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BR112018003695B1 - Molécula de ácido nucleico recombinante, uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente compreendendo a mesma, composição inibidora de inseto, produto básico, e métodos para controlar uma praga ou infestação de praga de espécie de lepidópteros e de detecção da presença de uma proteína pesticida - Google Patents

Molécula de ácido nucleico recombinante, uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente compreendendo a mesma, composição inibidora de inseto, produto básico, e métodos para controlar uma praga ou infestação de praga de espécie de lepidópteros e de detecção da presença de uma proteína pesticida Download PDF

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BR112018003695B1
BR112018003695B1 BR112018003695-1A BR112018003695A BR112018003695B1 BR 112018003695 B1 BR112018003695 B1 BR 112018003695B1 BR 112018003695 A BR112018003695 A BR 112018003695A BR 112018003695 B1 BR112018003695 B1 BR 112018003695B1
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David J. Bowen
Catherine A. Chay
Todd A. Ciche
Uma R. Kesanapalli
Jennifer L. Lutke
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Monsanto Technology Llc
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Publication date
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Abstract

PROTEÍNAS INIBIDORAS DE INSETO. Trata-se de proteínas pesticidas exibindo atividade tóxica contra espécies de praga de lepidópteros que são divulgadas e incluem, sem limitação, TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 e TIC7473PL. Os construtos de DNA que são fornecidos contêm uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma ou mais das proteínas pesticidas divulgadas. Plantas, células vegetais, semente e partes de plantas transgênicas resistentes à infestação de lepidópteros que são fornecidas contêm sequências de ácido nucleico recombinante que codificam as proteínas pesticidas da presente invenção. Métodos para detectar a presença das sequências de ácido nucleico recombinante ou das proteínas da presente invenção em uma amostra biológica e métodos de controle de pragas de espécie de lepidópteros usando qualquer uma das proteínas pesticidas TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 e TIC7473PL também são previstos.

Description

REFERÊNCIA A PEDIDO RELACIONADO
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US no 62/210.737, depositado em 27 de agosto de 2015, que está aqui incorporado por referência na sua totalidade.
INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[002] O arquivo nomeado "38-21_61627US0001 SEQLIS- TING_ST25.txt" contendo uma forma legível por computador da Lista-gem de Sequências foi criado no dia 3 de agosto de 2016. Este arquivo tem 94.508 bytes (medido em MS-Windows®), depositado simulta-neamente por envio eletrônico (utilizando o sistema de depósito EFS- Web do Escritório de Patentes dos Estados Unidos), e incorporado aqui por referência na sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A invenção geralmente se refere ao campo das proteínas inibidoras de insetos. Uma nova classe de proteínas que exibem atividade inibitória de insetos contra pragas relevantes para agricultura de plantas e sementes de cultura é descrita. Em particular, a classe descrita de proteínas é ativa como inseticida contra pragas agricolamente relevantes de plantas e sementes de cultivo, particularmente as espécies de Lepidópteros de pragas de insetos. São fornecidas plantas, partes de plantas e sementes contendo um construto de polinucleotí- deo recombinante que codifica uma ou mais das proteínas de toxina descritas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[004] Melhorar o rendimento das culturas de plantas agricolamen- te significativas, incluindo, dentre outras, milho, soja, cana-de-açúcar, arroz, trigo, vegetais e algodão, tornou-se cada vez mais importante. Além da crescente necessidade de produtos agrícolas para alimentação, vestuário e fornecer energia para uma população humana em crescimento, os efeitos relacionados ao clima e a pressão da população crescente para usar terras para outros fins além das práticas agrícolas preveem reduzir a quantidade de terras aráveis disponíveis para a agricultura. Estes fatores levaram a previsões sombrias de segurança alimentar, particularmente na ausência de grandes aprimoramentos na biotecnologia de planta e práticas agronômicas. À luz destas pressões, aprimoramentos ambientalmente sustentáveis em tecnologia, técnicas agrícolas e manejo de pragas são ferramentas vitais para expandir a produção de culturas sobre a quantidade limitada de terras aráveis disponíveis para agricultura.
[005] Insetos, particularmente insetos na ordem de Lepidópteros e Coleópteros, são considerados uma das principais causas de danos às culturas de campo, diminuindo, assim, o rendimento das culturas em áreas infestadas. Espécies de praga de Lepidópteros que afetam negativamente a agricultura incluem, sem limitação, lagarta-do- cartucho (Spodoptera exempta), lagarta-rosca (Agrotis ipsilon), lagarta- da-espiga-do-milho (Helicoverpa zea), curuquerê (Alabama argillacea), traça-das-crucíferas (Plutella xylostella), traça europeia do milho (Os- trinia nubilalis), lagarta-militar (Spodoptera frugiperda), lagarta-militar resistente a Cry1Fa1 (Spodoptera frugiperda), lagarta-do-velho-mundo (OWB, Helicoverpa armigera), lagarta-das-vagens (Spodoptera erida- nia), lagarta-falsa-medideira (Chrysodeixis includens), larva da mariposa manchada (Earias vittella), broca grande da cana-de-açúcar (Dia- traea grandiosella), lagarta-das-maçãs (Heliothis virescens), curuquerê oriental (Spodoptera litura, também conhecida como lagarta desfolha- dora), lagarta-rosca (Striacosta albicosta) e lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis).
[006] Historicamente, a aplicação intensiva de inseticidas quími cos sintéticos foi confiada como agente de controle de pragas na agricultura. As preocupações com o meio ambiente e a saúde humana, além de problemas de resistência emergentes, estimularam a pesquisa e o desenvolvimento de pesticidas biológicos. Este esforço de pesquisa levou à descoberta progressiva e ao uso de várias espécies microbianas entomopatogênicas, incluindo bactérias.
[007] O paradigma de controle biológico mudou quando o poten cial de bactérias entomopatogênicas, especialmente bactérias pertencentes ao gênero Bacillus, foi descoberto e desenvolvido como um agente biológico de controle de pragas. As cepas da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) foram utilizadas como fonte de proteínas pesticidas, uma vez que foi descoberto que as cepas de Bt mostram uma alta toxicidade contra insetos específicos. As cepas de Bt são conhecidas por produzir endotoxinas delta que estão localizadas dentro de corpos de inclusão cristalinos parasporais no início da esporulação e durante a fase de crescimento estacionária (por exemplo, proteínas Cry) e também são conhecidas por produzir proteína inseticida secretada. Após a ingestão por um inseto suscetível, as endotoxinas delta, bem como as toxinas secretadas exercem seus efeitos na superfície do epi- télio do intestino médio, rompendo a membrana celular, levando à ruptura celular e à morte. Os genes que codificam proteínas inseticidas também foram identificados em espécies bacterianas diferentes de Bt, incluindo outros Bacillus e uma diversidade de espécies bacterianas adicionais, tais como Brevibacillus laterosporus, Lysinibacillus sphaeri- cus ("Ls" anteriormente conhecido como Bacillus sphaericus) e Paeni- bacillus popilliae.
[008] As toxinas inseticidas solúveis cristalinas e secretadas são altamente específicas para seus hospedeiros e ganharam aceitação mundial como alternativas aos inseticidas químicos. Por exemplo, as proteínas de toxina inseticida foram empregadas em várias aplicações agrícolas para proteger plantas agricolamente importantes contra infestações de insetos, diminuir a necessidade de aplicações de pesticidas químicos e aumentar os rendimentos. As proteínas de toxina inseticida são usadas para controlar as pragas agricolamente relevantes de plantas de cultivo por métodos mecânicos, tais como a aspersão para dispersar formulações microbianas contendo várias cepas de bactérias sobre superfícies de plantas e utilizando técnicas de transformação genética para produzir plantas e sementes transgênicas que expressam proteína de toxina inseticida.
[009] O uso de plantas transgênicas que expressam proteínas de toxina inseticida foi adaptado globalmente. Por exemplo, em 2012, 26,1 milhões de hectares foram plantados com culturas transgênicas expressando toxinas de Bt (James, C., Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012. ISAAA Resumo no 44). O uso global de culturas transgênicas protegidas contra insetos e o número limitado de proteínas de toxinas inseticidas utilizadas nestas culturas criou uma pressão de seleção para os alelos de insetos existentes que conferem resistência às proteínas inseticidas atualmente utilizadas.
[0010] O desenvolvimento de resistência em pragas-alvo a proteí nas de toxinas inseticidas cria a necessidade contínua de descoberta e desenvolvimento de novas formas de proteínas de toxinas inseticidas que são úteis para gerenciar o aumento da resistência a insetos para culturas transgênicas expressando proteínas de toxinas inseticidas. As novas toxinas de proteínas com eficácia melhorada e que exibem controle sobre um espectro mais amplo de espécies de insetos suscetíveis reduzirão o número de insetos sobreviventes que podem desenvolver alelos de resistência. Além disto, o uso em uma planta de duas ou mais proteínas transgênicas de toxina inseticida tóxicas para a mesma praga de insetos e exibindo diferentes modos de ação reduz a probabilidade de resistência em qualquer espécie de inseto-alvo.
[0011] Desta forma, os inventores divulgam no presente documen to uma família de toxinas de proteína inovadora de Paenibacillus popil- liae, junto com proteínas de toxina similares, proteínas variantes e proteínas recombinantes exemplificadoras que exibem atividade inseticida contra espécies de Lepidópteros alvo, particularmente contra lagarta- do-cartucho (Spodoptera exempta), lagarta-rosca (Agrotis ipsilon), la- garta-da-espiga-do-milho (Helicoverpa zea), curuquerê (Alabama argil- lacea), traça-das-crucíferas (Plutella xylostella), traça europeia do milho (Ostrinia nubilalis), lagarta-militar (Spodoptera frugiperda), lagarta- militar resistente a Cry1Fa1 (Spodoptera frugiperda), lagarta-do-velho- mundo (OWB, Helicoverpa armigera), lagarta-das-vagens (Spodoptera eridania), lagarta-falsa-medideira (Chrysodeixis includens), larva da mariposa manchada (Earias vittella), broca grande da cana-de-açúcar (Diatraea grandiosella), lagarta-das-maçãs (Heliothis virescens), curu- querê oriental (Spodoptera litura, também conhecido como lagarta desfolhadora), lagarta-rosca (Striacosta albicosta) e lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0012] É aqui descrito um grupo inovador de proteínas pesticidas com atividade inibitória contra insetos (proteínas de toxina), aqui referidas como TIC6757, TIC7472 e TIC7473 pertencentes à classe de toxina de proteína TIC6757, que demonstram exibir atividade inibitória contra uma ou mais pragas de plantas de cultura. A proteína TIC6757 e as proteínas na classe de toxina da proteína TIC6757 podem ser usadas sozinhas ou em combinação com outras proteínas inseticidas e agentes tóxicos em formulações e in planta, fornecendo, assim, alternativas para proteínas inseticidas e químicos inseticidas atualmente em uso em sistemas agrícolas.
[0013] Em uma modalidade, é descrita neste pedido uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um fragmento promotor heterólogo ligado de forma operacional a um segmento de polinu- cleotídeo que codifica uma proteína pesticida ou fragmento da mesma, em que (a) a referida proteína pesticida compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:18; ou (b) a referida proteína pesticida compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85%, ou 90%, ou 95%, ou 98%, ou 99%, ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos com SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:18; ou (c) o referido segmento de polinucleotí- deo se hibridiza a um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotí- deos da SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15 e SEQ ID NO:17; ou (d) o referido segmento de polinucleotídeo que codifica uma proteína pesticida ou fragmento da mesma compreende uma sequência de polinucleotídeos tendo pelo menos 65%, ou 70%, ou 75%, ou 80%, ou 85%, ou 90%, ou 95%, ou 98%, ou 99%, ou cerca de 100% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15 ou SEQ ID NO:17; ou (e) a referida molécula de ácido nucleico recombinante está em ligação operável com um vetor, e o referido vetor é selecionado do grupo consistindo em um plasmídeo, fagomídeo, bacmídeo, cosmídeo e um cromossomo artificial bacteriano ou de levedura. A molécula de ácido nucleico recombinante pode compreender uma sequência que funciona para expressar a proteína pesticida em uma planta; ou é expressada em uma célula vegetal para produzir uma quantidade eficaz como pesticida de proteína pesticida.
[0014] Em outra modalidade deste pedido, são células hospedei ras compreendendo uma molécula de ácido nucleico recombinante do pedido, em que a célula hospedeira é selecionada do grupo consistindo em uma bactéria e uma célula vegetal. Células hospedeiras bacte- rianas contempladas incluem Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, Pantoec e Erwinia. Em certas modalidades, a referida espécie de Bacillus é Bacillus cereus ou Bacillus thuringiensis, a referida Brevibacillus é Brevibacillus laterosperous, ou Escherichia é Escherichia coli. As células hospedeiras vegetais contempladas incluem uma célula vegetal dicotiledônea e uma célula vegetal monocotiledônea. Células vegetais contempladas incluem, ainda, uma célula vegetal de alfafa, banana, cevada, feijão, brócolis, repolho, brassica, cenoura, mandioca, castanha, couve-flor, aipo, grão-de-bico, repolho chinês, cítricos, coco, café, milho, trevo, algodão (Gossypium sp.), cucurbitáceo, pepino, abeto de Douglas, be-rinjela, Eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho-poró, alface, pinheiro, painço, melões, nozes, aveia, azeitona, cebola, ornamental, palmeira, pastagem, ervilha, amendoim, pimenta, ervilha-da-Angola, pinho, batata, álamo, abóbora, pinheiro radiata, rabanete, colza, arroz, porta- enxertos, centeio, cártamo, arbusto, sorgo, pinho do sul, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata doce, pirais, chá, tabaco, tomate, triticale, relva, melancia e trigo.
[0015] Em outra modalidade, a proteína pesticida exibe atividade contra insetos de Lepidópteros incluindo lagarta-da-soja, broca da cana-de-açúcar, lagarta elasmo, lagarta-da-espiga-do-milho, lagarta-das- maçãs, lagarta-falsa-medideira, lagarta-do-cartucho, lagarta-das- vagens, lagarta-militar, lagarta-do-cartucho da beterraba, lagarta-do- velho-mundo, curuquerê oriental, lagarta-rosada do algodão, lagarta- rosca, broca grande da cana-de-açúcar, curuquerê, traça-das- crucíferas, lagarta-manchada, curuquê oriental, lagarta-rosca e traça europeia do milho.
