminoácido 22 foi alterado de Gly para Ala. A muteína pode exibir afinidade reduzida para os receptores Fc.

[079] "Fv" refere-se ao fragmento mínimo de anticorpo que contém um reconhecimento de antígeno completo e sítio de ligação ao antígeno. Esta região consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em forte associação não covalente. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação ao antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação ao antígeno para o anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antígeno) pode ter a capacidade de reconhecer e ligar um antígeno, embora com uma afinidade mais baixa do que todo o sítio de ligação.

[080] Tal como no presente documento utilizado, um anticorpo humanizado que compreende uma "região estrutural" variável de cadeia pesada ou leve a partir de uma sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana particular pode conter diferenças de aminoácidos em comparação com a região estrutural variável de cadeia pesada ou leve da sequência de linhagem germinativa particular, devido a, por exemplo, mutações somáticas de ocorrência natural ou introdução intencional de mutação direcionada ao sítio. Em várias modalidades, um anticorpo humanizado selecionado pode ser pelo menos 90% idêntico na sequência de aminoácidos da região estrutural variável de cadeia pesada ou leve com uma sequência de aminoácidos codificada pela região estrutural variável de cadeia pesada ou leve de um gene de imunoglobulina de linhagem germinativa humana e contém resíduos de aminoácidos que identificam o anticorpo humanizado como sendo derivado do humano quando comparado com as sequências de aminoácidos da imunoglobulina da linhagem germinativa de outras espécies (por exemplo, sequências da linhagem germinativa murina). Em certos casos, um anticorpo humanizado pode compartilhar pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência de aminoácidos com a região estrutural variável de cadeia pesada ou leve codificada pelo gene da imunoglobulina da linhagem germinativa. Em algumas modalidades, a região estrutural variável de cadeia pesada ou leve de um anticorpo humanizado derivado de uma sequência de linhagem germinativa humana particular exibirá não mais do que 11 aminoácidos, preferivelmente não mais do que 5, ou ainda mais preferivelmente não mais do que 4, 3, 2, ou 1 diferenças da sequência de aminoácidos da região estrutural variável de cadeia pesada ou leve codificada pelo gene da imunoglobulina da linhagem germinativa humana.

[081] Resíduos de "região estrutural" ou "FR" são aqueles resíduos de domínio variável que não os resíduos da região hipervariável, conforme definido no presente documento. Eles agrupam as regiões hipervariáveis no domínio variável. Os resíduos de FR podem ser identificados de acordo com um sistema de numeração padrão, por exemplo, os esquemas de numeração Kabat, Chothia ou Chotia modificado. No sistema de numeração único IMGT, os aminoácidos conservados sempre têm a mesma posição, por exemplo,

cisteína 23 (1º-CYS), triptofano 41 (CONSERVED-TRP), aminoácido hidrofóbico 89, cisteína 104 (2º-CYS), fenilalanina ou triptofano 118 (J- PHE ou J-TRP). Vide, por exemplo, Lefranc M. P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M. P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M. P., Pommié, C., Ruiz, M., Guidicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. e Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003). Em outra modalidade, a numeração única IMGT fornece uma delimitação padronizada das regiões estruturais (FR1 a IMGT: posições 1 a 26, FR2-IMGT: 39-55, FR3-IMGT: 66-104 e FR4-IMGT: 118 a 128) e das regiões determinantes de complementaridade: CDR1 a IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 e CDR3-IMGT: 105 a 117. A numeração única IMGT pode ser usada em representações gráficas 2D, designadas como IMGT Colliers de Peries. Vide, por exemplo, Ruiz, M. e Lefranc, M. P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. e Lefranc, M. P., Current Bioinformatics, 2, 21 a 30 (2007). Também pode ser usada para representar estruturas 3D. Vide, por exemplo, IMGT/3Dstructure-DB Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M. P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004).

[082] O termo "dobradiça" ou "região de dobradiça" ou "região de dobradiça do anticorpo" no presente documento inclui o polipeptídeo flexível que compreende os aminoácidos entre o primeiro e o segundo domínios constantes de um anticorpo ou fragmento de ligação a tau do mesmo. A "região de dobradiça", conforme referido no presente documento, pode ser uma sequência de 6-62 aminoácidos de comprimento, apenas presente em IgA, IgD e IgG, que engloba os resíduos de cisteína que ligam as duas cadeias pesadas.

[083] O termo "anticorpo humano", conforme usado no presente documento, pretende incluir anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana e podem ser, por exemplo, isolados de um ser humano ou produzidos de forma recombinante. As regiões constantes do anticorpo podem ser, por exemplo, as regiões constantes de um anticorpo do tipo IgG1 humano. Tais regiões podem ser alotípicas e são descritas por, por exemplo, Johnson, G. e Wu, T. T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 e os bancos de dados nele referenciados.

[084] O termo "anticorpo humanizado" refere-se a anticorpos nos quais as regiões estruturais (FR) e/ou as regiões determinantes de complementaridade (CDR) foram modificadas para compreender resíduos de aminoácidos de uma imunoglobulina de um humano em comparação com aqueles da imunoglobulina parental (por exemplo, resíduos de imunoglobulina parental de camundongo). Em uma modalidade, uma CDR murina é enxertada na região estrutural de um anticorpo humano para preparar o "anticorpo humanizado". Em outra modalidade, estruturas humanas são “enxertadas” ou unidas em anticorpos de camundongo, preservando as CDRs de anticorpo de camundongo e substituindo suas estruturas por estruturas de origem humana. O enxerto e a emenda podem ser feitos por várias tecnologias de DNA recombinante, incluindo PCR e mutagênese. Vários métodos de humanização existem na técnica (por exemplo, enxerto de CDR, remodelagem, animais transgênicos, bibliotecas combinatórias). Vide, por exemplo, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270; Sastry L, Alting-Mess M, Huse WD, Short JM, Sorge JA, Hay BN, Janda KD, Benkoviv SJ, Lerner RA (1989) Cloning of the immunological repertoire for generation of monoclonal catalytic antibodies: construction of a heavy chain variável region-specific cDNA library. Proc Natl Acad Sci USA 86, 5728-5732; e Huse WD, Sastry S, Iverson SA, Kang AS, Alting-Mees M, Burton DR, Benkoviv SJ, Lerner RA (1989) Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda.

Science 246, 1275-1281. Em algumas modalidades, os anticorpos humanizados são mais similares aos humanos, embora mantenham suas propriedades de ligação ao antígeno originais.

Presta, L.G.

Engineering of therapeutic antibodies to minimize immunogenicity and optimize function.

Advanced Drug Delivery Reviews, Volume 58, Questões 5-6: 640-656 (2006). Em algumas modalidades, a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreada contra uma biblioteca de sequências de domínio variável humanas conhecidas ou uma biblioteca de sequências de linhagem germinativa humanas.

A sequência humana que está mais próxima daquela do roedor pode então ser aceita como a região estrutural humana para o anticorpo humanizado (Sims et al., J.

Immunol. 1993; 151:2296 et seq.; Chothia et al, Chothia and Lesk, J.

Mol.

Biol. 1987; 196901 a 917). Em outra modalidade, a humanização envolve o uso de uma região estrutural particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas.

A mesma estrutura pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., PNAS USA, 1992; 89:4285 et seq.; Presta et al., J Immunol 1993; 151:2623 et seq.). Outros métodos concebidos para reduzir a imunogenicidade da molécula de anticorpo em um paciente humano incluem anticorpos folheados (vide, por exemplo, Patente U.S. 6.797.492 e publicações de pedido de Patente U.S. 20020034765 e 20040253645) e anticorpos que foram modificados por análise de epítopo de células T e remoção (vide, por exemplo, publicações de pedido de Patente U.S. 20030153043 e Patente U.S.

No. 5,712,120). Em várias modalidades, as CDRs dos anticorpos humanizados no presente documento descritos correspondem às sequências de CDR do anticorpo DC2E7 monoclonal de camundongo, nomeadamente SEQ ID Nos. 1 a 6.

[085] O termo "região hipervariável", quando usado no presente documento, refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que contribuem mais diretamente para a ligação ao antígeno. O termo é sinônimo do termo "região determinante de complementaridade" (ou "CDR"). Em uma modalidade, de acordo com IMGT, a região hipervariável geralmente compreende aminoácidos em três trechos em cada um dos domínios variáveis da cadeia pesada e leve (por exemplo, resíduos 27-32 (LCDR1), 49-51 (LCDR2) e 88-96 (LCDR3) no domínio variável de cadeia leve e 26-33 (HCDR1), 51 a 58 (HCDR2) e 97-102 (HCDR3) no domínio variável de cadeia pesada).

[086] O termo "tau insolúvel" refere-se a agregados de tau (como emaranhados neurofibrilares, fios de neurópilos, corpos de Pick, corpos em espiral, etc.), que podem ser identificados, por exemplo, por seu padrão característico no cérebro ou em solução. Por exemplo, os agregados de tau podem ser separados por centrifugação de amostras cerebrais homogeneizadas e avaliadas por, por exemplo, Western blot ou ensaios ELISA. Vide, por exemplo, Lasagna-Reeves et al., FASEB J. 26: 1946-59 (2012). Os agregados de tau podem ser compostos de monômeros de tau, dímeros de tau, trímeros ou oligômeros, tais como oligômeros de tau granulares (GTO) e vários tipos de filamentos, incluindo filamentos helicoidais pareados (PHF) e filamentos retos (SF), entre outros. Cowan, C.M. e Mudher, A., Are tau aggregates toxic or protection in tauopathies?, Frontiers in Neurology, 4: 114 (2013).

[087] O termo "ácido nucleico isolado", tal como no presente documento utilizado, significa um polinucleotídeo de origem genômica, cDNA ou sintética ou alguma combinação dos mesmos, que em virtude de sua origem (1) não está associado com a totalidade ou uma porção de um polinucleotídeo em que o "ácido nucleico isolado" é encontrado na natureza, (2) está operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que não é apreciado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior.

[088] "Ligado" refere-se à ligação de uma porção a um peptídeo, anticorpo, composto ou partícula sólida. O termo abrange casos em que uma porção é acoplada, ou complexada, ou covalentemente ou não covalentemente ligada a um peptídeo, anticorpo, composto ou partícula sólida. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento pode ser revestido covalentemente ou não covalentemente em uma esfera ou outra partícula vendida. A porção pode ser reticulada quimicamente ou expressa ou sintetizada como uma fusão com o peptídeo ou anticorpo.

[089] Conforme usado no presente documento, uma "molécula que é capaz de formar um complexo tau-molécula" é qualquer agente que preferivelmente pode se ligar a uma espécie de tau para formar um complexo. O termo abrange anticorpos, por exemplo, os anticorpos anti-tau no presente documento descritos, bem como receptores de antígeno, receptores conjugados com Fc, fragmentos de receptor, fatores de complemento e quaisquer outras porções de ligação adequadas capazes de formar um complexo com tau.

[090] O termo "ácido nucleico", conforme usado no presente documento, destina-se a incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de filamento simples ou de filamento duplo.

[091] "Tau patológica" inclui conformadores e estruturas de tau patológica e abrange todos os seguintes: tau modificada por doença (por exemplo, tau hiperfosforilada, tau truncada, etc.), tau perturbada, tau desordenada, tau solúvel desordenada, tau insolúvel, oligômeros e filamentos de tau, agregados de tau extracelulares e intracelulares, como emaranhados neurofibrilares, fios de neurópilos, placas neuríticas, emaranhados fantasmas e esferóides axonais, corpos de Pick, corpos enrolados, astrócitos em forma de tufo, placas astrocíticas ou qualquer outra forma de tau associada com AD ou outra tauopatia.

[092] Uma "amostra" ou "amostra biológica", conforme usado no presente documento, refere-se a qualquer porção de tecido ou fluido corporal (por exemplo, sangue, CSF, etc.) obtida de um objeto para fins de teste. A amostra pode ser isolada diretamente do objeto ou posteriormente processada antes do teste (por exemplo, por diluição, fixação, desnaturação, divisão, separação, centrifugação, dissociação de complexos imunes e similares). Partes da amostra usadas para fins de diagnóstico ou monitoramento também são abrangidas pelos termos. A amostra também pode ser processada durante ou após o teste (por exemplo, por imunoprecipitação, purificação, partição, etc.). Os termos "amostra" e "amostra biológica" se aplicam igualmente ao tecido ou fluido corporal antes, durante e/ou após essas etapas de processamento. O termo "amostra de controle", conforme usado no presente documento, refere-se a uma amostra obtida de um paciente saudável ou um paciente com outra tauopatia diagnosticada ou um paciente com um nível conhecido de uma espécie de tau em um fluido biológico, por exemplo, CSF.

[093] Vários tipos de tau (ou seja, espécies da proteína tau) podem existir em um objeto, por exemplo, em tecido cerebral ou em amostras, como CSF ou sangue. Os detalhes sobre estes tipos de tau são conhecidos e foram descritos, por exemplo, em WO2004/007547 A2 e U.S. 9.518.101, que são incorporados no presente documento por referência na sua totalidade. O termo "tau", quando usado sem especificação de isoforma adicional (por exemplo, tau 2N4R), abrange todas as formas de tau, bem como fragmentos de tau, a menos que especificado de outra forma.

[094] O termo "farmaceuticamente aceitável" significa biológica ou farmacologicamente compatível para uso in vivo em animais ou humanos, e preferivelmente significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopeia dos EUA ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais, e mais particularmente em humanos.

[095] O termo "tau fosforilada" refere-se a qualquer isoforma de tau compreendendo um ou mais aminoácidos fosforilados. A forma mais longa de tau cerebral humana adulta tem 80 resíduos de serina ou treonina e 5 resíduos de tirosina; portanto, quase 80% da molécula tem potencial para ser fosforilada. Vide Goedert, M. et al, Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer’s disease. Neuron 3, 519-526 (1989). O termo tau fosforilada também se refere a qualquer combinação de aminoácidos de tau fosforilada. Tau desempenha um papel fundamental na regulação da dinâmica dos microtúbulos, transporte axonal e crescimento de neurites. Todas essas funções de tau podem ser moduladas por fosforilação específica de sítio e alteração de eventos de fosforilação normais (por exemplo, hiperfosforilação, fosforilação anormal) podem contribuir para doenças neurodegenerativas, tal como a AD. Johnson GV et al., Tau phosphorylation in neuronal cell function and dysfunction. J. Cell Sci. 15 de nov. de 2004;117(Pt 24): 5721 a 9.

[096] Em algumas modalidades, tau fosforilada refere-se a uma proteína tau com qualquer combinação de um ou mais resíduos fosforilados entre os aminoácidos 188 e 227 (conforme numerado na proteína tau 2N4R ou os resíduos equivalentes em outro fragmento de tau ou isoforma). Em outra modalidade, tau fosforilada refere-se a tau fosforilada pelo menos na treonina 217 (conforme numerada na proteína tau 2N4R ou nos resíduos equivalentes em outro fragmento de tau ou isoforma). Em algumas modalidades, a proteína tau é fosforilada como nas proteínas tau fosforiladas detectadas nos Exemplos.

[097] "Tau fisiológica" refere-se a uma proteína tau nativa desdobrada encontrada no cérebro de objetos saudáveis, que pode ser de comprimento variável. Essas proteínas tau são tipicamente altamente solúveis e geralmente mostram menos tendência para agregação. Vide Wang et al., Tau in physiology and pathology, Nature Reviews, 17: 22-35, 2016.

[098] O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira"), tal como no presente documento utilizado, destina-se a referir-se a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos se destinam a referir-se não apenas à célula em questão em particular, mas à descendência de tal célula. Como certas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes devido a mutações ou influências ambientais, tal progênie pode não ser, de fato, idêntica à célula-mãe, mas ainda está incluída no escopo do termo "célula hospedeira", conforme usado no presente documento.

[099] Tal como no presente documento utilizado, "liga-se especificamente" em referência a um anticorpo significa que o anticorpo se liga ao seu antígeno ou epítopo alvo com maior afinidade do que a um antígeno (s) ou epítopo estruturalmente diferente.

[100] Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL de um anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. De preferência, o polipeptídeo Fv adicionalmente compreende um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Para uma revisão de scFv, vide Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994).

[101] O termo "tratamento", tal como no presente documento utilizado, é definido como a aplicação ou administração de um agente terapêutico a um objeto que tem uma doença, um sintoma de doença ou uma predisposição para uma doença, com o objetivo de curar, sarar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, amenizar, melhorar ou afetar a doença, um ou mais sintomas da doença ou a predisposição para a doença. Além disso, desde que as composições da invenção, isoladamente ou em combinação com outro agente terapêutico, curem, sarem, aliviem, mitiguem, alterem, remediem, amenizem, melhorem ou afetem pelo menos um sintoma da Doença de Alzheimer ou outra tauopatia sendo tratada, como em comparação com esse sintoma na ausência de tratamento, o resultado deve ser considerado um tratamento do distúrbio subjacente, independentemente de todos os sintomas do distúrbio terem sido curados, sarados, aliviados, mitigados, alterados, remediados, amenizados, melhorados ou afetados ou não. O tratamento pode ser alcançado usando uma "quantidade eficaz" de um agente terapêutico, que deve ser entendido como abrangendo o tratamento parcial e completo, por exemplo, curar, sarar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, amenizar, melhorar ou afetar parcial ou completamente, a doença, um ou mais sintomas da doença ou a predisposição para a doença. Uma “quantidade eficaz” pode ser determinada empiricamente. Da mesma forma, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma concentração ou que é eficaz para alcançar um efeito terapêutico declarado.

[102] "Tauopatia" refere-se a uma doença associada à formação de tau patológica. A tauopatia engloba todas as doenças neurológicas que são acompanhadas pelo aparecimento de formas anormais de proteína tau associada a microtúbulos nos cérebros dos pacientes. O termo inclui, mas não está limitado às seguintes doenças: doença de Alzheimer, doença de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, demência britânica, demência dinamarquesa, doença de Pick, paralisia supranuclear progressiva, degeneração corticobasal, doença por grãos argirofílicos, complexo de Guam Parkinsonismo-demência, demência somente de emaranhados, tauopatia da substância branca com inclusões gliais globulares, demência frontotemporal (por exemplo, FTDP-17), parkinsonismo ligado à encefalopatia traumática crônica do cromossomo 17, e doença nodular. Vide, por exemplo, Goedert M, Clavaguera F e Tolnay M. A propagação de inclusões de proteínas similares a príons em doenças neurodegenerativas. Trends Neurol. Sci. Em algumas modalidades, um objeto com Demência Frontotemporal (FTD) pode ter Afasia Progressiva Primária Agramática/Não Fluente (nfPPA), Afasia Progressiva Primária de Variante Semântica (svPPA), Demência Frontotemporal de Variante Comportamental (bvFTD) ou Esclerose Lateral Amiotemporal (ALSclerose Frontotemporal/FTD). Em uma modalidade, uma ou mais daquelas formas anormais de tau é reconhecida por um dos anticorpos ou fragmentos de ligação no presente documento descritos em pelo menos um ensaio. Em algumas modalidades, o ensaio é IHC. Em outras modalidades, o ensaio é ELISA. O termo "outra tauopatia" abrange todas as doenças neurológicas (por exemplo, causas baseadas em tau de demência), exceto AD que são acompanhadas pelo aparecimento de tau patológica, por exemplo, qualquer uma das outras taupatias listadas acima. Em contraste, a demência também pode surgir de etiologias não baseadas em tau, e isso não se enquadra no termo tauopatia.

[103] O termo "domínio variável" refere-se ao fato de que certas porções de uma imunoglobulina diferem extensivamente na sequência entre os anticorpos e são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. No entanto, a variabilidade geralmente não é distribuída uniformemente pelos domínios variáveis de anticorpos. Está concentrado em três segmentos denominados regiões hipervariáveis, tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como nos domínios variáveis de cadeia pesada. As porções mais conservadas dos domínios variáveis são chamadas de regiões estruturais (FRs). Os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves nativas compreendem, cada um, quatro FRs, que muitas vezes adotam uma configuração de folha beta, conectada por três regiões hipervariáveis, que muitas vezes formam loops de conexão e, em alguns casos, formando parte da estrutura da folha beta. As regiões hipervariáveis (HVR) em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno de anticorpos (vide Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Os "domínios constantes" de um anticorpo, em contraste, não estão tipicamente envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas contribuem para a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

[104] O termo "vetor", tal como no presente documento utilizado, destina-se a referir-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma loop de DNA de filamento duplo circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, assim, são replicados junto com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão operativamente ligados. Esses vetores são no presente documento referidos como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetores de expressão"). Em geral, os vetores de expressão úteis em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados indistintamente, pois o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada. No entanto, a invenção pretende incluir outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus defeituosos de replicação, adenovírus e vírus adenoassociados), que servem funções equivalentes.

[105] Conforme usado no presente documento, as formas singulares "um/uma" e "o/a" destinam-se a incluir as formas plurais também, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Além disso, na medida em que os termos "incluindo", "inclui", "tendo", "tem", "com" ou variantes dos mesmos são usados na descrição detalhada e/ou nas reivindicações, tais termos se destinam a ser inclusivos de uma maneira similar ao termo "compreendendo". Tal como no presente documento utilizado, os termos "cerca de" e "aproximadamente" significam dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor particular, conforme determinado por alguém versado na técnica, que dependerá em parte de como o valor é medido ou determinado, ou seja, as limitações do sistema de medição. Por exemplo, "cerca de" pode significar de 1 a 1,5 desvio (s) padrão ou de 1 a 2 desvios padrão, de acordo com a prática da técnica. Alternativamente, "cerca de" pode significar uma faixa de até e incluindo 20%, 10%, 5% ou 1% de um determinado valor. Alternativamente, particularmente com respeito a sistemas ou processos biológicos, o termo pode significar até e incluindo uma ordem de magnitude, até e incluindo 5 vezes, e até e incluindo 2 vezes, de um valor. Onde valores particulares são descritos no pedido e nas reivindicações, a menos que indicado de outra forma, o termo "cerca de" significando dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor particular deve ser assumido. Além disso, todos os intervalos descritos no presente documento incluem os pontos finais, bem como todos os pontos intermediários. O termo "ou" será entendido como significando "e/ou", a menos que o contexto indique claramente o contrário. Todas as referências citadas no presente documento são incorporadas por referência na sua totalidade. Na medida em que qualquer coisa em uma referência incorporada contradiga ou seja inconsistente com o material fornecido no presente documento, a presente invenção deve prevalecer. Anticorpos

[106] São descritos no presente documento novos anticorpos anti-tau úteis para detectar, monitorar, tratar e prevenir AD. Em algumas modalidades, os anticorpos são capazes de se ligar a uma tau fosforilada. Em algumas modalidades, os anticorpos são capazes de se ligar a tau fosforilada em uma amostra biológica (por exemplo, CSF ou sangue), tornando-os úteis para distinguir AD de outras tauopatias de forma não invasiva. Em algumas modalidades, os anticorpos podem ser conjugados a segundos agentes (por exemplo, agentes que não sejam anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno descritos no presente documento, tais como radiotraçadores ou agentes terapêuticos). Em algumas modalidades, um ou mais dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos são conjugados entre si. Em algumas modalidades, os anticorpos e/ou anticorpos conjugados cruzam a barreira hematoencefálica para se ligarem a tau no cérebro, tornando-

os úteis para a detecção ou tratamento in vivo de AD e outras tauopatias no cérebro.

[107] As sequências de CDRs de anticorpos e domínios variáveis, bem como a proteína tau 2N4R de comprimento total e suas porções, são mostradas na Tabela 1 abaixo. Em várias modalidades, os anticorpos e fragmentos de ligação descritos no presente documento compreendem uma ou mais das CDR e/ou sequências de domínio variável descritos na tabela e/ou se ligam a uma ou mais porções da proteína tau 2N4R descrita na tabela. Tabela 1

SEQ Polipeptídeo Sequência

ID NO 1 HCDR1 (E7) GFTFSSFG 2 HCDR2 (E7) ISGDSNTI 3 HCDR3 (E7) ARTLAY 4 LCDR1 (E7) EDIYNR 5 LCDR2 (E7) GAS 6 LCDR3 (E7) LQYWSIPWT

DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS H variável (E7) SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY 7

ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS 8 L variável (E7)

GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI PWTFGGGTKLEIKR

SEQ Polipeptídeo Sequência

ID NO MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT MHQDQEGDTD AGLKESPLQT PTEDGSEEPG SETSDAKSTP TAEDVTAPLV DEGAPGKQAA AQPHTEIPEG TTAEEAGIGD TPSLEDEAAG HVTQARMVSK SKDGTGSDDK KAKGADGKTK IATPRGAAPP GQKGQANATR IPAKTPPAPK TPPSSGEPPK

SGDRSGYSSP GSPGTPGSRS 9 tau 2N4R RTPSLPTPPT REPKKVAVVR

TPPKSPSSAK SRLQTAPVPM PDLKNVKSKI GSTENLKHQP

GGGKVQIINK KLDLSNVQSK CGSKDNIKHV PGGGSVQlVY

KPVDLSKVTS KCGSLGNIHH KPGGGQVEVK SEKLDFKDRV QSKIGSLDNI THVPGGGNKK IETHKLTFRE NAKAKTDHGA EIVYKSPVVS GDTSPRHLSN VSSTGSIDMV DSPQLATLAD

EVSASLAKQG L 10 PPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPT tau 188-227

PPTREPKKVA 11 tau 210-221 SRTPSLPTPPTR tau 210-221 12 SRTPSLPpTPPTR (pT217)

IATPRGAAPP GQKGQANATR 13 tau 151 a 188

IPAKTPPAPK TPPSSGEP

SEQ Polipeptídeo Sequência

ID NO 14 tau 163-172 KGQANATRIP 15 HCDR1 (E2) GFNIKDYY 16 HCDR2 (E2) LDPENDHT 17 HCDR3 (E2) SYYKYDDY 18 LCDR1 (E2) QSLLDSDGKTY 19 LCDR2 (E2) LVS 20 LCDR3 (E2) WQGTHFPLT

EVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIKD

YYMHWVRQRPDQGLEWIGWLDPENDHTIYD 21 H variável (E2) PRFQDRANLTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTA

VYYCSYYKYDDYWGQGTTLTVS DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDS

DGKTYLNWLVQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGV 22 L variável (E2) PDRFTGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYYCW

QGTHFPLTFGAGTKLELKR 23 HCDR1 (149) GFTLSSFG 24 HCDR2 (149) ISSGSSTI 25 HCDR3 (149) SRRLDY 26 LCDR1 (149) KSLLYKDGKTY 27 LCDR2 (149) LMS 28 LCDR3 (149) QQFVEYPLT

DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTLS 29 H variável (149)

SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYA

SEQ Polipeptídeo Sequência

ID NO DTVKGRFTISRDNPKNILFLQMTSLRSEDTAI YYCSRRLDYWGQGTSVTVS DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYK

DGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGV 30 L variável (149)

SDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQ

QFVEYPLTFGTGTKLELQR tau 210-221 31 SRpTPSLPpTPPTR (pT212, pT217) HCDR1 32 GFTFSGFG (E7cl07) HCDR1 33 GFTFGSFG (E7cl18) HCDR2 34 VSGDSNTI (E7cl06) HCDR2 35 ISGASSTI (E7cl13) HCDR2 (E7 36 ISGDGNTI cl17) HCDR2 37 ISGDSNTV (E7cl18) HCDR2 38 ISGDSSTI (E7cl29) LCDR1 39 ENIYNR (E7cl21PD) 40 LCDR2 (E7cl14) GAG 41 LCDR3 (E7cl03) LQYWSTPWT 42 LCDR3 (E7cl29) LQYRSIPWT

SEQ Polipeptídeo Sequência

ID NO DAQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMRWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 43 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl01)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 44 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl01)

PWTFGGGTKLEIKR

DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS H variável SFGMHWVRQAPEKGLEWVTYISGDSNTIYY 45 (E7cl02) ADTVKGRFTISRDNPKNTMFLQMTSLRSEDT

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSFSVSLGDRATITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 46 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl02)

PWTFGGGTKLEIKR DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWVRQAPEMGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 47 ADTVEGRFTISRDNPKNTLSLQMTSLRSEDT (E7cl03)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLEPGVPSRFS L variável 48 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWST (E7cl03)

PWTFGGGTKLEIKR

SEQ Polipeptídeo Sequência

ID NO DVQLVESGGGLAQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 49 ADTEKGRFTISRDNPKNALFLQMTSLRSEDT (E7cl04)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTVTCKASEDIYN

RLAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRF L variável 50 SGSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWS (E7cl04)

IPWTFGGGTKLEIKR DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 51 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLREDTAI (E7cl05)

YYCARTLAYWGQGALVTVS DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGDAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 52 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl05)

PWTFGGGTKLEIKR DVQLVESGGGLVQPGGSRRLSCAASGFTFS

SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYVSGDSNTIYY H variável 53 ADTVKDRFTISRDNPKNTLFLQMASLRSEDT (E7cl06)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 54 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl06)

PWTFSGGTKLEIKR

SEQ Polipeptídeo Sequência

ID NO DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

GFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 55 ADTVKGRFTISRDNPKNTLSLQMTSLRSEDT (E7cl07)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 56 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl07)

PWTFGGGTKLEIKR

DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS H variável SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY 57 (E7cl07PD) ADTVKGRLTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQIPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 58 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl07PD)

PWTFGGGTKLEIKR DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 59 ADTVKGRFTISRNNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl08)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSLSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 60 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl08)

PWTFGGGTKLEIKR

SEQ Polipeptídeo Sequência

ID NO DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWARQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 61 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl10)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGSAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 62 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl10)

PWTFGGGTKLEIKR DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 63 ADTVKGRFTISRDNPKNTLLLQMTSLRSEDT (E7cl11)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSLSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 64 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl11)

PWTFGGGTKLGIKR DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWVRQAPEKGLEWIAYISGDSNTIYYA H variável 65 DTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAI (E7cl12)

YYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 66 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl12)

PWTFGGGTKLEIKR

SEQ Polipeptídeo Sequência

ID NO DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGASSTIYYA H variável 67 DTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAI (E7cl13)

YYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 68 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl13)

PWTFGGGTKLEIKR DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWARQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 69 ADTVKGRLTISRDNPKNTLFLQTTSLRSEDTA (E7cl14)

ICYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKTSEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLIPGAGGLETGVPSRFS L variável 70 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl14)

PWTFGGGTKLEIKR DVQLVESGGGLVQPGGSRRLSCAASGFTFS

SFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 71 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl15)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVP DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 72 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl15)

PWTFGGGTKLEIKR

SEQ Polipeptídeo Sequência

ID NO DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 73 ADTVKGRFTISRDNPKNTLLLQMTSLRSEDT (E7cl16)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIRMTQSSSSFSVSLGVRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 74 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl16)

PWTFGGGTKLEIKR DVQLVESGGGLVQPGGSRRLSCAASGFTFS

SFGMHWARQAPEKGLEWVAYISGDGNTIYY H variável 75 ADTVKGRFTTSRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl17)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSLSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGSAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 76 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl17)

PWTFGGGTKLEIKR DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFG

SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTVYY H variável 77 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl18)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQPSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 78 GSGSGGDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl18)

PWTFGGGTKLEIKR

SEQ Polipeptídeo Sequência

ID NO DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 79 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl19)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSSSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 80 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl19)

PWTFGGGTKLEIKR DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 81 ADTAKGRFAISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl20)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGSAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 82 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl20)

PWTFGGGTKLEIKR DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 83 ADTVKGRFTISRDNPKSTLFLQMTSLRSEDT (E7cl21PD)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSLSVSLGDRVAITCKASENIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 84 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl21PD)

PWTFGGGTKLEIKR

SEQ Polipeptídeo Sequência

ID NO DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWARQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 85 ADAVKGRFTISRDNPKNTLSLQMTSLRSEDT (E7cl22)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSLSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 86 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl22)

PWTFGGGTKLEIKR DVQLVESGRGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 87 AGTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl23)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSSSVPLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 88 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl23)

PWTFGGGTKLEIKR DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWARQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 89 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl26)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS

DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNR L variável LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS 90 (E7cl26) GSGSGRDYTLSVTSLQTEDVATYYCLQYWSI

PWTFGGGTKLEIKR

SEQ Polipeptídeo Sequência

ID NO

GVRLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS H variável SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY 91 (E7cl27) ADTVKGRFTISRDNPESTLFLQMTSLRSEDT

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 92 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl27)

PWTFGGGTKLEIKR DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 93 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDT (E7cl28)

AIYYCARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSLSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 94 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl28)

PWTFGGGTKLEIKR DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSSTIYY H variável 95 ADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRPEDT (E7cl29)

AIYYGARTLAYWGQGTLVTVS DIQMTQSSSSLSVSLGDRVTITCEASEDIYNR

LAWYQQTPGDAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 96 GSGSGRDHTLSITSLQTEDVATYYCLQYRSIP (E7cl29)

WTFGGGTKLEVKR

SEQ Polipeptídeo Sequência

ID NO DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFS

SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISGDSNTIYY H variável 97 ADTVKGRFTISRDNPKNTLHLQMTSLRSEDT (E7cl30)

AIYYCARTLAYWGQGTPVTVS DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNR

LAWYQQTPGNAPSLLISGASGLETGVPSRFS L variável 98 GSGSGRDYTLSITSLQTEDVATYYCLQYWSI (E7cl30)

PWTFGGGTKLEIKR

DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTLS H variável SFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYA 99 (DC149) DTVKGRFTISRDNPKNILFLQMTSLRSEDTAI

YYCSRRLDYWGQGTSVTVS

DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYK L variável DGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGV 100 (DC149) SDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQ

QFVEYPLTFGTGTKLELQR HCDR1 101 GFTFSNYA (DC807) HCDR2 102 ISSGGTI (DC807) HCDR3 103 ARVNYDYGYAMDY (DC807) 104 LCDR1 (DC807) QSLENSNGNTY 105 LCDR2 (DC807) RVS 106 LCDR3 (DC807) LQVTHVPWT

SEQ Polipeptídeo Sequência

ID NO EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSN

YAMSWVRQNPEKRLEWVASISSGGTIYSPD H variável 107 SVKGRFTISRDNGRNILYLQMSSLRSEDTAM (DC807)

YSCARVNYDYGYAMDYWGQGTSVTVS DAVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLEN

SNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSNRFS L variável 108 GVLDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYF (DC807)

CLQVTHVPWTFGGGTKLEIKR

[108] Em várias modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos capazes de se ligar a tau no presente documento descrita compreendem uma ou mais das sequências de aminoácidos descritas na Tabela 1 acima. Em algumas modalidades, os anticorpos descritos no presente documento compreendem variantes de uma ou mais sequências descritas na Tabela 1, enquanto retêm a capacidade de se ligar a tau, por exemplo, tau fosforilada na posição 217.

