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Verfahren zur Gewinnung von Cephalosporin C
In der brit. Patentschrift Nr. 810, 196 wurde gezeigt, dass das Antibiotikum Caphalosporin C in reiner Form aus Rohkonzentraten mit Hilfe einer Vielzahl sowohl von Lösungsmittel-Fraktionierverfahren wie auch von Ionenaustauscher-Chromatographierverfahren isoliert werden kann. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verbesserungen in der Gewinnung von Cephalosporin C, wie es in der genannten Patentschrift beschrieben wird, und hat die Schaffung eines Verfahrens zum Ziele, welches die Nachteile der bisher bekannten Verfahren überwindet.
In den früheren Verfahren wurde z. B. das Gärungsmedium (im folgenden als "Brühe" bezeichnet) durch Filtrieren oder Zentrifugieren geklärt und mit Aktivkohle in Berührung gebracht,. aus welcher das aktive Material dann ausgewaschen und an einer Säule aus Aluminiumoxyd oder einem Anionenaustauscherharz wieder adsorbiert wurde, aus welcher es erneut ausgewaschen und sodann einem LösungsmittelExtraktionsverfahren unterworfen wurde, wodurch das Cephalosporin C räumlich getrennt wurde von dem gleichfalls anwesenden Cephalosporin N.
Alternativ wurde das Cephalosporin N in den Eluaten der Kohlesäule oder jenen der Ionenaustauscher-oder Aluminiumoxydsäuleentweder indie entsprechendePeni- cillinsäure umgewandelt, indem die Lösung solchen Temperatur-und Aziditätsbedingungen unterworfen wurde, dass die Umwandlung des Cephalosporin N in seine Penicillinsäure erfolgte, wobei aber das Cephalosporin C praktisch unangegriffen blieb, oder das Cephalosporin N wurde unter der Wirkung des En-
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dukten des Cephalosporin N durch die Wirkung der Penicillinase getrennt, wobei man sich der Lösungsmittelfraktionierung oder der Ionenaustauscherharz-Chromatographie bediente, die in der genannten brit, Patentschrift Nr. 810, 196 beschrieben sind.
D äs Gewinnungsverfahren war etwas kompliziert und es wurden Versuche unternommen, das Cephalosporin C direkt aus der mit Säure behandelten Brühe mit einem anionenaustauschenden Material zu adsorbieren, aber diese direkte Adsorption aus der Brühe hatte die Nachteile, dass sehr grosse Mengen des Anionenaustauscherharzes erforderlich waren, u.
zw. wegen der Gegenwart anderer Anionen als Cephalosporin C in der Brühe, während ausserdem das Chloridion laufend ausgewaschen wurde und Schwierigkeiten in den weiterenstufen derGewinnung desCephalosporinsC hervorrief, weil bei den weiteren Gewinnungsteilschritten ein Teilschritt die Auswaschung mit Pyridinacetat umfasste, was zum Vorhandensein von Pyridinhydrochlorid im Eluat führte, was wiederum während dem Konzentrieren der Lösung einen pH-Wert erzeugte, bei dem das Cephalosporin C zerstört wurde und bei dem ausserdem die Ausfällung bei Zugabe von Aceton zu der wässerigen Lösung verhindert wurde. Die Entfernung des Chloridions aus der Lösung könnte zwar durch Ausfällung mittels Ag-Verbindungen erreicht werden, doch wäre ein solches Verfahren unwirtschaftlich.
Nunmehr wurde ein sehr bequemes und ausserordentlich zufriedenstellendes Verfahren gefunden, indem man das Cephalosporin N mittels eines starken Kationenaustauschers zerstört. Dies bietet den Vorteil gegenüber der Verwendung von Säure, dass in die Lösung keine Fremdionen eingebracht werden, die bei der nachfolgenden Adsorption des Cephalosporins C an einem Anionenaustauscherharz stören würden.
