[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

BR112017025430B1 - Método, uso de um produto, produto de programa de computador e sistema - Google Patents

Método, uso de um produto, produto de programa de computador e sistema Download PDF

Info

Publication number
BR112017025430B1
BR112017025430B1 BR112017025430-1A BR112017025430A BR112017025430B1 BR 112017025430 B1 BR112017025430 B1 BR 112017025430B1 BR 112017025430 A BR112017025430 A BR 112017025430A BR 112017025430 B1 BR112017025430 B1 BR 112017025430B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
prostate cancer
expression
gene
individual
genes
Prior art date
Application number
BR112017025430-1A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112017025430A2 (pt
Inventor
Ralf Hoffmann
Eveline Den Biezen-Timmermans
Dianne Arnoldina Margaretha Wilhelmina Van Strijp
Anne Godefrida Catharina Van Brussel
Márcia Alves De Inda
Janneke Wrobel
Original Assignee
Koninklijke Philips N.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Koninklijke Philips N.V. filed Critical Koninklijke Philips N.V.
Publication of BR112017025430A2 publication Critical patent/BR112017025430A2/pt
Publication of BR112017025430B1 publication Critical patent/BR112017025430B1/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

MÉTODO, USO DE UM PRODUTO, PRODUTO DE PROGRAMA DE COMPUTADOR E SISTEMA. A presente invenção refere-se a métodos para determinar as assinaturas de expressão gênica para o diagnóstico de pacientes com câncer de próstata, por exemplo, para estabelecer um prognóstico para tais pacientes, para determinar a predisposição do dito paciente a desenvolver doença agressiva ou indolente, por exemplo, após tratamento primário e/ou para identificação e estratificação de pacientes com as terapias disponíveis. A invenção também refere-se a produtos usados em tais métodos, por exemplo, kits, software e similares. A presente invenção refere-se adicionalmente a terapias para uso no tratamento de pacientes que tenham sido diagnosticados, identificados ou estratificados em qualquer dos métodos apresentados na presente invenção.