[109] Por exemplo, em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou SEQ ID NO: 1 com uma substituição em uma ou mais das posições 5 e 6, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 2 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 4, 5, 6 e 8, HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e/ou em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 4 com uma substituição na posição 2, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 5 com uma substituição na pos ition 3 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, ou SEQ ID NO: 6 com uma substituição em uma ou mais das posições 4 e 6.

[110] Uma substituição em uma posição particular pode ser determinada contando da esquerda para a direita (amino ao terminal carbóxi) em uma sequência de aminoácidos, por exemplo, uma sequência listada na Tabela 1 começando na extremidade do terminal amino da sequência de peptídeo (ou extremidade esquerda da tabela).

[111] Em várias modalidades, a substituição na posição 5 em HCDR1 é glicina, a substituição na posição 6 em HCDR1 é glicina. Em algumas modalidades, a substituição na posição 1 em HCDR2 é valina, a substituição na posição 4 em HCDR2 é alanina, a substituição na posição 5 em HCDR2 é glicina, a substituição na posição 6 em HCDR2 é serina e/ou a substituição em a posição 8 em HCDR2 é valina. Em algumas modalidades, a substituição na posição 2 em LCDR1 é asparagina. Em algumas modalidades, a substituição na posição 3 em LCDR2 é glicina. Em algumas modalidades, a substituição na posição 4 de LCDR3 é arginina e/ou a substituição na posição 6 em LCDR3 é treonina.

[112] Em várias modalidades, HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 com uma substituição na posição 5, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 com uma substituição na posição 8 8 e/ou HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e/ou em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 com um substituto n na posição 2, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e/ou LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[113] Em várias modalidades, a substituição na posição 5 em HCDR1 é glicina e a substituição na posição 8 em HCDR2 é valina, e a substituição na posição 2 em LCDR1 é asparagina.

[114] Em várias modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende sequências variantes daquelas descritas na Tabela 1 compreende qualquer uma das CDRs de anticorpo (por exemplo, todas as seis CDRs) e/ou sequências de domínio variável de cadeia pesada e/ou leve completas (por exemplo, conjuntos emparelhados de sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve de um clone de anticorpo particular) selecionados daqueles mostrados nas Figuras 24-27B.

[115] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de ligar tau é descrito, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3). Em várias modalidades, as CDRs e/ou sequências de domínio variável são selecionadas daquelas listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[116] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau é descrito, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 7 com uma substituição em um ou mais da posição 1, 2, 3, 9, 12, 19, 30, 31, 35, 37, 42, 43, 48, 49, 51, 54, 55, 56, 58, 62, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 73, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 88, 94, 96, 107, 108 e 112, e/ou a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 8 com uma substituição em uma ou mais das posições 3, 7, 11, 14, 17, 19, 20, 21, 24, 25, 28, 39, 42, 49, 52, 56, 69, 71, 75, 92, 94, 99, 105 e 106.

[117] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 2, 3, 9, 12, 19, 30, 31, 35, 37, 42, 43, 48, 49, 51, 54, 55, 56, 58, 62, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 73, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 88, 94, 96, 107, 108 e 112, em que a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 1 é glicina, na posição 2 é alanina, na posição 3 é arginina, na posição 9 é arginina, na posição 12 é alanina, na posição 19 é arginina, na posição 30 é glicina, na posição 31 é glicina, na posição 35 é arginina, na posição 37 é alanina, na posição 42 é glicina, na posição 43 é metionina, na posição 48 é isoleucina, na posição 49 é treonina, na posição 51 é valina, na posição 54 alanina, na posição 55 é glicina, na posição 56 é serina, na posição 58 é valina, na posição 62 é glicina, na posição 63 é alanina, em posição 64 é selecionada a partir de alanina e ácido glutâmico, na posição 65 é ácido glutâmico, na posição 66 é ácido aspártico, na posição 68 é leucina, na posição 69 é alanina, na posição 70 é treonina, na posição 73 é asparagina, na posição 76 é ácido glutâmico, na posição 77 é serina, na posição 78 é alanina, na posição 79 é metionina, na posição 80 é selecionada a partir de serina, leucina e histidina, na posição 83 é treonina, na posição 84 é alanina, na posição 88 é prolina, na posição 94 é cisteína, na posição 95 é glicina, na posição 107 é alanina, na posição 108 é prolina e/ou na posição 112 é prolina.

[118] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 com uma substituição em uma ou mais das posições 3, 7, 11, 14, 17, 19, 20, 21, 24, 25, 28, 39, 42, 49, 52, 56, 69, 71, 75, 92, 94, 99, 105 e 106, em que a substituição na região variável de cadeia leve na posição 3 é arginina, na posição 7 é prolina, na posição 11 é selecionada a partir de serina ou leucina, na posição 14 é prolina, na posição 17 é valina, na posição 19 é alanina, na posição 20 é alanina, na posição 21 é valina, na posição 24 é ácido glutâmico, na a posição 25 é treonina, na posição 28 asparagina, na posição 39 isoleucina, na posição 42 é selecionada a partir de serina e ácido aspártico, na posição 49 é prolina, na posição 52 é glicina, na posição 56 é prolina, na posição 69 é glicina, na posição 71 é histidina, na posição 75 é valina, na posição 92 é arginina, na posição 94 é treonina, na posição 99 é serina, na posição 105 é glicina, e/ou na posição 106 é valina.

[119] Em várias modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 3, 30, 37, 48, 58, 63, 68, 76, 77 e 80, e/ou a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID SEQ ID NO: 8 com uma substituição em uma ou mais das posições 7, 11, 20, 28, 39 e 69.

[120] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 2 é alanina e/ou a substituição na posição 35 é arginina.

[121] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 49 é treonina e/ou na posição 79 metionina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 19 é alanina.

[122] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 43 é metionina, na posição 65 é ácido glutâmico e/ou na posição 80 é serina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 56 é prolina e na posição 94 é treonina.

[123] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 12 é alanina, na posição 64 é ácido glutâmico e na posição 78 é alanina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 21 é valina.

[124] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 107 é alanina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 42 é ácido aspártico.

[125] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 19 é arginina, na posição 51 é valina, na posição 66 é ácido aspártico e na posição 84 é alanina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 99 é serina.

[126] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 31 é glicina e/ou na posição 80 é serina.

[127] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 73 é asparagina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina.

[128] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 37 é alanina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 42 é serina.

[129] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 80 é leucina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina e na posição 105 é glicina.

[130] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 54 é alanina e/ou na posição 56 é serina.

[131] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 37 é alanina, na posição 68 é leucina, na posição 83 é treonina, na posição 99 é cisteína, a subestação na região variável de cadeia leve na posição 25 é treonina, na posição 49 é prolina e/ou na posição 52 é glicina.

[132] Em algumas modalidades, a substituição na posição na região variável de cadeia pesada na posição 19 é arginina, na posição 42 é glicina e/ou na posição 112 é prolina.

[133] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 80 é leucina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 3 é arginina e/ou na posição 17 é valina.

[134] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 19 é arginina, na posição 37 é alanina, na posição 55 é glicina, na posição 70 é treonina, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina e/ou na posição 42 é serina.

[135] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 64 é alanina, a substituição na posição 69 é alanina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 42 é serina.

[136] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 9 é arginina e/ou na posição 62 é glicina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é serina e/ou na posição 14 é prolina.

[137] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 37 é alanina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 75 é valina.

[138] Em algumas modalidades, a substituição na posição na região variável de cadeia pesada na posição 56 é serina, na posição 88 é prolina e/ou na posição 96 é glicina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve em a posição 11 é leucina, na posição 24 é ácido glutâmico, na posição 42 é ácido aspártico, na posição 71 é histidina, na posição 92 é arginina e/ou na posição 106 é valina.

[139] Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 80 é histidina e/ou na posição 108 é prolina.

[140] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau, compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 3, 30, 37, 48, 58, 63, 68, 76, 77 e 80, e uma região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID SEQ ID NO: 8 com uma substituição em uma ou mais das posições 7, 11, 20, 28, 39 e 69. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 1 é glicina, na posição 3 é arginina, na posição 30 é glicina, na posição 37 é alanina, na posição 48 é isoleucina, na posição 58 é valina, na posição 63 é alanina, na posição 68 é leucina, na posição 76 é ácido glutâmico, na posição 77 é serina e/ou na posição 80 é serina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 7 é prolina, na posição 11 é selecionado de leucina e serina, na posição 20 é alanina, na posição 28 é asparagina, na posição 39 é isoleucina e/ou na posição 69 é glicina.

[141] Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 68 é leucina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 39 é isoleucina.

[142] Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 48 é isoleucina.

[143] Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 30 é glicina e/ou na posição 58 é valina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 7 é prolina e/ou na posição 69 é glicina.

[144] Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é serina.

[145] Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 77 é serina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina, na posição 20 é alanina e/ou na posição 28 é asparagina.

[146] Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 37 é alanina, na posição 63 é alanina e/ou a posição 80 é serina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina.

[147] Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 1 é glicina, na posição 3 é arginina, na posição 76 é ácido glutâmico e/ou na posição 77 é serina.

[148] Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina.

[149] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[150] Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2, e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.

[151] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de ligar tau é descrito, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou SEQ ID NO: 1 com um substituição em uma ou mais das posições 5 e 6, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 2 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 4, 5, 6 e 8, HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 4 com uma substituição na posição 2, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 5 com uma substituição na posição 3, um d LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 6 com uma substituição em um ou mais da posição 4 e 6. Em várias modalidades, a substituição na posição 5 em HCDR1 é glicina, a substituição em posição 6 em HCDR1 é glicina, th A substituição na posição 1 em HCDR2 é valina, a substituição na posição 4 em HCDR2 é alanina, a substituição na posição 5 em HCDR2 é glicina, a substituição na posição 6 em HCDR2 é serina, a substituição na posição 8 em HCDR2 é valina, a substituição na posição 2 em LCDR1 é asparagina, a substituição na posição 3 em LCDR2 é glicina e/ou a substituição na posição 4 de LCDR3 é arginina e/ou a substituição na posição 6 em LCDR3 é treonina.

[152] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau, em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 com uma substituição na posição 5, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 com uma substituição na posição 8, HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 com uma substituição na posição 2, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e/ou LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[153] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau, em que a substituição na posição 5 em HCDR1 é glicina, a substituição na posição 8 em HCDR2 é valina e/ou a substituição na posição 2 em LCDR1 é asparagina.

[154] Em várias modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau compreende uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID

NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; ou

[155] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 34 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 6; ou

[156] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou

[157] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou

[158] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou

[159] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou

[160] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou

[161] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou

[162] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; ou

[163] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou

[164] uma HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[165] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; ou

[166] a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; ou

[167] a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 87 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 92; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94.

[168] Também são descritos no presente documento, em várias modalidades, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno que podem competir pela ligação com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo definido pela sequência, conforme descrito neste parágrafo. Em outra modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste no presente documento descrito pode se ligar ao mesmo epítopo na proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) como aquele de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo definido pela sequência, conforme descrito neste parágrafo.

[169] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que é descrito no presente documento pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o epítopo compreende um ou mais dos resíduos 210- 221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que é descrito no presente documento pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo os resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, o epítopo compreende os resíduos 210-221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). O epítopo pode conter pelo menos um ou mais de um resíduo fosforilado, que pode incluir uma fosfo-treonina na posição 217 da proteína tau 2N4R (SEQ

ID NO: 9). Em algumas modalidades, o epítopo também compreende uma serina fosforilada na posição 210, treonina na posição 212, serina na posição 214 ou treonina na posição 220 da proteína tau 2N4R ou qualquer combinação das mesmas.

Em certas modalidades, o epítopo compreende ou consiste em SRTPSLPpTPPTR (sequência de SEQ ID NO: 12). Em certas modalidades, o epítopo compreende ou consiste em uma região que compreende mais de um resíduo fosforilado, por exemplo, SRpTPSLPpTPPTR (sequência de SEQ ID NO: 31). Em algumas modalidades, o epítopo é determinado por qualquer método conhecido pelo versado na técnica.

Em algumas modalidades, a varredura de alanina ou estudos de deleção/mutagênese são usados para determinar o epítopo.

Em algumas modalidades, a espectrometria de massa é usada para determinar o epítopo.

Em certas modalidades, o epítopo é determinado por uma estrutura cristalina do complexo anticorpo-tau, onde o epítopo é definido como qualquer resíduo de contato em tau dentro de 5 angstroms da bolsa de ligação do anticorpo.

Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7 e uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou ligação ao antígeno fragmento compreende uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 29 e uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 3, 30, 37, 48, 58, 63, 68, 76, 77 e 80, e/ou a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID SEQ ID NO: 8 com uma substituição em um ou mais da posição 7, 11, 20, 28, 39 e 69. Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 68 é leucina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 39 é isoleucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 48 é isoleucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 30 é glicina e na posição 58 é valina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 7 é prolina e na posição 69 é glicina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é serina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 77 é serina e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina, na posição 20 é alanina e na posição 28 é asparagina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 37 é alanina, na posição 63 é alanina e a posição 80 é serina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 1 é glicina, na posição 3 é arginina, na posição 76 é ácido glutâmico e na posição 77 é serina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina.

[170] Em outros aspectos, são no presente documento descritos anticorpos que podem competir pela ligação à proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) com um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 29 e uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 com uma substituição em um ou mais da posição 1, 3, 30, 37, 48, 58, 63, 68, 76, 77 e 80, e/ou a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID SEQ ID NO: 8 com um substituição em um ou mais das posições 7, 11, 20, 28, 3 9 e 69. Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 68 é leucina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 39 é isoleucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 48 é isoleucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 30 é glicina e na posição 58 é valina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 7 é prolina e na posição 69 é glicina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é serina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 77 é serina e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina, na posição 20 é alanina e na posição 28 é asparagina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 37 é alanina, na posição 63 é alanina e a posição 80 é serina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 1 é glicina, na posição 3 é arginina, na posição 76 é ácido glutâmico e na posição 77 é serina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina.

[171] Em várias modalidades, a competição é medida por citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência, ELISA, HTRF e/ou SPR.

Em uma modalidade, ELISA de competição é usado para medir a ligação competitiva.

Em outra modalidade, um ensaio BIACORE é usado.

Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno com o qual o anticorpo descrito compete compreende uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 7 e uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno com o qual o anticorpo descrito compete compreende uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 29 e uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno com o qual o anticorpo descrito compete compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 3, 30, 37, 48, 58, 63, 68, 76, 77 e 80, e/ou a região variável de cadeia leve compreende o aminoácido se sequência de SEQ ID SEQ ID NO: 8 com uma substituição em uma ou mais das posições 7, 11, 20, 28, 39 e 69. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo com o qual o anticorpo descrito compete, compreende uma substituição na região variável de cadeia pesada na posição 68 é leucina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 39 é isoleucina.

Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 48 é isoleucina.

Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 30 é glicina e na posição 58 é valina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 7 é prolina e na posição 69 é glicina.

Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é serina.

Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 77 é serina e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina, na posição 20 é alanina e na posição 28 é asparagina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 37 é alanina, na posição 63 é alanina e a posição 80 é serina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 1 é glicina, na posição 3 é arginina, na posição 76 é ácido glutâmico e na posição 77 é serina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode se ligar ao mesmo um ou mais aminoácidos na proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) como um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[172] Em várias modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno com o qual o anticorpo descrito compete pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10). Em certas modalidades, o epítopo compreende um ou mais dos resíduos 210- 221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). Em outras modalidades, o epítopo compreende pelo menos um resíduo fosforilado. Em outra modalidade, o pelo menos um resíduo fosforilado compreende uma fosfo-treonina na posição 217 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) e, opcionalmente, também compreende uma serina fosforilada na posição 210, treonina na posição 212, serina na posição 214, ou treonina na posição 220 da proteína tau 2N4R ou qualquer combinação das mesmas. Em outra modalidade, o epítopo compreende ou consiste em SRTPSLPpTPPTR (sequência de SEQ ID NO: 12). Em certas modalidades, o epítopo compreende ou consiste em SRpTPSLPpTPPTR (sequência de SEQ ID NO: 31).

[173] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que pode se ligar a uma região ou fragmento da proteína tau 2N4R compreendendo ou consistindo nos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10), em que a região ou fragmento é fosforilado. Em várias modalidades, a região ou fragmento compreende ou consiste nos resíduos 210-221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). Em várias modalidades, a região ou fragmento é fosforilado em uma posição correspondente ao resíduo 217 da proteína tau 2N4R e, opcionalmente, também em uma ou mais das posições correspondentes a serina 210, treonina 212, serina 214 e treonina 220 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9). Em várias modalidades, a região ou fragmento da proteína tau 2N4R compreende ou consiste em SRTPSLPpTPPTR (sequência de SEQ ID NO. 12). Em certas modalidades, o epítopo compreende ou consiste em SRpTPSLPpTPPTR (sequência de SEQ ID NO: 31).

[174] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento pode se ligar a um epítopo fosforilado em tau, por exemplo, conforme medido por citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência, ELISA, HTRF e/ou SPR. Em uma modalidade, o ELISA é usado para medir ou verificar a ligação a tau fosforilada e desfosforilada. Em outra modalidade, um ensaio BIACORE é usado.

[175] Em várias modalidades, é descrito no presente documento um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 151 a 188 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, o epítopo em tau compreende um ou mais dos resíduos 163-172 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 14). Em várias modalidades, é descrito no presente documento um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo os resíduos 151 a 188 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, o epítopo em tau compreende os resíduos 163-172 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 14). Em certas modalidades, o epítopo compreende ou consiste em KGQANATRIP (sequência de SEQ ID NO. 14). Em certas modalidades, um ou mais dos resíduos no epítopo são fosforilados, por exemplo, uma treonina fosforilada na posição 169 da proteína tau 2N4R.

[176] Em várias modalidades, é descrito no presente documento um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que pode se ligar a uma porção ou fragmento de tau compreendendo os resíduos 151 a 188 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que pode se ligar a uma porção ou fragmento de tau compreendendo os resíduos 163-172 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 14).

[177] Em algumas modalidades, o epítopo de um anticorpo no presente documento descrito é determinado por qualquer método conhecido pelo versado na técnica. Em algumas modalidades, a varredura de alanina ou estudos de deleção/mutagênese são usados para determinar o epítopo. Em algumas modalidades, a espectrometria de massa é usada para determinar o epítopo. Em certas modalidades, o epítopo é determinado por uma estrutura cristalina do complexo anticorpo-tau, onde o epítopo é definido como qualquer resíduo de contato em tau dentro de 5 angstroms da bolsa de ligação do anticorpo.

[178] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de ligar tau é descrito, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em certas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno podem competir pela ligação a um ou mais aminoácidos ácidos na proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) com o anticorpo precedentemente descrito ou fragmento de ligação ao antígeno deste. Em outra modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ligar o mesmo epítopo na proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) ligada ao anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno previamente descritos neste parágrafo. Em uma modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ligar o fragmento ou região da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) ligada pelo anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno previamente descritos neste parágrafo.

[179] Em várias modalidades, qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos pode compreender uma região constante de cadeia pesada e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia pesada pode ser um isótipo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, ou um derivado ou fragmento deste que retém pelo menos uma função efetora da cadeia pesada intacta. A região constante de cadeia pesada pode ser um isótipo IgG humano. A região constante de cadeia pesada pode ser um isótipos de IgG1 humana ou IgG4 humana. A região constante de cadeia pesada pode ser um isótipo IgG1 humano. A região constante de cadeia leve pode ser uma cadeia leve kapa humana ou cadeia leve lambda ou um derivado ou fragmento desta que retém pelo menos uma função efetora da cadeia leve intacta. A região constante de cadeia leve pode ser uma cadeia leve kapa humana.

[180] Em várias modalidades, qualquer um dos anticorpos descritos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser um anticorpo de roedor ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo quimérico ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo enxertado com CDR ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em outra modalidade, qualquer um dos anticorpos descritos ou fragmentos de ligação ao antígeno compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve humanas ou derivadas de humanos, incluindo estruturas humanas, ou estruturas humanas com uma ou mais mutações reversas. Vide, por exemplo, as estratégias de retromutação delineadas na Patente U.S. No. 7.566.771, cuja invenção é no presente documento incorporada por referência. Em várias modalidades, qualquer um dos anticorpos descritos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser um fragmento Fab, Fab', F(ab')2, Fd, scFv, (scFv)2, scFv-Fc ou Fv.

[181] Em várias modalidades, o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno funcional do mesmo é descrito, em que DC2E7 é um anticorpo produzido por um hibridoma depositado sob o Depósito de Patentes do Catálogo de Culturas do Tipo Americanas No. PTA-124992. Em várias modalidades, o anticorpo DC2E2 ou um fragmento de ligação ao antígeno funcional do mesmo é descrito, em que DC2E2 é um anticorpo produzido por um hibridoma depositado sob o Depósito de Patentes do Catálogo de Culturas do Tipo Americanas No. PTA-124991. Também são descritos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que podem se ligar ao mesmo epítopo na proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) ou podem competir pela ligação à proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) com o anticorpo DC2E7 ou o anticorpo DC2E2.

[182] Em várias modalidades, qualquer um dos anticorpos descritos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser conjugados a um segundo agente. O segundo agente pode ser, por exemplo, pelo menos um agente detectável, incluindo, mas não se limitando a, uma enzima, um radioisótopo, um fluoróforo, um marcador de ressonância magnética nuclear ou um metal pesado. Em uma modalidade, o pelo menos um marcador detectável é um radioisótopo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conjugado a um marcador detectável (por exemplo, um radiomarcador) compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

[183] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conjugado a um marcador detectável (por exemplo, um radiomarcador) compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conjugado com um marcador detectável compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conjugado com um marcador detectável (por exemplo, um radiomarcador) compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 87 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94.

[184] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conjugado a um marcador detectável (por exemplo, um radiomarcador) pode competir pela ligação ou ligar o mesmo epítopo que este anticorpo definido pela sequência.

[185] Exemplos de tipos adequados de marcadores detectáveis consistentes com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, enzimas, radioisótopos e radionuclídeos, metais coloidais,

compostos fluorescentes, compostos quimioluminescentes, grupos biotinila, epítopos polipeptídicos predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de pares de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, etiquetas de epítopo) e compostos químicos/eletroquímicos/bioluminescentes. As enzimas incluem, mas não estão limitadas a, peroxidase (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre), luciferase, fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicose oxidase, glicose amilase, anidrase carbônica, acetilcolinesterase, lisozima, malato desidrogenase ou glicose-6 fosfato desidrogenase. Alternativamente, o marcador pode ser biotina, digoxina-genina ou 5- bromo-desoxiuridina. Os marcadores fluorescentes também podem ser combinados com os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, incluindo rodamina, fósforos de lantanídeos, fluoresceína e seus derivados, fluorocromos, rodamina e seus derivados, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente vermelha (RFP), dansila, umbeliferona, e outros. Esses conjugados podem ser preparados por métodos conhecidos por um especialista na técnica. Eles podem ser ligados diretamente a marcadores; através de um grupo espaçador ou grupo de ligação tal como polialdeído, glutaraldeído, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou ácido dietilenotriaminopentaacético (DPTA); ou na presença de outros agentes de ligação, tais como aqueles rotineiramente conhecidos na técnica.

[186] Outros marcadores detectáveis podem incluir marcadores radioativos, como iodo-123, iodo-125, iodo-126, iodo-133, iodo-131, bromo-77, tecnécio-99m, índio-113m, gálio-67, gálio- 68, rutênio-95, rutênio-97, rutênio-103, rutênio-106, mercúrio-203, escândio-47, telúrio-121m, telúrio-128, túlio-165, túlio-167, túlio-168, flúor-18, ítrio- 99 e zircônio-89. Métodos existentes conhecidos de um versado na técnica para marcar anticorpos com radioisótipos, seja direta ou indiretamente, por exemplo, através de um agente quelante como EDTA ou DTPA podem ser usados.

[187] Em várias modalidades, qualquer um dos anticorpos descritos ou fragmentos de ligação ao antígeno podem ser conjugados a um segundo agente, onde o segundo agente pode ser pelo menos um agente terapêutico para a doença de Alzheimer ou outra tauopatia. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conjugado a um agente terapêutico para a doença de Alzheimer compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer um ou mais (por exemplo, todas as seis CDRs e/ou uma sequência de domínio variável de cadeia pesada e/ou leve) selecionada daqueles mostrados na Tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 87 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94.

[188] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende SEQ ID NOS: 29 e 30. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conjugado a um agente terapêutico pode competir pela ligação ou ligar o mesmo epítopo que este anticorpo definido por sequência.

[189] Em algumas modalidades, o agente terapêutico pode ser uma imunoterapia passiva contra beta amiloide ou tau, ou um inibidor da acetilcolinestarase. Em algumas modalidades, o agente terapêutico pode ser selecionado a partir de um ou mais dentre: CAD106, Gantenerumab, Crenezumab, IVIG, AADvac1, ACI-35, NIC5-15, CHF-

5074, MK-8931, AZD 3293, LY33 14814, Elenbecestat, Tideglusib, Intranasal Humulin R, Intransal glulisine, SB742457 com donepezil, Azeliragon, Nivaldipine. Vide Godyn et al., Pharmacological Reports, 68: 127-138, 2016. Em algumas modalidades, o agente terapêutico pode ser selecionado a partir de:, Aducanumab, ALZT-OP1a + ALZT- OP1b, Aripiprazol, AVP-786, AZD3293 (LY3314814), Brexprprazol (OPC-34712), CAD106, CNP520, Elenbecestat, Insulina (humulina), Lumateperona, JNJ-54861911, Metilfenidato, MK-4305 (suvorexante), Nabilona, Nilvadipina, Pioglitazona, RVTigo-101 (intepiridina), oligo- manurarato de sódio (GV-971), TRx0237, TTp488 (azeliragon), AADvac1, ABBV-8E12, células AD-SVF, ANAVEX 2-73, Atomoxetina, AVP-786, AZD0530 (saracatinib), BAC, BAN2401, Benfotiamina, BI409306, Briostatina 1, Candesartan, CB-AC-02, Cilostazol, CPC- 201, CT1812, DAOIB, Dronabinol, E2609, Formoterol, hUCB-MSCs, JNJ-54861991, Levetiracetam, Liraglutida, LY3202626, NewGam 10% IVIG, Nilotinib, ORM-12741, Pimavanserina, Piromelatina, Posifeno, PQ912, Probucol, Rasagilina, Riluzol, RVT-101, S47445, Sargramostim, Sinvastatina + L-Arginina + Tetraidrobiopterina (SLAT), STA-1, SUVN-502, T-817 MA, Temisartan, UB-311, Valaciclovir, VX- 745, Xanamema. Vide Cummings et al., Alzheimer’s disease drug development pipeline: 2017, Alzheimer’s & Dementia, 3:367-384, 2017. Em algumas modalidades, a terapia anti-tau compreende uma molécula pequena ou terapia de vacina de peptídeo, ou uma terapia de anticorpo anti-tau. Vide Patente U.S. No. 9.518.101, que é incorporada por referência na sua totalidade.