Die Erfindung bezieht sich somit auf ein Verfahren zur Gewinnung von Cephalosporin C aus einem Kulturmedium durch Behandlung mit einem Anionenaustauschermaterial, nachdem im Medium befind-
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liches Cephalosporin N durch Umwandlung in Penicil1insäure zerstört worden ist, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Zerstörung von Cephalosporin N mit- Hilfe eines Kationenaustauschmaterials bewirkt wird und die Behandlung mit Anionenaustauschmaterial in der Weise durchgeführt wird, dass in einer ersten Stufe Verunreinigungen mit anorganischen Ionen selektiv aus dem Medium an ein Anionenaustauschmaterial adsorbiert werden, während das Cephalosporin C selbst in einer nachfolgenden Stufe an ein Anionenaustauschmaterial adsorbiert wird, welches frei von den genannten Verunreinigungen ist, worauf das Cephalosporin C eluiert wird.
Aus dem sauren Perkolat wird das Cephalosporin C durch Adsorption an ein Anionenaustauschmaterial
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rialien), abgetrennt.
Das Anionenaustauschmaterial wird vorzugsweise mit Wasser gewaschen und dann das adsorbierte Cephalosporin C aus dem Anionenaustauschermaterial mit Essig- oder Ameisensäure, welche im Falle der Verwendung von schwachen Anionenaustauschermaterialien durch Zusatz einer schwachen Base, vorzugsweise von Pyridin oder Ammoniak, gepuffert werden müssen, eluiert.
Die aus dem Anionenaustauschermaterial ausgewaschene Lösung des Cephalosporins C wird vorzugsweise durch Vakuumdestillation konzentriert, wenn Pyridin-Puffermaterialien verwendet worden sind. In jenen Fällen, in denen Ammonium-Puffermaterialien verwendet-worden sind, kann das Material durch Vakuumdestillation mit nachfolgender Entfernung aller verbleibenden flüchtigen Ammoniumsalze durch Sublimation im Hochvakuum konzentriert werden. Alternativ kann der Ammoniak durch Pyridin ersetzt werden, indem man das Konzentrat über ein starkes Kationenaustauschermaterial in der Pyridinform leitet und die Pyridinpuffer dann durch einfache Destillation entfernt. In jedem Falle wird das aktive Material durch Zugabe von Aceton ausgefällt,- wobei sodann der ausgefällte Feststoff gelöst wird.
Wenn er nicht von Cephalosporin N frei ist, wird die Lösung auf PH von etwa 3 gehalten, um das restliche Cephalosporin N in seinePenicillinsäure überzuführen, wonach ein feinverteiltes Anionenaustauschermaterial weniger stark mit Cephalosporin C beladen wird als die erste Säule, dann das Cephalosporin C aus diesem feinverteilten Anionenaustauschermaterial (vorzugsweise die Amberlitharze IRA-400, IR-4B oderXE-58) chromatographisch durch Auswaschentwicklung mit Essig- oder Ameisensäure abgetrennt, wobei diese Säuren wie oben angegeben gepuffert sein können. Die Anionenkonzentration wird so gewählt, um in der kürzest möglichen Reaktionszeit eine gute Abtrennung des Cephalosporins C von den vorhandenen Verunreinigungen zu erzielen.
Die Lösung wird sodann vorzugsweise durch Vakuumdestillation konzentriert, mit nachfolgender Entfernung aller verbleibenden Ammoniumsalze durch Hochvakuumsublimation oder durch Ersatz der Ammoniumsalze durch Pyridin, wie oben beschrieben, sowie Ausfällung der aktiven Materialien durch Zusatz von Aceton. Falls man die erste Anionenaustauschersäule weglässt, erhält man das Cephalosporin C in verdünnterer Lösung. Beim Verfahren ist auch das Wiederauflösen des Cephalosporins C und seine Umwandlung hauptsächlich in sein Na-Salz durch Zugabe von NaOH, um die Lösung auf ein PH von etwa 6 zu bringen, vorgesehen.
Schliesslich wird beim erfindungsgemässen Verfahren die Lösung über ein starkes Kationenaustauschermaterial (zweckmässig das unter der Handelsbezeichnung Dowexharz 50 x 8 bekannte Material) in der Na-Form geleitet, wobei das genannte Na-Salz dann konzentriert und aus der Lösung auskristallisiert wird. Andere Salze als das Na-Salz können durch entsprechende Abänderung der vorstehend geschilderten Vorgangsweise erhalten werden. Da das Verfahren lediglich mit Hilfe vonlonenaustauschmaterialien durchgeführt werden kann, erhält man Lösungen, die von andern Ionen als jenen der letzten Auswaschlösung, z. B. Essigsäure oder einem Salz derselben, wie Pyridinacetat, und natürlich dem Cephalosporin C, praktisch frei sind.
Es wurde gefunden, dass beim Perkolieren der Lösung durch das starke Anionenaustauschermaterial häufig ein Durchbrechen der Chloridionen eintritt, bevor das gesamte Cephalosporin C perkoliert worden ist. Eine Ausführungsform der Erfindung besteht darin, dass ein starkes Anionenaustauschermaterial (Amberlitharz IRA-400) in einer Anzahl von Abschnitten verwendet wird, wobei die Lösung sofort von einem Abschnitt in den nachfolgenden überführt wird, wenn Chloridionen in dem Perkolat festgestellt werden. Wenn man auf diese Weise arbeitet, kann mit Sicherheit erreicht werden, dass das Anionenaustauschermaterial stets mit Chloridionen gesättigt ist. Dadurch werden Verluste an aktivem Material in diesem Stadium vermieden.
Das aus den aufeinanderfolgenden Abschnitten des Anionenaustauschermaterials gesammelte, perkolierte Cephalosporin C enthält keine feststellbaren Mengen an Chlorid-, Sulfat-oder Phosphationen und ausserdem ist die Gesamtmenge des Cephalosporins C, die in der ursprünglichen, dem Anionenaustauscher aufgegebenen, angesäuerten Brühe enthalten war, vorhanden.
Es folgt nun eine Beschreibung der verschiedenen Arten von Ionenaustauschermaterialien, auf die vorstehend Bezug genommen wurde.
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1. Die für die Einstellung des pH-Wertes verwendeten starken Kationenaustauschermaterialien sind Ionenaustauschermaterialien, welche stark saure Gruppen enthalten, wie Sulfonat-oder Phosphatradikale, welche bei pH-Werten oberhalb 2, 5 Cephalosporin C nicht merklich adsorbieren. Typische geeignete Kationenaustauschermaterialien sind die unter den Namen"Amberlit IR-120"oder"Dowex 50 x 8" gehandelten Harze.
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drängt werden kann. Typische geeignete Anionenaustauschermaterialien sind die unter den Namen"Am- berlit IRA-400", "Dowex 1" oder "Deacídit-FF" gehandelten Harze.
3. Die für die Adsorption von Cephalosporin C verwendeten Anionenaustauschermaterialien können schwache Anionenaustauschermaterialien sein, welche eine grosse Kapazität für Cephalosporin C besitzen, wenn sie in der Acetatform vorliegen und wenn die Lösung ein PH von etwa 3 besitzt, welche weiterhin die Eigenschaft haben, Cephalosporin C bei einem PH von 6, 0 an eine 1, 0 M Pyridinacetatlösung abzugeben. Typische geeignete schwache Anionenaustauschermaterialien sind die Harze, welche unter den Markennamen"Amberlit IR-4B"und"Deacidit E"gehandelt werden. Alternativ können auch starke Anionenaustauschermaterialien, wie die unter den Handelsnamen"Amberlit IRA-400","Dowex l", "Dowex 2" und "Deacidit FF" gehandelten Harze verwendet werden, aus denen Cephalosporin C mit 1 N Essigsäure ausgewaschen wird.
4. Die starken Kationenaustauschermaterialien, welche in der Stufe der Umwandlung des gereinigten Cephalosporins C in sein Na-Salz verwendet werden, können jedes Austauschmaterial von starker Wirkung
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Das folgende Beispiel veranschaulicht die Durchführung der Erfindung :
Die gesamte Kulturbrühe wird durch Zugabe von Eisessig unter Rühren auf PH 5, 5 eingestellt. Die Suspension wird durch einen geeigneten Filterapparat geleitet, um ein klares Filtrat zu erhalten. Die Zugabe eines Kieselgurpräparates, wie das unter dem Handelsnamen "Celite Hy-flo Super-Gel" bekannte, kann bei gewissen Typen von Filtriergeräten vorteilhaft sein.
Das klare Filtrat wird durch Zugabe von Amberlitharz IR-120 inderH-Form unter Rühren auf PH 2, 8-3, 0 eingestellt. Sobald der gewünschte pH-Wert erreicht ist, wird die Suspension filtriert, auf 370C erwärmt und 3 h auf dieser Temperatur gehalten. Sie wird dann auf eine möglichst niedrige Temperatur, vorzugsweise auf OOC abgekühlt.
Anorganische Anionen, wie Chlorid, können den Reinigungsvorgang stören, da sie z. B. zugleich mit dem Cephalosporin C an dem Harz adsorbiert werden. Es ist daher zweckmässig, sie in dieser Stufe zu entfernen. Es wurde gefunden, dass das Ionenaustauscherharz Amberlit IRA-400 in seiner Acetatform, wenn es in einer Säule verwendet wird sowohl Cephalosporin C als auch starke Anionen adsorbiert, dass aber, wenn die Beladung bis zum Durchbrechen des Chlorids fortgesetzt wird, das Cephalosporin C völlig eluiert wird. Eine Reihe von Säulen mit IRA-400 (Siebmaschengrösse etwa 30, in der Acetatform) wird aufgestellt und das kalte Filtrat mit PH 3, 0 wird durch eine dieser Säulen geschickt, bis ein Durchbrechen des Chlorids stattfindet.
Sobald dies geschieht, wird der Fluss des Filtrates sofort auf eine zweite Säule geleitet usw., bis die gesamte Menge behandelt worden ist. Die Effluate werden mit Hilfe von salpetersaurem AgNO in üblicher Weise auf Chlorid geprüft. Es ist zweckmässig, eine einzige grosse Säule aufzurichten, welche in Übereinstimmung mit dem Umfang, in welchem die Verfahrensführung erfolgen soll, gross genug ist, um mit dem Chlorid die Hauptmenge beladen zu werden, wobei nur eine geringe Menge ubrig bleibt, die dann in einer Reihe kleiner Säulen behandelt wird. Auf diese Weise werden Verluste an Cephalosporin C, welches an der Säule adsorbiert bleiben kann, auf ein Mindestmass herabgesetzt.
Es wurde gefunden, dass das Gesamtvolumen des in den Säulen zusammengesetzten Harzes, welches erforderlich ist, etwa 0,75ci des Volumens des zu behandelnden Filtrates beträgt. Die angewendete Fliessgeschwindigkeit beträgt etwa 0, 3 Harzbett-Volumina/min, und die Höhe der Säulen beträgt etwa 50 cm.
Das Filtrat ist nun von anorganischen Anionen praktisch frei.
Das Antibiotikum kann leicht an Amberlitharze IR-4B in der Acetatform adsorbiert werden und wird daraus mit Pyridinacetatpuffer eluiert.
Das in einer etwa 60 cm hohen Säule enthaltene Harz (Standardform, Siebmaschengrösse etwa 30),
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sehen, um diesen Sättigungsgrad zu erreichen. Das Effluat sollte natürlich von Cephalosporin C frei sein.
Die Säule wird nun mit destilliertem Wasser mit der Geschwindigkeit von 0, 1 Bettvolumen/min gewaschen, bis das Effluat keine Ninhydrin-Reaktion zeigt. Darauf folgt eine Waschung mit 1 N Essigsäure,
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welche ein pigmentiertes Band entfernt, welches eine Ninhydrin-Reaktion zeigt, aber kein Cephalosporin C enthält. Dieses Band absorbiert auch stark ultraviolettes Licht bei 260 p, und das Waschen wird gewöhnlich fortgesetzt, bis die Absorption auf E = 3 (1 cm Zelle) oder weniger fällt. Nun wird mit dem Eluieren begonnen, wobei man 1 N Essigsäure verwendet, welche durch Zugabe von Pyridin auf PH 5,5 gebracht worden ist.
Diese Lösung soll vorzugsweise auf 00C gekühlt werden, bevor sie verwendet wird, und die Fraktionen des Eluats werden nach dem Sammeln so kühl wie möglich gehalten. Das PH des Effluats steigt stetig von 2, 4 auf 5,5 und wenn das PH bei 5,5 konstant ist, kann der Durchfluss gestoppt werden. Das Cephalosporin C beginnt eluiert zu werden, wenn das PH des Effluats auf etwa 4,0 gestiegen ist und ist gewöhnlich völlig eluiert, wenn das PH des Effluats auf 5,2 gestiegen ist. Die Fliessgeschwindigkeit beträgt etwa 0, 07 Bettvolumen/min und das Effluat wird in Fraktionen gesammelt, wobei jede Fraktion z. B. 0, 16 Bettvolumen beträgt. Es wurde gefunden, dass der biologische Versuch der zuverlässigste für die Bestimmung des Cephalosporin C ist, obgleich auch die Ninhydrinreaktion angewendet werden kann.
Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum bei nicht mehr als 25 C zu einem Sirup eingedampft. Je niedriger die mögliche Eindampfungstemperatur ist, desto geringere Zerstörung des Cephalosporins C findet statt. Es ist zweckmässig, die Abwesenheit von Chlorid vor dem Eindampfen festzustellen, da bei dessen Gegenwart das Cephalosporin C zerstört und auch die nachfolgende Ausfällung mit Aceton verhindert wird. Wenn Chlorid gefunden wird, dann soll es entfernt werden, indem man es bestimmt und dann 0,95 Äquivalente Silberacetatlösung zugibt. Das ausgefällte AgCl wird durch Filtrieren entfernt.
Der Sirup wird durch Zugabe von wenigstens 50 Vol.-Teilen absolutem Aceton gefällt und das erhal- tene Pulver in Aceton zermahlen. Das Pulver kann in der Zentrifuge abgetrennt und gründlich mit absolutem Aceton gewaschen werden, um die Essigsäure zu entfernen. Das Pulver, welches die rohe freie Säure des Cephalosporins C enthält, wird im Vakuum getrocknet. In dieser Stufe hat es gewöhnlich eine Aktivität von etwa lEinheit/mg. Das Pulver wird in ein wenig Wasser gelöst und sein PH, das etwa 3 betragen soll, wird durch vorsichtige Zugabe von NaOH auf 5 eingestellt.
Das rohe Na-Salz des Cephalosporins C wird dann auf eine Säule aufgegeben, welche in feinverteil-
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durch langsames Eluieren mit verdünntem Pyridinacetat eluiert. Das Cephalosporin C wird teilweise von Verunreinigungen befreit und das danach erhaltene Na-Salz kann leicht kristallisiert werden.
Das Harz (150-200 Siebmaschen) ist in einer Säule in etwa 50 cm Höhe enthalten. Das erforderliche Harzvolumen beträgt etwa 0, 0055mal das Volumen des ursprünglichen Kulturfiltrates. Die Säule wird vorzugsweise in einem gekühlten Raum bei etwa 40C gehalten und zur Fraktionierung des Effluats wird ein automatischer Fraktionensammler verwendet. Die Spülflüssigkeit (0, 3 M Essigsäure, durch Zugabe
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Die Kristallisation vollzieht sich spontan in dem konzentrierten Sirup. Der Sirup wird 24 h bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Durch Kühlen wird kein Vorteil erzielt, da sich die Kristallisation besser bei Zimmertemperatur vollzieht und bei niedriger Temperatur einige unerwünschte Gummen ausgefällt werden.
Die gummige Suspension der Mikrokristalle wird mit einer Lösung von Äthanol (700/0 Vol./Vol.) in Wasser gerührt und die Kristalle durch Filtrieren oder in der Zentrifuge abgetrennt. Sie werden mit einer
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Die Waschflüssigkeiten werden gesammelt und können zu Sirup eingedampft, wieder mit Aceton gefällt und das erhaltene Pulver in Wasser gelöst und abermals zu einem Sirup eingedampft werden, wenn eine zweite, weniger reine Ausbeute an Kristallen erhalten werden soll.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Gewinnung von Cephalosporin C aus einem Kulturmedium durch Behandlung mit einem Anionenaustauschmaterial, nachdem im Medium befindliches Cephalosporin N durch Umwandlung in Penicillinsäure zerstört worden ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Zerstörung von Cephalosporin N mit Hilfe eines Kationenaustauschmaterials bewirkt wird und die Behandlung mit Anionenaustauschmaterial in der Weise durchgeführt wird dass in einer ersten Stufe Verunreinigungen mit anorganischen Anionen selektiv aus dem Medium an ein Anionenaustauschmaterial adsorbiert werden, während das Cephalosporin C selbst in einer nachfolgenden Stufe an ein Anionenaustauschmaterial adsorbiert wird, welches frei von den genannten Verunreinigungen ist, worauf das Cephalosporin C eluiert wird.