Description

Campo da invenção
[001] A invenção refere-se a métodos para determinar as assinaturas de expressão gênica para o diagnóstico de pacientes com câncer de próstata, por exemplo, para estabelecer um prognóstico para tais pacientes, para determinar a predisposição do dito paciente a desenvolver doença agressiva ou indolente, por exemplo após tratamento primário e/ou para identificação e estratificação de pacientes com as terapias disponíveis. A invenção também se refere a produtos usados em tais métodos, por exemplo, kits, software e similares. A invenção refere-se adicionalmente a terapias para uso no tratamento de pacientes que tenham sido diagnosticados, identificados ou estratificados em qualquer dos métodos apresentados na presente invenção.
Antecedentes da invenção
[002] Câncer é uma classe de doenças em que um grupo de células apresenta um crescimento descontrolado, invasão e, às vezes, metástase. Essas três propriedades malignas dos cânceres os diferenciam dos tumores benignos, os quais são autolimitados, não invadem ou metastizam.
[003] O câncer de próstata (CaP) é a malignidade não cutânea de ocorrência mais comum nos homens, com uma estimativa de 900.000 novos casos diagnosticados mundialmente em 2008. Devido ao envelhecimento da população, a incidência de CaP aumentará dramaticamente nos próximos anos. O diagnóstico de rotina por determinação dos níveis sanguíneos do antígeno específico da próstata (PSA), exame retal digital (DRE) e análise de ultrassom transrectal (TRUS) resulta em diagnóstico excessivo significativo de primeira linha de condições benignas (não cancerosas) da próstata: das aproximadamente 1 milhão de biópsias de próstata realizadas anualmente nos Estados Unidos apenas para descobrir cerca de 250.000 novos casos, cerca de 75% são feitas desnecessariamente, incorrendo em complicações substanciais (urossepsia, hemorragias, retenção urinária) em pacientes e um custo total acima de 2 bilhões de dólares (2.100 dólares por procedimento de biópsia). Ao menos 4 de 100 homens com uma biópsia negativa têm a probabilidade de serem hospitalizados devido a efeitos colaterais e 9 de 10.000 pacientes submetidos a biópsia estão em risco de morte decorrente do procedimento atualmente em uso.
[004] Dos aproximadamente 250.000 casos de CaP recentemente detectados nos Estados Unidos por ano, cerca de 200.000 são inicialmente caracterizados como doença localizada, isto é, como câncer confinado ao órgão da próstata. Esta condição é, em certa medida, curável por abordagens primárias de tratamento, como radioterapia ou, em particular, a remoção parcial ou total da próstata por cirurgia (prostatectomia). No entanto, essas intervenções são tipicamente acompanhadas de efeitos colaterais sérios, particularmente, como consequências muito frequentes da prostatectomia, incontinência urinária e/ou disfunções eréteis. Cerca de 50% dos homens submetidos à prostatectomia radical desenvolvem incontinência urinária. Os estudos mostram que, um ano após a cirurgia, entre 15% e 50% dos homens ainda apresentam esses problemas. Problemas de ereção também são efeitos colaterais sérios da prostatectomia radical (PR). Apenas cerca de metade dos homens submetidos à cirurgia é capaz de recuperar parte de sua capacidade erétil. Além disso, todos os tratamentos rotineiramente aplicados a CaP localizado são caros (tipicamente na ordem de 20 a 30 mil dólares) e geram custos diretos totais de 5 bilhões de dólares nos Estados Unidos a cada ano.
[005] Entre os aproximadamente 200.000 homens nos Estados Unidos diagnosticados com doença clinicamente localizada, até 50% têm muito baixo ou baixo risco de câncer. Consequentemente, em uma revisão recente de suas diretrizes de tratamento de CaP, o NCCN (National Comprehensive Cancer Network) incluiu a vigilância ativa (VA ou AS “active surveillance”) como um tratamento alternativo brando e conveniente para pacientes com baixo risco da doença. A recomendação de vigilância ativa para pacientes adequados melhora significativamente a qualidade de vida de tais pacientes em comparação com os homens que foram submetidos a tratamento primário, além do custo envolvido no tratamento de pacientes em vigilância ativa por 5 anos ser menor que 10.000 dólares por paciente.
[006] Além disso, no caso de cirurgia (em contraste com vigilância ativa) ser o tratamento de escolha selecionado para um determinado paciente, é significativamente vantajoso estratificar a extensão da cirurgia de acordo com a agressividade potencial do tumor do paciente. Por exemplo, técnicas operatórias com preservação dos nervos poderiam ser mais genericamente aplicadas em homens com baixo risco previsto de ocorrência da doença para minimizar os efeitos adversos relacionadas a potência como consequência de prostatectomia radical. Da mesma forma, de acordo com as diretrizes mais recentes das diretrizes “Prostate Cancer Guidelines” da European Association Of Urology (EAU, Associação Européia de Urologia), a dissecção estendida do nódulo linfático é recomendada no caso de ser previsto alto risco de câncer, embora esse procedimento seja complexo, demorado e associado a taxas de complicação mais altas comparado aos procedimentos mais limitados. Consequentemente, embora a dissecção menos limitada do nódulo linfático tenha mostrado falha em detectar em cerca de 50% de metástases linfonodais, o manejo dos homens com câncer de próstata localizado exige predições pré-cirúrgicas altamente acuradas da agressividade potencial de um tumor individual para se fornecer o tratamento mais adequado para cada paciente.
[007] US 2013/196321 A1 descreve ensaios moleculares que compreendem a medição dos níveis de expressão de um ou mais genes em uma amostra de um paciente de câncer de próstata para fornecer informações relacionadas à probabilidade de um resultado clínico, identificar a classificação do risco e facilitar a tomada de decisão sobre o tratamento. A referência revela vários genes a serem analisados em tais ensaios, que são normalizados para, por exemplo, um gene constitutivo. Além disso, os kits compreendendo sondas e/ou iniciadores específicos para gene para realizar os ensaios e sistemas baseados em computador, algoritmos e produtos de programa de computador para executar a análise dos níveis de expressão também são descritos.
[008] O artigo “DYRK2 controls the epithelial- mesenchymal transition in breast cancer by degrading Snail” por Mimoto Rei et al. em Cancer Letters (2013), Volume 339, Número 2, páginas 214 a 225, revela que DYRK2 tem regulação negativa no tecido de câncer de mama humano e que pacientes com tumores com expressão baixa de DYRK2 apresentam um resultado pior que os tumores com expressão alta de SYRK2. Os autores concluem que DYRK2 é um possível marcador de prognóstico para o câncer de mama e mencionam também que foi demonstrado que DYRK2 tem regulação negativa no câncer de pulmão, cólon e próstata.
[009] WO 2010/131194 A1 refere-se a PDE4D7 como um marcador de câncer de próstata maligno sensível a hormônio e revelam um método para diagnosticar, detectar, monitorar e prognosticar o câncer de próstata maligno sensível a hormônio, que compreende a etapa de determinação do nível de PDE4D7. Além disso, métodos para a identificação de um indivíduo elegível para a terapia de câncer são descritos, bem como uma composição para executar o método, que compreende os oligonucleotídeos ou sondas específicos para o produto de expressão de PDE4D7.
[010] WO 2014/153442 A2 apresenta métodos para diagnóstico, prognóstico e tratamento de câncer de ovário que envolvem a determinação de níveis de expressão de certos genes marcadores. Os níveis de expressão são convertidos em um índice, no qual os genes são ponderados igualmente com os níveis de expressão dos genes com regulação negativa subtraídos dos genes com regulação positiva.
Sumário da invenção
[011] A presente invenção refere-se à identificação e ao uso de perfis de expressão gênica, assinaturas, padrões de genes biomarcadores de interesse (também chamados de genes marcadores) com relevância clínica para o câncer de próstata. Em particular, a invenção se baseia na análise da expressão gênica de ácidos nucleicos, de preferência, genes transcritos de biomarcadores, obtidos a partir de amostras biológicas, e a identificação de genes de biomarcadores que estão correlacionados à doença agressiva e indolente, sobrevida do paciente e reincidência do câncer de próstata. A análise da expressão desses genes marcadores pode ser usada para a obtenção de um índice de progressão do câncer de próstata (PCPI) que pode ser usado na classificação de pacientes com uma doença indolente e agressiva e com bom ou mau prognóstico correspondente.
[012] Além disso, o PCPI pode também ser usado para predizer a progressão da doença em indivíduos anteriormente clinicamente diagnosticados e tratados e para estratificar os pacientes de acordo com seu PCPI individual. Portanto, o PCPI fornece um parâmetro muito útil para a medicina personalizada em relação ao diagnóstico, prognóstico e tratamento de pacientes com câncer de próstata. O PCPI pode ser usado sozinho ou em combinação com outros meios ou métodos que fornecem informações sobre o estado da doença ou o estágio da doença do paciente.
[013] Os médicos e/ou patologistas podem usar vantajosamente o PCPI para confirmar os resultados obtidos em outros métodos para diagnóstico, identificação, prognóstico, classificação e/ou estratificação de pacientes, por exemplo, pacientes com uma predisposição para desenvolver formas de câncer de próstata agressiva versus indolente. Os métodos e meios fornecidos pela invenção ajudam, portanto, a estabelecer melhor diagnóstico, prognóstico, etc, para encontrar o melhor tratamento para um paciente, e para evitar cirurgia ou outros tratamentos desnecessários que são perigosas devido aos efeitos colaterais, às vezes supérfluos e que resultam em custos enormes para o sistema de saúde pública.
[014] Um aspecto da invenção refere-se a um método que compreende:
[015] determinar um nível de expressão gênica para as assinaturas gênicas: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2 e, opcionalmente, as isoformas de PDE4 que compreendem PDE4D5 e/ou PDE4D7, para obter um perfil de expressão de indivíduo para um indivíduo
[016] que compreende adicionalmente:
[017] classificar o indivíduo como tendo um bom prognóstico ou um mau prognóstico de câncer de próstata, com base no perfil de expressão do indivíduo, sendo que o bom prognóstico prediz uma probabilidade de sobrevida aumentada dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial e/ou nenhuma progressão da doença após o tratamento primário, e o mau prognóstico prediz doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida e uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial; e/ou
[018] classificar o indivíduo como tendo ou não tendo uma predisposição para câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença com base no perfil de expressão do indivíduo, sendo que a predisposição prediz uma doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida, uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial.
[019] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente:
[020] classificar o indivíduo como tendo um bom prognóstico ou um mau prognóstico de câncer de próstata, com base no perfil de expressão do indivíduo, sendo que o bom prognóstico prediz uma probabilidade de sobrevida aumentada dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial e/ou nenhuma progressão da doença após o tratamento primário, e o mau prognóstico prediz doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida e uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial; ou
[021] classificar o indivíduo como tendo ou não tendo uma predisposição para câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença com base no perfil de expressão do indivíduo, sendo que a predisposição prediz uma doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida, uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial.
[022] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente:
[023] classificar o indivíduo como tendo um bom prognóstico ou um mau prognóstico de câncer de próstata, com base no perfil de expressão do indivíduo, sendo que o bom prognóstico prediz uma probabilidade de sobrevida aumentada dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial e/ou nenhuma progressão da doença após o tratamento primário, e o mau prognóstico prediz doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida e uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial; e
[024] classificar o indivíduo como tendo ou não tendo uma predisposição para câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença com base no perfil de expressão do indivíduo, sendo que a predisposição prediz uma doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida, uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial.
[025] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente:
[026] classificar o indivíduo como tendo um bom prognóstico ou um mau prognóstico de câncer de próstata, com base no perfil de expressão do indivíduo, sendo que o bom prognóstico prediz uma probabilidade de sobrevida aumentada dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial e/ou nenhuma progressão da doença após o tratamento primário, e o mau prognóstico prediz doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida e uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial; ou
[027] classificar o indivíduo como tendo ou não tendo uma predisposição para câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença com base no perfil de expressão do indivíduo, sendo que a predisposição prediz uma doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida, uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial.
[028] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente:
[029] classificar o indivíduo como tendo um bom prognóstico ou um mau prognóstico de câncer de próstata, com base no perfil de expressão do indivíduo, sendo que o bom prognóstico prediz uma probabilidade de sobrevida aumentada dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial e/ou nenhuma progressão da doença após o tratamento primário, e o mau prognóstico prediz doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida e uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial; e
[030] classificar o indivíduo como tendo ou não tendo uma predisposição para câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença com base no perfil de expressão do indivíduo, sendo que a predisposição prediz uma doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida, uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial.
[031] Um outro aspecto da invenção é direcionado a um método que compreende:
[032] classificar um indivíduo como tendo um bom prognóstico ou um mau prognóstico com base em um perfil de expressão de indivíduo para o indivíduo, sendo que o perfil de expressão de indivíduo inclui o nível de expressão gênica das assinaturas gênicas: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2 e, opcionalmente, as isoformas de PDE4 que compreendem PDE4D5 e/ou PDE4D7 e sendo que um bom prognóstico prediz uma probabilidade de sobrevida aumentada dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial e/ou nenhuma progressão da doença após o tratamento primário, e o mau prognóstico prediz doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida e uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial; e/ou
[033] classificar um indivíduo como tendo ou não tenho uma predisposição para câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença com base em um perfil de expressão de indivíduo para o indivíduo, sendo que o perfil de expressão de indivíduo inclui o nível de expressão gênica das assinaturas gênicas: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2 e, opcionalmente, as isoformas de PDE4 que compreendem PDE4D5 e/ou PDE4D7, sendo que a predisposição prediz uma doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida, uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial.
[034] Em uma modalidade, um método compreende:
[035] classificar um indivíduo como tendo um bom prognóstico ou um mau prognóstico com base em um perfil de expressão de indivíduo para o indivíduo, sendo que o perfil de expressão de indivíduo inclui o nível de expressão gênica das assinaturas gênicas: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2 e, opcionalmente, as isoformas de PDE4 que compreendem PDE4D5 e/ou PDE4D7 e sendo que um bom prognóstico prediz uma probabilidade de sobrevida aumentada dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial e/ou nenhuma progressão da doença após o tratamento primário, e o mau prognóstico prediz doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida e uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial; ou
[036] classificar um indivíduo como tendo ou não tenho uma predisposição para câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença com base em um perfil de expressão de indivíduo para o indivíduo, sendo que o perfil de expressão de indivíduo inclui o nível de expressão gênica das assinaturas gênicas: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2 e, opcionalmente, as isoformas de PDE4 que compreendem PDE4D5 e/ou PDE4D7, sendo que a predisposição prediz uma doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida, uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial.
[037] Em uma modalidade, um método compreende:
[038] classificar um indivíduo como tendo um bom prognóstico ou um mau prognóstico com base em um perfil de expressão de indivíduo para o indivíduo, sendo que o perfil de expressão de indivíduo inclui o nível de expressão gênica das assinaturas gênicas: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2 e, opcionalmente, as isoformas de PDE4 que compreendem PDE4D5 e/ou PDE4D7 e sendo que um bom prognóstico prediz uma probabilidade de sobrevida aumentada dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial e/ou nenhuma progressão da doença após o tratamento primário, e o mau prognóstico prediz doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida e uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial; e
[039] classificar um indivíduo como tendo ou não tenho uma predisposição para câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença com base em um perfil de expressão de indivíduo para o indivíduo, sendo que o perfil de expressão de indivíduo inclui o nível de expressão gênica das assinaturas gênicas: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2 e, opcionalmente, as isoformas de PDE4 que compreendem PDE4D5 e/ou PDE4D7, sendo que a predisposição prediz uma doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida, uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial.
[040] Em uma modalidade, um método compreende:
[041] classificar um indivíduo como tendo um bom prognóstico ou um mau prognóstico com base em um perfil de expressão de indivíduo para o indivíduo, sendo que o perfil de expressão de indivíduo inclui o nível de expressão gênica das assinaturas gênicas: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2 e, opcionalmente, as isoformas de PDE4 que compreendem PDE4D5 e/ou PDE4D7 e sendo que um bom prognóstico prediz uma probabilidade de sobrevida aumentada dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial e/ou nenhuma progressão da doença após o tratamento primário, e o mau prognóstico prediz doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida e uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial; ou
[042] classificar um indivíduo como tendo ou não tenho uma predisposição para câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença com base em um perfil de expressão de indivíduo para o indivíduo, sendo que o perfil de expressão de indivíduo inclui o nível de expressão gênica das assinaturas gênicas: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2 e, opcionalmente, as isoformas de PDE4 que compreendem PDE4D5 e/ou PDE4D7, sendo que a predisposição prediz uma doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida, uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial.
[043] Em uma modalidade, um método compreende:
[044] classificar um indivíduo como tendo um bom prognóstico ou um mau prognóstico com base em um perfil de expressão de indivíduo para o indivíduo, sendo que o perfil de expressão de indivíduo inclui o nível de expressão gênica das assinaturas gênicas: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2 e, opcionalmente, as isoformas de PDE4 que compreendem PDE4D5 e/ou PDE4D7 e sendo que um bom prognóstico prediz uma probabilidade de sobrevida aumentada dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial e/ou nenhuma progressão da doença após o tratamento primário, e o mau prognóstico prediz doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida e uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial; e
[045] classificar um indivíduo como tendo ou não tenho uma predisposição para câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença com base em um perfil de expressão de indivíduo para o indivíduo, sendo que o perfil de expressão de indivíduo inclui o nível de expressão gênica das assinaturas gênicas: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2 e, opcionalmente, as isoformas de PDE4 que compreendem PDE4D5 e/ou PDE4D7, sendo que a predisposição prediz uma doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida, uma maior probabilidade de recidiva bioquímica, recidiva clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial.
[046] Em algumas modalidades de vários aspectos da invenção, o indivíduo é um paciente diagnosticado com câncer de próstata.
[047] Em algumas modalidades de vários aspectos da invenção, o perfil de expressão do indivíduo é obtido a partir de uma amostra de um indivíduo.
[048] Em uma modalidade específica de vários aspectos da invenção, a amostra são linhagens celulares.
[049] Em algumas modalidades de vários aspectos da invenção, o paciente é selecionado do grupo que compreende (a) aqueles recém-diagnosticados com câncer de próstata, (b) aqueles que foram submetidos ao tratamento primário de câncer de próstata.
[050] Em uma modalidade de vários aspectos da invenção, o paciente foi previamente diagnosticado com câncer de próstata clinicamente localizado.
[051] Em uma modalidade de vários aspectos da invenção, o tratamento primário é selecionado do grupo que consiste em cirurgia da próstata, remoção da próstata, radioterapia, quimioterapia, remoção limitada ou ampliada de um linfonodo.
[052] Em uma modalidade de vários aspectos da invenção, o paciente no grupo (a) é adicionalmente selecionado a partir de pacientes recém-diagnosticados com câncer de próstata que foram submetidos a pelo menos um dos seguintes métodos: determinação de níveis séricos do antígeno próstata- específico (PSA), exame retal digital (DRE), análise de ultrassom transretal (TRUS) e biópsia da próstata.
[053] Em algumas modalidades de vários aspectos da invenção, o período predeterminado é de pelo menos 6 meses, pelo menos 1 ano, pelo menos 2 anos, pelo menos 3 anos, pelo menos 4 anos, pelo menos 5 anos, pelo menos 10 anos ou pelo menos 15 anos.
[054] Em algumas modalidades de vários aspectos da invenção, o nível de expressão gênica é determinado pela detecção da expressão de mRNA com o uso de uma ou mais sondas e/ou um ou mais conjuntos de sondas.
[055] Em algumas modalidades de vários aspectos da invenção, o nível de expressão gênica é determinado pelo método baseado em amplificação e/ou análise de microarranjo.
[056] Em algumas modalidades de vários aspectos da invenção, o nível de expressão gênica é determinado por sequenciamento de RNA, PCR, qPCR ou PCR multiplex.
[057] Em algumas modalidades de vários aspectos da invenção, o perfil de expressão do paciente é convertido em um índice de progressão do câncer de próstata (PCPI).
[058] Em uma modalidade, o índice de progressão do câncer de próstata é calculado de acordo com a seguinte equação:
[059] PCPI = (GEV_av_GOI_up) - (GEV_av_GOI_down),
[060] onde GEV_av_GOI_up é um valor médio da expressão gênica de genes regulados positivamente e em que GEV_av_GOI_down é um valor médio da expressão gênica de genes regulados negativamente, sendo que os valores são determinados com base nos dados da expressão gênica normalizada por cada amostra de indivíduo. O cálculo do PCPI pode produzir uma boa predição de prognóstico ou um bom desempenho em outras aplicações clínicas, conforme descrito na presente invenção.
[061] Em algumas modalidades de vários aspectos da invenção, o nível de expressão do conjunto de assinaturas gênicas é normalizado para a expressão de um gene de referência, de preferência, sendo que o gene de referência é um gene constitutivo e, com mais preferência, sendo que o gene constitutivo é TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A ou B2M.
[062] É descrito aqui também um método em que o indivíduo é classificado como positivo para câncer de próstata quando a expressão de qualquer um ou mais dos genes selecionados do grupo que consiste em COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5, DYRK2 é regulada positivamente em comparação com os níveis da expressão gênica correspondente em uma amostra de controle, e sendo que a expressão de qualquer um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2 e, opcionalmente, PDE4D5 e/ou PDE4D7 é regulada negativamente em comparação com os níveis da expressão gênica correspondente em uma amostra de controle; ou o indivíduo é classificado como negativo para câncer de próstata quando a expressão de qualquer um ou mais dos genes selecionados do grupo que consiste em COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5, DYRK2 é regulada negativamente em comparação com os níveis da expressão gênica correspondente em uma amostra de controle, e sendo que a expressão de qualquer um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2 e, opcionalmente, PDE4D5 e/ou PDE4D7 é regulada positivamente em comparação com os níveis da expressão gênica em uma amostra de controle. Os genes selecionados podem conferir um bom desempenho na classificação.
[063] Em algumas modalidades de vários aspectos da invenção, o indivíduo é classificado como tendo um bom prognóstico se o índice de progressão do câncer de próstata estiver abaixo de um limiar selecionado ou como tendo um mau prognóstico se o índice de progressão do câncer de próstata estiver acima do limiar selecionado; e/ou o indivíduo é classificado como tendo uma predisposição para câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença se o índice de progressão do câncer de próstata estiver acima de um limitar selecionado ou como não tendo uma predisposição para câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença se o índice de progressão do câncer de próstata estiver abaixo do limiar selecionado.
[064] Em algumas modalidades de vários aspectos da invenção, o método compreende adicionalmente a estratificação do indivíduo para o risco de doença agressiva versus doença não agressiva, de acordo com o prognóstico determinado ou a predisposição determinada; e/ou o fornecimento de um tratamento para câncer adequado para o indivíduo que necessita do mesmo, de acordo com o prognóstico determinado ou a predisposição determinada.
[065] Em algumas modalidades de vários aspectos da invenção, o tratamento de câncer é selecionado dentre cirurgia da próstata, remoção da próstata, radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal, remoção limitada ou ampliada de linfonodo ou combinações das mesmas, de preferência, a combinação de terapia hormonal e radioterapia.
[066] Em algumas modalidades de vários aspectos da invenção, o mau prognóstico ou a predisposição de câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença é indicativo de elegibilidade do indivíduo para ser tratado com qualquer um ou mais dos tratamentos selecionados do grupo que consiste em cirurgia da próstata, remoção da próstata, quimioterapia, radioterapia, dissecação do linfonodo limitada ou alargada.
[067] Em algumas modalidades de vários aspectos da invenção, uma predisposição para câncer de próstata agressivo é indicativa de elegibilidade para um tratamento selecionado do grupo que compreende a rebiópsia, cirurgia de próstata, remoção da próstata, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, dissecação limitada ou ampliada de um linfonodo ou combinações das mesmas, de preferência, a combinação de terapia hormonal e radioterapia.
[068] Em algumas modalidades de vários aspectos da invenção, o método compreende, adicionalmente, exibir ou mostrar um resultado de uma das etapas em um dispositivo de interface de usuário, uma mídia de armazenamento legível por computador, um monitor ou um computador que é parte de uma rede.
[069] Um aspecto adicional refere-se ao uso de um produto que compreende:
[070] iniciadores e/ou sondas para determinação do nível de expressão gênica para as assinaturas gênicas: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2 e, opcionalmente, as isoformas de PDE4 que compreendem PDE4D5 e/ou PDE4D7;
[071] que compreende adicionalmente, de modo opcional, iniciadores e/ou sondas parar determinar os níveis de expressão de um conjunto de genes relacionados em qualquer uma das Figuras 1 ou 2 além dos genes acima mencionados; e/ou
[072] que compreende adicionalmente, de modo opcional, iniciadores e/ou sondas para determinar o nível de expressão gênica de um gene de referência, de preferência, sendo que o gene de referência é um gene constitutivo e, com mais preferência, sendo que o gene constitutivo é TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A ou B2M
[073] para o estabelecimento de um prognóstico para um paciente com diagnóstico de câncer de próstata, para a estratificação de um paciente com diagnóstico de câncer de próstata, para a determinação de predisposição para câncer de próstata agressivo ou indolente em um paciente com câncer de próstata.
[074] Em algumas modalidades, o produto é um kit, que inclui um kit de PCR, um kit de sequenciamento de RNA ou um kit de microarranjo, de preferência, um kit de microarranjo de DNA. Em uma modalidade, o produto é um microarranjo. O produto pode fornecer uma forma eficiente para a determinação de níveis, conforme descrito na presente invenção e, portanto, pode conferir um bom desempenho em aplicações clínicas, conforme descrito na presente invenção.
[075] Em algumas modalidades, o produto é um produto para executar o método da invenção, ou o produto é ou um produto para o diagnóstico de câncer de próstata, para o estabelecimento de um prognóstico para um paciente com diagnóstico de câncer de próstata, para a estratificação de um paciente com diagnóstico de câncer de próstata, para a determinação da predisposição para câncer de próstata agressivo ou indolente em um paciente que tem um câncer de próstata.
[076] Em algumas modalidades, o produto é uma composição que compreende um conjunto de moléculas de ácidos nucleicos, sendo que cada uma compreende pelo menos uma sequência de sonda de polinucleotídeos na análise da expressão gênica compreendida por qualquer uma das Figuras 1 ou 2, ou os genes, conforme descrito acima.
[077] Em algumas modalidades, o produto é um arranjo de ácido nucleico que compreende, para cada gene em um conjunto de genes, o conjunto de genes compreendendo os genes relacionados nas Figuras 1 ou 2, ou os genes, conforme descrito acima, uma ou mais sondas de polinucleotídeos complementares e hibridizáveis com uma sequência de codificação no gene, para determinar um perfil de expressão na próstata e/ou um PCPI conforme definido acima.
[078] Em algumas modalidades, o produto é um kit para o estabelecimento de um prognóstico para um paciente com diagnóstico de câncer de próstata, para a estratificação de um paciente com diagnóstico de câncer de próstata, para a determinação da predisposição de câncer de próstata agressivo ou indolente em um paciente que tem um câncer de próstata, de acordo com qualquer um dos métodos conforme aqui descritos, que compreende: a) uma matriz, conforme aqui definida, b) um controle de kit e c) opcionalmente, instruções para uso.
[079] Em algumas modalidades, o produto é um arranjo de ácido nucleico para a análise de expressão dos ácidos nucleicos obtidos a partir de uma amostra biológica, sendo que o dito arranjo compreende um substrato que compreende sondas adequadas para a ligação específica de ácidos nucleicos ou fragmentos dos mesmos codificados pelos genes mencionados nas Figuras 1 ou 2, ou os genes, conforme descrito acima.
[080] Em algumas modalidades, o produto é um artigo de PCR que compreende reagentes para amplificação e detecção específicas de ácidos nucleicos ou fragmentos dos mesmos codificados pelos genes mencionados nas Figuras 1 ou 2, ou os genes, conforme descrito acima.
[081] Um aspecto adicional da invenção refere- se a uma terapia selecionada dentre cirurgia de próstata, remoção da próstata, radioterapia, terapia hormonal, quimioterapia, remoção limitada ou ampliada de um linfonodo ou combinações das mesmas, para uso no tratamento de pacientes identificados como elegíveis, sendo que os ditos pacientes são diagnosticados com uma predisposição para câncer de próstata agressivo, conforme definido pelos métodos da presente invenção.
[082] Um aspecto adicional da invenção refere- se a um produto de programa de computador, que compreende código legível por computador armazenado em uma mídia legível por computador ou transferível por download de uma rede de comunicação que, quando executado em um computador, implementa uma ou mais etapas ou todas as etapas de qualquer um dos métodos conforme aqui definidos.
[083] Um aspecto adicional da invenção refere-se a uma mídia de armazenamento não transitório legível por computador com um programa executável armazenado na mesma, sendo que o programa instrui um microprocessador sobre como executar uma ou mais das etapas de quaisquer dos métodos da invenção.
[084] Ainda um outro aspecto da invenção refere- se a um dispositivo para a análise da expressão genética de ácidos nucleicos (ou fragmentos dos mesmos) codificados por genes mencionados nas Figuras 1 ou 2, ou os genes descritos acima, sendo que o dispositivo compreende, de preferência: a) um banco de dados, incluindo registros que compreendem os valores de expressão gênica de referência associados aos resultados clínicos, cada perfil de referência compreendendo os níveis de expressão de um conjunto de genes relacionados em qualquer uma das Figuras 1 ou 2 ou os genes, conforme descrito acima e/ou b) uma interface de usuário capaz de receber e/ou inserir uma seleção de valores de expressão gênica de um conjunto de genes, o conjunto compreendendo genes relacionados nas Figuras 1 ou 2, ou os genes, conforme descrito acima, para uso em comparação com os perfis de expressão gênica de referência no banco de dados; c) uma saída que exibe uma predição do prognóstico clínico, de acordo com os níveis de expressão do conjunto de genes.
[085] Ainda um outro aspecto da invenção refere- se a um dispositivo para a execução do método da invenção.
[086] Ainda um outro aspecto adicional da invenção refere-se a um sistema que compreende o produto descrito acima e o produto de programa de computador ou a mídia de armazenamento legível por computador da invenção ou o dispositivo para a análise da expressão gênica de ácidos nucleicos da invenção ou um dispositivo para a execução do método da invenção.
Breve descrição dos desenhos
[087] A Figura 1 mostra uma tabela que compreende os genes candidatos analisados que são derivados de dados de estudo publicamente disponíveis.
[088] A Figura 2 mostra uma tabela que compreende 57 genes candidatos analisados para construir o PCPI.
[089] A Figura 3 mostra uma visão geral do desempenho do PCPI_18 ou PCPI_17 para predizer o desfecho primário do desenvolvimento de metástases distantes em 10 a 15 anos após o tratamento primário (cirurgia de próstata) para os conjuntos de dados GSE21032, GSE41408, GSE25136, GSE16560, GSE10645.
[090] A Figura 4 mostra o desempenho de PCPI_18 para predizer o desfecho primário do desenvolvimento de metástases distantes em 10 a 15 anos após o tratamento primário para o conjunto de dados GSE46691.
[091] A Figura 5 mostra o desempenho de PCPI_18 ou PCPI_17 para predizer o desfecho primário do desenvolvimento de metástases distantes em 10 a 15 anos após o tratamento primário (cirurgia de próstata em geral) para os conjuntos de dados GSE21032, GSE41408, GSE16560, GSE10645 em uma análise de regressão de Cox multivariada comparada aos padrões dos parâmetros clínicos, como PSA pré-tratamento, escore de Gleason de biópsia ou patologia, ou estágio da doença clínica/patologia. O qui-quadrado, bem como a razão de risco, do PCI e dos parâmetros clínicos individuais PCPI, é mostrado para cada conjunto de dados individual.
[092] A Figura 6 mostra uma visão geral do desempenho do PCPI_18 para predizer o desfecho primário do desenvolvimento de recidiva de doença bioquímica (BCR) em 10 a 15 anos após o tratamento primário (cirurgia de próstata em geral) para os conjuntos de dados GSE21032, GSE41408, GSE25136.
[093] A Figura 7 mostra o desempenho de PCPI_18 para predizer o desfecho primário do desenvolvimento de recidiva de doença bioquímica (BCR) em 10 a 15 anos após o tratamento primário (cirurgia de próstata em geral) para os conjuntos de dados GSE21032, GSE41408, GSE25136 em uma análise de regressão de Cox multivariada comparada aos padrões dos parâmetros clínicos, como PSA pré-tratamento, escore de Gleason de biópsia ou patologia ou estágio da doença clínica/patologia.
[094] A Figura 8 mostra uma análise de corte da curva ROC de PCPI_18 para sustentar a decisão clínica em relação, por exemplo, à estratificação do paciente ou para a vigilância ativa (AS) ou o tratamento ativo (por exemplo, prostatectomia, radioterapia e terapia hormonal).
[095] A Figura 9 relaciona os genes de interesse mencionados neste pedido com suas sequências de ID de transcrito, ID de proteína bem como de iniciadores e sondas específicas para os genes de interesse.
[096] A Figura 10 relaciona os genes de referência mencionados neste pedido com suas sequências de ID de transcrito, ID de proteína bem como de iniciadores e sondas específicas para os genes de referência.
[097] A Figura 11 mostra uma análise de diferentes riscos de recidiva ao longo de 5 a 10 anos de 422 pacientes agrupados de acordo com o PCPI_19 e características de risco clínico da NCCN, conforme pode ser deduzido das orientações da página da web da National Comprehensive Cancer (NCCN) (https://www.nccn.org/professionals/physician gls/f guidelin es.asp).
[098] A Figura 12 mostra uma análise de diferentes riscos de recidiva ao longo de 5 a 10 anos de 407 pacientes agrupados de acordo com o escore GPSu e características de risco clínico da NCCN, conforme pode ser deduzido das orientações da página da web da National Comprehensive Cancer (NCCN) (https://www.nccn.org/professionals/physician gls/f guidelin es.asp).
[099] A Figura 13 mostra uma análise de diferentes riscos de recidiva ao longo de 5 a 10 anos de 407 pacientes agrupados de acordo com o escore CCP e características de risco clínico da NCCN, conforme pode ser deduzido das orientações da página da web da National Comprehensive Cancer (NCCN) (https://www.nccn.org/professionals/physician gls/f guidelin es.asp).
Descrição detalhada das modalidades
[100] Embora a presente invenção seja descrita em relação a modalidades específicas, essa descrição não deve ser interpretada em sentido limitador.
[101] Antes de descrever em detalhes as modalidades exemplificadoras da presente invenção, são apresentadas definições importantes para o entendimento da presente invenção.
[102] Como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas singulares de “um” e “uma” também incluem seus respectivos plurais, a menos que o contexto determine claramente o contrário.
[103] No contexto da presente invenção, os termos “cerca de” e “aproximadamente” denotam um intervalo de exatidão que o versado na técnica entenderá como certo de que o efeito técnico da característica em questão está assegurado. O termo tipicamente indica um desvio do valor numérico indicado de ± 20%, de preferência, de ± 15%, com mais preferência, ± 10%, e com mais preferência ainda, de ± 5%.
[104] Deve ser entendido que o termo “que compreende” não é limitador. Para os propósitos da presente invenção, o termo “consistindo em” é considerado uma modalidade preferencial do termo “que compreende”. Se deste ponto em diante do presente documento for definido que um grupo compreende ao menos um certo número de modalidades, isso significa que o grupo compreende também um grupo que, de preferência, consiste apenas nessas modalidades.
[105] Além disso, os termos “primeiro”, “segundo”, “terceiro” ou “(a)”, “(b)”, “(c)”, “(d)”, etc., e similares na descrição e nas reivindicações são usados para distinguir entre elementos similares, e não necessariamente para descrever uma ordem sequencial ou cronológica. Deve-se entender que os termos assim usados são intercambiáveis sob circunstâncias adequadas, e que as modalidades da invenção descritas neste documento podem ser praticadas em outras sequências, diferentes das descritas ou ilustradas neste documento.
[106] Caso os termos “primeiro”, “segundo”, “terceiro” ou “(a)”, “(b)”, “(c)”, “(d)”, etc., se refiram a etapas de um método ou uso, não haverá coerência de tempo ou intervalo de tempo entre as etapas, isto é, as etapas devem ser executadas simultaneamente ou deve haver intervalos de tempo de segundos, minutos, horas, dias, semanas, meses ou mesmo anos entre tais etapas, a menos que indicado de outro modo na aplicação, conforme estabelecido acima ou abaixo, na presente invenção. Deve ser entendido que esta invenção não é limitada por metodologias, protocolos, proteínas, bactérias, vetores, reagentes específicos, etc., aqui descritos, uma vez que os mesmos podem variar. Deve ser entendido também que a terminologia usada na presente invenção tem o propósito de descrever modalidades específicas apenas, e não é destinada a limitar o escopo da presente invenção, que será limitado apenas pelas reivindicações em anexo. A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm os mesmos significados, como comumente entendido por um versado na técnica.
[107] O termo “assinatura(s) gênica(s)”, “gene(s) marcador(es)” ou “gene de interesse (GOI)”, no contexto da presente invenção, podem ser usados de forma intercambiável e designam biomarcadores cujo nível de expressão é determinado nos métodos da presente invenção. Em modalidades preferenciais da presente invenção, esses genes são ilustrados na Figura 2 da presente revelação e mencionados explicitamente abaixo bem como nas reivindicações. Portanto, a presente invenção refere-se a genes marcadores cuja expressão é regulada positivamente ou negativamente quando se compara a expressão no tecido de câncer de próstata obtido após tratamento primário ou após um diagnóstico inicial de câncer de próstata à expressão no tecido de câncer de próstata obtido antes do diagnóstico inicial de câncer de próstata e/ou antes do tratamento inicial específico para o câncer de próstata. A expressão do gene marcador em tecidos obtidos após tratamento primário ou após diagnóstico inicial de câncer de próstata pode ser correlacionada aos resultados de parâmetros do paciente, por exemplo, recidiva bioquímica, desenvolvimento de metástases de câncer ósseo e/ou morte.