[0016] Também são contempladas neste pedido plantas que com preendem uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um fragmento promotor heterólogo ligado de modo operacional a um segmento de polinucleotídeo que codifica uma proteína pesticida ou fragmento da mesma, em que: (a) a referida proteína pesticida compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:18; ou (b) a referida proteína pesticida compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85%, ou 90%, ou 95%, ou 98%, ou 99%, ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoáci- dos com SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:18; ou (c) o referido segmento de poli- nucleotídeo hibridiza sob condições de hibridização rigorosas ao complemento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:15 ou SEQ ID NO:17; ou (d) a referida planta exibe uma quantidade detectável da referida proteína pesticida. Em certas modalidades, a proteína pesticida compreende SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:18. Em uma modalidade, a planta é uma planta dicotiledônea ou uma planta monocoti- ledônea. Em outra modalidade, a planta é adicionalmente selecionada do grupo consistindo em alfafa, banana, cevada, feijão, brócolis, repolho, brassica, cenoura, mandioca, castanha, couve-flor, aipo, grão-de- bico, repolho chinês, cítricos, coco, café, milho, trevo, algodão, cucur- bitáceo, pepino, abeto de Douglas, berinjela, Eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho-poró, alface, pinheiro, painço, melões, nozes, aveia, azeitona, cebola, ornamental, palmeira, pastagem, ervilha, amendoim, pimenta, ervilha-da-Angola, pinho, batata, álamo, abóbora, pinheiro radiata, rabanete, colza, arroz, porta-enxertos, centeio, cártamo, arbusto, sorgo, pinho do sul, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, milho doce, goma doce, batata doce, pirais, chá, tabaco, tomate, triticale, relva, melancia e trigo.
[0017] Em modalidades adicionais, são descritas sementes com preendendo as moléculas de ácido nucleico recombinante.
[0018] Em outra modalidade, é contemplada uma composição ini- bidora de inseto compreendendo as moléculas de ácido nucleico re- combinante descritas neste pedido. A composição inibidora de inseto pode compreender ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos um outro agente pesticida que é diferente da referida proteína pesticida. Em certas modalidades, o pelo menos um outro agente pesticida é selecionado do grupo consistindo em uma proteína inibido- ra de inseto, uma molécula de dsRNA inibidora de inseto e uma proteína auxiliar. Também é contemplado que o pelo menos um outro agente pesticida na composição inibidora de inseto exiba atividade contra uma ou mais espécies de praga das ordens Lepidópteros, Co- leópteros ou Hemípteros. O pelo menos um outro agente pesticida na composição inibidora de inseto é, em uma modalidade, selecionado do grupo consistindo em uma proteína Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C, variantes de Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F, quimeras de Cry1A/F, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, variantes de Cry3A, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-AXMI-, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100, AXMI-115, AXMI-113, e AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z e AXMI- 225z, AXMI-238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335,AXMI-R1 e variantes das mesmas, IP3 e variantes da mesma, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-657 e uma proteína DIG-11.
[0019] São também contemplados os produtos básicos que com preendem uma quantidade detectável das moléculas de ácido nucleico recombinante descritas neste pedido. Tais produtos básicos incluem mercadoria de milho ensacada por um manipulador de grãos, flocos de milho, bolos de milho, farinha de milho, farelo de milho, xarope de milho, óleo de milho, silagem de milho, amido de milho, cereais de milho e similares, e produtos básicos correspondentes de soja, arroz, trigo, sorgo, ervilha-da-Angola, amendoim, frutas, melões e vegetais, incluindo, se for caso, sucos, concentrados, geleias, compotas, marmeladas e outras formas comestíveis de tais produtos básicos contendo uma quantidade detectável de tais polinucleotídeos e ou polipeptídeos deste pedido, sementes de algodão inteiras ou processadas, óleo de algodão, fibra de algodão, sementes e partes de plantas processadas para ração ou alimentos, fibras, papel, biomassas e produtos combustíveis, tais como combustível derivado de óleo de algodão ou péletes derivados de resíduos de descaroçador de algodão, sementes de soja inteiras ou processadas, óleo de soja, proteína de soja, farelo de soja, farinha de soja, flocos de soja, flocos de soja, leite de soja, queijo de soja, vinho de soja, ração compreendendo soja, papel compreendendo soja, creme compreendendo soja, biomassa de soja e produtos combustíveis produzidos utilizando plantas de soja e partes de plantas de soja.
[0020] Também é contemplado neste pedido um método de pro dução de semente compreendendo as moléculas de ácido nucleico recombinante descritas neste pedido. O método compreende plantar pelo menos uma das sementes que compreende as moléculas de ácido nucleico recombinante descritas neste pedido; cultivar a planta da semente; e colher sementes das plantas, em que a semente colhida compreende as moléculas de ácido nucleico recombinante deste pedido.
[0021] Em outra modalidade ilustrativa, é fornecida uma planta re sistente à infestação de insetos, em que as células da referida planta compreendem: (a) uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica uma quantidade eficaz como inseticida de uma proteína pesticida conforme apresentado na SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:18; ou (b) uma quantidade eficaz como inseticida de uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85%, ou 90%, ou 95%, ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos com SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:18.
[0022] Também são descritos neste pedido métodos para controlar uma praga de espécies de Lepidópteros e para controlar uma infestação de pragas de espécies lepidópteros de uma planta, particularmente uma planta de cultivo. O método compreende, em uma modalidade, (a) colocar a praga em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de proteínas pesticidas conforme apresentado na SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:18; ou (b) colocar a praga em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de uma ou mais proteínas pesticidas que compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85%, ou 90%, ou 95%, ou cerca de 100% de identidade de sequência de ami- noácidos com SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:18.
[0023] É adicionalmente fornecido no presente documento um mé todo para detectar a presença de uma molécula de ácido nucleico re- combinante compreendendo um segmento polinucleotídico que codifica uma proteína pesticida ou fragmento da mesma, em que: (a) a referida proteína pesticida compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:18; ou (b) a referida proteína pesticida compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 65%, ou 70%, ou 75%, ou 80%, ou 85%, ou 90%, ou 95%, ou 98%, ou 99%, ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos com SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:18; ou (c) o referido segmento de polinucleotídeo hibridiza em um polinucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15 ou SEQ ID NO:17. Em uma modalidade da invenção, o método compreende colocar uma amostra de ácidos nucleicos em contato com uma sonda de ácido nucleico que hibridiza sob condições de hibridização rigorosas com DNA genômico de uma planta compreendendo um segmento de polinucleotídeo que codifica uma proteína pesticida ou fragmento da mesma fornecida no presente documento, e não hibridiza sob tais condições de hibridização com DNA genô- mico de uma planta de outro modo isogênica que não compreende o segmento, em que a sonda é homóloga ou complementar a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15 ou SEQ ID NO:17, ou uma sequência que codifica uma proteína pesticida compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 65%, ou 70%, ou 75%, ou 80%, ou 85%, ou 90%, ou 95%, ou 98%, ou 99%, ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos com SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:18. O método pode ainda compreender (a) submeter a amostra e a sonda a condições de hibridização rigorosas; e (b) detectar a hibridação da sonda com DNA da amostra.
[0024] Também são fornecidos pela invenção métodos de detec ção da presença de uma proteína pesticida ou fragmento da mesma em uma amostra compreendendo proteína, em que a referida proteína pesticida compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2; ou a referida proteína pesticida compreende uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 65%, ou 70%, ou 75%, ou 80%, ou 85%, ou 90%, ou 95%, ou 98%, ou 99%, ou cerca de 100% de identidade de sequência de aminoácidos com SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:18. Em uma modalidade, o método compreende: (a) colocar uma amostra em contato com um anticorpo imunorreativo; e (b) detectar a presença da proteína. Em algumas modalidades, a etapa de detecção compreende um ELISA ou um Western blot.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS
[0025] SEQ ID NO:1 é uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína pesticida TIC6757 obtida da espécie DSC004343 de Paenibacillus popilliae.
[0026] SEQ ID NO:2 é a sequência de aminoácidos da proteína pesticida TIC6757.
[0027] SEQ ID NO:3 é uma sequência de codificação sintética que codifica uma proteína pesticida TIC6757PL designada para expressão em uma célula vegetal, em que um códon de alanina adicional é inserido imediatamente após o códon de metionina de iniciação.
[0028] SEQ ID NO:4 é a sequência de aminoácidos de TIC6757PL codificada por uma sequência de codificação sintética designada para expressão em uma célula vegetal (SEQ ID NO:3), e em que um ami- noácido alanina adicional é inserido imediatamente após a metionina de iniciação.
[0029] SEQ ID NO:5 é uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína pesticida TIC6757_His, em que uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma etiqueta de Histidina é operativamente ligada em 5’ e em quadro à sequência de codificação de TIC6757.
[0030] SEQ ID NO:6 é a sequência de aminoácidos da proteína pesticida TIC6757_His.
[0031] SEQ ID NO:7 é uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína pesticida TIC7472 obtida de espécie DSC007648 de Paenibacillus popilliae.
[0032] SEQ ID NO:8 é a sequência de aminoácidos da proteína pesticida TIC7242.
[0033] SEQ ID NO:9 é uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína pesticida TIC7472_His, em que uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma etiqueta de Histidina é operativamente ligada em 3’ e em quadro à sequência de codificação de TIC7472.
[0034] SEQ ID NO:10 é a sequência de aminoácidos da proteína pesticida TIC7472_His.
[0035] SEQ ID NO:11 é uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína pesticida TIC7473 de um quadro de leitura aberto na posição de nucleotídeo 1-2391 e um códon de terminação de tradução.
[0036] SEQ ID NO:12 é a tradução de sequência de aminoácidos da proteína pesticida TIC7243 obtida da espécie DSC008493 de Pae- nibacillus popillia.
[0037] SEQ ID NO:13 é uma sequência de ácido nucleico recom- binante que codifica uma proteína pesticida TIC7473_His, em que uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma etiqueta de Histidina é operativamente ligada em 3’ e em quadro à sequência de codificação de TIC7472.
[0038] SEQ ID NO:14 é a tradução de sequência de aminoácidos da proteína pesticida TIC7473_His.
[0039] SEQ ID NO:15 é uma sequência de codificação sintética que codifica uma proteína pesticida TIC7472PL designada para expressão em uma célula vegetal, em que um códon de alanina adicional é inserido imediatamente após o códon de metionina de iniciação.
[0040] SEQ ID NO:16 é a sequência de aminoácidos de TIC7472PL codificada por uma sequência de codificação sintética designada para expressão em uma célula vegetal (SEQ ID NO:15), e em que um aminoácido alanina adicional é inserido imediatamente após a metionina de iniciação.
[0041] SEQ ID NO:17 é uma sequência de codificação sintética que codifica uma proteína pesticida TIC7473PL designada para expressão em uma célula vegetal, em que um códon de alanina adicional é inserido imediatamente após o códon de metionina de iniciação.
[0042] SEQ ID NO:18 é a sequência de aminoácidos de TIC7473PL codificada por uma sequência de codificação sintética designada para expressão em uma célula vegetal (SEQ ID NO:17), e em que um aminoácido alanina adicional é inserido imediatamente após a metionina de iniciação.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0043] O problema na técnica do controle de pragas agrícolas po- de ser caracterizado como uma necessidade de novas proteínas de toxina que são eficazes contra pragas-alvo, exibem toxicidade de amplo espectro contra espécies de praga-alvo, são capazes de serem expressas em plantas sem causar problemas agronômicos indesejáveis e fornecem um modo de ação alternativo em comparação com as toxinas atuais que são usadas comercialmente em plantas.
[0044] Proteínas pesticidas inovadoras exemplificadas por TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 e TIC7473PL são descritas no presente documento, e visam cada uma destas necessidades, particularmente contra um amplo espectro de pragas de inseto de Lepidópteros e, mais particularmente, contra lagarta-do- cartucho (Spodoptera exempta), lagarta-rosca (Agrotis ipsilon), lagarta- da-espiga-do-milho (Helicoverpa zea), curuquerê (Alabama argillacea), traça-das-crucíferas (Plutella xylostella), traça europeia do milho (Os- trinia nubilalis), lagarta-militar (Spodoptera frugiperda), lagarta-militar resistente a Cry1Fa1 (Spodoptera frugiperda), lagarta-do-velho-mundo (OWB, Helicoverpa armigera), lagarta-das-vagens (Spodoptera erida- nia), lagarta-falsa-medideira (Chrysodeixis includens), larva da mariposa manchada (Earias vittella), broca grande da cana-de-açúcar (Dia- traea grandiosella), lagarta-das-maçãs (Heliothis virescens), curuquerê oriental (Spodoptera litura, também conhecida como lagarta desfolha- dora), lagarta-rosca (Striacosta albicosta) e lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis).
[0045] Referência neste pedido de patente a TIC6757, "proteína TIC6757", "toxina de proteína TIC6757", "proteína de toxina TIC6757", "proteína pesticida TIC6757", "toxinas relacionadas a TIC6757", "proteínas de toxina relacionadas a TIC6757", TIC6757PL, "proteína TIC6757PL", "toxina de proteína TIC6757PL ", "proteína de toxina TIC6757PL", "proteína pesticida TIC6757PL", "toxinas relacionadas a TIC6757PL", "proteínas de toxina relacionadas a TIC6757PL", TIC7472, "proteína TIC7472", "toxina de proteína TIC7472 ", "proteína de toxina TIC7472", "proteína pesticida TIC7472", "toxinas relacionadas a TIC7472", "proteínas de toxina relacionadas a TIC7472", TIC7472PL, "proteína TIC7472PL", "toxina de proteína TIC7472PL", "proteína de toxina de TIC7472PL", "proteína pesticida de TIC7472PL", "toxinas relacionadas a TIC7472PL", "proteínas de toxina relacionadas a TIC7472PL ", TIC7473, "proteína TIC7473", "toxina de proteína TIC7473", "proteína de toxina TIC7473", "proteína pesticida TIC7473", "toxinas relacionadas a TIC7473", "proteínas de toxina relacionadas a TIC7473", TIC7473PL, "proteína TIC7473PL", "toxina de proteína TIC7473PL", "proteína de toxina TIC7473PL", "proteína pesticida TIC7473PL", "toxinas relacionadas a TIC7473PL", "proteínas de toxina relacionadas a TIC7473PL" e similares, se referem a qualquer proteína pesticida ou proteína inibidora de inseto inibidora que compreende, que consiste em, que é substancialmente homóloga, semelhante a, ou que é derivada de qualquer proteína pesticida ou proteína inibidora de inseto de sequência de TIC6757 (SEQ ID NO:2), TIC6757PL (SEQ ID NO:4), TIC7472 (SEQ ID NO:8). TIC7472PL (SEQ ID NO:16), TIC7473 (SEQ ID NO:12) ou TIC7473PL (SEQ ID NO:18) e seus segmentos inibidores de insetos ou pesticidas, ou combinações dos mesmos, que conferem atividade contra pragas de Lepidópteros, incluindo qualquer proteína que exiba atividade inibidora pesticida ou de insetos se o alinhamento desta proteína com TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL resultar em identidade de sequência de aminoácidos de qualquer porcentagem de fração de cerca de 85% a cerca de 100%. As proteínas TIC6757 e TIC6757PL incluem tanto a forma direcionada a plastídeo como não direcionada a plastí- deo das proteínas.