[190] Em outras modalidades, um imunoconjugado é fornecido tendo a fórmula (A)-(L)-(C), em que: (A) é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito; (L) é um ligante opcional; e (C) é um segundo agente (por exemplo, um marcador detectável ou um agente terapêutico para o tratamento de

AD ou outra tauopatia); em que o ligante (L) une (A) a (C). Em algumas modalidades, (C) é um agente terapêutico, um agente de imagem, um agente detectável ou um agente de diagnóstico. Em algumas modalidades, esses conjugados são referidos no presente documento como conjugados anticorpo-droga (ADCs).

[191] O ligante opcional (L), conforme usado no presente documento, pode estar presente ou ausente. Quando presente, (L) é uma molécula que é usada para unir (A) a (C). Em algumas modalidades, o ligante é capaz de formar ligações covalentes ao anticorpo e ao segundo agente. Os ligantes adequados são bem conhecidos dos versados na técnica e incluem, mas não estão limitados a, ligantes de carbono de cadeia linear ou ramificada, ligantes de carbono heterocíclicos ou ligantes de peptídeo. Quando o anticorpo e o segundo agente são polipeptídeos, os ligantes podem ser unidos aos aminoácidos constituintes por meio de seus grupos laterais (por exemplo, através de uma ligação dissulfeto à cisteína). No entanto, em outra modalidade, os ligantes podem ser unidos aos grupos amino e carboxila alfa carbono dos aminoácidos terminais.

[192] Em algumas circunstâncias, é desejável liberar o segundo agente do anticorpo quando o imunoconjugado atingir seu sítio alvo. Portanto, nessas circunstâncias, os imunoconjugados podem compreender ligações que são cliváveis na vizinhança do sítio alvo. A clivagem do ligante para liberar o segundo agente do anticorpo pode ser induzida pela atividade enzimática ou condições às quais o imunoconjugado é submetido tanto dentro da célula alvo quanto na vizinhança do sítio alvo. Em ainda outras modalidades, a unidade de ligação não é clivável e a droga não é liberada ou é liberada, por exemplo, por degradação do anticorpo.

[193] Uma série de reações diferentes está disponível para ligação covalente de drogas e/ou ligantes a anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos. Isso é frequentemente realizado pela reação dos resíduos de aminoácidos da molécula de anticorpo, incluindo os grupos amina de lisina, os grupos de ácido carboxílico livre de ácido glutâmico e aspártico, os grupos sulfidrila de cisteína e várias porções dos aminoácidos aromáticos. Um dos métodos não específicos mais comumente usados de fixação covalente é a reação de carbodiimida para ligar um grupo carbóxi (ou amino) de um composto a grupos amino (ou carbóxi) do anticorpo. Além disso, agentes bifuncionais, tais como dialdeídos ou imidoésteres, têm sido usados para ligar o grupo amino de um composto a grupos amino de uma molécula de anticorpo. Também disponível para ligação de drogas a anticorpos está a reação de base de Schiff. Este método envolve a oxidação de periodato de uma droga que contém grupos glicol ou hidroxila, formando assim um aldeído que é então reagido com o agente de ligação. A ligação ocorre através da formação de uma base de Schiff com grupos amino do agente de ligação. Os isotiocianatos também podem ser usados como agentes de acoplamento para ligar covalentemente drogas a agentes de ligação.

[194] Em algumas modalidades, o ligante é clivável por um agente de clivagem que está presente no ambiente intracelular (por exemplo, dentro de um lisossoma ou endossoma ou caveolea). O ligante pode ser, por exemplo, um ligante peptidila que é clivado por uma peptidase intracelular ou enzima protease, incluindo, mas não se limitando a, uma protease lisossomal ou endossômica. Vide, por exemplo, Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123. Outros exemplos de tais ligantes são descritos, por exemplo, na Patente U.S. No. 6.214.345. Em outras modalidades, o ligante clivável é sensível ao pH, isto é, sensível à hidrólise em certos valores de pH. Normalmente, o ligante sensível ao pH é hidrolisável em condições ácidas. Por exemplo, um ligante lábil em ácido que é hidrolisável no lisossoma (por exemplo, uma hidrozona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal ou similares) pode ser usado. (Vide, por exemplo, Patentes US Nos.

5.122.368; 5.824.805; 5.622.929; Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264: 14653 a

14661.). Em ainda em outras modalidades, o ligante é clivável sob condições de redução (por exemplo, um ligante dissulfeto). Uma variedade de ligantes dissulfeto é conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, aqueles que podem ser formados usando SATA (N- succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N succinimidil-3-(2- piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) e SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa(2piridil-ditio)tolueno)-, SPDB e SMPT. (Vide, por exemplo, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47: 5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radiolmagery and Therapy of Cancer (C.W. Vogel ed., Univ. de Oxford. Press, 1987. Vide também a Patente U.S.

4.880.935.). Em outra modalidade, o ligante é um ligante malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15: 1387-93), um ligante maleimidobenzoil (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3 (10): 1299- 1304), ou um análogo 3'-N-amida (Laur et al., 1995, Bioorg-Med- Chem. 3 (10): 1305-12).

[195] Em outra modalidade, a unidade de ligação não é clivável e a droga é liberada por degradação do anticorpo. (vide Publicação U.S. No. 2005/0238649). Em uma modalidade, o ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular. Tal como no presente documento utilizado, "não substancialmente sensível ao ambiente extracelular", no contexto de um ligante, significa que não mais do que cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 3% ou não mais do que 1% dos ligantes, em uma amostra de composto conjugado anticorpo-droga, são clivados quando o composto conjugado anticorpo-droga se apresenta em um ambiente extracelular (por exemplo, no plasma). Se um ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular pode ser determinado, por exemplo, incubando com plasma o composto conjugado anticorpo-droga por um período de tempo predeterminado (por exemplo, 2, 4, 8, 16 ou 24 horas) e quantificando a quantidade de droga livre presente no plasma.

[196] Em algumas modalidades, (L) também pode compreender um grupo espaçador ou um grupo de ligação, como polialdeído, glutaraldeído, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou ácido dietilenotriaminopentacético (DPTA).

[197] Em algumas modalidades, mais de um segundo agente pode ser anexado, diretamente ou por um ligante, a um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento. Em certas modalidades, a razão do segundo agente para o anticorpo pode variar em média de cerca de 1:1 a cerca de 1:8. Vide Patente U.S. No.

7.498.298. A carga (razão droga/anticorpo) de um ADC pode ser controlada de diferentes maneiras. Vide W02006/034488. Ácidos Nucleicos, Vetores, Células Hospedeiras

[198] Também são descritos ácido nucleico (s) isolado que codifica pelo menos uma região variável de uma cadeia de imunoglobulina de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos. Em certas modalidades, um ácido nucleico isolado codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno descritos precedentemente. Outras modalidades fornecem um vetor isolado compreendendo os ácidos nucleicos. Outra modalidade inclui uma célula hospedeira isolada compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos ou vetores.

[199] Os polinucleotídeos ou ácidos nucleicos que codificam os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos podem ser, por exemplo, DNA, cDNA, RNA ou DNA ou RNA produzido sinteticamente ou uma molécula de ácido nucleico quimérico produzida de forma recombinante compreendendo qualquer um desses polinucleotídeos isoladamente ou em combinação. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é parte de um vetor. Tais vetores podem compreender outros genes, tais como genes marcadores e/ou elementos de controle, permitindo a seleção e/ou expressão do vetor em uma célula hospedeira adequada e sob condições adequadas.

[200] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo está operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle de expressão, permitindo a expressão em células procarióticas ou eucarióticas. A expressão do polinucleotídeo pode compreender a transcrição do polinucleotídeo em mRNA traduzível. Elementos reguladores que garantem a expressão em células eucarióticas, para exemplo de células de mamífero, são conhecidas dos especialistas na técnica. Eles geralmente compreendem sequências regulatórias que garantem o início da transcrição e, opcionalmente, sinais poli-A garantindo o término da transcrição e estabilização do transcrito. Elementos reguladores adicionais podem incluir intensificadores da transcrição, bem como da tradução e/ou regiões promotoras naturalmente associadas ou heterólogas.

[201] A este respeito, o versado na técnica apreciará que os polinucleotídeos que codificam pelo menos as CDRs e/ou domínio variável de cadeia leve e/ou pesada podem codificar os domínios variáveis de ambas as cadeias de imunoglobulina ou apenas uma. Da mesma forma, os polinucleotídeos podem estar sob o controle do mesmo promotor ou podem ser controlados separadamente para expressão. Os possíveis elementos reguladores que permitem a expressão em células hospedeiras procarióticas compreendem, por exemplo, o promotor PL, lac, trp ou tac em E. coli, e exemplos de elementos reguladores que permitem a expressão em células hospedeiras eucarióticas são o promotor AOXI de GAL1 em levedura ou o promotor de CMV, SV40, RSV, intensificador de CMV, intensificador de SV40 ou um íntron de globina em células de mamíferos e outras células animais.

[202] Além dos elementos que são responsáveis pela iniciação da transcrição, tais elementos reguladores também podem compreender sinais de terminação da transcrição, como o sítio SV40- poli-A ou o sítio tk-poli-A, a jusante do polinucleotídeo. Além disso, dependendo do sistema de expressão utilizado, as sequências líder capazes de direcionar o polipeptídeo para um compartimento celular ou secretá-lo no meio podem ser adicionadas à sequência de codificação dos polinucleotídeos e são conhecidas na técnica. Quando usado, a (s) sequência (s) líder pode (m) ser montada (s) na fase apropriada com as sequências de tradução, iniciação e terminação e, opcionalmente, uma sequência líder capaz de direcionar a secreção da proteína traduzida, ou uma porção dela, no espaço periplasmático ou meio extracelular. Em algumas modalidades, a sequência heteróloga pode codificar uma proteína de fusão incluindo um peptídeo de identificação de terminal C ou N que confere as características desejadas, por exemplo, estabilização ou purificação simplificada do produto recombinante expresso. Neste contexto, os vetores de expressão adequados são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, o vetor de expressão de cDNA de Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, PcDNA1, PcDNA3 (Invitrogen) e pSPORT1 (GIBCO BRL).

[203] Em algumas modalidades, as sequências de controle de expressão podem ser sistemas promotores eucarióticos em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas, mas também podem ser utilizadas sequências de controle para hospedeiros procarióticos. Uma vez que o vetor tenha sido incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido sob condições adequadas para alto nível de expressão de sequências de nucleotídeos e, conforme desejado, a coleta e purificação das cadeias leves de imunoglobulina, cadeias pesadas, dímeros leves/pesados ou anticorpos intactos, fragmentos de ligação ou outras formas de imunoglobulina podem seguir-se. Vide, por exemplo, Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979).

[204] Em várias modalidades, vetores, particularmente plasmídeos, cosmídeos, vírus e bacteriófagos podem ser usados que compreendem um polinucleotídeo que codifica um domínio variável de uma cadeia de imunoglobulina de um anticorpo da presente invenção; opcionalmente em combinação com outro polinucleotídeo que codifica o domínio variável da outra cadeia de imunoglobulina de um anticorpo da presente invenção. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão e/ou transferência de gene ou vetor de direcionamento. Os vetores de expressão derivados de vírus, tais como retrovírus, vírus vacina, vírus adeno-associado, vírus do herpes ou vírus do papiloma bovino, podem ser usados para a entrega dos polinucleotídeos ou vetor da presente invenção em populações de células alvo. Quaisquer métodos que são conhecidos pelos versados na técnica podem ser usados para construir vetores virais recombinantes. Alternativamente, os polinucleotídeos e vetores fornecidos pela invenção podem ser reconstituídos em lipossomas para distribuição às células alvo. O (s) vetor (es) contendo os polinucleotídeos da presente invenção (por exemplo, o (s) domínio (s) variável (s) pesado (s) e/ou leve (s) das sequências de codificação das cadeias de imunoglobulina) podem ser transferidos para uma célula hospedeira por métodos conhecidos, que variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção de cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, enquanto o tratamento com fosfato de cálcio ou eletroporação pode ser usado para outros hospedeiros celulares.

[205] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é transformada com um polinucleotídeo ou vetor no presente documento descrito. A célula hospedeira pode ser uma célula procariótica ou eucariótica. O polinucleotídeo ou vetor que está presente na célula hospedeira pode ser integrado no genoma da célula hospedeira ou pode ser mantido extracromossomicamente. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica, como uma célula bacteriana, de inseto, fúngica, vegetal, animal ou humana. As células fúngicas preferidas são, por exemplo, aquelas do gênero Saccharomyces, como S. cerevisiae. Dependendo do hospedeiro usado em um procedimento de produção recombinante, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos codificados pelo polinucleotídeo podem ser glicosilados. Certos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos consistentes com a presente invenção também podem incluir um resíduo de aminoácido de metionina inicial. Um polinucleotídeo no presente documento descrito pode ser usado para transformar ou transfectar o hospedeiro usando qualquer uma das técnicas comumente conhecidas por aqueles versados na técnica. Além disso, os métodos para preparar genes fundidos, operacionalmente ligados e expressá-los em, por exemplo, células de mamíferos e bactérias são bem conhecidos na técnica. Em geral, os vetores de expressão contendo sequências promotoras que facilitam a transcrição eficiente do polinucleotídeo inserido são usados em conexão com um hospedeiro. O vetor de expressão contém tipicamente uma origem de replicação, um promotor e um terminador, bem como genes específicos que são capazes de fornecer seleção fenotípica das células transformadas. Células fonte adequadas para sequências de DNA e células hospedeiras para expressão e secreção de imunoglobulinas podem ser obtidas a partir de uma série de fontes, tais como Catálogo de Cultura do Tipo Americana ("Catalog of Cell Lines and Hybridomas," Quinta Edição (1985) Manassas, Va., EUA e outra versão disponível, incorporada no presente documento por referência). Além disso, os animais transgênicos, por exemplo, mamíferos, compreendendo células da invenção podem ser usados para a produção em grande escala dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos.

[206] Em outra modalidade, é descrito um hibridoma que produz o anticorpo DC2E7. O hibridoma foi depositado no Catálogo de Cultura do Tipo Americana no Depósito de Patentes No. PTA-124992.

[207] Em outra modalidade, é descrito um hibridoma que produz o anticorpo DC2E2. O hibridoma foi depositado no Catálogo de Cultura do Tipo Americana no Depósito de Patentes No. PTA-124991. Composições, Formulações e Combinações

[208] Em algumas modalidades exemplares, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste no presente documento descrito pode ser coformulado e/ou coadministrado com um ou mais compostos adicionais que também são úteis na detecção, prevenção e/ou tratamento de AD ou outra tauopatia.

[209] Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo no presente documento descrito é formulado para uso em um ensaio para detectar tau fosforilada em uma amostra biológica de um objeto humano (por exemplo, CSF ou sangue). Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é conjugado a um marcador detectável, por exemplo, uma enzima, um radioisótopo, um fluoróforo, um marcador de ressonância magnética nuclear ou um metal pesado. Em algumas modalidades, dois ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, etc.) anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos são formulados adequadamente para uso no ensaio. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno compreendem clones de anticorpo DC2E7 ou DC2E2 e/ou anticorpos ou fragmentos compreendendo as CDRs ou domínios variáveis desses clones, sozinhos ou conjugados com marcadores detectáveis adequados. Em algumas modalidades, as formulações compreendem ainda elementos e reagentes adicionais (por exemplo, suportes sólidos ou partículas, como esferas magnéticas) adequados para uso em ensaios de diagnóstico, como os ensaios de ELISA clássicos e digitais descritos abaixo.

[210] Em algumas modalidades, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos são preparados para uso em métodos de detecção de tau fosforilada em uma amostra biológica. Por exemplo, os anticorpos podem ser preparados e formulados conforme discutido no Exemplo 3 abaixo. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, por exemplo, DC2E7, DC149, DC807 e/ou DC2E2 ou fragmentos de ligação ao antígeno ou variantes dos mesmos, podem ser purificados a partir do sobrenadante de hibridoma sem soro, por exemplo, usando uma coluna de afinidade de Proteína G. O sobrenadante purificado pode então ser eluído, por exemplo, com 0,1 M de Glicina-HCl, pH 2,7 e neutralizado com 1 M de Tris-HCl pH 9,0. As frações agrupadas podem ser dialisadas em uma solução tampão, como solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em algumas modalidades, a solução de anticorpo tamponada pode ser concentrada, por exemplo, por ultrafiltração. Em algumas modalidades, a concentração do anticorpo é determinada medindo a absorbância a 280 nm, usando a fórmula c (mg/ml) = A280nm/1,43.

[211] DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno, quando usado como o anticorpo de captura no ELISA digital, pode ser preparado em uma solução tampão adequada. Em algumas modalidades, DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno é imobilizado em um suporte sólido (por exemplo, uma superfície sólida ou esfera de captura ELISA). Em algumas modalidades, o DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno é unido a uma superfície sólida, por exemplo, conforme descrito de acordo com o Exemplo 10 abaixo. Resumidamente, DC2E7 pode ser acoplado a uma esfera, por exemplo, uma esfera magnética (Quanterix). Em algumas modalidades, o DC2E7 é acoplado à esfera a uma concentração de cerca de 0,1 a 5,0 mg/mL (por exemplo, cerca de 1,0 mg/mL). Em algumas modalidades, o DC2E2 ou um fragmento de ligação ao antígeno é usado como um anticorpo detector e pode ser conjugado a um marcador detectável. Por exemplo, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser biotinilado para fins de detecção, por exemplo, por exposição a 1 a 200 vezes (por exemplo, cerca de 120 vezes) em excesso de biotina em relação à concentração de anticorpo.

[212] Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo no presente documento descrito pode ser coformulado e/ou coadministrado com um marcador detectável. Em algumas modalidades, o marcador detectável é uma enzima, um radioisótopo, um fluoróforo, um marcador de ressonância magnética nuclear ou um metal pesado. Em algumas modalidades, o marcador detectável está em associação (por exemplo, covalente ou não covalente) com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno. Aditivos adequados e condições de formulação para administração de anticorpos podem ser usados, por exemplo, aqueles conhecidos na técnica para formular anticorpos para administração parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular), ou injeção intravenosa, intramuscular ou subcutânea.

[213] Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é formulado em combinação com compostos adicionais que também são úteis na prevenção e/ou tratamento de AD ou outra tauopatia. Estes incluem, sem limitação, compostos que são úteis em imunoterapias ativas e passivas para AD, tais como peptídeos beta-amiloides (por exemplo, peptídeos beta amiloides N-terminais) e peptídeos tau que podem ou não ser conjugados a outros compostos, como toxina da difteria mutada, KLH ou outros veículos. Outras opções incluem anticorpos contra beta- amiloide, como bapineuzumab, solaneuzumab, gantenerumab, crenezumab, ponezumab e imunoglobulina IVIG, outras terapias de imunização direcionadas a oligômeros Abeta, outros anticorpos tau, compostos que impedem a hiperfosforilação de tau e outras terapias de imunização ativa e passiva segmentação de agregados de tau.

[214] Outras drogas que podem ser úteis na terapia de combinação com os anticorpos e fragmentos de ligação de tau descritos no presente documento incluem inibidores da agregação de beta-amiloide (por exemplo, Tramiprosato), inibidores da gama- secretase (por exemplo, semagacestat) e moduladores da gama- secretase (tarenflurbil). Além disso, um ou mais dos novos anticorpos descritos no presente documento podem ser usados ou formulados em combinação com dois ou mais dos agentes terapêuticos precedentes. Nos estágios iniciais da doença, as terapias combinadas podem ser vantajosas. As terapias de combinação também são vantajosas em estágios posteriores da doença, como a combinação de hAb e fatores de crescimento e outras moléculas biologicamente ativas que induzem plasticidade neuronal e regeneração.

Essas terapias de combinação podem utilizar vantajosamente dosagens mais baixas dos agentes terapêuticos administrados, evitando assim possíveis toxicidades ou complicações associadas às várias monoterapias.

De acordo com uma modalidade relacionada, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste no presente documento descrito pode ser usado em combinação com pelo menos um agente de combinação escolhido a partir de inibidores da acetilcolinesterase (por exemplo, donepezil, rivastigmina, galantamina, tacrina, suplementos nutricionais), antagonistas do receptor de N-Metil-D-aspartato (NMDA) (por exemplo, memantina), inibidores de reparo de DNA (por exemplo, pirenzepina ou um metabólito do mesmo), quelantes de metais de transição, fatores de crescimento, hormônios, ant-iinflamatórios não esteroidais (NSAID), antioxidantes, agentes redutores de lipídios, inibidores seletivos da fosfodiesterase, inibidores da agregação de tau, inibidores de proteínas quinases, inibidores de drogas antidisfunção mitocondrial, neurotrofinas, inibidores de proteínas de choque térmico, inibidores de fosfolipase A2 associada à lipoproteína e quaisquer sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Em uma modalidade, um anticorpo descrito e/ou fragmento de ligação a tau do mesmo é combinado com um inibidor de colinesterase (ChEI) e/ou memantina.

Em uma modalidade, o agente de combinação é selecionado a partir do grupo que consiste em um composto antiapoptótico, um quelante de metal, um inibidor de reparo de DNA, ácido 3-amino-1 a propanossulfônico (3APS), 1,3-propanodissulfonato (1,3PDS), um ativador de secretase, um inibidor de beta-secretase, um inibidor de gama-secretase, um peptídeo beta-amiloide, um anticorpo beta- amiloide, um neurotransmissor, um quebrador de folha beta, uma molécula anti-inflamatória e um inibidor de colinesterase.

Em uma modalidade, o inibidor da colinesterase é rivastigmina, donepezil,

galantamina ou um suplemento nutritivo. Em outra modalidade, o agente adicional é selecionado a partir de inibidores BACE; antagonistas muscarínicos; inibidores da colinesterase; inibidores da gama secretase; moduladores de gama secretase; inibidores de HMG- CoA redutase; agentes anti-inflamatórios não esteroides; antagonistas do receptor N-metil-D-aspartato; anticorpos antiamiloide; vitamina E; agonistas do receptor de acetilcolina nicotínico; agonistas inversos do receptor CB1 ou antagonistas do receptor CB1; um antibiótico ic; secretagogos do hormônio do crescimento; antagonistas de histamina H3; Agonistas de AMPA; inibidores de PDE4; agonistas inversos de GABAA; inibidores da agregação amiloide; inibidores de glicogênio sintase quinase beta; promotores da atividade da alfa secretase; inibidores de PDE-10 e inibidores de absorção do colesterol.

[215] Outros compostos que podem ser usados em combinação com o anticorpo e o fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descritos incluem os anticorpos e peptídeos terapêuticos descritos na U.S. 9.518.101, que é incorporado no presente documento por referência em sua totalidade. Também são úteis os compostos descritos em WO 2004/058258, que é incorporado no presente documento por referência na sua totalidade (vide especialmente as páginas 16 e 17), incluindo alvos terapêuticos de drogas (páginas 36-39), ácidos alcanossulfônicos e ácidos alcanolsulfúricos (páginas 39-51), inibidores da colinesterase (páginas 51 a 56), antagonistas do receptor NMDA (páginas 56-58), estrogênios (páginas 58-59), drogas anti-inflamatórias não esteroides (páginas 60- 61), antioxidantes (páginas 61 a 62), agonistas do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma (PPAR) (páginas 63-67), agentes de redução do colesterol (páginas 68-75); inibidores de amiloide (páginas 75-77), inibidores de formação de amiloide (páginas 77-78), quelantes de metal (páginas 78-79), antipsicóticos e antidepressivos (páginas 80-

82), suplementos nutricionais (páginas 83-89) e compostos que aumentam a disponibilidade de substâncias biologicamente ativas no cérebro (vide páginas 89-93) e pró-drogas (páginas 93 e 94). Outros compostos que podem ser usados em combinações incluem aqueles descritos em Cummings et al., Alzheimer’s disease drug development pipeline: 2017, Alzheimer’s & Dementia: Translational Research & Clinical Interventions 3 (2017) 367-384.

[216] Também são fornecidas no presente documento composições compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito no presente documento, e outro componente, como um veículo. Também são fornecidas composições/formulações compreendendo um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito no presente documento, e um veículo, por exemplo, um veículo adequado para usos diagnósticos ou terapêuticos.

[217] Em uma modalidade, as formulações e composições dos anticorpos usados de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento e/ou administração por mistura de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tendo o grau de pureza desejado com veículos opcionais, por exemplo, veículos, diluentes, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 21ª edição, Mohr, M. Ed. (2006)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Em uma modalidade, os veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis não são tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbezilamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, butil ou benilalcolol; alquilparabenos tais como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m- cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal, tais como sódio, complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou surfactantes não iônicos, tais como TWEEN, PLURONICS ou polietilenoglicol (PEG). Exemplos de formulações de anticorpos liofilizados são descritos em WO 97/04801, expressamente incorporado no presente documento por referência.

[218] Em uma modalidade, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para administração a um objeto. Em certas modalidades, a composição farmacêutica compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme descrito no presente documento, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento de absorção e similares que são fisiologicamente compatíveis. Exemplos adicionais de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais de água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similares, bem como suas combinações. Em muitos casos, a composição incluirá agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis podem compreender ainda pequenas quantidades de substâncias auxiliares, como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões, que aumentam a vida útil ou a eficácia do anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo.

[219] As composições no presente documento descritas, compreendendo os anticorpos descritos ou fragmentos de ligação ao antígeno, podem estar em uma variedade de formas. Estes incluem, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semilíquidas, semissólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e supositórios. Em algumas modalidades, tais composições também podem compreender tampões (por exemplo, solução salina tamponada neutra ou solução salina tamponada com fosfato), carboidratos (por exemplo, glicose, manose, sacarose ou dextranos), manitol, proteínas, polipeptídeos ou aminoácidos, tais como glicina, antioxidantes, quelantes agentes como EDTA ou glutationa, adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio) e/ou conservantes. Alternativamente, as composições da presente invenção podem ser formuladas como um liofilizado. Os anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno também podem ser encapsulados em lipossomas.

[220] As formas de dosagem adequadas para uso em ensaios de diagnóstico ou para administração interna geralmente contêm de cerca de 0,1 miligrama a cerca de 500 miligramas de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo por unidade ou recipiente. Nessas composições, o ingrediente ativo estará normalmente presente em uma quantidade de cerca de 0,5-99,999% em peso com base no peso total da composição. A forma de dosagem preferida depende do uso pretendido e/ou modo de administração.

[221] Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos podem atravessar a barreira hematoencefálica ou são formulados para atravessar a barreira hematoencefálica. Certas doenças neurodegenerativas, incluindo AD e tauopatias relacionadas, estão associadas a um aumento na permeabilidade da barreira hematoencefálica, de modo que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo possa ser facilmente introduzido no cérebro. Quando a barreira hematoencefálica permanece intacta, existem várias abordagens conhecidas na técnica para transportar moléculas através dela, incluindo, mas não se limitando a, métodos físicos, métodos baseados em lipídios e métodos baseados em receptores e canais. Os métodos para contornar a barreira hematoencefálica incluem, mas não estão limitados a, injeção direta no cérebro (vide, por exemplo, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)) e implantar um dispositivo de distribuição no cérebro (vide, por exemplo, Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003): e Gliadel Wafers, T.M., Guildford Pharmaceutical). Os métodos de criação de aberturas na barreira incluem, mas não estão limitados a, ultrassom (vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 2002/0038086), pressão osmótica (por exemplo, por administração de manitol hipertônico ((Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989))), permeabilização por, por exemplo, bradicinina ou permeabilizador A-7 (vide, por exemplo, Patentes U.S. 5.112.596, 5.268.164, 5.506.206, e

5.686.416), e transfecção de neurônios que se estendem pela barreira hematoencefálica com vetores contendo genes que codificam o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. 2003/0083299). Métodos baseados em lipídios para transportar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo através da barreira hematoencefálica incluem, mas não estão limitados a, encapsular o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em lipossomas que são acoplados a fragmentos ativos do mesmo que se ligam a receptores no endotélio vascular da barreira hematoencefálica (vide, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 20020025313), e revestir o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em partículas de lipoproteína de baixa densidade (vide, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 20040204354) ou apolipoproteína E (vide, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 20040131692).

[222] Em várias modalidades, uma composição pode compreender qualquer um ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos e um veículo e/ou diluente. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma ou mais (por exemplo, todas as seis CDRs e/ou um domínio variável de cadeia pesada e/ou leve) sequência selecionada daquelas mostradas na Tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma das sequências mostradas na tabela 1, por exemplo, um conjunto de seis CDRs e/ou sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve emparelhadas listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende SEQ ID NOS: 29 e 30. Em algumas modalidades, a composição é adequada para uso em um ensaio de diagnóstico, por exemplo, ELISA clássico ou digital. Em algumas modalidades, a composição é uma composição farmacêutica e compreende um veículo farmaceuticamente aceitável.

[223] Em certas modalidades, uma composição compreende quaisquer dois anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, conforme descrito precedentemente. Em certas modalidades, uma composição compreende pelo menos um outro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno e/ou pelo menos um agente adicional. Em uma modalidade exemplar, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e o outro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[224] Em algumas modalidades, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma ou mais (por exemplo, todas as seis CDRs e/ou um domínio variável de cadeia pesada e/ou leve) sequência selecionada daquelas mostradas na Tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma das sequências mostradas na tabela 1, por exemplo, um conjunto de seis CDRs e/ou sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve emparelhadas listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende SEQ ID NOS: 29 e 30. Em algumas modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma ou mais (por exemplo, todas as seis CDRs e/ou um domínio variável de cadeia pesada e/ou leve) da sequência selecionada daquelas mostradas na Tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma das sequências mostradas na tabela 1, por exemplo, um conjunto de seis CDRs e/ou sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve emparelhadas listadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende SEQ ID NOS: 29 e 30.