[108] Quando os valores de expressão são determinados no contexto dos métodos da presente invenção, um “perfil de expressão gênica” individualizado é obtido que reflete os valores da expressão gênica dos GOIs em questão. No último caso, os valores de expressão são também chamados de “perfil de expressão do indivíduo”. Observa-se que o perfil de expressão da amostra e/ou o perfil de expressão do indivíduo pode variar em função do tempo. Por exemplo, os perfis de expressão gênica antes ou após tratamento terapêutico de um paciente com diagnóstico de câncer de próstata podem ser diferentes. De modo similar, os perfis de expressão gênica encontrados em uma amostra contendo células de câncer de próstata são diferentes dos encontrados em uma amostra que não contém células de câncer de próstata.
[109] O termo “genes marcadores” ou “gene(s) de interesse”, como usado aqui, portanto, refere-se a um conjunto de genes(s), unidade(s) ou sequência(s) genética(s) (sequência(s) de nucleotídeos) conforme definido acima, cujo nível de expressão é regulado positiva ou negativamente em uma célula ou tecido de câncer de próstata ou em qualquer tipo de amostra compreendendo tais células ou tecidos, ou porções ou fragmentos dos mesmos, quando comparados a um nível de controle, de preferência, quando comparados à expressão no tecido da próstata obtido em diferentes momentos, por exemplo, no diagnóstico inicial, diretamente após o tratamento primário, ou mais tarde, ou seja, vários meses ou anos após o diagnóstico inicial ou tratamento primário. O termo refere-se a qualquer produto de expressão da dita unidade ou sequência gênica, em particular, a um transcrito de mRNA. Quando os genes marcadores ou genes de interesse são examinados pela primeira vez, isto é, quando um paciente pela primeira vez apresenta suspeita de câncer de próstata, é também contemplado o uso de material de controle adicional que é derivado do tecido normal ou tecido de tumor benigno de próstata.
[110] O termo “nível de expressão”, como usado aqui, refere-se à quantidade de transcrito do gene marcador derivável de um número definido de células ou de uma porção definida de tecido, de preferência, à quantidade de transcrito obtenível em um procedimento padrão de extração de ácido nucleico (por exemplo, RNA). Métodos de extração adequados são conhecidos pela pessoa versada na técnica.
[111] O termo “nível de controle” (ou “estado de controle”), como usado aqui, refere-se a um nível de expressão que pode ser determinado ao mesmo tempo e/ou sob condições similares e/ou comparáveis como a amostra de teste com o uso de amostra(s) anteriormente coletada(s) e armazenada(s) de um indivíduo ou indivíduos cuja condição ou estado da doença, por exemplo, tumor de próstata não canceroso, normal ou benigno, câncer da próstata avançado, etc., é conhecida. Para a determinação de uma predisposição a câncer agressivo versus câncer indolente, o nível de controle é determinado, de preferência, no tecido de câncer obtido para estabelecer o diagnóstico inicial, que é, então, comparado à expressão de GOIs que é determinado em um estágio posterior, por exemplo, depois do tratamento primário. O termo “estado de doença” ou “estado de doença cancerosa” refere-se a qualquer estado ou tipo de condição celular ou molecular entre um estado de célula não cancerosa e (incluindo) um estado de célula cancerosa terminal. De preferência, o termo inclui/ou diferentes estágios de proliferação/desenvolvimento ou níveis de desenvolvimento de tumor no organismo entre (e excluindo) um estado de célula não cancerosa e (incluindo) um estado de célula cancerosa terminal. Tais estágios de desenvolvimento podem incluir todos os estágios do sistema de classificação TNM (tumor, nódulo, metástase) de tumores malignos, conforme definido pela UICC, por exemplo, estágios 0 e I a IV. O termo inclui também etapas antes de estágio 0 de TNM, por exemplo, estágios de desenvolvimento em que biomarcadores conhecidos pela pessoa versada na técnica mostram uma expressão ou padrão de expressão modificado alterado.
[112] O nível de expressão mencionado acima pode ser, de preferência, o nível de expressão do gene marcador ou GOI, conforme aqui definido.
[113] O termo “canceroso”, no contexto da presente invenção, refere-se a um estado de doença cancerosa, conforme aqui definido.
[114] O termo “não canceroso” no contexto da presente invenção refere-se a uma condição na qual proliferação benigna ou maligna pode ser detectada. Meios adequados para a dita detecção são conhecidos na técnica.
[115] O nível do controle da expressão pode ser determinado por um método estatístico com base nos resultados obtidos através da análise do(s) nível(is) de expressão anteriormente determinados de gene(s) marcador(es) da presente invenção em amostras de pacientes cujo estado da doença é conhecido. Além disso, o nível de controle pode ser derivado a partir de uma base de dados de padrões de expressão ou níveis de expressão de pacientes, tecidos ou células testados anteriormente. O nível de controle pode ser determinado a partir de uma amostra de referência derivada de um paciente que foi diagnosticado com câncer de próstata, por exemplo, de câncer de próstata independente de hormônio ou resistente a hormônio. Além disso, o nível de expressão dos genes marcadores da presente invenção em uma amostra biológica a ser testada pode ser comparado com múltiplos níveis de controle, cujos níveis de controle são determinados a partir de múltiplas amostras de referência. É contemplado o uso de um nível de controle determinado a partir de uma amostra de referência derivada de um tipo de tecido similar àquele da amostra biológica derivada do paciente. É particularmente preferido o uso de amostras derivadas de um paciente cujo estado de doença é canceroso conforme definido aqui acima.
[116] Em adição aos métodos para diagnóstico de câncer de próstata utilizando genes marcadores aqui descritos, é também possível determinar o nível de controle em tecidos de pacientes que apresentam uma condição de saúde na qual a proliferação benigna ou maligna pode ser detectada. É também contemplado o uso de amostra(s) derivada(s) de um paciente ou pacientes com tumor de próstata benigno, conforme definido acima, isto é, que apresentam uma condição de saúde em que a proliferação benigna pode ser detectada.
[117] O termo “tumor benigno de próstata” como aqui usado refere-se a um tumor de próstata que não apresentada todas as três as propriedades malignas de um câncer, isto é, não se desenvolve de uma maneira ilimitada e agressiva, não invade tecidos circundantes, e não se metastiza. Tipicamente, um tumor de próstata benigno significa uma doença neoplástica, ou inchaço, moderada e não progressiva que não apresenta as propriedades invasivas de um câncer. Além disso, os tumores benignos de próstata são tipicamente encapsulados, e, portanto, inibidos em sua capacidade de se comportar de uma maneira maligna. Um tumor benigno ou uma condição saudável pode ser determinado por meio de qualquer método molecular, histológico ou fisiológico independente adequado conhecido pela pessoa versada na técnica.
[118] Alternativamente, as amostras de referência podem compreender materiais derivados de linhagens celulares, por exemplo, linhagens de células de câncer imortalizadas. De preferência, o material derivado de linhagens de células de câncer de próstata pode estar compreendido em uma amostra de referência de acordo com a presente invenção. Exemplos de linhagens celulares de câncer preferenciais compreendem as linhagens celulares PC346P, PC346B, LNCaP, VCaP, DuCaP, PC346C, PC3, DU145, PC346CDD, PC346Flul, PC346Flu2.
[119] Em uma outra alternativa preferencial, as amostras de referência podem ser derivadas de tecidos do indivíduo/paciente ou painéis de tecidos ou coletas de tecidos obtidas em ambientes clínicos. As amostras podem, por exemplo, ser obtidas de pacientes masculinos sendo submetidos a cirurgia. As amostras podem ser derivadas de qualquer tipo de tecido, por exemplo de tecido ou linfonodos da próstata. Os exemplos preferenciais de coletas de tecidos de pacientes são derivados de procedimentos cirúrgicos (por exemplo, prostatectomia).
[120] Além disso, é contemplado o uso do valor padrão dos níveis de expressão de genes marcadores da presente invenção em uma população com um estado de doença conhecido, por exemplo, uma população tendo tumor de próstata benigno ou uma população saudável. O valor padrão pode ser obtido por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, uma faixa de média ± 2 DP (desvio padrão) ou média ± 3 DP ou pode ser usada como um valor padrão.
[121] Além disso, o nível de controle pode também ser determinado ao mesmo tempo e/ou sob condições similares ou comparáveis à amostra de teste com o uso de amostra(s) anteriormente coletada(s) e armazenada(s) de um paciente ou pacientes cujos estados de doença são conhecidos como cancerosos, isto é, que foram independentemente diagnosticados como tendo câncer de próstata, em particular, câncer de próstata agressivo.
[122] No contexto da presente invenção, um nível de controle determinado a partir de uma amostra biológica que é conhecida como não cancerosa, por exemplo, uma amostra de tecido saudável ou uma amostra de tumor de próstata benigno, é chamado de “nível de controle normal”.
[123] Se o nível de controle for determinado a partir de uma amostra biológica cancerosa, em particular, uma amostra de um paciente para o qual o câncer de próstata foi diagnosticado independentemente, pode ser designado como “nível de controle canceroso”.
[124] O termo “câncer da próstata” refere-se a um câncer da glândula da próstata no sistema reprodutor masculino, que ocorre quando células da próstata sofrem mutação e começam a se multiplicar sem controle. Tipicamente, o câncer de próstata é ligado a um nível elevado de antígeno específico da próstata (PSA). Em uma modalidade da presente invenção, o termo “câncer da próstata” refere-se a um câncer que mostra níveis de PSA acima de 4,0. Em uma outra modalidade, o termo refere-se a câncer que mostra os níveis de PSA acima de 2,0. O termo “nível de PSA” refere-se à concentração de PSA no sangue em ng/ml.
[125] O termo “câncer de próstata” compreende também o câncer de próstata ou linhagens celulares de câncer de próstata que são sensíveis à estimulação de hormônio sexual masculino no que diz respeito ao seu crescimento ou proliferação. O termo “sensível” refere-se a situações em que o câncer de próstata ou linhagens celulares de câncer de próstata mostram um padrão de reação bioquímica ou celular na presença de hormônios sexuais masculinos, mas não precisam de um hormônio sexual masculino para o crescimento e/ou proliferação. Um tumor de próstata hormônio-sensível é consequentemente entendido como um tumor de próstata maligno que se desenvolveu a partir de formas pré-malignas como neoplasia intraepitelial prostática (NIP) e é caracterizada pelo fato de que seu crescimento ainda é dependente da presença de hormônios sexuais masculinos androgênios. Em contraste, uma vez que esses tumores são tratados por terapia de depleção hormonal, esses tipos de câncer se desenvolvem tipicamente em uma forma hormônio-resistente que cresce independente da presença de androgênio.
[126] O termo “câncer de próstata hormônio- resistente” significa que o crescimento e a proliferação de câncer de próstata ou linhagens celulares de câncer de próstata de hormônio são resistentes ao estímulo do hormônio sexual masculino. O termo também se refere a um último estágio de desenvolvimento do câncer de próstata que não é mais compatível com uma administração de anti-hormônios, de preferência, antiandrogênios, conforme anteriormente definido neste documento.
[127] O termo “hormônio sexual masculino”, como usado aqui, refere-se a um androgênio, de preferência, testosterona, androstenediona, di-hidrotestosterona, desidroepiandrosterona, androstenediol ou androsterona.
[128] Um outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso de genes marcadores ou GOIs como um marcador para diagnóstico, detecção, monitoramento ou prognóstico de câncer de próstata hormônio-sensível maligno ou a progressão para câncer de próstata.
[129] Os termos “regulação positiva” ou “nível de expressão com regulação positiva” ou “nível de expressão aumentado” (os quais podem ser usados como sinônimos) no contexto da presente invenção denotam, portanto, uma elevação no nível de expressão entre uma situação a ser analisada, por exemplo, uma situação derivável de uma amostra do paciente, e um ponto de referência, que pode ser um nível de controle normal ou um nível de controle canceroso, derivável de qualquer estágio tumor de próstata ou câncer de próstata adequado conhecido pelo versado na técnica. Os níveis de expressão são considerados “aumentados” quando a expressão gênica, por exemplo, em uma amostra a ser analisada, difere em, isto é, é elevada em, por exemplo, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais de 50% em comparação com um nível de controle, ou em ao menos 0,1 vezes, ao menos 0,2 vezes, ao menos 1 vez, ao menos 2 vezes, ao menos 5 vezes, ou ao menos 10 vezes ou mais em comparação com um nível de controle. O nível de controle pode ser um nível de controle normal ou um nível de controle canceroso como aqui definido acima. Se a comparação com um nível de controle canceroso deve ser feita, uma comparação adicional com um nível de controle normal é preferida. Tal comparação adicional permite a determinação de uma tendência da modificação, por exemplo, a magnitude de um aumento do nível de expressão pode ser observada e/ou conclusões correspondentes podem ser tiradas. É preferencial uma comparação com um tumor da próstata benigno, ou um tecido saudável ou uma amostra derivada de um indivíduo saudável.
[130] Os termos “regulação negativa” ou “nível de expressão com regulação negativa” ou “nível de expressão reduzido” (os quais podem ser usados como sinônimos) no contexto da presente invenção denotam, portanto, uma queda no nível de expressão entre uma situação a ser analisada, por exemplo, uma situação derivável de uma amostra do paciente, e um ponto de referência, que pode ser um nível de controle normal ou um nível de controle canceroso, derivável de qualquer estágio tumor de próstata ou câncer de próstata adequado conhecido pelo versado na técnica. Os níveis de expressão são considerados “reduzidos” quando a expressão gênica, por exemplo, em uma amostra a ser analisada, difere em, isto é, é reduzida em, por exemplo, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ou mais de 50% em comparação com um nível de controle, ou em ao menos 0,1 vezes, ao menos 0,2 vezes, ao menos 1 vez, ao menos 2 vezes, ao menos 5 vezes, ou ao menos 10 vezes ou mais em comparação com um nível de controle. O nível de controle pode ser um nível de controle normal ou um nível de controle canceroso como aqui definido acima. Se a comparação com um nível de controle canceroso deve ser feita, uma comparação adicional com um nível de controle normal é possível. Tal comparação adicional permite a determinação de uma tendência da modificação, por exemplo, a magnitude de uma redução do nível de expressão pode ser observada e/ou conclusões correspondentes podem ser tiradas. É preferencial uma comparação com um tumor da próstata benigno, ou um tecido saudável ou uma amostra derivada de um indivíduo saudável.
[131] Os valores de expressão do(s) gene(s) de interesse aqui mencionados podem ser usados para estabelecer um “índice de progressão do câncer de próstata (PCPI)” usando- se a seguinte equação:
[132] PCPI = (GEV_av_GOI_up) - (GEV_av_GOI_down),
[133] em que GOI, refere-se a genes de interesse selecionados, por exemplo, genes (bio)marcadores, os quais são agrupados nos regulados negativamente entre grupos de pacientes com e sem progressão após tratamento primário em comparação com os regulados positivamente entre os grupos de pacientes com e sem progressão após tratamento primário. Um valor médio da expressão gênica para os genes regulados negativamente é calculado (GEV_av_GOI_down) bem como um valor médio de expressão gênica para os genes regulados positivamente (GEV_av_GOI_up).
[134] Em uma modalidade específica, um índice de progressão do câncer de próstata específico da amostra do indivíduo é calculado de acordo com a seguinte equação:
[135] PCPI = (GEV_av_GOI_up) - (GEV_av_GOI_down),
[136] em que GEV_av_GOI_up é um valor médio de expressão gênica de genes regulados positivamente e em que GEV_av_GOI_down é um valor médio de expressão gênica de genes regulados negativamente, sendo que os valores são determinados com base nos dados de expressão gênica normalizada para cada amostra de paciente, e em que “os genes regulados positivamente” referem-se a genes regulados positivamente entre grupos de pacientes com e sem progressão após o tratamento primário e os “genes regulados negativamente” referem-se a genes regulados negativamente entre grupos de pacientes com e sem progressão após tratamento primário.
[137] Uma seleção de genes potencialmente relevantes à estratificação no câncer de próstata ou para determinar a predisposição ao desenvolvimento de câncer de próstata agressivo após o tratamento primário é fornecido, por exemplo na Figura 2. A Figura 2 fornece uma visão geral dos 57 genes selecionados que eram expressos significativamente (p<0,05) diferencialmente e que foram regulados entre grupos de pacientes na mesma direção (isto é, regulados positiva ou negativamente). Esses 57 genes podem ser usados como GOIs de acordo com um aspecto da invenção. É também possível usar genes selecionados dos 57 genes acima, por exemplo, pelo menos 17 genes, pelo menos 18 genes, pelo menos 19 genes, pelo menos 20 genes, pelo menos 21 genes, pelo menos 22 genes, pelo menos 23 genes, pelo menos 24 genes, pelo menos 25 genes, pelo menos 26 genes, pelo menos 27 genes, pelo menos 28 genes, pelo menos 29 genes, pelo menos 30 genes, pelo menos 31 genes, pelo menos 32 genes, pelo menos 33 genes, pelo menos 34 genes, pelo menos 35 genes, pelo menos 36 genes, pelo menos 37 genes, pelo menos 38 genes, pelo menos 39 genes, pelo menos 40 genes, pelo menos 41 genes, pelo menos 42 genes, pelo menos 43 genes, pelo menos 44 genes, pelo menos 45 genes, pelo menos 46 genes, pelo menos 47 genes, pelo menos 48 genes, pelo menos 49 genes, pelo menos 50 genes, ou mais.
[138] Em um outro aspecto, uma assinatura prognóstica de expressão gênica compreendida de uma combinação de genes individuais é fornecida, sendo que o nível de expressão desses GOIs pode ser medido usando-se, por exemplo, o RNA extraído de amostras de tecido de câncer de próstata humano de uma maneira quantitativa. A combinação dessas características em um único modelo de dados (isto é, o PCPI) fornece um poder de classificação significativamente melhorado para predizer a progressão de câncer de próstata.
[139] Em uma modalidade preferencial, a assinatura PCPI compreende os seguintes 19 genes: PDE4D5, PDE4D7, AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2.
[140] O termo “fosfodiesterase 4D5” ou “PDE4D5” refere-se à variante 5 do splicing da fosfodiesterase humana PDE4D, isto é, o gene PDE4D5 humano da fosfodiesterase, de preferência, à sequência conforme definido na sequência de referência do NCBI: NM_001197218.1, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 1, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de PDE4D5 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 2, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_001184147.1 que codifica o polipeptídeo de PDE4D5. O termo “fosfodiesterase 4D5” ou “PDE4D5” refere-se, também, ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o PDE1D5_forward (SEQ ID NO: 3) e o PDE1D5_reverse (SEQ ID NO: 4), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 5.
[141] O termo “fosfodiesterase 4D7” ou “PDE4D7” refere-se à variante 7 do splicing da fosfodiesterase humana PDE4D, isto é, o gene PDE4D7 humano da fosfodiesterase, de preferência, à sequência conforme definido na sequência de referência do NCBI: NM_001165899.1, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 6, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de PDE4D7 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 7, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_001159371.1 que codifica o polipeptídeo de PDE4D7. O termo “fosfodiesterase 4D7” ou “PDE4D7” refere-se, também, ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o PDE1D7_forward (SEQ ID NO: 8) e o PDE1D7_reverse (SEQ ID NO: 9), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 10.
[142] O termo “AZGP1” refere-se ao gene da Alfa- 2-Glicoproteína de ligação ao zinco 1, de preferência, a sequência, conforme definida pela sequência de referência do NCBI: NM_001185.3, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 11, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de AZGP1 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 12, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_001176.1 que codifica o polipeptídeo de AZGP1. O termo “AZGP1” refere-se também ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o AZGP1_forward (SEQ ID NO: 13) e o AZGP1_reverse (SEQ ID NO: 14), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 15.
[143] O termo “FBLN1” refere-se ao gene da Fibulina1, de preferência, a uma ou mais das sequências, conforme definido pela sequência de referência do NCBI: NM_001996.3, NM_006485.3, NM_006486.2 e NM_006487.2, com mais preferência, às sequências de nucleotídeos conforme definido nas SEQ ID NOs: 16, 17, 18 e 19, respectivamente, que correspondem às sequências das sequências de referência no NCBI dos transcritos de Fibulina1 indicadas acima e referem-se também à sequência de aminoácidos correspondente conforme apresentada nas SEQ ID NOs: 20, 21, 22 e 23 que correspondem às sequências de proteínas definidas nas sequências de referência de acesso de proteína do NCBI NP_001987.2, NP_006476.2, NP_006477.2 e NP_006478.2, respectivamente, que codificam os polipeptídeos de Fibulina 1. O termo “FBLN1” refere-se também ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o FBLN1_forward (SEQ ID NO: 24) e o FBLN1_reverse (SEQ ID NO: 25), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 26.
[144] O termo “ILKL” refere-se ao gene da Quinase acoplada à Integrina, de preferência, a uma ou mais das sequências, conforme definido pelas sequências de referência do NCBI: NM_001014794.2, NM_001014795.2, NM_001278441.1, NM_001278442.1 e NM_004517.3, com mais preferência, às sequências de nucleotídeos conforme apresentadas nas SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 30 e 31, respectivamente, que correspondem às sequências das sequência de referência no NCBI acima indicada dos transcritos de quinase acoplada à integrina, e refere-se também à sequência de aminoácidos correspondente conforme apresentada nas SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35 e 36 que correspondem às sequências de proteínas definidas nas sequências de referência de acesso de proteína do NCBI NP_001014794.1, NP_001014795.1, NP_001265370.1, NP_001265371.1 e NP_004508.1, respectivamente, que codificam os polipeptídeos da quinase acoplada à integrina. O termo “ILK” refere-se também ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o ILK_forward (SEQ ID NO: 37) e o ILK_reverse (SEQ ID NO: 38), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 39.
[145] O termo “KRT15” refere-se ao gene da Queratina 15, de preferência, à sequência, conforme definida pela sequência de referência do NCBI: NM_002275.3, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 40, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de KRT15 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 41, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_002266.2 que codifica o polipeptídeo de KRT15. O termo “KRT15” refere-se também ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o KRT15_forward (SEQ ID NO: 42) e o KRT15_reverse (SEQ ID NO: 43), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 44.
[146] O termo “MEIS2” refere-se à MEIS Homeobox 2, de preferência, a uma ou mais das sequências, conforme definido pelas sequências de referência do NCBI: NM_001220482.1, NM_002399.3, NM_170674.4, NM_170675.4, NM_170676.4, NM_170677.4, NM_172315.2 e NM_020149.2, com mais preferência, às sequências de nucleotídeos conforme apresentadas nas SEQ ID NOs: 46, 47, 48, 49, 50 e/ou 51, respectivamente, que correspondem às sequências das sequências de referência no NCBI dos transcritos de MEIS2 indicadas acima e referem-se também à sequência de aminoácidos correspondente conforme apresentada nas SEQ ID NOs: 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 e/ou 60 que correspondem a sequências de proteína definidas nas sequências de referência de acesso de proteína do NCBI NP_001207411.1, NP_002390.1, NP_733774.1, NP_733775.1, NP_733776.1, NP_733777.1, NP_758526.1 e NP_758527.1, respectivamente, codificando polipeptídeos de MEIS2. O termo “MEIS2” refere-se também ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o MEIS2_forward (SEQ ID NO: 61) e o MEIS2_reverse (SEQ ID NO: 62), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 63.
[147] O termo “MYBPC1” refere-se à Proteína C de Ligação à Miosina, do tipo lento, de preferência, a uma ou mais das sequências, conforme definido pelas sequências de referência do NCBI: NM_001254718.1, NM_001254719.1, NM_001254720.1, NM_001254721.1, NM_001254722.1, NM_001254723.1, NM_002465.3, NM_206819.2, NM_206820.2 e NM_206821.2, com mais preferência, às sequências de nucleotídeos conforme apresentadas nas SEQ ID NOs: 64, 65, 66,67, 68, 69, 70, 71, 72 e/ou 73, respectivamente, que correspondem às sequências das sequências de referência no NCBI acima indicadas dos transcritos de MYBPC1 e refere-se também à sequência de aminoácidos correspondente conforme apresentada nas SEQ ID NOs: 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 e/ou 83 que correspondem às sequências de proteína definidas nas sequências de referência de acesso de proteína do NCBI NP_001241647.1, NP_001241648.1, NP_001241649.1, NP_001241650.1, NP_001241651.1, NP_001241652.1, NP_002456.2,NP_996555.1, NP_996556.1 e NP_996557.1, respectivamente, codificando os polipeptídeos de MYBPC1. O termo “MYBPC1” refere-se também ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o MYBPC1_forward (SEQ ID NO: 84) e o MYBPC1_reverse (SEQ ID NO: 85), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 86.
[148] O termo “PAGE4” refere-se ao gene da família do antígeno P, membro 4, de preferência, à sequência, conforme definida pela sequência de referência do NCBI: NM_007003.3, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 87, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de PAGE4 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 88, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_008934.1 que codifica o polipeptídeo de PAGE4. O termo “PAGE4” refere-se também ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o PAGE4_forward (SEQ ID NO: 89) e o PAGE4_reverse (SEQ ID NO: 90), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 91.
[149] O termo “SRD5A2” refere-se ao gene da Esteroide 5-Alfa-Redutase tipo 2, de preferência, à sequência, conforme definida pela sequência de referência do NCBI: NM_000348.3, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 92, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de SRD5A2 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 93, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_000339.2 que codifica o polipeptídeo de SRD5A2. O termo “SRD5A2” refere-se também ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o SRD5A2_forward (SEQ ID NO: 94) e o SRD5A2_reverse (SEQ ID NO: 95), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 96.
[150] O termo “COL1A1” refere-se ao gene do Colágeno alfa I tipo I, de preferência, à sequência, conforme definida pela sequência de referência do NCBI: NM_000088.3, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 97, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de COL1A1 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 98, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_000079.2 que codifica o polipeptídeo de COL1A1. O termo “COL1A1” refere-se também ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o COL1A1_forward (SEQ ID NO: 99) e o COL1A1_reverse (SEQ ID NO: 100), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 101.
[151] O termo “COL3A1” refere-se ao gene do Colágeno alfa I tipo III, de preferência, à sequência, conforme definida pela sequência de referência do NCBI: NM_000090.3, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 102, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de COL3A1 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 103, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_000081.1 que codifica o polipeptídeo de COL3A1. O termo “COL3A1” refere-se também ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o COL3A1_forward (SEQ ID NO: 104) e o COL3A1_reverse (SEQ ID NO: 105), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 106.
[152] O termo “COL5A2” refere-se ao gene do Colágeno alfa 2 tipo V, de preferência, à sequência, conforme definida pela sequência de referência do NCBI: NM_000393.3, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 107, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de COL5A2 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 108, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_000384.2 que codifica o polipeptídeo de SRD5A2. O termo “COL5A2” refere-se também ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o COL5A2_forward (SEQ ID NO: 109) e o COL5A2_reverse (SEQ ID NO: 110), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 111.
[153] O termo “INHBA” refere-se ao gene da beta Inibina A, de preferência, à sequência, conforme definida pela sequência de referência do NCBI: NM_002192.2, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 112, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de INHBA e refere-se também à sequência de aminoácidos correspondente conforme apresentada na SEQ ID NO: 113, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_002183.1 que codifica o polipeptídeo de PDE4D2. O termo “INHBA” refere-se também ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o INHBA_forward (SEQ ID NO: 114) e o INHBA_reverse (SEQ ID NO: 115), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 116.
[154] O termo “THBS2” refere-se ao gene da Trombospondina 2, de preferência, à sequência, conforme definida pela sequência de referência do NCBI: NM_003247.3, com mais preferência, à sequência de nucleotídeos conforme apresentada na SEQ ID NO: 117, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de THBS2 e refere-se, também, à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 118, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_003238.2 que codifica o polipeptídeo de THBS2. O termo “THBS2” refere-se também ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o THBS2_forward (SEQ ID NO: 119) e o THBS2_reverse (SEQ ID NO: 120), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 121.
[155] O termo “VCAN” refere-se ao gene do Versicano, de preferência, a uma ou mais das sequências, conforme definido pela sequência de referência do NCBI: NM_001126336.2, NM_001164097.1, NM_001164098.1 e NM_004385.4, com mais preferência, a uma ou mais sequências de nucleotídeos conforme apresentadas na SEQ ID NO: 122, 123, 124 e 125, respectivamente, que correspondem às sequências das sequências de referência no NCBI dos transcritos de VCAN indicadas acima e referem-se também às sequências de aminoácidos correspondentes conforme apresentada nas SEQ ID NOs: 126, 127, 128 e 129 que correspondem às sequências de proteínas definidas nas sequências de referência de acesso de proteína do NCBI NP_001119808.1, NP_001157569.1, NP_001157570.1 e NP_004376.2, respectivamente, que codificam os polipeptídeos VCAN. O termo “VCAN” refere-se também ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o VCAN_forward (SEQ ID NO: 130) e o VCAN_reverse (SEQ ID NO: 131), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 132.
[156] O termo “BNG” refere-se ao gene do Biglicano, de preferência, à sequência, conforme definida pela sequência de referência do NCBI: NM_001711.4, com mais preferência, com a sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 133, que corresponde à sequência da sequência de referência no NCBI acima indicada do transcrito de BNG e refere-se também à sequência de aminoácidos correspondente como apresentada na SEQ ID NO: 134, que corresponde à sequência de proteína definida na sequência de referência de acesso de proteína do NCBI NP_001702.1 que codifica o polipeptídeo de PDE4D2. O termo “BNG” refere-se também ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o BNG_forward (SEQ ID NO: 135) e o BNG_reverse (SEQ ID NO: 136), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 137.
[157] O termo “BIRC5” refere-se ao gene do Versicano, de preferência, a uma ou mais das sequências, conforme definido pela sequência de referência do NCBI: NM_001012270.1, NM_001012271.1 e NM_001168.2, com mais preferência, às sequências de nucleotídeos conforme apresentadas na SEQ ID NO: 138, 139 e 140, respectivamente, que correspondem às sequências das sequências de referência no NCBI dos transcritos de BIRC5 indicadas acima e referem- se também à sequência de aminoácidos correspondente conforme apresentada nas SEQ ID NOs: 141, 142 e 143 que correspondem às sequências de proteínas definidas nas sequências de referência de acesso de proteína do NCBI NP_001012270.1, NP_001012271.1 e NP_001159.2, respectivamente, que codificam os polipeptídeos de BIRC5. O termo “BIRC5” refere-se também ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o BIRC5_forward (SEQ ID NO: 144) e o BIRC5_reverse (SEQ ID NO: 145), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 146.
[158] O termo “DYRK2” refere-se ao gene do Versicano, de preferência, a uma ou mais das sequências, conforme definido pela sequência de referência do NCBI: NM_003583.3 e NM_006482.2, com mais preferência, a uma ou mais sequências de nucleotídeos, conforme apresentadas na SEQ ID NO: 147 e 148, respectivamente, que correspondem às sequências das sequências de referência no NCBI dos transcritos de DYRK2 indicadas acima e referem-se também às sequências de aminoácidos correspondentes, conforme apresentada nas SEQ ID NOs: 149 e 150 que correspondem às sequências de proteínas definidas nas sequências de referência de acesso de proteína do NP_003574.1 e NP_006473.2, respectivamente, que codificam os polipeptídeos de DYRK2. O termo “DYRK2” refere-se também ao amplicon que pode ser gerado pelo par de iniciadores, o DYRK2_forward (SEQ ID NO: 151) e o DYRK2_reverse (SEQ ID NO: 152), e pode ser detectado pela sonda da SEQ ID NO: 153.
[159] Em outras modalidades, a assinatura PCPI pode ser uma lista de 18 genes compreendendo PDE4D em vez de PDE4D5 e PDE4D7 ou pode compreender os demais 17 genes. Portanto, em uma modalidade preferencial, a assinatura PCPI pode ser uma lista de 17 genes que compreende os 17 genes acima mencionados e não compreende nem PDE4D5 nem PDE4D7.
[160] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece uma assinatura de prognóstico de expressão gênica que compreende uma combinação de 19 genes individuais que podem ser medidos no RNA extraído de amostras de tecido de câncer de próstata humano de uma maneira quantitativa. A combinação dessas características em um único modelo de dados (=PCPI ->índice de progressão do câncer de próstata) fornece um poder de classificação significativamente melhorado para predizer a progressão do câncer de próstata. Em modalidades que usam esses 19 genes, ou 17, 18 ou 57, o PCPI mencionado na presente invenção é usado em métodos para diagnóstico de câncer de próstata em uma amostra, prognóstico do estado da doença individual do paciente e desenvolvimento esperado da doença, e oferece um parâmetro em métodos para estratificar e/ou identificar pacientes para tratamento ou terapia individualmente preferencial, se aplicável. Com base no parâmetro PCPI, a predisposição ou probabilidade de que, por exemplo, o tumor progrida para câncer de próstata agressivo, pode ser determinada. Por exemplo, se o PCPI obtido na análise de um tumor for maior que um nível de corte (ou limiar) definido, a probabilidade de que o dito tumor progrida para uma forma agressiva é também mais alta, e vice- versa.
[161] A etapa de classificação das amostras de tumor que são analisadas, de acordo com os métodos descritos na presente invenção, compreende, dessa forma, a comparação entre os valores de PCPI entre amostras que foram obtidas em um ponto no tempo específico no passado (por exemplo, antes do diagnóstico de câncer de próstata) e as amostras obtidas em um estágio posterior. Quando o PCPI obtido na análise de uma amostra de tumor no dito estágio posterior é maior que um limiar ou valor de corte definido, esse parâmetro pode ser usado como uma indicação de uma progressão para câncer de próstata agressivo.
[162] O valor de corte pode ser definido com base em um conjunto de dados de referência que compreendem grupos de pacientes com ou sem progressão. O valor de corte pode ser ajustado, por exemplo, em 70%, 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de sensibilidade em relação à classificação de pacientes com ou sem progressão. Em uma modalidade preferencial, o valor de corte pode ser ajustado para 90% de sensibilidade.
[163] Evidentemente, o PCPI pode também ser usado em métodos para estabelecer um prognóstico de um paciente, em um método para a estratificação dos pacientes em grupos para um tratamento adequado, com o auxílio do qual o médico chega à conclusão de que um tratamento específico não é adequado, que uma terapia (ainda) não é necessária, ou que as terapias não são mais necessárias tendo em vista a condição física geral do paciente.
[164] As modalidades da presente invenção referem-se, dessa forma, à identificação e ao uso de padrões (ou “perfis” ou “assinaturas”) de expressão de genes marcadores (ou sequência) que são clinicamente relevantes para o câncer de próstata. Os perfis de expressão do gene marcador, seja incorporado na expressão do ácido nucleico, expressão da proteína ou outras formas de expressão, podem ser usados para prever a recidiva de câncer de próstata e/ou sobrevida de indivíduos acometidos de câncer de próstata. Particularmente, os genes marcadores são usados para estabelecer o perfil de progressão do câncer de próstata (PCPI) aqui descrito que é usado na identificação/classificação de pacientes com uma doença agressiva ou indolente.
[165] No contexto da presente aplicação, a expressão “diagnóstico inicial” refere-se ao primeiro diagnóstico ou ao diagnóstico subsequente anterior à data em que um dos métodos, de acordo com a presente invenção, foi executado e o PCPI foi calculado. Por exemplo, o diagnóstico inicial pode ser estabelecido para um paciente cujo material de tecido da próstata foi analisado pela primeira vez e, de preferência, antes do diagnóstico de câncer de próstata.
[166] No contexto do presente pedido, o termo “período predeterminado após o diagnóstico inicial” compreende um período de cerca de 6 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos, 10 anos, 15 anos, 20 anos ou mais. No contexto do presente pedido, a expressão “paciente com câncer de próstata recém- diagnosticado” refere-se a um indivíduo que foi diagnosticado como tendo valores de exames bioquímicos ou valores clínicos ou valores de PCPI que confirmam ou levantam suspeita de presença de células de câncer de próstata em uma amostra obtida a partir desse paciente pela primeira vez.
[167] No contexto do presente pedido, a expressão “tratamento primário para câncer de próstata” refere-se a qualquer método conhecido para o tratamento de câncer de próstata, ou seja, cirurgia, quimioterapia, tratamento com agentes biológicos, radioterapia e similares.
[168] No contexto da presente aplicação, a expressão “tratamento com agentes biológicos” refere-se ao tratamento de câncer de próstata com anticorpos monoclonais ou derivados dos mesmos, ou peptídeos ou fragmentos dos mesmos, que especificamente inibem ou bloqueiam ou neutralizam as moléculas biológicas, in vivo bem como in vitro, que estão envolvidas no crescimento, na proliferação, na manutenção ou em qualquer outra via metabólica que é usada por células de câncer de próstata. Os anticorpos monoclonais direcionados a alvos estabelecidos incluem aqueles que são aprovados para tumores sólidos, como anticorpos monoclonais anti-EGFR-2 humano, como trastuzumabe, anticorpos anti-EGFR, cituximabe e panitumumabe, e o anticorpo monoclonal do fator de crescimento endotelial antivascular (VEGF), bevacizumabe.
[169] No contexto do presente pedido, a expressão “recidiva bioquímica” refere-se, por exemplo, a valores biológicos recorrentes de PSA aumentados que indicam a presença de células de câncer da próstata em uma amostra. Entretanto, também é possível usar outros marcadores que podem ser usados na detecção da presença ou que elevam a suspeita de tal presença.
[170] No contexto do presente pedido, o termo “recidiva clínica” refere-se à presença de sinais clínicos ou valores clínicos, conforme medidos, por exemplo, com o uso de formação do escore de Gleason.
[171] No contexto do presente pedido de patente, a expressão “predisposição a câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença” refere-se a um parâmetro mensurável e significativo (por exemplo, o PCPI), que fornece uma indicação de que a probabilidade de que o paciente de quem a amostra foi investigada desenvolva câncer de próstata agressivo, isto é, após o diagnóstico e tratamento de câncer de próstata, por exemplo, por prostatectomia, quimioterapia e/ou radioterapia, as células de câncer de próstata reapareçam com um potencial para crescimento agressivo, como a formação de metástases nos linfonodos e nos ossos.
[172] No contexto do presente pedido de patente, a expressão “método implementado por computador para determinar um prognóstico de um paciente com câncer de próstata” refere-se a um método em que os algoritmos do software calculam um PCPI e com base no mesmo fornecem um prognóstico para o paciente que é analisado, sendo que esse método utiliza dados brutos obtidos na medição do nível de expressão gênica dos genes mencionados na presente invenção, e a conversão dos mesmos em um índice PCPI usando a equação acima descrita.
[173] No contexto do presente pedido, os métodos para diagnóstico, prognóstico, identificação de uma predisposição para desenvolvimento ou progressão de câncer de próstata agressivo, a identificação de pacientes acometidos de câncer de próstata ou estão sujeitos à recidiva de câncer de próstata após tratamento primário, podem ser tratados com um regime terapêutico adequado com base nos resultados obtidos em qualquer um dos métodos de acordo com a presente invenção. Dessa forma, por exemplo, se o prognóstico é de que um paciente desenvolva câncer de próstata agressivo com base nos resultados determinando uma predisposição para esse tipo de câncer, o médico pode decidir se usar ou não qualquer das terapias disponíveis para o tratamento de câncer de próstata, como cirurgia, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, ou combinações dos mesmos e similares.