[0046] O termo "segmento" ou "fragmento" é usado neste pedido para descrever sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos con- secutivas que são menores do que a sequência de aminoácido ou de ácido nucleico completa que descreve uma proteína TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL. Um segmento ou fragmento exibindo atividade inibidora de insetos também é descrito neste pedido se o alinhamento de tal segmento ou fragmento com a seção correspondente da proteína TIC6757 apresentada na SEQ ID NO:2, proteína TIC6757PL apresentada na SEQ ID NO:4, proteína TIC7472 apresentada na SEQ ID NO:8, proteína TIC7472PL apresentada na SEQ ID NO:16, proteína TIC7473 apresentada na SEQ ID NO:12 ou proteína TIC7473PL apresentada na SEQ ID NO:18, resultar na identidade de sequência de aminoácidos de qualquer per-centual de fração de cerca de 85 a cerca de 100 por cento entre o segmento ou fragmento e a seção correspondente da proteína TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL.
[0047] A referência neste pedido aos termos "ativo" ou "atividade", "atividade pesticida" ou "pesticida" ou "atividade inseticida", "inibidor de insetos" ou "inseticida" se refere à eficácia de um agente tóxico, tal como uma toxina de proteína, na inibição (inibição do crescimento, alimentação, fecundidade ou viabilidade), supressão (supressão do crescimento, alimentação, fecundidade ou viabilidade), controle (controle da infestação de pragas, controle das atividades de alimentação de pragas em uma cultura particular contendo uma quantidade efetiva de proteína TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL) ou extermínio (causando a morbidade, mortalidade ou redução da fecundidade de) de uma praga. Estes termos se destinam a incluir o resultado do fornecimento de uma quantidade eficaz como pesticida de uma proteína tóxica para uma praga onde a exposição da praga à proteína tóxica resulta em morbidade, mortalidade, redução da fecundidade ou crescimento retardado. Estes termos também incluem a repulsão da praga da planta, de um tecido da planta, de uma parte da planta, de uma semente, de células vegetais ou da localização geográfica particular onde a planta pode estar crescendo, como resultado do fornecimento de uma quantidade eficaz como pesticida da proteína tóxica em ou sobre a planta. Em geral, a atividade pesticida se refere à capacidade de uma proteína tóxica ser eficaz na inibição do crescimento, desenvolvimento, viabilidade, comportamento alimentar, comportamento de acoplamento, fecundidade ou qualquer diminuição mensurável dos efeitos adversos causados por uma alimentação de insetos nesta proteína, fragmento de proteína, segmento de proteína ou polinucleotídeo de uma praga-alvo particular, incluindo, sem limitação, insetos da ordem de Lepidópteros. A proteína tóxica pode ser produzida pela planta ou pode ser aplicada à planta ou ao meio ambiente dentro do local onde a planta está localizada. Os termos "bioati- vidade", "efetivo", "eficaz" ou variações dos mesmos também são utili-zados de forma intercambiável neste pedido para descrever os efeitos das proteínas da presente invenção em pragas de insetos-alvo.
[0048] A quantidade eficaz como pesticida de um agente tóxico, quando fornecido na dieta de uma praga-alvo, exibe atividade pesticida quando o agente tóxico entra em contato com a praga. Um agente tóxico pode ser uma proteína pesticida ou um ou mais agentes químicos conhecidos na técnica. Os agentes químicos pesticidas ou inseticidas e os agentes de proteínas pesticidas ou inseticidas podem ser usados sozinhos ou em combinações entre si. Os agentes químicos incluem, sem limitação, moléculas de dsRNA direcionando genes específicos para supressão em uma praga-alvo, organocloretos, organo- fosfatos, carbamatos, piretroides, neonicotinoides e rianoides. Os agentes de proteína pesticida ou inseticida incluem as toxinas de proteínas apresentadas neste pedido, bem como outros agentes tóxicos proteicos, incluindo aqueles que visam lepidópteros, bem como toxinas de proteínas que são usadas para controlar outras pragas de plantas, tais como proteínas Cry e Cyt disponíveis na técnica para utilização no controle de espécies de Coleópteros, Hemípteros e Homópteros.
[0049] Pretende-se que a referência a uma praga, particularmente uma praga de uma planta de cultivo, signifique pragas de insetos de plantas de cultivo, particularmente aquelas pragas de insetos de Lepi- dópteros que são controladas pela classe de toxina de proteína TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL. No entanto, a referência a uma praga também pode incluir pragas de insetos de Coleópteros, Hemípteros e Homópteros, bem como nema- tódeos e fungos, quando os agentes tóxicos que visam estas pragas estão colocalizados ou presentes junto com a proteína TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL ou uma proteína que é 85 a cerca de 100 por cento idêntica a TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL.
[0050] As proteínas TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 e TIC7473PL estão relacionadas por uma função comum e exibem atividade inseticida em relação a pragas de insetos das espécies de insetos lepidópteros, incluindo adultos, pupas, larvas e neonatos.
[0051] Insetos da ordem do lepidópteros incluem, sem limitação, lagarta-do-cartucho, minhocas, lagartas e heliotinas na família Noctui- dae, por exemplo, lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda), lagar- ta-do-cartucho da beterraba (Spodoptera exigua), lagarta-do-cartucho (Spodoptera exempta), lagarta-das-vagens (Spodoptera eridania), lagarta dos cereais (Mamestra configurata), lagarta rosca (Agrotis ipsi- lon), lagarta plusia (Trichoplusia ni), lagarta-falsa-medideira (Pseudo- plusia includens), lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis), lagarta do trevo verde (Hypena scabra), lagarta das maçãs (Heliothis virescens), lagarta rosca (Agrotis subterranea), lagarta-do-cartucho (Pseudaletia unipuncta), lagarta-do-cartucho do oeste (Agrotis orthogonia); brocas, traça das paredes, traça das teias, vermes das coníferas, vermes do repolho e esqueletizantes da família Pyralidae, por exemplo, broca do milho (Ostrinia nubilalis), lagarta da laranja (Amyelois transitella), lagarta da teia da raiz do milho (Crambus caliginosellus), verme da teia dos gramados (Herpetogramma licarsisalis), traça do girassol (Ho- moeosoma electellum), broca do colo (Elasmopalpus lignosellus); brocas das folhas, traças, vermes das sementes e vermes das frutas na família Tortricidae, por exemplo, mariposa das maçãs (Cydia pomonel- la), traça da uva (Endopiza viteana), traça da fruta oriental (Grapholita molesta), traça do broto do girassol (Suleima helianthana); e muitos outros lepidópteros economicamente importantes, por exemplo, traça das crucíferas (Plutella xylostella), lagarta rosada do algodão (Pecti- nophora gossypiella) e mariposa cigana (Lymantria dispar). Outras pragas de inseto da ordem dos Lepidópteros incluem, por exemplo, curuquerê (Alabama argillacea), traça trotríceda de árvores frutíferas (Archips argyrospila), lagarta-rosada (Archips rosana) e outras espé-cies de Archips, (Chilo suppressalis, broca do arroz asiática ou broca do caule do arroz), broca da filha do arroz (Cnaphalocrocis medinalis), verme de teias da raiz do milho (Crambus caliginosellus), lagarta da grama azul (Crambus teterrellus), broca grande da cana-de-açúcar (Diatraea grandiosella), broca da cana-de-açúcar (Diatraea sacchara- lis), larva da mariposa espinhosa (Earias insulana), mariposa manchada (Earias vittella), lagarta do tomate (Helicoverpa armigera), lagarta do milho (Helicoverpa zea, também conhecida como lagarta da soja e lagarta do algodão), lagarta das maçãs (Heliothis virescens), traça das teias do gramado (Herpetogramma licarsisalis), lagarta-rosca (Stria- costa albicosta), traça europeia dos cachos de videiras (Lobesia botra- na), larva mineradora do cítrus (Phyllocnistis citrella), borboleta branca da couve (Pieris brassicae), borboleta branca pequena (Pieris rapae, também conhecida como verme do repolho), lagarta-do-cartucho (Spodoptera exigua), curuquerê oriental (Spodoptera litura, também conhecida como lagarta desfolhadora) e traça do tomateiro (Tuta absoluta).
[0052] A referência neste pedido a uma "molécula de DNA isola da", ou a um termo ou expressão equivalente, pretende significar que a molécula de DNA é aquela que está presente sozinha ou em combinação com outras composições, mas não dentro do seu ambiente natural. Por exemplo, os elementos de ácido nucleico, tais como sequência de codificação, sequência de íntron, sequência líder não traduzida, sequência de promotor, sequência de terminação da transcrição e similares, que são naturalmente encontrados dentro do DNA do genoma de um organismo não são considerados "isolados" desde que o elemento esteja dentro do genoma do organismo e no local dentro do ge- noma em que é naturalmente encontrado. No entanto, cada um destes elementos e subpartes destes elementos seria "isolado" dentro do escopo da presente invenção, desde que o elemento não esteja dentro do genoma do organismo e na localização dentro do genoma em que é naturalmente encontrado. Da mesma forma, uma sequência de nu- cleotídeos que codifica uma proteína inseticida ou qualquer variante inseticida natural daquela proteína seria uma sequência de nucleotí- deos isolada, desde que a sequência de nucleotídeos não esteja dentro do DNA da bactéria da qual a sequência que codifica a proteína é naturalmente encontrada. Uma sequência sintética de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da proteína inseticida de ocorrência natural seria considerada isolada para efeitos da presente invenção. Para os propósitos da presente invenção, qualquer sequência transgênica de nucleotídeos, ou seja, a sequência de nucleotídeos do DNA inserido no genoma das células de uma planta ou bactéria, ou presente em um vetor extracromossômico, seria considerada uma sequência isolada dos nucleotídeos se está presente dentro do plasmí- deo ou estrutura similar utilizada para transformar as células, dentro do genoma da planta ou da bactéria, ou presente em quantidades detec- táveis em tecidos, progênies, amostras biológicas ou produtos básicos derivados da planta ou da bactéria.
[0053] Conforme descrito adicionalmente neste pedido, um quadro de leitura aberto (ORF) que codifica TIC6757 (SEQ ID NO:19) foi descoberto em DNA obtido de cepa DSC004343 de Paenibacillus popil- liae. A sequência de codificação foi clonada e expressa em células hospedeiras microbianas para produzir proteínas recombinantes usadas em bioensaios. As técnicas de triagem de alto rendimento e bioin- formática foram utilizadas para pesquisar sequências microbianas para genes que codificam proteínas que exibem similaridade com TIC6757. Um quadro de leitura aberto (ORF) que codifica TIC7472 (SEQ ID NO:7) foi descoberto em DNA obtido de cepa DSC007648 de Paeni- bacillus popilliae. Um quadro de leitura aberto (ORF) que codifica TIC7473 (SEQ ID NO:11) foi descoberto em DNA obtido de cepa DSC008493 e Paenibacillus popilliae. O bioensaio que usa proteínas microbianas derivadas de célula hospedeira de TIC6757 demonstrou atividade contra as espécies de Lepidópteros lagarta-do-cartucho da beterraba (Spodoptera exigua), lagarta-rosca (Agrotis ipsilon), lagarta- da-espiga-do-milho (Helicoverpa zea), curuquerê (Alabama argillacea), traça-das-crucíferas (Plutella xylostella), traça europeia do milho (Os- trinia nubilalis), lagarta-militar (Spodoptera frugiperda), lagarta-militar resistente a Cry1Fa1 (Spodoptera frugiperda), lagarta-do-velho-mundo (OWB, Helicoverpa armigera), lagarta-das-vagens (Spodoptera erida- nia), lagarta-falsa-medideira (Chrysodeixis includens), larva da mariposa manchada (Earias vittella), broca grande da cana-de-açúcar (Dia- traea grandiosella), lagarta-das-maçãs (Heliothis virescens), curuquerê oriental (Spodoptera litura, também conhecida como lagarta desfolha- dora) e lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis). O bioensaio que usa proteínas microbianas derivadas de célula hospedeira de TIC7472 e TIC7473 demonstrou atividade contra as espécies de Lepidópteros lagarta-da-espiga-do-milho (Helicoverpa zea), lagarta-militar (Spodop- tera frugiperda), lagarta-das-vagens (Spodoptera eridania), lagarta- falsa-medideira (Chrysodeixis includens) e broca grande da cana-de- açúcar (Diatraea grandiosella).
[0054] Para a expressão em células vegetais, as proteínas TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 e TIC7473PL podem ser expressas para residir no citosol ou direcionadas a várias organelas da célula vegetal. Por exemplo, direcionar uma proteína para o cloroplasto pode resultar em níveis aumentados de proteína expressada em uma planta transgênica enquanto evita a ocorrência fora de fenótipos. O direcionamento também pode resultar em um aumento na eficácia da resistência contra pragas no evento transgênico. Um peptídeo-alvo ou peptídeo de trânsito é uma cadeia peptídica curta (370 aminoácidos) que direciona o transporte de uma proteína para uma região específica na célula, incluindo o núcleo, mitocôndria, retículo endoplasmático (ER), cloroplasto, apoplasto, peroxissoma e membrana plasmática. Alguns peptídeos-alvo são clivados da proteína por peptidases de sinal após as proteínas serem transportadas. Para direcionar o cloroplasto, as proteínas contêm peptídeos de trânsito que são cerca de 40-50 aminoácidos. Para descrições do uso de peptídeos de trânsito de cloroplasto, consulte as Patentes US nos 5.188.642 e 5.728.925. Muitas proteínas localizadas em cloroplasto são expressas a partir de genes nucleares como precursores e são direcionadas para o cloroplasto por um peptídeo de trânsito de cloroplasto (CTP). Exemplos de tais proteínas de cloroplasto isoladas incluem, sem limitação, aquelas associadas à subunidade pequena (SSU) de ribulose-1,5, - bisfosfato carboxilase, ferredoxina, ferredoxina oxidorredutase, proteína I e proteína II do complexo de colheita leve, tiorredoxina F, fosfato sintase de enolpiruvil shikimato (EPSPS) e peptídeos de trânsito descritos na Patente US no 7.193.133. Foi demonstrado in vivo e in vitro que as proteínas não cloroplasto podem ser direcionadas para o cloro- plasto por meio de fusões proteicas com um CTP heterólogo e que o CTP é suficiente para direcionar uma proteína para o cloroplasto. Incorporação de um peptídeo de trânsito de cloroplasto adequado, tal como o CTP EPSPS de Arabidopsis thaliana (CTP2) (consulte, Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210:437-442, 1987) ou o CTP EPSPS de Petunia hybrida (CTP4) (consulte, della-Cioppa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 83:6873-6877, 1986) demonstrou direcionar sequências de proteína EPSPS heteróloga para cloroplastos em plantas transgênicas (consulte as Patentes US nos 5.627.061; 5.633.435; e 5.312.910; e EP 0218571; EP 189707; EP 508909; e EP 924299). Para direcionar a proteína de toxina TIC6757 ou TIC6757PL para o cloroplasto, uma sequência que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto é colocada em 5’ em ligação operacional e em quadro para uma sequência de codificação sintética que codifica a proteína de toxina TIC6757 ou TIC6757PL que foi projetada para uma expressão ideal em células ve-getais.