[225] Em algumas modalidades, a composição é adequada para uso em um ensaio de diagnóstico, por exemplo, ELISA clássico ou digital. Em algumas modalidades, a composição é uma composição farmacêutica e compreende um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode compreender ainda pelo menos um agente terapêutico adicional para o tratamento da doença de Alzheimer ou outra tauopatia. Métodos de Tratamento

[226] Os anticorpos e composições no presente documento descritos podem ser usados para vários métodos de tratamento e prevenção de AD e outras tauopatias. Em algumas modalidades, os anticorpos e as composições podem ser usados para detectar pacientes adequados para tratamentos baseado em anti-tau, para informar a seleção do tratamento ou para monitorar o progresso do tratamento ao longo do tempo. Em outras modalidades, os anticorpos e as composições no presente documento descritos podem ser usados como tratamentos diretos ou prevenção para AD e outras tauopatias por administração de um ou mais anticorpos ou composições a um paciente em necessidade dos mesmos.

[227] Em aplicações preventivas (ou seja, profiláticas), os anticorpos e composições farmacêuticas no presente documento descritos (por exemplo, anticorpo DC2E7 ou um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que pode se ligar ao mesmo epítopo que, ou compreende as CDRs ou domínios variáveis do anticorpo DC2E7) pode ser administrado a um paciente suscetível a, ou de outra forma em risco de, doença de Alzheimer ou outra tauopatia. Em algumas modalidades, o anticorpo ou composição farmacêutica é administrado em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco, diminuir a gravidade ou atrasar o início da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários que se apresentam durante o desenvolvimento da doença. Em aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um paciente suspeito, diagnosticado e/ou já sofrendo de tal doença em uma quantidade suficiente para curar ou, pelo menos, reduzir parcialmente, deter ou reverter os sintomas da doença (bioquímicos, histológica e/ou comportamental), incluindo suas complicações e fenótipos patológicos intermediários no desenvolvimento da doença.

[228] Em algumas modalidades, o tratamento da doença de Alzheimer refere-se a diminuir ou prevenir a deterioração comportamental, funcional e cognitiva ao longo do tempo. Em algumas modalidades, os aspectos comportamentais, funcionais e cognitivos da doença de Alzheimer podem ser avaliados por qualquer um ou mais de uma série de testes padronizados conhecidos por pessoas de habilidade comum na técnica, incluindo, mas não se limitando a, testes neuropsicológicos, o Miniexame do Estado Mental, Miniexame cog, Inventário Neuropsiquiátrico, Escala de Avaliação de Demência Blessed Roth, Escalas de Avaliação Neuropsicológicas (SENAS) em Espanhol e Inglês, Avaliação Comportamental Psiquiátrica, Avaliação Funcional, Teste de Desenho do Relógio, Teste de Nomenclatura de Boston. Teste de Aprendizado Verbal da Califórnia, Lista de Verificação de Sintomas Cognitivos, Teste de Desempenho Contínuo, Teste de Associação de Palavras Oral Controlada, Cognistat, Teste de Atenção d2, Sistema de Função de Execução Delis-Kaplan, Escala de Classificação de Demência, Teste de Vigilância do Dígito, Teste de Fluência de Figura, Teste de Batidas do Dedo, Teste de Categoria Halstead, Bateria Neuropsicológica Halstead-Reitan, Teste de

Organização Visual Hooper, Avaliação Neurocognitiva Kaplan Baycrest, Avaliação Neuropsicológica Kaufman Short, Bateria Neuropsicológica Luria-Nebraska, Escalas de Avaliação de Memória, Teste de Triagem Neurológica Rápida, Bateria Repetível para Avaliação do Status Neuropsicológico, Teste de Stroop, Teste de Modalidades de Símbolos-Dígitos, Teste de Desempenho Tactual, Teste de Apercepção Temática, Torre de Londres, Testes de Trilha A e B, Testes de Fluência Verbal (Palavra), e Teste de Classificação de Cartas Wisconsin. Também são usados testes adicionais para depressão, ansiedade, afasia, agitação e parâmetros comportamentais conhecidos por pessoas ordinariamente versadas na técnica. Além disso, em algumas modalidades, os pacientes podem ser diagnosticados ou monitorados quanto à eficácia do tratamento usando qualquer um dos métodos de detecção descritos no presente documento envolvendo um ou mais dos anticorpos descritos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos.

[229] Em algumas modalidades, os anticorpos e composições farmacêuticas descritos no presente documento (por exemplo, anticorpo DC2E7 ou um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que pode se ligar ao mesmo epítopo que, ou compreende as CDRs ou domínios variáveis do anticorpo DC2E7) podem ser administrados para tratar AD ou outra tauopatia em um paciente. Em algumas modalidades, a eficácia de um tratamento da doença de Alzheimer é determinada pela melhora ou falta de deterioração ou redução na taxa de deterioração em pelo menos uma avaliação selecionada a partir do grupo que consiste em Escala de Avaliação da Doença de Alzheimer - subescala cognitiva (ADAS-cog), a Soma de Caixas de Avaliação de Demência Clínica (CDR-sb), Atividades de Estudo Cooperativo da Doença de Alzheimer da Escala de Vida Diária (ADCS-ADL), o inventário Neuropsiquiátrico (NPI), a Escala de

Deterioração Progressiva (PDS), Atividades Instrumentais de Amsterdam da Vida Diária (AIVD), a Escala de Avaliação de Demência Clínica (CDR), a Avaliação de Incapacidade para Escala de Demência (DAD), e a Avaliação do Estado Minimental (MMSE). Em algumas modalidades, o tratamento resulta em uma redução na taxa de deterioração nas pontuações ADAS-cog. Em outras modalidades, o tratamento resulta em uma redução mediana na taxa de deterioração das pontuações ADAS-cog de dois a cinco pontos.

[230] Em algumas modalidades, um método para retardar a progressão da doença de Alzheimer é fornecido, compreendendo a administração de um ou mais dos anticorpos descritos, por exemplo, anticorpo DC2E7 ou um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo epítopo que, ou compreende as CDRs ou domínios variáveis do anticorpo DC2E7. Em uma modalidade, "atrasar" a progressão da DA significa adiar, impedir, retardar, retardar, estabilizar e/ou adiar o desenvolvimento da doença. Esse retardo pode ser por um período de tempo variável, dependendo do histórico da doença e/ou do indivíduo sendo tratado. Como é evidente para um especialista na técnica, um atraso suficiente ou significativo pode, com efeito, abranger a prevenção, em que o indivíduo não desenvolve a doença. Em uma modalidade, um método que "retarda" a progressão da AD ou outra tauopatia é um método que reduz a probabilidade de desenvolvimento da doença em um determinado período de tempo e/ou reduz a extensão da doença em um determinado período de tempo, quando comparado ao não uso do método. Essas comparações são normalmente baseadas em estudos clínicos, usando um número estatisticamente significativo de objetos.

[231] Em certas modalidades, AD ou outra tauopatia pode ser atrasada por dias, meses ou anos. Por exemplo, o método pode atrasar o progresso de AD ou outra tauopatia por uma ou mais semanas, meses ou anos.

[232] Pacientes, objetos ou indivíduos incluem mamíferos, como humanos, bovinos, equinos, caninos, felinos, suínos e ovinos. O objeto pode ser um ser humano e pode ou não estar afetado por uma doença ou apresentar sintomas no momento. No caso de AD, virtualmente qualquer pessoa corre o risco de sofrer de AD se viver o suficiente. Portanto, os presentes métodos podem ser administrados profilaticamente à população em geral sem a necessidade de qualquer avaliação do risco do paciente em questão. Em outras modalidades, o objeto é avaliado para AD usando um método para detecção no presente documento descrito.

[233] Em uma modalidade, o paciente no presente documento é opcionalmente submetido a um teste de diagnóstico antes da terapia, que pode incluir os métodos de diagnóstico no presente documento descritos. Em uma modalidade, os métodos descritos são úteis para indivíduos que têm um risco genético conhecido de AD. Esses indivíduos incluem aqueles que têm parentes que sofreram dessa doença e aqueles cujo risco é determinado pela análise de marcadores genéticos ou bioquímicos. Os marcadores genéticos de risco para AD incluem mutações no gene APP, particularmente mutações na posição 717 e posições 670 e 671 referidas como mutações Hardy e Swedish, respectivamente. Vide Hardy (1997) Trends Neurosci. 20: 154-9). Outros marcadores de risco são mutações nos genes da presenilina, PS1 PS2 e ApoE4, histórico familiar de AD, hipercolesterolemia ou aterosclerose. Os indivíduos que atualmente sofrem de AD também podem ser identificados a partir de características comportamentais. Em pacientes assintomáticos, o tratamento pode começar em qualquer idade (por exemplo, 10, 20, 30). Em alguns pacientes, pode não ser necessário iniciar o tratamento e/ou monitoramento até que o paciente atinja uma idade mais avançada, por exemplo, 40, 50, 60 ou 70, ou mais tarde, ou qualquer período de tempo entre. O tratamento pode envolver várias dosagens ao longo de um período de tempo. O tratamento pode ser monitorado de várias maneiras, incluindo o uso dos métodos de detecção de AD no presente documento descritos.

[234] O uso periódico de um ou mais desses testes pode aconselhar um médico ou outro profissional médico quanto à progressão ou regressão da doença de Alzheimer e tauopatias relacionadas e a necessidade de tratamento adicional. A escolha do teste e a determinação do sucesso do tratamento são da competência dos profissionais médicos na área da doença de Alzheimer. Uma pontuação melhorada em um ou mais testes é uma indicação de diminuição na gravidade da AD naquele objeto.

[235] Em várias modalidades, é descrito um método para tratamento, retardamento da progressão ou prevenção da progressão da doença de Alzheimer de outra tauopatia em um objeto, compreendendo administrar ao objeto uma quantidade eficaz de pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito. Este método pode resultar na redução do comprometimento motor, melhorando a função motora, reduzindo o comprometimento cognitivo, melhorando a função cognitiva ou uma combinação dos mesmos. O uso de qualquer anticorpo no presente documento descrito pode ser usado no tratamento, retardamento da progressão ou prevenção da doença de Alzheimer pela administração do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno a um objeto em necessidade do mesmo.

[236] Métodos de detecção e monitoramento da progressão da AD e outras tauopatias

[237] A invenção no presente documento se concentra, em parte, na descoberta de certos resíduos de epítopo em tau, particularmente aqueles contendo um ou mais resíduos fosforilados em tau, que podem ser detectados em certas amostras biológicas (por exemplo, sangue ou CSF) e usados para identificar e distinguir AD, outras tauopatias e outras formas de demência.

Por exemplo, os resíduos de epítopo úteis podem compreender um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10). Em certas modalidades, o epítopo compreende um ou mais dos resíduos 210-221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). Em certas modalidades, o epítopo compreende pelo menos um resíduo fosforilado, por exemplo, fosfo- treonina na posição 217 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) e, opcionalmente, também compreende uma serina fosforilada na posição 210, treonina na posição 212, serina na posição 214, ou treonina na posição 220 da proteína tau 2N4R, ou qualquer combinação das mesmas.

Em outra modalidade, o epítopo compreende ou consiste em SRTPSLPpTPPTR (sequência de SEQ ID NO: 12) ou aquele trecho de resíduos de aminoácidos com uma ou mais posições fosforiladas adicionais nele.

Em outra modalidade, o epítopo compreende ou consiste em SRpTPSLPpTPPTR (sequência de SEQ ID NO: 31). A invenção é baseada em parte na descoberta surpreendente de que a quantidade de espécies de tau fosforiladas nessas amostras pode ser usada para distinguir AD de outras tauopatias e de objetos com outras formas de demência e, assim, diagnosticar, monitorar e/ou orientar as decisões de tratamento para AD ou para outra tauopatia ou para outra causa de demência com base nos resultados do ensaio.

Sem estar limitado pela teoria, a descoberta de que o nível desses epítopos fosforilados (por exemplo, na posição 217) pode ser usado para distinguir AD, outras tauopatias e outras formas de demência em certas amostras é particularmente inesperado, dado o fato de que os epítopos fosforilados podem frequentemente ser detectados no cérebro em diferentes tauopatias.

[238] A invenção fornecida no presente documento também se concentra, em parte, em anticorpos (por exemplo, quaisquer anticorpos compreendendo uma ou mais sequências mostradas na Tabela 1, por exemplo, todas as seis CDRs e/ou um domínio variável de cadeia pesada e/ou leve selecionado daqueles mostrado na Tabela 1) que são capazes de se ligar a esses epítopos de tau fosforiladas particulares em certos tipos de amostras biológicas (por exemplo, CSF ou sangue) e são particularmente úteis para identificar e distinguir AD, outras tauopatias e outras formas de demência com base no nível de ligação nas amostras. A invenção é baseada em parte na descoberta surpreendente de que a quantidade de espécies de tau fosforiladas ligadas pelos anticorpos descritos nessas amostras pode ser usada para distinguir AD de outras tauopatias e de objetos com outras formas de demência e, assim, diagnosticar, monitorar e/ou orientar as decisões de tratamento para AD ou para outra tauopatia ou para outra causa de demência com base nos resultados do ensaio.

[239] Além da AD, outras tauopatias são conhecidas na técnica, incluindo demência frontotemporal (FTD), doença corticobasal (CBD) e paralisia supranuclear progressiva (PSP). Murray et al., Clinicopathologic assessment and imaging of tauopathies in neurodegenerative dementias, Alzheimer’s Research & Therapy, 6: 1,

2014. Inúmeras outras causas de demência também são conhecidas. Sem estar limitado pela teoria, as quantidades elevadas das espécies de tau fosforiladas em certas amostras biológicas de pacientes com AD e pacientes com outras tauopatias (por exemplo, CSF ou sangue) que são ligadas pelos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno descritos no presente documento podem contribuir para sua utilidade na detecção e distinção não invasiva de AD de outras causas de demência ou outras tauopatias nestes fluidos corporais.

[240] Numerosas espécies de tau estão presentes em certos tipos de amostras (por exemplo, sangue e/ou CSF) tanto de objetos saudáveis quanto daqueles com demência.

Apesar desses muitos alvos potenciais, os anticorpos que podem se ligar a determinadas espécies de tau nessas amostras podem fornecer poder diagnóstico (por exemplo, anticorpos que se ligam a espécies de tau apenas presentes em amostras objetos indivíduos com AD e/ou outras tauopatias ou presentes em amostras daqueles objetos em níveis elevados e/ou distintos) não foram identificados precedentemente.

Sem ser limitado pela teoria, em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento fornece uma melhoria em relação à técnica devido à sua capacidade de se ligar a um epítopo fosforilado em tau que está presente em certos tipos de amostras (por exemplo, sangue ou CSF) de um paciente com AD em um nível maior do que em uma amostra comparável de um paciente com outra tauopatia, outra doença neurológica ou em um objeto saudável.

Esta diferença pode ser usada, em algumas modalidades, para detectar se um objeto que apresenta demência tem AD, outra tauopatia ou outra causa de demência e/ou para monitorar o curso do tratamento de AD.

Por exemplo, limites distintos ou diferenças de dobra na quantidade de tau ligada pelo anticorpo (por exemplo, em comparação com os níveis em objetos saudáveis ou em comparação com objetos com causas conhecidas de demência) podem ser detectados e correlacionados com AD, outra tauopatia ou outra causa de demência em um objeto.

Em algumas modalidades, esta diferença pode ser usada para detectar se um objeto que apresenta demência tem AD ou outra tauopatia.

Em algumas modalidades, esta diferença pode ser usada para detectar se um objeto que apresenta demência tem AD ou alguma outra causa de demência.

Em algumas modalidades, esta diferença pode ser usada para distinguir se um objeto que apresenta demência tem AD ou outra tauopatia. Em algumas modalidades, esta diferença pode ser usada para distinguir se um objeto que apresenta demência tem AD ou alguma outra causa de demência.

[241] Em várias modalidades, um método para detectar uma tauopatia em um objeto é descrito, compreendendo: obter uma amostra biológica do objeto; contatar a amostra do objeto com uma quantidade eficaz de uma molécula que é capaz de formar um complexo tau-molécula (por exemplo, pelo menos um receptor, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento que é capaz de ligar tau para formar um tau complexo de anticorpo); detectar a presença e/ou quantidade do complexo tau- molécula usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito; em que a presença e/ou quantidade de complexo tau-molécula indica uma tauopatia no objeto. Em várias modalidades, um método para detectar uma tauopatia em um objeto compreende: contatar uma amostra biológica do objeto com uma quantidade eficaz de pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento que é capaz de se ligar a tau para formar um complexo tau-anticorpo, em que a presença e/ou quantidade do complexo tau-anticorpo indica uma tauopatia no objeto. Em algumas modalidades, a detecção é por um bioensaio de redução imunomagnética, por exemplo, usando um dispositivo de bioensaio da MagQu Co. Ltd.

[242] Em algumas modalidades, a tau detectada na amostra é uma tau fosforilada. Em várias modalidades, o pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10). Em várias modalidades, o pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos

210-221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno usados nos métodos compreendem uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[243] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno usado nos métodos compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 com uma substituição na posição 2, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 com uma substituição em uma ou mais das posições 2 e 12, e/ou HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e/ou em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 com uma substituição na posição 2, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e/ou

LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em várias modalidades, a substituição na posição 2 em HCDR1 é glicina, a substituição na posição 2 em HCDR2 é isoleucina, a substituição na posição 12 em HCDR2 é valina e/ou a substituição na posição 2 em LCDR1 é asparagina.

[244] Em várias modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma das sequências mostradas na tabela 1, por exemplo, um conjunto de seis CDRs e/ou sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve emparelhadas listadas na Tabela 1.

[245] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno usado nos métodos compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno usado nos métodos descritos pode, em várias modalidades, compreender DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou qualquer uma das variantes no presente documento descritas que são capazes de ligação a tau. Em várias modalidades, o antígeno ou fragmento de ligação ao antígeno adicionalmente compreende um marcador detectável.

[246] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 7 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 2, 3, 9, 12, 19, 30, 31, 35, 37, 42, 43, 48, 49, 51, 54, 55, 56, 58, 62, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 73, 76, 77, 78, 79, 80, 83, 84, 88, 94, 96, 107, 108 e 112, e/ou a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 8 com uma substituição em um ou mais da posição 3, 7, 11, 14, 17, 19, 20, 21, 24, 25, 28, 39, 42, 49, 52, 56, 69, 71, 75, 92, 94, 99, 105 e 106. Em algumas modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 1 é glicina, na posição 2 é alanina, na posição 3 é arginina, na posição 9 é arginina, na posição 12 é alanina, na posição 19 é arginina, na posição 30 é glicina, na posição 31 é glicina, na posição 35 é arginina, na posição 37 é alanina, na posição 42 é glicina, na posição 43 é metionina, na posição o íon 48 é isoleucina, na posição 49 é treonina, na posição 51 é valina, na posição 54 alanina, na posição 55 é glicina, na posição 56 é serina, na posição 58 é valina, na posição 62 é glicina, na posição 63 é alanina, na posição 64 é selecionada a partir de alanina e ácido glutâmico, na posição 65 é ácido glutâmico, na posição 66 é ácido aspártico, na posição 68 é leucina, na posição 69 é alanina, na posição 70 é treonina, na posição 73 é asparagina, na posição 76 é glutâmico ácido, na posição 77 é serina, na posição 78 é alanina, na posição 79 é metionina, na posição 80 é selecionado de serina, leucina e histidina, na posição 83 é treonina, na posição 84 é alanina, na posição 88 é prolina, na posição 94 é cisteína, na posição 95 é glicina, na posição 107 é alanina, na posição 108 é prolina e/ou na posição 112 é prolina e/ou a substituição na região variável de cadeia leve na posição 3 é arginina, na posição 7 é prolina, na posição 11 é selecionada a partir de serina e leucina, na posição 14 é prolina, na posição 17 é valina, na posição 19 é alanina, na posição 20 é alanina, na posição 21 é valina, na posição 24 é ácido glutâmico, na posição 25 é treonina, na posição 28 asparagina, na posição 39 isoleucina, na posição 42 é selecionada a partir de serina e ácido aspártico, na posição 49 é prolina, na posição 52 é glicina, na posição 56 é prolina, em posição 69 é glicina, na posição 71 é histidina, na posição n 75 é valina, na posição 92 é arginina, na posição 94 é treonina, na posição 99 é serina, na posição 105 é glicina e/ou na posição 106 é valina.

[247] Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 68 é leucina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 39 é isoleucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 48 é isoleucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 30 é glicina e na posição 58 é valina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 7 é prolina e na posição 69 é glicina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é serina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 77 é serina e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina, na posição 20 é alanina e na posição 28 é asparagina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 37 é alanina, na posição 63 é alanina e a posição 80 é serina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 1 é glicina, na posição 3 é arginina, na posição 76 é ácido glutâmico e na posição 77 é serina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina.

[248] Em várias modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma das sequências mostradas na tabela 1, por exemplo, um conjunto de seis CDRs e/ou sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve emparelhadas listadas na Tabela 1.

[249] Em algumas modalidades, o método compreende o contato de uma amostra biológica de um objeto (por exemplo, sangue ou CSF) com pelo menos um anticorpo de captura e pelo menos um anticorpo de detecção. Em algumas modalidades, mais de um anticorpo de captura e/ou mais de um anticorpo de detecção é usado. Em algumas modalidades, os anticorpos de captura e detecção são os mesmos (por exemplo, ao detectar oligômeros de tau em uma amostra). Em algumas modalidades, um primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo de detecção) capaz de formar um complexo tau-anticorpo, e em que a presença do complexo tau- anticorpo é detectada usando um segundo anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo de detecção) no presente documento descrito. Em algumas modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se liga a um epítopo diferente em tau do que o primeiro anticorpo.

[250] Em algumas modalidades, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10) ou um ou mais dos resíduos 210-221 de proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). O epítopo pode compreender pelo menos um resíduo fosforilado na posição 217 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) e, opcionalmente, também pode compreender uma serina fosforilada na posição 210, treonina na posição 212, serina na posição 214 ou treonina na posição 220 da proteína tau 2N4R ou qualquer combinação das mesmas. Em certas modalidades, o epítopo em tau compreende ou consiste em SRTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO: 12). Em certas modalidades, o epítopo em tau compreende ou consiste em SRpTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO 31). Em algumas modalidades, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[251] Em outra modalidade, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.

[252] Em várias modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 151 a 188 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, o epítopo compreende um ou mais dos resíduos 163-172 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 14). Em certas modalidades, um ou mais dos resíduos no epítopo são fosforilados, por exemplo, uma treonina fosforilada na posição 169 da proteína tau 2N4R. Em algumas modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em certas modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. Em uma modalidade, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende o anticorpo DC2E2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[253] Em outras modalidades, o primeiro e o segundo anticorpos são invertidos e/ou mais de um primeiro e segundo anticorpos são usados (que podem ser os mesmos ou diferentes).

[254] Em algumas das modalidades reversas, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 151 a 188 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 13). Em algumas modalidades, o epítopo compreende um ou mais dos resíduos 163-172 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 14). Em certas modalidades, um ou mais dos resíduos no epítopo são fosforilados, por exemplo, uma treonina fosforilada na posição 169 da proteína tau 2N4R. Em algumas modalidades, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma das sequências mostradas na tabela 1, por exemplo, um conjunto de seis CDRs e/ou sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve emparelhadas listadas na Tabela 1.

[255] Em algumas modalidades, o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em uma modalidade, o f O primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. Em uma modalidade, o primeiro anticorpo ou antígeno o fragmento de ligação compreende o anticorpo DC2E2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[256] Em algumas das modalidades reversas, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10) ou um ou mais dos resíduos 210 - 221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11). O epítopo ligado ao segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode compreender pelo menos um resíduo fosforilado na posição 217 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, o epítopo também compreende uma serina fosforilada na posição 210, treonina na posição 212, serina na posição 214 ou treonina na posição 220 da proteína tau 2N4R ou qualquer combinação das mesmas. Em certas modalidades, o segundo anticorpo pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo SRTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende qualquer uma das sequências mostradas na tabela 1, por exemplo, um conjunto de seis CDRs e/ou sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve emparelhadas listadas na Tabela 1.

[257] Em algumas modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[258] Em várias modalidades, o primeiro ou segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é ligado e/ou revestido em uma superfície sólida ou partícula. A superfície sólida pode ser a superfície de uma placa de microtitulação. Uma placa de microtitulação ou placa de múltiplos poços tipicamente tem, por exemplo, 6, 12, 24, 48, 96, 384 ou 1536 ou mais poços de amostra dispostos em uma matriz retangular 2: 3. Cada poço normalmente contém algo entre dezenas de nanolitros e vários mililitros de líquido. Se uma partícula sólida for usada no lugar ou em adição a uma superfície sólida, pode ser uma esfera. A partícula pode ser uma esfera magnética. A esfera pode ser um leito de polímero sintético ou plástico que compreende: polietileno, polipropileno, poliestireno, poliamida, poliuretano, polímero fenólico,

nitrocelulose, polímero derivado naturalmente, borracha de látex, polissacarídeo, polipeptídeo, material compósito, cerâmica, sílica ou material à base de sílica, carbono, metal ou composto de metal, ouro, prata, aço, alumínio, cobre, vidro inorgânico ou material de sílica ou uma combinação dos mesmos. A esfera pode ter uma forma esférica, de disco, anel ou similar a um cubo.

[259] Em certas modalidades, o primeiro e/ou segundo anticorpo é conjugado a um marcador detectável. O marcador pode compreender uma enzima, um radioisótopo, biotina, um marcador de ressonância magnética nuclear, um metal pesado ou uma combinação dos mesmos. O método pode ainda compreender a detecção de um sinal do marcador detectável. Em uma modalidade, a detecção do marcador é conseguida pela detecção de um sinal fluorescente ou da intensidade desse sinal de um anticorpo marcado após a ligação a tau. Em algumas modalidades, o marcador detectável é biotina e é detectado pelo contato da amostra com estreptavidina conjugada a uma enzima, de preferência peroxidase de rábano, fosfatase alcalina ou β-galactosidase.

[260] Em certas modalidades, os métodos de detecção de tau no presente documento descritos compreendem um ensaio ELISA clássico/convencional (isto é, sistemas de leitura analógica). Adicionalmente ou alternativamente, os métodos podem compreender um ELISA digital (isto é, sistemas de leitura digital que permitem que as concentrações sejam determinadas digitalmente, em vez da medição do sinal analógico total até um único imunocomplexo, embora, em algumas concentrações, esses métodos também possam ser usados para ler sinais analógicos). Vide Rissin, D.M., et al., Single- molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol., 2010. 28(6), 555-

559. Por exemplo, uma matriz de molécula única (simoa) pode ser usada, que é um ELISA digital em que, após a formação de um complexo sanduíche em microesferas magnéticas, as contas são transferidas, em solução de substrato, para uma matriz de micropoços, por exemplo, micropoços do tamanho de um femtolitro. Em algumas modalidades, esses poços acomodam apenas uma esfera cada. Em algumas modalidades, após a adição de um substrato fluorogênico para a enzima com a qual o anticorpo de detecção é rotulado, um filme de óleo é então aplicado para selar os poços em um pequeno volume, por exemplo, confinando o volume da reação a 50 fL. Em algumas modalidades, este pequeno volume permite que um sinal legível seja detectado mesmo se apenas um complexo sanduíche estiver presente na esfera. Como repórter, a enzima β-galactosidase e o substrato resorufina-β-D-galactopiranosídeo podem ser usados e os poços com um sinal detectável são contados, assim como todos os poços contendo uma esfera. A razão entre essas contagens pode fornecer uma produção enzimática média por esfera (AEB). Quando a AEB é baixa (<0,1), a estatística de Poisson pode ser usada para mostrar que uma das esferas tem apenas um ou menos complexos em sua superfície. Quando o sinal AEB fica mais alto, aumentando a probabilidade de mais de um complexo por esfera, uma transição para cálculos de intensidade de luz pode ser usada, o que permite uma AEB utilizável mesmo em sinais > 0,1. O algoritmo para a transição pode ser implementado usando software para um instrumento Simoa, por exemplo, software que faz a amostragem e calibra, por exemplo, a partir de uma placa de microtitulação de 96 poços ou frascos separados.

[261] Outros imunoensaios são conhecidos na técnica e podem ser usados com os anticorpos descritos e anticorpos marcados para detectar tau fosforilada em uma amostra. Por exemplo, uma plataforma de contagem de molécula única (SMC) pode ser usada, por exemplo, aquela em que os anticorpos com e sem marcadores fluorescentes formam complexos sanduíche com tau, seja em esferas ou placas, os complexos são então quebrados e as moléculas de fluorescência anticorpos de detecção marcados (por exemplo, Alexa Fluor) são puxados para um tubo capilar e contados à medida que passam por um feixe de laser que excita o fluoróforo. Um evento digital pode ser contado se a fluorescência ultrapassar um limite de fundo. Em concentrações mais altas, a soma total de todos os fótons emitidos pode ser usada como leitura do sinal, permitindo uma alta faixa dinâmica. Em algumas modalidades, a detecção é por contagem de molécula única, por exemplo, usando um dispositivo de contagem de molécula única da Merck Millipore (desenvolvido pela Singulex). Outro imunoensaio de alta sensibilidade que pode ser usado envolve anexar nanopartículas magnéticas a um anticorpo no presente documento descrito e detectar uma alteração na oscilação das nanopartículas em um campo magnético alternado de uma maneira dependente da concentração após a ligação ao analito, por exemplo, detecção de redução imunomagnética (IMR). Em algumas modalidades, a detecção é por um bioensaio de redução imunomagnética, por exemplo, usando bioensaio da MagQu Co. Ltd.

[262] Em várias modalidades, uma amostra pode ser diluída antes de ser contatada com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em certas situações, os antígenos circulantes podem ser mascarados por anticorpos naturalmente existentes contra os antígenos que também circulam no sangue. A proteína p24 do HIV é um exemplo bem conhecido. Além disso, complexos tau/anticorpo anti-tau naturalmente existentes foram relatados na literatura. Wu J, Li L. Autoantibodies in Alzheimer’s disease: potential biomarkers, pathogenic roles, and therapeutic implications. Journal of Biomedical Research. 2016;30(5):361 a 372. A presença desses complexos pode interferir com os ensaios de detecção no presente documento descritos. Por conseguinte, em várias modalidades, a amostra pode ser submetida à dissociação de complexo imune (ICD) (por exemplo, dissociação do complexo tau-anticorpo/tau-molécula naturalmente existente na amostra de modo que tau não esteja mais ligada ao anticorpo/molécula naturalmente existente e é, portanto, livre para ser detectado pelos métodos da invenção) antes de ser contatado com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção. Em algumas modalidades, a dissociação de imunocomplexos é obtida aplicando calor e/ou ácido à amostra ou qualquer outro método conhecido de obtenção de ICD.

[263] Em qualquer uma das modalidades precedentes, a amostra biológica pode compreender fluido cerebroespinhal (CSF). O CSF pode ser obtido de um paciente, por exemplo, por uma punção lombar realizada em um ambiente médico. Alternativamente, a amostra biológica pode compreender plasma sanguíneo e/ou soro.