[174] Os métodos, de acordo com a presente invenção, também fornecem informações com o auxílio do PCPI com base em que pode ser decidido se um paciente deve ou não ser submetido à cirurgia, quimioterapia, radioterapia ou se uma outra biópsia deve ser feita. Dessa forma, o PCPI representa um parâmetro importante para estabelecer um diagnóstico individualizado, prognóstico, permite identificar pacientes com uma predisposição para câncer de próstata agressivo ou estratificar o mesmo para a terapia mais adequada para o paciente. O PCPI pode também ser usado em combinação com outros meios e métodos para estabelecer um diagnóstico ou prognóstico, ou para identificar ou estratificar pacientes, conforme discutido neste documento. A presente invenção, portanto, refere-se também a terapias ou tratamentos específicos para câncer de próstata, conforme mencionado acima, para uso no tratamento de pacientes que foram identificados como elegíveis para tais terapias com base no PCPI, opcionalmente, em combinação com outros métodos de diagnóstico ou prognóstico, com intenção de selecionar o tratamento para câncer mais adequado para o dito paciente. Por exemplo, a completa remoção de linfonodos pode ser uma opção no tratamento de pacientes que foram identificados ou diagnosticados ou para os quais um prognóstico tenha sido estabelecido usando os métodos, de acordo com a invenção, quando o PCPI é alto em comparação com uma amostra de controle.
[175] Em modalidades da presente invenção envolvendo pacientes, que foram tratados por prostatectomia após diagnóstico clínico inicial, a invenção inclui métodos para predizer a probabilidade ou a predisposição à recidiva de câncer de próstata, metástase de câncer e/ou recidiva de níveis elevados de PSA.
[176] Modalidades adicionais da presente invenção referem-se a métodos para identificar e, então, usar, perfis de expressão do gene marcador (ou sequência) em uma amostra que proporcionam informações de prognóstico relacionadas ao câncer de próstata. Os perfis de expressão se correlacionam com (e, dessa forma, são capazes de discriminar) pacientes com resultados bons ou ruins de recidiva, metástase de câncer e/ou sobrevida.
[177] Em modalidades da presente invenção, um método para identificar os perfis de expressão do gene marcador relevantes para recidiva e/ou metástase de câncer em pacientes com câncer de próstata é fornecido.
[178] Em modalidades adicionais da invenção, métodos de comparação da expressão do gene marcador (ou sequência) em uma amostra que compreende a análise da expressão gênica em células de câncer de próstata de um paciente com um perfil de expressão identificado, o PCPI, são fornecidos para determinar o provável resultado para o paciente, por exemplo, após prostatectomia, quimioterapia, radioterapia, etc. Em outros aspectos dessas modalidades da invenção, as informações obtidas podem ser vantajosamente usadas para predizer se um paciente provavelmente se beneficiará de, por exemplo, cirurgia para tratar câncer de próstata ou se será melhor para um paciente um outro tipo de tratamento ou um tratamento adjuvante além da cirurgia. Os pacientes que provavelmente se beneficiarem de cirurgia, como uma prostatectomia radical, podem ser selecionados com base no perfil de expressão da amostra da próstata do paciente, conforme aqui descrito, para estarem livres de recidiva e/ou metástases de câncer após a cirurgia. Em uma outra modalidade, é predito que um paciente o qual não se esperaria que se beneficiasse de cirurgia, pelo perfil de expressão das células de câncer de próstata do paciente, conforme aqui revelado, desenvolva metástase de câncer após a cirurgia. A título de exemplo, a recidiva do câncer de próstata pode ser no mesmo local, enquanto a metástase é frequentemente em um local ou tecido diferente, como em um linfonodo ou osso. Modalidades adicionais da presente invenção referem-se a um método para identificar um paciente, a partir de uma população de pacientes com câncer de próstata, ou após prostatectomia, como pertencendo a uma subpopulação de pacientes com um resultado melhor de recidiva de câncer e/ou sobrevida (como menor risco de recidiva ou metástase), em relação a uma outra subpopulação, ou como pertencente a uma subpopulação com um resultado de recidiva de câncer e/ou sobrevida pior (como risco elevado de recorrência ou metástase), em relação a uma outra subpopulação. Os métodos da invenção permitem, portanto, estratificar os pacientes em subpopulações ou subtipos.
[179] Os métodos da presente invenção referem- se a modalidades para a identificação de pacientes com câncer de próstata, opcionalmente, após prostatectomia, como com probabilidade de ter um resultado melhor ou pior de recidiva de câncer, metástase de câncer e/ou sobrevida por meio de análise por PCPI aqui revelada. Onde a interpretação previamente subjetiva da amostra obtida de pacientes (como aquelas com base na coloração imunoistoquímica e análise subjetiva) pode ser usada para determinar a predisposição a doença agressiva versus indolente e/ou tratamento de câncer de próstata, ou pacientes pré ou pós-prostatectomia, ou pacientes com câncer da próstata que foram tratados com uma terapia diferente, a presente invenção introduz um índice objetivo refletindo padrões de expressão, que podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros critérios (subjetivos e/ou objetivos) para fornecer uma avaliação mais precisa de resultados de pacientes, incluindo a sobrevida e a recidiva ou metástase de câncer. Os métodos com base na análise dos padrões de expressão do gene marcador da presente invenção incluem, portanto, um meio para detectar/diagnosticar câncer de próstata ou prognóstico de pré ou pós-prostatectomia ou, de modo mais genérico, para determinar a predisposição ao tratamento pré ou pós-tratamento primário para doença agressiva ou indolente.
[180] O PCPI é baseado na análise de mais de um gene marcador, ou sequência expressa, capaz de distinguir entre os estágios de câncer de próstata, ou estágios de câncer de próstata pré ou pós-prostatectomia com precisão significativa. O nível de expressão do(s) gene(s) marcador(es) ou sequência(s) expressa(s) de interesse são identificados como correlacionados aos resultados de modo que o(s) nível(is) de expressão é/são relevantes para uma determinação de protocolos de tratamento preferenciais de um paciente. Portanto, a invenção inclui modalidades relacionadas a um método para determinar o resultado de um indivíduo com câncer de próstata, opcionalmente, pré ou pós-prostatectomia, analisando os níveis de expressão da amostra suspeita de conter uma célula cancerosa do dito paciente que são correlacionados aos resultados do paciente, de acordo com os métodos aqui revelados. Em uma outra modalidade da invenção, o método para determinar o risco de recidiva e/ou metástase de câncer de próstata em um paciente é apresentado.
[181] Nos métodos da invenção, uma amostra suspeita de conter células de câncer de próstata de um paciente é analisada quanto aos níveis de expressão dos genes marcadores aqui revelados. Os níveis de expressão agregados dos genes marcadores podem ser comparados aos níveis médios ou medianos de expressão dos mesmos em uma população de células de câncer de próstata. Essa avaliação pode, então, ser usada para determinar o risco de recidiva e/ou metástase de câncer de próstata no indivíduo do qual a amostra foi obtida quando o PCPI é usado. Os níveis de expressão dos genes revelados (ou sequências expressas) estão correlacionadas com um baixo risco de recidiva e/ou metástase de câncer, ou um alto risco de recidiva e/ou metástase de câncer.
[182] Dito de outra forma, os genes marcadores individuais (ou sequências expressas) aqui revelados são expressos em níveis mais altos ou mais baixos (em comparação a valores de expressão normalizada em um população de células de câncer de próstata), de modo que o desvio está correlacionado a um risco mais alto ou mais baixo ou predisposição para o desenvolvimento de câncer agressivo versus indolente em pacientes anteriormente diagnosticados com câncer de próstata, opcionalmente em pacientes que já tenham sido especificamente tratados para o câncer de próstata ou pacientes diagnosticados de novo.
[183] Em algumas modalidades, a análise dos níveis de expressão pode ser feita através do uso de sondas de ácido nucleico selecionadas que especificamente reconhecem os genes marcadores, conforme aqui revelado. Essas sondas hibridizam, sob condições adequadas, e detectam as sequências expressas aqui reveladas. Em modalidades da presente invenção, as sondas podem ser usadas para detectar uma região de sequência amplificada a partir de uma sequência (gene) de marcador expressa.
[184] A detecção ou determinação dos níveis de expressão das sequências (genes) de marcador pode ser chamada de detecção ou a determinação de um perfil de expressão ou de assinatura. Os padrões de expressão da invenção compreendendo as sequências de gene marcador são identificados e usados conforme descrito aqui. Para sua identificação, uma amostragem grande dos níveis de expressão gênica em uma amostra contendo células de câncer de próstata é obtida através da quantificação dos níveis de expressão do mRNA. Em uma modalidade, a invenção inclui a detecção de níveis de expressão do gene marcador (ou sequência) através da análise da expressão gênica de população de células únicas ou células homogêneas que foram dissecadas de, ou isoladas e purificadas de, células contaminantes além do que é possível por uma biópsia simples. Uma vez que a expressão de vários genes flutua entre as células de diferentes pacientes, bem como entre células de amostra do mesmo paciente, dados múltiplos da expressão de sequências de genes individuais são usados como dados de referência para gerar modelos que, por sua vez, permitem a identificação de genes e sequências individuais, a expressão dos quais está correlacionada a resultados específicos de câncer de próstata, ou pré ou pós-prostatectomia, ou que permitem a classificação de pacientes de acordo com sua predisposição para câncer agressivo versus indolente. Nesses métodos, os níveis de expressão gênica são, de preferência, convertidos em um PCPI conforme definido acima, usando-se os genes marcadores de interesse mencionados nas reivindicações e ao longo de todo o presente pedido.
[185] De acordo com a presente invenção, os níveis de expressão de genes marcadores de vários genes nesses modelos foram, então, analisados para identificar as sequências de ácidos nucleicos, cuja expressão é positivamente ou negativamente correlacionada a um resultado de câncer de próstata, ou tratamento pós-câncer de próstata.
[186] Modalidades preferenciais da presente invenção são baseadas na identificação de um subconjunto de sequências de genes marcadores expressos em uma célula, identificadas como correlacionadas aos resultados, conforme aqui descrito. Um perfil ou padrão de expressão da invenção inclui uma combinação dessas sequências de marcador (ou genes) identificadas que são convertidas em um PCPI. O uso de múltiplas amostras para a identificação de sequências expressas aumenta a confiança de que um gene é considerado como correlacionado a um resultado de recidiva, metástase e/ou sobrevida ao câncer de próstata. Sem confiança suficiente, permanece imprevisível se um gene específico está realmente correlacionado a um resultado e também imprevisível se a expressão de um gene pode ser usada com sucesso para identificar o resultado de indivíduo ou paciente com câncer de próstata, ou pré ou pós-prostatectomia. As sequências de ácido nucleico identificadas correspondendo aos genes marcadores revelados (ou sequências expressas) de interesse podem ser selecionadas para avaliação como um perfil de expressão a ser detectado ou avaliado por suas propriedades preditivas.
[187] Um perfil de níveis de expressão ou PCPI que é altamente correlacionado a um resultado em relação a outro pode ser usado para analisar uma amostra contendo célula de câncer de próstata de um indivíduo ou paciente para predizer o resultado do indivíduo do qual a amostra foi obtida. Esse ensaio pode ser usado como parte de um método para determinar o tratamento terapêutico para o dito indivíduo com base no resultado identificado. Essa correlação fornece uma determinação molecular de resultados de recidiva de câncer de próstata, metástase de câncer e/ou sobrevida, conforme aqui revelados. Sem se ater à teoria, e oferecida para melhorar a compreensão da presente invenção, a determinação molecular revelada é mais poderosa que outros indicadores moleculares relacionados ao câncer de próstata, como a determinação dos níveis de antígeno sérico de próstata (PSA). Usos adicionais dos padrões e perfis de expressão correlacionados estão na classificação de células e tecidos; a determinação de diagnóstico e/ou prognóstico e a determinação e/ou alteração de terapia.
[188] A capacidade de discriminar é conferida pela identificação de expressão das sequências de genes marcadores individuais como relevante e não pela forma da análise usada para determinar o nível de expressão real. Os métodos da invenção refletem, quantitativamente ou qualitativamente, a expressão da sequência de genes do marcador no “transcritoma” (a fração transcrita dos genes em um genoma). A natureza da amostra contendo célula de câncer de próstata não é limitadora, uma vez que tecido fresco, tecido recém-congelado e fixação de tecido e tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) podem ser usados nos métodos revelados. Em algumas modalidades, a amostra pode ser uma biópsia por agulha (núcleo) ou outra biópsia.
[189] Para detectar um padrão de expressão identificado ou assinatura PCPI, as modalidades da invenção incluem a detecção dos padrões de expressão gênica (ou sequência) mediante a coleta global, ou quase global, de dados de expressão genética de populações de células únicas ou de células homogêneas que foram dissecadas de, ou de outro modo isoladas ou purificadas de, células contaminantes além daqueles possíveis por uma biópsia simples. Os níveis de expressão dos genes marcadores (sequências) no padrão ou perfil são então detectados ou de outro modo medidos. Em outras modalidades, um método pode detectar ou medir apenas os níveis de expressão dos genes (sequências) no perfil sem avaliação ou outra determinação da expressão de outros genes ou sequências.
[190] Em um aspecto adicional, a análise de níveis de expressão pode ser realizada em combinação com, ou no lugar de, outras avaliações ou indicadores de câncer de próstata. Em algumas modalidades, a análise é feita em combinação com um método para determinar o grau do câncer de próstata em uma amostra que compreende células de câncer de próstata um indivíduo. Em outras modalidades, a combinação é com um método de determinação do estágio de câncer de próstata na amostra. Uma terceira possibilidade é combinação com a detecção ou a determinação dos níveis de PSA do indivíduo, opcionalmente antes de um procedimento usado para isolar as células de câncer de próstata. É claro que uma combinação com um, dois, ou todos os três destes exemplos representativos é possível. Quando mais de um tipo de avaliação é usado, o resultado é uma análise multivariada. A invenção inclui expressamente todas as possíveis combinações de avaliações descritas na presente invenção como modalidades multivariadas.
[191] Em geral, qualquer método aceito para avaliação do grau e/ou estágio de câncer de próstata, conforme conhecido pelo versado na técnica, pode ser usado. Em alguns casos, o método de determinação do grau de câncer de próstata compreende a determinação de um escore de Gleason (ou grau de Gleason). Em outros casos, o método de determinação do estágio de câncer de próstata compreende uma determinação de acordo com o sistema de estagiamento de tumor do American Joint Committee on Cancer (AJCC) para avaliar o estágio de câncer de próstata. E, conforme descrito na presente invenção, a análise dos níveis de expressão gênica (sequência) pode ser realizada em vez de, ou em combinação com, o escore de Gleason ou a determinação de estágio do tumor do AJCC. Nos casos dos níveis de PSA, sua avaliação pode ser conduzida antes de uma prostatectomia, que é utilizada para fornecer uma amostra que compreende células de câncer de próstata para uso em qualquer método descrito na presente invenção.
[192] Em modalidades adicionais, a invenção inclui meios físicos e metodológicos para detectar a expressão de genes (ou sequências) aqui revelados. Esses meios podem ser direcionados à análise de um ou mais aspectos dos moldes de DNA subjacentes à expressão do gene (ou sequência), do RNA usado como um intermediário para expressar o gene (ou sequência) ou do produto proteináceo expresso pelo gene (ou sequência).
[193] Embora a presente invenção seja descrita principalmente no contexto de câncer de próstata humano, ela pode ser praticada no contexto de câncer de próstata de qualquer animal que está conhecidamente acometido de câncer de próstata. Alguns exemplos não limitadores de animais para a aplicação da presente invenção são mamíferos, particularmente, aqueles importantes em aplicações agrícolas (como, mas não se limitam a, gado, ovelha, cavalos, e outros “animais agrícolas”), modelos animais de câncer de próstata e de animais de companhia (como, mas não se limitando a, cães e gatos).
[194] Um “padrão” ou “perfil” ou “assinatura” de expressão gênica e o PCPI calculado correspondente referem-se à expressão relativa de genes de interesse (sequências de expressão) entre dois ou mais resultados dentre câncer de próstata, ou pré ou pós-prostatectomia, recidiva do câncer, metástase e/ou sobrevida, cuja expressão é correlacionada a ser capaz de distinguir entre os resultados.
[195] Um “gene” ou “sequência expressa” é um polinucleotídeo que codifica e expressa, de uma maneira detectável, um produto discreto, seja de RNA ou proteináceo por natureza. É entendido que mais do que um polinucleotídeo pode ser capaz de codificar um produto discreto. O termo inclui alelos e polimorfismos de um gene ou sequência expressa que codifica o mesmo produto, ou um análogo funcionalmente associados (incluindo ganho, perda, ou modulação de função) do mesmo, com base na localização cromossômica e na capacidade de recombinar durante mitose normal.
[196] Os termos “correlaciona” ou “correlação”, ou equivalentes dos mesmos, referem-se a uma associação entre a expressão de dois ou mais genes e um estado fisiológico de uma célula da próstata para a exclusão de um ou mais outros estados, conforme identificado pelo uso de métodos, conforme aqui descritos. Um gene pode ser expresso em níveis mais altos ou mais baixos e ainda ser correlacionado a um ou mais dentre estado ou resultado de câncer de próstata, ou pré ou pós- prostatectomia.
[197] Como usado aqui, um “gene marcador” ou “sequência de gene marcador” cuja expressão é analisada no contexto da presente invenção, pode também ser descrito como um gene de interesse (GOI).
[198] Em modalidades da invenção, a intensidade da expressão de um dado gene marcador (ou sequência expressa) é normalizada (como em relação à expressão de um gene de referência que é expresso em níveis relativamente constantes, ou a expressão do GOI é medida ao longo de todas as amostras disponíveis e o valor da expressão é normalizado) para fornecer um valor normalizado ou escore para a análise de correlação ou da assinatura da expressão do gene marcador (por exemplo, o PCPI) e outro parâmetro, por exemplo, dados clínicos. Em muitos casos, os dados de expressão são normalizados, centrados em uma mediana e transformados para log, conforme é de conhecimento do versado na técnica, antes de ser usado novamente, como em análise de agrupamento e discriminante. Onde mais de um nível de expressão é usado (como no caso de um perfil ou índice de expressão gênica, por exemplo o PCPI), os valores ou escores podem ser somados e, então, analisados como um valor agregado para avaliar a correlação ou conduzir a classificação com base na correlação.
[199] Um “polinucleotídeo” é uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, quer ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Este termo se refere apenas à estrutura primária da molécula. Dessa forma, este termo inclui DNA e RNA de fita dupla e de fita simples. Ele também inclui tipos conhecidos de modificações, incluindo marcadores conhecidos na técnica, metilação, “terminações”, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, e modificações de internucleotídeo como ligações sem carga (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), bem como formas não modificadas do polinucleotídeo.
[200] O termo “amplificar” é usado no sentido amplo para significar que a criação de um produto de amplificação pode ser feita enzimaticamente com DNA ou RNA polimerases. “Amplificação,” como usado na presente invenção, refere-se geralmente ao processo de produzir cópias múltiplas de uma sequência desejada, particularmente as de uma amostra. “Múltiplas cópias” significa ao menos 2 cópias. Uma “cópia” não necessariamente significa sequência perfeita de complementaridade ou identidade para a sequência de modelo. É possível usar, ainda, qualquer método de sequenciamento adicional conhecido na técnica para identificar as sequências de GOI.
[201] O termo “correspondente” pode referir-se a, quando adequado, uma molécula de ácido nucleico que tem uma quantidade substancial de identidade de sequência com uma outra molécula de ácido nucleico. Quantidade substancial significa ao menos 95%, geralmente ao menos 98% e, mais geralmente, de ao menos 99%, e a identidade de sequência é determinada com o uso do algoritmo BLAST, como descrito em Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403 - 410 (usando a configuração padrão, isto é, os parâmetros w=4, t=17). Métodos de amplificação de mRNA são de conhecimento geral na técnica, e incluem PCR por transcrição reversa (RT-PCR) e aqueles descritos no pedido de patente US n° de série 10/062.857 (depositado em 25 de outubro de 2001), bem como os pedidos de patente provisórios US 60/298.847 (depositado em 15 de junho de 2001) e 60/257.801 (depositado 22 de dezembro de 2000), todos os quais estão aqui incorporados por referência em sua totalidade como se integralmente apresentados. Um outro método que pode ser usado é a PCR quantitativa (ou Q-PCR). Alternativamente, o RNA pode ser diretamente marcado como o cDNA correspondente por métodos conhecidos na técnica.
[202] O termo “valor de Cq” define o ciclo de PCR em qRT-PCR (PCR quantitativo em tempo real) em que a fluorescência medida ultrapassa pela primeira vez a fluorescência de fundo.
[203] Um “microarranjo” é um arranjo linear ou bi-dimensional de regiões distintas, cada uma tendo uma área definida, formada sobre a superfície de um suporte genericamente sólido, como, mas não limitado a, vidro, plástico, ou membrana sintética. A densidade das regiões distintas em um microarranjo é determinada pelos números totais de polinucleotídeos imobilizados a serem detectados sobre a superfície de um suporte de fase sólida única, como ao menos cerca de 50/cm2, ao menos cerca de 100/cm2, ao menos cerca de 500/cm2, porém abaixo de cerca de 1.000/cm2 em algumas modalidades. Os arranjos podem conter menos que cerca de 500, cerca de 1.000, cerca de 1.500, cerca de 2.000, cerca de 2.500, cerca de 3.000, ou polinucleotídeos imobilizados no total. Como usado aqui, um microarranjo de DNA é um arranjo de oligonucleotídeos ou polinucleotídeos colocados em um chip ou outras superfícies usadas para hibridizar com polinucleotídeos amplificados ou clonados de uma amostra. Uma vez que a posição de cada grupo particular de polinucleotídeos no arranjo é conhecida, as identidades de uma amostra de polinucleotídeos pode ser determinada com base em sua ligação a uma posição particular no microarranjo.
[204] Como a invenção se baseia na identificação de genes (ou sequências expressas) que são superexpressas ou subexpressas, uma modalidade da invenção envolve determinar a expressão por hibridização de mRNA, ou uma versão amplificada ou clonada do mesmo (como cDNA ou DNA), de uma célula de amostra com um polinucleotídeo que é único para uma sequência gênica particular. Os polinucleotídeos desse tipo podem conter ao menos cerca de 20, ao menos cerca de 22, ao menos cerca de 24, ao menos cerca de 26, ao menos cerca de 28, ao menos cerca de 30, ou ao menos cerca de 32 pares de base consecutivos de uma sequência gênica que não é encontrada em outras sequências de genes. O termo “cerca de”, como usado na sentença anterior refere-se a um aumento ou diminuição de 1 do valor numérico declarado. Outras modalidades podem usar polinucleotídeos de ao menos ou cerca de 50, ao menos ou cerca de 100, ao menos ou cerca de 150, ao menos ou cerca de 200, ao menos ou cerca de 250, ao menos ou cerca de 300, ao menos ou cerca de 350, ao menos ou cerca de 400 de pares de bases de uma sequência de genes que não é encontrada em outras sequências de genes. O termo “cerca de”, como usado na sentença precedente refere-se a um aumento ou diminuição de 10% do valor numérico declarado. Tais polinucleotídeos podem também ser chamados de sondas de polinucleotídeos que são capazes de se hibridizar com as sequências dos genes, ou porções únicas dos mesmos, descritas aqui. Em muitos casos, as condições de hibridização são condições estringentes de cerca de 30% em volume a cerca de 50% de formamida e de cerca de 0,01 M a cerca de 0,15 M de sal para hibridização e de cerca de 0,01 M a cerca de 0,15 M de sal para condições de lavagem a cerca de 55 a cerca de 65°C ou mais, ou condições equivalentes às mesmas.
[205] Em outras modalidades, as sondas de oligonucleotídeos para uso na invenção podem ter cerca de ou 95%, cerca de ou 96%, cerca de ou 97%, cerca de ou 98% ou, cerca de ou 99% de identidade com as sequências do gene marcador cuja expressão será determinada. A identidade é determinada usando o algoritmo BLAST, como descrito acima. Tais sondas podem também ser descritas com base na capacidade de hibridizar a genes marcadores expressos usados em métodos da invenção sob condições estringentes, conforme descrito acima, ou condições equivalentes às mesmas.
[206] Em muitos casos, as sequências são aquelas de mRNA codificado pelos genes marcadores, o cDNA correspondente a estes mRNAs, e/ou versões amplificadas destas sequências. Em algumas modalidades da invenção, as sondas de polinucleotídeos são imobilizadas em um arranjo, outros dispositivos ou em pontos individuais que localizam as sondas.
[207] Os marcadores adequados que podem ser usados de acordo com a invenção, incluem radioisótopos, cromóforos de nucleotídeos, enzimas, substratos, moléculas fluorescentes, porções quimioluminescentes, partículas magnéticas, porções bioluminescentes, e similares. Como tal, uma marcação é qualquer composição detectável por meios espectroscópico, fotoquímico, bioquímico, imunoquímico, elétrico, óptico ou químico. O termo “suporte” refere-se a suportes convencionais, como microesferas, partículas, varetas, fibras, filtros, membranas e suportes de silano ou silicato como lâminas de vidro.
[208] Como usado aqui, uma “amostra de tecido de próstata” ou “amostra de célula de câncer de próstata” refere- se a uma amostra de tecido de próstata isolada de um indivíduo, como um acometido por câncer de próstata. A amostra pode ser de material removido por meio de uma prostatectomia, como uma prostatectomia radical. Alternativamente, elas são obtidas por outros meios, como por uma biópsia por agulha (núcleo) ou outras técnicas de biópsia, como biópsias lateralmente direcionadas, a abordagem convencional de biópsia sextante, diferentes combinações de biópsia lateral e sextante como técnicas ampliadas, biópsia da próstata guiada por ultrassom transretal e outras, como conhecidas pelos versados na técnica. Essas amostras são isolados primários (em contraste com células cultivadas) e podem ser coletadas por quaisquer meios adequados reconhecidos na técnica. Em algumas modalidades, a “amostra” pode ser coletada por um método invasivo, incluindo, mas não limitado a, biópsia cirúrgica. A amostra pode conter células de tumor de próstata que são isoladas por métodos conhecidos ou outros métodos adequados, conforme considerado desejável pelo versado na técnica. Os métodos de isolamento incluem, mas não se limitam a, microdissecção, microdissecção e captura a laser (LCM) ou microdissecção a laser (LMD) antes do uso de acordo com a invenção. “Expressão” e “expressão gênica” incluem a transcrição e/ou tradução do material do ácido nucleico. Para uso na presente invenção, o termo “compreendendo” e seus cognatos são usados em seu sentido inclusivo; ou seja, equivalente ao termo “incluindo” e seus cognatos correspondentes.
[209] As condições que “permitem” que um evento ocorra ou as condições que são “adequadas” para que um evento ocorra, como hibridização, extensão da cadeia e similares, ou condições “adequadas” são condições que não evitam que tais eventos ocorram. Dessa forma, essas condições permitem, melhoram, facilitam e/ou conduzem ao evento. Tais condições, conhecidas na técnica e aqui descritas, dependem, por exemplo, da natureza da sequência de nucleotídeos, temperatura e condições do tampão. Essas condições dependem também de qual evento é desejado, como hibridização, clivagem, extensão de cadeia ou transcrição.
[210] “Detecção” inclui qualquer meio de detecção, incluindo de detecção direta e indireta da expressão gênica e mudanças na mesma. Por exemplo, produtos “menos detectáveis” podem ser observados diretamente ou indiretamente, e o termo indica qualquer redução (incluindo a ausência de sinal detectável). De modo similar, “mais detectável” significa qualquer aumento, observado direta ou indiretamente.
[211] “Prostatectomia” refere-se à remoção do tecido da próstata por um profissional versado, como um cirurgião. Alguns exemplos não limitadores incluem prostatectomia radical; prostatectomia aberta (tradicional) (que envolve uma incisão através do períneo); prostatectomia laparoscópica; e prostatectomia robótica (de preservação do nervo).
[212] “Escore de Gleason” refere-se à classificação de uma amostra de câncer de próstata por um patologista treinado de acordo com o sistema de Gleason, que atribui um escore de Gleason usando-se números de 1 a 5, com base em similaridades nas células de uma amostra de tecido de próstata com o tecido canceroso ou com o tecido de próstata normal. Ao tecido que se parece mais com o tecido da próstata normal é dado uma pontuação ou grau de 1, enquanto um tecido que não apresenta características normais e as células parecem ser espalhadas aleatoriamente através da próstata é dado uma pontuação ou grau de 5. Pontuações ou graus de 2 a 4, inclusive, têm características entre essas possibilidades. Devido aos cânceres de próstata poderem ter áreas com diferentes pontuações ou grau, pontuações ou graus separados são dadas para as duas áreas que formam a maior parte do tecido. As duas pontuações ou graus são adicionadas para produzir um escore de Gleason (ou soma de Gleason) entre 2 e 10.
[213] Os níveis de expressão dos genes marcadores aqui mencionados se correlacionam com os resultados clínicos, conforme descrito aqui, e, portanto, podem ser usados como preditores, conforme descrito na presente invenção. Os genes identificados foram relatados como participando em várias funções celulares conforme descrito em http://csbi.ltdk. Helsinki.fi/anduril/tcga- gbm/table4_2.html. Nos métodos subjacentes das modalidades da presente invenção, esses dados foram correlacionados ao suposto marcador gênico prognóstico PDE4D7, conforme descrito em WO2010131194 e WO2010131195, cujo conteúdo está aqui incorporado a título de referência. No contexto da presente invenção, as vias moleculares que mostraram correlação significativa foram selecionadas para análise a jusante (Figura 2).
[214] Em modalidades da invenção, o padrão de expressão do gene marcador (ou o índice PCPI) pode estar correlacionado aos níveis de PSA pré ou pós-cirurgia, escore de Gleason e estágio de pT. O perfil tem também a capacidade de estratificar amostras com escores de Gleason de <=6 e 7 em baixo e alto risco de falha de PSA. Na análise multivariada com fatores prognósticos conhecidos, o perfil era o único preditor que permanece estatisticamente significativo (p<0,05). Portanto, a detecção do perfil na biópsia, ou no tecido removido durante a prostatectomia, permite a distinção de câncer indolente do agressivo.
[215] Modalidades da presente invenção, portanto, se referem à identificação e uso de padrões da expressão gênica (ou perfis ou “assinaturas”) que discriminam entre (ou estão correlacionados com) resultados de sobrevida e recidiva do câncer de próstata em um indivíduo. Tais padrões podem ser determinados pelos métodos da invenção por uso de várias amostras de células ou tecidos de referência, como aquelas analisadas por um patologista versado na patologia de câncer de próstata, que reflete células de câncer de próstata em oposição a células normais ou outras não cancerosas. Os resultados apresentados pelos indivíduos dos quais as amostras foram obtidas podem estar correlacionados com os dados de expressão para identificar padrões correlacionados aos resultados. Como o perfil de expressão gênica global difere de uma pessoa para outra, de um câncer para outro e de uma célula para outra, as correlações entre certas células e genes expressos e subexpressos podem ser feitas como descrito aqui para identificar genes que são capazes de discriminar os resultados de câncer de próstata.
[216] Em modalidades da presente invenção, genes com correlações significativas com resultados de sobrevida, metástase ou recidiva de câncer de próstata (ou pré ou pós- prostatectomia) são usados para distinguir entre os resultados. Os padrões ou índices são capazes de prever a classificação de uma amostra desconhecida com base na expressão dos genes usados para discriminação nos modelos.
[217] Em modalidades da presente invenção, genes marcadores (sequências) expressos em correlação com os resultados do câncer de próstata, ou pré ou pós- prostatectomia/tratamento primário, proporcionam a capacidade de concentrar a análise da expressão gênica apenas nos genes que contribuem para a capacidade de estratificar um indivíduo, entre diferentes resultados.
[218] Como ficará entendido pelos versados na técnica, que os padrões de expressão (e o PCPI) são altamente úteis para discriminar entre diferentes resultados no câncer de próstata, ou pré ou pós-prostatectomia, e podem ser prontamente realizados pelos versados na técnica para permitir a geração de modelos, conforme descrito acima, para predizer o estado de uma amostra desconhecida com base nos níveis de expressão desses genes.
[219] Para determinar os níveis de expressão (regulada positivamente ou regulada negativamente) de genes (sequências expressas) na prática da invenção, qualquer método conhecido na técnica pode ser usado. Em algumas modalidades, a expressão com base na detecção de RNA que se hibridiza com os genes (ou sequências de sonda) identificada e descrita na presente invenção é usada. Isso é prontamente realizado por qualquer método de detecção ou de amplificação + detecção de RNA conhecido ou reconhecido como equivalente na técnica, como, mas não se limitando a, sequenciamento de RNA, transcrição reversa- PCR (RT-PCR), PCR em tempo real, RT-PCR em tempo real, os métodos revelados no pedido de patente US n° 10/062.857 (depositado em 25 de outubro de 2001), bem como os pedidos de patente provisórios US 60/298.847 (depositado em 15 de junho de 2001) e 60/257.801 (depositado 22 de dezembro de 2000) e os métodos para detectar a presença ou ausência de sequências estabilizadoras ou desestabilizadoras de RNA.
[220] Alternativamente, a expressão baseada na detecção do estado do DNA pode ser usada. A detecção do DNA de um gene identificado como metilado ou deletado pode ser usada para genes que têm expressão reduzida em correlação com um resultado de câncer de próstata específico ou pré ou pós- prostatectomia. Isso pode ser prontamente realizado por métodos à base de PCR conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados a, Q-PCR.
[221] Por outro lado, a detecção do DNA de um gene identificado como ampliado pode ser usada para genes que têm expressão aumentada em correlação com um resultado de câncer de próstata específico ou pré ou pós-prostatectomia. Isso pode ser prontamente feito por meio de métodos com base em PCR, hibridização fluorescente in situ (FISH) e e hibridização de cromossomos in situ (CISH) conhecidos na técnica.
[222] Uma expressão com base na detecção de presença, aumento ou redução nos níveis ou atividade de proteína pode também ser usada, por exemplo, em adição ao cálculo de um PCPI de uma amostra individual/paciente. A detecção pode ser feita por qualquer método com base em imunoistoquímica (IHC), sangue (especialmente para proteínas secretadas), anticorpos (incluindo autoanticorpos contra a proteína), célula esfoliada (do câncer), espectroscopia de massa e imagem (incluindo uso de ligante marcado) conhecido na técnica e reconhecido como apropriado para a detecção da proteína. Métodos com base em anticorpos e imagem são adicionalmente utilizáveis para a localização de tumores após determinação de câncer pelo uso de células obtidas por um procedimento não invasivo (como lavagem ou aspiração por agulha), onde a fonte das células cancerosas não é conhecida. Um anticorpo ou ligante marcado pode ser usado para localizar o(s) carcinoma(s) dentro de um paciente.
[223] Modalidades da presente invenção referentes ao uso de um ensaio com base em ácido nucleico para determinar a expressão são realizadas por imobilização de uma ou mais sequências de genes marcadores identificados na presente invenção como um polinucleotídeo em um suporte sólido, incluindo, mas não limitado a, um substrato sólido como uma matriz ou em contas ou tecnologia com base em contas conforme conhecido na técnica. Em algumas modalidades, o ensaio é o ensaio DASL (anelamento, seleção, extensão e ligação mediada por cDNA) disponível junto à Illumina. Alternativamente, ensaios de expressão com base em solução conhecidos na técnica podem também ser usados. As sondas de polinucleotídeo imobilizadas podem ser exclusivas ou de outro modo específicas para os genes revelados (ou sequências expressas) de modo que os polinucleotídeos são capazes de se hibridizar a um DNA ou RNA correspondendo aos genes (ou sequências). Esses polinucleotídeos podem ter o comprimento total dos genes (ou das sequências expressas) ou podem ser sondas de comprimento mais curto (até um nucleotídeo mais curto que a sequência de comprimento total conhecida na técnica por deleção da extremidade 5 ‘ ou 3 ‘ da sequência) que são opcionalmente minimamente interrompidas (como por desemparelhamentos ou pares de bases não complementares inseridos), de modo que sua hibridização com um DNA ou RNA cognato correspondente os genes (ou sequências) não seja afetada. Em muitas modalidades, uma sonda de polinucleotídeos contém a sequência 3‘ de um gene ou sequência expressa revelada. As sondas de polinucleotídeos contendo mutações relativas às sequências dos genes revelados podem também ser usadas contanto que a presença das mutações ainda permita que a hibridização produza um sinal detectável. Os polinucleotídeos imobilizados podem ser usados para determinar o estado das amostras de ácidos nucleicos preparadas a partir da(s) célula(s) de próstata para as quais o resultado do indivíduo da amostra (por exemplo, paciente do qual a amostra é obtida) não é conhecido ou para confirmação de um resultado que já é atribuído ao indivíduo da amostra. Sem limitar a invenção, essa célula pode ser de um paciente com câncer de próstata, como um material removido por prostatectomia. O(s) polinucleotídeo(s) imobilizado(s) precisa(m) ser apenas suficiente(s) para especificamente se hibridizar com as moléculas de ácidos nucleicos correspondentes derivadas da amostra em condições adequadas. Embora a expressão de mesmo um único gene correlacionado pode proporcionar exatidão adequada na discriminação entre dois resultados de câncer de próstata, a invenção inclui o uso de níveis de expressão de mais de um gene ou sequência expressa. Em particular, os genes (sequências expressas) do conjunto de 17, 18, 19 ou o conjunto de 57 mencionados na seção de exemplos (acima) são usados.
[224] Em algumas modalidades, o ácido nucleico derivado da amostra de células de câncer de próstata pode ser, de preferência, amplificado pelo uso de iniciadores apropriados (como usado em PCR), de modo que apenas os genes a serem analisados são amplificados para reduzir sinais de fundo contaminadores de outros genes ou sequências expressos na amostra. O tamanho de um amplicon de PCR da invenção pode ser de qualquer tamanho, incluindo pelo menos cerca de 50, pelo menos ou cerca de 100, ou pelo menos ou cerca de 150, pelo menos ou cerca de 200, pelo menos ou cerca de 250, pelo menos ou cerca de 300, pelo menos ou cerca de 350, pelo menos ou cerca de 400 nucleotídeos consecutivos, com inclusão da porção complementar aos iniciadores de PCR usados. É claro que a PCR pode ser opcionalmente acoplada por transcrição reversa (ou RT-PCR no caso de RNA como material de partida) ou PCR quantitativa, como PCR em tempo real, ou combinações das mesmas. É claro que o RNA das amostras aqui descritas pode ser preparado e usado por meios prontamente conhecidos pelos versados na técnica. Alternativamente, e onde genes múltiplos devem ser analisados ou onde poucas células (ou uma célula) são usadas, o ácido nucleico da amostra pode ser totalmente amplificado antes de hibridização com as sondas de polinucleotídeo imobilizadas, como em um arranjo ou microarranjo. Naturalmente, o RNA, ou seu cDNA correspondente homólogo, pode ser diretamente marcado e usado, sem amplificação, pelos métodos conhecidos na técnica. Uma modalidade preferencial dos métodos para detecção dos genes marcadores descritos na presente invenção é o sequenciamento de RNA.
[225] A invenção apresenta um conjunto de critérios mais objetivo, sob a forma de perfis de expressão gênica de um conjunto de genes marcadores isolado, para diferenciar (ou delinear) resultados de câncer de próstata, ou pré ou pós-prostatectomia, e permite a predição de uma predisposição de doença agressiva versus indolente. Em algumas modalidades, os ensaios são usados para discriminar entre resultados melhores e piores dentro de cerca de 6 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 7 anos, 10 anos, 15 anos ou até mais.
[226] Embora resultados melhores ou piores de recidiva, metástase e/ou sobrevida possam ser definidos relativamente em comparação um com o outro, um resultado “melhor” ou um “bom prognóstico” pode ser visto como melhor que 50% de chance de recidiva de câncer e/ou de 50% de chance de sobrevida após 60 meses após intervenção cirúrgica para remover tumor(es) de câncer de próstata. Um resultado “melhor” ou um “bom prognóstico” pode também ser melhor que cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% ou cerca de 90% de recidiva de câncer e/ou chance de sobrevida de cerca de 60 meses após de intervenção cirúrgica. Um “mau” resultado/prognóstico pode ser visto como um 50% ou mais de chance de recidiva de câncer e/ou menos que 50% de chance de sobrevida após cerca de 60 meses após intervenção cirúrgica para remover o tumor de câncer de próstata. O PCPI e os métodos, de acordo com a invenção, ajudam a classificar os pacientes nos que apresentam o prognóstico acima.
