Verfahren zur Gewinnung eines antibiotischen Fermentierungsprodukts aus einer Fermentierungsbrühe Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues und verbessertes Verfahren zur Gewinnung und Konzen tration von Antibiotika aus Fermentierungsbrühen, welche entwickelte Antibiotika, Mycelien von Mikro Organismen und Nährstoffe enthalten.
Früher erfolgte die Isolierung und Abtrennung von Antibiotika aus Fermentierungsbrühen, in welchen die Antibiotika entwickelt worden waren, durch Extra hieren mit Lösungsmitteln und Ionenaustausch-Ver- fahren, welche Operationen an den gewonnenen Brü hen im filtrierten oder unfiltrierten Zustand durch geführt wurden.
Die vorliegende Erfindung richtet sich nun auf eine neue Technik zum Isolieren von Antibiotika, we'l'che durch Fermentierungsverfahren erzeugt wur den.
Die Erfindung bezweckt die Schaffung eines neuen und verbesserten Verfahrens zum Abtrennen und Reinigen von Antibiotika aus den Fermentierungs- brühen, in welchen diese Antibiotika gezüchtet wur den.
Weiter bezweckt sie die Schaffung eines Verfah rens zur Isolierung von Antibiotika in hohen Aus beuten. Schliesslich ist ein Zweck der Erfindung die Schaffung eines kommerziell anwendbaren Verfahrens zur Gewinnung der antibiotischen Aktivität aus Fermentierungsbrühen, in welchen Antibiotika ent wickelt wurden.
Es wurde gefunden, d'ass Antibiotika aus den Fermentierungsbrühen, in welchen sie gezüchtet wer den, gleichzeitig mit der Fermentierung isoliert wer den können. Das heisst, der Isolierungsprozess kann während der Entwicklung des Antibiotikums durch geführt werden. Dies :erreicht man, indem man der Fermentierungsbrühe das ausgewählte Ionenaus- tauschharz zusetzt und die Fermentierung nach Zu gabe des Harzes sich noch eine gewisse Zeit lang fortsetzen lässt.
Das überraschende Merkmal dieser Erfindüng, ausser der Erleichterung der Durch führung und der Einsparung an Zeit und Vorrichtun- gen, liegt in den erhöhten Ausbeuten, welche nach dem erfindungsgemässen Vorgehen erzielt werden. Die Ausbeuten sind gegenüber denjenigen, welche erzielt werden, wenn die Adsorption an der bereits geernteten Brühe durchgeführt wird, um etwa<B>25%</B> erhöht.
Diese Erhöhung der Ausbeute resultiert dar aus, dass man die Fermentierung in Gegenwart eines Ionenaustauschharzes durchführt, welches das Anti biotikum bei seiner Entwicklung adsorbiert. Eine weitere Erhöhung der Ausbeute wird bewirkt durch das Wegfallen der Filtration der Fedrmentierungs- brühe vor der Weiterbehandlung. Ausserdem erfolgt die Adsorption durch das:
Harz bei Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens wirksamer infolge der verlängerten Kontaktzeiten von Brühe und Harz, die sich aus der Adsorption während der Fermen- tierungergeben. Ein weiterer Vorteil ist, dass das Fer- mentieruggsgefäss selbst zur Durchführung der Ad sorption ^benutzt wird",
wodurch die Notwendigkeit einer Überführung der Fermentierungsbrühe in ein anderes Gefäss zum Inberührungbringen mit dem Harz entfällt.
Die dem erfindungsgemässen Verfahren innewoh nenden Möglichkeiten und Vorteile kommen am voll sten zur Geltung im Zusammenhang mit instabilen Antibiotika, wie Penicillin, wobei das Antibiotikum bei seiner Bildung adsorbiert und dadurch aus der Lösung fortgeschafft wird, in welcher es in beträcht lichem Ausmass instabil und der chemischen sowohl wie enzymatischen Zersetzung unterworfen ist.
Zur wirksamen Durchführung des erfindungs- gemässen Verfahrens ist es wesentlich, dass das Ionenaustauschharz der Fermentierungsbrühe in einem solchen Zeitpunkt zugesetzt wird, dass die Fermentierung der Brühe in Gegenwart des Harzes möglich ist. Das Harz wird bereits bei Beginn der Fermentierung oder auch zu einem späteren Zeitpunkt bis zu etwa 1 Stunde vor dem Moment der Ernte der Fermentierungsbrühe zugesetzt.