[264] Em várias modalidades, os métodos descritos no presente documento detectam a presença e/ou quantidade de uma tau fosforilada em uma amostra, que é comparada com a quantidade de tau fosforilada na amostra ao nível em uma amostra de controle de um indivíduo saudável, e em que um aumento no nível de tau fosforilada na amostra em relação ao controle indica uma tauopatia. Em outra modalidade, a tauopatia detectada é a doença de Alzheimer. Em certas modalidades, um aumento no nível de tau fosforilada em uma amostra de um objeto sobre uma amostra de um controle saudável e/ou um paciente com uma amostra de tauopatia não AD conhecida indica que o objeto tem doença de Alzheimer em vez de outra tauopatia ou outra causa de demência.

[265] Por exemplo, a 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 ou mais desdobramentos no nível de tau detectado por um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (ou qualquer aumento no meio) em uma amostra de um objeto com demência em comparação ao nível em uma amostra de controle de um objeto saudável pode indicar a presença de AD ou outra tauopatia.

Em algumas modalidades, o aumento de desdobramentos está entre cerca de 1 a 100 vezes ou cerca de 2-3 vezes.

Em algumas modalidades, o aumento de desdobramento é entre cerca de 1 a 50, 1 a 25, 1 a 10 ou 1 a 5 vezes.

Em algumas modalidades, um nível de tau ligada em uma amostra de um objeto com demência maior do que um limite (por exemplo, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 9,3 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ou 1000 pg/ml, ou qualquer valor entre) observado em uma amostra de controle de um objeto saudável pode indicar a presença de AD ou outra tauopatia.

Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 9,3 pg/ml de tau.

Em algumas modalidades, o limite é qualquer valor entre 0,93 e 93 pg/ml de tau.

Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 5,37 pg/ml.

Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 305 pg/ml.

Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 100-600 pg/ml.

Em algumas modalidades, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, ou mais de aumento desdobramento no nível de tau detectado por um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (ou qualquer aumento no meio) em uma amostra de um objeto com demência em comparação com o nível em um controle amostra de um paciente com uma tauopatia conhecida diferente de AD (por exemplo, FTD, CBD ou PSP), ou uma amostra de controle de um paciente com outra forma de demência, pode indicar a presença de AD no objeto com demência.

Em algumas modalidades, o aumento de desdobramento é entre cerca de 1 a 100 vezes, ou cerca de 1 a 50 vezes, ou cerca de 1 a 25 vezes, ou cerca de 1 a 5 vezes, ou cerca de 2-3 vezes. Em algumas modalidades, um nível de tau ligada em uma amostra de um objeto com demência maior do que um limite (por exemplo, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 9,3, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ou 1000 pg/ml, ou qualquer valor intermediário) observado em uma amostra de controle de um paciente com uma tauopatia conhecida diferente de AD (por exemplo, FTD, CBD ou PSP), ou uma amostra de controle de um paciente com outra forma de demência, pode indicar a presença de AD no objeto com demência. Em várias modalidades, o nível de tau detectado pela ligação do anticorpo é quantificado usando métodos de rotina, por exemplo, medindo a intensidade de fluorescência, por Western blot, espectrometria de massa, ELISA clássico, ELISA digital ou outros métodos conhecidos pelo versado na técnica.

[266] Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 0,1 a 10 pg/ml quando o ensaio de detecção é calibrado usando uma proteína tau fosforilada, isto é, uma proteína tau de comprimento total compreendendo uma ou mais posições fosforiladas. Em algumas modalidades, o limite é de cerca de 100-600 pg/ml quando o ensaio de detecção é calibrado usando um peptídeo sintético 2E7 (2E7pep) com a seguinte sequência: GQKGQANATRIPAKGGGSGGGSGGGSSRTPSLPpTPPTREPK.

[267] Em várias modalidades, é descrito um método para distinguir a doença de Alzheimer de outra tauopatia ou outra causa de demência em um objeto, compreendendo: obter uma amostra biológica do objeto; contatar a amostra do objeto com uma quantidade eficaz de uma molécula que é capaz de formar um complexo tau- molécula (por exemplo, pelo menos um receptor, ou anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno descrito hererin que é capaz de ligar tau para formar uma tau -complexo de anticorpos); detectar a presença e/ou quantidade do complexo tau-molécula usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito; em que a presença e/ou um nível elevado de tau fosforilada ligada à molécula na amostra em relação ao nível em uma amostra de um objeto de controle saudável e/ou em relação ao nível em uma amostra de um objeto com uma tauopatia conhecida diferente de AD (por exemplo, FTD, CBD ou PSP) indica que o objeto tem doença de Alzheimer em vez de outra tauopatia ou uma causa alternativa de demência. Em várias modalidades, o objeto com Demência frontotemporal (FTD) pode ter Afasia Progressiva Primária Agramática/Não Fluente (nfPPA), Afasia Progressiva Primária Variante Semântica (svPPA), Demência Frontotemporal Variante Comportamental (bvFTD) ou Esclerose Lateral Amiotemporal (ALSclerose Frontotemporal)/FTD).

[268] Em várias modalidades, é descrito um método para distinguir a doença de Alzheimer de outra tauopatia ou outra causa de demência em um objeto, compreendendo: obter um fluido cerebroespinhal ou amostra de sangue de um objeto; contatar a amostra com um anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo no presente documento descrito; e detectar a presença e/ou quantidade do complexo tau-anticorpo usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito, em que a presença e/ou um nível elevado de tau fosforilada ligada ao anticorpo na amostra em relação ao nível em uma amostra de um objeto de controle saudável e/ou em relação ao nível em uma amostra de um objeto com uma tauopatia conhecida diferente de AD (por exemplo, FTD, CBD ou PSP) indica que o objeto tem doença de Alzheimer em vez de outra tauopatia ou outra forma de demência.

Em algumas modalidades, o método usa um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é capaz de se ligar a tau fosforilada para formar um complexo tau fosforilada-anticorpo; e detectar a presença e/ou quantidade de tau fosforilada complexada com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno na amostra, em que a presença e/ou um nível elevado de tau fosforilada na amostra em relação ao nível em uma amostra de um objeto de controle saudável indica que o objeto tem doença de Alzheimer em vez de outra tauopatia ou uma causa alternativa de demência.

Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende um aminoácido sequência de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação compreende o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[269] Em várias modalidades, o complexo anticorpo-tau é detectado com um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau. Em algumas modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em certas modalidades, o segundo anticorpo ou O fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. Em várias modalidades, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende o anticorpo DC2E2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, os anticorpos de detecção e captura são invertidos.

[270] Em várias modalidades, um método para tratamento é descrito, compreendendo a administração de um agente terapêutico para a doença de Alzheimer a um objeto que sofre da doença de Alzheimer, em que o objeto foi identificado como portador da doença de Alzheimer de acordo com qualquer um dos métodos precedentes. O tratamento pode compreender a administração de um anticorpo, peptídeo terapêutico ou molécula pequena que trata a AD, por exemplo, qualquer um dos tratamentos no presente documento mencionados. Em várias modalidades, os agentes terapêuticos podem incluir um ou mais dos anticorpos ou peptídeos terapêuticos descritos na Patente U.S. No. 9.518.101 e/ou WO 2016/079597, que são no presente documento incorporados por referência em sua totalidade. Em certas modalidades, o agente terapêutico pode ser o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e/ou DC2E2, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em uma modalidade, o agente terapêutico pode ser um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao mesmo epítopo que DC2E7 e/ou DC2E2.

[271] Também são descritos no presente documento, em certas modalidades, os usos dos anticorpos descritos e fragmentos de ligação ao antígeno conjugados com marcadores detectáveis (por exemplo, marcadores radioativos) que podem ser administrados (por exemplo, por via intravenosa) a um objeto para detectar o padrão de tau fosforilada em o cérebro e, assim, diagnosticar AD ou outra tauopatia.

[272] Em várias modalidades, um método para detectar a doença de Alzheimer ou outra tauopatia em um objeto humano é descrito, compreendendo administrar ao objeto o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento conjugado a um marcador detectável, como um radioisótopo e detectar um sinal de o radioisótopo ou outro marcador detectável no cérebro do paciente, em que a detecção de um sinal indica que o objeto tem doença de Alzheimer ou outra tauopatia. Em algumas modalidades, a distribuição do cérebro das espécies de tau ligadas pelos anticorpos descritos e fragmentos de ligação ao antígeno conjugados com marcadores detectáveis podem ser usados para determinar se um objeto tem AD ou outra tauopatia. Por exemplo, a ligação do anticorpo pode diferir na AD (onde a espécie tau pode ser mais proeminente no hipocampo CA1) em comparação com outras tauopatias, como FTD - doença de Pick (onde a espécie tau pode ser mais proeminente no giro dentado, e, em alguma extensão, hipocampo), CBD (onde a espécie tau pode ser mais proeminente no núcleo caudatus) e PSP (onde a espécie tau pode ser mais proeminente no putâmen/núcleo caudatus). Em algumas modalidades, um objeto é administrado com um anticorpo e fragmento de ligação ao antígeno conjugado a um marcador detectável (por exemplo, via administração intravenosa) e, em seguida, seu cérebro é fotografado (por exemplo, via PET) para gerar um mapa de tau ligado pelo anticorpo marcado e fragmento de ligação ao antígeno no cérebro. O mapa pode ser analisado contra mapas conhecidos de AD e outras tauopatias para determinar se o paciente tem AD ou outra tauopatia.

[273] Em certas modalidades, a detecção é feita por tomografia de emissão de pósitrons. A distribuição do sinal no cérebro pode indicar se o objeto tem doença de Alzheimer ou outra tauopatia. Vide Murray et al., Clinicopathologic assessment and imaging of tauopathies in neurodegenerative demmentias, Alzheimer's Research & Therapy, 6:1, 2014. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes da complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes da complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação compreende o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compete pela ligação ou se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[274] Em várias modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo conjugado a um radioisótopo pode ser administrado a um objeto como no presente documento descrito. O radiossinal pode ser detectado no cérebro por tomografia por emissão de pósitrons. Imagens tridimensionais da concentração de conjugado de anticorpo dentro do corpo podem então ser construídas por análise de computador. As concentrações de sinal em todo o cérebro podem ser usadas para correlacionar com padrões distintos associados com AD ou outras tauopatias, ou para determinar se um paciente que apresenta demência tem ou não tem AD, outra tauopatia ou outra causa de sua demência. Esses padrões de sinal podem ser interpretados por um especialista na técnica para determinar se um objeto tem AD ou outra tauopatia. Vide Murray et al., Clinicopathologic assessment and imaging of tauopathies in neurodegenerative dementias, Alzheimer’s Research & Therapy, 6:1, 2014.

[275] Em várias modalidades, um objeto humano apresentando sintomas de demência é primeiro submetido a qualquer um ou mais dos métodos de detecção da doença de Alzheimer ou outra tauopatia descrita no presente documento antes de uma decisão de tratamento ser feita. Em certas modalidades, uma amostra (por exemplo, CSF ou sangue) é retirada de um objeto humano apresentando sintomas de demência e analisada de acordo com os métodos descritos acima, e/ou o objeto humano é administrado com anticorpo DC2E7 conjugado com um radioisótopo e um sinal é detectado no cérebro do objeto para determinar se o objeto tem a doença de Alzheimer ou outra tauopatia. Em uma modalidade, um objeto humano que foi determinado ter a doença de Alzheimer ou outra tauopatia pode ser administrado com uma composição farmacêutica que trata AD ou outra tauopatia. Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito. Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende um ou mais dos anticorpos ou peptídeos terapêuticos descritos na Patente U.S. No. 9.518.101 e/ou WO 2016/079597. Alternativamente, se for determinado que o objeto não tem AD ou outra tauopatia, um tratamento alternativo pode ser administrado.

[276] Em várias modalidades, um método para determinar o estágio da doença de Alzheimer em um objeto humano é descrito, compreendendo: obter um fluido cerebroespinhal ou amostra de sangue do objeto, contatar a amostra com uma quantidade eficaz de uma molécula que é capaz de formar um complexo tau-molécula (por exemplo, pelo menos um receptor, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento que é capaz de se ligar a tau para formar um complexo tau-anticorpo); detectar a quantidade do complexo tau-molécula usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito; e comparar a quantidade de tau complexada com a molécula com a quantidade em uma amostra de estágio de AD conhecido ou um limite, identificando assim o estágio da doença de Alzheimer. Em algumas modalidades, uma quantidade maior de tau na amostra indica um estágio mais avançado de AD. Em várias modalidades, os níveis e/ou limites são avaliados conforme descrito acima. Em algumas modalidades, um estágio avançado é determinado por comparação com a quantidade de tau fosforilada detectada em uma amostra de estágio AD conhecido, por exemplo, Estágios I-VI de Braak. Braak et al., "Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes". Acta Neuropathologica, 82 (4): 239-59 (1991).

[277] Em várias modalidades, um método para determinar o estágio da doença de Alzheimer em um objeto humano é descrito, compreendendo: obter um fluido cerebroespinhal ou amostra de sangue do objeto, contatar a amostra com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é capaz de se ligar à tau fosforilada para formar um complexo tau fosforilada-anticorpo, detectando a quantidade de tau fosforilada complexada com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno na amostra e comparando a quantidade de tau complexada com o anticorpo para a quantidade em uma amostra de estágio de AD conhecido ou um limite, identificando assim o estágio da doença de Alzheimer. Em algumas modalidades, uma quantidade maior de tau na amostra indica um estágio mais avançado de AD. Em várias modalidades, os níveis e/ou limites são avaliados conforme descrito acima. Em algumas modalidades, um estágio avançado é determinado por comparação com a quantidade de tau fosforilada detectada em uma amostra de estágio AD conhecido, por exemplo, Estágios I-VI de Braak. Braak et al., "Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes". Acta Neuropathologica, 82 (4): 239-59 (1991). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação compreende o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o nível de tau determinado na amostra é comparado ao nível em uma amostra de um paciente de estágio conhecido de AD e/ou a uma amostra de controle de um indivíduo saudável para determinar se o objeto de teste tem uma quantidade elevada de tau em sua amostra.

[278] Em várias modalidades, um método para determinar a eficácia de uma terapia anti-tau para a doença de Alzheimer é descrito, compreendendo: obter um líquido cefalorraquidiano ou amostra de sangue de um objeto humano; contatar a amostra com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é capaz de se ligar a tau fosforilada para formar um complexo tau fosforilada-anticorpo; e detectar a presença e/ou quantidade de tau fosforilada complexada com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno na amostra, em que um nível elevado de tau fosforilada na amostra em relação ao nível em uma amostra de um objeto de controle saudável ou um limite indica que o objeto tem probabilidade aumentada de responder a uma terapia anti-tau para a doença de Alzheimer. Em várias modalidades, um nível elevado acima de um limite ou um aumento em tau é determinado conforme descrito acima.

[279] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno usado na determinação da eficácia de uma terapia anti-tau para a doença de Alzheimer compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes da complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação compreende o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[280] Em certas modalidades, uma terapia anti-tau é administrada a um objeto identificado como sendo mais propenso a responder à terapia. Em uma modalidade, a terapia anti-tau compreende administrar um anticorpo que se liga a tau e promove sua eliminação do cérebro ou inibe a disseminação da patologia tau. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, a terapia anti-tau compreende qualquer uma das no presente documento descritas e/ou qualquer uma descrita na Patente U.S. No. 9.518.101 e WO 2016/079597. Em várias modalidades, a terapia anti-tau compreende uma molécula pequena ou terapia de vacina de peptídeo ou terapia de anticorpo. Vide Patente

U.S. No. 9.518.101 e WO 2016/079597, que são incorporados por referência na sua totalidade.

[281] Em várias modalidades, é descrito um método para monitoramento da eficácia de uma terapia anti-tau para a doença de Alzheimer, compreendendo: (a) obter fluido cerebroespinhal ou amostra de sangue de um objeto humano antes do tratamento; (b) contatar a amostra com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento descrito, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é capaz de se ligar a tau fosforilada para formar um complexo tau fosforilada-anticorpo; (c) detectar a presença e/ou quantidade de tau fosforilada complexada com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno; (d) administrar uma terapia anti-tau ao objeto; (e) repetir as etapas (a) - (c) após a administração da terapia anti-tau, em que uma redução no nível de tau fosforilada na amostra após o tratamento em comparação com o nível na amostra antes do tratamento indica uma terapia eficaz. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, o método adicionalmente compreende administrar a terapia anti-tau novamente a um objeto que tem um nível mais baixo de tau fosforilada na amostra obtida após o tratamento, em comparação com o nível na amostra obtida antes do tratamento.

Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende um aminoácido sequência de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação compreende o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

Em várias modalidades, a terapia anti-tau compreende uma pequena molécula ou vacina de peptídeo ou terapia com anticorpos.

Vide WO 2016/079597 e Patente U.S.

No. 9.518.101, que são incorporados por referência na sua totalidade.

Em uma modalidade, a terapia anti-tau compreende administrar um anticorpo que se liga a tau e promove sua eliminação do cérebro.

Em certas modalidades, a terapia anti-tau compreende administrar um anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, a terapia anti-tau compreende qualquer uma das no presente documento descritas e/ou qualquer uma descrita na Patente U.S. No. 9.518.101 e WO 2016/079597. Outros métodos de monitoramento e/ou confirmação de DA

[282] Uma série de medidas adicionais pode ser usada para determinar, confirmar e/ou monitorar o estado de AD, por exemplo, por avaliação comportamental, para uso na confirmação de um diagnóstico de AD ou para avaliar os efeitos do tratamento e/ou progressão da doença. Em algumas modalidades, as medidas incluem alteração média nas pontuações da escala de atividade da doença de Alzheimer-subescala cognitiva 13 (ADAS-Cog 13) e alteração média nas pontuações do estudo cooperativo de atividades de vida diária da doença de Alzheimer (ADCS-ADL). Outras medidas podem incluir mudança na volumetria de MRI, mudança na Classificação Clínica de Demência (CDR-SB/CDR-GS), mudança no comportamento neuropsiquiátrico: pontuações total e de domínio de inventário neuropsiquiátrico (NPI) e/ou mudança na cognição: pontuação total MMSE. Em outra modalidade, as medidas podem incluir qualquer um dos seguintes: tempo para a ocorrência de morte, institucionalização, perda da capacidade de realizar atividades da vida diária, tempo para demência grave, ADCS-ADL, pontuação ADAS-cog, pontuação MMSE, desempenho cognitivo, biomarcadores de plasma CSF, pontuação total de ADAS, Qualidade de vida avaliada pela escala de Qualidade de Vida da doença de Alzheimer, pontuações de testes comportamentais, e soma de caixas da classificação de demência clínica da FDA dos EUA.

[283] Em várias modalidades, um método para detectar doenças de Alzheimer ou outra tauopatia em um objeto humano compreende administrar a um objeto um anticorpo ou fragmento de antígeno descrito no presente documento que foi conjugado a um radioisótopo e a detecção de um sinal no cérebro do paciente, em que o padrão de sinal detectado no cérebro indica se o objeto tem doença de Alzheimer ou outra tauopatia. A detecção do sinal pode ser feita por topografia de emissão de pósitrons. A distribuição do sinal no cérebro pode ser usada para indicar se o objeto tem doença de Alzheimer ou outra tauopatia. Em uma modalidade, o anticorpo administrado ou fragmento de ligação ao antígeno conjugado a um radioisótopo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[284] Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno descritos no presente documento para usos terapêuticos ou de diagnóstico podem ser administrados por qualquer via de administração adequada, por exemplo, via parenteral, tópica, intradérmica, intravenosa, oral, subcutânea, intraperitoneal, intranasal ou intramuscular. Uma via típica de administração pode ser subcutânea, embora outras possam ser igualmente eficazes. Outra via típica pode ser a injeção intramuscular. Este tipo de injeção é normalmente realizado nos músculos do braço ou perna. As injeções intravenosas, bem como as injeções intraperitoneais, intra-arteriais, intracranianas ou intradérmicas também podem ser usadas. Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno descritos no presente documento podem ser administrados como dosagens injetáveis de uma solução ou suspensão da substância em um veículo e/ou diluente fisiologicamente aceitável, por exemplo, um líquido estéril, como água, óleo, solução salina, glicerol ou etanol. Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno descritos no presente documento também podem ser administrados por meio da perfuração de um pequeno orifício no crânio para administração, o que pode permitir o cruzamento da barreira hematoencefálica. Kits

[285] Em várias modalidades, os kits são descritos no presente documento, compreendendo um ou mais dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno no presente documento descritos. Em certas modalidades, o kit compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação compreende o anticorpo DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[286] Em certas modalidades, o kit compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) selecionadas daqueles na Tabela 1, por exemplo, um conjunto de seis CDRs daquelas na tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um domínio variável de cadeia leve e um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve selecionado daqueles na Tabela 1, por exemplo, sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve pareadas selecionadas daqueles na Tabela 1.

[287] Em certas modalidades, o kit compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 com uma substituição na posição 2, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 com uma substituição em uma ou mais das posições 2 e 12, e/ou HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e/ou em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 com uma substituição na posição 2, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e/ou LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em várias modalidades, a substituição na posição 2 em HCDR1 é glicina e, a substituição na posição 2 em HCDR2 é isoleucina e/ou a substituição na posição 12 em HCDR2 é valina e/ou a substituição na posição 2 em LCDR1 é asparagina.

Em várias modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 3, 30, 37, 48, 58, 63, 68, 76, 77, e 80, e/ou a região variável de cadeia leve compreende o amino a sequência cid de SEQ ID SEQ ID NO: 8 com uma substituição em uma ou mais das posições 7, 11, 20, 28, 39 e 69. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 68 é leucina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 39 é isoleucina.

Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 48 é isoleucina.

Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 30 é glicina e na posição 58 é valina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 7 é prolina e na posição 69 é glicina.

Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é serina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 77 é serina e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina, na posição 20 é alanina e na posição 28 é asparagina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 37 é alanina, na posição 63 é alanina e a posição 80 é serina, e a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia pesada na posição 1 é glicina, na posição 3 é arginina, na posição 76 é ácido glutâmico e na posição 77 é serina. Em várias modalidades, a substituição na região variável de cadeia leve na posição 11 é leucina.

[288] Em várias modalidades, um kit compreende dois ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno. Em certas modalidades, um kit compreende: a. um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N ° 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e b. outro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[289] Em certas modalidades, o kit compreende dois ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, em que um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, e o outro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. Em certas modalidades, o kit compreende anticorpo ou DC2E7 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e/ou anticorpo ou DC2E2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[290] Em várias modalidades, um kit compreende dois ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno. Em certas modalidades, um kit compreende: a. um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo qualquer uma das sequências mostradas na tabela 1, por exemplo, um conjunto de seis CDRs e/ou sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve emparelhadas listadas na Tabela 1; b. outro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[291] Em várias modalidades, um kit compreende dois ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno. Em certas modalidades, um kit compreende: a. um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23,

HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; b. e outro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[292] Em outra modalidade, qualquer um dos kits precedentes pode compreender ainda instruções para o uso de um ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno para detectar tau fosforilada em uma amostra de um objeto de acordo com os métodos no presente documento descritos e, assim, detectar a doença de Alzheimer no objeto. As instruções podem exigir que a amostra seja líquido cefalorraquidiano ou sangue. Os kits podem compreender ainda componentes adicionais para uso com um ELISA clássico ou um ELISA digital.

EXEMPLOS

[293] Várias das modalidades precedentes são ilustradas nos exemplos não limitativos apresentados abaixo. No entanto, outras modalidades da invenção serão evidentes para os versados na técnica a partir da consideração do relatório descritivo como um todo. Pretende-se que a especificação e os exemplos sejam considerados apenas exemplificativos. Além disso, todas as referências citadas no presente documento devem ser consideradas incorporadas por referência em sua totalidade. Exemplo 1 Preparação de Proteínas Tau Humanas Recombinantes

[294] Tau 2N4R de comprimento total humana e mutantes de deleção de tau: As proteínas tau recombinantes foram geradas a partir do clone τ40 (Goedert et al., Multiple isoforms of human microtubule- associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer’s disease, Neuron 3, 519-526 (1989), que foi subclonado no plasmídeo de expressão pET-17b (Novagen) e expresso em bactérias. Cada mutante de deleção de tau foi verificado por sequenciamento de DNA. Todos os mutantes de deleção de tau e peptídeos de tau foram numerados de acordo com a isoforma 2N4R mais longo da tau humana, que tem 441 aminoácidos de comprimento e, portanto, também é chamada de tau441 (D'Souza, I., and Schellenberg, G.D. (2005). Regulation of tau isoform expression and dementia. Biochimica et biophysica acta 1739, 104-115). A produção de proteínas tau envolveu as seguintes etapas: a) expressão de tau em bactérias; b) purificação de tau por cromatografia de troca iônica; c) purificação de tau por filtração em gel; d) concentração e armazenamento de tau isolada. a) Expressão bacteriana de tau de comprimento total humana (2N4R) e mutantes de deleção de tau recombinante: os plasmídeos de expressão de tau humana (acima) foram transformados em Escherichia coli (E. coli), cepa de produção BL21 (DE3). As células bacterianas contendo o plasmídeo de expressão apropriado foram cultivadas e induzidas conforme descrito em "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" por Sambrook e Russell (2001). Uma única colônia de bactérias BL21 (DE3), transformada com o plasmídeo pET-17b dirigindo a expressão de uma proteína tau ou seu fragmento, foi cultivada a 37 ºC em 500 mL de meio de caldo Luria com 100 μg/ml de ampicilina a 300 rpm e induzida pela adição de isopropil-β-D-1 a tiogalactopiranosídeo (IPTG) a uma concentração final de 0,4 mM.

Após incubação adicional a 37 ºC por 3 horas, as bactérias foram coletadas por centrifugação a 3.000xg por 15 min a 4 ºC. b) Purificações por cromatografia de troca catiônica das proteínas tau básicas e neutras (seis isoformas tau, mutantes pontuais da isoforma tau 2N4R: Ser198Ala, Ser199Ala, Ser202Ala, Thr205Ala, Ser208Ala, Ser210Ala, Thr212Ala, Ser214Ala, Thr222Ala, Ser214Ala, Thr222Ala, Ser214Ala, Thr222Ala, tau99- 441, tau188- 44, tau31 a 441, tau151 a 391, tau127-441, tau2N4RΔ (134-168), tau2N4RΔ (49- 243) foram concluídos essencialmente como descrito precedentemente (Krajciova et al.,Preserving free thios of intrinsically disordered tau protein without use of a reducing agent, Analytical Biochemistry, 383:343-345, 2008). Após a expressão, os péletes bacterianos foram ressuspensos em 10 ml de tampão de lise (50 mM de ácido 1,4-piperazinodietanossulfônico (PIPES) pH 6,9, 50 mM de cloreto de sódio (NaCl), 1 mM de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), 5 mM de ditiotreitol (DTT), 0,1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), 5% (v/v) glicerol), rapidamente congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80 ºC até ser usado para purificação de proteínas tau.

Para a purificação da proteína tau, as suspensões bacterianas congeladas foram rapidamente descongeladas e colocadas em gelo.

As paredes das células bacterianas foram quebradas por sonicação em gelo usando Sonopuls HD 2200, ponta TT-13 (Bandelin, Alemanha) definida para ciclo de trabalho de 50%, potência de saída de 50 W, 6 vezes por 30 s com pausas de 30 s.

Os lisados foram clarificados por centrifugação (21.000xg por 15 min a 4 ºC) e os sobrenadantes foram filtrados em um filtro de membrana de 0,45 μm.

A purificação em grande escala das proteínas tau recombinantes foi realizada a 6 ºC usando uma estação de trabalho ÄKTA-FPLC (Amersham Biosciences, Suécia). Os lisados filtrados foram carregados a uma taxa de fluxo de 3 ml/min em uma coluna HiTrap SP HP de 5 ml (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) equilibrada com o tampão de lise e lavados extensivamente com 60 ml do tampão de lise até a linha de base em 280 nm tornar-se estável.

As proteínas tau ligadas foram eluídas por um gradiente (0-30% em 15 ml) de Tampão B (tampão de lise suplementado com 1 M de NaCl). Frações individuais de 1 mL foram recolhidas e analisadas por eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS- PAGE). Para remover os ácidos nucleicos, que copurificam-se com proteínas tau carregadas positivamente, as frações contendo proteína tau foram reunidas e purificadas por uma segunda etapa de cromatografia de troca catiônica, usando uma coluna HiTrap SP HP de 5 ml (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) com um gradiente menos acentuado de Tampão B (0–30% em 45 ml). A purificação por cromatografia de troca aniônica das proteínas tau ácidas (tau1 a 226, tau1 a 136, tau1 a 242) foi feita conforme descrito precedentemente (Csokova et. al, Rapid purification of truncated tau proteins: model approach to purification of functionally active fragments of disordered proteins, implication for neurodegenerative diseases, Protein Expression and Purification, 35:366-372, 2004). Após a expressão, os péletes bacterianos foram ressuspensos em 10 ml de tampão de lise de histidina (20 mM de histidina, pH 6,0, 50 mM de NaCl, 1 mM de

EDTA, 5 mM de DTT, 0,1 mM de PMSF e glicerol 5% (v/v)). As paredes das células bacterianas foram quebradas por sonicação em gelo usando Sonopuls HD 2200, ponta TT-13 (Bandelin, Alemanha) definida para ciclo de trabalho de 50%, potência de saída de 50 W, 6 vezes por 30 s com pausas de 30 s.

Os lisados foram clarificados por centrifugação (21.000xg durante 15 min a 4 ºC). Os lisados bacterianos foram precipitados por sulfato de estreptomicina a 1% (Medexport, Rússia), incubados em gelo por 5 min, clarificados por centrifugação (21.000xg por 15 min a 4 ºC) e filtrados por um filtro de membrana de 0,45 μm.

Os lisados precipitados de estreptomicina filtrados foram carregados a uma taxa de fluxo de 3 ml/min em uma coluna HiTrap QSepharose HP de 5 ml (Amersham Biosciences, Suécia) e lavados extensivamente com 30-50 ml de tampão de lise de histidina até a linha de base A280 se tornar estável.

As proteínas tau foram eluídas com um gradiente de sal em duas etapas (0,05-0,5M de NaCl em 40ml seguido por 0,5-1M de NaCl em 20 ml) em tampão de lise de histidina. a) Na etapa final de purificação de filtração em gel (a mesma para todas as proteínas tau), as frações de proteína tau reunidas obtidas por cromatografia de troca iônica foram injetadas em uma coluna de filtração em gel (coluna HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade, GE Healthcare) a 3 ml/min em Tampão de lise PIPES ou Histidina para proteínas tau básicas/neutras ou ácidas, respectivamente, suplementado com 100 mM de NaCl.