[227] Os métodos apresentados podem também ser usados com material de tecido sólido. Por exemplo, uma biópsia sólida pode ser coletada e preparada para visualização seguida pela determinação da expressão de dois ou mais genes ou sequências expressas identificadas na presente invenção para determinar o resultado do câncer de próstata, ou pré ou pós- prostatectomia. Um desses meios é mediante o uso de hibridização in situ com sonda(s) de identificação de polinucleotídeos para analisar a expressão do dito gene ou genes.
[228] Em algumas modalidades, a detecção da expressão gênica das amostras pode ser pelo uso de um microarranjo único capaz de analisar a expressão gênica de alguns ou todos os genes da presente invenção para maior conveniência e precisão.
[229] Outros usos da invenção incluem fornecer a capacidade para identificar amostras de células de câncer de próstata, conforme correlacionados com resultados específicos de sobrevida ou recidiva de câncer de próstata para pesquisa e estudo adicionais. Isso fornece uma vantagem específica em muitos contextos que exigem a identificação de células com base em critérios moleculares ou genéticos objetivos.
[230] Os materiais para uso nos métodos da presente invenção são idealmente apropriados para preparação de kits produzidos de acordo com procedimentos bem conhecidos. A invenção, portanto, fornece kits compreendendo agentes para a detecção da expressão dos genes e sequências apresentados para identificação de resultados do câncer de próstata, ou pré ou pós-prostatectomia. Tais kits opcionalmente compreendem o agente com uma descrição ou rótulo ou instruções de identificação relacionados ao seu uso nos métodos da presente invenção. Esse kit pode compreender recipientes, cada um com um ou mais dos vários reagentes (tipicamente na forma concentrada) usados nos métodos, incluindo, por exemplo, microarranjos, tampões, os nucleotídeos trifosfatos adequados pré-fabricados (por exemplo, dATP, dCTP, dGTP e dTTP; ou rATP, rCTP, RGTP e UTP), transcriptase reversa, DNA polimerase, RNA polimerase e um ou mais complexos de iniciadores da presente invenção (por exemplo, poli(T) de comprimento adequado ou iniciadores aleatórios ligados a um promotor reativo com a RNA polimerase). Um conjunto de instruções também será tipicamente incluído.
[231] Os métodos fornecidos pela invenção podem também ser automatizados no todo ou em parte. Todos os aspectos da invenção podem também ser praticados de modo que consistam essencialmente em um subconjunto dos genes apresentados para a exclusão de material irrelevante para a identificação de resultados de recidiva, metástase e/ou sobrevida de câncer de próstata através de uma amostra contendo uma célula.
[232] No contexto dos métodos da presente invenção, o PCPI é usado para diagnosticar câncer de próstata em pacientes, identificar câncer de próstata em pacientes e estabelecer um prognóstico para pacientes com câncer de próstata, para determinar a predisposição a desenvolver doença agressiva versus indolente e para estratificar pacientes com câncer de próstata de modo que uma decisão possa ser tomada pelo médico do tratamento sobre como, se possível, um paciente deve ser tratado. O PCPI pode ser usado como parâmetro único para os propósitos acima ou pode ser usado em combinação com outro método diagnóstico, prognóstico ou de estratificação conhecidos para fornecer suporte adicional ao médico.
[233] O termo “diagnóstico de câncer de próstata”, como usado aqui, significa que um paciente ou indivíduo pode ser considerado como estando acometido por um câncer de próstata, quando o nível de expressão dos GOIs da presente invenção é regulado positiva ou negativamente, comparado a um nível de controle, conforme definido anteriormente na presente invenção, de preferência, se comparado ao nível de controle normal, conforme definido anteriormente na presente invenção, de modo que o PCPI seja significativamente maior que/diferente daquele encontrado em um tecido de controle. O termo “diagnóstico” refere-se também à conclusão obtida pelo processo de comparação.
[234] Em uma outra modalidade da presente invenção, o diagnóstico pode ser combinado com a elucidação de níveis de expressão do biomarcador de câncer adicionais, particularmente de biomarcadores de câncer de próstata. Vários de câncer de próstata específicos seriam conhecidos pelo versado na técnica. Por exemplo, a expressão de biomarcadores como ASP pode ser testada.
[235] O câncer de próstata pode ser considerado como sendo diagnosticado quando o nível de expressão do GOI da presente invenção é regulado positiva ou negativamente, em comparação ao nível de controle normal, conforme anteriormente definido neste documento, e quando o PCPI é significativamente mais alto que o obtido com o material de controle.
[236] Em uma outra modalidade preferencial, um câncer de próstata pode ser considerado como sendo diagnosticado ou uma predisposição para desenvolver doença agressiva versus indolente a ser determinada, se o nível de expressão do GOI mencionado neste documento for regulado positiva ou negativamente por um valor entre 20% e 80%, de preferência, por um valor de 30%, 40%, 50%, 60% ou 70% em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle, de preferência, um nível de controle normalizado. O nível de controle pode ser um nível de controle normal ou um nível de controle canceroso como aqui definido acima. Em uma modalidade particularmente preferencial, um câncer de próstata pode ser considerado como sendo diagnosticado ou uma predisposição para desenvolver doença agressiva versus indolente se o nível de expressão, conforme anteriormente definido neste documento, é regulado positiva ou negativamente por um fator de 1,5 a 10 vezes, de preferência, por um fator de 2 a 5 vezes em uma amostra de teste em comparação com um nível de controle, em particular, um tecido saudável ou um tumor de próstata benigno ou, muito preferencialmente, em comparação com o tecido do câncer de próstata do mesmo paciente no diagnóstico inicial.
[237] O termo “detecção de câncer de próstata”, como usado aqui, significa que a presença de uma doença ou distúrbio de câncer de próstata em um organismo pode ser determinada ou de modo que uma doença ou distúrbio possam ser identificados em um organismo. A determinação ou identificação de uma doença ou distúrbio de câncer de próstata pode ser feita por meio de uma comparação do nível de expressão dos GOIs da presente invenção e o nível de controle normal, conforme anteriormente definido neste documento, ou pela determinação do PCPI. O câncer de próstata não progressivo pode ser detectado quando o nível de expressão do GOI é regulado positiva ou negativamente em comparação ao nível de controle normal conforme anteriormente definido neste documento. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, um câncer de próstata pode ser detectado se o nível de expressão dos GOIs for similar a um nível de expressão de uma célula ou linhagem celular de câncer de próstata estabelecida, por exemplo, estabelecida independentemente, por exemplo, uma linhagem celular de câncer ou uma linhagem celular conforme anteriormente definido neste documento.
[238] Os termos “monitoramento de câncer de próstata” e “identificação de um indivíduo com uma predisposição a câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença” (isto é, identificação de doença agressiva versus doença indolente), como usado na presente invenção, refere-se ao acompanhamento de um doença ou distúrbio de câncer de próstata diagnosticado ou detectado, por exemplo, durante ou após um procedimento de tratamento ou durante ou após um certo período de tempo, tipicamente, durante 2 meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, 5 anos, 10 anos, ou qualquer outro período de tempo durante ou após o início ou fim do tratamento primário. O termo “acompanhamento” significa que estados da doença ou o PCPI, conforme anteriormente definido neste documento e, em particular, alterações desses estados de doença ou PCPI podem ser detectados comparando-se os níveis de expressão dos GOIs da presente invenção em uma amostra a um nível de controle normal, conforme anteriormente definido neste documento, de preferência, um nível de expressão de controle derivado de um controle de tumor benigno, ou um controle saudável ou o nível de expressão de uma célula ou linhagem celular de câncer de próstata estabelecida, por exemplo, independentemente estabelecida, ou uma linhagem celular em qualquer tipo de segmento de tempo periódico, por exemplo, a cada semana, a cada 2 semanas, a cada mês, a cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses, a 1,5 anos, a cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 anos, durante qualquer período de tempo, por exemplo, durante 2 semanas, 3 semanas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 anos, respectivamente. A célula ou linhagem celular de câncer de próstata estabelecido, por exemplo, independentemente estabelecido, que dá origem a um nível de controle adicional pode ser derivada de amostras que correspondem a diferentes estágios de desenvolvimento de câncer, por exemplo, estágios 0 e I a IV do sistema de classificação de TNM. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o termo refere-se ao acompanhamento de um câncer de próstata diagnosticado, por exemplo, um câncer de próstata maligno sensível a hormônio. O monitoramento pode também incluir a detecção da expressão de genes ou elementos gênicos adicionais, por exemplo, genes constitutivos, como GAPDH ou PBGD. A presente invenção também se refere a métodos de monitoramento em pacientes com o objetivo de identificar as assinaturas gênicas apresentadas aqui usando o PCPI conforme revelado ao longo do relatório descritivo para identificar os pacientes com probabilidade de desenvolver câncer de próstata agressivo. Esses pacientes serão, então, tratados conforme descrito em todo o relatório descritivo.
[239] O termo “prognóstico de câncer de próstata (agressivo)”, como usado na presente invenção, refere-se à previsão do curso ou resultado de um câncer de próstata agressivo diagnosticado ou detectado, por exemplo, durante um certo período de tempo, durante um tratamento ou após um tratamento. O termo refere-se também a uma determinação de uma probabilidade de sobrevida ou recuperação da doença, bem como a uma previsão da expectativa de tempo de sobrevida de um indivíduo. Um prognóstico pode, especificamente, envolver estabelecer a probabilidade de sobrevida de um paciente durante um período de tempo no futuro, como 6 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, 5 anos, 10 anos ou qualquer outro período de tempo.
[240] Os termos “progressão para câncer de próstata” e “progressão para câncer de próstata agressivo (versus indolente)”, como usados aqui, referem-se a uma alteração entre diferentes estágios do desenvolvimento de câncer, por exemplo, estágios 0 e I a IV da classificação TNM, ou qualquer outro estágio ou subetapa, partindo de uma condição saudável até câncer de próstata maligno, e câncer de próstata sensível a hormônio ou maligno resistente a hormônio. Essas alterações são, tipicamente, acompanhadas por uma modificação no nível de expressão dos genes marcadores ou GOIs e um PCPI, como usado aqui, em uma amostra de teste em comparação com uma amostra de teste anterior do mesmo indivíduo, por exemplo, em comparação com uma amostra derivada de um controle de tumor de próstata benigno ou controle de tecido saudável. Uma progressão para câncer de próstata agressivo pode ser considerada como sendo detectada ou diagnosticada se o nível de expressão dos GOIs usado para calcular o PCPI, conforme anteriormente definido neste documento, for diferente, por exemplo, em um valor de entre 3% a 50%, de preferência, em um valor de 10%, 15%, 20% ou 25% em uma amostra de teste, em comparação com um PCPI anterior calculado a partir dos valores de expressão gênica em uma amostra de teste do mesmo indivíduo. A modificação pode ser detectada ao longo de qualquer período de tempo, de preferência, acima de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 anos, isto é, o valor indicado acima, pode ser calculado comparando-se o nível de expressão dos genes marcadores ou GOIs ou PCPI em um primeiro ponto no tempo e em um segundo ponto no tempo após o período de tempo indicado acima.
[241] Em uma modalidade particularmente preferencial da presente invenção, o termo “progressão para câncer de próstata” refere-se a uma alteração do estado saudável ou um estado de tumor de próstata benigno para um estado de tumor de próstata maligno. A progressão de um estado saudável para um estado de câncer de próstata pode ser considerada como sendo detectada ou diagnosticada se o PCPI, conforme definido anteriormente neste documento, for mais alto em um valor entre 20% e 50%, de preferência, em um valor de 20%, 25%, 30% ou 35%, em uma amostra de teste em comparação com uma amostra de teste anterior do mesmo indivíduo, que foi diagnosticado como sendo saudável. Alternativamente, as amostras de teste de comparação de outros indivíduos podem ser usadas, por exemplo, amostras de indivíduos saudáveis. É também contemplado o uso de informações do banco de dados disponíveis sobre a expressão ou uso das amostras de coleta de célula de câncer.
[242] A progressão de um estado de tumor de próstata benigno para um câncer de próstata maligno pode ser considerada como sendo detectada ou diagnosticada se o PCPI, conforme anteriormente definido neste documento, for mais alto em um valor entre 3% e 30%, de preferência, em um valor de 5%, 10%, 15% ou 20%, em uma amostra de teste em comparação com uma amostra de teste anterior do mesmo indivíduo, que teve tumor de próstata benigno diagnosticado. Alternativamente, para comparação, amostras de teste de outros indivíduos podem ser usadas, por exemplo, amostras de testes de indivíduos com tumores de próstata benignos diagnosticados. É também contemplado o uso de informações do banco de dados disponíveis sobre a expressão ou uso das amostras de coleta de célula de câncer.
[243] A modificação pode ser detectada ao longo de qualquer período de tempo, de preferência, acima de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 anos, isto é, o valor indicado acima, pode ser calculado comparando-se o nível de expressão dos genes marcadores ou GOIs em um primeiro ponto no tempo e em um segundo ponto no tempo após o período de tempo indicado acima.
[244] Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se ao diagnóstico e detecção de uma predisposição para o desenvolvimento de câncer de próstata. Uma “predisposição para desenvolver câncer de próstata (agressivo)”, no contexto da presente invenção, é um estado de risco de desenvolver câncer de próstata (agressivo). De preferência, uma predisposição para desenvolver câncer de próstata agressivo pode estar presente nos casos em que o nível de expressão de GOIs ou o PCPI, conforme definido aqui, é significativamente diferente de um nível de controle, conforme definido aqui, isto é, um nível de expressão de referência ou PCPI de referência, derivado de tecidos ou amostras de um paciente obtidos antes do diagnóstico inicial de câncer de próstata, de modo que também o PCPI calculado com base na expressão gênica em tecidos cancerosos seja mais alto que o PCPI obtido da amostra de controle. Dessa forma, uma predisposição para câncer de próstata agressivo pode ser considerada como sendo diagnosticada ou detectada se a situação acima descrita for observada.
[245] Em geral, e também no estabelecimento do PCPI, a diferença entre os níveis de expressão de uma amostra biológica de teste e um nível de controle pode ser normalizada para o nível de expressão de outros ácidos nucleicos de controle, por exemplo, genes constitutivos cujos níveis de expressão não diferem dependendo do estado canceroso ou não canceroso da célula. Genes de controle exemplificadores incluem, entre outros, beta-actina, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), porfobilinogênio desanimase (PBGD) e similares.
[246] No contexto da presente invenção, os termos “diagnosticar” e “prognosticar” são também destinados a incluir análises de predições e probabilidade. O PCPI, como um parâmetro, pode, consequentemente, ser usado clinicamente para tomar decisões relacionadas a modalidades de tratamento, incluindo intervenção terapêutica ou critérios diagnósticos, como uma vigilância da doença. De acordo com a presente invenção, um resultado intermediário para o exame da condição de um paciente pode ser fornecido. Esses resultados intermediários podem ser combinados com informações adicionais para ajudar o médico, enfermeiro ou outro profissional de saúde a diagnosticar um paciente com a doença. Alternativamente, a presente invenção pode ser usada para detectar células cancerosas em um tecido derivado de um paciente e para fornecer ao médico informações úteis para diagnosticar que o paciente apresenta a doença.
[247] Um paciente ou indivíduo a ser diagnosticado, monitorado ou no qual um câncer de próstata, uma progressão para câncer de próstata agressivo versus indolente ou uma predisposição para câncer de próstata agressivo versus indolente devem ser detectados, ou prognosticados de acordo com a presente invenção, é um animal, de preferência, um mamífero, com mais preferência, um ser humano. O uso de ferramentas moleculares de imageamento, conforme é conhecido pelo versado na técnica, por exemplo, tecnologia de imageamento por ressonância magnética (IRM) e/ou imageamento por ressonância magnética por emissão de fótons (IMP) e/ou IRM multiparamétrica (mpIRM) além do PCPI como marcador para diagnosticar, detectar, monitorar ou prognosticar câncer de próstata da progressão para câncer de próstata agressivo versus indolente.
[248] Em um outro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição para diagnosticar, detectar, monitorar ou prognosticar câncer de próstata ou progressão para câncer de próstata ou uma predisposição para câncer de próstata em um indivíduo. A composição, de acordo com a presente invenção, pode compreender um ligante com afinidade por ácido nucleico para o(s) produto(s) de expressão de GOI.
[249] O termo “ligante com afinidade por ácido nucleico para o produto de expressão de GOI”, como usado aqui, refere-se a uma molécula de ácido nucléico capaz de especificamente se ligar a um transcrito de GOI. O ligante com afinidade por ácido nucleico pode também ser capaz de se ligar especificamente a uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com as sequências de GOI, ou quaisquer fragmentos das ditas sequências.
[250] O termo “produto de expressão”, como usado aqui, refere-se a uma transcrição de um GOI ou molécula de mRNA gerada pela expressão de GOI. Com mais preferência, o termo refere-se a um transcrito processado conforme definido aqui acima.
[251] A composição da presente invenção pode, por exemplo, compreender um conjunto de oligonucleotídeos específicos para os produtos de expressão de GOI e/ou uma sonda específica para os produtos de expressão de GOI. O termo “oligonucleotídeo específico para os produtos de expressão de GOI”, como usado aqui, refere-se a uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma fita senso ou antissenso de um GOI.
[252] O oligonucleotídeo pode ter qualquer comprimento e sequência conhecidos pelo versado na técnica, como derivável a partir da sequência do GOI ou seu complemento. Tipicamente, os oligonucleotídeos podem ter um comprimento entre 8 e 60 nucleotídeos, de preferência, entre 10 e 35 nucleotídeos, com mais preferência, um comprimento de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. As sequências de oligonucleotídeos, por exemplo, oligonucleotídeos utilizáveis como iniciadores de sentido direto e reverso específicos para produtos de expressão do GOI podem ser definidas com a ajuda de ferramentas de software conhecidas pelo versado na técnica.
[253] O termo “sonda específica para os produtos de expressão de GOI”, como usado aqui, refere-se a uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma fita senso ou antissenso dos GOIs aqui descritos.
[254] A sonda pode ter qualquer comprimento e sequência adequados conhecidos pelo versado na técnica, como derivável a partir da sequência dos GOIs descritos na presente invenção. Tipicamente, a sonda pode ter um comprimento entre 6 e 300 nucleotídeos, de preferência, entre 15 e 60 nucleotídeos, com mais preferência, um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 nucleotídeos. Sequências de sondas específicas para o produto de expressão dos GOIs podem ser definidas com a ajuda de ferramentas de software conhecidas pelo versado na técnica.
[255] O ligante com afinidade por ácido nucleico, conforme descrito acima na presente invenção, pode ser marcado com vários marcadores ou pode ser detectado por um ligante de afinidade secundário, marcado com vários marcadores, para permitir a detecção, visualização e/ou quantificação. Isso pode ser obtido usando quaisquer marcadores adequados, que podem ser conjugados ao ligante de afinidade capazes de interação com o produto de expressão ou a qualquer ligante de afinidade secundário, com o uso de qualquer técnica adequada ou métodos conhecidos pelo versado na técnica. O termo “ligante de afinidade secundário” refere- se a uma molécula que é capaz de ligação ao ligante de afinidade, como aqui definido acima (isto é um “ligante de afinidade primário” se for usado no contexto de um sistema com dois ligantes de afinidade interagindo). A interação de ligação é, de preferência, uma ligação específica.
[256] Exemplos de marcadores que podem ser conjugados a ligantes de afinidade primário e/ou secundário incluem corantes ou metais fluorescentes (por exemplo, fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, fluorescamina), corantes cromofóricos (por exemplo, rodopsina), compostos quimioluminescente (por exemplo, luminal, imidazol) e as proteínas bioluminescentes (por exemplo, luciferina, luciferase), haptenos (por exemplo, biotina).
[257] Em modalidades da presente invenção, os ligantes com afinidade por ácidos nucleicos para serem usados como sondas, em particular, uma sonda específica para os produtos de expressão do GOI, conforme definido anteriormente neste documento, pode ser marcada com um marcador fluorescente, como 6-FAM, HEX, TET, ROX, Cy3, Cy5, Vermelho Texas ou Rodamina, e/ou ao mesmo tempo com um marcador para extinção, como TAMRA, Dabcyl, Black Hole Quencher, BHQ-I ou BHQ-2. Uma variedade de outros corantes fluorescentes e cromóforos é descrita em Stryer, 1968, Science, 162:526-533. Os ligantes de afinidade podem também ser marcados com enzimas (por exemplo, peroxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina, beta-lactamase), radioisótopos (por exemplo 3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 125I) ou partículas (por exemplo, ouro). Os diferentes tipos de marcadores podem ser conjugados a um ligante de afinidade, usando-se várias químicas, por exemplo, a reação de amina ou a reação de tiol. Entretanto, outros grupos reativos além de aminas e tióis podem ser usados, por exemplo, aldeídos, ácidos carboxílicos e glutamina.
[258] Em uma modalidade específica da presente invenção, uma composição pode compreender, adicionalmente, ingredientes acessórios, como tampões, dNTPs, uma polimerase, para PCR, íons como cátions bivalentes ou cátions monovalentes, soluções de hibridização, corantes de detecção e qualquer outro composto ou líquido adequado necessário para o desempenho de uma detecção, conforme definido aqui acima, que é conhecido pelo versado na técnica.
[259] Um outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso de um ácido nucleico para o produto de expressão do GOI, conforme definido aqui acima, para a preparação de uma composição para diagnosticar, detectar, monitorar ou prognosticar câncer de próstata agressivo ou a progressão para câncer de próstata agressivo versus indolente ou uma predisposição para doença agressiva versus doença indolente em um indivíduo, conforme anteriormente definido neste documento.
[260] Em uma modalidade preferencial, a presente invenção refere-se ao uso de um oligonucleotídeo específico para os produtos de expressão do GOI e/ou uma sonda específica para os produtos de expressão, conforme anteriormente neste documento, para a preparação de uma composição para diagnosticar, detectar, monitorar ou prognosticar câncer de próstata agressivo ou a progressão para câncer de próstata agressivo versus indolente ou uma predisposição para doença agressiva versus doença indolente em um indivíduo, conforme anteriormente definido neste documento.
[261] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, uma composição, conforme anteriormente definida neste documento, é uma composição de diagnóstico.
[262] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit diagnóstico para detectar, diagnosticar, monitorar ou prognosticar o câncer de próstata ou a progressão para câncer de próstata ou uma predisposição para câncer de próstata agressivo, que compreende um conjunto de oligonucleotídeos específicos para os produtos de expressão do GOI, uma sonda específica para os produtos de expressão do GOI.
[263] Tipicamente, o kit diagnóstico da presente invenção contém um ou mais agentes que permitem a detecção específica de genes marcadores ou GOI conforme definido anteriormente neste documento. Os agentes ou ingredientes de um kit diagnóstico podem de acordo com a presente invenção, ser compreendidos de um ou mais recipientes ou entidades separadas. A natureza dos agentes é determinada pelo método de detecção para a qual o kit é destinado.
[264] Além disso, o kit pode compreender uma quantidade de uma molécula de ácido nucleico conhecida, que pode ser usada para uma calibração do kit ou como um controle interno. Tipicamente, um kit diagnóstico para a detecção de produtos de expressão de genes marcadores ou GOI pode compreender ingredientes acessórios como tampões PCR, dNTPs, uma polimerase, íons como cátion bivalentes ou cátions monovalentes, soluções de hibridização, etc. Tais ingredientes são conhecidos das pessoas versadas na técnica e podem variar dependendo do método de detecção realizado. Adicionalmente, o kit pode compreender um folheto de instrução e/ou pode fornecer informações quanto à relevância dos resultados obtidos.
[265] Em outros aspectos, a presente invenção refere-se a métodos para detectar, diagnosticar, monitorar ou prognosticar câncer de próstata ou a progressão para câncer de próstata agressivo versus indolente, por exemplo, em um indivíduo, que compreende ao menos a etapa de determinar o nível de gene(s) marcador(es) ou de GOIs em uma amostra. O termo “determinação do nível de genes marcadores ou GOIs” refere-se à determinação da presença ou da quantidade de produtos de expressão dos genes marcadores ou GOIs. O termo “nível de gene(s) marcador(es) ou de GOI” significa, portanto, a presença ou a quantidade de produtos de expressão de gene(s) marcador(es) ou de GOI, por exemplo, transcrito(s), e/ou a determinação da presença ou quantidade de gene(s) ou marcador(es) ou de GOI. A determinação da presença ou quantidade de produtos de expressão de gene(s) marcadores ou de GOI, pode ser realizada por quaisquer meios conhecidos na técnica.
[266] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a determinação da presença ou quantidade de produtos de expressão de gene(s) marcador(es) ou de GOI é realizada através da medição de ácido nucleico. Dessa forma, os níveis de expressão podem ser determinados por um método que envolve a detecção de um mRNA codificado pelo gene.
[267] Por exemplo, a medição do nível de ácido nucleico de expressão de gene(s) marcador ou de GOI pode ser avaliada pela purificação de moléculas de ácido nucleico (por exemplo RNA ou cDNA) obtidas da amostra, seguida por hibridização com sondas de oligonucleotídeos específicos conforme definido anteriormente neste documento. A comparação dos níveis de expressão pode ser realizada visualmente ou por meio de um dispositivo adequado. Métodos para a detecção de mRNA ou de produtos de expressão são conhecidos da pessoa versada na técnica.
[268] Alternativamente, o nível de ácido nucleico de expressão de gene(s) marcador(es) ou GOI pode ser detectado em uma abordagem de arranjos ou microarranjos de DNA. Tipicamente, amostras de ácidos nucleicos derivadas de pacientes a serem testados são processadas e marcadas, de preferência com um marcador fluorescente. Posteriormente, essas moléculas de ácido nucleico podem ser usadas em uma abordagem de hibridização com sondas de captura imobilizadas que correspondem aos genes marcadores da presente invenção. Meios adequados para a execução de análises de microarranjo são conhecidos do versado na técnica.
[269] Em uma configuração padrão, um arranjo ou microarranjo de DNA compreende sondas de alta densidade imobilizadas para detectar um número de genes. As sondas no arranjo são complementares a uma ou mais partes da sequência dos genes marcadores. Tipicamente, cDNAs, produtos de PCR, e oligonucleotídeos são úteis como sondas.
[270] Um método de detecção baseado em arranjo ou microarranjos de DNA tipicamente compreende as seguintes etapas: (1) Isolamento de mRNA a partir de uma amostra e a conversão opcionalmente do mRNA em cDNA, e subsequentemente marcação desse RNA ou cDNA. Métodos de isolamento de RNA, convertendo-o em cDNA e para marcação de ácidos nucleicos são descritos em manuais de tecnologia de microarranjo. (2) Hibridização dos ácidos nucleicos da etapa 1 com sondas para os genes marcadores. Os ácidos nucleicos de uma amostra podem ser marcados com um corante, como os corantes fluorescentes Cy3 (vermelho) ou Cy5 (azul). Geralmente uma amostra de controle é marcada com um corante diferente. (3) Detecção da hibridização dos ácidos nucleicos da amostra com as sondas e determinação de ao menos qualitativamente, e mais particularmente quantitativamente, as quantidades de mRNA na amostra de genes marcadores investigados. A diferença no nível de expressão entre a amostra e o controle pode ser estimada com base em uma diferença na intensidade de sinal. Estes podem ser medidos e analisados por software adequado como, mas não limitado a, o software fornecido, por exemplo, por Affymetrix.
[271] Não há limitação quanto ao número de sondas que correspondem aos genes marcadores usados, os quais são depositados em um arranjo de DNA. Também, um gene marcador pode ser representado por duas ou mais sondas, as sondas que hibridizam diferentes partes de um gene. As sondas são projetadas para cada gene marcador selecionado. Tal sonda é tipicamente um oligonucleotídeo que compreende, tipicamente, 5 a 50 resíduos de nucleotídeos. DNAs mais longos podem ser sintetizados por PCR ou quimicamente. Métodos para sintetizar tais oligonucleotídeos e aplicá-los sobre um substrato são bem conhecidos no campo de microarranjos. Genes diferentes dos genes marcadores podem também ser depositados no arranjo de DNA. Por exemplo, uma sonda para um gene cujo nível de expressão não é significativamente alterado pode ser depositada no arranjo de DNA para normalizar os resultados do ensaio ou para comparar os resultados do ensaio de múltiplos arranjos ou diferentes ensaios.
[272] Alternativamente, o nível de ácido nucleico de expressão dos genes marcadores ou GOI pode ser detectado em uma abordagem de RT-PCR quantitativa, de preferência em uma abordagem de PCR em tempo real seguindo a transcrição reversa de transcritos de interesse. Tipicamente, a primeira etapa, um transcrito é transcrito de forma reversa em cDNA de uma molécula de acordo com qualquer método adequado conhecido do versado na técnica. Uma abordagem de PCR em tempo real ou quantitativa pode ser executada posteriormente com base em uma primeira fita de DNA obtida como descrito acima.
[273] De preferência, sondas taqman ou molecular Beacon com sondas Fret de base deste tipo pode ser usado para a detecção de PCR quantitativa. Em ambos os casos, as sondas servem como sondas internas que são usadas em conjunto com um par de iniciadores que flanqueiam região alvo de interesse, de preferência, um conjunto de oligonucleotídeos específicos de genes marcadores conforme definido anteriormente neste documento. Mediante a amplificação de um segmento alvo, a sonda pode se ligar seletivamente aos produtos em uma sequência de identificação entre os locais de iniciadores, causando assim o aumento da sinalização FRET em relação a aumentos na frequência alvo.
[274] De preferência, uma sonda Taqman a ser usada para uma abordagem de PCR quantitativa de acordo com a presente invenção pode compreender um oligonucleotídeo específico conforme definido acima de cerca de 22 a 30 bases que é marcado em ambas as extremidades como um par FRET. Tipicamente, a extremidade 5’ terá um fluoróforo de comprimento de onda mais curto, como fluoresceína (por exemplo, FAM) e a extremidade 3’ é comumente marcada com um supressor de comprimento de onda mais longo (por exemplo, TAMRA) ou um composto supressor (“quencher”) não fluorescente (por exemplo. Black Hole Quencher). Prefere-se que as sondas a serem usadas para PCR quantitativa, em particular as sondas conforme definido anteriormente neste documento, não tenham guanina (G) na extremidade 5’ adjacente ao corante repórter para evitar diminuição ou supressão da intensidade da fluorescência do repórter após a sonda ser degradada.
[275] Uma sonda molecular Beacon a ser usada para uma abordagem de PCR quantitativa de acordo com a presente invenção usa, de preferência, interações de FRET para detectar e quantificar um produto de PCR, sendo que cada sonda tem uma extremidade 5’ marcada com fluorescência e uma extremidade 3’ marcada com supressor. Esta configuração em forma de grampo (hairpin ou haste-alça da estrutura da sonda compreende, de preferência, uma haste com duas extremidades curtas autoligantes e uma alça com uma região específica de alvo interna, longa de cerca de 20 a 30 bases.
[276] Mecanismos de detecção alternativos que podem também ser de usados no contexto da presente invenção são direcionados a uma sonda fabricada com somente uma estrutura de alça e sem uma região de haste complementar curta. Uma abordagem alternativa com base em FRET para PCR quantitativa que também pode ser usada no contexto da presente invenção se baseia no uso de duas sondas de hibridização que se ligam a sítios em posição adjacente no alvo, sendo que a primeira sonda tem uma marcação doadora fluorescente na extremidade 3' e a segunda sonda tem uma marcação receptora fluorescente em sua extremidade 5'.
[277] Em ainda outra modalidade, em uma outra etapa adicional, uma decisão sobre a presença ou estágio de câncer ou a progressão do câncer podem ser baseados nos resultados de uma etapa de comparação. Um câncer de próstata maligno sensível a hormônio pode ser diagnosticado ou prognosticado ou uma progressão para câncer de próstata (agressivo) pode ser diagnosticada ou prognosticada no dito método, de acordo com as definições correspondentes fornecidas anteriormente neste documento, no contexto de genes marcadores ou GOIs como marcador para câncer de próstata maligno.
[278] Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para detectar, diagnosticar, monitorar ou prognosticar câncer de próstata (agressivo) ou a progressão para câncer de próstata (agressivo), que compreende pelo menos as etapas de: (a) testar em pelo menos uma amostra obtida a partir de pelo menos um indivíduo com suspeita de câncer de próstata para o nível de expressão dos produtos de expressão do GOI; (b) testar em pelo menos uma amostra de controle para o nível de expressão do produto de expressão do GOI; (c) determinar a diferença na expressão das etapas (a) e (b) e (d) decidir sobre a presença ou estágio de câncer de próstata ou a progressão para câncer de próstata agressivo com base nos resultados obtidos na etapa (c).
[279] Em uma modalidade, as etapas a), b), c) e/ou d) deste método de diagnóstico podem ser executadas fora do corpo humano ou animal, por exemplo, em amostras obtidas de um paciente ou indivíduo.
[280] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para diagnosticar, monitorar ou prognosticar, por exemplo, câncer de próstata agressivo ou progressão para câncer de próstata agressivo, sendo que o dito método faz a distinção entre um tumor benigno e câncer de próstata agressivo, que compreende as etapas de (a) determinar o nível dos genes marcadores ou GOIs, (b) determinar o nível de expressão de um gene de referência em uma amostra; (c) normalizar o nível de expressão medido dos genes marcadores ou GOIs para a expressão do gene de referência e (d) comparar o nível de expressão normalizado com um valor de corte predeterminado escolhido para excluir o tumor de próstata benigno, sendo que um nível de expressão normalizado acima do valor de corte é indicativo de um câncer de próstata agressivo, sendo que o dito valor de corte situa- se entre -2 e +2, de preferência, de cerca de 0.
[281] Os resultados da expressão podem ser normalizados de acordo com qualquer método adequado conhecido do versado na técnica. Tipicamente, tais testes ou fórmula correspondente, que seriam do conhecimento do versado na técnica, poderiam ser usados para padronizar os dados de expressão para permitir a diferenciação entre variações reais nos níveis e varações de expressão dos genes devido aos processos de medição. Para microarranjos, o algoritmo RMA (Robust Multiarray Average) pode ser usado como uma abordagem de normalização.
[282] Em uma modalidade específica, os valores normalizados são gerados mediante a aplicação do seguinte:
[283] N(Cq gene de interesse ) = Média (Cq gene de ref) — (Cq gene de interesse)
[284] Em que N(Cq gene de interesse) é valor da expressão gênica normalizada para genes de interesse selecionados; em que Média (Cq gene de ref) é a média aritmética dos valores de Cq de PCR da combinação selecionada dos genes de referência; em que (Cq gene de interesse) é o valor de Cq de PCR do gene de interesse.
[285] Em uma modalidade específica, os valores normalizados são gerados mediante a aplicação do seguinte:
[286] N(Cq gene de interesse ) = Média(Cq gene de ref) — (Cq gene de interesse)
[287] Em que N(Cq gene de interesse) é valor da expressão gênica normalizada para genes de interesse selecionados; em que Média (Cq gene de ref) é a média aritmética dos valores de Cq de PCR dos ao menos dois genes de referência selecionados dentre TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, POLR2A, B2M, PUM1, K-ALPHA-1 e ALAS-1; em que (Cq gene de interesse) é o valor de Cq de PCR do gene de interesse.
[288] Em uma modalidade específica, os valores normalizados são gerados mediante a aplicação do seguinte:
[289] N(Cq gene de interesse ) = Média(Cq gene de ref) — (Cq gene de interesse)
[290] Em que N(Cq gene de interesse) é valor da expressão gênica normalizada para genes de interesse selecionados; onde a Média (Cq gene de ref) é a média aritmética dos valores de Cq PCR dos genes de referência TBP, HPRT1, ACTB e RPLP0; em que (Cq gene de interesse) é o valor de Cq de PCR do gene de interesse.
[291] Em uma modalidade específica, os valores normalizados são gerados mediante a aplicação do seguinte:
[292] N(Cq gene de interesse ) = Média(Cq gene de ref) — (Cq gene de interesse)
[293] Em que N(Cq gene de interesse) é valor da expressão gênica normalizada para genes de interesse selecionados; onde a Média(Cq gene de ref ) é média aritmética dos valores de C1 da PCR dos genes de referência TBP, HPRT1, PUM1, K-ALPHA-1 e ALAS-1 em que (Cq gene de interesse) é o valor de Cq de PCR do gene de interesse.
[294] Genes de referência exemplificadores incluem, entre outros, proteína de ligação à caixa TATA (TBP) de Homo sapiens, hipoxantina fosforribosiltransferase 1 de Homo sapiens (HPRT1), mRNA de beta-actina (ACTB) de Homo sapiens, mRNA de fosfoproteína ribossomal P0 ácida 60S (RPLP0) de Homo sapiens, membro da família pumílio de ligação a RNA (PUM1) de Homo sapiens, polipeptídeo A da polimerase (RNA) II (DNA- direcionada) polipeptídeo A, 220kDa (POLR2A), beta-2- microglobulina (B2M), tubulina-alfa-1b (K-ALPHA-1), aminolevulinato-delta-sintase (ALAS-1).
[295] Em uma modalidade preferencial, uma combinação de genes de referência é selecionada dentre a proteína de ligação à caixa TATA (TBP), hipoxantina fosforribosiltransferase 1 de Homo sapiens (HPRT1), mRNA de beta-actina (ACTB) de Homo sapiens, mRNA de fosfoproteína ribossomal P0 ácida 60S (RPLP0) de Homo sapiens, membro da família pumílio de ligação a RNA (PUM1) de Homo sapiens, polipeptídeo A da polimerase (RNA) II (DNA-direcionada), 220kDa (POLR2A), beta-2-microglobulina (B2M), tubulina-alfa- 1b (K-ALPHA-1), aminolevulinato-delta-sintase (ALAS-1).
[296] Em uma modalidade específica, o nível de expressão da assinatura gênica é normalizado para a expressão de um gene de referência, sendo que o gene de referência é, de preferência, um gene constitutivo e sendo que o gene constitutivo é, de preferência, TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A ou B2M.
[297] Em uma outra modalidade preferencial, a combinação de genes de referência compreende TBP, HPRT1 e ao menos um, ao menos dois ou ao menos três genes de referência adicionais selecionados do grupo que compreende ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A, B2M, K-ALPHA-1 (TUBA1B) ou ALAS-1.
[298] Em uma outra modalidade preferencial, a combinação de genes de referência compreende TBP, HPRT1 e ao menos dois genes de referência adicionais selecionados do grupo que compreende ACTB, RPLP0, PUM1, K-ALPHA-1 (TUBA1B) ou ALAS-1.
[299] Uma combinação particularmente preferencial é TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0. Uma outra combinação particularmente preferencial é TBP, HPRT1, PUM1, K-ALPHA-1, ALAS-1.
[300] Uma descrição detalhada dos genes de referência incluindo sua identificação de transcrição (NCBI RefSeq) e a SEQ ID NO da sequência de nucleotídeos correspondente, a identificação de proteínas (acesso de proteína) e a SEQ ID NO da sequência do aminoácido correspondente são reveladas na Figura 10. Adicionalmente, a Figura 10 revela para cada gene de referência um iniciador direto, um iniciador reverso para a geração de um amplicon que é específico para o gene de referência e uma sequência de sonda que se liga especificamente ao amplicon. O nível de expressão dos genes marcadores ou GOI pode ser determinado no ácido nucleico, conforme anteriormente descrito neste documento. É preferencial a determinação do nível de expressão dos transcritos dos genes marcadores ou GOI. Além disso, o nível de um gene constitutivo em uma amostra pode ser determinado.
[301] O termo “gene de referência”, como aqui usado, refere-se a qualquer gene adequado, por exemplo, a qualquer gene, produto gênico, produto de expressão, proteína ou variante de proteína, que é regularmente expresso e continuamente detectável no organismo de escolha.
[302] A expressão pode acontecer, de preferência, dentro da mesma amostra, isto é, o nível de um gene marcador ou GOI e o gene de referência é determinado na mesma amostra. Se o teste é executado na mesma amostra, uma abordagem de detecção única ou de detecção multiplex, conforme descrito aqui, pode ser realizada. Para o desempenho de detecção multiplex, a concentração de oligonucleotídeos iniciadores e/ou sonda pode ser modificada. Além disso, a concentração e presença de outros ingredientes, como tampões, íons etc., pode ser modificada, por exemplo, regulada positiva ou negativamente em comparação com as indicações dos fabricantes.