[0055] É contemplado que sequências de proteína de toxina adi cionais relacionadas a TIC6757, TIC7472 e TIC7473 podem ser criadas utilizando a sequência de aminoácidos de TIC6757, TIC7472 ou TIC7473 para criar proteínas inovadoras com propriedades inovadoras. As proteínas de toxinas TIC6757, TIC7472 e TIC7473 podem ser alinhadas para combinar diferenças no nível da sequência de aminoá- cidos em variantes de sequência de aminoácidos inovadoras e fazer mudanças apropriadas no sequência de ácido nucleico recombinante que codifica as variantes.
[0056] A presente invenção contempla ainda que as variantes me lhoradas da classe de proteína de toxina TIC6757 podem ser projeta- das in planta utilizando vários métodos de edição de genes conhecidos na técnica. Tais tecnologias utilizadas para a edição do genoma incluem, sem limitação, sistemas de ZFN (nuclease de dedo de zinco), meganucleases, TALEN (nucleases efetoras do tipo ativadora de trans- fecção) e CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas Regularmente Interespaçadas Agrupadas)/Cas (associado a CRISPR). Estes métodos de edição de genoma podem ser usados para alterar a sequência de codificação de proteína de toxina transformada dentro de uma célula vegetal para uma sequência de codificação de toxina diferente. Especificamente, através destes métodos, um ou mais códons dentro da sequência de codificação de toxina são alterados para modificar uma sequência de aminoácidos de proteína inovadora. Alternativamente, um fragmento dentro da sequência de codificação é substituído ou excluído, ou fragmentos de DNA adicionais são inseridos na sequência de codificação, para modificar uma nova sequência de codificação de toxina. A nova sequência de codificação pode codificar uma proteína de toxina com novas propriedades, tais como atividade aumentada ou espectro contra pragas de insetos, bem como fornecer atividades contra espécies de praga de insetos em que a resistência se desenvolveu contra a proteína de toxina original. A célula vegetal que compreende a sequência de codificação de toxina editada pelo gene pode ser utili-zada por métodos conhecidos na técnica para gerar plantas inteiras que expressam a nova proteína de toxina.
[0057] Também é contemplado que fragmentos de TIC6757, TIC7472 e TIC7473 ou variantes de proteínas dos mesmos podem ser formas truncadas em que um ou mais aminoácidos são excluídos da extremidade N-terminal, extremidade C-terminal, meio da proteína ou combinações dos mesmos em que os fragmentos e as variantes retêm a atividade inibitória dos insetos. Estes fragmentos podem ser variantes naturais ou experimentais de TIC6757, TIC7472 e TIC7473 ou va- riantes de proteínas derivadas, mas devem reter a atividade inibitória de insetos de pelo menos TIC6757, TIC7472 ou TIC7473.
[0058] As proteínas que se assemelham às proteínas TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 e TIC7473PL podem ser identificadas e comparadas entre si utilizando vários algoritmos baseados em computador conhecidos na técnica (consultar Tabelas 1 e 2). As identidades de sequência de aminoácidos relatadas neste pedido são o resultado de um alinhamento Clustal W utilizando estes parâmetros padrão: Matriz de peso: blosum, Penalidade por abertura de lacuna: 10,0, Penalidade por extensão da lacuna: 0,05, Lacunas hidro- fílicas: Ligado, Resíduos hidrofílicos: GPSNDQERK, Penalidades por lacuna específica de resíduo: Ligado (Thompson, et al (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). A porcentagem de identidade de ami- noácidos é ainda calculada pelo produto de 100% multiplicado por (identidades de aminoácidos/comprimento da presente proteína). Outros algoritmos de alinhamento também estão disponíveis na técnica e fornecem resultados semelhantes para aqueles obtidos utilizando um alinhamento W Clustal e são contemplados aqui.
[0059] Prevê-se que uma proteína que exibe atividade inibidora de insetos contra a espécie de inseto de Lepidópteros esteja relacionada a TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL se a proteína for usada em uma consulta, por exemplo, em um alinhamento Clustal W e as proteínas da presente invenção conforme apresentado em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:12 ou SEQ ID NO:18 são identificadas como acertos em tal alinhamento em que a proteína de consulta exibe pelo menos 85% a cerca de 100% de identidade de aminoácido ao longo do comprimento da proteína de consulta que é cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% ou qualquer porcentagem de fração nesta faixa.
[0060] As proteínas exemplificadoras TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 e TIC7473PL foram alinhadas entre si utilizando um algoritmo Clustal W. Uma matriz em pares de porcentagem identidades de sequência de aminoácidos para cada uma das proteínas de comprimento total foi criada, como relatado na Tabela 1. Tabela 1. Exibição de matriz em pares de proteínas exemplificado- ras TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 e TIC7473PL.
Figure img0001
[0061] Descrição de Tabela: Alinhamento Clustal W entre (X) e (Y) é relatado em uma matriz em pares. A porcentagem de identidade de aminoácidos entre todos os pares é calculada e é representada pelo primeiro número em cada caixa. O segundo número (entre parênteses) em cada caixa representa o número de aminoácidos idênticos entre o par.
[0062] Além da porcentagem de identidade, TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473, TIC7473PL e proteínas relacionadas também podem ser relacionadas por estrutura primária (motivos conservados de aminoácidos), por comprimento (cerca de 797 aminoáci- dos) e por outras características. Características das toxinas de proteína TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 e TIC7473PL são relatadas na Tabela 2. Tabela 2. Características selecionadas das proteínas TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 e TIC7473PL.
Figure img0002
[0063] Conforme descrito adicionalmente nos Exemplos deste pe- dido, uma sequência de molécula de ácido nucleico sintético que codifica uma variante de TIC6757, TIC6757PL foi projetada para utilização em plantas. Uma sequência de molécula de ácido nucleico recombi- nante exemplificadora que foi projetada para utilização em plantas que codificam a proteína TIC6757PL é apresentada como SEQ ID NO:3. A proteína TIC6757PL tem um aminoácido alanina adicional imediatamente após a metionina de iniciação em relação à proteína TIC6757. Acredita-se que o resíduo de alanina adicional inserido na sequência de aminoácidos de TIC6757 melhore a expressão da proteína in planta. Do mesmo modo, as sequências de moléculas de ácido nucleico sintético que codificam variantes de TIC7472 e TIC7473 são aqui referidas como TIC7472PL e TIC7473PL, e foram projetadas para utilização em plantas. Exemplos de sequências de moléculas de ácido nu- cleico sintético que foram projetadas para uso em plantas que codificam TIC7472PL e TIC7473PL são apresentadas como SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 17, respectivamente. As proteínas TIC7472PL e TIC7473PL têm um aminoácido alanina adicional imediatamente após a metionina de iniciação em relação às proteínas TIC7472 e TIC7473.
[0064] Os cassetes de expressão e os vetores contendo uma mo lécula de sequência de ácido nucleico recombinante podem ser construídos e introduzidos em células de plantas de milho, soja ou algodão de acordo com métodos de transformação e técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a transformação mediada por Agrobacterium é descrita nas Publicações de Pedido de Patente US nos 2009/0138985A1 (soja), 2008/0280361A1 (soja), 2009/0142837A1 (milho), 2008/0282432 (algodão), 2008/0256667 (algodão), 2003/0110531 (trigo), 2001/0042257 A1 (beterraba), Patentes US nos 5.750.871 (canola), 7.026.528 (trigo) e 6.365.807 (arroz) e em Arencibia et al. (1998) Transgenic Res. 7:213-222 (cana-de-açúcar) todos as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. As células transformadas podem ser regeneradas em plantas transformadas que expressam as proteínas TIC6757PL, TIC7472 e TIC7473 e demonstram atividade pesticida através de bioensaios realizados na presença de larvas de pragas de lepidópteros utilizando discos de folhas de plantas obtidos das plantas transformadas. As plantas podem ser derivadas das célu- las vegetais por técnicas de transformação de semente, pólen ou de meristemas ou de regeneração. Os métodos para transformar plantas são conhecidos na técnica.
[0065] Como alternativa aos métodos de transformação tradicio nais, uma sequência de DNA, tal como um transgene, um cassete de expressão, etc., pode ser inserida ou integrada a um sítio ou locus específico dentro do genoma de uma planta ou célula vegetal através de integração sítio-dirigida. O construto (ou construtos) de DNA e a molécula (ou moléculas) recombinante da presente invenção podem, assim, incluir uma sequência de modelo de doador que compreende pelo menos um transgene, cassete de expressão ou outra sequência de DNA para inserção no genoma da planta ou célula vegetal. Este modelo de doador para integração sítio-dirigida pode incluir ainda um ou dois braços de homologia que acompanham uma sequência de inserção (isto é, a sequência, o transgene, o cassete, etc., a serem inseridos no genoma da planta). O construto (ou construtos) de DNA re- combinante da presente invenção podem compreender ainda um cassete (ou cassetes) de expressão que codifica uma nuclease sítio- específica e/ou qualquer proteína (ou proteínas) associada para realizar a integração sítio-dirigida. Este cassete (ou cassetes) de expressão de nuclease pode estar presente na mesma molécula ou vetor que o modelo de doador (em cis) ou em uma molécula ou vetor separado (em trans). Vários métodos para integração sítio-dirigida são conhecidos na técnica envolvendo diferentes proteínas (ou complexos de proteínas e/ou guia de RNA) que cortam o DNA genômico para produzir uma quebra de dupla cadeia (DSB) ou nick em um sítio ou locus ge- nômico desejado. Brevemente, conforme entendido na técnica, durante o processo de reparação do DSB ou nick introduzido pela enzima nuclease, o DNA de modelo do doador pode se tornar integrado ao genoma no sítio do DSB ou nick. A presença do braço (ou braços) de homologia no modelo de doador pode promover a adoção e o direcionamento da sequência de inserção no genoma de planta durante o processo de reparo através de recombinação homóloga, embora um evento de inserção possa ocorrer através de união de extremidade não homóloga (NHEJ). Exemplos de nucleases sítio-específicas que podem ser utilizadas incluem nucleases de dedo de zinco, meganucleases de modificação ou nativas, TALE-endonucleases e endonucleases guiadas por RNA (por exemplo, Cas9 ou Cpf1). Para os métodos que utilizam nucleases sítio-específicas guiadas por RNA (por exemplo, Cas9 ou Cpf1), o construto (ou construtos) de DNA recombi- nante também compreenderá uma sequência codificando um ou mais RNAs guia para direcionar a nuclease para o sítio desejado dentro do genoma de planta.
[0066] São contempladas composições de moléculas de ácido nu- cleico recombinantes que codificam TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 e TIC7473PL. Por exemplo, as proteínas TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 e TIC7473PL podem ser expressas com construtos de DNA recombinante nas quais uma molécula de polinucleotídeo com um ORF que codifica a proteína é operativamente ligada a elementos de expressão genética, tais como um promotor e qualquer outro elemento regulador necessário para expressão no sistema para o qual o construto se destina. Exemplos não limitantes incluem um promotor funcional de planta operativamente ligado a uma proteína TIC6757PL, TIC7472PL ou TIC7473PL que codifica a sequência para expressão da proteína em plantas ou um promotor funcional Bt operativamente ligado a uma proteína TIC6757, TIC7472 ou TIC7473 que codifica a sequência para expressão da proteína em uma bactéria Bt ou outras espécies de Bacillus. Outros elementos podem ser operativamente ligados à proteína TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL que codifi- ca a sequência incluindo, sem limitação, intensificadores, íntrons, líderes não traduzidos, etiquetas de imobilização de proteínas codificadas (etiqueta HIS), peptídeos de translocação (peptídeos de trânsito de plastídeo, peptídeos de sinalização), sequências polipeptídicas para enzimas modificadoras pós-tradução, sítios de ligação ribossômica e locais-alvo de RNAi. As moléculas de polinucleotídeo recombinantes exemplificadoras fornecidas aqui incluem, sem limitação, um promotor heterólogo operativamente ligado a um polinucleotídeo, tal como SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 17, que codifica os respectivos polipeptídeos ou proteínas que têm a sequência de aminoácidos conforme a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 4 ID NO: 16 e SEQ ID NO: 18. Um promotor heterólogo também pode ser operativamente ligado a sequências de codificação de DNA sintéticas que codificam uma TIC6757PL, TIC7472PL ou TIC7473PL plastídeo- direcionada; ou uma TIC6757PL, TIC7472PL ou TIC7473PL não direcionada. Os códons de uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica as proteínas aqui descritas podem ser substituídos por códons sinônimos (conhecidos na arte como uma substituição silenciosa).
[0067] Um construto de DNA recombinante que compreende as sequências de codificação de proteína TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL pode ainda compreender uma região de DNA que codifica um ou mais agentes inibidores de insetos que podem ser configurados para concomitantemente expressar ou coexpressar com uma sequência de DNA que codifica uma proteína TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL, uma proteína diferente de uma proteína TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL, uma molécula de dsR- NA inibidora de inseto ou uma proteína auxiliar. As proteínas auxiliares incluem, sem limitação, cofatores, enzimas, parceiros de ligação ou outros agentes que funcionam para auxiliar na eficácia de um agente inibidor de insetos, por exemplo, auxiliando sua expressão, influenciando sua estabilidade em plantas, otimizando a energia livre para a oligomerização, aumentando sua toxicidade e aumentando seu espectro de atividade. Uma proteína auxiliar pode facilitar a absorção de um ou mais insetos inibidores de insetos, por exemplo, ou potencializar os efeitos tóxicos do agente tóxico.