As proteínas tau eluídas foram agrupadas. c) Para a concentração de proteína tau após a purificação por filtração em gel, as frações reunidas foram diluídas com 1,5 volume de glicerol 2,5% e carregadas novamente em uma coluna HiTrap SP HP (proteínas tau básicas e neutras) ou em uma coluna HiTrap Q HP (proteínas tau ácida). A proteína tau recombinante concentrada foi então eluída da coluna com um gradiente de NaCl a 1 M em etapas. Finalmente, o tampão foi trocado por solução salina tamponada com fosfato (PBS, fosfato dissódico a 8,09 mM (Na2HPO4), dihidrogenofosfato de potássio a 1,47 mM (KH2PO4), NaCl a 136,89 mM, cloreto de potássio a 2,7 mM (KCl)) saturado com argônio, usando uma coluna de dessalinização HiTrap de 5 mL (GE Healthcare). A quantificação de proteínas das amostras purificadas foi feita usando kits de quantificação de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, EUA), com albumina de soro bovino (BSA) como padrão. As proteínas Tau foram divididas em alíquotas de trabalho, congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e armazenadas a -70 ºC. Exemplo 2 Preparação de linhagens celulares de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais contra Tau1 a 242 humano, triagem de anticorpos monoclonais por ELISA e caracterização inicial de anticorpo monoclonal DC2E2

[295] Camundongos Balb/c de seis semanas de idade foram iniciados por via subcutânea com 50 μg de tau1 a 242-recombinante (preparado como descrito no Exemplo 1) em adjuvante de Freund completo (SIGMA) e reforçado três vezes em intervalos de quatro semanas com 50 μg do mesmo antígeno em adjuvante de Freund incompleto. Três dias antes da fusão, os camundongos foram injetados por via intravenosa com 50 μg do mesmo antígeno em PBS. As células do baço de camundongos imunizados foram fundidas com células de mieloma NS/0 de acordo com o método para Kontsekova et al., The effect of postfusion cell density on establishment of hybridomas, Folia Biol. 34, 18-22 (1988). Os esplenócitos foram misturados com células de mieloma NS/0 (razão 5:1) e fundidos por 1 minuto em 1 ml de polietilenoglicol (PEG) 1550 (Serva) 50% em meio Eagle modificado por Dulbecco sem soro (DMEM) suplementado com

10% de dimetilsulfóxido. As células fundidas foram ressuspensas em DMEM contendo 20% de soro de cavalo, L-glutamina (2 mM), hipoxantina (0,1 mM), aminopterina (0,04 mM), timidina (0,016 mM) e gentamicina (40 U/ml), em uma densidade de 2,5 x 105 células de baço por poço em placas de 96 poços.

[296] As células foram incubadas durante 10 dias a 37 ºC e os hibridomas em crescimento foram rastreados para a produção de anticorpos monoclonais específicos anti-tau1 a 242 por um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). As placas de microtitulação foram revestidas durante a noite com tau1 a 242 (5 μg/ml, 50 μl/poço) a 37 ºC em PBS. As placas foram bloqueadas com 1% de leite em pó desnatado para reduzir a ligação não específica, lavadas com PBS- Tween 20 a 0,05% e incubadas com 50 μl/poço de sobrenadante de cultura de hibridoma por 1 hora a 37 ºC. Os anticorpos monoclonais ligados foram detectados com imunoglobulina (Ig) de ovelha anticamundongo conjugada com peroxidase de rábano silvestre (HRP, DAKO). A reação foi desenvolvida com TMB one (Kem-En-Tec Diagnostics) como substrato de peroxidase e interrompida com 50 μl de H2SO4 a 2 M. A absorbância a 450 nm foi medida usando um Powerwave HT (Bio-Tek). As leituras com um valor de absorbância de pelo menos duas vezes o valor dos controles negativos (PBS) foram consideradas positivas. Culturas de hibridoma positivas foram subclonadas em ágar mole de acordo com o procedimento descrito em Kontsekova et al., Método para uma etapa para estabelecer hibridomas resistentes a 8-azaguanina adequados para preparação de triomas, J. Immunol. Methods, 145, 247-250 (1991).

[297] O anticorpo monoclonal DC2E2 (produzido pela linhagem celular de hibridoma de camundongo depositada na Catálogo de Culturas do Tipo Americanas, com a designação de depósito de patente ATCC PTA-124991) foi identificado entre as culturas de hibridoma positivas assim produzidas e selecionadas. DC2E2 foi ainda caracterizado como descrito abaixo. O isótipo do anticorpo foi determinado ser IgG1 murino por ELISA (Fig. 1) usando um kit de isotipagem de Ig de camundongo (ISO-2, SIGMA). Exemplo 3 Mapeamento do Epítopo DC2E2 Usando Mutantes de Deleção de Tau Recombinantes, Peptídeos Derivados de Tau e Espectrometria de Massa

[298] Mutantes de deleção da proteína tau humana 2N4R foram usados para mapeamento de epítopo de DC2E2 usando ELISA (Fig. 2A). Isoformas de tau humana recombinante 2N4R, 1N4R, 2N3R, 0N4R, 1N3R, 0N3R e mutantes de deleção tau foram preparados conforme descrito no Exemplo 1. Placas de microtitulação foram revestidas durante a noite a 37 ºC com proteínas tau recombinantes (5 μg/ml em PBS, 50 μl/poço). As placas foram bloqueadas com PBS- Tween20 (0,1% v/v) para reduzir a ligação não específica e foram incubadas com 50 μl/poço de sobrenadante de cultura de hibridoma DC2E2, por 1 hora a 37 ºC. O anticorpo monoclonal ligado foi detectado com Ig HRP de ovelha anticamundongo conjugado (DAKO). A reação foi desenvolvida com uma solução TMB (Kem-En-Tec Diagnostics) como substrato de peroxidase e interrompida com 50 μl de H2SO4 a 2M. A absorbância foi medida a 450 nm usando um Powerwave HT (Bio-Tek). As leituras com um valor de absorbância de pelo menos duas vezes o valor dos controles negativos (PBS) foram consideradas positivas. DC2E2 reconheceu as seguintes proteínas tau humana: seis isoformas de tau humana (Fig. 2B), tau 1 a 242, tau 31 a 441, tau 99-441, tau 1 a 226, tau151 a 391, tau 127-441, mas falhou em reconhecer os mutantes de deleção tau 1 a 136, tau 221 a 441 e tau 2N4R (Δ134-168) (Fig. 2C). Juntos, esses resultados sugerem que DC2E2 reconhece sítios de ligação ou epítopos em tau, localizados na região de alcance de prolina de tau entre os aminoácidos 151 a 188.

[299] Para definir ainda mais o epítopo, foi realizado ELISA de competição. Para experimentos de competição, o anticorpo monoclonal DC2E2 (mAb) foi purificado a partir do sobrenadante de hibridoma sem soro em uma coluna de afinidade de Proteína G, como segue. O sobrenadante do hibridoma foi ajustado para pH 7,5, a solução foi pré-purificada por centrifugação, filtrada em um filtro de membrana de 0,45 μm e carregada em uma coluna de 5 ml de Proteína G Sepharose. O mAb DC2E2 foi eluído da coluna com glicina-HCl a 0,1 M, pH 2,7. As frações eluídas foram imediatamente neutralizadas com Tris-HCl a 1M pH 9,0. As frações combinadas foram dialisadas contra PBS, concentradas por ultrafiltração e armazenadas a -70 ºC. A concentração do anticorpo foi determinada medindo a absorbância a 280 nm, usando a fórmula c (mg/ml) = A280nm/1,43.

[300] Para ELISA de competição, peptídeos (tau 141 a 17 0, 161 a 190, 181 a 210, 171 a 200) foram sintetizados por EZBiolabs com pureza superior a 90%. Placas de ELISA (Nunc Medisorp, Thermo Scientific, Dinamarca) foram revestidas durante a noite a 4 ºC com 50 μl/poço de 0,4 μg/ml de tau 1 a 242 recombinante purificado em PBS. As placas foram lavadas 4 vezes com PBS/Tween 20 (0,1% v/v) e bloqueadas com PBS/Tween 20 durante 2 h a 25 ºC. Os peptídeos foram dissolvidos separadamente em PBS a uma concentração final de 5 mM. Diluições em série (2,5 vezes) dos peptídeos em PBS/Tween 20 foram preparadas em placas de polipropileno com fundo de poço cônico (Greiner, # 651201) (faixa de concentração 200 μM, 32 μM, 12,8 μM, 5,1 μM, 2 μM, 0,8 μM e 0,3 μM). 60 μl de cada diluição foram adicionados por poço. DC2E2 purificado foi diluído para uma concentração de 0,6 μg/ml em PBS/Tween 20 e 60 μl deste anticorpo diluído foi misturado com cada diluição em série de peptídeos, resultando em misturas de 120 μl com 0,36 ng de anticorpo/60μl contendo cada respectivo peptídeo de teste em uma concentração de 200 μM, 32 μM, 12,8 μM, 5,1 μM, 2 μM, 0,8 μM e 0,3 μM. As misturas de anticorpo/peptídeo foram incubadas por 1 hora a 25 ºC em uma plataforma rotativa ajustada para 250 rpm. Cinquenta microlitros (50 μl) de misturas de anticorpo/peptídeo foram transferidos das placas de polipropileno para placas revestidas com tau1 a 242 e bloqueadas com PBS/Tween 20 (em duplicatas) e incubadas por 1 hora a 25 ºC em uma plataforma giratória configurada para 250 rpm. As placas foram lavadas 4x com PBS/Tween 20 e incubadas por 1 hora a 25 ºC em uma plataforma rotativa (definida para 250 rpm) com 50 μl de imunoglobulinas policlonais anticamundongo de cabra/HRP (Dako, # P0447) diluídas 1:1000 em PBS/Tween 20. As placas foram lavadas 4x com PBS/Tween e depois incubadas com 50 μl/poço de uma solução TMB (Kem-En-Tec Diagnostics) como substrato de peroxidase. A reação foi interrompida pela adição de 50 μl de H2SO4 a 2 M (Merck). A absorbância foi medida a 450 nm usando um Powerwave HT (Bio-Tek).

[301] ELISA de competição foi realizado com os seguintes peptídeos: tau 141 a 170, 161 a 190, 171 a 200, 181 a 210. (Fig. 2D) Apenas o peptídeo de tau 161 a 190 competiu com tau 1 a 242 pela ligação a DC2E2 (Fig. 2D). No entanto, o deslocamento de peptídeos para o terminal C de tau (171 a 200, 181 a 210) ou para o terminal N de tau (141 a 170) levou à perda de atividade competitiva com tau 1 a 242 para ligação a DC2E2. Estes resultados sugerem que o epítopo está localizado entre os aminoácidos 161 a 181.

[302] Uma abordagem de espectrometria de massa LC/MALDI foi usada com o objetivo de definir o epítopo mais precisamente. A sequência do sítio de ligação foi identificada pela ligação de proteínas tau digeridas proteoliticamente ao anticorpo monoclonal DC2E2 imobilizado em esferas magnéticas e subsequente identificação de peptídeos eluídos por espectrometria de massa LC/MALDI. Proteínas tau (tau 2N4R e tau151 a 391) foram digeridas com a mistura de tripsina, Glu-C, quimiotripsina a 37 ºC durante a noite ou ácido fórmico durante 2 horas a 108 ºC. A reação de ligação foi realizada em CHAPS a 1% em PBS durante 2 horas. Os peptídeos não ligados foram removidos por três lavagens com 1% de CHAPS em PBS. Os peptídeos ligados foram eluídos por três lavagens com ácido fórmico e liofilizados. Os peptídeos foram separados por UHPLC (Dionex, Ultimate 3000 nano-LC system), as frações foram misturadas com solução de matriz HCCA e distribuídas em placa de amostra MTP Anchor Chip 384 MALDI (Bruker Daltonics). As amostras fracionadas foram analisadas com um instrumento MALDI TOF/TOF (Ultraflextreme, Bruker Daltonics) operado no modo de íon positivo. Os espectros de MS e MS/MS coletados foram buscados contra banco de dados de proteínas tau usando o mecanismo de busca Mascot (Matrix Science).

[303] A análise do banco de dados revelou várias sequências de peptídeos, todas contendo KGQANATRIP. Este peptídeo está localizado em tau 2N4R na região de 163-172, uma região rica em prolina. Exemplo 4 DC2E2 Reconhece um Tripleto A68 Específico para Tau Insolúvel na Doença de Alzheimer, Tau Fosforilada e Tau Não Fosforilada

[304] Na doença de Alzheimer, a tau é hiperfosforilada. Portanto, para caracterização detalhada das propriedades de ligação de DC2E2, PHF-tau hiperfosforilada e tau fosforilada in vitro foram examinadas.

[305] Complexos de tau insolúveis em sarcosil (PHF-Tau) foram isolados de cérebros humanos com AD usando o método sarcosil (Greenberg and Davies, A preparation of Alzheimer’s paried helical filaments that displays distint tau proteins by polyacrylamide gel electrophoresis, PNAS, 87:5827-31, 1990). Para a extração de proteínas, tecido cerebral humano com AD congelado (córtex frontal, amostras de Braak estágio VI obtidas do banco de cérebro da Holanda) foi homogeneizado em 10 volumes de tampão de extração frio (10 mM de Tris pH 7,4, 0,8 M de NaCl, 1 mM de EGTA e Sacarose a 10%) e o homogenato foi centrifugado durante 20 min a 20.000xg. Para preparar tau insolúvel em sarcosil, o sobrenadante foi suplementado com N-lauroilsarcosina (SIGMA) até uma concentração final de 1% e incubado por 1 h em temperatura ambiente, com agitação. Após centrifugação a 100.000xg por 1h, o sobrenadante resultante foi descartado e um pélete compreendendo a fração de tau insolúvel em sarcosil foi ressuspenso em 1/50 volume do sobrenadante usado para a preparação da tau insolúvel.

[306] Para a fosforilação in vitro de tau 2N4R e tau151 a 391, foi usado o extrato de quinase. Cérebro de rato adulto (1g/2,5 ml) foi homogeneizado em tampão de quinase (10 mM de TRIS-HCl, pH 7,4; 5mM EGTA, 2mM de DTT; 1mM de PMSF; 2mM de MgCl2, leupeptina (20 μg/ml), pepstatina (20 μg/ml), aprotinina (20 μg/ml)) e após centrifugação a 100.000 xg por 30 min a 4 ºC o sobrenadante (extrato de quinase) foi utilizado para a fosforilação da tau. A reação de fosforilação foi realizada a 37 ºC em 10 mM de TRIS-HCl, pH 7,4; 5mM de EGTA, 2mM de DTT; 1 mM de PMSF; leupeptina (20μg/ml); pepstatina (20μg/ml); aprotinina (20μg/ml); 2 mM de ATP; 2 mM de MgCl2 e 10 µM de ácido ocadaico. O extrato da quinase cerebral (5 µl) foi adicionado a 50 µl de solução de tau (1 µM) e a reação foi incubada a 37 ºC por 24h. A fosforilação de tau foi analisada por SDS-PAGE e immunoblotting usando antissoro de coelho criado contra seis isoformas de tau humana recombinante (Csokova et al., Rapid purification of truncated tau proteins: model approach to purification of functionally active fragments of disordered proteins, implication for neurodegenerative diseases, Protein Expression and Purification, 35:366-372, 2004).

[307] As proteínas tau 2N4R e tau151 a 391 fosforilada e não fosforilada e PHF-tau insolúvel em sarcosil foram analisadas por imunotransferência usando DC2E2. As proteínas tau solúveis foram diluídas com um volume igual de tampão de carregamento de amostra 2x SDS (dodecilsulfato de sódio) (com β-mercaptoetanol) (Laemmli, 1970) e 250 ng de proteínas foram carregadas por pista. Para PHF-tau insolúvel, os péletes foram dissolvidos em tampão de carregamento de amostra SDS 1x, em 1/50 do volume da fração solúvel usada para a preparação da fração insolúvel de tau. Em seguida, volumes iguais de tau solúvel e frações de tau insolúvel em sarcosil foram usados para imunoblotting, que correspondeu a 15 μg de proteína total na fração solúvel (vide Filipcik et al. 2010). As amostras foram aquecidas a 95 ºC durante 5 min, carregadas em géis de SDS poliacrilamida com gradiente de 5-20% e sujeitas a eletroforese em um sistema tampão Tris-glicina-SDS durante 40 minutos a 25 mA. As proteínas foram transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (1 h a 150 mA em 10 mM de CAPS, pH 12). Após a transferência, as membranas foram bloqueadas em 5% de leite em pó desnatado em solução salina tamponada com fosfato (PBS; 136,89 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 8,09 mM de Na2HPO4, 1,47 mM de KH2PO4) por 1 h em temperatura ambiente e, em seguida, incubadas por 12 h com sobrenadante de cultura de hibridoma DC2E2, seguido por três lavagens com grandes volumes de PBS-T (1% Tween 20). As membranas foram incubadas (1 h em temperatura ambiente) com Ig anticamundongo de cabra conjugado com HRP (DAKO, Dinamarca), diluído 1:3.000 com leite em pó desnatado a 1% em PBS, como anticorpo secundário. Esta incubação foi seguida por lavagem (três vezes) com Tween 20 a 0,1% em PBS. Os blots foram desenvolvidos com Substrato Quimioluminescente SuperSignal West Pico (Pierce, U.S.A), e os sinais de proteína detectados usando um sistema de imagem LAS3000 (FUJI Photo Film Co., Japão). As intensidades do sinal de quimioluminescência foram quantificadas usando o software AIDA (Advanced Image Data Analyzer, Raytest, Straubenhardt, Germany).

[308] DC2E2 reconheceu ambas as formas de proteínas tau, tau 2N4R fosforilada in vivo, 151 a 391 e formas de tipo selvagem (não fosforilada) de tau 2N4R e tau151 a 391 (Fig. 3).

[309] Além disso, é digno de nota que DC2E2 reconheceu o tripleto A68, uma característica da tau patológica (PHF-tau) na degeneração neurofibrilar da AD. Estes resultados demonstram que DC2E2 pode reconhecer e ligar diferentes tipos de proteínas tau, tau patológica isolada de cérebro com AD, tau fisiológica (2N4R), tau151 a 391 truncada e suas formas fosforiladas. Assim, o DC2E2 reconheceu epítopos independentes da fosforilação do epítopo. As propriedades de ligação descritas de DC2E2 sugerem a possibilidade de usar o anticorpo como ferramenta de diagnóstico para AD. Exemplo 5 Sequenciamento de Regiões Variáveis DC2E2

[310] Determinação das sequências de nucleotídeos e aminoácidos das regiões variáveis da cadeia leve e pesada de DC2E2 (Fig. 5). A sequência de nucleotídeos das regiões variáveis DC2E2 (Fig. 5A e 5C) foi determinada por sequenciamento de DNA de cDNA sintetizado usando RNA total extraído da linhagem celular de hibridoma de camundongo DC2E2 (ATCC), que expressa o anticorpo monoclonal DC2E2. O RNA total foi extraído usando o MiniKit RNeasy (Qiagen, Alemanha). A síntese do primeiro filamento de cDNA foi realizada usando o kit de "Transcrição reversa de cDNA de alta capacidade" de acordo com o protocolo do fabricante (Applied

Biosystems, EUA). A composição dos reagentes para a mistura mestre de transcrição reversa 2x foi a seguinte (quantidades por 20 μL de reação): 2 μL de tampão RT 10x; 0,8 μL de 25x dNTP Mix (100 mM); 2 μl de Iniciadores Aleatórios 10x RT (50 μM); 1 μL de Transcriptase Reversa MultiScribe™ (50 U/μL); 4,2 μL de H2O livre de nuclease. Para a transcrição reversa, 10 μL da mistura principal de transcrição reversa 2x foram misturados com a amostra de RNA (1 μg/10 μL) e o cDNA foi sintetizado nas seguintes condições: 10 min a 25 ºC, 120 min a 37 ºC, 5 min a 85 ºC e resfriamento final a 4 ºC. Os genes que codificam as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas foram amplificados por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando DNA Polimerase de Alta Fidelidade Phusion® (Thermo Fisher Scientific, EUA). Os iniciadores diretos (M13 a L6 5’-

TGTAAAACGACGGCCAGTΑTGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGG -3’ e M13 a H1 5’- TGTAAAACGACGGCCAGTATGAAATGCAGCTGGGTCATSTTCTTC- 3’), para a cadeia leve e pesada, respectivamente, foram selecionados após a triagem de iniciadores diretos da sequência de imunoglobulina de camundongo, respectivamente. O uso de iniciadores diretos de sequência de sinal tem a vantagem de amplificar todo o gene V de cadeias leves e pesadas de anticorpos, sem polarização introduzida quando o início da região variável estiver sendo usado para o projeto de iniciadores. Os iniciadores reversos para as cadeias leves e pesadas (M13 a KC 5’- CAGGAAACAGCTATGACCACTGGATGGTGGGAAGATGG-3’ e M13 a CG1 5’- CAGGAAACAGCTATGACCCAGTGGATAGACAGATGGGGG-3’, respectivamente) foram derivados de cadeias constantes kapa e IgG1, respectivamente.

[311] Os produtos de PCR foram sequenciados e as sequências de DNA resultantes das regiões variáveis das cadeias leve e pesada de DC2E2 são mostradas nas Figs. 5A e 5C, respectivamente. As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) estão sublinhadas nas sequências de proteínas das cadeias leve e pesada de DC2E2 (Figs. 5B e 5D, respectivamente). CDRs e regiões estruturais (FR) foram identificadas de acordo com o sistema de numeração ImMunoGeneTics (IMGT) (vide, por exemplo, Lefranc MP The IMGT unique numbering for immunoglobulins, T-cell receptors, and Ig-like domains. The Immunologist, 7, 132-1 36, 1999 (1999)).similares Exemplo 6 Preparação de Linhagens Celulares de Hibridoma que Produzem Anticorpos Monoclonais Contra Espécies de Tau Insolúveis na Doença de Alzheimer Humana, Triagem de Anticorpos Monoclonais por ELISA e Caracterização Inicial do Anticorpo Monoclonal DC2E7

[312] Tau insolúvel em sarcosil (PHF-tau) de cérebro com AD foi usada como um imunogênio para imunização de camundongos Balb/c. Os complexos de tau insolúveis em sarcosil foram isolados do cérebro humano com AD (córtex frontal, Braak estágio VI, banco de cérebro da Holanda) usando o método sarcosil (Greenberg e Davies, A preparation of Alzheimer paired helical filaments that diplays distinct tau proteins by polyacrylamide gel electrophoresis, PNAS, 87:5827-31, 1990) conforme descrito no Exemplo 4.

[313] Camundongos Balb/c de seis semanas de idade foram preparados por via subcutânea com aproximadamente 20-30 μg de proteína tau insolúvel isolada do tecido cerebral de Alzheimer humano em adjuvante completo de Freund (SIGMA) e reforçados cinco vezes em intervalos de quatro semanas com 20-30 μg do mesmo antígeno em adjuvante incompleto de Freund. Três dias antes da fusão, os camundongos foram injetados por via intravenosa com 20-30 μg do mesmo antígeno em PBS. As células do baço de camundongos imunizados foram fundidas com células de mieloma NS/0 de acordo com o método para Kontsekova et al., The effect of postfusion cell density on establishment of hybridomas, Folia Biol. 34, 18-22 (1988). Os esplenócitos foram misturados com células de mieloma NS/0 (razão 5:1) e fundidos por 1 minuto em 1 ml de polietilenoglicol (PEG) 1550 (Serva) 50% em meio de Eagle modificado por Dulbecco sem soro (DMEM) suplementado com 10% de dimetilsulfóxido. As células fundidas foram ressuspensas em DMEM contendo 20% de soro de cavalo, L-glutamina (2 mM), hipoxantina (0,1 mM), aminopterina (0,04 mM), timidina (0,016 mM) e gentamicina (40 U/ml), em uma densidade de 2,5 x 105 células de baço por poço em placas de 96 poços.

[314] As células foram incubadas por 10-14 dias a 37 ºC e os hibridomas em crescimento foram rastreados para a produção de anticorpos monoclonais específicos anti-PHF-tau por um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). As placas de microtitulação foram revestidas durante a noite com PHF-tau (5 μg/ml, 50 μl/poço) a 37 ºC em PBS. As placas foram bloqueadas com 1% de leite em pó desnatado para reduzir a ligação não específica, lavadas com PBS- Tween 20 a 0,05% e incubadas com 50 μl/poço de sobrenadante de cultura de hibridoma por 1 hora a 37 ºC. Os anticorpos monoclonais ligados foram detectados com imunoglobulina (Ig) de ovelha anticamundongo conjugada com peroxidase de rábano (HRP, DAKO). A reação foi desenvolvida com TMB one (Kem-En-Tec Diagnostics) como substrato de peroxidase e interrompida com 50 μl de H2SO4 a 2 M. A absorbância a 450 nm foi medida usando um Powerwave HT (Bio-Tek). As leituras com um valor de absorbância de pelo menos duas vezes o valor dos controles negativos (PBS) foram consideradas positivas. Culturas de hibridoma positivas foram subclonadas em ágar mole de acordo com o procedimento descrito em Kontsekova et al., One-step method for establishing 8-azaguanine-resistant hybridomas suitable for preparation of triomas, J. Immunol. Methods, 145, 247-250, (1991).

[315] O anticorpo monoclonal DC2E7 (produzido pela linhagem celular de hibridoma de camundongo depositada no Catálogo de Culturas do Tipo Americanas, com a Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-124992) foi identificado entre as culturas de hibridoma positivas. DC2E7 foi ainda caracterizado conforme descrito abaixo. O isótipo do anticorpo foi determinado ser IgG2a murino por ELISA (Fig. 4) usando um kit de isotipagem de Ig de camundongo (ISO-2, SIGMA). Exemplo 7 Sequenciamento de Regiões Variáveis DC2E7

[316] Determinação das sequências de nucleotídeos e aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve e pesada de DC2E7 (Fig. 6). A sequência de nucleotídeos das regiões variáveis de DC2E7 (Figs. 6A e 6C) foi determinada por sequenciamento de DNA de cDNA sintetizado usando RNA total extraído da linhagem celular de hibridoma de camundongo DC2E7 (ATCC), que expressa o anticorpo monoclonal DC2E7. O RNA total foi extraído usando o MiniKit RNeasy (Qiagen, Alemanha). A síntese do primeiro filamento de cDNA foi realizada usando o kit de "Transcrição reversa de cDNA de alta capacidade" de acordo com o protocolo do fabricante (Applied Biosystems, EUA). A composição dos reagentes para a mistura mestre de transcrição reversa 2x foi a seguinte (quantidades por 20 μL de reação): 2 μL de tampão RT 10x; 0,8 μL de 25x Mistura de dNTP (100 mM); 2 μl de Iniciadores Aleatórios 10x RT (50 μM); 1 μL de Transcriptase Reversa MultiScribe™ (50 U/μL); 4,2 μL de H2O sem nuclease. Para a transcrição reversa, 10 μL da mistura mestre 2x de transcrição reversa foram misturados com a amostra de RNA (1 μg/10 μL) e o cDNA foi sintetizado nas seguintes condições: 10 min a 25 ºC, 120 min a 37 ºC, 5 min a 85 ºC e resfriamento final a 4 ºC. A amplificação dos genes que codificam as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas foi feita por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando DNA de Alta Fidelidade Polimerase Phusion® (Thermo Fisher Scientific, EUA). Os iniciadores diretos (M13 a L12 5'- TGTAAAACGACGGCCAGTATGAAGTTTCCTTCTCAACTTCTGCTC- 3' e M13 a H5 5'-

TGTAAAACGACGGCCAGTATGGACTCCAGGCTCAAMAGTTTTCCT T-3') foram selecionados após a triagem de uma biblioteca de iniciadores diretos da sequência de sinal de imunoglobulina de camundongo. O uso dos iniciadores diretos da sequência de sinal tem a vantagem de amplificar todo o gene V de ambas as cadeias de anticorpos leves e pesadas, sem desvios introduzidos quando o início da região variável está sendo usado para o projeto de iniciador. Os iniciadores reversos para as cadeias leve e pesada (M13 a KC 5'- CAGGAAACAGCTATGACCACTGGATGGTGGGAAGATGG-3' e M13 a CG2a 5'- CAGGAAACAGCTATGACCCAGTGGATAGACCGATGGGGC-3') foram derivados das regiões constantes das cadeias kapa e IgG2a, respectivamente.

[317] Os produtos de PCR foram sequenciados e as sequências de DNA resultantes de regiões variáveis de cadeias leve e pesada de DC2E7 são mostradas nas Figs. 6A e 6C, respectivamente. As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) estão sublinhadas nas sequências de proteínas das cadeias leve e pesada de DC2E7 (Figs. 6B e 6D, respectivamente). As CDRs e as regiões estruturais (FR) foram identificadas de acordo com o sistema de numeração ImMunoGeneTics (IMGT) (vide, por exemplo, Lefranc M.P. The IMGT unique numbering for immunoglobulins, T-cell receptors, and Ig-like domains. The Immunologist 7, 132-1 36, 1999 (1999)).similares Exemplo 8 Anticorpo Monoclonal DC2E7 é Específico Para Formas Fosforiladas de Proteína Tau

[318] Tau 2N4R de comprimento total recombinante, 2N4R fosforilada, PHF-tau e tau fetal foram usadas para caracterização adicional da atividade de ligação de anticorpo monoclonal DC2E7 por imunoblotting. A isoforma 2N4R de tau humana recombinante foi preparada conforme descrito no Exemplo 1. PHF-tau foi preparada conforme descrito no Exemplo 4.