[303] Além disso, os resultados de expressão podem ser comparados aos resultados já conhecidos de casos ou bases de dados de referência. A comparação pode incluir, adicionalmente, um procedimento de normalização a fim de melhorar a relevância estatística dos resultados.
[304] Os resultados da expressão podem ser normalizados de acordo com qualquer método adequado conhecido pelo versado na técnica, por exemplo, de acordo com métodos estatísticos de normalização, como o escore padrão, o teste T de Student, o teste residual studentizado, o teste padronizado de momento ou o teste de variação de coeficiente. Tipicamente, tais testes ou fórmula correspondente, que seriam do conhecimento do versado na técnica, poderiam ser usados para padronizar os dados de expressão para permitir a diferenciação entre variações reais nos níveis e varações de expressão dos genes devido aos processos de medição.
[305] Com base nos resultados obtidos nas etapas (a) e (b) e/ou nos resultados normalizados obtidos na etapa (c), uma comparação com um valor de corte para os níveis de expressão de GOI pode ser feita. O valor de corte acima do qual o nível de expressão dos genes marcadores ou GOIs é indicativo de um câncer de próstata agressivo excluindo, assim, formas de tumor de próstata benigno ou formas de condições saudáveis ou de tecido saudável, situa-se entre cerca de -3 e + 3, -3 e + 2,75, -3 e + 2,5, -3 e + 2,25, -3 e + 2, -3 e + 1,75, -3 e +1,5, -3 e + 1,25, -3 e + 1, -3 e + 0,75, -3 e + 0,5, -3 e + 0,25, -3 e 0, -2,75 e + 3, - 2,5 e + 3, -2,25 e + 3, -2 e + 3, -1,75 e + 3, -1. 5 e + 3, -1,25 e + 3, -1 e + 3, -0,75 e + 3, -0. 5 e + 3, -0,25 e + 3 ou 0 e + 3. Com mais preferência, um valor de corte de cerca de 0, por exemplo, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 ou -0,9, -0,8, -0,7, -0,6, -0,5, -0,4, -0,3, - 0,2 ou -0,1.
[306] Se os níveis de expressão medidos e/ou normalizados ficam abaixo do valor de corte indicado, isso pode ser visto como uma indicação de que o indivíduo está saudável em relação a tumores de próstata ou apresenta tumores de próstata benignos, mas não câncer de próstata agressivo.
[307] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de captura de dados que compreende pelo menos as etapas de: (a) testar um indivíduo quanto à expressão dos genes marcadores ou GOIs, e (b) comparar a expressão conforme determinado na etapa (a) para um nível de controle. O teste para expressão de genes marcadores ou GOIs pode ser feito de acordo com as etapas, conforme anteriormente definidas neste documento. De preferência, o teste pode ser feito como medição de ácido nucleico dos genes marcadores ou GOIs. O teste pode ser feito em um indivíduo, isto é, in vivo, ou fora do indivíduo, isto é, ex vivo ou in vitro. O termo “nível de controle”, como usado no contexto do método de captura de dados, refere-se à expressão de genes marcadores aqui mencionados ou outros marcadores em um controle normal ou um controle canceroso, conforme anteriormente definido neste documento. O status, a natureza, a quantidade e a condição do nível de controle podem ser ajustados de acordo com as necessidades. De preferência, um nível de controle normal e saudável pode ser usado. Uma comparação da expressão com um nível de controle pode ser feita de acordo com qualquer método adequado para analisar, calcular, avaliar ou processar os dados e, particularmente, tem como objetivo a detecção das diferenças entre dois conjuntos de dados. Uma avaliação estatística da significância da diferença pode ser ainda executada. Métodos estatísticos adequados são conhecidos pelo versado na técnica. Dados e informação obtidos podem ser armazenados, acumulados ou processados por métodos ou ferramentas de informática ou computacionais conhecidos pelo versado na técnica e/ou podem ser apresentados de maneira adequada para permitir que o médico use os dados para uma ou mais etapas de dedução ou conclusão.
[308] Além disso, o nível de um gene de referência, conforme definido acima em uma amostra, pode ser determinado. Alternativamente, a determinação do gene de referência pode ser executada com qualquer outro agente adequado ou ser combinada com a detecção da presença ou quantidade de ácidos nucleicos conforme aqui descrito.
[309] Um outro aspecto da invenção refere-se a um método para identificar a elegibilidade de um indivíduo para terapia de câncer de próstata que compreende: (a) testar em uma amostra obtida de um indivíduo a expressão dos genes marcadores ou GOIs, (b) testar na dita amostra a expressão de um gene de referência e/ou testar em uma amostra de controle a expressão dos genes marcadores ou GOIs; (c) classificar os níveis de expressão da etapa (a) em relação aos níveis da etapa (b); e calcular os respectivos PCPIs, (d) identificar o indivíduo como elegível para receber uma terapia de câncer de próstata em que a amostra do indivíduo é classificada como tendo um nível regulado positivamente ou negativamente da expressão dos genes marcadores ou GOIs ou um PCPI que é indicativo de doença agressiva.
[310] O termo “classificar os níveis de expressão da etapa (a) em relação à etapa (b)”, como usado aqui, significa que a expressão em uma amostra de teste de GOIs e a expressão em uma amostra de controle de GOIs são comparadas, por exemplo, após a normalização contra referências de normalização adequadas e/ou após o respectivo cálculo dos PCPIs.
[311] De acordo com o cálculo dos PCPIs, um indivíduo pode ser considerado elegível para uma terapia de câncer de próstata quando os níveis de expressão gênica são significativamente diferentes em comparação com uma amostra de controle.
[312] O termo “estratificação de um indivíduo ou coorte de indivíduos para terapia de câncer de próstata”, como usado aqui, significa que um indivíduo é identificado como pertencendo a um grupo de indivíduos similares, cuja forma de terapia ótima é uma terapia para câncer de próstata, por exemplo, uma terapia de acordo com o resultado do cálculo do PCPI, conforme anteriormente descrito neste documento.
[313] Um indivíduo é considerado elegível para terapia de câncer de próstata ou estratificado para terapia de câncer de próstata, conforme anteriormente descrito neste documento, pode receber qualquer tratamento terapêutico adequado para essa forma de câncer de próstata conhecido pelo versado na técnica. Em particular, o termo “terapia para câncer de próstata”, como usado aqui, refere-se a qualquer terapia de câncer de próstata adequada conhecida pelo versado na técnica, e inclui, de preferência, a castração cirúrgica pela remoção dos testículos como o principal órgão de produção do hormônio sexual masculino, castração química, por exemplo, terapia hormonal, como supressão de geração de androgênios ou pela inibição da atividade de receptor de androgênio, citotóxicos, quimioterápicos, radioterapia (radioterapia de feixe externa, braquiterapia), crioterapia, terapias focais, como ablação HIFU (ablação por ultrassom de alta frequência) ou ablação térmica ou combinações dos mesmos, de preferência, a combinação de terapia hormonal e radioterapia.
[314] Tipicamente, um indivíduo considerado elegível para terapia de câncer de próstata pode ser considerado acometido de câncer de próstata (agressivo) ou ser propenso a desenvolver, como, por exemplo, dentro dos próximos de 1 a 24 meses. Um indivíduo correspondentemente identificado ou estratificado pode ser tratado com uma composição farmacêutica inibitória. Em uma outra modalidade, um indivíduo correspondentemente identificado pode ser tratado com uma composição farmacêutica inibitória com uma terapia para câncer adicional. O termo “terapia para câncer adicional” refere-se a quaisquer tipos de terapia para câncer conhecidos pelo versado na técnica. São preferenciais formas de terapia para câncer conhecidas para o câncer de próstata. O termo inclui, por exemplo, todas as formas adequadas de quimioterapia, radioterapia, cirurgia e terapia de anticorpo, etc.
[315] Alternativamente, um indivíduo correspondentemente identificado ou estratificado pode também ser tratado unicamente com uma ou mais terapias para o câncer, como quimioterapia, radioterapia, cirurgia, terapias com anticorpos, etc. Terapias para o câncer preferenciais são tipicamente usadas para o câncer de próstata, com mais preferência, terapias para o câncer usadas para câncer de próstata agressivo.
[316] Em uma outra modalidade da presente invenção, o método de classificação para elegibilidade ou estratificação, conforme anteriormente descrito neste documento, também pode ser usado para monitorar o tratamento de um indivíduo, por exemplo um indivíduo classificado como acometido por um câncer de próstata agressivo. O processo de monitoramento pode ser feito como determinação da expressão ao longo de um período de tempo prolongado, por exemplo, durante ou após as sessões de tratamento durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 semanas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 meses, ou 1, 2, 3 ou mais anos. A determinação pode ser feita em intervalos adequados, por exemplo, a cada semana, 2 semanas, 3 semanas, a cada mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 12 meses, etc. Em uma outra modalidade da presente invenção, qualquer esquema de tratamento, conforme mencionado acima, pode ser ajustado, por exemplo, aplicado ou atenuado ou alterado de qualquer maneira adequada em correspondência com os resultados do processo de monitoramento.
[317] Em uma outra modalidade da presente invenção, o método para a identificação de um indivíduo para elegibilidade para terapia contra câncer de próstata agressivo com base na expressão de genes marcadores ou GOIs e o PCPI correspondente, conforme anteriormente descrito neste documento, pode ser adicionalmente combinado com um ou mais métodos de identificação similares, com base na expressão de um ou mais biomarcadores diferentes. É preferencial a determinação do nível do antígeno específico da próstata (PSA) no sangue. Portanto, se o nível de PSA no sangue está em uma faixa de cerca de 2 a 5 ng/ml ou mais, de preferência de cerca de 2,2 a 4,8 ng/ml ou mais, de 2,4 a 4,4 ng/ml ou mais, de 2,6 a 4,2 ng/ml ou mais ou de 2,8 a 4,0 ng/ml ou mais, com mais preferência, de cerca de 2,5 a 4 ng/ml ou mais, um indivíduo pode ser considerado como acometido por câncer de próstata maligno ou pode ter probabilidade de desenvolver câncer de próstata maligno em um futuro próximo, ou seja, nos próximos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 14, 48 meses. O teste para expressão de genes marcadores ou GOIs e determinação do PCPI pode ser feito de acordo com as etapas conforme anteriormente definidas neste documento.
[318] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o diagnóstico, a detecção, o monitoramento ou o prognóstico, conforme mencionados acima, devem ser feitos em uma amostra obtida de um indivíduo. O termo “amostra obtida de um indivíduo”, como usado na presente invenção, refere-se a qualquer material biológico obtido de um indivíduo através de métodos adequados conhecidos pela pessoa versada na técnica. A amostra usada no contexto da presente invenção deve, de preferência, ser coletada de maneira clinicamente aceitável, com mais preferência, de uma maneira que os ácidos nucleicos (RNA em particular) ou as proteínas sejam conservados(as).
[319] As amostras biológicas podem incluir tecidos e fluidos corpóreos, como sangue, suor e urina. Além disso, a amostra biológica pode conter um extrato celular derivado de uma célula ou população de células, incluindo uma célula epitelial, de preferência, uma célula epitelial cancerosa ou célula epitelial derivada do tecido suspeita de ser canceroso. Ainda mais preferencialmente, a amostra biológica pode conter uma população de células derivada de um tecido glandular, por exemplo, a amostra pode ser derivada da próstata de um indivíduo do sexo masculino. Adicionalmente, as células podem ser purificadas a partir de tecidos e fluidos corpóreos obtidos, se necessário, e, então, usadas como a amostra biológica.
[320] As amostras, particularmente após o processamento inicial, podem ser agrupadas. Entretanto, também amostras não agrupadas podem ser usadas.
[321] Em uma modalidade específica da presente invenção, o conteúdo de uma amostra biológica pode também ser submetido a uma etapa de enriquecimento. Por exemplo, uma amostra pode ser colocada em contato com ligantes específicos para a membrana celular ou organelas de determinados tipos de células, por exemplo, células da próstata, funcionalizadas, por exemplo, com partículas magnéticas. O material concentrado pelas partículas magnéticas pode ser posteriormente usado nas etapas de detecção e análise, conforme descrito na presente invenção acima ou abaixo.
[322] Em uma modalidade específica da invenção, amostras de biópsia ou de ressecções podem ser obtidas e/ou usadas. Tais amostras podem compreender células ou lisados celulares.
[323] Além disso, as células, por exemplo células de tumor, podem ser enriquecidas através de processos de filtração de fluido ou de amostras líquidas, por exemplo, sangue, urina, etc. Tais processos de filtração podem também ser combinados com as etapas de enriquecimento, com base em interações ligante-específicas, conforme descrito aqui acima.
[324] Em uma modalidade particularmente preferencial da presente invenção, uma amostra pode ser uma amostra de tecido, uma amostra de biópsia, uma amostra de urina, uma amostra de sedimento de urina, uma amostra de sangue, uma amostra de saliva, uma amostra de sêmen, uma amostra que compreende células de tumor circulantes, ou uma amostra contendo exossomas secretados pela próstata. Uma amostra de sangue, pode, por exemplo, uma amostra de soro ou uma amostra de plasma.
[325] No tratamento do câncer de próstata, compostos ou composições farmacêuticas que são ativos contra células de câncer podem ser usados. A composição farmacêutica pode compreender inibidores de hormônio, de preferência, antiandrogênio ou antagonistas de androgênio, como espironolactona, acetato de ciproterona, flutamida, nilutamida, bicalutamida, cetoconazol, finasterida ou dutasterida.
[326] Em uma outra modalidade específica, a presente invenção contempla um método para monitorar o desenvolvimento de câncer de próstata, que compreende a determinação de genes marcadores ou GOIs, de preferência, em combinação com a determinação de um gene de referência, conforme descrito acima, em um certo período de tempo, isto é, após repetidas etapas de determinação, por exemplo, a cada 4 semanas, 6 semanas, dois meses, 4 meses, 6 meses, 8 meses, 12 meses, 1,5 anos, 2 anos, 2,5 anos, 3 anos, 4 anos, ou qualquer outro período de tempo adequado, etc. O método pode fornecer dados que mostram um aumento ou uma diminuição no nível dos genes marcadores ou GOIs em comparação com os controles, por exemplo, controles não cancerosos, controles cancerosos ou com dados anteriores obtidos do mesmo indivíduo. Com a ajuda de métodos estatísticos adequados conhecidos pelo versado na técnica, a posição dentro da dita curva pode ser determinada. Em dependência da posição dentro da dita curva, isto é, em uma porção crescente ou uma porção decrescente da dita curva, a presença ou futuro desenvolvimento de câncer de próstata podem ser diagnosticados. De modo correspondente, o uso de composições farmacêuticas é contemplado. De preferência, qualquer tal determinação pode ser combinada com a determinação de biomarcadores secundários, por exemplo, marcadores para câncer de próstata, em particular, PSA. No caso de níveis baixos de PSA (até 2,0 a 4,0 ng/ml), os dados de GOI podem ser análises relacionadas ao câncer de próstata inicial, isto é, câncer de próstata benigno ou dependente de hormônio/sensível a hormônio. No caso de níveis de PSA maiores (maiores que cerca de 20 ng/ml, por exemplo, cerca de 30, 40, ou 50 ng/ml), os dados podem ser analisados em relação ao câncer de próstata mais avançado, por exemplo, câncer de próstata resistente a hormônio.
[327] Um “câncer de próstata sensível a hormônio de estágio I a IV”, como usado aqui, denota um câncer de próstata que pode ser classificado de acordo com a classificação TNM pela União Internacional para Controle do Câncer (UICC) em estágios I a IV.
[328] Um “câncer de próstata recorrente sensível a hormônio”, como usado aqui, denota um de câncer de próstata cujo crescimento e progressão é regulado e dependente de um hormônio sexual masculino. Um exemplo preferencial de tal hormônio sexual masculino é um androgênio.
[329] Um “câncer de próstata metastático sensível a hormônio”, como usado aqui, denota um de câncer de próstata cujo crescimento e progressão é regulado e dependente de um hormônio sexual masculino. Um exemplo preferencial de tal hormônio sexual masculino é androgênio.
[330] Um “câncer de próstata insensível a hormônio”, como usado aqui, denota um câncer de próstata cujo crescimento e progressão não é regulado e dependente de um hormônio sexual masculino. Um exemplo preferencial de tal hormônio sexual masculino é androgênio.
[331] Um aspecto adicionado da invenção refere- se a um produto de programa de computador, que compreende código legível por computador armazenado em uma mídia legível por computador ou transferível por download de uma rede de comunicação que, quando executado em um computador, implementa uma ou mais etapas ou todas as etapas de qualquer um dos métodos conforme aqui definido.
[332] Pode ser usada qualquer combinação de uma ou mais mídias legíveis por computador. A mídia legível por computador pode ser uma mídia de sinal legível por computador ou uma mídia de armazenamento legível por computador. Uma mídia de armazenamento legível por computador pode, por exemplo, ser mas não se limitar a, um sistema, aparelho ou dispositivo eletrônico, magnético, óptico, eletromagnético, infravermelho ou semicondutor, ou qualquer combinação adequada dos anteriormente mencionados. Exemplos mais específicos (uma lista não exaustiva) da mídia de armazenamento legível por computar incluiria o seguinte: uma conexão elétrica tendo um ou mais fios, um disquete de computador portátil, um disco rígido, uma memória de acesso aleatório (RAM, random access memory), uma memória só de leitura (ROM, read-only memory), uma memória só de leitura programável e apagável (EPROM, erasable programmable read-only memory, ou memória Flash), uma fibra óptica, uma memória só de leitura de disco compacto portátil (CD-ROM), um dispositivo de armazenamento óptico, um dispositivo de armazenamento magnético ou qualquer combinação adequada dos anteriormente mencionados. No contexto deste documento, uma mídia de armazenamento legível por computador pode ser qualquer mídia tangível que possa conter ou armazenar um programa para uso por meio de, ou em conjunto com, um sistema, aparelho ou dispositivo de execução de instruções.
[333] Uma mídia de sinal legível por computador pode incluir um sinal de dados propagado com código de programa legível por computador incorporado ao mesmo, por exemplo, em banda base ou como parte de uma onda portadora. Tal sinal propagado pode assumir qualquer uma dentre uma variedade de formas, incluindo, mas não se limitando a, uma forma eletromagnética, óptica ou qualquer combinação adequada das mesmas. Uma mídia de sinal legível por computador pode ser qualquer mídia legível por computador que não seja uma mídia de armazenamento legível por computador, e que possa comunicar, propagar ou transportar um programa para uso por ou em conexão com um dispositivo, aparelho ou sistema de execução de instruções.
[334] O código de programa incorporado em uma mídia legível por computador pode ser transmitido com o uso de qualquer meio adequado incluindo, mas não se limitando a, rede sem fio, rede com fio, cabo de fibra óptica, RF, etc. ou qualquer combinação adequada dos meios anteriormente mencionados.
[335] O código do programa de computador que executa operações relacionadas aspectos da presente invenção pode ser escrito em qualquer combinação de uma ou mais linguagens de programação, incluindo uma linguagem de programação orientada para objetos, como Java, Smalltalk, C++ ou similares, e linguagens de programação procedural convencionais, como a linguagem de programação “C” ou linguagens de programação similares. O código do programa de computador pode ser executado integralmente no computador do usuário, parcialmente no computador do usuário, como um pacote de software autônomo, parcialmente no computador do usuário e parcialmente em um computador remoto, ou integralmente no computador remoto ou servidor. Finalmente, o computador remoto pode ser conectado ao computador do usuário através de qualquer tipo de rede, incluindo uma rede de área local (LAN) ou uma rede de área ampla (WAN), ou a conexão pode ser feita até um computador externo (por exemplo, através da Internet com o uso de um Provedor de Serviço de Internet).
[336] Essas instruções de programa de computador podem também ser armazenadas em uma mídia legível por computador que pode guiar um computador, outro aparelho de processamento de dados programável, ou outros dispositivos a funcionar de uma forma específica, de modo que as instruções armazenadas na mídia legível por computador produzem um artigo de fabricação que inclui instruções que implementam a função/ação especificada no presente documento.
[337] As instruções de programa de computador também podem ser carregadas em um computador, outro aparelho de processamento de dados programável, ou outros dispositivos para conduzir à execução de uma série de etapas operacionais no computador, outro aparelho programável, ou outros dispositivos para produzir um processo implementado por computador, de modo que as instruções executadas no computador ou outro aparelho programável fornecem processos para implementar as funções/ações especificadas no presente documento.
[338] A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm os mesmos significados, como comumente entendido por um versado na técnica ao qual esta invenção pertence.
[339] Os exemplos e figuras a seguir são fornecidos para propósitos ilustrativos. Deve-se entender, dessa forma, que o exemplo e as figuras não devem ser interpretados como limitadores. O versado na técnica será claramente capaz de contemplar modificações adicionais dos princípios aqui apresentados.
Exemplos Exemplo 1 - Seleção de gene para gerar um índice de prognóstico de câncer de próstata (PCPI)
[340] Para selecionar genes candidatos para a geração do índice PCPI, várias vias moleculares (como resumido em http://csbi.ltdk.helsinki.fi/anduril/tcga-gbm/table4_2.html) foram investigadas para correlação com o suposto marcador gênico PDE4D7, conforme descrito em WO2010131194 e WO2010131195. As vias moleculares que mostraram correlação significativa foram selecionadas para análise a jusante (Figura 1).
[341] Além disso, candidatos a gene relacionados ao câncer de próstata metastático e/ou hormônio-refratário foram selecionados a partir das seguintes publicações:
[342] - Gorlov IP et al. Candidate pathways and genes for prostate cancer: a meta-analysis of gene expression data; BMC Medical Genomics 2009, 2:48
[343] - Stanbrough M et al: Increased Expression of Genes Converting Adrenal Androgens to Testosterone in Androgen-Independent Prostate Cancer; Cancer Res 2006;66:2815-2825
[344] - Tamura K et al. Molecular Features of Hormone-Refractory Prostate Cancer Cells by Genome-Wide Gene Expression Profiles; Cancer Res 2007; 67(11):5117-25
[345] - Lapointe J et al. Gene expression profiling identifies clinically relevant subtypes of prostate cancer; PNAS 2003; 101(3):8110816
[346] - Sun Y et al. Optimizing Molecular Signatures for Predicting Prostate Cancer Recurrence. The Prostate, 69:1119-1127 (2009)
[347] No total, 967 genes (ver Figura 1) relatados como sendo possivelmente relevantes à progressão do câncer de próstata foram selecionados para análise adicional.
[348] Para construir uma assinatura de prognóstico de 19 genes, isto é, um conjunto de genes marcadores de interesse, os seguintes conjuntos de dados foram usados:
[349] - Taylor BS et al. Integrative Genomic Profiling of Human Prostate Cancer. Cancer Cell 18, 11-22, 2010 (GEO data set ID: GSE21032
[350] - Boormans JL et al. Identification of TDRD1 as a direct target gene of ERG in primary prostate cancer. Int J Cancer, 15 de julho de 2013; 133(2):335-45 (GEO data set ID: GSE41408)
[351] - Sun Y et al. Optimizing Molecular Signatures for Predicting Prostate Cancer Recurrence. The Prostate, 69:1119-1127 (2009) (GEO data set ID: GSE25136)
[352] - Sboner A et al. Molecular sampling of prostate cancer: a dilemma for predicting disease progression. BMC Medical Genomics 2010, 3:8 (GEO data set ID: GSE16560)
[353] - Nagakawa T et al. A Tissue Biomarker Panel Predicting Systemic Progression after PSA Recurrence PostDefinitive Prostate Cancer Therapy. PLoS ONE 3(5), e2318 (2010) (GEO data set ID: GSE10645)
[354] Para testar adicionalmente e validar o índice de prognóstico de câncer de próstata (PCPI) gerado, o seguinte conjunto de dados foi usado:
[355] Erho N et al. Discovery and Validation of a Prostate Cancer Genomic Classifier that Predicts Early Metastasis Following Radical Prostatectomy. PLoS One 8(6), e66855 (2013) (GEO data set ID: GSE46691)
Processamento de dados de expressão gênica de GSE
[356] Os respectivos arquivos CEL foram baixados do GEO (Gene Expression Omnibus) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/. Os dados do arquivo CEL dados foram carregados no Expression Console (Affymetrix Inc; Build 1.3.1.187) e foram pré-processados usando-se os arquivos de conjunto de sondas adequados fornecidos pela Affymetrix Inc, quando adequado, isto é, conjuntos de dados executados em uma plataforma Affymetrix Inc: GSE21032, GSE41408, GSE25136. Para conjuntos de dados analisados na plataforma DASL (isto é, GSE16560, GSE10645), os arquivos da matriz de série de dados foram usados conforme fornecidos pelo GEO para análise de dados a jusante.
[357] Supõe-se que genes de referência tenham uma expressão estável independentemente da amostra sendo processada e podem, portanto, ser usados como um padrão interno para normalizar os valores de saída Cq de uma análise de PCR de modo que os resultados sejam comparáveis, independentemente da quantidade da amostra de entrada usada. Embora esses genes sejam supostamente estáveis, sempre há certa variabilidade em sua expressão, e essa estabilidade pode também depender do tecido que está sendo analisado. Por essa razão, é recomendado o uso de mais de um gene de referência na normalização de valores de Cq de PCR e o uso de um conjunto de genes que apresenta baixa variabilidade no tipo específico de tecido/amostra sendo analisada (C. L. Andersen, J. L. Jensen, e T. F. 0rntoft, “Normalization of Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Data: A Model-Based Variance Estimation Approach to Identify Genes Suited for Normalization, Applied to Bladder and Colon Cancer Data Sets”, Cancer Res., vol. 64, n° 15, pp. 5245-5250, agosto de 2004; J. Vandesompele, K. De Preter, F. Pattyn, B. Poppe, N. Van Roy, A. De Paepe, e F. Speleman, “Accurate normalization of realtime quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes”, Genome Biol., vol. 3, no. 7, p. RESEARCH0034, junho de 2002).
[358] Foi feita uma seleção inicial de 9 genes de referência para ser usada neste estudo. A seleção final do conjunto de genes de referência usado para a normalização foi feita com o uso da ferramenta de software Biogazelle (qBase+ com análise GeNorm J. Hellemans, G. Mortier, A. D. Paepe, F. Speleman, e J. Vandesompele, “qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data”, Genome Biol., vol. 8, no. 2, p. R19, fevereiro de 2007) em todas as amostras clínicas analisadas.
[359] Os valores Cq de saída de um ensaio de PCR são intrinsecamente logarítmicos (base 2), e inversamente proporcionais à quantidade de mRNA presente na amostra. Usa-se a seguinte fórmula para normalizar os valores de Cq brutos:
[360] N(Cq gene de interesse ) = Média(Cq gene de ref) — (Cq gene de interesse)
[361] Em que N(Cq gene de interesse) é valor da expressão gênica normalizada para genes de interesse selecionados; onde a Média (Cq gene de ref) é a média aritmética dos valores de Cq de PCR da combinação selecionada dos genes de referência; em que (Cq gene de interesse) é o valor de Cq de PCR do gene de interesse.
[362] No caso de outras tecnologias além de qRT- PCR serem usadas para medir a expressão dos genes de referência ou dos genes de interesse, o valor de Cq de PCR será substituído por uma medição normalizada do valor de expressão gênica normalizada da respectiva tecnologia (por exemplo, uma RMA (Robust Multi-array Average) para microarranjos de DNA ou um valor de expressão gênica normalizada de FPKM (Fragements Per Kilobase of Exon Per Million Fragments Mapped, fragmentos por quilobase de éxon por milhão fragmentos mapeados) para sequenciamento de RNA).
Cálculo do índice de progressão do câncer de próstata (PCPI)
[363] Os genes de interesse (GOI) selecionados foram agrupados nos regulados negativamente entre grupos de pacientes com e sem progressão após tratamento primário em comparação com os regulados positivamente entre os grupos de pacientes com e sem progressão após tratamento primário. Um valor médio da expressão gênica para os genes regulados negativamente foi calculado (GEV_av_GOI_down) bem como um valor médio de expressão gênica para os genes regulados positivamente (GEV_av_GOI_up) a partir dos dados de expressão gênica normalizada para cada amostra de paciente analisada. O índice de progressão do câncer de próstata PCPI por paciente foi determinado como: PCPI = (GEV_av_GOI_up) - (GEV_av_GOI_down)
[364] O PCPI calculado foi usado para análise adicional de dados estatísticos.
Cálculo do PCPI 17 (com base nos dados de PCR quantitativa em tempo real)
[365] O PCPI foi calculado usando-se a seguinte fórmula:
[366] PCPI = Média(N(Cq PCPI genes pos ) ) — Média(N(Cq PCPI genes neg)) em que
[367] Média(N(CqPCPI genes pos )) é a média aritmética dos valores da expressão gênica normalizada (ver acima) para os genes: BGN, BIRC5, COL1A1, COL3A1, COL5A2, DYRK2, INHBA, THBS2 e VCAN e onde
[368] Média(N(CqPCPI genes neg)) é a média aritmética dos valores da expressão gênica normalizada (ver acima) para os genes: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4 e SRD5A2.
Cálculo do PCPI 18 (com base nos dados de PCR quantitativa em tempo real)
[369] O PCPI foi calculado usando-se a seguinte fórmula: PCPI = Média(N(Cq PCPI genes pos ) ) - Média(N(Cq PCPI genes neg)) em que
[370] Média(N(CqPCPI genes pos )) é a média aritmética dos valores da expressão gênica normalizada (ver acima) para os genes: BGN, BIRC5, COL1A1, COL3A1, COL5A2, DYRK2, INHBA, THBS2 e VCAN e onde
[371] Média(N(CqPCPI genes neg)) é a média aritmética dos valores da expressão gênica normalizada (ver acima) para os genes: PDE4D, AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4 e SRD5A2
Cálculo do PCPI 19 (com base nos dados de PCR quantitativa em tempo real)
[372] O PCPI foi calculado usando-se a seguinte fórmula: PCPI = Média(N(Cq PCPI genes pos ) ) - Média(N(Cq PCPI genes neg)) em que
[373] Média(N(CqPCPI genes pos )) é a média aritmética dos valores da expressão gênica normalizada (ver acima) para os genes: BGN, BIRC5, COL1A1, COL3A1, COL5A2, DYRK2, INHBA, THBS2 e VCAN e onde
[374] Média(N(CqPCPI genes neg)) é a média aritmética dos valores da expressão gênica normalizada (ver acima) para os genes: PDE4D5, PDE4D7, AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4 e SRD5A2.
[375] Análise de correlação do índice de progressão de câncer de próstata (PCPI) vs. parâmetros clínicos e resultados do paciente
[376] Todas as análises estatísticas (por exemplo, análise de regressão logística, análise ROC, análise de regressão de COX, etc.) do PCPI e sua correlação com o resultado do paciente em comparação com os parâmetros clínicos, como PSA, pGleason, estágio de pT foram realizadas com XLSTAT versão 2014.1.03
Resultados
[377] Os 967 genes candidatos selecionados foram investigados quanto à expressão diferencial nos conjuntos de dados da expressão gênica acima entre os pacientes com câncer de próstata que não apresentaram progressão da doença após tratamento primário em relação aos que demonstraram progressão da doença para um dos seguintes desfechos clínicos: recidiva bioquímica, recidiva clínica por detecção de metástases locais ou distantes, morte por câncer de próstata específico.
[378] A Tabela 2 (ver Figura 2) fornece uma visão geral dos 57 genes selecionados que foram encontrados como sendo expressos significativamente (p<0,05) e diferencialmente, e foram regulados entre grupos de paciente na mesma direção (isto é, regulados positivamente ou negativamente) entre grupos de paciente mencionados acima em pelo menos três dos cinco conjuntos de dados testados. Subsequentemente, os genes foram classificados em três categorias, de acordo com os seguintes critérios:
[379] Cat_3: todos os genes que foram observados no máximo em 3 conjuntos de dados a serem diferencialmente expressos com um valor de p significativo (p< 0,05) na mesma direção ou genes com observação não única
[380] Cat_2: todos os genes que foram observados em 4 dos 5 conjuntos de dados a serem diferencialmente expressos com um valor de p significativo (p< 0,05) na mesma direção
[381] Cat_1: todos os genes que foram observados em 4 dos 5 conjuntos de dados a serem diferencialmente expressos com um valor de p significativo (p< 0,05) na mesma direção, mas limitados a 9 genes com regulação positiva bem como 10 genes com regulação negativa
[382] De preferência, a assinatura de PCPI compreende ou consiste dos 19 genes a seguir: PDE4D5, PDE4D7, AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2.
[383] Como nem todos os conjuntos de dados fornecem informações sobre o nível de transcrito das isoformas de PDE4D (isto é, PDE4D5 e PDE4D7), os resultados demonstrados são baseados na medição do gene PDE4D, uma vez que a expressão do gene PDE4D é muito bem correlacionada à expressão de PDE4D7 (normalizada em relação à expressão de PDE4D5) nos conjuntos de dados GSE21032 e GSE41408); consequentemente, o PCPI_18 determinado compreendeu os 18 genes a seguir: PDE4D, AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5, DYRK2.
[384] Para tais conjuntos de dados onde o gene PDE4D não foi medido (isto é, GSE16560, GSE10645) o PCPI_17 determinado compreendeu os 17 genes a seguir: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5, DYRK2.
Correlação do PCPI aos dados de resultado clínico de pacientes com câncer da próstata após tratamento primário
[385] A Tabela 3 (vide Figura 3) mostra uma visão geral do desempenho do PCPI_18 ou PCPI_17 para predizer o desfecho primário do desenvolvimento de metástases distantes em 10 a 15 anos após o tratamento primário (cirurgia de próstata em geral) para os conjuntos de dados GSE21032, GSE41408, GSE25136, GSE16560, GSE10645. Para os pacientes investigados no conjunto de dados GSE16560, o câncer de próstata foi detectado durante uma TURP (ressecção transuretral) e os pacientes foram subsequentemente tratados de maneira conservadora (isto é, sem remoção da próstata). Para os pacientes investigados no conjunto de dados GSE10645, o monitoramento de pacientes para o desfecho apenas começou após o início da recidiva bioquímica). Esses conjuntos de dados foram usados para construir a assinatura PCPI (dados de treinamento). O número de pacientes por grupo (não progressão vs. progressão para metástases) é também mostrado como AUC (área sob a curva) derivada de uma análise ROC. A AUC indica o poder relativo do PCPI nos diferentes conjuntos de dados para prever o desfecho primário dentro da coorte).
[386] A Tabela 4 (ver Figura 4) mostra o desempenho de PCPI_18 para predizer o desfecho primário do desenvolvimento de metástases distantes em 10 a 15 anos após o tratamento primário para o conjunto de dados GSE46691; esse conjunto de dados não foi usado para treinar o PCPI e é usado como um conjunto de dados de verificação independente (dados de validação). Para os pacientes investigados no conjunto de dados GSE10645, o monitoramento de pacientes para o desfecho só começou após o início da recidiva bioquímica). O número de pacientes por grupo (não progressão vs. progressão para metástases) é também mostrado como AUC (área sob a curva) derivada de uma análise ROC. A AUC indica o poder relativo do PCPI nos diferentes conjuntos de dados para prever o desfecho primário dentro da coorte).
[387] A Tabela 5 (ver Figura 5) mostra o desempenho de PCPI_18 ou PCPI_17 para predizer o desfecho primário do desenvolvimento de metástases distantes em 10 a 15 anos após o tratamento primário (cirurgia de próstata em geral) para os conjuntos de dados GSE21032, GSE41408, GSE16560, GSE10645 em uma análise de regressão de Cox multivariada comparada aos padrões dos parâmetros clínicos, como PSA pré- tratamento, escore de Gleason de biópsia ou patologia, ou estágio da doença clínica/patologia. O qui-quadrado, bem como a razão de risco, para o PCPI e os parâmetros clínicos individuais, é mostrado para cada conjunto de dados individual.
[388] A Tabela 6 (ver Figura 6) mostra uma visão geral do desempenho do PCPI_18 para predizer o desfecho primário do desenvolvimento de recidiva de doença bioquímica (BCR) em 10 a 15 anos após o tratamento primário (cirurgia de próstata em geral) para os conjuntos de dados GSE21032, GSE41408, GSE25136. O número de pacientes por grupo (sem progressão vs. progressão para BCR) é também mostrado como a AUC (área sob a curva) derivada de uma análise ROC. A AUC indica o poder relativo do PCPI nos diferentes conjuntos de dados para prever o desfecho primário dentro da coorte).
[389] A Tabela 7 (ver Figura 7) mostra o desempenho de PCPI_18 para predizer o desfecho primário do desenvolvimento de recidiva de doença bioquímica (BCR) em 10 a 15 anos após o tratamento primário (cirurgia de próstata em geral) para os conjuntos de dados GSE21032, GSE41408, GSE25136 em uma análise de regressão de Cox multivariada comparada aos padrões dos parâmetros clínicos, como PSA pré-tratamento, escore de Gleason de biópsia ou patologia ou estágio da doença clínica/patologia. O qui-quadrado, bem como a razão de risco, para o PCPI e os parâmetros clínicos individuais, é mostrado para cada conjunto de dados individual.
[390] A Tabela (ver Figura 8) mostra uma análise de corte da curva ROC de PCPI_18 para sustentar a decisão clínica em relação à estratificação do paciente ou para a vigilância ativa (AS) ou o tratamento ativo (por exemplo, prostatectomia, radioterapia e terapia hormonal). O corte, conforme mostrado na tabela, foi selecionado da curva ROC de modo que >=90% dos homens com doença agressiva foram corretamente classificados (correspondendo a 90% de sensibilidade). Esse corte permite a estratificação de 134 com um perfil de muito baixo risco em relação, por exemplo, à vigilância ativa em vez de, por exemplo, cirurgia. A sobrevida livre de progressão nessa coorte para o desfecho de doença metastática ao longo de aproximadamente 10 anos de acompanhamento está próxima a 85%. A mesma abordagem foi aplicada para o modelo clínico (escore de Gleason de patologia) com o resultado de que um valor de corte de um escore de Gleason <=6 levaria à estratificação de apenas 57 homens em relação à, por exemplo, vigilância ativa em vez de, por exemplo, cirurgia. A sobrevida livre de progressão nesta coorte de paciente seria próxima a 90%, mas com o custo de que muitos mais homens com doença não progressiva seriam estratificados para, por exemplo, cirurgia; o uso de PCPI_18 estratifica mais que o dobro de homens para AS em comparação com o escore de Gleason de patologia enquanto o perfil de risco é muito comparável (85% versus 90% de sobrevida livre de progressão, respectivamente). O poder de estratificação pode ser aumentado ainda mais por um modelo de combinação de PCPI_18 e Gleason de patologia. Usando esse modelo, 146 homens (comparado a 134) seriam estratificados para AS com probabilidade de sobrevida livre de progressão ao longo de 10 anos de cerca de 87%.
[391] A análise de corte para a coorte de paciente mostrada foi realizada para a coorte total (545 pacientes), uma subcoorte com escores de Gleason de patologia >=7 (482 pacientes), bem como uma subcoorte com escores de Gleason de patologia >=8 (211 pacientes).
[392] As Figuras 11, 12 e 13 referem-se a uma análise obtida de um estudo que foi conduzido em aproximadamente 500 pacientes com acompanhamento longitudinal comparando o desempenho de PCPI_19 (Figura 11), o escore GPSu, que é derivado dos dados de RNAseq analisando a expressão de 12 genes relacionados ao câncer e 5 genes de referência e foi calculado de acordo com o método, desde que possa ser pressuposto do artigo “Analytical validation of the Oncotype DX prostate cancer assay - a clinical RT-PCR assay optimized for prostate needle biopsies” de Dejan Knezevic et al. em BMC Genomics (2013), 14: 690 (Figura 12) e o escore CCP derivado dos níveis de expressão de 31 genes e calculado desde que possa ser pressuposto do artigo “Prognostic value of an RNA expression signature derived from cell cycle proliferation genes for recurrence and death from prostate cancer: A retrospective study in two cohorts” de Jack Cuzick et al. em Lancet Oncol. (2011); 12(3): 245-255) (Figura 13).
[393] Para melhor comparação, o escore GPSu e CCP foram escalonados para uma faixa entre 1 e 5.
[394] As Figuras 11, 12 e 13 mostram diferentes riscos de recidiva (ver a descrição abaixo) ao longo de 5 ou 10 anos, de acordo com diferentes grupos de paciente. No eixo X, os grupos de pacientes foram definidos pelos grupos de risco NCCN; VL&LR=risco muito baixo e baixo; FIR=risco intermediário favorável; UIR=risco intermediário desfavorável; HR=alto risco. NCCN são diretrizes americanas comumente usadas em oncologia (https://www.nccn.org/professionals/physician gls/f guidelines .asp) . No eixo Y, os grupos de pacientes foram definidos em 4 categorias de diferentes escores: escore 1-2; 2-3; 3-4 e 4-5. Na grade 4x4, os pacientes foram selecionados para qualquer uma das células da grade, de acordo com suas características de risco clínico NCCN e de acordo com o escore de PCPI, GPSu ou CCP. O risco diferente, de acordo com o grupo de risco clínico, foi calculado (a linha no fundo) ou de acordo com a categoria de escore (a coluna do lado direito do quadro da tabela). No interior das células, apenas o risco de recidiva de BCR de 5 anos é representado por razões de clareza.
[395] As descrições de risco são:
[396] 5-y BCR - recidiva bioquímica ao longo de 5 anos
[397] 10-y RC - recidiva clínica para metástases ao longo de 10 anos
[398] 10-y PCSM - mortalidade específica de câncer de próstata ao longo de 10 anos
[399] 10-y OM - mortalidade total (devido a todos os motivos) ao longo de 10 anos
[400] Os números sublinhados nas Figuras 11, 12 e 13 indicam áreas de melhor desempenho de PCPI em relação às outras assinaturas. Os pacientes que se enquadram nessas categorias têm potencial de vigilância ativa em comparação com decisões clínicas de tratamento ativo e devem, portanto, ter, de preferência, o mínimo de risco de recidiva possível. O PCPI tem melhor desempenho que as outras assinaturas nessas áreas.