[0068] Um construto de DNA recombinante pode ser montado de modo que todas as proteínas ou moléculas de dsRNA sejam expressas de um promotor ou cada molécula de proteína ou dsRNA esteja sob controle de promotor separado ou alguma combinação destes. As proteínas desta invenção podem ser expressas a partir de um sistema de expressão multigene em que uma ou mais proteínas de TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL são expressas de um segmento de nucleotídeo comum que também contém outros quadros de leitura abertos e promotores, dependendo do tipo de sistema de expressão selecionado. Por exemplo, um sistema de expressão multigene bacteriano pode utilizar um único promotor para conduzir a expressão de quadros de leitura abertos multiplamente li- gados/em tandem de um único operon (ou seja, expressão policistrô- nica). Em outro exemplo, um sistema de expressão multigene de planta pode utilizar cassetes de expressão multiplamente não ligados ou ligados, cada cassete expressando uma proteína diferente ou outro agente, tal como moléculas de um ou mais dsRNA.
[0069] Os polinucleotídeos recombinantes ou os construtos de DNA recombinante compreendendo sequência de codificação de proteína TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL podem ser entregues às células hospedeiras por vetores, por exemplo, um plasmídeo, baculovírus, cromossoma sintético, vírion, cosmídeo, fagomídeo, fago ou vetor viral. Tais vetores podem ser usados para alcançar uma expressão estável ou transitória de uma sequência de codificação de proteína TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL em uma célula hospedeira ou expressão subsequente do polipeptídeo codificado. Um polinucleotídeo recombinante exógeno ou construto de DNA recombinante que compreende uma sequência de codificação de proteína TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL e que é introduzida na célula hospedeira é referida neste pedido como um "transgene".
[0070] As bactérias transgênicas, células de plantas transgênicas, plantas transgênicas e partes de plantas transgênicas que contêm um polinucleotídeo recombinante que expressa qualquer uma das TIC6757 ou uma sequência de codificação de proteína de toxina familiar relacionada são aqui fornecidas. O termo "célula bacteriana" ou "bactéria" pode incluir, sem limitação, uma célula de Agrobacterium, de Bacillus, de Escherichia, de Salmonella, de Pseudomonas, de Brevi- bacillus, de Klebsiella, de Erwinia ou de Rhizobium. O termo "célula vegetal" ou "planta" pode incluir, sem limitação, uma planta dicotiledô- nea ou monocotiledônea. O termo "célula vegetal" ou "planta" também pode incluir, sem limitação, uma célula vegetal ou planta de alfafa, banana, cevada, feijão, brócolis, repolho, brassica, cenoura, mandioca, castanha, couve-flor, aipo, grão-de-bico, repolho chinês, cítricos, coco, café, milho, trevo, algodão, cucurbitáceo, pepino, abeto de Douglas, berinjela, Eucalipto, linho, alho, uva, lúpulo, alho-poró, alface, pinheiro, painço, melões, nozes, aveia, azeitona, cebola, ornamental, palmeira, pastagem, ervilha, amendoim, pimenta, ervilha-da-Angola, pinho, batata, álamo, abóbora, pinheiro radiata, rabanete, colza, arroz, porta- enxertos, centeio, cártamo, arbusto, sorgo, pinho do sul, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, milho do- ce, goma doce, batata doce, pirais, chá, tabaco, tomate, triticale, relva, melancia e trigo. Em certas modalidades, são fornecidas plantas transgênicas e partes de plantas transgênicas regeneradas de uma célula vegetal transgênica. Em certas modalidades, as plantas trans- gênicas podem ser obtidas de uma semente transgênica, cortando, rompendo, triturando ou desassociando de outro modo a parte da planta. Em certas modalidades, a parte de planta pode ser uma semente, um folículo, uma folha, uma flor, um caule, uma raiz ou qualquer porção da mesma, ou uma porção não regenerável de uma parte de planta transgênica. Como usado neste contexto, uma porção "não regenerável" de uma parte de planta transgênica é uma porção que não pode ser induzida a formar uma planta inteira ou que não pode ser induzida a formar uma planta inteira que é capaz de reprodução se- xuada e/ou assexuada. Em certas modalidades, uma porção não re- generável de uma parte de planta é uma porção de uma semente, folí- culo, folha, flor, caule ou raiz transgênica.
[0071] São fornecidos métodos de produção de plantas transgêni- cas que compreendem quantidades inibidoras de insetos Lepidópteros de uma proteína TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL. Tais plantas podem ser feitas pela introdução de um polinucleotídeo recombinante que codifica qualquer uma das proteínas fornecidas neste pedido em uma célula vegetal, e selecionando uma planta derivada da referida célula vegetal que expressa uma quantidade inibidora de insetos Lepidópteros das proteínas. As plantas podem ser derivadas das células vegetais por técnicas de transformação de semente, pólen ou de meristemas ou de regeneração. Os métodos para transformar plantas são conhecidos na técnica.
[0072] Produtos de planta processados, em que o produto proces sado compreende uma quantidade detectável de uma proteína TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL, um segmento inibidor de inseto ou fragmento do mesmo, ou qualquer porção distintiva, também são descritos. Em certas modalidades, o produto processado é selecionado do grupo consistindo em partes de plantas, biomassa vegetal, óleo, farelo, açúcar, ração animal, farinha, flocos, sêmea, peles, cascas, sementes processadas e sementes. Em certas modalidades, o produto processado é não regenerável. O produto de planta pode compreender produtos básicos ou outros produtos do comércio derivados de uma planta transgênica ou parte de planta transgênica, onde um produto básico ou outros produtos podem ser rastreados através do comércio detectando segmentos de nucleotí- deos ou RNA ou proteínas expressas que codificam ou compreendem porções distintivas de uma proteína TIC6757 TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL.
[0073] As plantas que expressam as proteínas TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL podem ser cruzadas por reprodução com eventos transgênicos que expressam outras proteínas de toxina e/ou expressando outros traços transgêni- cos, tais como genes de tolerância a herbicidas, genes que conferem rendimento ou traços de tolerância ao estresse e similares, ou estes traços podem ser combinados em um único vetor para que os traços sejam todos ligados.
[0074] Conforme descrito adicionalmente nos Exemplos, as se quências de codificação de TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL e sequências com uma porcentagem substancial de identidade com TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL podem ser identificadas utilizando métodos conhecidos pelos versados na técnica, tais como reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificação térmica e hibridização. Por exemplo, as proteínas TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL podem ser usadas para produzir anticorpos que se ligam especificamente a proteínas relacionadas e podem ser usados para varrer e encontrar outros membros de proteínas que estão intimamente relacionados.
[0075] Além disto, as sequências de nucleotídeos que codificam as proteínas de toxina TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 e TIC7473PL podem ser utilizadas como sondas e iniciadores para varredura para identificar outros membros da classe utilizando métodos de hibridização e amplificação isotérmica ou de ciclo térmico. Por exemplo, podem ser utilizados oligonucleotídeos derivados de sequência conforme apresentado na SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:15 ou SEQ ID NO:17 para determinar a presença ou ausência de um transgene TIC6757PL, TIC7472PL ou TIC7473PL em uma de amostra de ácido desoxirribonucleico derivada de um produto básico. Dada a sensibilidade de certos métodos de detecção de ácido nucleico que em-pregam oligonucleotídeos, é previsto que os oligonucleotídeos derivados de sequências conforme apresentado na SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:15 e SEQ ID NO:17 podem ser usados para detectar um transgene de TIC6757PL, TIC7472PL e TIC7473PL em produtos de produtos básicos derivados de fontes agrupadas onde apenas uma fração do produto básico é derivada de uma planta transgênica contendo qualquer dos transgenes. É ainda reconhecido que tais oligonucleotídeos podem ser utilizados para introduzir a variação de sequência de nucle- otídeos em cada uma de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:15 e SEQ ID NO:17. Tais oligonucleotídeos de "mutagênese" são úteis para a identificação de variantes de sequência de aminoácidos TIC6757PL, TIC7472PL e TIC7473PL exibindo uma faixa de atividade inibitória de insetos ou expressão variada em células hospedeiras de plantas transgênicas.
[0076] Os homólogos da sequência de nucleotídeos, por exemplo, proteínas inseticidas codificadas por sequências de nucleótidos que se hibridizam a cada uma ou qualquer uma das sequências descritas neste pedido sob condições de hibridização rigorosas são também uma modalidade da presente invenção. A invenção também fornece um método para detectar uma primeira sequência de nucleotídeos que hibridiza a uma segunda sequência de nucleotídeos, em que a primeira sequência de nucleotídeos (ou sua sequência complementar reversa) codifica uma proteína pesticida ou fragmento pesticida da mesma e hibridiza à segunda sequência de nucleotídeos. Neste caso, a segunda sequência de nucleotídeos pode ser qualquer uma das sequências de nucleotídeos apresentadas como SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:15 ou SEQ ID NO:17 sob condições de hibridização rigorosas. As sequências de codificação de nucleotídeos hibridizam entre si sob condições de hibridização apropriadas, tais como as condições de hibridização rigorosas, e as proteínas codificadas por estas sequências de nucleotídeos reagem de forma cruzada com o antissoro levantado contra qualquer uma das outras proteínas. Condições rigorosas de hibridização, conforme definido aqui, compreendem pelo menos a hibridização a 42°C seguido por duas lavagens por cinco minutos cada à temperatura ambiente com 2X SSC, 0,1% de SDS, seguido por duas lavagens por trinta minutos cada uma a 65°C em 0,5X SSC, 0,1% de SDS. Lavagens a temperaturas ainda mais elevadas constituem condições ainda mais rigorosas, por exemplo, condições de hibridização de 68°C, seguido por lavagem a 68°C, em 2xSSC contendo 0,1% SDS.
[0077] Um versado na técnica reconhecerá que, devido à redun dância do código genético, muitas outras sequências são capazes de codificar tais proteínas relacionadas, e estas sequências, na medida em que funcionam para expressar proteínas pesticidas em cepas de Bacillus ou em células vegetais, são modalidades da presente invenção, reconhecendo, evidentemente, que muitas destas sequências de codificação redundantes não hibridizam sob condições às sequências nativas de Bacillus ou Paenibacillus que codificam TIC6757, TIC7472 e TIC7473. Este pedido contempla o uso destes e outros métodos de identificação conhecidos pelos versados na técnica, para identificar as sequências que codificam proteínas TIC6757, TIC7472 e TIC7473 e sequências tendo uma porcentagem substancial de identidade com sequências de codificação de proteína TIC6757, TIC7472 e TIC7473.
[0078] A presente invenção também contempla a utilização de mé todos moleculares conhecidos na técnica para modificar e clonar proteínas comercialmente úteis compreendendo quimeras de proteínas de proteínas pesticidas; por exemplo, as quimeras podem ser montadas de segmentos das proteínas TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL para derivar modalidades úteis adicionais incluindo montagem de segmentos de proteínas TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL com segmentos de diversas proteínas diferentes de TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL e proteínas relacionadas. As proteínas TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL podem ser submetidas a alinhamento entre si e a outras proteínas de Bacillus, Paenibacillus ou outras proteínas pesticidas (independentemente de estas estarem estreita ou distalmente relacionadas filogeneticamente) e segmentos de cada uma destas proteínas podem ser identificados que são úteis para a substituição entre as proteínas alinhadas, resultando na construção de proteínas quiméricas. Tais proteínas quiméricas podem ser submetidas à análise de bioensaio de pragas e caracterizadas pela presença ou ausência de bioatividade aumentada ou espectro de praga-alvo expandido em comparação com as proteínas parentais das quais cada um destes segmentos nas quimeras foi derivado. A atividade pesticida dos poli- peptídeos pode ser adicionalmente desenvolvida para a atividade de uma praga particular ou para um espectro mais amplo de pragas trocando domínios ou segmentos com outras proteínas ou utilizando métodos de evolução dirigida conhecidos na técnica.
[0079] Os métodos de controle de insetos, em particular, as infes tações de Lepidópteros de plantas de cultivo, com as proteínas TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL também são descritos neste pedido. Tais métodos podem compreender cultivar uma planta compreendendo uma quantidade inibidora de inseto ou Lepidópteros de uma proteína de toxina TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL. Em certas modalidades, tais métodos podem compreender ainda qualquer um ou mais de: (i) aplicar qualquer composição compreendendo ou codificando uma proteína de toxina TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL a uma planta ou uma semente que dê origem a uma planta; e (ii) transformar uma planta ou uma célula vegetal que dê origem a uma planta com um polinucleotídeo que codifica uma proteína de toxina TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL. Em geral, é contemplado que uma proteína de toxina TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL pode ser fornecida em uma composição, fornecida em um micro-organismo ou fornecida em uma planta transgêni- ca para conferir atividade inibitória de insetos contra insetos Lepidópte- ros.
[0080] Em certas modalidades, uma molécula de ácido nucleico recombinante das proteínas de toxina TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL é o ingrediente ativo como inseticida de uma composição inibidora de inseto preparada cultivando Bacillus recombinante ou qualquer outra célula bacteriana recombinante transformada para expressar uma proteína de toxina TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL sob condi- ções adequadas para expressar a proteína de toxina TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL. Tal composição pode ser preparada por dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de tais células recombinantes que expres- sam/produzem o referido polipeptídeo recombinante. Tal processo pode resultar em um extrato celular bacteriano de Bacillus ou outro extrato celular bacteriano entomopatogênico, suspensão celular, homogeneizado celular, lisado celular, sobrenadante celular, filtrado celular ou sedimento celular. Obtendo os polipeptídeos recombinantes assim produzidos, uma composição que inclui os polipeptídeos recombinan- tes podem incluir células bacterianas, esporos bacterianos e corpos de inclusão parasporais e pode ser formulada para várias utilizações, incluindo como produtos de aspersão inibitória de insetos agrícolas ou como formulações inibidoras de insetos em bioensaios dietéticos.
[0081] Em uma modalidade, para reduzir a probabilidade de de senvolvimento de resistência, uma composição inibidora de inseto compreendendo TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL pode compreender ainda pelo menos um polipeptídeo adicional que exibe atividade inibidora de inseto contra as mesmas espécies de insetos lepidópteros, mas que é diferente da proteína de toxina TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL. Possíveis polipeptídeos adicionais para tal composição incluem uma proteína inibidora de insetos e uma molécula de dsRNA inibidora de inseto. Um exemplo para a utilização de tais sequências de ribonucleotídeo para controlar pragas de insetos é descrito em Baum, et al. (Publicação de Patente US no 2006/0021087 A1). Tal po- lipeptídeo adicional para o controle de pragas de Lepidópteros pode ser selecionado do grupo consistindo em uma proteína inibidora de inseto, tal como, sem limitação, Cry1A (Patente US no 5.880.275), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B (Publicação de Patente n° US 10/525.318), Cry1C (Patente US no 6.033.874), CrylD, CrylDa e variantes dos mesmos, Cry1E, Cry1F, e Quimeras de Cry1A/F (Patentes US nos 7.070.982; 6.962.705; e 6.713.063), Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, quimeras do tipo Cry1, tais como, sem limitação, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869 e TIC1100 (Publicação de Pedido Internacional no WO2016/061391 (A2)), TIC2160 (Publicação de Pedido Internacional no WO2016/061392(A2)), Cry2A, Cry2Ab (Patente US no 7.064.249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, Vip3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 e AXMI- 045 (Publicação de Patente US no 2013-0117884 A1), AXMI-52, AXMI- 58, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100 (Publicação de Patente US no 2013-0310543 A1), AXMI-115, AXMI- 113, AXMI-005 (Publicação de Patente US no 2013-0104259 A1), AX- MI-134 (Publicação de Patente US no 2013-0167264 A1), AXMI-150 (Publicação de Patente US no 2010-0160231 A1), AXMI-184 (Publicação de Patente US no 2010-0004176 A1), AXMI-196, AXMI-204, AXMI- 207, AXMI-209 (Publicação de Patente US no 2011-0030096 A1), AX- MI-218, AXMI-220 (Publicação de Patente US no 2014-0245491 A1), AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z (Publicação de Patente US no 2014-0196175 A1), AXMI-238 (Publicação de Patente US no 2014-0033363 A1), AXMI-270 (Publicação de Patente US no 2014-0223598 A1), AXMI-345 (Publicação de Patente US no 2014-0373195 A1), AXMI-335 (Publicação de Pedido Internacional no WO2013/134523(A2)), DIG-3 (Publicação de Patente US no 20130219570 A1), DIG-5 (Publicação de Patente US no 2010-0317569 A1), DIG-11 (Publicação de Patente US no 2010-0319093 A1), AfIP-1A e derivados dos mesmos (Publicação de Patente US no 2014-0033361 A1), AfIP-1B e derivados dos mesmos (Publicação de Patente US no 2014-0033361 A1), PIP-1APIP-1B (Publicação de Patente US no 20140007292 A1), PSEEN3174 (Publicação de Patente US no 2014 0007292 A1), AECFG-592740 (Publicação de Patente US no 20140007292 A1), Pput_1063 (Publicação de Patente US no 2014-0007292 A1), DIG-657 (Publicação de Pedido Internacional no WO2015/195594 A2), Pput_1064 (Publicação de Patente US no 2014-0007292 A1), GS- 135 e derivados dos mesmos (Publicação de Patente US no 20120233726 A1), GS153 e derivados dos mesmos (Publicação de Patente US no 2012-0192310 A1), GS154 e derivados dos mesmos (Publicação de Patente US no 2012-0192310 A1), GS155 e derivados dos mesmos (Publicação de Patente US no 2012-0192310 A1), SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente US no 2012-0167259 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente US no 2012-0047606 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente US no 2011-0154536 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente US no 2011-0112013 A1, SEQ ID NO:2 e 4 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente US no 2010-0192256 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente US no 2010-0077507 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente US no 2010-0077508 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente US no 2009-0313721 A1, SEQ ID NO:2 ou 4 e derivados dos mesmos conforme descrito na Publicação de Patente US no 2010-0269221 A1, SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito na Patente US no 7.772.465 (B2), CF161_0085 e derivados dos mesmos conforme descrito no documento no WO2014/008054 A2, proteínas tóxicas de Lepidópteros e seus derivados conforme descrito nas Publicações de Patente US nos US2008-0172762 A1, US2011- 0055968 A1 e US2012-0117690 A1; SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito no documento no US7510878(B2), SEQ ID NO:2 e derivados dos mesmos conforme descrito na Patente US no 7812129(B1); e similares.
[0082] Em outras modalidades, esta composição/formulação pode ainda compreender pelo menos um polipeptídeo adicional que exibe atividade inibidora de insetos para um inseto que não é inibido por uma proteína inibitória de outros insetos da presente invenção para expandir o espectro de inibição de insetos obtido. Por exemplo, para o controle de pragas de Hemiptéros, combinações de proteínas inibido- ras de insetos da presente invenção podem ser utilizadas com proteínas ativas para Hemípteros, tais como TIC1415 (Publicação de Patente US no 2013-0097735 A1), TIC807 (Patente US no 8.609.936), TIC834 (Publicação de Patente US no 2013-0269060 A1), AXMI-036 (Publicação de Patente US no 2010-0137216 A1) e AXMI-171 (Publicação de Patente US no 2013-0055469 A1). Adicionalmente, um poli- peptídeo para o controle de pragas de Coleópteros pode ser selecio-nado do grupo consistindo em uma proteína inibidora de inseto, tal como, sem limitação, Cry3Bb (Patente US no 6,501,009), variantes de Cry1C, variantes de Cry3A, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, AXMI134 (Publicação de Patente US no 2013-0167264 A1) AXMI-184 (Publicação de Patente US no 2010-0004176 A1), AXMI-205 (Publicação de Patente US no 2014-0298538 A1), AXMI-207 (Publicação de Patente US no 2013-0303440 A1), AXMI-218, AXMI-220 (Publicação de Patente US no 20140245491A1), AXMI-221z, AXMI-223z (Publicação de Patente US no 2014-0196175 A1), AXMI-279 (Publicação de Patente US no 2014-0223599 A1), AXMI-R1 e variantes dos mesmos (Publicação de Patente US no 2010-0197592 A1), TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10 (Publicação de Patente US no 2010-0319092 A1), eHIPs (Publicação de Pedido de Patente US no 2010/0017914), IP3 e variantes dos mesmos (Publicação de Patente US no 2012-0210462 A1) e Hexatoxin-Hv1a (Publicação de Pedido de Patente US no US2014-0366227 A1).
[0083] Polipeptídeos adicionais para o controle de pragas de inse tos de Coleópteros, Lepidópteros e Hemípteros podem ser encontrados no site de nomenclatura de toxinas de Bacillus thuringiensis mantido por Neil Crickmore (na rede mundial de computadores em btno- menclature.info).
[0084] A possibilidade de insetos desenvolverem resistência a cer tos inseticidas foi documentada na técnica. Uma estratégia de gerenciamento de resistência a insetos é empregar culturas transgênicas que expressam dois inibidores de insetos distintos que operam através de diferentes modos de ação. Portanto, qualquer inseto com resistência a qualquer um dos agentes inibidores de insetos pode ser controlado pelo outro agente inibidor de insetos. Outra estratégia de gerenciamento de resistência a insetos emprega a utilização de plantas que não estão protegidas contra as espécies específicas de praga de Lepi- dópteros para fornecer um refúgio para tais plantas desprotegidas. Um exemplo particular está descrito na Patente US no 6.551.962, que está incorporada por referência na sua totalidade.
[0085] Outras modalidades, tais como os químicos pesticidas apli cados topicamente que são projetados para controlar pragas que também são controladas pelas proteínas aqui descritas a serem usadas com proteínas em tratamentos de sementes, formulações de aspersão, gotejamento ou limpeza podem ser aplicadas diretamente ao solo (um encharcamento de solo), aplicadas a plantas crescentes que expressam as proteínas descritas no documento presente, ou formuladas para serem aplicadas a semente contendo um ou mais transgenes que codificam um ou mais das proteínas descritas. Tais formulações para utilização em tratamentos de sementes podem ser aplicadas com vá- rios agentes de pegajosidade e de adesividade conhecidos na técnica. Tais formulações podem conter pesticidas que são sinérgicos no modo de ação com as proteínas descritas, de modo que pesticidas de formulação atuem através de um modo de ação diferente para controlar as mesmas pragas ou similares que podem ser controladas pelas proteínas descritas ou que tais pesticidas atuem para controlar as pragas dentro de uma faixa mais ampla de hospedeiros ou espécies de praga de planta que não sejam efetivamente controladas pelas proteínas pesticidas TIC6757, TIC6757PL, TIC7472, TIC7472PL, TIC7473 ou TIC7473PL .
[0086] A composição/formulação mencionada acima pode ainda compreender um carreador agricolamente aceitável, tal como uma isca, um pó, poeira, pélete, grânulo, aspersão, emulsão, uma suspensão coloidal, uma solução aquosa, uma preparação de esporos/cristais de Bacillus, um tratamento de sementes, uma planta/semente/tecido ve- getal/célula vegetal transformada para expressar uma ou mais das proteínas, ou bactéria transformada para expressar uma ou mais das proteínas. Dependendo do nível de inibição de insetos ou inibição inseticida inerente ao polipeptídeo recombinante e do nível de formulação a ser aplicada a uma planta ou ensaio de dieta, a composi- ção/formulação pode incluir várias quantidades em peso do polipeptí- deo recombinante, por exemplo, de 0,0001% a 0,001% a 0,01% a 1% a 99% em peso do polipeptídeo recombinante.
[0087] Em vista do exposto acima, os versados na técnica devem apreciar que mudanças podem ser feitas nos aspectos específicos que são descritos e ainda obter um resultado igual ou similar sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Assim, os detalhes estruturais e funcionais específicos aqui descritos não devem ser interpretados como limitantes. Deve entender-se que toda a descrição de cada referência aqui citada é incorporada à descrição deste pedido. EXEMPLOS Exemplo 1 Descoberta, clonagem e expressão de TIC6757
[0088] Sequências que codificam três proteínas pesticidas de Pa- enibacillus popilliae inovadoras foram identificadas, clonadas, confirmadas por sequência e testadas em bioensaio de inseto. As proteínas pesticidas, TIC6757, TIC7472 e TIC7473, isoladas das cepas DSC004343, DSC007648 e DSC008493 de Paenibacillus popilliae, respectivamente, representam proteínas do tipo Vip3C inovadoras. As sequências distantemente relacionadas a TIC6757, TIC7472 e TIC7473 são Vip3Ca2 (83,7% de identidade, a relação conhecida mais próxima), Vip3Aa1 (66,75% de identidade) e uma proteína do tipo Vip3B (60,93% de identidade). A qualidade distintiva e única de TIC6757, TIC7472 e TIC7473 indica que estas proteínas pesticidas provavelmente terão um novo modo de ação (MOA).
[0089] Os iniciadores de reação em cadeia da polimerase (PCR) foram projetados para amplificar uma cópia de comprimento completo da região de codificação para TIC6757, TIC7472 e TIC7473 do DNA genômico total isolado das cepas DSC004343, DSC007648 e DSC008493, respectivamente, de Paanibacillus popilliae. Os amplicons de PCR também incluíram códons de iniciação e terminação de tradução de cada sequência de codificação.
[0090] Cada um dos amplicons foi clonado utilizando métodos co nhecidos na técnica em dois vetores de expressão de Bt diferentes em ligação operável com um promotor expressável de Bt. Um vetor de expressão de Bt compreendia um promotor que está ligado durante a esporulação do bacillus. O outro vetor de expressão compreendia um promotor de não esporulação. Além disto, cada um dos amplicons foi clonado em um vetor usado para expressão de proteína em Escherichia coli (E. coli). Para o isolamento das proteínas expressas em E. coli, uma etiqueta de Histidina foi operativamente ligada às sequências de codificação expressas para facilitar a purificação de coluna da proteína. As sequências de codificação e suas respectivas sequências de proteína utilizadas para expressão bacteriana são apresentadas na Tabela 3 abaixo. Tabela 3. Sequências de codificação de toxina e sequências de proteína correspondentes usadas para expressão em Bt e E. coli.
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Exemplo 2 TIC6757, TIC7472 e TIC7473 demonstram atividade de Lepidópte- ros em bioensaio de inseto
[0091] As proteínas pesticidas TIC6757, TIC7472 e TIC7473 foram expressas em Bt e E. coli e analisadas para toxicidade para várias espécies de Lepidópteros, Coleópteros e Hemípteros. Preparações de cada toxina de Bt foram analisadas contra as espécies de Lepidópte- ros lagarta-do-cartucho da beterraba (BAW, Spodoptera exigua), lagar- ta-rosca (BCW, Agrotis ipsilon), lagarta-da-espiga-do-milho (CEW, He- licoverpa zea), curuquerê (CLW, Alabama argillacea), traça-das- crucíferas (DBM, Plutella xylostella), traça europeia do milho (ECB, Ostrinia nubilalis), lagarta-militar (FAW, Spodoptera frugiperda), lagarta-militar resistente a Cry1Fa1 (FAWR1, Spodoptera frugiperda), lagar- ta-do-tomate (AWB, Helicoverpa armigera), lagarta-rosada do algodão (PBW, Pectinophora gossypiella), lagarta-das-vagens (SAW, Spodop- tera eridania), lagarta-falsa-medideira (SBL, Chrysodeixis includens), larva da mariposa manchada (SBW, Earias vittella), broca grande da cana-de-açúcar (SWCB, Diatraea grandiosella), lagarta-das-maçãs (TBW, Heliothis virescens), curuquerê oriental (TCW, Spodoptera litu- ra, também conhecida como lagarta desfolhadora), e lagarta-da-soja (VBW, Anticarsia gemmatalis); as espécies de coleópteros escarave- lho-da-batata (CPB, Leptinotarsa decemlineata), lagarta-da-raiz do milho (WCB, Diabrotica virgifera virgifera); e as espécie de hemiptéros percevejo Lygus (TPB, Lygus lineolaris), percevejo sugador das folhas (WTP, Lygus hesperus), percevejo marrom da soja (NBSB, Euschistus heros) e Maria fedida (GSB, Nezara viridula).
[0092] A bioatividade das proteínas pesticidas TIC6757, TIC7472 e TIC7473 foi avaliada produzindo a proteína em um hospedeiro de expressão de E. coli ou Bt. NO caso de hospedeiro de Bt, um cepa de Bt expressando TIC6757, TIC7472 ou TIC7473 foi cultivada por vinte e quatro (24) horas e, então, a cultura foi adicionada à dieta de inseto. A mortalidade e o crescimento retardado foram avaliados comparando o crescimento e o desenvolvimento de insetos em uma dieta com uma cultura da cepa de Bt que expressa TIC6757, TIC7472 ou TIC7473 a insetos em uma dieta com cultura de controle não tratada. As cepas de E. coli que expressam TIC6757, TIC7472 ou TIC7473 foram tratadas de forma semelhante e também foram fornecidas em uma dieta de insetos. A atividade de bioensaio observada para cada proteína da pre-paração de Bt ou E. coli ou ambas as preparações é apresentada nas Tabelas 4 e 5 abaixo, em que "+" indica atividade e "NT" indica que a toxina não foi ensaiada contra esta praga de insetos específica. Tabela 4. Atividade de bioensaio de TIC6757, TIC7472 e TIC7473 contra pragas de insetos.
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Tabela 5. Atividade de bioensaio de TIC6757, TIC7472 e TIC7473 contra pragas de insetos.
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[0093] Como pode ser visto nas Tabelas 4 e 5 acima, a toxina de inseto TIC6757 demonstrou atividade contra muitas pragas de insetos Lepidópteros (BAW, BCW, CEW, CLW, DBM, ECB, FAW, FAWR1, AWB, SAW, SBL, SBW, SWCB, TBW, TCW e VBC). A atividade foi observada para a maioria das pragas analisadas contra TIC7472 e TIC7473 (CEW, FAW, SAW, SBL, SWCB). Exemplo 3 Ensaio de atividade de TIC6757PL contra pragas de Lepidópteros em plantas de milho ESTAVELMENTE TRANSFORMADAS
[0094] Os vetores de transformação de planta binários que com preendem cassetes de transgene projetados para expressar a proteína pesticida TIC6757PL direcionada e não direcionada para o plastídeo foram clonados utilizando métodos conhecidos na técnica. Os vetores resultantes foram utilizados para transformar de forma estável plantas de milho. Os tecidos foram colhidos dos transformantes e utilizados em bioensaio de insetos contra várias pragas de insetos lepidópteros.
[0095] As sequências de codificação sintéticas foram construídas para utilização na expressão da proteína codificada em plantas, clona- das em um vetor de transformação de planta binário e usadas para transformar células de plantas de milho. As sequências sintéticas foram sintetizadas, de acordo com métodos geralmente descritos na Patente U.S. no 5.500.365, para evitar certas sequências problemáticas inimigas, tais como sequências de poliadenilação de plantas ricas em ATTTA e A/T, preservando a sequência de aminoácidos da proteína de Paenibacillus nativa. As sequências de codificação sintéticas codificaram uma proteína TIC6757PL que compreende um resíduo de ala- nina adicional imediatamente após a metionina de iniciação em relação à proteína TIC6757. Para proteínas direcionadas a plastídeos, a sequência codificadora de proteína pesticida TIC6757PL sintética estava operativamente ligada em quadro com uma sequência de codificação de peptídeo de sinalização de direcionamento de cloroplasto. Os vetores de transformação de plantas resultantes compreendem um primeiro cassete de transgene para expressão da proteína pesticida TIC6757PL que compreendeu um promotor constitutivo, ligado operacionalmente em 5’ a um líder, ligado operacionalmente em 5’ a um ín- tron, ligado operacionalmente em 5’ a uma sequência de codificação sintética que codifica uma proteína TIC6757PL direcionada ou não direcionada a plastídeo, que foi, por sua vez, ligada operacionalmente em 5’ a uma UTR 3'; e um segundo cassete de transgene para a seleção de células de plantas transformadas utilizando seleção de glifosa- to. A sequência de codificação sintética para a proteína pesticida TIC6757PL é apresentada como SEQ ID NO: 3 e codifica a proteína apresentada como SEQ ID NO:4.
[0096] As plantas de milho foram transformadas com quatro dife rentes vetores de transformação binária como descrito acima utilizando um método de transformação mediada por Agrobacterium. Os Construtos 1 e 3 de vetor de transformação de planta binária compre- endiam uma sequência de codificação que codificava uma proteína CET6757PL direcionada a plastídeo, enquanto os Construtos 2 e 4 compreendiam uma sequência de codificação que codificava uma proteína TIC6757PL não direcionada. As células transformadas foram induzidas a formar plantas por métodos conhecidos na técnica. Os bio- ensaios utilizando discos de folhas da planta foram realizados de forma análoga àquela descrita na Patente US no 8.344.207. Uma única larva recém-nascida de neonatos com menos de um dia de idade foi colocada em cada amostra de disco de folhas e permitida alimentar-se durante aproximadamente quatro dias. Uma planta de milho não transformada foi usada para obter tecido a ser usado como controle negativo. Múltiplos eventos de inserção de cópia única de R0 de transformação de cada vetor binário foram analisados contra lagarta-rosca (BCW, Agrotis ipsilon), lagarta-da-espiga-do-milho (CEW, Helicoverpa zea), lagarta-militar (FAW, Spodoptera frugiperda) e broca grande da cana- de-açúcar (SWCB, Diatraea grandiosella).
[0097] Plantas R0 transformadas expressando TIC6757PL eram altamente eficazes (definido como tendo menos que ou igual a dezessete e meio por cento de dano de folha com cem por cento de mortalidade) contra todas as quatro pragas de insetos analisadas como mostrado na Tabela 6. A alta penetração (indicada por "(H)") é definida como superior a cinquenta por cento dos eventos analisados para cada construto tendo menos que ou igual a dezessete e meio por cento de dano de folha com uma mortalidade de cem por cento. A baixa penetração (indicada por "(L)") é definida como menor ou igual a cinquenta por cento dos eventos analisados para cada construto com menos que ou igual a dezessete e meio por cento de dano de folha com cem por cento de mortalidade. Tabela 6. Número de Eventos Expressando TIC6757 com < 17,5% de Dano de Folha com Cem Por Cento de Mortalidade e Penetração.
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[0098] Os eventos de R0 selecionados derivados de Construto 1 (direcionado a plastídeo) e Construto 2 (não direcionado a plastídeo) de R0 foram permitidos a autopolinizar, produzindo progênie de F1. Diversas plantas de progênie de F1 heterozigotas de cada evento de R0 foram selecionadas para bioensaio de disco de folha e analisadas contra lagarta-rosca (BCW, Agrotis ipsilon), lagarta-da-espiga-do-milho (CEW, Helicoverpa zea), lagarta-militar (FAW, Spodoptera frugiperda) e broca grande da cana-de-açúcar (SWCB, Diatraea grandiosella). A Tabela 7 abaixo mostra a porcentagem média de danos de folha e mortalidade média para cada planta derivada de cada constru- to/evento. As plantas de progênie de F1 são referidas em relação ao evento de R0. Por exemplo, "Evento-1_1" é a primeira planta de pro- gênie de F1 heterozigota derivada de Evento-1 e "Evento-1_2" é a primeira planta de progênie de F1 heterozigota derivada de Evento-1. "N" representa o número de amostras de cada planta utilizada na ensaio. Como pode ser visto nas Tabelas 7 e 8, a maioria das plantas derivadas de cada evento de R0 demonstrou não mais que cinco por cento de dano de folha e cem por cento de mortalidade contra BCW, CEW e FAW. Em relação a SWCB, múltiplas plantas derivadas de cada even- to de R0 demonstraram menos do que dez por cento de dano de folha e mais do que cinquenta por cento de mortalidade no ensaio. Tabela 7. Percentual Médio de Dano de Folha e Mortalidade em Progênie de F1 Derivada de Eventos de R0 Selecionados que Ex-pressam TIC6757PL.
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Tabela 8. Percentual Médio de Dano de Folha e Mortalidade em Progênie de F1 Derivada de Eventos de R0 Selecionados que Expressam TIC6757PL.
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[0099] Eventos de R0 selecionados derivados do Construto 3 (di- recionado a plastídeo) e do Construto 4 (não direcionado) foram permitidos a autopolinizar para produzir progênie de F1. Uma planta de pro- gênie de F1 heterozigota de cada evento de R0 foi selecionada para bioensaio de disco de folha e analisada contra lagarta-rosca (WBC, Striacosta albicosta). A Tabela 9 mostra o percentual médio de dano de folha e o percentual médio de mortalidade da planta de progênie de F1 de cada evento de R0 e do controle negativo. "N" representa o número de amostras de cada planta utilizada na ensaio. Tabela 9. Percentual Médio de Dano de Folha e Percentual Médio de Mortalidade em Progênie de F1 Derivada de eventos de R0 Selecionados Expressando TIC6757PL. Construto Evento N % Médio de Dano de Folha Mortalidade Média
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[00100] Como pode ser visto na Tabela 9 acima, todas as plantas de progênie de F1, exceto uma, de cada evento R0 testado contra WBC demonstraram não mais do que cinco por cento de dano e cem por cento de mortalidade.
[00101] Mudas derivadas de plantas de progênie de F1 heterozigo- tas transformadas com o Construto 3 (direcionado a plastídeo) e o Construto 4 (não direcionado) foram analisadas para resistência contra lagarta-rosca (BCW, Agrotis ipsilon). Sementes de progênie de F1, bem como semente não transformada (controle negativo), foram plantadas em vasos. Após oito dias, quando as mudas emergiam do solo, cada planta estava infestada com três BCW de terceiro estágio. Quatorze dias após a infestação, as plantas foram inspecionadas para contar o número de plantas que foram cortadas por BCW. Sessenta e oito plantas de progênie de F1 derivadas de dez diferentes eventos de R0 transformados com o Construto 3 e dez plantas de progênie de F1 de-rivadas de quatro eventos de R0 diferentes transformados com o Cons- truto 4 foram utilizadas no ensaio. Quinze plantas de controle negativo também foram utilizadas no ensaio. Após a inspeção das plantas, observou-se que oitenta por cento dos controles negativos foram reduzidos por BCW, enquanto que zero por cento das plantas da progênie de F1 transformadas com o Construto 3 e o Construto 4 demonstraram o corte.
[00102] O disposto acima demonstra que plantas de milho transformadas que expressam TIC6757PL fornecem resistência superior a pragas de insetos de Lepidóptero, em particular, lagarta-rosca (Agrotis ipsilon), lagarta-da-espiga-do-milho (Helicoverpa zea), lagarta-militar (Spodoptera frugiperda), broca grande da cana-de-açúcar (Diatraea grandiosella) e lagarta-rosca (Striacosta albicosta). Exemplo 4 Ensaio de atividade de TIC6757PL contra pragas de Lepidópteros em plantas de soja estavelmente transformadas
[00103] Os vetores de transformação de planta binários que compreendem cassetes de transgene projetados para expressar a proteína pesticida TIC6757PL direcionada e não direcionada para o plastídeo foram clonados utilizando métodos conhecidos na técnica. Os vetores resultantes foram utilizados para transformar de forma estável plantas de soja. Os tecidos foram colhidos dos transformantes e utilizados em bioensaio de insetos contra várias pragas de insetos lepidópteros.
[00104] A sequência de codificação sintética projetada para a expressão de planta como descrito no Exemplo 3 acima foi clonada em vetores de transformação de planta binários e utilizada para transformar células de plantas de soja. Os vetores binários compreendendo sequências de codificação de TIC6757PL direcionadas e não direcionadas a plastídeo foram construídos utilizando métodos conhecidos na técnica. Os vetores de transformação de plantas resultantes compreenderam um primeiro cassete de transgene para expressão da proteína pesticida TIC6757PL que compreendia um promotor constitutivo, ligado operacionalmente em 5 ‘ a um líder, ligado operacionalmente em 5’ a uma sequência de codificação sintética que codifica uma proteína TIC6757PL direcionada ou não direcionada a plastídeo, que es-tava, por sua vez, ligada operacionalmente em 5’ a uma 3‘ UTR e; um segundo cassete de transgene para a seleção de células de plantas transformadas utilizando seleção de espectinomicina. Os Construtos 1, 3 e 5 compreendiam uma sequência de codificação que codifica uma proteína pesticida TIC6757PL não direcionada. Os Construtos 2, 4 e 6 compreendiam uma sequência de codificação que codifica uma proteína TIC6757PL direcionada a plastídeo.
[00105] As células de soja transformadas foram incluídas para formar plantas por métodos conhecidos na técnica. Os bioensaios utilizando discos de folhas da planta foram realizados de forma análoga àquela descrita na Patente US no 8.344.207. Uma planta de soja não transformada foi usada para obter tecido a ser usado como um controle negativo. Múltiplos eventos de transformação de cada vetor binário foram analisados contra lagarta-das-vagens (SAW, Spodoptera erida- nia), lagarta-falsa-medideira (SBL, Chrysodeixis includens) e lagarta- da-espiga-do-milho (SPW, Helicoverpa zea).
[00106] As plantas de soja de R0 transformadas expressando TIC6757PL eram altamente eficazes (definido como tendo menos que ou igual a vinte por cento de dano de folha) contra SAW, SBL e SPW conforme mostrado na Tabela 10. Alta penetração (indicado por "(H)") é definido como maior do que cinquenta por cento dos eventos analisados para cada construto tendo menos que ou igual a vinte por cento de dano de folha. Baixa penetração (indicado por "(L)") é definido como menos que ou igual a cinquenta por cento dos eventos analisados para cada construto tendo menos que ou igual a vinte por cento de dano de folha. Tabela 10. Número de Eventos que Expressam TIC6757PL com < 20% de Dano de Folha e Penetração.
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[00107] Plantas de soja transgênica de R0 selecionadas expressando toxina de proteína TIC6757PL derivada da transformação dos Construtos 3, 4, 5 e 6 foram permitidas autopolinizar e produzir semente de R1. A semente de R1 foi permitida germinar a plantas de R1 pro- ducente. Plantas de R1 homozigotas para o cassete de expressão de TIC6757PL foram selecionadas para bioensaio de disco de folha contra lagarta-das-vagens (SAW, Spodoptera eridania), lagarta-falsa- medideira (SBL, Chrysodeixis includens), lagarta-da-espiga-do-milho (SPW, Helicoverpa zea) e lagarta-da-soja (VBW, Anticarsia gemmata- lis). As Tabelas 11 e 12 mostram o percentual médio de dano de folha demonstrado por cada inseto para cada planta de progênie R1 e o controle negativo, variedade A3555. As Tabelas 11 e 12 também mostram a média de erro padrão (SEM) do dano de folha percentual demonstrado por cada inseto para cada evento analisados em relação ao controle negativo. "N" representa o número de amostras de cada planta utilizada na ensaio. "SEM" representa o erro padrão do dano percentual média. Tabela 11. Percentual Médio de Dano de Folha para Plantas de Soja de R1 que Expressam TIC6757PL.
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Tabela 12. Percentual Médio de Dano de Folha para Plantas de Soja de R1 que Expressam TIC6757PL.
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[00108] Como pode ser visto nas Tabelas 11 e 12, plantas de soja de R1 que expressam proteína de toxina TIC6757PL fornecem resistência superior a SAW, SBL, SPW e VBC. Em relação a SAW, todos os quatro eventos demonstraram menos que um (1) por cento de dano de folha enquanto o controle negativo tinha aproximadamente oitenta e oito (88) por cento de dano de folha. Em relação a SBL, todos os quatro (4) eventos demostraram menos do que dois (2) por cento de dano de folha enquanto o controle tinha aproximadamente oitenta (80) por cento de dano de folha. Em relação a SPW, três dos quatro eventos demonstraram menos do que quatro (4) por cento de dano de folha enquanto o controle tinha aproximadamente noventa e sete (97) por cento de dano de folha. Em relação a VBC, três dos eventos demons-traram menos do que um (1) por cento de dano de folha e um evento demonstrou menos do que dois (2) por cento de dano de folha, enquanto o controle negativo tinha quase oitenta e nove (89) por cento de dano de folha.
[00109] O disposto acima demonstra que plantas de soja transformadas que expressam TIC6757PL fornecem resistência superior a insetos de Lepidópteros, em particular, lagarta-das-vagens (Spodoptera erida- nia), lagarta-falsa-medideira (Chrysodeixis includens), lagarta-da-espiga- do-milho (Helicoverpa zea) e lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis). Exemplo 5 Ensaio de atividade de TIC6757PL contra pragas de Lepidópteros em plantas de algodão estavelmente transformadas
[00110] Os vetores de transformação de planta binários que compreendem cassetes de transgene projetados para expressar a proteína pesticida TIC6757PL direcionada e não direcionada para o plastídeo foram clonados utilizando métodos conhecidos na técnica. Os vetores resultantes foram usados para transformar de maneira estável plantas de algodão. Os tecidos foram colhidos dos transformantes e utilizados em bioensaio de insetos contra várias pragas de insetos lepidópteros.
[00111] A sequência de codificação sintética projetada para expressão de planta como descrito no Exemplo 3 acima foi clonada em vetores de transformação de planta binários, e usada para transformar células de planta de algodão. Os vetores binários compreendendo sequências de codificação de TIC6757PL direcionadas e não direcionadas a plastídeo foram construídos utilizando métodos conhecidos na técnica. Os vetores de transformação de plantas resultantes compreenderam um primeiro cassete de transgene para expressão da proteína pesticida TIC6757PL que compreendia um promotor constitutivo, ligado operacionalmente em 5 ‘ a um líder, ligado operacionalmente em 5’ a uma sequência de codificação sintética que codifica uma proteína TIC6757PL direcionada ou não direcionada a plastídeo, que es-tava, por sua vez, ligada operacionalmente em 5’ a uma 3‘ UTR e; um segundo cassete de transgene para a seleção de células de plantas transformadas utilizando seleção de espectinomicina.
[00112] As células de algodão transformadas foram induzidas a formar plantas por métodos conhecidos na técnica. Os bioensaios utili- zando discos de folhas da planta foram realizados de forma análoga àquela descrita na Patente US no 8.344.207. Uma planta de algodão não transformada foi usada para obter tecido a ser usado como um controle negativo. Múltiplos eventos de transformação de cada vetor binário foram analisados contra lagarta-das-vagens, lagarta-do- algodão (CBW, Helicoverpa zea), lagarta-militar (FAW, Spodoptera frugiperda), lagarta-falsa-medideira (SBL, Chrysodeixis includens) e lagarta-das-maçãs (TBW, Heliothis virescens).
[00113] Plantas de algodão de R0 transformadas que expressam TIC6757PL eram altamente eficazes (definido como tendo menos que ou igual a dez por cento de dano de planta) contra CBW, FAW, SBL e TBW conforme mostrado na Tabela 13. Alta penetração (conforme indicado por "(H)") é definido como maior que cinquenta por cento dos eventos analisados para cada construto tendo menos que ou igual a dez por cento de dano de folha. Baixa penetração (conforme indicado por "(L)") é definido como menos que ou igual a cinquenta por cento dos eventos analisados para cada construto tendo menos que ou igual a dez por cento de dano de folha. Tabela 13. Número de Eventos que Expressam TIC6757PL com < 10% de Dano de Folha e Penetração.
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Exemplo 6 Ensaio de atividade de TIC7472PL e TIC7473PL pragas de Lepi- dópteros em plantas de milho estavelmente transformadas
[00114] Os vetores de transformação de planta binários que compreendem cassetes de transgene projetados para expressar a proteína pesticida TIC7472PL ou TIC7473PL direcionada ou não direcionada a plastídeo são clonados utilizando métodos conhecidos na técnica. Os vetores resultantes são usados para transformar de forma estável plantas de milho. Os tecidos são colhidos dos transformantes e utilizados em bioensaio de insetos contra várias pragas de insetos de Lepi- dópteros.
[00115] As sequências de codificação sintéticas são construídas para utilização na expressão da proteína codificada em plantas, clona- das em um vetor de transformação de planta binário e usadas para transformar células de plantas de milho. As sequências sintéticas são sintetizadas de acordo com os métodos geralmente descritos na Patente US no 5.500.365, evitando certas sequências problemáticas inimigas, tais como sequências de poliadenilação de planta rica em ATTTA e A/T enquanto preserva a sequência de aminoácidos da proteína de Paenibacillus nativa. As sequências de codificação sintéticas codificam uma proteína TIC7472PL e TIC7473PL, que compreendem um resíduo de alanina adicional imediatamente após a metionina de iniciação em relação à proteína TIC7472 e TIC7473. Para a proteína direcionada a plastídeo, a sequência de codificação de proteína pesti-cida TIC7472PL ou TIC7473PL sintética está operativamente ligada em quadro a uma sequência de codificação de peptídeo de sinalização de direcionamento a cloroplasto. Os vetores de transformação de plantas resultantes compreendem um primeiro cassete de transgene para a expressão da proteína pesticida TIC7472PL ou TIC7473PL que compreende um promotor constitutivo, ligado operacionalmente em 5’ a um líder, ligado operacionalmente em 5' a um íntron, ligado opera-cionalmente em 5’ a uma sequência de codificação sintética que codifica uma proteína TIC7472PL ou TIC7473PL direcionada ou não direcionada a plastídeo, que é, por sua vez, ligado operacionalmente em 5’ a uma 3’ UTR; e um segundo cassete de transgene para a seleção de células de plantas transformadas utilizando seleção de glifosato. A sequência de codificação sintética para a proteína pesticida TIC7472PL é apresentada como SEQ ID NO:15 e codifica a proteína apresentada como SEQ ID NO:16. A sequência de codificação sintética para a proteína pesticida TIC7473PL é apresentada como SEQ ID NO:17 e codifica a proteína apresentada como SEQ ID NO:18.
[00116] As plantas de milho são transformadas com os vetores de transformação binários descritos acima utilizando um método de transformação mediada por Agrobacterium. As células transformadas são induzidas a formar plantas por métodos conhecidos na técnica. Bioensaios utilizando discos de folha de planta são realizados em analogia àqueles descritos na Patente US no 8.344.207. Uma planta de milho não transformada é usada para obter tecido a ser usado como um controle negativo. Múltiplos eventos de transformação de cada vetor binário foram analisados contra lagarta-rosca (BCW, Agro- tis ipsilon), lagarta-da-espiga-do-milho (CEW, Helicoverpa zea), lagarta-militar (FAW, Spodoptera frugiperda) e broca grande da cana-de- açúcar (SWCB, Diatraea grandiosella), bem como outras praga de insetos de Lepidópteros.
[00117] As pragas de insetos são observadas quanto à mortalidade e ao crescimento retardado causados pela ingestão dos discos foliares apresentados que expressam TIC7472PL ou TIC7473PL e comparados a discos foliares derivados de plantas de milho não transformadas. Exemplo 7 Ensaio de atividade de TIC6757PL contra pragas de Lepidópteros em plantas de soja e algodão estavelmente transformadas
[00118] Os vetores de transformação de planta binários que compreendem cassetes de transgene projetados para expressar a proteína pesticida TIC7472PL ou TIC7473PL direcionada ou não direcionada a plastídeo são clonados utilizando métodos conhecidos na técnica. Os vetores resultantes são usados para transformar de maneira estável plantas de soja e milho. Os tecidos são colhidos dos transformantes e utilizados em bioensaio de insetos contra várias pragas de insetos de Lepidópteros.
[00119] As sequências de codificação sintéticas projetadas para a expressão de plantas como descrito no Exemplo 6 acima são clonadas em vetores de transformação de planta binários e usadas para transformar células de plantas de soja ou algodão. Os vetores binários compreendendo sequências de codificação de TIC7472PL ou TIC7473PL direcionadas segmentadas e não direcionadas a plastídeo são construídos utilizando métodos conhecidos na técnica. Os vetores de transformação de plantas resultantes compreendem um primeiro cassete de transgene para a expressão da proteína pesticida TIC7472PL ou TIC7473PL que compreende um promotor constitutivo, ligado operacionalmente em 5’ a um líder, ligado operacionalmente em 5' a uma sequência de codificação sintética que codifica uma proteína TIC7472PL ou TIC7473PL direcionada ou não direcionada a plastídeo, que é, por sua vez, ligado operacionalmente em 5’ a uma 3’ UTR e; um segundo cassete de transgene para a seleção de células de plantas transformadas usando seleção de espectinomicina. Os Construtos 1, 2 e 7 compreendiam uma sequência de clonagem que codifica uma proteína pesticida TIC6757PL não direcionada. Os Construtos 3, 4, 5 e 6 compreendiam uma sequência de codificação que codifica uma proteína pesticida TIC6757PL direcionada.
[00120] As células de soja e algodão transformadas são induzidas a formar plantas por métodos conhecidos na técnica. Bioensaios utilizando discos de folha de planta são realizados em analogia àqueles descritos na Patente US no 8.344.207. Uma planta de soja e algodão não transformada é usada para obter tecido a ser usado como um controle negativo. Múltiplos eventos de transformação de cada vetor binário são analisados contra lagarta-das-vagens (SAW, Spodoptera eri- dania), lagarta-falsa-medideira (SBL, Chrysodeixis includens), lagarta- da-espiga-do-milho (SPW, Helicoverpa zea), lagarta-militar (FAW, Spodoptera frugiperda), lagarta-falsa-medideira (SBL, Chrysodeixis includens), lagarta-das-maçãs (Heliothis virescens), lagarta-do- algodão (CBW, Helicoverpa zea) e lagarta-da-soja (VBW, Anticarsia gemmatalis), bem como outras pragas de inseto de Lepidópteros. As pragas de insetos são observadas quanto à mortalidade e ao crescimento retardado causados pela ingestão dos discos foliares apresentados que expressam TIC7472PL ou TIC7473PL e comparados a discos foliares derivados de plantas de soja ou algodão não transformadas.
[00121] Todas as composições descritas e reivindicadas no presente documento podem ser feitas e executadas sem experimentação indevida à luz da presente descrição. Embora as composições desta invenção tenham sido descritas em termos das modalidades ilustrativas anteriores, será evidente para os versados na técnica que variações, mudanças, modificações e alterações podem ser aplicadas à composição aqui descrita, sem se afastar do conceito verdadeiro, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que estão ligados química e fisiologicamente podem ser substituídos pelos agentes aqui descritos, enquanto resultados iguais ou similares seriam alcançados. Todos estes substitutos e modificações similares aparentes para os versados na técnica são considerados dentro do espírito, escopo e conceito da invenção, conforme definido pelas reivindicações anexas.
[00122] Todas as publicações e documentos de patente publicados citados no relatório descritivo estão aqui incorporados por referência na mesma extensão que se cada publicação individual ou pedido de patente fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

Claims (9)

1. Molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende um promotor heterólogo operativamente ligado a um segmento de polinucleotídeo que codifica uma proteína pesticida, em que o referido segmento de polinucleotídeo compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:3 ou uma sequência nu- cleotídica da mesma que codifica a mesma sequência de aminoácido, em que a proteína pesticida é ativa contra insetos lepidóp- teros, em que a referida proteína pesticida compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
2. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: a. a referida molécula de ácido nucleico recombinante compreende uma sequência que funciona para expressar a proteína pesticida em uma planta; ou b. a referida molécula de ácido nucleico recombinante é ex-pressada em uma célula vegetal para produzir uma quantidade eficaz como pesticida da proteína pesticida; ou c. a referida molécula de ácido nucleico recombinante está em ligação operável com um vetor, e o referido vetor é selecionado do grupo consistindo em um plasmídeo, fagemídeo, bacmídeo, cosmídeo e um cromossoma artificial de levedura ou bacteriano.
3. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é definida como presente em uma célula hospedeira bacteriana.
4. Composição inibidora de inseto, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico recombinante, como definida na reivindicação 1.
5. Produto básico, caracterizado pelo fato de que é produ- zido de uma planta, ou parte da mesma, a referida planta compreendendo a molécula de ácido nucleico recombinante como definida na reivindicação 1, em que o referido produto básico compreende uma quantidade detectável da referida molécula de ácido nucleico recombinante e da referida proteína pesticida, em que o referido produto básico é um produto processado selecionado dentre o grupo que consiste em farinha, farelo, amido, flocos ou silagem produzidos a partir da planta ou parte da mesma.
6. Método para controlar uma praga ou infestação de praga de espécie de lepidópteros, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende colocar a praga em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de uma proteína pesticida conforme apresentado na SEQ ID NO:4.
7. Método de detecção da presença da molécula de ácido nucleico recombinante, como definida na reivindicação 1, em uma amostra compreendendo o uso de DNA genômico de planta, caracterizado pelo fato de que compreende: a. colocar a referida amostra em contato com uma sonda de ácido nucleico que hibridiza sob condições de hibridização rigorosas com DNA genômico de uma planta compreendendo a molécula de ácido nucleico recombinante, conforme definida na reivindicação 1, e não hibridiza sob tais condições de hibridização com DNA genômico de uma planta, de outro modo, isogênica que não compreende a molécula de ácido nucleico recombinante, conforme definida na reivindicação 1, em que a referida sonda é homóloga ou complementar à SEQ ID NO:3; b. submeter a referida amostra e a referida sonda a condições de hibridização rigorosas; e c. detectar a hibridização da referida sonda de ácido nuclei- co com o referido DNA genômico de planta da referida amostra.
8. Método de detecção da presença de uma proteína pesticida, em uma amostra compreendendo proteína, caracterizado pelo fato de que a referida proteína pesticida compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4; compreendendo: a. colocar a referida amostra em contato com um anticorpo imunorreativo; e b. detectar a presença da referida proteína pesticida.
9. Uso de uma planta, célula de planta, parte de planta ou semente compreendendo a molécula de ácido nucleico recombinante como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para cruzar com uma segunda planta, regenerar uma planta, plantar ou cultivar um campo de plantas ou produzir um produto de planta.
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