Das Minimum von 1 Stunde ist jene Zeitdauer, welche sich als not wendig erwiesen hat zur Erzielung einer wesentlichen Ausbeute an antibiotischer Aktivität aus der Fermen- tierungsbrühe. In einer bevorzugten"Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Ionenaustausch- harz etwa 48 Stunden nach Beginn der Fermentie- rung bis zu etwa 24 Stunden vor der Ernte der Fer- <RTI
ID="0002.0021"> mentierungsbrühe zugesetzt.
Das Harz kann der Fermentierungsbrühe in be liebiger Konzentration zugegeben werden, vorzugs weise in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 5 Volumen, abhängig in erster Linie von der in der Brühe entwickelten Konzentration an antibioti scher Aktivität.
Im erfindungsgemässen Verfahren besteht das einzige und neuartige Merkmal darin, dass das Ionen austauschharz bei Beginn oder während der Fermen- tierung zugesetzt und die Fermentierung dann in Ge genwart des Harzes fortgesetzt wird. Gewisse anti biotische Fermentationen sind indessen gegen Anstek- kung durch Fremdmikroorganismen empfindlich. Diese können sogar :einen vollständigen Verlust des gewünschten Fermentierungsprodukts hervorrufen, wie im Falle von Penicillin.
Es ist deshalb zweck mässig, das Ionenaustauschharz vor der Zugabe in das Fermentierungsgefäss zu steri'l'isieren. Diese Sterf- sation kann durch Behandlung des Harzes mit Hitze oder Dampf erfolgen. Wenn das Harz nicht hitze beständig ist, empfiehlt sich jedoch die Verwendung eines Antiseptikums, wie z. B. wässrigem Alkohol.
Nach der Adsorption kann man das Ionenaus- tauschharz mit dem darauf adsorbierten Antibiotikum nach den üblichen Verfahren zum Isolieren des Anti biotikums aufarbeiten. Die Brühe und das Harz können getrennt werden, beispielsweise durch Sieben.
Das derart abgetrennte Harz kann gewaschen wer den zur Entfernung jeglicher Spuren von Mycelium oder vorhandenen nichtadsorbierten chemischen Ver unreinigungen, worauf man mit einer Lösung eluiert, welche vom Harz jegliche antibiotische Aktivität, welche darauf adsorbiert ist, abzulösen vermag.
Das Eluat kann dann einer Anzahl weiterer geeigneter Behandlungen, wie Kristallisationen oder Extrak tionen mit Lösungsmitteln, unterworfen werden zur Gewinnung des reinen Antibiotikums aus dem Eluat.
Das eluierte Harz kann durch Behandeln mit einer geeigneten Regenerierungslösung regeneriert und erneut für die Adsorption von Antibiotikum verwen det werden, oder es kann gewünschtenfalls dem Fermentierungsgefäss zusammen mit dem regenerier ten Harz frisches Harz zugesetzt werden. Die er schöpfte Brühe kann wieder mit frischem oder regene riertem Harz in Kontakt gebracht und wiederum wie oben beschrieben abgetrennt werden.
Die weitere Beschreibung bezieht sich insbeson dere und: im Sinne eines Beispiels auf die Benut zung von Novobiocin als Antibiotikum.
Ionenaustauschharze, welche im erfindungs gemässen Verfahren im Falle von Novobiocin ge eignet sind, sind insbesondere Harze aus der Klasse der stark basischen polymeren stickstoffhaltigen Anionenaustauschharze. Es handelt sich dabei ge wöhnlich um Harze mit quaternären Ammonium gruppen, welche mit einer Styrol-Divinylbenzol-Ma- trize verbunden sind.
Beispiele für derartige Harze sind: Dowex -Harze, auf den Markt gebracht durch Dow Chemical Co., Midland, Mich., beispielsweise Dowex 1-X2 , Dowex 1-X4 und Dowex 2-X4 ;
Amberlite -Harze, auf den Markt gebracht durch Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pa., beispielsweise Amberlite IRA-400 , Amberlite IRA-401 und Amberlite XE-98 sowie Duolite -Harze, auf den Markt gebracht von Chemical Process Co., Red wood City, Calif., beispielsweise Duolite A-40 , Duolite A-101 und Duolite A-102 .
Ausser diesen beispielsweise angeführten Harzen können zur Ad sorption von Novobiocin auch andere Ionenaustausch- harze vom stark basischen Typ verwendet werden.
Es ist dem Fachmann klar, dass andere Antibiotika andere Typen von Ionenaustauschharzen erfordern können. Während beispielsweise Penicillin G, ein anderes saures Antibiotikum, auf basischen Anionen austauschharzen von dem für Novobiocin verwen deten Typus adsorbiert werden können, erfordern basische Antibiotika, wie Streptomycin, Neomycin, Eulicin und Cytovirin, ein saures Kationena:u.stausch- harz.
Die Harzteilchengrösse ist nicht ausschlaggebend, doch werden Harze mit Teilchengrössen in einem Bereich von 10=200 Maschen und vorzugsweise von etwa 35-100 Maschen bevorzugt, indem sie sich für die Adsorption als besonders brauchbar erwiesen haben.
Zur Abtrennung des Harzes, an welchem die antibiotische Aktivität der Brühe adsorbiert ist, von der erschöpften Brühe ist es zweckmässig, die Brühe zunächst durch Zugabe eines Verdünnungsmittels, wie Wasser, zu verdünnen. Dieses Verdünnen ist für das erfindungsgemässe Verfahren nicht unbedingt er forderlich, erleichtert aber die Trennung von er schöpfter Brühe und Harz. Es hat sich gezeigt, dass durch Vermischen der Brühe mit einem gleichen Vo lumen Wasser die Abtrennung des Harzes von der erschöpften Brühe, welche Mikroorganismen-Myce- lium, unverbrauchte Nährstoffe und verschiedene andere feste Verunreinigungen enthält, erleichtert werden kann.
Die das Harz enthaltende Brühe kann dann durch Sieben oder nach irgendeiner andern geeigneten Methode vom Harz abgetrennt werden. Für diese Abtrennung hat es sich als zweckmässig erwiesen, das Gemisch mit einem Sieb zu sieben, dessen Maschen weite den Durchtritt des Myceliums gestattet, welches aber das Harz zurückhält, wofür sich gewöhnlich Siebe mit etwa 10 bis etwa 200 Maschen eignen; bei geeigneter Durchführung wird kein Verstopfen des Siebes mit Mycelium oder erschöpfter Brühe beobachtet. Zur weiteren Erleichterung dieser Ab trennung kann man :ein vibrierendes Sieb verwenden. Gewünschtenfafls können zum Abtrennen auch andere Methoden benutzt werden, z.
B. unter Ver wendung von Flüssigkeitszyklonen, Schwerkraft- sichtern usw.
Zum Eluieren der auf dem Ionenaustauschharz adsorbierten antibiotischen Aktivität von demselben wird eine einen Elektrolyten enthaltende wässrige Eluieru-ngslösung verwendet. Im Falle von Novobiocin haben sich wässrige saure Lösungen, welche ein orga nisches Lösungsmittel für Novobiocin enthalten, als wirksam erwiesen.
Beispielsweise erwiesen sich wäss- rige Lösungen von Salzsäure oder Essigsäure in Mischung mit einem geeigneten, mit Wasser misch- baren organischen Lösungsmittel, wie einem Alkohol oder Keton, für das Eluieren von Novobiocin- Aktivität vom Ionenaustauschharz als befriedigend.
Die Konzentration der sauren Verbindung in der Eluierungslösung beträgt vorzugsweise etwa 1-10% (Gewicht(Volumen). Die organische Phase kann aus etwa 70 bis etwa 98% des organischen Lösungsmit tels und etwa 30 bis etwa 2% Wasser bestehen..
Im Falle von andern Antibiotika als Novobiocin werden zum Eluieren der antibiotischen Aktivität vom lonenaustauschharz :entsprechend geeignete Eluie- rungsmittel verwendet.
Beispielsweise ist im Falle von Neomycin und Cytovirin wässriges Ammoniak ein befriedigendes Eluierungsmittel. Anderseits ist metha- nofische Salzsäure für das Eluieren von Eulicin und Streptomycin brauchbar.
Das Eluieren kann entweder in der Kolonne oder in ansatzweisem Betrieb :erfolgen, wobei aber das Arbeiten mit der Kolonne bevorzugt wird, da gerin gere Volumina nötig sind und das Eluat relativ leicht periodisch analysiert und in Fraktionen unterteilt wer den kann. Das Eluat kann anschliessend einer weiteren Reinigungsbehandlung unterworfen werden, welche im Falle von Novobiocin beispielsweise im Durch leiten durch eine chromatographische Säule bestehen kann, z.
B. eine mit verdünnter Schwefelsäure und Wasser gewaschene Tonerdesäule; das gereinigte und entfärbte Eluat wird mit einer sauren Lösung, bei spielsweise einer Methanol-Essigsäure-Lösung, be handelt zur Kristallisation der Novobiocinsäure. Die erhaltenen Kristalle können abfiltriert und bei spielsweise mit einer Wasser-Methanol-Lösung ge waschen, filtriert und getrocknet werden.
Gewünsch- tenfalls 'fassen sich aus dieser Navobiocinsäure nach geeigneten Neutralisationsverfahren verschiedene Novobiocinsalze herstellen.
Die folgenden Beispiele beziehen sich auf Novo- biocin, wobei sich aber versteht, dass das Verfahren auch auf andere Antibiotika, wie Streptomycin, Neo- mycin, Eulicin, Cytovirin, Penicillin und dergleichen, anwendbar ist.
<I>Beispiel</I> Zu 29 cm3 Novobiocin-Fermentierungsbrühe gibt man 1 cm3 Dowex 1-X2 -Harz, Teilchengrösse 50 bis 100 Maschen, in der Chloridperiode, welches zu vor durch Behandlung mit wasserfreiem Äthanol sterilisiert wurde. Die Fermentierung erfolgt während insgesamt 168 Stunden.
Das Harz wird von der erschöpften Brühe mit einem 70-Maschen-Sieb ab getrennt und in eine Kolonne von 1 auf<B>15,2</B> cm gegeben, mit Methanol zurückgewaschen und mit einer 16%igen wässrigen Salzsäurelösung in Methanol (2-n) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,2 cm31 Minute eluiert. Durch Versuch wurde festgestellt, dass das Eluat 20000 Novobiocin-Wirkungseinheiten ent hielt.
Dies entspricht einer Eluatausbeute von 75 mit Bezug auf einen Parallelversuch in Abwesenheit von Harz.
Die folgende Tabelle fasst Werte zusammen, wel che unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 1 erzielt wurden, wobei der Harzzusatz zu verschiedenen Zeitpunkten erfolgte.
EMI0003.0104
Moment <SEP> der <SEP> Harzzugabe <SEP> Moment <SEP> der <SEP> Ernte <SEP> Volumen <SEP> der <SEP> Brühe <SEP> Harzvolumen <SEP> Eluatausbeute
<tb> (Std. <SEP> nach <SEP> der <SEP> Impfung) <SEP> (Std.
<SEP> nach <SEP> der <SEP> Impfung) <SEP> (cm3) <SEP> (cm3) <SEP> (%)
<tb> 48 <SEP> 180 <SEP> <B>3000</B> <SEP> 351 <SEP> 902
<tb> 144 <SEP> 168 <SEP> 378500 <SEP> 50003 <SEP> 904
<tb> 156 <SEP> 168 <SEP> 2721 <SEP> 353 <SEP> 854
<tb> Mit <SEP> Dampf <SEP> sterilisiertes <SEP> Harz.
<tb> Mit <SEP> Bezug <SEP> auf <SEP> einen <SEP> Parallelversuch <SEP> in <SEP> Abwesenheit <SEP> von <SEP> Harz.
<tb> Nichtsterilisiertes <SEP> Harz.
<tb> -} <SEP> Bezogen <SEP> auf <SEP> die <SEP> Aktivität <SEP> in <SEP> der <SEP> Brühe <SEP> im <SEP> Moment <SEP> der <SEP> Harzzugabe.
<I>Beispiel 2</I> Zu 3000 cm3 Neomycin-Fermentierungsbrühe gibt man 180 cms Duolite C-25 -Harz in der Natriumperiod'e, das zuvor durch Behandeln mit einer Mischung aus 70% Äthylalkohol und 30% Wasser sterilisiert wurde.
Duolite C-25 -Ionenaustausch- harz ist ein sulfoniertes Palystyrol-Divinylbenzol-Ka- tionenaustauschharz mit hochporöser Struktur, wel ches von Chemical Proeess Company, Redwood City, Calif., auf den Markt gebracht wird. Das Harz wird 48 Stunden nach der Impfung zugesetzt, und die Brühe wird 163 Stunden nach der Impfung geerntet.
Das Harz wird von der erschöpften Brühe mittels eines 28-Maschen-Siebes abgetrennt, mit Wasser ge- waschen, in eine 25,4-mm-Kolonne gegeben und im Aufwärtsstrom mit Wasser gewaschen zur Entfer nung von festen Fermentierungsrückständen. Das Harz wird dann abwärtsströmend mit 1-n Ammo- niaklösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 3 cm3/Minute eluiert. Durch Untersuchung ergibt sich,
dass das Eluat eine Aktivität besitzt, welche einer Ausbeute von 90% mit Bezug auf einen Parallelver such in Abwesenheit von Harz :entspricht.
Neomycin kann auch auf Amberlite IRC-50 - Harz adsorbiert werden, bei welchem es sich um ein saures Pc>Iystyro'1-Divinylbenzol-Kationenaus- tauschharz handelt, dessen Ionenaustausch-Eigen- schaften im wesentlichen auf den Carbonsäuregruppen beruhen, und das von Rohm & Haas Co., Phila delphia, Pa., auf den Markt gebracht wird. Auch andere Harze aus der Klasse der sauren Kationen austauschharze sind für diesen Zweck verwendbar.