Claims (12)

1. MÉTODO, caracterizado por compreender: - determinar um nível de expressão gênica para as assinaturas gênicas: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2 e, opcionalmente, as isoformas de PDE4 compreendem PDE4D5 e/ou PDE4D7, para obter um perfil de expressão de indivíduo para um indivíduo, e por compreender ainda: - classificar o indivíduo como tendo um bom prognóstico ou um mau prognóstico de câncer de próstata, com base no perfil de expressão do indivíduo, sendo que o bom prognóstico prediz uma probabilidade de sobrevida aumentada dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial e/ou nenhuma progressão da doença após o tratamento primário, e o mau prognóstico prediz doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida e uma maior probabilidade de recorrência bioquímica, recorrência clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial; e/ou - classificar o indivíduo como tendo ou não tendo uma predisposição para câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença com base no perfil de expressão do indivíduo, sendo que a predisposição prediz uma doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida e uma maior probabilidade de recorrência bioquímica, recorrência clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial.
2. MÉTODO, caracterizado por compreender: - classificar um indivíduo como tendo um bom prognóstico ou um mau prognóstico com base em um perfil de expressão de indivíduo para o indivíduo, sendo que o perfil de expressão de indivíduo inclui o nível de expressão gênica das assinaturas gênicas: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2 e, opcionalmente, as isoformas de PDE4 que compreendem PDE4D5 e/ou PDE4D7 e sendo que um bom prognóstico prediz uma probabilidade de sobrevida aumentada dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial e/ou nenhuma progressão da doença após o tratamento primário, e o mau prognóstico prediz doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida e uma maior probabilidade de recorrência bioquímica, recorrência clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial; e/ou - classificar um indivíduo como tendo ou não tendo uma predisposição para câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença com base em um perfil de expressão de indivíduo para o indivíduo, sendo que o perfil de expressão de indivíduo inclui o nível de expressão gênica das assinaturas gênicas: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2 e, opcionalmente, as isoformas de PDE4 que compreendem PDE4D5 e/ou PDE4D7, sendo que a predisposição prediz uma doença agressiva, uma probabilidade de sobrevida reduzida, uma maior probabilidade de recorrência bioquímica, recorrência clínica e/ou a presença de metástases locais ou distantes, dentro de um período de tempo predeterminado após o diagnóstico inicial.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo perfil de expressão de indivíduo ser convertido em um índice de progressão do câncer de próstata.
4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo índice de progressão do câncer de próstata ser calculado de acordo com a seguinte equação: PCPI = (GEV_av_GOI_up) - (GEV_av_GOI_down), onde GEV_av_GOI_up é um valor médio da expressão gênica de genes regulados positivamente e em que GEV_av_GOI_down é um valor médio da expressão gênica de genes regulados negativamente, sendo que os valores são determinados com base nos dados da expressão gênica normalizada por cada amostra de indivíduo.
5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo nível da expressão do conjunto de assinaturas gênicas ser normalizado para a expressão de um gene de referência, sendo que o gene de referência é um gene constitutivo , sendo que o gene constitutivo é TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A ou B2M.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo indivíduo ser classificado como tendo um bom prognóstico se o índice de progressão do câncer de próstata estiver abaixo de um limiar selecionado ou como tendo um mau prognóstico se o índice de progressão do câncer de próstata estiver acima do limiar selecionado; e/ou sendo que o indivíduo é classificado como tendo uma predisposição para câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença se o índice de progressão do câncer de próstata estiver acima de um limitar selecionado ou como não tendo uma predisposição para câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença se o índice de progressão do câncer de próstata estiver abaixo do limiar selecionado.
7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por compreender adicionalmente: a estratificação do indivíduo para o risco de doença agressiva versus doença não agressiva, de acordo com o prognóstico determinado ou a predisposição determinada.
8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo mau prognóstico ou predisposição de câncer de próstata que é suscetível à progressão da doença ser indicativo de elegibilidade do indivíduo para ser tratado com qualquer um ou mais dos tratamentos selecionados do grupo que consiste em cirurgia da próstata, remoção da próstata, quimioterapia, radioterapia, braquiterapia, dissecação do linfonodo limitada ou alargada, terapia hormonal.
9. USO DE UM PRODUTO, caracterizado por compreender: iniciadores e/ou sondas para determinação do nível de expressão gênica para as assinaturas gênicas: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2 e, opcionalmente, as isoformas de PDE4 que compreendem PDE4D5 e/ou PDE4D7; para o estabelecimento de um prognóstico para um paciente com diagnóstico de câncer de próstata, para a estratificação de um paciente com diagnóstico de câncer de próstata ou para a determinação de predisposição para câncer de próstata agressivo ou indolente em um paciente com câncer de próstata.
10. USO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo produto ser um kit de PCR, um kit de sequenciamento de RNA ou uma micromatriz ou um kit de micromatriz.
11. SISTEMA, caracterizado por compreender um produto de programa de computador compreendendo um código legível por computador armazenado em uma mídia legível por computador ou que pode ser transferido por download de uma rede de comunicação que, quando executado em um computador, implementa uma ou mais etapas, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e um produto compreendendo: iniciadores e/ou sondas para determinação do nível de expressão gênica para as assinaturas gênicas: AZGP1, FBLN1, ILK, KRT15, MEIS2, MYBPC1, PAGE4, SRD5A2, COL1A1, COL3A1, COL5A2, INHBA, THBS2, VCAN, BGN, BIRC5 e DYRK2 e, opcionalmente, as isoformas de PDE4 que compreendem PDE4D5 e/ou PDE4D7; que compreende adicionalmente, de modo opcional, iniciadores e/ou sondas para determinar os níveis de expressão de um conjunto de genes relacionados em qualquer uma das Figuras 1 ou 2 além dos genes acima mencionados; e/ou que compreende adicionalmente, de modo opcional, iniciadores e/ou sondas para determinar o nível de expressão gênica de um gene de referência, de preferência, sendo que o gene de referência é um gene constitutivo e, com mais preferência, sendo que o gene constitutivo é TBP, HPRT1, ACTB, RPLP0, PUM1, POLR2A ou B2M.
12. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo produto ser um kit de PCR, um kit de sequenciamento de RNA ou uma micromatriz ou um kit de micromatriz.
BR112017025430-1A 2015-05-29 2016-05-26 Método, uso de um produto, produto de programa de computador e sistema BR112017025430B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15169782.8 2015-05-29
EP15169782 2015-05-29
PCT/EP2016/061885 WO2016193109A1 (en) 2015-05-29 2016-05-26 Methods of prostate cancer prognosis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112017025430A2 BR112017025430A2 (pt) 2018-09-11
BR112017025430B1 true BR112017025430B1 (pt) 2024-04-30