[319] A extração e purificação de tau de rato fetal foram feitas essencialmente como descrito em Ivanovova et al., High-yield purification of fetal tau preserving its structure and phosphorylation, J. Immunol. Methods, 339:17 a 22, 2008, usando ácido perclórico a 1%. Tecido cerebral obtido de filhotes de ratos com 1 a 7 dias de idade foi homogeneizado em ácido perclórico a 1% resfriados em gelo (1,5 g de tecido por 5 ml de ácido perclórico, Applichem) e deixado em gelo por 20 min. O homogenato foi centrifugado a 15.000xg por 20 min, e o sobrenadante límpido foi concentrado e, simultaneamente, o tampão foi mudado para tampão de lavagem (20 mM de Tris, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,1% Tween 20) usando um dispositivo de Filtro UltraCentrífuga Amicon (Millipore). O extrato filtrado foi carregado a uma taxa de fluxo de 0,2 ml/min em uma coluna Poly-Prep C10/10 (GE Healthcare) embalada com Sepharose portadora do mAb DC25 pan-

tau imobilizado. As proteínas não ligadas foram lavadas com 10-15 ml de tampão de lavagem até a absorbância das frações de eluição (a 280 nm) se tornar estável. A tau fetal, ligada ao mAb DC25, foi eluída com glicina a 0,1 M, pH 2,6. As frações de 0,5 ml eluídas foram imediatamente neutralizadas com 50 μl de Tris-HCl a 1M, pH 9, e analisadas por SDS-PAGE. As frações contendo tau fetal foram concentradas usando dispositivos Filtro UltraCentrífuga Amicon (Millipore) com troca de tampão simultânea para PBS. A tau fetal purificada por cromatografia de afinidade foi precipitada de acordo com Chen et al., (2005) por adição de quatro volumes de acetona resfriada em gelo contendo 10% de ácido tricloroacético. A mistura foi incubada a -20 ºC durante 2 horas e centrifugada a 15.000xg durante 20 min a 2 ºC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspenso em 1 ml de acetona gelada, deixada em gelo por 20 min e novamente centrifugada como acima. O pélete resultante foi seco à temperatura ambiente e dissolvido em um volume de PBS igual àquele volume antes da precipitação.

[320] Isoforma 2N4R de tau de comprimento total, PHF-tau insolúvel em sarcosil e tau fetal foram analisadas por imunotransferência usando DC2E7 como descrito no Exemplo 4. Em imunotransferência, o anticorpo DC2E7 reconheceu PHF-tau e tau fetal (Fig. 7). Ambos os tipos de tau testados foram fosforilados, mas em diferentes níveis de fosforilação. Nenhuma imunorreatividade foi observada em tau 2N4R humana recombinante. Por outro lado, o anticorpo se ligou a versões fosforiladas in vitro da isoforma 2N4R de tau humana. Os resultados indicam que DC2E7 reconhece um epítopo que é fosforilado, portanto, o anticorpo é específico para espécies de tau fosforiladas. O epítopo reconhecido pelo anticorpo está presente em PHF-tau fosforilada, tau fetal e tau fosforilada in vitro. Consequentemente, DC2E7 é capaz de distinguir tau fosforilada derivada do tecido cerebral com doença de Alzheimer (PHF-tau) de tau fisiológica (2N4R). Exemplo 9 Mapeamento do Fosfoepítopo DC2E7 Usando Mutantes de Deleção de Tau Recombinantes, Mutantes de Ponto de Tau e Peptídeos Derivados de Tau

[321] A imunorreatividade de DC2E7 sugeriu que o anticorpo reconhece o epítopo em tau fosforilada (tau fetal, PHF-tau, tau fosforilada in vitro, vide supra). Portanto, para determinar o epítopo, mutantes de deleção fosforilados da proteína tau foram usados (Fig. 8). A fosforilação de mutantes de deleção de tau foi feita usando extrato de quinase como descrito no Exemplo 4.

[322] Mutantes de deleção fosforilados da proteína tau humana 2N4R (tau 1 a 296, tau 188-441, tau 221 a 441, tau151 a 391, tau 122- 227) foram usados para a localização do epítopo de DC2E7 em immunoblotting (vide Exemplo 4). A análise de imunoblotting demonstrou que DC2E7 reconheceu todos os seguintes mutantes de deleção: tau1 a 296, tau188-441, tau151 a 391, tau122-227, exceto proteína tau 221 a 441 (Fig. 9). Estes resultados indicam que o fosfoepítopo DC2E7 se encontra na região de alcance da prolina, entre os resíduos de aminoácidos 188-227.

[323] O mapeamento acima mencionado do epítopo DC2E7 com mutantes de deleção tau sugeriu um epítopo entre Pro188-Ala227. Nesta região de tau, existem 11 sítios de fosforilação (Ser191, Tyr197, Ser198, Ser199, Ser202, Thr205, Ser208, Ser210, Thr212, Ser214, Thr217) detectados em PHF-tau (Hanger et al., 2009, Fig. 10). Quatro deles (Ser198, Ser199, Ser202, Thr217) foram encontrados também em tau fetal (Morishima-Kawashima et al., 1995, Fig. 10). Como o DC2E7 também reconhece a tau fetal, o primeiro foco foi nos fosfo- sítios que estão presentes e confirmados em tau fetal (Ser198;

Ser199; Ser202; Thr217).

[324] Para definir o fosfosito (s) exato para DC2E7, foram geradas formas mutadas de tau 2N4R com mutações de ponto único em que os resíduos de Serina e Treonina foram substituídos por Alanina. A inserção das mutações pontuais desejadas (Ser198Ala; Ser199Ala; Ser202Ala; Thr217Ala) na proteína tau 2N4R humana foi feita usando o kit de mutagênese dirigida ao sítio QuickChange (Agilent Technologies, EUA, CA) de acordo com as instruções do fabricante. 5-50 µg de plasmídeo contendo a sequência de codificação para a proteína tau 2N4R de tipo selvagem e 125 ng de cada iniciador foram usados em uma reação de 50 µL. Parâmetros de ciclagem foram os seguintes: 95 ºC durante 30 segundos, depois a PCR continuou com o ciclo que foi repetido 16 vezes: desnaturação 95 ºC durante 30 segundos, hibridação 55 ºC durante 60 segundos, alongamento 68 ºC durante 6 min. Toda a reação foi digerida com DpnI, que é específico para DNA metilado, para eliminar o plasmídeo parental. 50 µl de Escherichia coli XL-1 Blue supercompetente (fornecido com o kit de mutagênese) foram transformados com 1 µl da reação e espalhados em placas de ágar LB suplementadas com ampicilina. Os plasmídeos foram isolados de colônias cultivadas e a verificação da mutagênese foi feita usando sequenciamento de DNA. Os plasmídeos com as mutações desejadas foram usados para a produção de proteínas recombinantes, conforme descrito no Exemplo

1.

[325] Mutantes de tau preparados foram purificados conforme descrito no Exemplo 1, fosforilados por extrato de quinase do cérebro de rato e corados com DC2E7 em imunotransferência. A fosforilação de mutantes de deleção de tau induziu mudança no peso molecular, portanto, todas as proteínas foram fosforiladas, como mostrado na coloração com anticorpo pan tau DC25 (epítopo 347-353 aa, AXON

Neuroscience, SE) (Fig. 11). A análise do mutante de ponto tau fosforilada demonstrou que DC2E7 detectou todas as mutações únicas (Ser198Ala, Ser199Ala, Ser202Ala), mas Thr217Ala (Fig. 11). Estes resultados sugeriram que a fosfo-treonina na posição 217 cria uma parte chave do epítopo reconhecido pelo anticorpo DC2E7.

[326] No entanto, outros fosfo-sítios que estão localizados nas proximidades do fosfo-sítio Thr217 podem ser uma parte do epítopo ou podem estar envolvidos na criação do epítopo. Portanto, o possível impacto dos fosfo-sítios Thr205, Ser208, Ser210, Thr212, Ser214, Ser231 no epítopo reconhecido por DC2E7 foi examinado. As proteínas tau mutantes preparadas com mutações de ponto único (Thr205Ala, Ser208Ala, Ser210Ala, Thr212Ala, Ser214Ala, Ser231A) foram fosforiladas por extrato de quinase e testadas em immunoblotting com DC2E7 (Fig. 11). A análise de imunotransferência demonstrou que o anticorpo reconheceu todas as proteínas tau portadoras das mutações pontuais (Fig. 11). Assim, os fosfo-sítios localizados na proximidade de Thr217 não afetaram o epítopo reconhecido por DC2E7.

[327] Esses experimentos de mapeamento sugeriram a presença de fosfo-treonina 217 dentro do epítopo de DC2E7. A fim de examinar o efeito dos resíduos na região do epítopo DC2E7 na ligação do anticorpo, os peptídeos sintéticos de diferentes comprimentos transportando diferentes fosfo-sítios foram analisados em ELISA competitivo. Peptídeos (tau 210-224/pT212/pT217, 210- 222/pT212/pT217, 210-221/pT212/pT217, 210-220/pT212/pT217, 210- 219/pT212/pT217, 210-218/pT212/pT217, tau 201 a 230/pT212, tau 193-222/pS208, 193-222/pS214, tau 193- 231/pS208/pS210/pT212/pS214/pT217, tau 193- 231/pS202/pS205/pT212/pT220, tau 201 a 229), foram sintetizados pela EZBiolabs (EUA) com pureza superior a 95%. Cada peptídeo sintetizado continha fosfo-sítio localizado (s) em torno do resíduo Thr217, exceto do peptídeo não fosforilado tau 201 a 229 (usado como controle negativo). Como controle positivo, tau151 a 391 fosforilada in vitro foi usada.

[328] Em seguida, todos os peptídeos foram analisados quanto à sua capacidade de competir com tau151 a 391 fosforilada in vitro pela ligação a DC2E7 por ELISA de competição. Placas de ELISA (Nunc Medisorp, Thermo Scientific, Dinamarca) foram revestidas durante a noite a 37 ºC com 50 μl/poço de PHF-tau, diluídas 200 x em PBS. As placas revestidas foram lavadas 5 vezes com PBS/Tween 20 (0,05% v/v) e bloqueadas com PBS/Tween 20 durante 1 h a 25 ºC. Cada um dos peptídeos foi dissolvido separadamente em PBS a uma concentração final de 1 mM. Diluições em série (2,5x) de peptídeos em PBS/Tween 20 foram preparadas em placas de microtitulação de polipropileno com fundo de poço cônico (Greiner) dentro da faixa de concentração de 200 μM; 80 μM; 32 μM; 12,8 μM; 5,12 μM; 2,048 μM; 0,8192 μM; 0,32768 μM). O anticorpo monoclonal DC2E7 foi diluído para uma concentração de 0,6 μg/ml em PBS e 60 μl deste anticorpo diluído foi adicionado em cada poço para diluição em série de peptídeos resultando em 120 μl/poço de mistura. As misturas de anticorpo/peptídeo foram incubadas por 1 hora a 25 ºC em uma plataforma rotativa ajustada para 230 rpm. 50 μl/poço de misturas de anticorpo/peptídeo foram transferidos de placas de polipropileno para placas de ELISA revestidas com PHF-tau e PBS/Tween 20 bloqueadas (em duplicatas) e incubadas por 1 hora a 25 ºC. As placas foram lavadas 5x com PBS/Tween 20 e incubadas com 50 μl/poço de imunoglobulinas policlonais de cabra anticamundongo/HRP (Dako) diluídas 1:1000 em PBS/Tween 20 por 1 hora a 25 ºC. Após a lavagem, as placas foram incubadas com 50 μl/poço de 1 mg/2 mL de o-PDA (o-fenilenodiamina, Sigma) em Na-Acetato 0,1 M pH = 6,0

(Roth) suplementado com 1,5 μl/2 ml de H2O2 a 30% (Sigma) por 20 minutos a 25 ºC no escuro. A reação foi interrompida pela adição de 50 μl/poço de H2SO4 a 2M (Merck) seguido pela leitura das placas a 492 nm (Powerwave HT, Bio-Tek).

[329] Todos os peptídeos analisados que abrangiam a treonina fosforilada 217 competiram com tau151 a 391 fosforilada pela ligação a DC2E7 (Fig.12). Em resumo, o DC2E7 se liga a um epítopo tau que inclui uma treonina 217 fosforilada. Nenhum outro fosfo-sítio pareceu afetar a imunorreatividade do anticorpo. Mas, notavelmente, o encurtamento da parte C terminal dos peptídeos testados de 224 para 220 aminoácidos (210-220/pT212/pT217, 210-219/pT212/pT217, 210- 218/pT212/pT217) levou à perda de atividade competitiva apesar da presença de treonina fosforilada 217. Os dados sugerem, portanto, que DC2E7 se liga a um fosfoepítopo em tau fosforilada humana de 12 aminoácidos que compreende os resíduos 210-SRTPSLPTPPTR-221, onde pelo menos a treonina 217 é fosforilada. Exemplo 10 Anticorpos Monoclonais DC2E2 e DC2E7 Reconhecem Patologia no Cérebro Humano com Doença de Alzheimer e Tauopatias

[330] Este exemplo mostra que DC2E7 e DC2E2 reconhecem lesões neurofibrilares na doença de Alzhemer. As seguintes áreas do cérebro foram usadas para estudo imuno-histoquímico: hipocampo e córtex entorrinal da doença de Alzheimer (estágio 6 de Braak), FTD (doença de Pick) e cérebros de controle (Braak estágio 1 e 3), núcleo caudado da degeneração corticobasal (CBD) e putâmen/núcleo caudado de paralisia supranuclear progressiva (PSP). Os blocos de parafina do tecido cerebral foram obtidos no banco de cérebros de Amsterdam.

[331] Os blocos de cérebros incluídos em parafina foram cortados em um micrótomo (Leica RM2255) para obter seções de 8 μm de espessura. As seções foram colocadas em slides HistoBond (Marienfeld, Alemanha). Para imunohistoquímica, as seções foram pré-tratadas com ácido fórmico (98% por 1 min a 4 ºC ou 80% por 1 hora) e calor (autoclave, 121 ºC, 20 min.), seguido de incubação durante a noite com anticorpos primários (AT8 1:1000, DC2E7 1:10.000, DC2E2 1:200). Todas as seções foram incubadas com anticorpo secundário biotinilado anticamundongo à temperatura ambiente durante 1 hora e com complexo avidina-biotina-peroxidase durante 1 hora. A imunorreação foi visualizada com VIP (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories, CA, EUA) e contrastada com verde de metila (Vector Laboratories).

[332] Análises imunohistoquímicas revelaram que DC2E7 e DC2E2 reconheceram a patologia tau na doença de Alzheimer e outras tauopatias (Fig. 13) de maneira similar ao anticorpo monoclonal AT8, que é considerado padrão ouro para coloração histopatológica. Patologia neurofibrilar corada com DC2E7 e DC2E2 no hipocampo do paciente com AD, corpos de Pick no giro dentado do paciente com FTD, patologia da tau glial no núcleo caudado de pacientes que sofrem de CBD e PSP. DC2E7 e DC2E2 não reconhecem a patologia tau no cérebro normal cumprindo os critérios para o estágio 1 de Braak, no estágio prodrômico (estágio 3 de Braak), ambos os anticorpos identificados na patologia neurofibrilar do hipocampo, nos anticorpos de AD totalmente desenvolvidos visualizaram patologia tau extensa na forma de neurofibrilar emaranhados, fios de neurópilos e placas neuríticas (Fig. 14). Usando uma ampliação maior, foi demonstrado que os anticorpos se ligam a emaranhados neurofibrilares em AD, corpos de Pick em FTD e patologia de tau glial em PSP e CBD (Fig. 15). Exemplo 11 DC2E7 ELISA

Preparação de padrão para DC2E7 ELISA

[333] Tau151 a 391 fosforilada in vitro foi purificada por cromatografia de afinidade. Duas colunas de afinidade foram preparadas: DC2E7 e DC190 (epítopo 368-376, AXON Neuroscience, SE). Os anticorpos foram purificados de acordo com o método parascrito no Exemplo 3. Os anticorpos foram acoplados a Sepharose 4B ativada por CnBr (GE Healthcare, # 17 a 0430-01) de acordo com a recomendação do fabricante. A reação de fosforilação in vitro (vide Exemplo 4) foi dialisada contra PBS a 4 ºC (3 x 100 vezes de excesso). Todas as etapas de purificação foram realizadas a 4 ºC. A coluna DC2E7 foi lavada com 3 x 5 ml de tampão WBNP0.1 (50 mM de Tris pH 7,4, 150 mM de NaCl e NP40 a 0,1%). A reação de fosforilação in vitro foi diluída 4 vezes com tampão WBNP1 gelado (50 mM de Tris pH 7,4, 150 mM de NaCl e NP40 a 1%) e filtrada através de filtro de 0,2 µm. A amostra foi aplicada na coluna DC2E7. Após a amostra ter entrado, a coluna de resina foi lavada da seguinte forma: 2 x 5 mL com tampão WBNP1, 2 x 5 mL com tampão WBNP0.1, 1 x 5 mL com 50 mM de Tris.HCl pH 7,4, 150 mM de NaCl. As proteínas ligadas foram eluídas com 3 x 2 ml de tampão de eluição (100 mM de glicina/HCl, pH 2,8). As proteínas eluídas foram imediatamente ajustadas a pH 7-8 com 1 M de Tris.HCl, pH 9, e diluídas 1:1 com tampão WBNP0.1. A amostra foi aplicada na coluna de afinidade DC190 e purificada conforme descrito para purificação de afinidade DC2E7. As proteínas eluídas foram dialisadas contra PBS e a concentração foi estimada espectrofotometricamente. A proteína purificada foi designada “calibrador DC2E7”.

[334] DC2E7 ELISA foi configurado em formato de alta sensibilidade, ELISA digital, usando o analisador Simoa-HD1 (Quanterix). Os reagentes para ELISA digital foram preparados de acordo com o Quanterix Homebrew Assay Development Guide com os seguintes detalhes.

O anticorpo DC2E7 foi usado como um anticorpo de captura e o anticorpo DC2E2 foi usado como um anticorpo detector.

DC2E7 foi acoplado a esferas magnéticas (Quanterix) na concentração de 0,5 mg/mL.

O anticorpo detector foi preparado por biotinilação de DC2E2, em que um excesso de 120 vezes de Biotina, EZ‐Link™ NHS‐PEG4‐Biotina (Thermo Scientific, #21329) sobre a concentração de anticorpo foi usado.

O calibrador DC2E7 foi diluído em diluente calibrador (20 mM de fosfato de sódio pH 7,4, 137 mM de NaCl, KCl 2,7 mM, BSA a 2% e caseína 0,01%) em diluições seriadas de duas vezes a partir de 100 pg/mL, seguido de 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56 e 0 pg/ml.

As concentrações de calibrador preparadas foram misturadas em uma razão de 3:1 com diluente de amostra (80 mM de fosfato de sódio pH 7,4, 548 mM de NaCl, 10,8 mM de KCl, caseína 0,04% e Tween 20 a 0,4%). Amostras de CSF de indivíduos de controle também foram diluídas com diluente de amostra, conforme descrito precedentemente.

A recuperação de pico da amostra de CSF foi realizada usando picos de CSF com 10, 5, 2 e 0 pg/ml de calibrador DC2E7. Calibradores e amostras diluídos foram pipetados em placa de 96 poços, inseridos no analisador Simoa HD1 e também capturam esferas de anticorpo DC2E7 diluídas em diluente de esfera, detector DC2E2 diluído em diluente detector a 1,2 µg/ml, SBG diluído em diluente SBG a 200 pM e substrato RGP foram inseridos no analisador (todos os tampões, SBG e RGP foram obtidos da Quanterix). O ensaio foi programado no software Simoa 1.5 e a análise foi realizada.

Após a análise, a avaliação foi feita por Graphpad Prism e/ou por software incluído no software Simoa 1.5. Um exemplo de uma curva de calibração é mostrado na Fig. 16. Um exemplo de um experimento de recuperação de pico é mostrado na Fig. 17. Exemplo 12 ELISA Digital de DC2E7 Distingue-se Significativamente entre

Pacientes com Doença de Alzheimer e Indivíduos de Controle

[335] ELISA digital de DC2E7 foi usado para análise de amostras de CSF de pacientes com doença de Alzheimer (n = 20) e indivíduos saudáveis n = 20) (Fig. 18). A análise demonstrou que ELISA digital de DC2E7 distinguiu pacientes com doença de Alzheimer de indivíduos de controle com significância muito alta. A área da curva ROC foi muito próxima de 1. A uma concentração > 4,43 pg/mL, o ensaio fornece 95% de sensibilidade e 89,5% de especificidade e em concentração > 6,19 pg/mL, a sensibilidade é de 95% e a especificidade de 100%. Exemplo 13 ELISA Digital de DC2E7 Distingue-se Significativamente entre Pacientes com Doença de Alzheimer e Pacientes que Sofrem de Outras Tauopatias

[336] ELISA digital de DC2E7 foi usado para análise de amostras de CSF de pacientes com doença de Alzheimer (n = 6) e demência frontotemporal (n = 16) (Fig.19). A análise demonstrou que ELISA digital de DC2E7 distinguiu pacientes com doença de Alzheimer de pacientes com outras tauopatias com significância muito alta. A área da curva ROC é 0,97. Na concentração > 3,89 pg/ml, o ensaio apresenta sensibilidade de 93,8% e especificidade de 100%. Exemplo 14 DC2E7 Reconhece Espécies Insolúveis de Tau na Doença de Alzheimer e Tauopatias Humanas

[337] Resultados precedentes mostraram que o DC2E7 reconheceu um epítopo que ocorre em tau fosforilada. Portanto, a imunorreatividade de DC2E7 para a proteína tau fosforilada que ocorre em outras tauopatias foi analisada.

[338] Complexos insolúveis de tau (formas anormais de tau) foram isolados do cérebro humano de AD (Braak estágio V, córtex frontal, banco de cérebro de Amsterdã), degeneração corticobasal (banco de cérebro de Londres, córtex frontal) e FTD (banco de cérebro de Amsterdã), conforme descrito em Exemplo 4. Proteínas tau insolúveis extraídas foram analisadas em immunoblotting usando DC2E7 como descrito no Exemplo 4.

[339] As análises de imunoblot de cérebros de pacientes com AD e tauopatias mencionadas acima revelaram que as frações insolúveis de tau foram detectadas usando DC2E7. Os resultados sugerem que os agregados patológicos de tau em tauopatias são compostos de tau hiperfosforilada similar a PHF-tau em DA (Fig. 20). Além disso, o DC2E7 reconheceu três bandas similares a PHF-tau de 60, 64 e 68 KDa (tripleto A68) em CBD e FTD similares ao de AD. Exemplo 15 Ensaio ELISA Digital de Tau pT217 Distinguiu Pacientes com AD de FTD e Objetos Saudáveis com Alta Sensibilidade e Especificidade

[340] Um ensaio digital de tau pT217 usando anticorpo DC2E7 foi usado para analisar CSF de pacientes com AD (n = 30), pacientes FTD (nfPPA, n = 14; svPPA, n = 10; bvFTD, n = 10, PSP, n = 19; e CBD, n = 15), e objetos saudáveis (n = 30). O ensaio foi comparado com um ensaio INNOTEST Phospho-Tau (181P).

[341] A análise demonstrou que o ensaio ELISA digital tau pT217 distinguiu pacientes com AD de FTD e objetos saudáveis. O ensaio separou melhor AD de FTD/controles (> 5,37 pg/ml, 94,1% de sensibilidade, 91,7% de especificidade, Fig. 21), em comparação com o ensaio Innotest Phospho-Tau (181P) (> 52 pg/ml, 78,0% sensibilidade, 100% de especificidade. (Fig. 21). O ensaio também foi ligeiramente melhor em distinguir pacientes com AD de objetos saudáveis (> 3,855 pg/ml, AUC 0,96, IC de 95%, 0,89-0,99, sensibilidade de 95%, especificidade de 89,7%) do que o ensaio p-tau

181 (> 52 pg/ml, AUC 0,93, IC 95%, 0,85-0,97, sensibilidade 92%, especificidade 87,5%) (Fig. 22). Comparando a alta correlação entre os ensaios pT217 e pT181 no grupo AD (P <0,0001, coeficiente de Spearman r = 0,8226) com as correlações baixas observadas em controles saudáveis (P < 0,5, coeficiente de Spearman r = 0,4032) e FTD (P = 0,387, coeficiente de Spearman r = 0,232) sugere que o pT217. As espécies de tau no CSF podem fornecer um biomarcador específico da DA no CSF. Nenhum benefício foi observado no uso da razão INNOTEST Aβ42/pT217 tau quando comparado com o próprio pT217 tau.

[342] Foi observada alta correlação entre os ensaios de tau pT217 e pT181 tau no grupo AD (P < 0,0001, coeficiente de Spearman r = 0,8226) e as correlações baixas foram observadas em controles sem demência (P < 0,5, coeficiente de Spearman r = 0,4032).

[343] Nenhuma correlação foi observada entre os ensaios de tau pT217 e pT181 tau em pacientes de FTD (P = 0,7517, coeficiente de Spearman r = 0,08929); em que forte correlação foi observada entre os ensaios pT181 e HTAU nos mesmos pacientes FTD (P = 0,0019, coeficiente de Spearman r = 0,7321).

[344] Todos esses resultados sugerem que a espécie pT217 tau no CSF pode fornecer um biomarcador específico de AD no CSF. Exemplo 16 Ensaio ELISA Digital de Tau pT217 Diferenciou Pacientes com AD de FTD e Objetos Saudáveis com Alta Sensibilidade e Especificidade Usando Diferentes Calibradores

[345] O ensaio ELISA digital de tau pT217 pode distinguir entre indivíduos com comprometimento cognitivo leve (LCC) e objetos saudáveis. As concentrações de pT217 tau no líquido cefalorraquidiano (CSF) são similares para indivíduos com LCC e AD (Fig. 23A). Três objetos com LCC desenvolveram posteriormente AD.

[346] O ensaio de tau pT217 foi usado para testar amostras de CSF de indivíduos com outros distúrbios neurológicos, incluindo esclerose múltipla (MS), doença de Parkinson (DP), esclerose lateral amotrófica (ALS) e demência frontotemporal (FTD), onde a patologia tau pode estar presente (Fig. 23B). Os pacientes com FTD representam populações bastante heterogêneas, alguns deles sofriam de paralisia supranuclear progressiva (PSP) ou degeneração corticobasal (CBD), enquanto os outros desenvolveram sintomas típicos de afasia progressiva primária (PPA). O ensaio ELISA digital de tau pT217 distingue entre DA e os outros distúrbios neurológicos (ponto de corte 9,3 pg/ml, especificidade, 94%, sensibilidade 100%).

[347] O ensaio ELISA digital de tau pT217 pode distinguir pacientes com DA de pacientes com DFT e objetos saudáveis com sensibilidade e especificidade similares, independentemente do calibrador escolhido. A distribuição de pT217 tau em amostras de CSF de pacientes com AD, pacientes com FTD e objetos saudáveis usando proteína tau fosforilada in vitro ou peptídeo sintético mostrou sensibilidade e especificidade similares. Usando o calibrador de proteína tau fosforilada, o ensaio exibiu 94,1% de sensibilidade e 91,7% de especificidade (> 5,37 pg/ml). Usando o peptídeo 2E7 (2E7pep), o ensaio exibiu 93,9% de sensibilidade e 90,0% de especificidade (> 305 pg/ml) (Fig. 29). 2E7pep possuía a seguinte sequência de aminoácidos: GQKGQANATRIPAKGGGSGGGSGGGSSRTPSLPpTPPT REP. A primeira sequência sublinhada representa um epítopo do anticorpo DC2E2, a segunda sequência sublinhada representa um epítopo do anticorpo DC2E7 (os primeiros 3 aminoácidos e os últimos aminoácidos são derivados da proteína tau, enquanto a sequência (GGGS)3 é um ligante conectando o epítopos de DC2E2 e DC2E7). Exemplo 17

Otimização de Anticorpo DC2E7 por Tecnologias Recombinantes

[348] A afinidade do anticorpo DC2E7 foi otimizada por exibição de ribossomo e tecnologias de exibição de fago. Primeiro, o cDNA que codifica um formato scFv do anticorpo DC2E7 foi gerado por amplificação e clonagem a partir de uma linhagem celular de hibridoma DC2E7. O gene para o scFv DC2E7 foi então mutado por PCR propenso a erros e uma biblioteca de fragmentos scFv DC2E7 mutados foi selecionada por afinidade contra 2E7pep por exibição de ribossomo (Hanes et al., 1998) e tecnologias de exibição de fago (Harrison at al., 1996)

[349] Após quatro rodadas de seleção, fragmentos de scFvs isolados foram clonados em um vetor de expressão de modo que os scFvs foram fundidos a um marcador myc e expressos em E. coli JM109 (Sanmark et. Al., 2015). Os lisados bacterianos de 30 colônias contendo scFv DC2E7 mutado foram testados usando um imunoensaio de competição de peptídeo. Os imunoensaios foram realizados em placas de microtitulação de 96 poços revestidas com 100 µl/poço de 0,01 µg/ml de 2E7pep em PBS a 4 ºC durante a noite. As placas foram lavadas 4x e bloqueadas em PBS-T durante 30 min à temperatura ambiente. A ligação foi realizada com 100 µl de lisado bacteriano diluído 10x em PBS-T, contendo anticorpo anti-myc diluído

10.000 x, em uma plataforma de agitação por 1 hora à temperatura ambiente. Os poços foram lavados quatro vezes com PBS-T e a competição com um 2E7pep a uma concentração de 10 µg/ml por lisado foi realizada durante 2 horas à TA em uma plataforma de agitação. Em seguida, as placas foram lavadas 4x com PBS-T e incubadas com conjugado de estreptavidina-HRP diluído 1:10.000 em PBS-T por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas 4xPBS-T e desenvolvidas usando um substrato TMB por 5 min antes da reação colorimétrica ser interrompida usando H2SO4 1 M. A absorbância a 450 nm foi lida usando um leitor de absorbância de placa de microtitulação.

[350] A absorbância para os scFvs gerados pela exibição de ribossomo e exibição de fago são mostradas na Fig. 24. scFv K+ representa DC217 não mutado. Espera-se que todos os scFv mostrando sinal acima da linha correspondente a scFv K+ tenham maior afinidade (marcado com um asterisco), em comparação com o DC217 scFv original.

[351] Os alinhamentos das sequências de aminoácidos da cadeia pesada e leve dos scFvs isolados por exibição de ribossomo e exibição de fago ("PD" no final de um nome de clone indica que foi obtido por exibição de fago) são mostrados na Fig 25. VL (Fig. 25A) e sequências de VH (Fig. 25B) são mostradas. Os anticorpos com ligação melhorada em relação a DC2E7 são mostrados na Fig. 25C (cadeia leve) e Fig. 25D (cadeia pesada). A primeira linha representa o anticorpo DC2E7 original. Os resíduos idênticos à sequência em DC2E7 são representados por pontos. A numeração de resíduos de aminoácidos em VL e VH e a marcação de CDRs estão de acordo com o sistema de numeração IMGT. Exemplo 18 Comparação de Anticorpos DC2E7, DC149 e DC807

[352] Anticorpo DC149 foi gerado de maneira similar ao que foi descrito no Exemplo 2, com a seguinte diferença: Os camundongos foram imunizados com um peptídeo duplo fosforilado nas posições Thr212 e Thr217, ou seja, CSRpTPSLPpTPPTREPK (210-224 de 2N4R tau) conjugado através da primeira cisteína para KLH. A triagem foi realizada por ELISA como descrito no Exemplo 2, em que DC149 foi identificado por ligação específica ao peptídeo compreendendo SRTPSLPpTPPTREPK (isto é, o mesmo peptídeo mono-fosforilado em Thr217 que DC2E7 se ligou) e DC807 por ligação específica ao peptídeo duplo-fosforilado. Os anticorpos DC149 e DC807 não se ligaram a um peptídeo não fosforilado ou a uma proteína tau não fosforilada, enquanto o DC807 também não se ligou a peptídeos monofosforilados.

[353] DC2E7 e DC149 e DC807 foram analisados em um ensaio ELISA clássico usando uma configuração similar à que foi descrita no exemplo 10, em que o calibrador 2E7pep foi usado. Todos os três anticorpos ligados ao peptídeo de tau fosforilada pelo menos em Thr217 com afinidades muito similares (Fig. 26).

[354] Sequências de aminoácidos para os anticorpos DC217, DC149 e DC807 foram determinadas por clonagem e por espectrometria de massa. O alinhamento das sequências da cadeia pesada e leve em DC2E7 e DC149 é mostrado na Fig. 27A-B. Os alinhamentos das sequências da cadeia pesada e leve em DC2E7 e DC807 são mostrados na Fig. 28A-B. Os resíduos idênticos à sequência de DC2E7 são representados por pontos. As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de VL e VH estão dentro de uma caixa. A numeração de resíduos de aminoácidos em VL e VH e a marcação de CDRs estão de acordo com o sistema de numeração IMGT. Referências de literatura: Hanes et al., (1998). Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinity antibodies in vitro from immune libraries. PNAS, Vol. 95, pp. 14130–14135. doi.org/10.1073/pnas.95.24.14130. Harrison et al., (1996). Screening of phage antibody libraries. vol. 26783-109, pp. 83-109. doi.org/10.1016/S0076- 6879(96)67007-4. Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesmann, K. S. & Foeller, C. (1991) in Sequences of Proteins of Immunological Interest (U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, MD) Vol.

I, pp. 151 e 464, 5a Ed. Exemplo 19 Validação Independente do Ensaio pT217

[355] O protocolo para detecção e quantificação de pT217 discutido precedentemente foi aplicado ao SIMOA usando um analisador HD-1. O protocolo foi considerado adequado para a medição de pT217 em amostras de CSF humano. A sensibilidade, linearidade, paralelismo e recuperação do ensaio foram analisados. As curvas padrão foram medidas adicionando o peptídeo calibrador 2E7 pep em amostras de CSF e em PBS. DC2E7 foi usado como o anticorpo de captura e DC2E2 foi usado como o anticorpo de detecção. O limite de detecção observado foi de 184,4 pg/mL. A repetibilidade foi avaliada: Intraensaio (<15% para valores dentro do intervalo linear da curva padrão), Interensaio (<15% para valores dentro do intervalo linear da curva padrão) e Intraplaca (ensaio (<15% para valores dentro da faixa linear da curva padrão). Paralelismo e recuperação foram determinados como sendo <15%.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 1 com uma substituição em uma ou mais das posições 5 e 6, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 2 com uma substituição em uma ou mais das posições 1, 4, 5, 6 e 8, HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 4 com uma substituição na posição 2, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 5 com uma substituição na posição 3, e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 6 com uma substituição em uma ou mais das posições 4 e 6.

   2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a substituição na posição 5 em HCDR1 é glicina, a substituição na posição 6 em HCDR1 é glicina, a substituição na posição 1 em HCDR2 é valina, a substituição na posição 4 em HCDR2 é alanina, a substituição na posição 5 em HCDR2 é glicina, a substituição na posição 6 em HCDR2 é serina, a substituição na posição 8 em HCDR2 é valina, a substituição na posição 2 em LCDR1 é asparagina, a substituição na posição 3 em LCDR2 é glicina e/ou a substituição na posição 4 de LCDR3 é arginina e/ou a substituição na posição 6 em LCDR3 é treonina.

   3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 com uma substituição na posição 5, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 com uma substituição na posição 8, HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 com uma substituição na posição 2, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e/ou LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

   4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a substituição na posição 5 em HCDR1 é glicina, a substituição na posição 8 em HCDR2 é valina, e/ou a substituição na posição 2 em LCDR1 é asparagina.

   5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ

   ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

   6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que HCDR1 compreende a sequência de minoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41; ou HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 34 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO 6; ou HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ

   ID NO: 35 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.

   7. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

   8. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

   8.

   9. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 81 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 87 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

   98.

   10. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

   94.

   11. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

   12. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

   13. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

   24 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.

   14. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.

   15. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que pode competir pela ligação à proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) com um anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

   16. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que pode ligar o mesmo epítopo na proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) ligada pelo anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

   17. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que pode se ligar a um epítopo na proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9), em que o epítopo é fosforilado.

   18. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o epítopo em tau compreende um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10).

   19. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o epítopo em tau compreende um ou mais dos resíduos 210-221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11).

   20. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o um ou mais resíduos fosforilados compreendem uma fosfo-treonina na posição 217 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9).

   21. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o epítopo também compreende uma serina fosforilada na posição 210, treonina na posição 212, serina na posição 214 ou treonina na posição 220 da proteína tau 2N4R, ou qualquer combinação das mesmas.

   22. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de que o epítopo compreende ou consiste em SRTPSLPpTPPTR (sequência de SEQ ID NO. 12).

   23. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de que o epítopo compreende ou consiste em SRpTPSLPpTPPTR (sequência de SEQ ID NO: 31).

   24. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 23, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou compete pela ligação com um anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

   25. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que pode se ligar a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 151 a 188 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 13).

   26. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o epítopo em tau compreende um ou mais dos resíduos 163-172 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 14).

   27. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que o epítopo em tau compreende KGQANATRIP (sequência de SEQ ID NO. 14) e, opcionalmente, em que um ou mais dos resíduos no epítopo são fosforilados e, opcionalmente, em que a fosforilação compreende um treonina fosforilada na posição 169 da proteína tau 2N4R.

   28. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelo fato de que o epítopo em tau consiste em KGQANATRIP (sequência de SEQ ID NO. 14).

   29. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 14, ou compete pela ligação com um anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 14.

   30. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende uma região constante de cadeia pesada e uma região constante de cadeia leve.

   31. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante de cadeia pesada do isótipo IgG humano.

   32. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o isótipo IgG humano é um isótipo IgG1 humano ou um isótipo IgG4 humano.

   33. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende uma região constante de cadeia leve kapa humana.

   34. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é selecionado a partir de um anticorpo de roedor ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo quimérico ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo enxertado com CDR ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e um anticorpo humanizado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

   35. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é um Fab, Fab’, F(ab’)2, Fd, scFv, (scFv) 2, scFv-Fc, ou fragmento Fv.

   36. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é conjugado a um segundo agente.

   37. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o segundo agente é pelo menos um marcador detectável.

   38. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que pelo menos um marcador detectável compreende uma enzima, um radioisótopo, um fluoróforo, uma biotina, um marcador de ressonância magnética nuclear ou um metal pesado.

   39. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que pelo menos um marcador detectável compreende um radioisótopo ou biotina.

   40. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o segundo agente compreende pelo menos um agente terapêutico para a doença de Alzheimer ou outra tauopatia.

   41. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que codifica pelo menos uma região variável de uma cadeia de imunoglobulina do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 35.

   42. Vetor isolado, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido na reivindicação 41.

   43. Célula hospedeira isolada, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 41 e/ou o vetor como definido na reivindicação 42.

   44. Método para produzir um anticorpo ou fragmento do mesmo capaz de se ligar a tau, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira, como definido na reivindicação 43, sob condições suficientes para produzir o anticorpo ou fragmento do mesmo.

   45. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, e um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável.

   46. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que compreende dois ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40.

   47. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 45 ou 46, caracterizada pelo fato de que adicionalmente compreende pelo menos um agente terapêutico adicional para o tratamento da doença de Alzheimer ou outra tauopatia.

   48. Método para tratar, retardar a progressão ou prevenir a progressão da doença de Alzheimer ou outra tauopatia em um objeto, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao objeto uma quantidade eficaz de pelo menos um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40 ou uma composição farmacêutica de acordo como definida em qualquer uma das reivindicações 45 a 47.

   49. Uso de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que é como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, ou uma composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 45 a 47, na fabricação de um medicamento para tratar, retardar a progressão ou prevenir a doença de Alzheimer pela administração do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno a um objeto com necessidade do mesmo.

   50. Método para detectar uma tauopatia em um objeto, caracterizado pelo fato de que compreende: obter uma amostra biológica do objeto; contatar a amostra com uma quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, e detectar a ligação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno a tau na amostra, detectar assim uma tauopatia no objeto.

   51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, adicionalmente compreende um marcador detectável.

   52. Método, de acordo com a reivindicação 50 ou 51, caracterizado pelo fato de que a presença e/ou uma quantidade aumentada de tau complexada com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno em relação a uma amostra de controle ou limite indica uma tauopatia no objeto, opcionalmente em que a tauopatia é a doença de Alzheimer.

   53. Método para detectar uma tauopatia em um objeto, caracterizado pelo fato de que compreende: obter uma amostra biológica do objeto; contatar a amostra com uma quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40 ("primeiro anticorpo"), e contatar a amostra biológica com uma molécula capaz de formar um complexo com tau, opcionalmente em que a molécula é um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno capaz de se ligar a tau ("segundo anticorpo"), detectar a ligação do primeiro e/ou segundo anticorpo a tau na amostra, detectar assim uma tauopatia no objeto.

   54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o primeiro e/ou segundo anticorpo adicionalmente compreende um marcador detectável.

   55. Método, de acordo com a reivindicação 53 ou 54, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo se liga a tau para formar um complexo tau-anticorpo e o segundo anticorpo se liga ao complexo tau-anticorpo, ou em que o segundo anticorpo se liga a tau para formar um tau complexo de anticorpo, e o primeiro anticorpo se liga ao complexo tau-anticorpo, e em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de complexo tau-anticorpo em relação a uma amostra de controle ou limite indica uma tauopatia no objeto.

   56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 55, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo se liga a um epítopo diferente em tau do que o segundo anticorpo.

   57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo se liga a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10).

   58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo se liga a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 210-221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11).

   59. Método, de acordo com a reivindicação 57 ou 58, caracterizado pelo fato de que o epítopo em tau compreende pelo menos um resíduo fosforilado na posição 217 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) e, opcionalmente, também compreende uma serina fosforilada na posição 210, treonina na posição 212, serina na posição 214 ou treonina na posição 220 da proteína tau 2N4R ou qualquer combinação das mesmas.

   60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o epítopo em tau compreende SRTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO: 12).

   61. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o epítopo em tau compreende SRpTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO: 31).

   62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 61, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou 13 a 14.

   63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 62, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo compreende uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

   64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 62, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo compreende uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou em que o primeiro anticorpo compreende uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

   65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 62, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo compreende uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.

   66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 62, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8

   67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 62, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e a região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92; ou a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

   94.

   68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 62, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30

   69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 68, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo se liga a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 151 a 188 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 13).

   70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo se liga a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 163-172 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 14).

   71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 70, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

   72. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o segundo anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

   73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 72, caracterizado pelo fato de que o primeiro e/ou segundo anticorpo está ligado a uma superfície sólida ou partícula.

   74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a partícula é uma esfera.

   75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a esfera é uma esfera magnética.

   76. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a esfera é uma esfera de plástico ou polímero sintético.

   77. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a esfera compreende um polietileno, polipropileno, poliestireno, poliamida, poliuretano, polímero fenólico, nitrocelulose, polímero derivado naturalmente, borracha de látex, polissacarídeo, polipeptídeo, material compósito, cerâmica, sílica ou material à base de sílica, carbono, metal ou composto de metal, ouro, prata, aço, alumínio, cobre, vidro inorgânico ou material de sílica ou uma combinação dos mesmos.

   78. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 77, caracterizado pelo fato de que a esfera tem uma forma esférica, de disco, de anel ou de cubo.

   79. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o marcador detectável compreende uma enzima, um radioisótopo, um fluoróforo, biotina, um marcador de ressonância magnética nuclear, um metal pesado ou uma combinação dos mesmos.

   80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende detectar um sinal do marcador detectável.

   81. Método para 80, caracterizado pelo fato de que o marcador detectável é biotina e é detectado pelo contato da amostra com estreptavidina conjugada a uma enzima, de preferência peroxidase de rábano bravo, fosfatase alcalina ou β-galactosidase.

   82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 81, caracterizado pelo fato de que o método compreende um ELISA clássico.

   83. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 81, caracterizado pelo fato de que o método compreende um ELISA digital ou uma matriz de molécula única.

   84. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 83, caracterizado pelo fato de que a amostra é diluída antes de ser colocada em contato com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.

   85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 84, caracterizado pelo fato de que a amostra é submetida à dissociação do complexo imune antes de ser contatada com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.

   86. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que a dissociação do complexo imune compreende a aplicação de calor e/ou ácido à amostra.

   87. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 86, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende fluido cérebro-espinhal (CSF) ou sangue.

   88. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende plasma e/ou frações de soro de sangue.

   89. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 88, caracterizado pelo fato de que o método paratecta a quantidade de uma tau fosforilada na amostra e, opcionalmente, a tau fosforilada detectada na amostra é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais vezes maior do que na amostra de controle e/ou opcionalmente em que a tau fosforilada detectada na amostra é maior do que um limite de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 pg/ml.

   90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que a tau fosforilada detectada na amostra é maior do que um limite de cerca de 100-600 pg/ml.

   91. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o limite é de cerca de 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270,

   280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580 ou 590 pg/ml.

   92. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o limite é de cerca de 300 pg/ml.

   93. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o limite é de cerca de 305 pg/ml.

   94. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o limite é de cerca de 295 pg/ml.

   95. Método, de acordo com as reivindicações 50 a 94, caracterizado pelo fato de que compreende comparar a quantidade de tau fosforilada na amostra com o nível em uma amostra de controle de um indivíduo saudável, e em que um aumento no nível de tau fosforilada na amostra sobre o controle indica um tauopatia.

   96. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 95, caracterizado pelo fato de que a tauopatia detectada é AD.

   97. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que compreende a comparação da quantidade de tau fosforilada na amostra com um limite ou um nível em uma amostra de controle de um paciente com uma tauopatia conhecida diferente de AD, em que um nível aumentado de tau fosforilada na amostra indica o objeto tem doença de Alzheimer em vez de outra tauopatia ou outra causa de demência.

   98. Método para distinguir a doença de Alzheimer de outra tauopatia ou outra causa de demência em um objeto, caracterizado pelo fato de que compreende: obter um fluido cerebroespinhal ou amostra de sangue do objeto; realizar o método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 97 para determinar a quantidade de tau fosforilada na amostra; e comparar o nível de tau fosforilada ao nível em uma amostra de controle ou a um limite, em que um nível elevado de tau fosforilada na amostra em relação ao nível na amostra de controle ou limite indica que o objeto tem doença de Alzheimer em vez de outra tauopatia ou uma causa alternativa de demência.

   99. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que a outra tauopatia ou causa alternativa de demência compreende demência frontotemporal (FTD) ou outro distúrbio neurológico, como doença de Parkinson (DP), esclerose múltipla (MS) e/ou esclerose lateral amiotrófica (ALS).

   100. Método, de acordo com a reivindicação 98 ou 99, caracterizado pelo fato de que a amostra de controle é de um indivíduo saudável ou um paciente com uma tauopatia conhecida diferente de AD.

   101. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 98-100, caracterizado pelo fato de que a tau fosforilada detectada na amostra é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais vezes mais alto do que na amostra de controle.

   102. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 98-101, caracterizado pelo fato de que a tau fosforilada detectada na amostra é maior do que um limite de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 9,3 ou 10 pg/ml ou maior do que um limite de cerca de 100-600 pg/ml.

   103. Método, de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de que o limite é cerca de 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 400, 410, 420, 430,

   440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580 ou 590 pg/ml.

   104. Método, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que o limite é de cerca de 300 pg/ml.

   105. Método, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que o limite é de cerca de 305 pg/ml.

   106. Método, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que o limite é de cerca de 295 pg/ml

   107. Método para tratamento, caracterizado pelo fato de que compreende administrar um agente terapêutico para a doença de Alzheimer a um objeto que sofre da doença de Alzheimer, em que o objeto foi identificado como portador da doença de Alzheimer de acordo com o método como definido em qualquer uma das reivindicações 50 a 106.

   108. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, e instruções para o uso de um ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno para identificar um objeto com doença de Alzheimer ou outra tauopatia.

   109. Kit, de acordo com a reivindicação 108, caracterizado pelo fato de que compreende dois ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40.

   110. Método para detectar a doença de Alzheimer ou outra tauopatia em um objeto humano, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao objeto um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 35, conjugado a um radioisótopo e detecta um sinal do radioisótopo no cérebro de o paciente, em que a detecção do sinal indica que o objeto tem doença de Alzheimer ou outra tauopatia.

   111. Método, de acordo com a reivindicação 110, caracterizado pelo fato de que a detecção é feita por tomografia de emissão de pósitrons.

   112. Método, de acordo com a reivindicação 110 ou 111, caracterizado pelo fato de que o padrão de distribuição do sinal no cérebro indica se o objeto tem doença de Alzheimer ou outra tauopatia.

   113. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 110 a 112, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se liga a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 188-227 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 10).

   114. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 110 a 113, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno se liga a um epítopo em tau compreendendo um ou mais dos resíduos 210-221 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 11).

   115. Método, de acordo com a reivindicação 113 ou 114, caracterizado pelo fato de que o epítopo em tau compreende pelo menos um resíduo fosforilado na posição 217 da proteína tau 2N4R (SEQ ID NO: 9) e, opcionalmente, também compreende uma serina fosforilada na posição 210, treonina na posição 212, serina na posição 214 ou treonina na posição 220 da proteína tau 2N4R ou qualquer combinação das mesmas.

   116. Método, de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pelo fato de que o epítopo em tau compreende SRTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO: 12).

   117. Método, de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pelo fato de que o epítopo em tau compreende SRpTPSLPpTPPTR (SEQ ID NO: 31).

   118. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 110 a 117, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou 13 a 14.

   119. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 110 a 118, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

   120. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 110 a 118, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e em que LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

   121. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 110 a 118, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.

   122. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 110 a 118, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

   123. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 110 a 118, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94.

   124. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 110 a 118, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30.

   125. Método para determinar o estágio da doença de Alzheimer em um ser humano objeto, caracterizado pelo fato de que compreende: obter um fluido cerebroespinhal ou amostra de sangue do objeto; realizar o método para qualquer uma das reivindicações 50 a 97 para determinar a quantidade de tau fosforilada na amostra; e comparar o nível de tau fosforilada com o nível em uma amostra de um paciente de estágio AD conhecido ou um nível de limite, identificando assim o estágio da doença de Alzheimer.

   126. Método, de acordo com a reivindicação 125, caracterizado pelo fato de que o nível de limite é cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 pg/ml ou cerca de 100-600 pg/ml.

   127. Método para determinar a eficácia de uma terapia anti- tau para a doença de Alzheimer, caracterizado pelo fato de que compreende: obter um fluido cerebroespinhal ou amostra de sangue de um objeto humano; realizar o método para qualquer uma das reivindicações 50 a 97 para determinar a quantidade de tau fosforilada na amostra; e em que um nível elevado de tau fosforilada na amostra em relação ao nível em uma amostra de um objeto de controle saudável e/ou em relação a um nível de limite indica que o objeto tem mais probabilidade de responder a uma terapia anti-tau para a doença de Alzheimer.

   128. Método, de acordo com a reivindicação 127, caracterizado pelo fato de que o nível de limite é cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 pg/ml ou cerca de 100-600 pg/ml.

   129. Método, de acordo com a reivindicação 127 ou 128,

   caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende a administração de uma terapia anti-tau a um objeto identificado como sendo mais propenso a responder à terapia.

   130. Método, de acordo com a reivindicação 129, caracterizado pelo fato de que a terapia anti-tau compreende um anticorpo anti-tau, molécula pequena ou terapia com vacina de peptídeo.

   131. Método, de acordo com a reivindicação 130, caracterizado pelo fato de que a terapia anti-tau compreende administrar um anticorpo que se liga a tau e promove sua eliminação do cérebro.

   132. Método, de acordo com a reivindicação 130, caracterizado pelo fato de que a terapia anti-tau compreende administrar um anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40.

   133. Método para monitorar a eficácia de uma terapia anti- tau para a doença de Alzheimer, caracterizado pelo fato de que compreende: obter um fluido cerebroespinhal ou amostra de sangue de um objeto humano antes do tratamento; realizar o método para qualquer uma das reivindicações 50 a 97 para determinar a quantidade de tau fosforilada na amostra; administrar uma terapia anti-tau ao objeto; repetir as etapas a) -b) após a administração da terapia anti-tau, em que uma redução no nível de tau fosforilada na amostra após o tratamento em comparação com o nível na amostra antes do tratamento indica uma terapia eficaz.

   134. Método, de acordo com a reivindicação 133, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende a administração contínua da terapia anti-tau a um objeto que tem um nível inferior de tau fosforilada em uma amostra obtida após o tratamento em comparação com o nível na amostra obtida antes do tratamento.

   135. Método, de acordo com a reivindicação 133 ou 134, caracterizado pelo fato de que a terapia anti-tau compreende um anticorpo anti-tau, molécula pequena ou terapia de vacina de peptídeo.

   136. Método, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo fato de que a terapia anti-tau compreende administrar um anticorpo que se liga a tau e promove sua eliminação do cérebro.

   137. Método, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo fato de que a terapia anti-tau compreende administrar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40.

   138. Hibridoma que produz o anticorpo DC2E7, caracterizado pelo fato de que o hibridoma é depositado sob o Depósito de Patente Catálogo de Culturas do Tipo Americanas No. PTA-124992.

   139. Hibridoma que produz o anticorpo DC2E2, caracterizado pelo fato de que o hibridoma é depositado sob o depósito de patente da Catálogo de Culturas do Tipo Americanas No. PTA-124991.

   140. Método para detecção da doença de Alzheimer (AD) ou comprometimento cognitivo leve (LCC) em um objeto, caracterizado pelo fato de que compreende: contatar uma amostra biológica do objeto com uma quantidade eficaz de pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, que é capaz de se ligar a tau para formar um complexo tau-anticorpo;

   detectar a presença e/ou quantidade do complexo tau- anticorpo; e comparar a presença/quantidade de tau ligada ao anticorpo na amostra com a quantidade em uma amostra de controle ou um limite, em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de tau complexada com o anticorpo em relação à amostra de controle ou limite indica AD ou LCC no objeto.

   141. Método, de acordo com a reivindicação 140, caracterizado pelo fato de que o LCC indica um precursor de AD em um paciente.

   142. Método, de acordo com a reivindicação 140 ou 141, caracterizado pelo fato de que a quantidade do complexo tau-anticorpo distingue LCC e/ou AD de outras doenças neurológicas.

   143. Método, de acordo com a reivindicação 142, caracterizado pelo fato de que a outra doença neurológica é selecionada a partir de doença de Parkinson, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica e/ou demência frontotemporal.

   144. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 140 a 143, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende fluido cérebro-espinhal (CSF).

   145. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 140 a 143, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende sangue.

   146. Método, de acordo com a reivindicação 145, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende plasma e/ou frações de soro de sangue.

   147. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 140 a 146, caracterizado pelo fato de que a quantidade aumentada de tau complexada com o anticorpo é uma quantidade acima de um limite de cerca de 9,3 pg/ml de tau.

   148. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 140 a 146, caracterizado pelo fato de que a quantidade aumentada de tau complexada com o anticorpo é uma quantidade acima de um limite de cerca de 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 pg/ml de tau, ou cerca de 100- 600 pg/ml de tau.

   149. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 140 a 146, caracterizado pelo fato de que o limite é de cerca de 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580 ou 590 pg/ml.

   150. Método, de acordo com a reivindicação 149, caracterizado pelo fato de que o limite é de cerca de 300 ou 305 pg/ml.

   151. Método, de acordo com a reivindicação 149, caracterizado pelo fato de que o limite é de cerca de 295 pg/ml.

   152. Método para detecção da doença de Alzheimer (AD) ou comprometimento cognitivo leve (LCC) em um objeto, caracterizado pelo fato de que compreende: obter uma amostra biológica do objeto; detectar a presença e/ou quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada pelo menos na posição treonina 217 na amostra biológica; e comparar a presença/quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada na treonina 217 com a quantidade em uma amostra de controle ou um limite, em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de proteína tau 2N4R fosforilada na treonina 217 em relação à amostra de controle ou limite indica DA ou LCC no objeto.

   153. Método, de acordo com a reivindicação 152,

   caracterizado pelo fato de que o LCC é um precursor de DA em um paciente.

   154. Método, de acordo com a reivindicação 152 ou 153, caracterizado pelo fato de que uma quantidade aumentada distingue LCC e/ou DA de outras doenças neurológicas.

   155. Método, de acordo com a reivindicação 154, caracterizado pelo fato de que a outra doença neurológica é selecionada a partir de doença de Parkinson, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica e/ou demência frontotemporal.

   156. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 152 a 155, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende fluido cérebro-espinhal (CSF).

   157. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 152 a 155, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende sangue.

   158. Método, de acordo com a reivindicação 157, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende plasma e/ou frações de soro de sangue.

   159. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 152 a 158, caracterizado pelo fato de que a quantidade aumentada de tau é uma quantidade acima de um limite de cerca de 9,3 pg/ml de tau.

   160. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 152 a 158, caracterizado pelo fato de que a quantidade aumentada de tau é uma quantidade acima de um limite de cerca de 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 pg/ml de tau.

   161. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 152 a 158, caracterizado pelo fato de que a quantidade aumentada de tau é uma quantidade acima de um limite de cerca de

   100-600 pg/ml.

   162. Método, de acordo com a reivindicação 161, caracterizado pelo fato de que o limite é de cerca de 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580 ou 590 pg/ml.

   163. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 152 a 162, caracterizado pelo fato de que a presença e/ou quantidade da proteína tau 2N4R fosforilada pelo menos na posição treonina 217 é detectada usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou 13 a 14.

   164. Método para distinguir a doença de Alzheimer e/ou comprometimento cognitivo leve da doença de Parkinson, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica e/ou demência frontotemporal em um objeto, caracterizado pelo fato de que compreende: contatar uma amostra biológica do objeto com uma quantidade eficaz de pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, com definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, que é capaz de se ligar a tau para formar um complexo tau- anticorpo; detectar a presença e/ou quantidade do complexo tau- anticorpo; e comparar a presença/quantidade de tau ligada ao anticorpo na amostra com a quantidade em uma amostra de controle ou um limite, em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de tau complexada com o anticorpo em relação à amostra de controle de limite indica doença de Alzheimer e/ou comprometimento cognitivo leve no objeto.

   165. Método, de acordo com a reivindicação 164, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou 13 a 14.

   166. Método para distinguir a doença de Alzheimer e/ou comprometimento cognitivo leve da doença de Parkinson, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica e/ou demência frontotemporal em um objeto, caracterizado pelo fato de que compreende: obter uma amostra biológica do objeto; detectar a presença e/ou quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada pelo menos na posição treonina 217 na amostra biológica; e comparar a presença/quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada na treonina 217 com a quantidade em uma amostra de controle ou um limite, em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de proteína tau 2N4R fosforilada na treonina 217 em relação aos controles amplo ou limite indica DA ou LCC no objeto.

   167. Método, de acordo com a reivindicação 166, caracterizado pelo fato de que a presença e/ou quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada pelo menos na posição treonina 217 na amostra biológica é detectada usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer um de reivindicações 1 a 10 ou 13 a 14.

   168. Método para prever a probabilidade de que um paciente com deficiência cognitiva leve desenvolverá a doença de Alzheimer, caracterizado pelo fato de que compreende:

   contatar uma amostra biológica do objeto com uma quantidade eficaz de pelo menos um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40, que é capaz de se ligar a tau para formar um complexo tau-anticorpo; detectar a presença e/ou quantidade do complexo tau- anticorpo; e comparar a presença/quantidade de tau ligada ao anticorpo na amostra com a quantidade em uma amostra de controle ou um limite, em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de tau complexada com o anticorpo em relação à amostra de controle ou limite indica uma probabilidade aumentada de que o paciente desenvolverá a doença de Alzheimer.

   169. Método para prever a probabilidade de que um paciente com deficiência cognitiva leve desenvolverá a doença de Alzheimer, caracterizado pelo fato de que compreende: obter uma amostra biológica do objeto; detectar a presença e/ou quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada pelo menos na posição treonina 217 na amostra biológica; e comparar a presença/quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada na treonina 217 com a quantidade em uma amostra de controle ou um limite, em que a presença e/ou uma quantidade aumentada de proteína tau 2N4R fosforilada pelo menos na treonina 217 em relação à amostra de controle ou limite indica uma probabilidade aumentada de que o paciente desenvolverá a doença de Alzheimer.

   170. Método, de acordo com a reivindicação 169, caracterizado pelo fato de que a presença e/ou quantidade de proteína tau 2N4R fosforilada pelo menos na posição treonina 217 na amostra biológica é detectada usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer um de reivindicações 1 a 10 ou 13 a 14.

   171. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a tau, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3), e a região variável de cadeia leve compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 101, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102, HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103, LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 106.

   172. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 171, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

   108.

   173. Método para tratamento da doença de Alzheimer (AD) em um objeto, caracterizado pelo fato de que compreende, detectar DA no objeto usando o método para qualquer uma das reivindicações 50 a 97, 110 a 124 e 140 a 163, e administrar um tratamento para DA ao objeto identificado como tendo AD.

   174. Método, de acordo com a reivindicação 173, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende um ou mais dos seguintes: um anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40; um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao beta amiloide; uma terapia genética contra amiloide beta e/ou tau; e/ou uma terapia de vacina de peptídeo, por exemplo, usando uma vacina compreendendo um peptídeo sintético cuja sequência de aminoácidos consiste em KDNIKHVPGGGS.

   175. Método para tratar um paciente que foi identificado como portador da doença de Alzheimer, de acordo com o método para qualquer uma das reivindicações 50 a 97, 110 a 124 e/ou 140 a 163, caracterizado pelo fato de que compreende administrar um tratamento para a doença de Alzheimer ao paciente.

   176. Método, de acordo com a reivindicação 175, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende um ou mais dos seguintes: um anticorpo anti-tau ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 40; um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao beta amiloide; uma terapia genética contra amiloide beta e/ou tau; e/ou uma terapia de vacina de peptídeo, por exemplo, usando uma vacina compreendendo um peptídeo sintético cuja sequência de aminoácidos consiste em KDNIKHVPGGGS.