Family

ID=53298160

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112017025430-1A BR112017025430B1 (pt) 2015-05-29 2016-05-26 Método, uso de um produto, produto de programa de computador e sistema

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20180148794A1 (pt)
EP (1) EP3303618B1 (pt)
JP (1) JP6743056B2 (pt)
KR (1) KR20180014086A (pt)
CN (1) CN107743524B (pt)
BR (1) BR112017025430B1 (pt)
DK (1) DK3303618T3 (pt)
ES (1) ES2754434T3 (pt)
RU (1) RU2721916C2 (pt)
WO (1) WO2016193109A1 (pt)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3548631B1 (en) * 2016-12-01 2021-08-25 Koninklijke Philips N.V. Risk scores based on human phosphodiesterase 4d variant 7 expression
SG11201906318WA (en) * 2017-02-13 2019-08-27 Genomic Health Inc Algorithms and methods for assessing late clinical endpoints in prostate cancer
EP3502280A1 (en) 2017-12-21 2019-06-26 Koninklijke Philips N.V. Pre-surgical risk stratification based on pde4d7 expression and pre-surgical clinical variables
CN109293763B (zh) * 2018-10-26 2021-10-26 中国农业科学院特产研究所 水貂激活素b蛋白及其制备与应用
KR102455469B1 (ko) * 2019-04-17 2022-10-17 사회복지법인 삼성생명공익재단 하부요로증상 진단보조 방법
CN110760584B (zh) * 2019-11-07 2022-12-09 深圳市华启生物科技有限公司 前列腺癌疾病进展生物标志物及其应用
RU2740382C1 (ru) * 2019-12-13 2021-01-13 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ выявления пациентов с повышенным риском развития рака простаты
CN111363848A (zh) * 2020-03-19 2020-07-03 申联生物医药（上海）股份有限公司 用于呼吸道rna病毒pcr检测的内参基因及其检测产品
US11845993B2 (en) * 2020-03-24 2023-12-19 The Regents Of The University Of Michigan Methods for identifying prostate cancer
EP3960875A1 (en) * 2020-08-28 2022-03-02 Koninklijke Philips N.V. Pcr method and kit for determining pathway activity
RU2770787C1 (ru) * 2021-04-09 2022-04-21 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ индивидуального прогнозирования сложности робот-ассистированной простатэктомии в зависимости от объема предстательной железы
RU2768477C1 (ru) * 2021-04-19 2022-03-24 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ прогнозирования агрессивных форм рака предстательной железы у больных группы промежуточного и высокого риска
CN113499434B (zh) * 2021-08-24 2023-10-31 海碧诗(海南)实业集团有限公司 一种治疗发少、脱发的洗发水
EP4360711A1 (en) * 2022-10-27 2024-05-01 Koninklijke Philips N.V. Treatment of prostate cancer by promoting pde4d7
WO2024088865A1 (en) 2022-10-27 2024-05-02 Koninklijke Philips N.V. Treatment of prostate cancer by promoting pde4d7

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2608643A1 (en) * 2005-05-13 2006-11-16 Universite Libre De Bruxelles Gene-based algorithmic cancer prognosis
KR102110469B1 (ko) * 2009-05-12 2020-05-14 코닌클리케 필립스 엔.브이. 악성의 호르몬 민감성 전립선 암에 대한 마커로서의 포스포디에스테라제 4ｄ7
WO2011130435A1 (en) * 2010-04-13 2011-10-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Biomarkers based on a multi-cancer invasion-associated mechanism
MX338883B (es) * 2010-07-27 2016-05-04 Genomic Health Inc Metodo para usar expresion de gen para determinar el pronostico de cancer de prostata.
WO2012174203A2 (en) * 2011-06-14 2012-12-20 Anthony Albino Methods and kits for the detection and treatment of recurring prostate cancer
JP6351112B2 (ja) * 2012-01-31 2018-07-04 ジェノミック ヘルス， インコーポレイテッド 前立腺癌の予後を定量化するための遺伝子発現プロフィールアルゴリズムおよび試験
WO2014012176A1 (en) * 2012-07-20 2014-01-23 Diagnocure Inc. Methods, kits and compositions for providing a clinical assessment of prostate cancer
EP2755030A1 (en) * 2013-01-15 2014-07-16 Bergen Teknologioverforing AS Prognostic marker for endometrial carcinoma
WO2014153442A2 (en) * 2013-03-21 2014-09-25 The General Hospital Corporation Methods and systems for treatment of ovarian cancer

Also Published As

Publication number Publication date
CN107743524A (zh) 2018-02-27
KR20180014086A (ko) 2018-02-07
RU2017146154A3 (pt) 2019-12-11
WO2016193109A1 (en) 2016-12-08
EP3303618A1 (en) 2018-04-11
JP6743056B2 (ja) 2020-08-19
CN107743524B (zh) 2022-10-28
RU2017146154A (ru) 2019-07-01
BR112017025430A2 (pt) 2018-09-11
RU2721916C2 (ru) 2020-05-25
US20180148794A1 (en) 2018-05-31
DK3303618T3 (da) 2019-12-16
ES2754434T3 (es) 2020-04-17
EP3303618B1 (en) 2019-09-25
JP2018527883A (ja) 2018-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3303618B1 (en) Methods of prostate cancer prognosis
JP7042784B2 (ja) 遺伝子発現を用いた前立腺癌の予後を定量化する方法
Filella et al. Emerging biomarkers in the diagnosis of prostate cancer
US11549148B2 (en) Neuroendocrine tumors
JP2021177761A (ja) 遺伝子発現を用いて腎癌の臨床的結果の見込みを判定する方法
JP2019076096A (ja) 目的遺伝子発現の線形結合を用いた細胞信号伝達経路活性の評価
CN106893784A (zh) 用于预测肝癌预后的lncRNA标志物
KR20120065959A (ko) 위암의 예후 예측용 마커 및 이를 이용하는 위암의 예후 예측 방법
PT1781814E (pt) Métodos e kit para o prognóstico do cancro da mama
US11827938B2 (en) Methods of prostate cancer prognosis
US20160222461A1 (en) Methods and kits for diagnosing the prognosis of cancer patients
Lerebours et al. Hemoglobin overexpression and splice signature as new features of inflammatory breast cancer?
KR102376220B1 (ko) 전립선암에서 후기 임상적 종점을 평가하기 위한 알고리즘 및 방법
CN109402252A (zh) 急性髓系白血病风险评估基因标志物及其应用
JP7184771B2 (ja) ヒトホスホジエステラーゼ４ｄバリアント７の発現に基づくリスクスコア
JP2022512634A (ja) Ｐｄｅ４ｄ７及びｄｈｘ９発現に基づく術前のリスク層別化
WO2015121663A1 (en) Biomarkers for prostate cancer
Kawashima et al. TERT promotor region rearrangements analyzed in high-risk neuroblastomas by FISH method and whole genome sequencing
WO2023023064A1 (en) Methods and materials for predicting the progression of prostate cancer and treating same
BRPI1003742B1 (pt) Uso combinado de técnicas e biomarcadores moleculares para monitoramento e diagnóstico do câncer de próstata

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]

Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS.

B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 26/05/2016, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS