NO343547B1

NO343547B1 - Interleukin-13-bindende proteiner

Info

Publication number: NO343547B1
Application number: NO20091411A
Authority: NO
Inventors: Paul R Hinton; Jonathan P Belk; Richard W Dixon; Shankar Kumar; Chengbin Wu; Hua Ying; Maria A Argiriadi; Carolyn A Cuff; Terry L Melim; Yan Chen
Original assignee: Abbvie Bahamas Ltd
Priority date: 2006-09-08
Filing date: 2009-04-07
Publication date: 2019-04-01
Also published as: CN104774266B; IL226291A0; US10086076B2; RU2012142311A; TW200831533A; MY161894A; BRPI0716438A8; KR101625961B1; IL197213A; WO2008127271A3; DK3339445T3; ES2661032T3; RU2605327C2; CA2914170C; BRPI0716438A2; US20140099313A1; PT3339445T; JP2010502224A; CR20140465A; NO20091411L

Description

Den foreliggende oppfinnelsen angår IL-13-bindende proteiner, som angitt i krav 1 og antistoffkonstrukter omfattende et slikt protein som angitt i krav 9 samt farmasøytiske sammensetninger omfattende slike. Slike proteiner, konstrukter og sammensetninger kan anvendes innen forebygging og/eller behandling av forskjellige sykdommer inkludert astma, allergi, COPD, fibrose, og kreft.

Bakgrunn til oppfinnelsen

Humant-IL-13 er et 17-kDa glykoprotein klonet fra aktiverte T-celler (Zurawski og de Vries 1994 Immunol Today 1519-26), og blir produsert av aktiverte T-celler av Th2-linjen, selv om Th0 og Th1 CD4+ T-celler, CD8+ T-celler, og flere ikke-T-cellepopulasjoner så som mastceller også produserer IL-13 (Zurawski og de Vries 1994 Immunol Today 1519-26). Virkningen av IL-13 inkluderer immunoglobulin isotypebytting til IgE i humane B-celler (Punnonen, Aversa et al.1993 Proc Natl Acad Sci U S A 903730-4) og å undertrykke inflammatorisk cytokinproduksjon i både menneske og mus (de Waal Malefyt, Figdor et al.1993 J Immunol 1516370-81; Doherty, Kastelein et al. 1993 J Immunol 1517151-60). IL-13 binder seg til sine celleoverflatereseptorer, IL-13Ralpha1 og IL-13Ralpha2. IL-13Ralpha1 interagerer med IL-13 med en lav affinitet (KD ~10nM), etterfulgt av rekruttering av IL-4Ra for å danne et høy-affinitets (KD ~ 0,4 nM) heterodimerisk signaliseringsreseptorkompleks (Aman, Tayebi et al.1996 J Biol Chem 27129265-70; Hilton, Zhang et al.1996 Proc Natl Acad Sci U S A 93497-501). IL-4R/IL-13Ralpha1-komplekset er uttrykt på mange celletyper så som B-celler, monocytter/makrofager, dendritiske celler, eosinofiler, basofiler, fibroblaster, endotelceller, epitelceller og glatte muskelceller i luftveiene (Graber, Gretener et al.1998 Eur J Immunol 28 4286-98; Murata, Husain et al.1998 Int Immunol 101103-10; Akaiwa, Yu et al.2001 cytokin 1375-84). Ligering av IL-13Ralpha1/IL-4R reseptorkomplekset resulterer i aktivering av en rekke forskjellige signaltransduksjonsveier inkludert signaltransduser og aktivator av transkripsjon (STAT6) og insulinreseptorsubstrat-2 (IRS-2) reaksjonsveien (Wang, Michieli et al.1995 Blood 864218-27; Takeda, Kamanaka et al.1996 J Immunol 1573220-2). IL-13Ralpha2 kjeden alene har en høy affinitet (KD ~ 0,25-0,4 nM) for IL-13, og funksjonerer både som en narrereseptor som negativt regulerer IL-13-binding (Donaldson, Whitters et al.1998 J Immunol 1612317-24), og en signalreseptor som induserer TGF-b syntese og fibrose via AP-1 reaksjons veien i makrofager og muligens andre celletyper (Fichtner-Feigl, Strober et al.2006 Nat Med 1299-106).

Flere studier utført i prekliniske dyremodeller for astma indikerer at IL-13 spiller en viktig rolle i astma. Disse data inkluderer resistens ovenfor astma i IL-13 “knockout”-mus så vel som inhibering av astma fenotypen med IL-13 antagonister (løselige IL-13 reseptorer, anti-IL-13 mAbs, osv.) i forskjellige musemodeller (Sela 1999 Harefuah 137 317-9; Wills-Karp og Chiaramonte 2003 Curr Opin Pulm Med 921-7; Wills-Karp 2004 Immunol Rev 202175-90). Flere studier har vist at farmakologisk administrering av rekombinant IL-13 til lungene til mus så vel som marsvin induserer hyperutsondring av luftveismukus, eosinofili og AHR (Grunig, Warnock et al.1998 Science 2822261-3; Wills-Karp, Luyimbazi et al.1998 Science 2822258-61; Kibe, Inoue et al.2003 Am J Respir Crit Care Med 16750-6; Vargaftig og Singer 2003 Am J Physiol Lung celle Mol Physiol 284 L260-9; Vargaftig og Singer 2003 Am J Respir cell Mol Biol 28410-9). Disse effektene av IL-13 er reprodusert i transgene musesystemer med enten konstitutiv eller induserbar ekspresjon av IL-13 (Zhu, Homer et al.1999 J Clin Invest 103779-88; Zhu, Lee et al.2001 Am J Respir Crit Care Med 164 S67-70; Lanone, Zheng et al.2002 J Clin Invest 110463-74). Kronisk transgen overekspresjon av IL-13 induserer også subepitel-fibrose og emfysem. Mus som er defisiente i IL-13 (og IL-4) signalmolekylet STAT6 mislykkes i å utvikle allergen-indusert AHR og overproduksjon av mukus (Kuperman, Huang et al.2002 Nat Med 8885-9). Studier som bruker løselig IL-13-reseptor fusjonsprotein (sIL-13Ralpha2Fc) har vist den viktige rollen til dette cytokinet i eksperimentell allergen ovalbumin (OVA)-indusert luftveissykdom (Grunig, Warnock et al. 1998 Science 2822261-3; Wills-Karp, Luyimbazi et al.1998 Science 2822258-61; Taube, Duez et al.2002 J Immunol 1696482-9). Effektiviteten av anti-IL-13-behandling ble også demonstrert i en kronisk modell av astma i mus. I tillegg til å fremvise trekk fra hyper-utsondring av mukus og AHR, demonstrerer denne modellen av kronisk astma flere kjennetegn av menneskelig sykdom som mangler i de mer fokuserte modellene. Disse inkluderer eosinofili av lungevevet lokalisert i inter-epitele rom så vel som glattmuskelfibrose som målt ved økninger i kollagenavleiring. Den kroniske astmamodellen blir indusert med repeterte aerosolutfordringer med OVA i OVA-sensiterte mus 1x/uken i totalt 4 uker. Anti-IL-13 antistoff administrert i de siste 2 ukene av OVA-utfordringene (fra dag 36 med effektivitetsavlesning vurdert på dag 53 av studiet) inhiberte signifikant AHR, pulmonær inflammasjon, gobletcelle hyperplasi, hyper-utsondring av mukus, og luftveisfibrose (Yang, Li et al.2005 J Pharmacol Exp Ther). I tillegg ble også terapeutisk effekt av IL-13-antagonist demonstrert å inhibere AHR i en primatmodell av astma [Abstract, American Thoracic Society 2005].

IL-13 er implisert i patogenesen til menneskelig astma ettersom økte nivåer av IL-13 mRNA og protein har blitt detektert i lunger hos astmatiske pasienter, som korrelerer med alvorlighetsgraden av sykdommen (Huang, Xiao et al.1995 J Immunol 1552688-94). I tillegg har genetiske polymorfismer i humant-IL-13, som leder til forhøyede IL-13 nivåer, blitt identifisert og er assosiert med astma og atopi (Heinzmann, Mao et al.

2000 Hum Mol Genet 9549-59; Hoerauf, Kruse et al.2002 Mikrobes Infect 437-42; Vercelli 2002 Curr Opin allergi Clin Immunol 2389-93; Heinzmann, Jerkic et al.2003 J allergi Clin Immunol 112735-9; Chen, Ericksen et al.2004 J allergi Clin Immunol 114 553-60; Vladich, Brazille et al.2005 J Clin Invest), og forhøyede IL-13 nivåer har blitt detektert i lungene til astmapasienter (Huang, Xiao et al.1995 J Immunol 1552688-94; Arima, Umeshita-Suyama et al.2002 J allergi Clin Immunol 109980-7; Berry, Parker et al. 2004 J allergi Clin Immunol 1141106-9). En genetisk sammenheng mellom IL-13 og astma har også blitt demonstrert siden individer med en polymorfisme i IL-13 genet som forårsaker høyere plasma IL-13 nivåer, har en økt risiko for atopi og astma (Wills-Karp 2000 Respir Res 119-23).

På grunn av rollen til humant-IL-13 i en rekke menneskelige forstyrrelser, har terapeutiske strategier blitt utarbeidet for å inhibere eller motvirke IL-13 aktivitet.

Spesielt har antistoffer som binder til, og nøytraliserer, IL-13 blitt lett etter som en måte å inhibere IL-13 aktivitet. Imidlertid eksisterer det et behov i teknikken for forbedrede antistoffer i stand til å binde til IL-13. Fortrinnsvis binder antistoffene til humant-IL-13. Fortrinnsvis er antistoffene i stand til å nøytralisere humant-IL-13. Den foreliggende tilveiebringer oppfinnelsen en ny familie av bindende proteiner, CDR-podede antistoffer, humaniserte antistoffer, og fragmenter derav, i stand til å binde humant-IL-13, å binde med høy affinitet, og å binde og nøytralisere humant-IL-13. Slike proteiner er definert i krav 1.

Sammendrag ifølge oppfinnelsen

Denne oppfinnelsen angår IL-13-bindende proteiner som angitt i krav 1. Bindende proteiner ifølge oppfinnelsen inkluderer slike antistoffer, og antigenbindende deler, i stand til å binde til humant-IL-13. Videre tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for å fremstille slike IL-13-bindende proteiner.

Et aspekt ifølge oppfinnelsen angår et slikt bindende protein som angitt i krav 1 og som er i stand til å binde IL-13. I en foretrukket utførelsesform binder bindingsproteinet humant-IL-13. Fortrinnsvis er bindingsproteinet i stand til å modulere en biologisk funksjon av IL-13. Mer fortrinnsvis er bindingsproteinet i stand til å nøytralisere IL-13.

I et aspekt ifølge oppfinnelsen er bindingsproteinet i stand til å binde IL-13, og å forhindre bindendeen av IL-13 til IL-13 α1-reseptoren. I et annet aspekt ifølge oppfinnelsen er bindingsproteinet i stand til å binde IL-13, og å forhindre bindingen av IL-13 til IL-13 α2-reseptoren. I en foretrukket utførelsesform er bindingsproteinet i stand til å binde IL-13, og å forhindre bindendeen av IL-13 til både IL-13 α1-reseptoren og IL-13 α2-reseptoren.

En utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringer et slikt isolert antistoff, eller det antigenbindende fragmentet derav, hvori nevnte antistoff, eller det antigenbindende fragmentet derav binder humant-IL-13 og inhiberer bindingen av nevnte IL-13 til IL-13 α2-reseptoren i et celleoverflatebasert reseptorbindendesassay med en IC50valgt fra gruppen bestående på omtrent 1.5x10-8 til 1x10-8 M, 1x10-8 til 1x10-9 M, 10-9 til 10-10 M og 10-10 til 10-11 M eller i et ELISA-basert reseptorbindingsassay med en IC50valgt fra gruppen bestående av omtrent 1,8x10-8 til 1x10-8 M, 1x10-8 til 1x10-9 M, 10-9 til 10-10 M og 10-10 til 10-11 M. Fortrinnsvis binder antistoffet humant-IL-13 og inhiberer bindingen av nevnte IL-13 til IL-13 α2-reseptoren i et celleoverflate-basert reseptorbindingsassay med en IC50på 2.7 x10-9 M og i et ELISA-basert reseptorbindingsassay med en IC50på 1.1x10-9 M. Fortrinnsvis binder antistoffet, eller det antigenbindende fragmentet derav, humant-IL-13 og inhiberer bindingen av nevnte IL-13 til IL-13 α2-reseptoren i et celleoverflatebasert reseptorbindingsassay eller i et ELISA-basert reseptorbindings assay med omtrent 70-100 % ved en konsentrasjon på 100 nM. Fortrinnsvis er antistoffet 13C5.5. Mer fortrinnsvis er antistoffet ikke BAK502G9, mAb13.2 eller MJ2-7.

I et annet aspekt, tilveiebringer oppfinnelsen et isolert antistoff, eller det antigenbindende fragmentet derav som angitt i krav 4, hvori nevnte antistoff, eller det antigenbindende fragmentet derav binder humant-IL-13 og inhiberer AHR med omtrent 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % eller 100 % i en humant-IL-13-indusert astmamodell.

Fortrinnsvis inhiberer antistoffet AHR med mer enn 86 % i en humant-IL-13-indusert astmamodell. I en annen utførelsesform binder det isolerte antistoffet, eller det antigenbindende fragmentet derav, humant-IL-13 og inhiberer AHR med omtrent 50 %, 60 %, 70 %, 80 % 90 % eller 100 % og inhiberer mukusproduksjon med omtrent 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % 90 % eller 100 % i en humant-IL-13-indusert astmamodell. Fortrinnsvis er antistoffet 13C5.5. Mer fortrinnsvis er antistoffet ikke BAK502G9, mAb13.2 eller MJ2-7.

I en utførelsesform har bindingsproteinet ifølge oppfinnelsen en på-hastighetskonstant (kon) til IL-13 på minst omtrent 102M-1s-1; minst omtrent 103M-1s-1; minst omtrent 104M-1s-1; minst omtrent 105M-1s-1; eller minst omtrent 106M-1s-1 , som målt ved overflateplasmonresonans. Fortrinnsvis har bindingsproteinet ifølge oppfinnelsen en påhastighetskonstant (kon) til IL-13 mellom 102M-1s-1 til 103M-1s-1; mellom 103M-1s-1 til 104M-1s-1; mellom 104M-1s-1 til 105M-1s-1; eller mellom 105M-1s-1 til 106M-1s-1 , som målt ved overflateplasmonresonans.

I en annen utførelsesform har bindingsproteinet ifølge oppfinnelsen en av-hastighetskonstant (koff) til IL-13 på maksimalt omtrent 10-3s-1; på maksimalt omtrent 10-4s-1; på maksimalt omtrent 10-5s-1; eller på maksimalt omtrent 10-6s-1 , som målt ved overflateplasmonresonans. Fortrinnsvis har bindingsproteinet ifølge oppfinnelsen en avhastighetskonstant

til 10-6s-1 , som målt ved overflateplasmonresonans.

I en annen utførelsesform har bindingsproteinet ifølge oppfinnelsen en dissosieringskonstant (KD) til IL-13 på maksimalt omtrent 10-7 M; på maksimalt omtrent 10-8 M; på maksimalt omtrent 10-9 M; på maksimalt omtrent 10-10 M; på maksimalt omtrent 10-11 M; på maksimalt omtrent 10-12 M; eller på maksimalt 10-13 M. Fortrinnsvis har bindingsproteinet ifølge oppfinnelsen en dissosieringskonstant (KD) til IL-13 på 10-7 M til 10-8 M; på 10-8 M til 10-9 M; på 10-9 M til 10-10 M; på 10-10 til 10-11 M; på 10-11 M til 10-12 M; eller på 10-12 til M 10-13 M.

Fortrinnsvis binder antistoffet, eller det antigenbindende fragmentet derav, IL-13 med bindendeskarakteristikker valgt fra gruppen bestående av: a) en on-hastighetskonstant (kon) mellom omtrent 105M-1s-1 til 106M-1s-1 eller omtrent 106M-1s-1 til 107M-1s-1 ,eller b) en off-hastighetskonstant (koff) på omtrent 10-4s-1 til 10-5s-1; eller på omtrent 10-5s-1 til 10-6s-1 , som målt ved overflateplasmonresonans; eller c) en dissosieringskonstant (KD) på omtrent 1.5x10-10 til 1x10-10 M eller omtrent 10-10 til 10-11 M. Fortrinnsvis har antistoffet, eller det antigenbindende fragmentet derav, en på-hastighetskonstant (kon) til IL-13 valgt fra gruppen bestående av: 6.68x105M-1s-1 , 7.86x105M-1s-1 , 8.35x105M-1s-1 , 8.69x105M-1s-1 , 9.15x105M-1s-1 , 1.26x106M-1s-1 , 1.7x106M-1s-1 , og 2.51x106M-1s-1.

Fortrinnsvis har antistoffet, eller det antigenbindende fragmentet derav, en avhastighetskonstant (koff) til IL-13 valgt fra gruppen bestående av: 1.23x10-4s-1; 1.76x10-4s-1; 4.74x10-4s-1; 1.91x10-5s-1; 2.14x10-5s-1 , 3.82x10-5s-1; 8.81x10-5s-1 og 9.65x10-5s-1 , som målt ved overflateplasmonresonans. Fortrinnsvis har antistoffet, eller det antigenbindende fragmentet derav, en dissosieringskonstant (KD) til IL-13 valgt fra gruppen bestående av: 1.05x10-10 M; 7.10x10-10 M; 1x10-11 M; 2.20x10-11 M; 2.72x10-11 M; 4.17x10-11 M; 5.68x10-11 M; 7.01x10-11 M; 7.10x10-11 M; og 9.79x10-11 M.

Et aspekt ifølge oppfinnelsen angår bindende proteiner i stand til å binde til en spesifikk epitop på IL-13. Fortrinnsvis omfatter den spesifikke epitopen den C-terminale Helix D-regionen av humant-IL-13. Mer fortrinnsvis omfatter den spesifikke epitopen aminosyresekvensen VRDTK IEVAQ FVKDL LL HLK KLFRE GR, tilsvarende aminosyre 104-130 av SEQ ID NR.1. I et annet aspekt binder antistoffet, eller den antigenbindende del, en epitop omfattende den C-terminale Helix D-regionen og den N-terminale Helix A-regionen av humant-IL-13. Fortrinnsvis binder antistoffet, eller det antigenbindende fragment derav, humant-IL-13 slik at IL-13 med nevnte antistoff, eller det antigenbindende fragmentet derav, bundet til epitopen definert ved de topografiske regionene Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 og Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu-128-Gly129-Arg130 av SEQ ID Nr.1, er inhiberte fra å binde til IL-13-reseptoren. Fortrinnsvis binder antistoffet, eller det antigenbindende fragmentet derav, humant-IL-13 slik at IL-13 med nevnte antistoff, eller det antigenbindende fragmentet derav, bundet til epitopen definert ved de topografiske regionene Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 og Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127 av SEQ ID Nr.1, er inhiberte fra å binde til IL-13-reseptoren. Fortrinnsvis binder antistoffet, eller det antigenbindende fragmentet derav, humant-IL-13 slik at IL-13 med nevnte antistoff, eller det antigenbindende fragmentet derav, bundet til epitopen definert ved de topografiske regionene Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 og Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu-128-Gly129-Arg130 av SEQ ID Nr. 1, er inhiberte fra å binde til IL-13 α2-reseptoren. Mer fortrinnsvis binder antistoffet, eller det antigenbindende fragmentet derav, humant-IL-13 slik at IL-13 med nevnte antistoff, eller det antigenbindende fragmentet derav, bundet til epitopen definert ved de topografiske regionene Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 og Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu-128-Gly129-Arg130 av SEQ ID Nr.1, er inhiberte fra å binde til IL-13 α2-reseptoren, forutsatt at nevnte antistoff ikke er BAK502G9 eller MJ2-7. Mest fortrinnsvis er antistoffet 13C5.5.

I et aspekt binder det isolerte antistoffet, eller det antigenbindende fragmentet derav, IL-13 og forhindrer bindende av IL-13 til IL-13 α2-reseptoren med bindendesærtrekk valgt fra gruppen bestående av å binde til en epitop på IL-13 inkludert Helix A og D; en onhastighetskonstant (k 5 1

on) mellom omtrent 10 M-1s-1 til 106M-1s- eller omtrent 106M-1s-1 til 107M-1s-1; en off-hastighetskonstant (koff) på omtrent 10-4s-1 til 10-5s-1; eller på omtrent 10-5s-1 til 10-6s-1 , som målt ved overflateplasmonresonans; og en dissosieringskonstant (KD) på omtrent 1.5x10-10 til 1x10-10 M eller omtrent 10-10 til 10-11 M. I et annet aspekt binder det isolerte antistoffet, eller det antigenbindende fragmentet derav, variant IL-13 og forhindrer bindende av variant IL-13 til IL-13 α2-reseptoren med bindendeskarakteristikker valgt fra gruppen bestående av å binde til en epitop på IL-13 inkludert Helix A og D; en on-hastighetskonstant (kon) mellom omtrent 105M-1s-1 til 106M-1s-1 eller omtrent 106M-1s-1 til 107M-1s-1; en av-hastighetskonstant (koff) på omtrent 10-4s-1 til 10-5s-1; eller på omtrent 10-5s-1 til 10-6s-1 , som målt ved overflateplasmonresonans; og en dissosieringskonstant (KD) på omtrent 1.5x10-10 til 1x10-10 M eller omtrent 10-10 til 10-11 M.

I et aspekt av oppfinnelsen er det bindende protein i stand til å binde IL-13, nevnte antigenbindende domene omfatter minst en CDR omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av:

CDR-H1. X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7(SEQ ID NO: 64), hvori;

X1er T, D, G, eller S;

X2er S;

X3er D;

X4er M, S, Y, L, eller H;

X5er G, W, Y, A, S, eller N;

X6er V, I, eller M; og

X7er D, H, S, Y, N, eller G;

CDR-H2. X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8–X9–X10–X11–X12–X13–X14–X15–

X16–X17(SEQ ID NO: 65), hvori;

X1er M, E, H, R, S, G, eller L;

X2er I eller ikke tilstedeværende;

X3er H, Y, A, D, S, eller W;

X4er P, S, W, eller G;

X5er S, G, E, eller D;

X6er D, G, S, E, eller N;

X7er S, Y eller G;

X8er E, N, Y, V, eller R;

X9er T, I, eller K;

X10er R, Y, I, D, eller A;

X11er L, Y, D, eller F;

X12er N, P, S, eller D;

X13er Q, E, D, P, eller S;

X14er K, M, S, T, A, eller V;

X15er F, L, V, eller M;

X16er K, R, eller Q; og

X17er D, G, eller S;

CDR-H3. X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8–X9–X10–X11–X12–X13–X14(SEQ ID NO: 66), hvori;

X1er W, T, G, Y, D, eller I;

X2er R, A, S, G, eller V;

X3er T, F, Y, eller S;

X4er S, T, eller Y;

X5er Y, F, eller G;

X6er F, eller Y;

X7er S, Y, I, eller F;

X8er D, L, Y, eller P;

X9er Y;

X10er G;

X11er Y, A, P, eller E;

X12er F, M, S, L, eller I;

X13er D, V, N, eller K; og

X14er Y, eller F;

CDR-L1. X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8–X9–X10–X11–X12–X13–X14–X15

X16–X17(SEQ ID NO: 67), hvori;

X1er K, eller R;

X2er S, eller A;

X3er S eller T;

X4er Q, K, eller I;

X5er N, S, T, G, eller E;

X6er L, T, eller S;

X7er L, Q, eller V;

X8er Y, N, H, D, eller T;

X9er S, I, eller T;

X10er S, D, N, H, eller Y;

X11er N, eller G;

X12er Q;

X13er K, F, N, E, eller S;

X14er N, T, eller S;

X15er Y, eller F;

X16er L, A, eller M; og

X17er A, D, E, H, eller N

CDR-L2. X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7(SEQ ID NO: 68), hvori; X1er L, S, K, T, W, eller Y;

X2er V, T, eller A;

X3er S, eller N;

X4er N, K, T, M, eller R;

X5er R, K, eller L;

X6er F, D, E, H, P, eller A; og

X7er S, R, eller P;

og

CDR-L3. X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8–X9(SEQ ID NO: 69),

hvori;

X1er F, W, Q eller A;

X2er Q eller L;

X3er H, G, Y, W, eller N;

X4er N, S, T, L, eller Y;

X5er Y, T, S, E, eller H;

X6er L, V, F, Y, N, G, P, eller D;

X7er P, eller, H;

X8er L, F, Y, W, eller R; og X9er T, eller V.

Fortrinnsvis omfatter det antigenbindende domenet minst en CDR omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av:

residuer 31-35 av SEQ ID NR:32; residuer 52-67 av SEQ ID NR:48;

residuer 50-66 av SEQ ID NR:32; residuer 100-112 av SEQ ID NR:48;

residuer 99-105 av SEQ ID NR:32; residuer 24-34 av SEQ ID NR:49;

residuer 24-39 av SEQ ID NR:33; residuer 50-56 av SEQ ID NR:49;

residuer 55-61 av SEQ ID NR:33; residuer 89-97 av SEQ ID NR:49;

residuer 94-102 av SEQ ID NR:33; residuer 31-37 av SEQ ID NR:50;

residuer 31-35 av SEQ ID NR:34; residuer 52-67 av SEQ ID NR:50;

residuer 50-66 av SEQ ID NR:34; residuer 100-112 av SEQ ID NR:50;

residuer 99-105 av SEQ ID NR:34; residuer 24-34 av SEQ ID NR:51;

residuer 24-39 av SEQ ID NR:35; residuer 60-66 av SEQ ID NR:51;

residuer 55-61 av SEQ ID NR:35; residuer 89-97 av SEQ ID NR:51;

residuer 94-102 av SEQ ID NR:35; residuer 31-35 av SEQ ID NR:52;

residuer 31-35 av SEQ ID NR:36; residuer 50-66 av SEQ ID NR:52;

residuer 50-66 av SEQ ID NR:36; residuer 99-107 av SEQ ID NR:52;

residuer 99-109 av SEQ ID NR:36; residuer 23-36 av SEQ ID NR:53;

residuer 24-39 av SEQ ID NR:37; residuer 52-58 av SEQ ID NR:53;

residuer 55-61 av SEQ ID NR:37; residuer 91-99 av SEQ ID NR:53;

residuer 94-102 av SEQ ID NR:37; residuer 31-35 av SEQ ID NR:54;

residuer 31-35 av SEQ ID NR:38; residuer 50-65 av SEQ ID NR:54;

residuer 50-66 av SEQ ID NR:38; residuer 98-107 av SEQ ID NR:54;

residuer 99-109 av SEQ ID NR:38; residuer 24-38 av SEQ ID NR:55;

residuer 31-35 av SEQ ID NR:39; residuer 54-60 av SEQ ID NR:55;

residuer 50-66 av SEQ ID NR:39; residuer 93-101 av SEQ ID NR:55;

residuer 99-112 av SEQ ID NR:39; residuer 31-35 av SEQ ID NR:56;

residuer 24-39 av SEQ ID NR:40; residuer 50-65 av SEQ ID NR:56;

residuer 55-61 av SEQ ID NR:40; residuer 98-107 av SEQ ID NR:56;

residuer 94-102 av SEQ ID NR:40; residuer 24-38 av SEQ ID NR:57;

residuer 31-35 av SEQ ID NR:41; residuer 54-60 av SEQ ID NR:57;

residuer 50-66 av SEQ ID NR:41; residuer 93-101 av SEQ ID NR:57;

residuer 99-112 av SEQ ID NR:41; residuer 31-35 av SEQ ID NR:58;

residuer 31-35 av SEQ ID NR:42; residuer 50-65 av SEQ ID NR:58;

residuer 50-66 av SEQ ID NR:42; residuer 98-107 av SEQ ID NR:58;

residuer 99-100 av SEQ ID NR:42; residuer 24-38 av SEQ ID NR:59;

residuer 24-39 av SEQ ID NR:43; residuer 54-60 av SEQ ID NR:59;

residuer 55-61 av SEQ ID NR:43; residuer 93-101 av SEQ ID NR:59;

residuer 94-102 av SEQ ID NR:43; residuer 31-35 av SEQ ID NR:60;

residuer 31-35 av SEQ ID NR:44; residuer 50-65 av SEQ ID NR:60;

residuer 50-65 av SEQ ID NR:44; residuer 98-107 av SEQ ID NR:60;

residuer 98-106 av SEQ ID NR:44; residuer 24-38 av SEQ ID NR:61;

residuer 24-40 av SEQ ID NR:45; residuer 54-60 av SEQ ID NR:61;

residuer 56-62 av SEQ ID NR.:45; residuer 93-101 av SEQ ID NR.:61;

residuer 95-103 av SEQ ID NR:45; residuer 31-35 av SEQ ID NR:62;

residuer 32-38 av SEQ ID NR:46; residuer 50-65 av SEQ ID NR:62;

residuer 52-67 av SEQ ID NR:46; residuer 98-107 av SEQ ID NR:62;

residuer 100-112 av SEQ ID NR:46; residuer 24-38 av SEQ ID NR:63;

residuer 24-34 av SEQ ID NR:47; residuer 54-60 av SEQ ID NR:63;

residuer 50-56 av SEQ ID NR:47; og

residuer 89-97 av SEQ ID NR:47; residuer 93-101 av SEQ ID NR:63.

residuer 31-37 av SEQ ID NR:48;

I en foretrukket utførelsesform omfatter bindingsproteinet minst 3 CDRer valgt fra et variabelt domene CDR-sett bestående av:

Fortrinnsvis omfatter bindingsproteinet minst to variable domene CDR-sett.

Fortrinnsvis er minst to variable domene CDR-sett valgt fra en gruppe bestående av:

VH 25C8 CDR-Sett & VL 25C8 CDR-Sett;

VH 9C11 CDR-Sett & VL 9C11 CDR-Sett;

VH 21D9 CDR-Sett & VL 21D9 CDR-Sett;

VH 22D10 CDR-Sett & VL 22D10 CDR-Sett;

VH 5F1 CDR-Sett & VL 5F1 CDR-Sett;

VH 5G1 CDR-Sett & VL 5G1 CDR-Sett;

VH 3H7 CDR-Sett & VL 3H7 CDR-Sett;

VH 14B2 CDR-Sett & VL 14B2 CDR-Sett;

VH 13C5 CDR-Sett & VL 13C5 CDR-Sett;

VH 29G5 CDR-Sett & VL 29G5 CDR-Sett;

VH 33C3 CDR-Sett & VL 33C3 CDR-Sett;

VH 4A8 CDR-Sett & VL 4A8 CDR-Sett;

VH 1B6 CDR-Sett & VL 1B6 CDR-Sett;

VH 3E5CDR-Sett & VL 3E5 CDR-Sett;

VH 6C8 CDR-Sett & VL 6C8 CDR-Sett;

VH 5D3 CDR-Sett & VL 5D3 CDR-Sett; og

VH 8B6 CDR-Sett & VL 8B6 CDR-Sett.

I en annen utførelsesform omfatter bindingsproteinet beskrevet over ytterligere et humant akseptorrammeverk. Fortrinnsvis omfatter det humane akseptorrammeverket en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av:

SEQ ID NR:6 SEQ ID NR:16 SEQ ID NR:26

SEQ ID NR:7 SEQ ID NR:17 SEQ ID NR:27

SEQ ID NR:8 SEQ ID NR:18 SEQ ID NR:28

SEQ ID NR:9 SEQ ID NR:19 SEQ ID NR:29

SEQ ID NR:10 SEQ ID NR:20 SEQ ID NR:30

SEQ ID NR:11 SEQ ID NR:21 og

SEQ ID NR:12 SEQ ID NR:22 SEQ ID NR:31

SEQ ID NR:13 SEQ ID NR:23

SEQ ID NR:14 SEQ ID NR:24

SEQ ID NR:15 SEQ ID NR:25

I en foretrukket utførelsesform er bindingsproteinet et CDR-podet antistoff, eller en antigenbindende del derav, som er i stand til å binde IL-13. Fortrinnsvis omfatter det CDR-podede antistoffet, eller den antigenbindende delen derav, en eller flere CDRer beskrevet over. Fortrinnsvis omfatter det CDR-podede antistoffet, eller den antigenbindende delen derav, et humant akseptorrammeverk. Mer fortrinnsvis er det humane akseptorrammeverket ethvert av de humane akseptorrammeverkene beskrevet over.

I en foretrukket utførelsesform er bindingsproteinet et humanisert antistoff, eller en antigenbindende del derav, i stand til å binde IL-13. Fortrinnsvis omfatter det humaniserte antistoffet, eller en antigenbindende del derav, en eller flere CDRer beskrevet over inkorporert inn i et humant antistoff variabelt domene av et humant akseptorrammeverk. Fortrinnsvis er det variable domenet av et humant antistoff et konsensus humant variabelt domene. Mer fortrinnsvis omfatter det humane akseptorrammeverket minst en aminosyresubstitusjon i rammeverkregionen ved et nøkkelresidu, hvori nøkkelresiduet er valgt fra gruppen bestående av et residu ved siden av en CDR; et glykosyleringsområde residu; et sjeldent residu; et residu i stand til å interagere med humant-IL-13; et residu i stand til å interagere med en CDR; et kanonisk residu; et kontaktresidu mellom tungkjede variabel region og lettkjede variabel region; et residu inne i en Vernier sone; og et residu i en region som overlapper mellom en Chothia-definert variabel tungkjede CDR1 og et Kabat-definert første tungkjede rammeverk. Fortrinnsvis omfatter det humane akseptorrammeverket minst en aminosyresubstitusjon i rammeverkregionen, hvori aminosyresekvensen til rammeverket er minst 65% identisk med sekvensen av nevnte humane akseptorrammeverk og omfatter minst 70 aminosyreresiduer identiske med nevnte humane akseptorrammeverk. Fortrinnsvis er aminosyresubstitusjonen i rammeverkregionen ved et nøkkelresidu valgt fra gruppen bestående av 2L, 15L, 22L, 41L, 42L, 44L, 49L, 50L, 51L, 62L, 71L, 73L, 10H, 44H, 46H, 48H, 67H, 68H, 70H, 72H, 74H, 76H, 83H, 84H, 86H, 87H, og 97H.

I en foretrukket utførelsesform er bindingsproteinet et humanisert antistoff, eller en antigenbindende del derav, i stand til å binde IL-13. Fortrinnsvis omfatter det humaniserte antistoffet, eller den antigenbindende del derav, en eller flere CDRer beskrevet over. Mer fortrinnsvis omfatter det humaniserte antistoffet, eller den antigenbindende delen derav, tre eller flere CDRer beskrevet over. Mest fortrinnsvis omfatter det humaniserte antistoffet, eller antigenbindende del derav, seks CDRer beskrevet over.

I en annen utførelsesform av den krevde oppfinnelse omfatter det humaniserte antistoffet, eller en antigenbindende del derav, minst et variabelt domene som har en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av;

SEQ ID NR:70 SEQ ID NR:77 SEQ ID NR:84

SEQ ID NR:71 SEQ ID NR:78 SEQ ID NR:85

SEQ ID NR:72 SEQ ID NR:79 SEQ ID NR:92

SEQ ID NR:73 SEQ ID NR:80 SEQ ID NR:93

SEQ ID NR:74 SEQ ID NR:81 og

SEQ ID NR:75 SEQ ID NR:82 SEQ ID NR:94.

SEQ ID NR:76 SEQ ID NR:83

Mer fortrinnsvis omfatter det humaniserte antistoffet, eller en antigenbindende del derav, to variable domener valgt fra gruppen beskrevet over. Mer fortrinnsvis omfatter bindingsproteinet to variable domener, hvori nevnte to variable domener har aminosyresekvenser valgt fra gruppen bestående av;

SEQ ID NR:70 & SEQ ID NR:71,

SEQ ID NR:72 & SEQ ID NR:73,

SEQ ID NR:74 & SEQ ID NR:75,

SEQ ID NR:76 & SEQ ID NR:77,

SEQ ID NR:78 & SEQ ID NR:79,

SEQ ID NR:80 & SEQ ID NR:81,

SEQ ID NR:82 & SEQ ID NR:83,

SEQ ID NR:84 & SEQ ID NR:85

SEQ ID NR:80 & SEQ ID NR:92,

SEQ ID NR:80 & SEQ ID NR:93, OG

SEQ ID NR:80 & SEQ ID NR:94.

En utførelsesform ifølge oppfinnelsen tilveiebringer et antistoffkonstruksjon omfattende ethvert av bindendesproteinene beskrevet over og et linker-polypeptid eller et immunoglobulin. I en foretrukket utførelsesform er antistoff-konstruksjonen valgt fra gruppen bestående av et immunoglobulinmolekyl, et monoklonalt antistoff, et chimerisk antistoff, et CDR-podet antistoff, et humanisert antistoff, en Fab, en Fab’, en F(ab’)2, en Fv, en disulfid-linket Fv, en scFv, et enkeltdomene antistoff, et diastoff, et multispesifikt antistoff, et dobbeltspesifikt antistoff, og et bispesifikt antistoff. I en foretrukket utførelsesform omfatter antistoffkonstruksjonen et tungkjede immunoglobulin konstant domene valgt fra gruppen bestående av et humant IgM konstant domene, et humant IgG1 konstant domene, et humant IgG2 konstant domene, et humant IgG3 konstant domene, et humant IgG4 konstant domene, et humant IgE konstant domene, og et humant IgA konstant domene. Mer fortrinnsvis omfatter antistoffkonstruksjonen SEQ ID NR.:2; SEQ ID NR.:3; SEQ ID NR.:4; og SEQ ID NR.:5. I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff-konjugat omfattende antistoffkonstruksjonen beskrevet over og et middel valgt fra gruppen bestående av; et immunotilknytningsmolekyl, et billedfremkallingsmiddel, et terapeutisk middel, og et cytotoksisk middel. I en foretrukket utførelsesform er billedfremkallingsmidlet valgt fra gruppen bestående av en radiomarkør, et enzym, en fluorescerende markør, en luminescerende markør, en bioluminescerende markør, en magnetisk markør, og biotin. Mer fortrinnsvis er billedfremkallingsmidlet en radiomarkør valgt fra gruppen bestående av:

90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, og 153Sm. I en foretrukket utførelsesform er det terapeutiske eller cytotoksiske midlet valgt fra gruppen bestående av; en anti-metabolitt, et alkyleringsmiddel, et antibiotikum, en vekstfaktor, et cytokin, et anti-angiogent middel, et anti-mitotisk middel, en anthracyclin, toksin, og et apoptotisk middel.

I en annen utførelsesform er antistoffkonstruksjonen glykosylert. Fortrinnsvis er glykosyleringen et humant glykosyleringsmønster.

I en annen utførelsesform eksisterer bindingsproteinet, antistoff-konstruksjonen eller antistoff-konjugatet beskrevet over som en krystall. Fortrinnsvis er krystallen en bærerfri farmasøytisk kontrollert-frigivelseskrystall. I en foretrukket utførelsesform har det krystalliserte bindingsproteinet, den krystalliserte antistoff-konstruksjonen eller det krystalliserte antistoff-konjugatet en større halveringstid in vivo enn dets løselige motpart. I en annen foretrukket utførelsesform bibeholder det krystalliserte bindingsproteinet, den krystalliserte antistoff-konstruksjonen eller det krystalliserte antistoff-konjugatet biologisk aktivitet etter krystallisering.

Et aspekt ifølge oppfinnelsen angår et DVD-bindende protein omfattende bindende proteiner i stand til å binde IL-13. Fortrinnsvis er DVD-bindingsproteinet i stand til å binde IL-13 og et andre mål. Det andre målet er valgt fra gruppen bestående av CSF1 (MCSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFN α1, IFN β1, IFN Υ, histamin og histamin-reseptorer, IL-1 α, IL-1 β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 α, IL-12 β, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, KITLG, PDGFB, IL-2R α, IL-4R, IL-5R α, IL-8R α, IL-8R β, IL-12R β1, IL-12R β2, IL-13R α1, IL-13R α2, IL-18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24,CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR, og kitinase. Mer fortrinnsvis er DVD-proteinet i stand til å kjenne igjen IL-13 og IL-1 β, IL-13 og IL-9; IL-13 og IL-4; IL-13 og IL-5; IL-13 og IL-25; IL-13 og TARC; IL-13 og MDC; IL-13 og MIF; IL-13 og TGF- β; IL-13 og LHR agonist; IL-13 og CL25; IL-13 og SPRR2a; IL-13 og SPRR2b; eller IL-13 og ADAM8. Mest fortrinnsvis er DVD-proteinet i stand til å binde IL-13 og TNF α.

Et aspekt ifølge oppfinnelsen angår en isolert nukleinsyre som koder for ethvert av bindingsproteinet, antistoffkonstruksjonen eller antistoffkonjugatet beskrevet over. En ytterligere utførelsesform tilveiebringer en vektor omfattende den isolerte nukleinsyren beskrevet over hvori nevnte vektor er valgt fra gruppen bestående av pcDNA; pTT (Durocher et al., Nukleinsyrer Research 2002, Vol.30, Nr.2); pTT3 (pTT med ytterligere multiple kloningsseter; pEFBOS (Mizushima, S. og Nagata, S., (1990) Nukleinsyrer Research Vol 18, Nr.17); pBV; pJV; og pBJ.

I et annet aspekt er en vertscelle transformert med vektoren beskrevet over. Fortrinnsvis er vertscellen en prokaryotisk celle. Mer fortrinnsvis er vertscellen E.Coli. I en beslektet utførelsesform er vertscellen en eukaryotisk celle. Fortrinnsvis er den eukaryotiske cellen valgt fra gruppen bestående av protist celle, dyrecelle, plantecelle og soppcelle. Mer fortrinnsvis er vertscellen en pattedyrcelle inkludert, men ikke begrenset til, CHO og COS; eller en soppcelle sånn som Saccharomyces cerevisiae; eller en insektcelle så som Sf9.

Et annet aspekt ifølge oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å fremstille et bindende protein som binder IL-13, omfattende å dyrke enhver av vertscellene beskrevet over i et dyrkingsmedium under betingelser tilstrekkelig for å fremstille et bindende protein som binder IL-13.

En utførelsesform tilveiebringer en sammensetning for frigjørelse av et bindende protein hvori sammensetningen omfatter en formulering som igjen omfatter et krystallisert bindende protein, en krystallisert antistoff-konstruksjon eller et krystallisert antistoffkonjugat som beskrevet over og en ingrediens; og minst en polymer bærer. Fortrinnsvis er den polymere bæreren en polymer valgt fra en eller flere av gruppen bestående av: poly(akrylsyre), poly(cyanoakrylatr), poly(aminosyrer), poly(anhydrider), poly(depsipeptid), poly(estere), poly(melkesyre), poly(melke-ko-glykolsyre) eller PLGA, poly(b-hydroksybutyrat), poly(kaprolakton), poly(dioksanon); poly(etylenglykol), poly((hydroksypropyl) metakrylamid, poly[(organo)fosfazen], poly(ortoestere), poly(vinylalkohol), poly(vinylpyrrolidon), malein anhydrid- alkylvinyl eter kopolymere, pluroniske polyoler, albumin, alginat, cellulose og cellulose derivater, kollagen, fibrin, gelatin, hyaluron syre, oligosakkarider, glykaminoglykaner, sulferte polysakkarider, blandinger og kopolymere derav. Fortrinnsvis er ingrediensene valgt fra gruppen bestående av albumin, sukrose, trehalose, laktitol, gelatin, hydroksypropyl- βsyklodekstrin, metoksypolyetylenglykol og polyetylenglykol.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en farmasøytisk sammensetning omfattende et bindende protein, antistoff-konstruksjon eller antistoff-konjugat som beskrevet over og en farmasøytisk akseptabel bærer. I en ytterligere uførelsesform omfatter den farmasøytiske sammensetningen minst et ytterligere terapeutisk middel for å behandle en forstyrrelse hvori IL-13 aktivitet er skadelig. Fortrinnsvis er det ytterligere midlet valgt fra gruppen bestående av: terapeutisk middel, bildefremkallingsmiddel, cytotoksisk middel, angiogenese inhibitorer (inkludert anti-VEGF antistoffer eller VEGF-felle); kinase inhibitorer (inkludert KDR og TIE-2 inhibitorer); ko-stimulerings molekylblokkere (inkludert anti-B7.1, anti-B7.2, CTLA4-Ig, anti-CD20); adhesjonsmolekylblokkere (inkludert anti-LFA-1 Abs, anti-E/L selectin Abs, småmolekyl inhibitorer); anti-cytokin antistoff eller funksjonelt fragment derav (inkludert anti-IL-18, anti-TNF, anti-IL-6/cytokinreseptor antistoffer); methotrexat; syklosporin; rapamycin; FK506; detekterbar merkør eller reporter; en TNF-antagonist; et antireumatisk middel; en muskelavslapper, et narkotikum, et ikke-steroid antiinflammatorisk medikament (NSAID), et smertestillende middel, et bedøvelsesmiddel, et beroligende middel, et lokalt bedøvelsesmiddel, en nevromuskulær blokker, et antimikrobisk middel, et middel mot psoriasis, et kortikosteroid, et anabolt steroid, et erythropoietin, et immuniserende middel, et immunoglobulin, et immundempende middel, et veksthormon, et hormonerstatningsmedikament, et radiofarmasøytikum, et antideprimerende middel, et antipsykotisk middel, et stimulerende middel, et astmamedikament, en beta-agonist, et inhalert steroid, et epinefrin eller analog, et cytokin, og en cytokin-antagonist.

I en utførelsesform kan det aktuelle medikament administreres til et pattedyr, f.eks. et menneske lidende av en eller flere IL-13-assosierte forstyrrelser, inkludert, f.eks. respiratoriske forstyrrelser (f.eks. astma (f.eks. allergisk og ikke-allergisk astma), kronisk obstruktiv pulmonær sykdom (COPD), og andre tilstander som involverer luftveisinflammasjon, eosinofili, fibrose og overdreven mukusproduksjon; atopiske forstyrrelser (f.eks. atopisk dermatitt og allergisk rhinitt); inflammatoriske og/eller autoimmune tilstander av, huden, gastrointestinale organer (f.eks. inflammatoriske tarmsykdommer (IBD), så som ulcerøs kolitt og/eller Crohn's sykdom), og lever (f.eks. kirrose, fibrose); skleroderma; svulster eller krefttyper, f.eks. Hodgkin's lymfom som beskrevet heri. Følgelig inkluderer beskrivelsen anvendelsen av et IL-13-bindende middel (så som et anti-IL-13 antistoff eller fragment derav beskrevet heri) for fremstilling av et medikament til en behandling beskrevet heri. Eksempler på IL-13-assosierte forstyrrelser inkluderer, men er ikke begrenset til, en forstyrrelse valgt fra en eller flere av: respiratoriske forstyrrelser, f.eks. astma (f.eks. allergisk og ikke-allergisk astma (f.eks. astma på grunn av infeksjon med, f.eks. respiratorisk syncytialt virus (RSV), f.eks. i yngre barn)), kronisk obstruktiv pulmonær sykdom (COPD), og andre tilstander som involverer luftveisinflammasjon, eosinofili, fibrose og overdreven mukusproduksjon, f.eks. cystisk fibrose og pulmonær fibrose; atopiske forstyrrelser, f.eks. som resultat av en økt følsomhet for IL-13 (f.eks. atopisk dermatitt, urtikaria, eksem, allergisk rhinitt, og allergisk enterogastritt); inflammatoriske og/eller autoimmun tilstander av huden (f.eks. atopisk dermatitt), gastrointestinale organer (f.eks. inflammatoriske tarmsykdommer (IBD), så som ulcerøs kolitt og/eller Crohn's sykdom), lever (f.eks. kirrose, hepatocellulært karsinom), og skleroderma; svulster eller krefttyper (f.eks. mykvev eller faste svulster), så som leukemi, glioblastom, og lymfom, f.eks. Hodgkin's lymfom; virale infeksjoner (f.eks. fra HTLV-1); fibrose av andre organer, f.eks. fibrose av leveren, (f.eks. fibrose forårsaket av et hepatitt B og/eller C virus); og undertrykking av ekspresjon av beskyttende type 1 immunresponser, (f.eks. , under vaksinasjon), som beskrevet heri.

I andre utførelsesformer tilveiebringer denne søknaden en fremgangsmåte for fremstilling av et medikament til å behandle (f.eks. redusere, forbedre) eller forhindre en eller flere symptomer assosiert med en respiratorisk forstyrrelse, f.eks. astma (f.eks. allergisk og ikke-allergisk astma); allergier; kronisk obstruktiv pulmonær sykdom (COPD); en tilstand som involverer luftveisinflammasjon, eosinofili, fibrose og overdreven mukusproduksjon, f.eks. cystisk fibrose og pulmonær fibrose. For eksempel inkluderer symptomer på astma gisping, kortpustethet, fortetting av bronkiene, luftveishyperaktivitet, nedsatt lungekapasitet, fibrose, luftveisinflammasjon og mukusproduksjon. Medikamentet gjør det mulig å administrere til pasienten en IL-13-antagonist, f.eks. et IL-13 antistoff eller et fragment derav, i en mengde tilstrekkelig for å behandle (f.eks. redusere, forbedre) eller forhindre en eller flere symptomer. IL-13-antistoffet kan bli administrert terapeutisk eller profylaktisk, eller begge deler. IL-13-antagonisten, f.eks. anti-IL-13 antistoffet, eller fragment derav, kan bli administrert til pasienten, alene eller i kombinasjon med andre terapeutiske modaliteter som beskrevet heri. Fortrinnsvis er pasienten et pattedyr, f.eks. et menneske lidende fra en IL-13-assosiert forstyrrelse som beskrevet heri.

I et annet aspekt tilveiebringer denne søknaden en fremgangsmåte for å detektere nærværet av IL-13 i en prøve in vitro (f.eks. en biologisk prøve, sånn som serum, plasma, vev, biopsi). Fremgangsmåte kan bli anvendt for å diagnostisere en forstyrrelse, f.eks. en immun celle-assosiert forstyrrelse. Fremgangsmåten inkluderer: (i) å bringe prøven eller en kontrollprøve i kontakt med anti-IL-13 antistoffet eller fragment derav som beskrevet heri; og (ii) å detektere dannelse av et kompleks mellom anti-IL-13 antistoffet eller fragment derav, og prøven eller kontrollprøven, hvori en statistisk signifikant forandring i dannelsen av komplekset i prøven i forhold til kontrollprøven er indikerende for nærværet av IL-13 i prøven.

I nok et annet aspekt tilveiebringer det bindende protein ifølge oppfinnelsen en mulighet for å detektere nærværet av IL-13 in vivo (f.eks. in vivo "imaging" i et individ). Dette kan bli anvendt for å diagnostisere en forstyrrelse, f.eks. en IL-13- assosiert forstyrrelse. Detekteringen inkluderer: (i) å administrere anti-IL-13 antistoffet, eller fragment derav, som beskrevet heri til et individ eller et kontrollindivid under betingelser som tillater binding av antistoffet, eller fragment, til IL- 13; og (ii) å detektere dannelse av et kompleks mellom antistoffet, eller fragment, og IL-13, hvori en statistisk signifikant forandring i dannelsen av komplekset i individet i forhold til kontrollindividet er indikerende for nærværet av IL-13. I et annet aspekt er bindendesproteinene ifølge oppfinnelsen nyttige for å fremstille et medikament for å behandle en forstyrrelse valgt fra gruppen bestående av artritt, osteoartritt, juvenil kronisk artritt, septisk artritt, Lyme artritt, psoriasis artritt, reaktiv artritt, spondyloartropati, systemisk lupus erytematose, Crohn's sykdom, ulcerøs kolitt, inflammatorisk tarmsykdom, insulinavhengig diabetes mellitus, tyroiditt, astma, allergiske sykdommer, psoriasis, dermatitt skleroderma, graft versus vert sykdom, organtransplantasjonfrastøting, akutt eller kronisk immunsykdom assosiert med organtransplantasjon, sarkoidose, aterosklerose, disseminert intravaskulær koagulering, Kawasaki's sykdom, Grave's sykdom, nefrotisk syndrom, kronisk utmattelsessyndrom, Wegener's granulomatose, Henoch-Schoenlein purpurea, mikroskopisk vaskulitt på nyrene, kronisk aktiv hepatitt, uveitt, septisk sjokk, toksisk sjokksyndrom, sepsissyndrom, kakeksi, smittsomme sykdommer, parasittiske sykdommer, ervervet immunsviktsyndrom, akutt transvers myelitt, Huntington's korea, Parkinson's sykdom, Alzheimer's sykdom, slag, primær biliær kirrose, hemolytisk anemi, ondartedheter, hjertesvikt, myokardialt infarkt, Addison's sykdom, sporadisk polyglandulær mangel type I og polyglandulær mangel type II, Schmidt's syndrom, voksen (akutt) respiratorisk distress syndrom, alopeki, alopeki areata, seronegativ artropati, artropati, Reiter's sykdom, psoriasis artropati, ulcerøs kolittisk artropati, enteropatisk synovitt, klamydia, yersinia- og salmonella-assosiert artropati, spondyloartropati, ateromatisk sykdom/arteriosklerose, atopisk allergi, autoimmun blæredannende sykdom, pemphigus vulgaris, pemphigus foliaceus, pemfigoid, lineær IgA sykdom, autoimmun hemolytisk anemi, Coombs positiv hemolytisk anemi, ervervet pernisiøs anemi, juvenil pernisiøs anemi, myalgisk encefalitt/Royal Free-sykdom, kronisk mukokutan candidiasis, storcelle-artritt, primær skleroserende hepatitt, kryptogen autoimmun hepatitt, ervervet immunsvikt sykdoms syndrom, ervervet immunsviktrelaterte sykdommer, hepatitt B, hepatitt C, vanlig variert immunsvikt (vanlig variabel hypogammaglobulinanemi), dilatert kardiomyopati, kvinnelig ufruktbarhet, eggstokksvikt, prematur eggstokksvikt, fibrotisk lungesykdom, kryptogen fibroserende alveolitt, post-inflammatorisk interstitiell lungesykdom, interstitiell pneumonitt, bindevevssykdom assosiert interstitiell lungesykdom, blandet bindevevssykdom assosiert lungesykdom, systemisk sklerose-assosiert interstitiell lungesykdom, revmatoid artritt-assosiert interstitiell lungesykdom, systemisk lupus erytematoseassosiert lungesykdom, dermatomyositt/polymyositt-assosiert lungesykdom, Sjögren's sykdom-assosiert lungesykdom, ankyloserende spondylitt-assosiert lungesykdom, vaskuliserende diffus lungesykdom, hemosiderose-assosiert lungesykdom, legemiddelindusert interstitiell lungesykdom, fibrose, strålingsfibrose, bronkiolitt obliterans, kronisk eosinofilisk lungebetennelse, lymfosytisk infiltrativ lungesykdom, postinfeksiøs interstitiell lungesykdom, urinsyregikt, autoimmun hepatitt, type-1 autoimmun hepatitt (klassisk autoimmun eller lupoid hepatitt), type-2 autoimmun hepatitt (anti-LKM antistoff-hepatitt), autoimmun-mediert hypoglykemi, type B insulinresistens med acanthosis nigricans, hypoparatyroidisme, akutt immunsykdom assosiert med organtransplantasjonasjon, kronisk immunsykdom assosiert med organtransplantasjon, osteoartrose, primær skleroserende cholangitt, psoriasis type 1, psoriasis type 2, idiopatisk leukopeni, autoimmun neutropeni, nyresykdom NOS, glomerulonefritid, mikroskopisk vasulitt av nyrene, Lymes sykdom, diskoid lupus erytematose, mannlig ufruktbarhet idiopatisk eller NOS, sæd-autoimmunitet, multippel sklerose (alle undertyper), sympatisk oftalmi, pulmonær hypertensjon sekundært til bindevevssykdom, Goodpasture's syndrom, pulmonær manifestering av polyartritt nodosa, akutt revmatisk feber, revmatoid spondylitt, Still's sykdom, systemisk sklerose, Sjögren's syndrom, Takayasu's sykdom/artritt, autoimmun trombocytopeni, idiopatisk trombocytopeni, autoimmun tyroid sykdom, hypertyroidisme, strumøs autoimmun hypotyroidisme (Hashimoto's sykdom), atrofisk autoimmun hypotyroidisme, primær myxødem, fakogen uveitt, primær vaskulitt, vitiligo akutt leversykdom, kroniske leversykdommer, alkoholisk kirrose, alkohol-indusert leverskade, choleosatatis, idiosynkratisk leversykdom, legemiddel-indusert hepatitt, ikke-alkoholisk steatohepatitt, allergi og astma, gruppe B streptokokk (GBS)-infeksjon, mentalforstyrrelser (f.eks. depressjon og schizofreni), Th2 Type og Th1 Type medierte sykdommer, akutt og kronisk smerte (forskjellige typer av smerte), og krefttyper så som lunge, bryst, mave, blære, tykktarm, bukspyttkjertel, eggstokk, prostata og rektal kreft og hematopoietiske ondartedheter (leukemi og lymfom), abetalipoprotemia, acrocyanose, akutt og kronisk parasittiske eller smittsomme prosesser, akutt leukemi, akutt lymfoblastisk leukemi (ALLE), akutt myeloid leukemi (AML), akutt eller kronisk bakteriell infeksjon, akutt pankreatitt, akutt nyresvikt, adenokarsinomer, aerial ectopiske slag, AIDS demenskompleks, alkoholindusert hepatitt, allergisk konjunktivitt, allergisk kontakt dermatitt, allergisk rhinitt, allograft frastøting, alfa-l- antitrypsinmangel, amyotrofisk lateral sklerose, anemi, angina pektoris, forliggende horncelledegenerering, anti cd3 terapi, antifosfolipid syndrom, anti-reseptor hyperfølsomhetsreaksjoner, aortiske og periferale anevrismer, aortisk disseksjon, arteriell hypertensjon, arteriosklerose, arteriovenøs fistula, ataksi, atrial fibrillering (vedvarende eller paroksysmal), atriell dirring, atrioventrikulær blokkering, B-celle lymfom, bengraft frastøting, benmargstransplantasjon (BMT)-frastøting, bundle branch blokkering, Burkitt's lymfom, forbrenninger, hjerte-arytmier, “cardiac stun” syndrom, hjertesvulster, kardiomyopati, kardiopulmonær bypass inflammasjonsrespons, brusktransplantasjonsfrastøting, cerebrale kortikale degenereringer, cerebrale forstyrrelser, kaotisk eller multifokal atriell takykardi, kjemoterapi-assosierte forstyrrelser, kronisk myelogen leukemi (CML), kronisk alkoholisme, kroniske inflammatoriske patologier, kronisk lymfatisk leukemi (CLL), kronisk obstruktiv pulmonær sykdom (COPD), kronisk saliylatforgiftning, kolorektalt karsinom, kongestiv hjertesvikt, konjunktivitt, kontakt-dermatitt, cor pulmonale, koronær arteriesykdom, Creutzfeldt-Jakob sykdom, negativ-kultur-sepsis, cystisk fibrose, cytokinterapi-assosierte forstyrrelser, demens pugilistica, demyelinerende sykdommer, dengue blødende feber, dermatitt, dermatologiske tilstander, diabetes, diabetes mellitus, diabetisk ateriosklerotisk sykdom, diffus Lewy-body-sykdom, dilatert kongestiv kardiomyopati, forstyrrelser i den basale ganglia, Down's syndrom i middelaldrende, medikamentinduserte bevegelsesforstyrrelser indusert av medikamenter som blokkerer CNS dopaminreseptorer, medikamentfølsomhet, eksem, encefalomyelitt, endokarditt, endokrinopati, epiglottitt, epstein-barr virusinfeksjon, erytromelalgi, ekstrapyramidale og cerebrale forstyrrelser, familiært hematofagocytisk lymfohistiocytose, føtal tymus implantatfrastøting, Friedreich's ataksi, funksjonelle perifere arteriellforstyrrelser, fungal sepsis, gasskoldbrann, mavesår, glomerulær nefritt, graftfrastøting av ethvert organ eller vev, gram-negativ sepsis, gram-positiv sepsis, granuloma på grunn av intracellulære organismer, hårcelleleukemi, Hallerrorden-Spatz sykdom, Hashimoto's tyroiditt, høyfeber, hjertetransplantasjonsfrastøting, hemakromatose, hemodialyse, hemolytisk uremisk syndrom/trombolytisk trombocytopenisk purpura, blødning, hepatitt (A), His knippe arytmier, HIV-infeksjon/HIV-nevropati, Hodgkin's sykdom, hyperkinetiske bevegelsesforstyrrelser, hyperfølsomhetsreaksjoner, hyperfølsomhetspneumonitt, hypertensjon, hypokinetisk bevegelsesforstyrrelser, hypotalamisk-pituitær-adrenalakse-evaluering, idiopatisk Addison's sykdom, idiopatisk pulmonær fibrose, antistoffmediert cytotoksisitet, asteni, infantil spinalmuskulær atrofi, inflammasjon av aorta, influensa, ioniserende strålningsutsettelse, iridocyclitt/uveitt/optisk neuritt, iskemi-reperfusjonsskade, iskemisk slag, juvenil revmatoid artritt, juvenil spinal muskulær atrofi, Kaposi's sarkom, nyre transplantasjonsfrastøting, legionella, leishmaniasis, spedalskhet, lesjoner på det kortikospinale system, lipødem, levertransplantasjonsfrastøting, lymfødem, malaria, ondartet lymfom, ondartet histiocytose, ondartet melanom, meningitt, meningokokkitt, metabolsk/idiopatisk migrene hodeverk, mitokondriell multisystemforstyrrelse, blandet bindevevssykdom, monoklonal gammopati, multippel myelitt, flersystemsdegenerering (Mencel Dejerine- Thomas Shi-Drager og Machado-Joseph), myasteni gravis, intracellulært mycobacterium avium, mycobacterium tuberculosis, myelodyplastisk syndrom, myokardialt infarkt, myokardiale iskemiske forstyrrelser, nasofaryngealt karsinom, neonatal kronisk lungesykdom, nefritt, nefrose, nevrodegenerative sykdommer, nevrogenisk muskulære atrofier, neutropen feber, ikke-Hodgkins lymfom, okklusjon av den abdominale aorta og dens avgreninger, okklusive arterielle forstyrrelser, okt3-terapi, orkitt/epidydimitis, orkitt/vasektomi reverseringsprosedyrer, organomegali, osteoporose, bukkspyttkjertel transplantasjonsfrastøting, bukkspyttkjertel karsinom, paraneoplastisk syndrom/hyperkalsemi av ondartettype, paratyroid transplantasjonsfrastøting, pelvisk inflammatorisk sykdom, perennial rhinitt, perikardial sykdom, perifer aterosklerotisk sykdom, perifere vaskulære forstyrrelser, peritonitt, pernisiøs anemi, pneumocystis carinii lungebetennelse, lungebetennelse, POEMS syndrom (polynevropati, organomegali, endokrinopati, monoklonal gammopati, og hudforandringer syndrom), post perfusjon-syndrom, post pumpe-syndrom, post-MI kardiotomi-syndrom, preeklampsi, progressiv supranukleo lammelse, primær pulmonær hypertensjon, skader fra strålingsterapi, Raynaud's fenomen og sykdom, Raynoud's sykdom, Refsum's sykdom, vanlig smal QRS takykardi, renovaskulær hypertensjon, reperfusjonsskade, restriktiv kardiomyopati, sarkomer, skleroderma, senil korea, senil demens av Lewy-legeme-type, seronegative artropatier, sjokk, sigdcelle-anemi, hudallograftfrastøting, hudforandringersyndrom, “tynntarm” transplantasjonsfrastøting, faste svulster, spesifikke arytmier, spinal ataksi, spinocerebrale degenereringer, streptococcal myositt, strukturelle lesjoner på cerebellum, subakutt skleroserende panencefalitt, synkope, syfilis i det kardiovaskulære system, systemisk anafylaksi, systemisk inflammatorisk respons syndrom, systemisk begynnende juvenil revmatoid artritt, T-celle eller FAB ALLE, Telangiectasi, tromboangitt obliterans, trombocytopeni, toksisitet, transplantasjonstrauma/blødning, type III hyperfølsomhetsreaksjoner, type IV hyperfølsomhet, ustabil angina, uremi, urosepsis, urtikaria, hjerteventilsykdommer, åreknuter, vaskulitt, venøse sykdommer, venøs trombose, ventrikulær fibrillering, virale og fungale infeksjoner, vital encefalitt/aseptisk meningitt, vital-assosiert hemafagocytisk syndrom, Wernicke-Korsakoff syndrom, Wilson's sykdom, xenograft frastøting av ethvert organ eller vev, akutte koronærsyndromer, akutt idiopatisk polynevritt, akutt inflammatorisk demyelinerende polyradiculonevropati, akutt iskemi, voksen Still’s sykdom, alopeki areata, anafylakse, Anti-fosfolipid antistoff syndrom, aplastisk anemi, arteriosklerose, atopisk eksem, atopisk dermatitt, autoimmun dermatitt, autoimmun forstyrrelse assosiert med Streptococcus infeksjon, autoimmun Enteropati, autoimmunt hørselstap, autoimmunt Lymfoproliferativt syndrom (ALPS), autoimmun myokarditt, autoimmun prematur eggstokksvikt, blefaritt, bronkiektasi, blæredannende pemfigoid, kardiovaskulær sykdom, katastrofisk Antifosfolipid syndrom, cøliaki, cervikal spondylose, kronisk iskemi, cicatricial pemfigoid, klinisk isolert syndrom (CIS) med risiko for multippel sklerose, konjunktivitt, barndomsbegynnende psykiatrisk forstyrrelse, kronisk obstruktiv pulmonær sykdom (COPD), dacryocystitt, dermatomyositt, diabetisk retinopati, Diabetes mellitus, skive-brokk, skive-prolaps, medikamentindusert immun hemolytisk anemi, endocarditt, endometriose, endoftalmitt, episkleritt, erytema multiforme, erytema multiforme major, gestational pemfigoid, Guillain-Barré syndrom (GBS), høyfeber, Hughes syndrom, idiopatisk Parkinson’s sykdom, idiopatisk interstitiell lungebetennelse, IgE-mediert allergi, immun hemolytisk anemi, inklusjonslegeme-myositt, smittsom okkulær inflammatorisk sykdom, inflammatorisk demyelinerende sykdom, inflammatorisk hjertesykdom, inflammatorisk nyre sykdom, IPF/UIP, iritt, keratitt, keratojuntivitt sicca, Kussmaul sykdom eller Kussmaul-Meier sykdom, Landry's paralyse, Langerhan's cellehistiocytose, Livedo reticularis, makulær degenerering, mikroskopisk polyangitt, Morbus Bechterev, motornevron-forstyrrelser, slimhinne-pemfigoid, multippel organsvikt, Myasteni Gravis, Myelodysplastisk syndrom, myokarditt, nerverotforstyrrelser, nevropati, Ikke-A Ikke-B hepatitt, optisk nevritt, osteolyse, pauciartikulær JRA, perifer okklusiv arterie-sykdom (PAOD), perifer vaskulær sykdom (PVD), perifer arteriesykdom (PAD), Phlebitt, Polyartritt nodosa (eller periartritt nodosa), polychondritt, Polymyalgi Revmatiska, Poliose, Polyartikulær JRA, Polyendokrint mangelsyndrom, Polymyositt, polymyalgi revmatiska (PMR), Post-Pump syndrom, primær parkinsonisme, Prostatitt, ren rødcelleaplasi, primær adrenal utilstrekkelighet, tilbakevendende nevromyelitt optica, restenose, revmatisk hjertesykdom, SAPHO (synovitt, akne, pustulose, hyperostose, og osteitt), skleroderma, sekundær amyloidose, sjokklunge, Scleritt, Sciatica, Sekundær Adrenal Utilstrekkelighet, Silikonassosiert bindevevssykdom, Sneddon-Wilkinson Dermatose, spondylitt ankylosans, Stevens-Johnson syndrom (SJS), systemisk inflammatorisk responssyndrom, Temporær artritt, toksoplasmisk retinitt, toksisk epidermal nekrolyse, transvers myelitt, TRAPS (Svulst Necrosis Faktor reseptor, Type 1 allergisk reaksjon, Type II Diabetes, urtikaria, vanlig interstitiell lungebetennelse (UIP), vaskulitt, vernal konjunktivitt, viral retinitt, Vogt-Koyanagi-Harada syndrom (VKH syndrom), våt makulær degenerering, og sårheling.

I et annet aspekt, er bindingsproteinene ifølge oppfinnelsen nyttige for å behandle en forstyrrelse valgt fra gruppen bestående av akutt Lymfoblastisk leukemi, akutt Myeloid leukemi, Adrenokortisk karsinom, Analkreft, blindtarmskreft, cerebral Astrocytom, Cerebral Astrocytom, Basalcelle karsinom, gallekanalkreft, Extrahepatisk, Blærekreft, Benkreft, Osteosarkom/Malignant Fibrøs Histiocytoma Hjernestamme Glioma, Hjernesvulst, Hjernestamme Gliom, Cerebral strocytom/Malignant Gliom, Ependymom, Medulloblastom, Supratentorial Primitive nevroektodermale svulster, visuell signalvei og hypothalamisk Gliom, brystkreft, Bronkisk Adenomar/karsinoider, Karsinoid Svulst, Gastrointestinalt karsinom av ukjent primær type, sentralnervesystemlymfom, primær cerebral Astrocytom, Livmorhalskreft, kronisk Lymfocytisk leukemi, kronisk Myelogen leukemi, kroniske Myeloproliferative forstyrrelser, Tykktarmkreft, kolorektalkreft, Kutant T-celle-lymfom,, Endometrisk kreft, Ependymom, Esofagkreft, Ewing-familien av svulster, Ekstrakraniell Germcellesvulst, Extragonadal Germcellesvulst, Ekstrahepatisk gallekanalkreft, øyekreft, Intraokkulært Melanom Retinoblastom, galleblærekreft, mavekreft, Gastrointestinal Karsinoid Svulst, Gastrointestinal Stromal Svulst (GIST), Extrakraniell Germcellesvulst, Extragonadal Germcellesvulst, Eggstokk Germcellesvulst, Gestatisk Trofoblastisk Svulst, Gliom, Hjernestamme Gliom, Cerebral Astrocytom Gliom, Visuell signalvei og hypothalamisk Gliom hos barn, hårcelleleukemi, Hode- og Nakkekreft, Hepatocellulær (lever)kreft, Hodgkin lymfom, Hypofaryngeal kreft, Intraokulært Melanom, Islet-celle karsinom (endokrin bukkspyttkjertel), Kaposi sarkom, nyrekreft, Laryngealkreft, akutt Lymfoblastisk leukemi, akutt Myeloid leukemi, kronisk Lymfosytisk leukemi, kronisk Myelogen leukemi, hårcelleleukemi, leppe og munnhulekreft, leverkreft, ikke-småcellet lungkreft, Småcellet lungkreft, AIDS-Relatert lymfom, Burkitt lymfom, Kutant T-celle lymfom, Hodgkin lymfom, Ikke-Hodgkin lymfom, primært sentralnervesystemlymfom, Waldenström Makroglobulinemi, Malignant Fibrøst Histiocytom i Ben/Osteosarkom, Medulloblastom, Melanom, Intraokulært (øye) melanom, Merkelcelle karsinom, ondartet Mesoteliom, Metastatisk skvamøs nakkekreft med okkult primær kreft, munnkreft, Multippel endokrint Neoplasisyndrom, multippel myelitt/Plasmacelle Neoplasma, Mycosis Fungoides, Myelodysplastiske Syndromer, Myelodysplastisk/ Myeloproliferative sykdommer, Myelogen leukemi, kronisk Myeloid leukemi, multippel myelitt, Myeloproliferative forstyrrelser, nesehule og paranasal bihulekreft, nasofaryngeal kreft, nevroblastom, oralkreft, munnhulekreft, leppe og orofaryngealkreft, Osteosarkom/Malignant Fibrøst Histiocytom i ben, eggstokkkreft, eggstokkepitelkreft, eggstokk Germcellesvulst, eggstokksvulst med lavt malignant potensial, bukkspyttkjertelkreft, Islet-celle bukkspyttkjertelkreft, Paranasal bihule og nesehulekreft, Paratyroidkreft, Penilekreft, faryngealkreft, feokromocytom, Pineoblastom og Supratentoriale Primitive nevroektodermale svulster, pituitærsvulst, Plasmacelle Neoplasma/multippel myelitt, Pleuropulmonært Blastom, Prostatakreft, Rektalkreft, nyrekreft, nyrebekken og urinrør, transiell cellekreft, Retinoblastom, spyttkjertelkreft, sarkom, Ewing-familien av svulster, Kaposi sarkom, mykvev sarkom, livmorsarkom, Sézary syndrom, hudkreft (ikke-melanom), hudkreft (melanom), Merkelcelle hudkarsinom, tynntarmskreft, skvamøs celle karsinom, Metastatisk skvamøs Nakkekreft med Okkult primærkreft, mavekreft, Supratentoriale Primitive nevroektodermale svulster, Kutan T-celle lymfom, Testikkelkreft, strupekreft, Tymom og Tymisk karsinom, tyroidkreft, transiell cellekreft av nyrebekkenet og urinrør, Gestatisk Trofoblastisk Svulst, urinrør og nyrebekkenkreft, transiell cellekreft, livmorkreft, Endometrielt livmorsarkom, Vaginalkreft, visuell signalvei og hypotalamisk gliom, Vulvarkreft, Waldenström Makroglobulinemi, Wilms Svulst.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en mulighet for å behandle en pasient lidende fra en forstyrrelse hvori humant-IL-13 er skadelig, hvor ethvert av bindendesproteinene beskrevet over kan administreres før, sammenfallende, eller etter administreringen av et andre middel, som diskutert over. Foretrukket inkluderer det ytterligere terapeutiske middel som kan bli koadministrert og/eller koformulert med en eller flere IL-13 antagonister, (f.eks, anti- IL-13 antistoffer eller fragmenter derav,), en eller flere av: inhalerte steroider; orale steroider; beta-agonister, f.eks. kortvirkende eller langtvirkende beta-agonister; antagonister av leukotriener eller leukotrienreseptorer; kombinasjonsmedikamenter sånn som ADVAIR; IgE inhibitorer, f.eks. anti-IgE antistoffer (f.eks, XOLAIR); fosfodiesteraseinhibitorer (f.eks. PDE4-inhibitorer); xanthiner; antikolinergiske medikamenter; mastcelle-stabiliserende midler så som cromolyn; IL-4-inhibitorer; IL-5-inhibitorer; eotaxin/CCR3-inhibitorer; antagonister av histamin eller dens reseptorer inkludert H1, H2, H3, og H4, og antagonister av prostaglandin D eller dens reseptorer (DP1 og CRTH2). Slike kombinasjoner kan bli anvendt for å behandle astma og andre respiratoriske forstyrrelser. Ytterligere eksempler på terapeutiske midler som kan bli koadministrert og/eller koformulert med en eller flere anti-IL-13 antistoffer eller fragmenter derav, inkluderer blant andre en eller flere av: TNF-antagonister (f.eks. et løselig fragment av en TNF-reseptor, f.eks. p55 eller p75 human TNF-reseptor eller derivater derav, f.eks.75 kD TNFR-IgG (75 kD TNF reseptor-IgG fusionsprotein, ENBREL)); TNF-enzym-antagonister, f.eks. TNF-konverterende enzym (TACE)-inhibitorer; muskarinreseptorantagonister; TGF-betaantagonister; interferon gamma; perfenidon; kjemoterapeutiske midler, f.eks. metotreksat, leflunomid, eller en sirolimus (rapamycin) eller en analog derav, f.eks. CCI-779; Cox2 og cPLA2-inhibitorer; NSAIDer; immunomodulatorer; p38-inhibitorer, TPL-2, MK-2 og NFkB-inhibitorer. Ytterligere et andre middel valgt fra gruppen bestående av budenosid, epidermal vekstfaktor, kortikosteroider, cyclosporin, sulfasalazine, aminosalicylater, 6-mercaptopurin, azatioprin, metronidazol, lipoksygenase-inhibitorer, mesalamin, olsalazine, balsalazid, antioksidanter, tromboksan-inhibitorer, IL-1-reseptorantagonister, anti-IL-1 β monoklonale antistoffer, anti-IL-6 monoklonale antistoffer, vekstfaktorer, elastaseinhibitorer, pyridinyl-imidazolforbindelser, antistoffer eller agonister av TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, og PDGF, antistoffer av CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 eller deres ligander, metotreksat, cyclosporin, FK506, rapamycin, mycofenolat mofetil, leflunomid, NSAIDer, ibuprofen, kortikosteroider, prednisolon, fosfodiesterase-inhibitorer, adenosin-agonister, antitrombotiske midler, komplementinhibitorer, adrenergiske midler, IRAK, NIK, IKK, p38, MAP-kinase-inhibitorer, IL-1 β-konverterende enzyminhibitorer, TNF αkonverterende enzyminhibitorer, T-celle signalinhibitorer, metalloproteinase-inhibitorer, sulfasalazin, azatioprin, 6-mercaptopuriner, angiotensin-konverterende enzyminhibitorer, løselige cytokinreseptorer, løselige p55 TNF-reseptorer, løselig p75 TNF-reseptor, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, antiinflammatoriske cytokiner, IL-4, IL-10, IL-11, og TGF β.

De farmasøytiske sammensetninger beskrevet over kan bli administrert til pasienten ved minst en metode valgt fra parenteral, subkutan, intramuskulær, intravenøs, intrartikulær, intrabronkiell, intraabdominal, intrakapsulær, intrakartilagin, intrakavitært, intraceliært, intracerebralt, intracerebroventrikulært, intrakolisk, intracervikalt, intragastrisk, intrahepatisk, intramyokardialt, intraostealt, intrapelvisk, intraperikardielt, intraperitonealt, intrapleuralt, intraprostatisk, intrapulmonært, intrarektalt, intrarenalt, intraretinalt, intraspinalt, intrasynovialt, intratoraktisk, intrauterint, intravesikalt, bolus, vaginalt, rektalt, bukkalt, sublingualt, intranasalt og transdermalt.

Et aspekt ifølge oppfinnelsen tilveiebringer minst et IL-13 anti-idiotype antistoff til minst et IL-13-bindingsprotein ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Anti-idiotype antistoffet inkluderer ethvert protein- eller peptidinneholdende molekyl som omfatter minst en del av et immunoglobulinmolekyl så som minst en komplementerende bestemmende region (CDR) av en tung- eller lettkjede eller en ligandbindende del derav, en tungkjede eller lettkjede variabel region, en tungkjede eller lettkjede konstant region, en rammeverkregion, eller; enhver del derav, som kan bli inkorporert inn i et bindende protein ifølge den foreliggende oppfinnelsen.

Detaljert beskrivelse ifølge oppfinnelsen

Denne oppfinnelsen angår humane IL-13-bindingsproteiner som angitt i krav 1, spesielt anti-IL-13 antistoffer, eller antigenbindende deler derav, som binder IL-13. Forskjellige aspekter ifølge oppfinnelsen angår antistoffer og antistoffragmenter, og farmasøytiske sammensetninger derav, så vel som nukleinsyrer, rekombinante ekspresjonsvektorer og vertsceller for å lage slike antistoffer og fragmenter. Fremgangsmåter for å bruke antistoffene ifølge oppfinnelsen for å detektere humant-IL-13, for å inhibere human IL-13 aktivitet, in vitro; og for å regulere genekspresjon er også omfattet ifølge oppfinnelsen.

Med mindre annet er definert heri, skal vitenskapelige og tekniske uttrykk anvendt i forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen ha de betydninger som er vanlig forstått av fagmannen. Betydningen og omfanget av uttrykkene burde være klar, imidlertid, i tilfellet av enhver latent ambiguitet, har definisjonene gitt heri presedens over enhver ordboklig eller ytre definisjon. Videre, med mindre annet er krevet ved kontekst, skal singulære uttrykk inkludere flertallsformene og flertallsuttrykk skal inkludere de singulære. I denne søknaden betyr anvendelsen av "eller" det samme som "og/eller" med mindre annet er uttalt. Videre er ikke anvendelsen av uttrykket "inkludert", så vel som andre former, så som "inkluderer" og "inkludert", begrensende. Også uttrykk så som "element" eller "komponent" omfatter både elementer og komponenter omfattende en enhet og elementer og komponenter som omfatter mer enn en underenhet med mindre annet er spesifikt uttalt.

Generellt er nomenklaturer anvendt i forbindelse med, og teknikker i, celle- og vevskultur, molekylærbiologi, immunologi, mikrobiologi, genetikk og protein- og nukleinsyrekjemi og hybridisering beskrevet heri, de velkjent og vanligvis anvendt i teknikken. De aktuelle metodene og teknikkene er generelt utført ifølge konvensjonelle metoder velkjent i teknikken og som beskrevet i forskjellige generelle og mer spesifikke referanser som er sitert og diskutert gjennom hele den foreliggende spesifikasjonen med mindre annet er indikert. Enzymatiske reaksjoner og renseteknikker er utført ifølge produsentens spesifikasjoner, som vanligvis utført i teknikken eller som beskrevet heri. Nomenklaturene anvendt i forbindelse med, og laboratorieprosedyrene og teknikkene ifølge, analytisk kjemi, syntetisk organisk kjemi, og medisinal og farmasøytisk kjemi beskrevet heri er de velkjente og vanligvis anvendt i teknikken. Standard teknikker er anvendt for kjemiske synteser, kjemiske analyser, farmasøytiske fremstillinger, formuleringer, og levering, og behandling av pasienter.

Slik at den foreliggende oppfinnelsen kan bli lettere forstått er utvalgte uttrykk definert under.

Uttrykket "polypeptid” som anvendt heri, refererer til enhver polymerkjede av aminosyrer. Uttrykket "peptid" og “protein” er anvendt utskiftbart med uttrykket polypeptid og refererer også til en polymerkjede av aminosyrer. Uttrykket "polypeptid" omfatter naturlige eller kunstige proteiner, proteinfragmenter og polypeptidanaloger av en proteinsekvens. Et polypeptid kan være en monomer eller en polymer.

Uttrykket "isolert protein" eller "isolert polypeptid" er et protein eller polypeptid som grunnet dets opprinnelse eller kilde som det er avledet fra, ikke er assosiert med naturlig assosierte komponenter som medfølger det i dets naturlige tilstand; er hovedsakelig fritt for andre proteiner fra de samme arter; er uttrykt av en celle fra en forskjellig art; eller forekommer ikke i naturen. Således vil et polypeptid, som er kjemisk syntetisert eller syntetisert i et cellulært system forskjellig fra cellen fra hvilken det naturlig stammet, bli "isolert" fra sine naturlige assosierte komponenter. Et protein kan også bli gjort hovedsakelig fritt for naturlig assosierte komponenter ved isolering, ved å bruke velkjente i teknikker.

Uttrykket “gjenvinne” som anvendt heri, refererer til prosessen med å gjøre en kjemisk forbindelse, så som et polypeptid, hovedsaklig fritt for naturlig assosierte komponenter ved isolering, f.eks. ved å bruke proteinrensingsteknikker velkjent i teknikken.

Uttrykket “humant-IL-13” og “humant-IL-13 viltype” (forkortet heri som h IL-13, h IL-13wt), som anvendt heri, inkluderer et menneskecytokin som er utsondret primært av T helper 2-celler. Uttrykket inkluderer et monomerisk protein av 13 kDa polypeptid.

Strukturen til humant-IL-13 er beskrevet videre i, f.eks. (Moy, Diblasio et al.2001 J Mol Biol 310219-30). Uttrykket humant-IL-13 er ment å inkludere rekombinant humant-IL-13 (rh IL-13), som kan bli fremstilt ved standard rekombinante ekspresjonsmetoder. Tabell 1 viser aminosyresekvensen av humant-IL-13, SEQ ID Nr.1, som er kjent i teknikken.

Tabell 1: sekvens av humant-IL-13

Uttrykket “humant-IL-13 variant” (forkortet heri som h IL-13v), som anvendt heri, inkluderer en variant av humant-IL-13 hvori aminosyreresidu 130 av SEQ ID NR.1 er forandret fra Arginin til Glutamin (R130Q).

“Biologisk aktivitet ” som anvendt heri, refererer til alle iboende biologiske egenskaper til cytokinet. Biologiske egenskaper av IL-13 inkluderer å binde til IL-13-reseptoren (andre eksempler inkluderer immunoglobulin isotype bytting til IgE i humane B-celler og undertrykke inflammatorisk cytokinproduksjon).

Uttrykket "spesifikk bindende" eller "spesifikt bindende", som anvendt heri, med referanse til interaksjonen av et antistoff, et protein, eller et peptid med en andre kjemisk forbindelse, betyr at interaksjonen er avhengig av nærværet av en spesiell struktur (f.eks. en antigen determinant eller epitop) på den kjemiske forbindelsen; f.eks. et antistoff gjenkjenner og binder seg til en spesifikk proteinstruktur heller enn til proteiner generelt. Hvis et antistoff er spesifikt for epitop "A", vil nærværet av et molekyl inneholdende epitop A (eller fri, umerket A), i en reaksjon inneholdende merket "A" og antistoffet, redusere mengden av merket A bundet til antistoffet.

Uttrykket "antistoff”, som anvendt heri, refererer bredt til ethvert immunoglobulin (Ig)-molekyl bestående av fire polypeptidkjeder, to tung (H)-kjeder og to lett (L)-kjeder, eller ethvert funksjonelt fragment, mutant, variant, eller derivat derav, som bibeholder de essensielle epitop-bindende trekkene til et Ig molekyl. Slike mutant-, variant-, eller derivat-antistoff-formater er kjent i teknikken. Ikke-begrensende utførelsesformer av disse er diskutert under.

I et fullengde antistoff omfatter hver tungkjede en tungkjede variabel region (forkortet heri som HCVR eller VH) og en tungkjede konstant region. Den tungkjedete konstant regionen omfatter tre domener, CH1, CH2 og CH3. Hver lettkjede omfatter en lettkjede variabel region (forkortet heri som LCVR eller VL) og en lettkjede konstant region. Den lettkjedete konstante regionen omfatter et domene, CL. VH og VL regionene kan bli ytterligere delt inn i regioner av hypervariabilitet, kalt komplementerbarhetsbestemmende regioner (CDR), delt opp av regioner som er mer konservert, kalt rammeverkregioner (FR). Hver VH og VL består av tre CDRer og fire FRer, arrangert fra amino-terminus til carboksy-terminus i den følgende rekkefølge: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Immunoglobulinmolekyler kan være av enhver type (f.eks. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA og IgY), klasse (f.eks. IgG 1, IgG2, IgG 3, IgG4, IgA1 og IgA2) eller underklasse.

Uttrykket "antigenbindende del" av et antistoff (eller bare "antistoff-del"), som anvendt heri, refererer til en eller flere fragmenter av et antistoff som beholder evnen til å spesifikt binde til et antigen (f.eks. hIL-13). Det har blitt vist at den antigenbindende funksjonen til et antistoff kan bli utført av fragmenter av et fullengde antistoff. Slike antistoffutførelsesformer kan også være bispesifikke, dualspesifikke, eller multispesifikke formater; spesifikt bindende til to eller flere forskjellige antigener.

Eksempler på bindende fragmenter omfattet i uttrykket "antigenbindende del" av et antistoff inkluderer (i) et Fab fragment, et monovalent fragment bestående av VL, VH, CL og CH1 domenene; (ii) et F(ab')2 fragment, et bivalent fragment omfattende to Fab fragmenter bundet sammen med en disulfidbro ved hengselregionen; (iii) et Fd fragment bestående av VH og CH1 domenene; (iv) et Fv fragment bestående av VL og VH domenene av en enkelt arm av et antistoff, (v) et dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, Winter et al., PCT publikasjon WO 90/05144 A1), som omfatter et enkelt variabelt domene; og (vi) en isolert komplementerbarhetsbestemmende region (CDR). Videre, selv om de to domenene av Fv fragmentet, VL og VH, er kodet for av separate gener, kan de bli knyttet sammen ved å bruke rekombinante metoder, ved en syntetisk linker som gjør dem i stand til å bli fremstilt som en enkelt proteinkjede hvori VL- og VH-regionene parres for å danne monovalente molekyler (kjent som enkelkjede Fv (scFv); se f.eks. Bird et al. (1988) Science 242:423-426; og Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Slike enkelkjede antistoffer er også ment å være omfattet av uttrykket "antigenbindende del" av et antistoff. Andre former av enkelkjede antistoffer, sånn som “diabodies” er også omfattet. “Diabodies” er bivalente, bispesifikke antistoffer hvori VH og VL domener er uttrykt på en enkel polypeptidkjede, men ved å bruke en linker som er for kort til å tillate parring mellom de to domenene på den samme kjeden, for dermed å tvinge domenene til å parre med komplementære domener til en annen kjede og danne to antigenbindende seter (se f.eks. Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Struktur 2:1121-1123). Slike antistoffbindende seter er kjent i teknikken (Kontermann og Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York.790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).

Uttrykket “antistoffkonstruksjon” som anvendt heri, refererer til et polypeptid omfattende en eller flere antigenetbindende seter ifølge oppfinnelsen bundet til et linkerpolypeptid eller et immunoglobulin konstant domene. Linkerpolypeptider omfatter to eller fler aminosyreresiduer sammenbundet ved peptidbindinger og blir anvendt for å binde sammen en eller flere antigenbindende deler. Slike linker-polypeptider er velkjent i teknikken (se f.eks. Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Struktur 2:1121-1123). Et immunoglobulin konstant domene refererer til et tung eller lettkjede konstant domene. Aminosyresekvenser til Human IgG tungkjede og lettkjede konstant domene er kjent i teknikken og vist i Tabell 2.

Tabell 2: sekvens av human IgG tungkjede konstant domene og lettkjede konstant domene

Videre kan et antistoff eller antigenbindende del derav være del av et større immunoadhesjonsmolekyl, dannet ved kovalent eller ikke-kovalent assosiasjon av antistoffet eller antistoffdelen med en eller flere andre proteiner eller peptider.

Eksempler på slike immunoadhesjonsmolekyler inkluderer bruk av streptavidin kjerneregionen for å lage et tetramerisk scFv molekyl (Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human antibodies and Hybridomer 6:93-101) og bruk av et cysteinresidu, et markørpeptid og en C-terminal polyhistidinmarkør for å lage bivalente og biotinylerte scFv-molekyler (Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol.31:1047-1058).

Antistoffdeler, så som Fab og F(ab')2-fragmenter, kan bli fremstilt fra hele antistoffer ved å bruke konvensjonelle teknikker, så som respektivt papain- eller pepsinspalting av hele antistoffer. I tillegg kan antistoffer, antistoffdeler og immunoadhesionsmolekyler bli oppnådd ved å bruke standard rekombinante DNA teknikker, som beskrevet heri.

Et "isolert antistoff", som anvendt heri, er ment å refere til et antistoff som er hovedsakelig fritt for andre antistoffer som har forskjellige antigene spesifisiteter (f.eks. et isolert antistoff som spesifikt binder hIL-13 er hovedsaklig fritt for antistoffer som spesifikt binder antigener andre enn hIL-13). Et isolert antistoff som spesifikt binder hIL-13 kan, imidlertid, ha kryssreaktivitet til andre antigener, så som IL-13-molekyler fra andre arter. I tillegg kan et isolert antistoff være hovedsaklig fritt for andre cellulære materialer og/eller kjemikalier.

Uttrykket "humant antistoff", som anvendt heri, er ment å inkludere antistoffer som har variable og konstante regioner avledet fra humane kjønnscellelinje immunoglobulinsekvenser. De humane antistoffene ifølge oppfinnelsen kan inkludere aminosyreresiduer ikke kodet for av humane kjønnscellelinje immunoglobulinsekvenser (f.eks. mutasjoner introdusert ved tilfeldig eller sete-spesifikk mutagenese in vitro eller ved somatisk mutasjon in vivo), f.eks. i CDRene og spesielt i CDR3. Imidlertid er uttrykket "humant antistoff", som anvendt heri, ikke ment å inkludere antistoffer hvori CDR-sekvenser avledet fra kjønnscellelinje til en annen pattedyrart, så som en mus, har blitt knyttet på humane rammeverksekvenser.

Uttrykket "rekombinant humant antistoff", som anvendt heri, er ment å inkluderer alle humane antistoffer som er fremstilt, uttrykt, skapt eller isolert ved rekombinante metoder, så som antistoffer uttrykt ved å bruke en rekombinant ekspresjonsvektor transfektert inn i en vertscelle (beskrevet videre i Seksjon II C, under), antistoffer isolert fra et rekombinant, kombinatorisk humant antistoffbibliotek (Hoogenboom H.R., (1997) TIB Tech.15:62-70; Azzazy H., og Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem.35:425-445; Gavilondo J.V., og Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., og Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378 ), antistoffer isolert fra et dyr (f.eks. en mus) som er transgene for humane immunoglobulingener (se f.eks. Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S.-A., og Green L.L. (2002) Current Opinion in Bioteknologi 13:593-597; Little M. et al (2000) Immunology Today 21:364-370) eller antistoffer fremstilt, uttrykt, skapt eller isolert ved enhver annen metode som involverer spleising av humane immunoglobulingenesekvenser til andre DNA-sekvenser. Slike rekombinante humane antistoffer har variable og konstante regioner avledet fra human kjønnscellelinje immunoglobulinsekvenser. I visse utførelsesformer blir imidlertid slike rekombinante humane antistoffer underkastet in vitro mutagenese (eller, når et dyretransgen for humane Ig sekvenser er anvendt, in vivo somatisk mutagenese) og således er aminosyresekvensene av VH- og VL-regionene av de rekombinante antistoffene sekvenser som, selv om de er derivert fra og beslektet med humane kjønnscellelinje VH- og VL-sekvenser, muligens ikke eksisterer naturlig i det humane antistoff kjønnscellelinje-repertoaret in vivo. En utførelsesform tilveiebringer fullt humane antistoffer i stand til å binde humant-IL-13 som kan bli generert ved å bruke teknikker velkjent i teknikken, så som ved å bruke humant Ig fag-biblioteker så som dem vist i Jermutus et al., PCT publikasjon Nr. WO 2005/007699 A2.

Uttrykket “kimerisk antistoff” refererer til antistoffer som omfatter tung og lettkjede variable regionsekvenser fra en art og konstante regionsekvenser fra en annen art, så som antistoffer som har murine tung og lettkjede variable regioner bundet til humane konstante regioner.

Uttrykket “CDR-podet antistoff” refererer til antistoffer som omfatter tung og lettkjede variable regionsekvenser fra en art men hvori sekvensene av en eller flere av CDR-regionene av VH og/eller VL er byttet ut med CDR-sekvenser av en annen art, så som antistoffer som har murine tung og lettkjede variable regioner hvori en eller flere av de murine CDRene (f.eks. CDR3) har blitt byttet ut med humane CDR-sekvenser.

Uttrykket “humanisert antistoff” refererer til antistoffer som omfatter tung og lettkjede variable regionsekvenser fra en ikke-human art (f.eks. en mus) men hvori minst en del av VH og/eller VL-sekvensen har blitt forandret for å være mer “human-lignende”, dvs.

mer lik humane kjønnscellelinje variable sekvenser. En type av humanisert antistoff er et CDR-podet antistoff, hvori humane CDR-sekvenser er introdusert i ikke-humane VH og VL-sekvenser for å erstatte de tilsvarende ikke-humane CDR-sekvensene. I en utførelsesform er humaniserte anti humant-IL-13 antistoffer og antigenbindende deler tilveiebrakt. Slike antistoffer ble generert ved å danne murine anti-hIL-13 monoklonale antistoffer ved å bruke tradisjonell hybridomteknologi etterfulgt av humanisering ved å bruke in vitro genetisk konstruksjon, så som de vist i Kasaian et al PCT publikasjon Nr. WO 2005/123126 A2.

Uttrykket "Kabat nummerering", "Kabat definisjoner" og "Kabat merking" er anvendt utskiftbart heri. Disse uttrykkene, som er gjenkjent i teknikken, referer til et system for nummerering av aminosyreresiduer som er mer variable (dvs. hypervariable) enn andre aminosyreresiduer i de tung- og lettkjedete variable regionene til et antistoff, eller i en antigenbindende del derav (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci.190:382-391 og Kabat, E.A., et al. (1991) Sequenses of Proteins of Immunological Interesse, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publikasjon Nr.91-3242). For den tungkjedete variable regionen strekker den hypervariable regionen seg fra aminosyreposisjonene 31 til 35 for CDR1, aminosyreposisjoner 50 til 65 for CDR2, og aminosyreposisjoner 95 til 102 for CDR3. For den lettkjedete variable regionen strekker den hypervariable regionen seg fra aminosyreposisjonene 24 til 34 for CDR1, aminosyreposisjonene 50 til 56 for CDR2, og aminosyreposisjonene 89 til 97 for CDR3.

Som anvendt heri, refererer uttrykket "akseptor" og "akseptor antistoff" til antistoffeller nukleinsyresekvensen som tilveiebringer eller som koder for minst 80 %, minst 85 %, minst 90 %, minst 95 %, minst 98 % eller 100 % av aminosyresekvensene til en eller flere av rammeverkregionene. I noen utførelsesformer refererer uttrykket "akseptor" til antistoff-, aminosyre- eller nukleinsyresekvensen som tilveiebringer eller som koder for den konstante regionen(e). I nok en annen utførelsesform refererer uttrykket "akseptor" til antistoff-, aminosyre- eller nukleinsyresekvensen som tilveiebringer eller som koder for en eller flere av rammeverkregionene og de(n) konstante regionen(e). I en spesifikk utførelsesform refererer uttrykket "akseptor" til en human antistoff-, aminosyre- eller nukleinsyresekvens som tilveiebringer eller koder for minst 80 %, fortrinnsvis, minst 85 %, minst 90 %, minst 95 %, minst 98 %, eller 100 % av aminosyresekvensene til en eller flere av rammeverkregionene. I samsvar med denne utførelsesformen kan en akseptor inneholde minst 1, minst 2, minst 3, minst 4, minst 5, eller minst 10 aminosyreresiduer som ikke forekommer ved en eller flere spesifikke posisjoner på et humant antistoff. En akseptorrammeverkregion og/eller akseptor konstant region(er) kan være, f.eks. derivert eller oppnådd fra et kjønnscellelinje antistoffgen, et modent antistoff gen, et funksjonelt antistoff (f.eks. antistoffer velkjent i teknikken, antistoffer i utvikling, eller antistoffer som er kommersielt tilgjengelige).

Som anvendt heri, refererer uttrykket "CDR" til den komplementærhetsbestemmende regionen i antistoff variable sekvenser. Det er tre CDRer i hver av de variable regionene til tungkjeden og lettkjeden, som er betegnet CDR1, CDR2 og CDR3, for hver av de variable regionene. Uttrykket “CDR sett” som anvendt heri, refererer til en gruppe av tre CDRer som forekommer i en enkelt variabel region i stand til å binde antigenet. De eksakte grensene til disse CDRene har blitt definert forskjellig ifølge forskjellige systemer. Systemet beskrevet av Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interesse (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) og (1991)) tilveiebringer ikke bare et utvetydig residunummereringssystem anvendbart på enhver variabel region av et antistoff, men tilveiebringer også presise residugrenser som definerer de tre CDRene. Disse CDRer kan bli referert til som Kabat CDRer. Chothia og medarbeidere (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987) og Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)) fant at visse underdeler inne i Kabat CDRer antar nesten identiske peptidryggradskonformasjoner, selv om de har store forskjeller på aminosyresekvensnivået. Disse underdeler ble betegnet som L1, L2 og L3 eller H1, H2 og H3 hvor "L" og "H" betegner henholdsvis lettkjede- og tungkjederegionene. Disse regionene kan bli referert til som Chothia CDRer, som har grenser som overlapper med Kabat CDRer. Andre grenser som definerer CDRer som overlapper med Kabat CDRene har blitt beskrevet av Padlan (FASEB J.9:133-139 (1995)) og MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)). Ytterligere andre CDR grensedefinisjoner kan strengt tatt ikke følge en av de ovennevnte systemer, men vil allikevel overlappe med Kabat CDRene, selv om de kan bli forkortet eller forlenget i lys av prediksjon eller eksperimentelle funn som partikulære residuer eller grupper av residuer eller til og med hele CDRer, men har ikke stor betydning for antigenbinding. Metodene anvendt heri kan utnytte CDRer definert ifølge ethvert av disse systemene, selv om foretrukne utførelsesformer bruker Kabat eller Chothia definerte CDRer.

Som anvendt heri refererer uttrykket "kanonisk" residu til et residu i en CDR eller rammeverk som definerer en spesifikk kanonisk CDR-struktur som definert ved Chothia et al. (J. Mol. Biol.196:901-907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol.227:799 (1992)). Ifølge Chothia et al., har kritiske deler av CDRene til mange antistoffer nesten identiske peptidryggradkonformasjoner til tross for stor forskjell på aminosyresekvensnivået. Hver kanonisk struktur spesifiserer primært ett sett av peptidryggradvridningsvinkler for et kontinuerlig segment av aminosyreresiduer som danner en løkke.

Som anvendt heri, refererer uttrykket "donor" og "donor antistoff" til et antistoff som tilveiebringer en eller flere CDRer. I en foretrukket utførelsesform er donorantistoffet et antistoff fra en art forskjellig fra den som antistoffet som rammeverkregionene er oppnådd eller avledet fra. I forbindelse med et humanisert antistoff, refererer uttrykket "donor antistoff" til et ikke-humant antistoff som tilveiebringer en eller flere CDRer.

Som anvendt heri, refererer uttrykket "rammeverk" eller "rammeverksekvens" til de gjenværende sekvenser av en variabel region minus CDRene. Fordi den eksakte definisjonen av en CDR-sekvens kan bli bestemt ved forskjellige systemer, er betydningen av en rammeverksekvens gjenstand for tilsvarende forskjellige fortolkninger. De seks CDRene (CDR-L1, CDR-L2, og CDR-L3 av lettkjede og CDR-H1, CDR-H2, og CDR-H3 av tungkjede) deler også rammeverkregionene på lettkjeden og tungkjeden inn i fire underregioner (FR1, FR2, FR3 og FR4) på hver kjede, hvori CDR1 er plassert mellom FR1 og FR2, CDR2 mellom FR2 og FR3, og CDR3 mellom FR3 og FR4. Uten å spesifisere de spesifikke underregioner som FR1, FR2, FR3 eller FR4, representerer en rammeverkregion, som referert av andre, de samlede FR'ene inne i den variable regionen til en enkelt, naturlig forkommende immunoglobulinkjede. Som anvendt heri, representerer en FR en av de fire underregionene, og FRer representerer to eller fler av de fire underregionene som utgjør en rammeverkregion.

Humane tungkjede og lettkjede akseptorsekvenser er kjent i teknikken. I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen er de humane tungkjede og lettkjede akseptorsekvensene valgt fra sekvensene beskrevet i Tabell 3 og Tabell 4.

Tabell 3: tungkjede AKSEPTORsekvenser

Tabell 4: lettkjede AKSEPTORsekvenser

Som anvendt heri, refererer uttrykket "kjønnscellelinje antistoffgen" eller "genfragment" til en immunoglobulinsekvens kodet av ikke- lymfoide celler som ikke har undergått modningsprosessen som leder til genetisk omleiring og mutasjon for ekspresjon av et spesifikt immunoglobulin. (Se, f.eks. Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol.484:13-30 (2001).) En av fordelene tilveiebrakt av forskjellige utførelsesformer av proteinet ifølge den foreliggende oppfinnelsen stammer fra anerkjennelsen at kjønnscellelinjeantistoffgener er mer sannsynlige for å bevare essensielle aminosyresekvensstrukturer karakteristisk for individer av arten enn modne antistoffgener, og derfor sannsynligvis gjenkjent som å være fra en fremmed kilde når anvendt terapeutisk i den arten.

Som anvendt heri, refererer uttrykket "nøkkel"-residuer til visse residuer inne i den variable regionen som har mer innvirkning på bindingsspesifisiteten og/eller affiniteten til et antistoff, spesielt et humanisert antistoff. Et nøkkelresidu inkluderer en eller flere av de følgende: et residu som er ved siden av en CDR, et potensielt glykosyleringssete (kan være enten et N- eller O-glykosyleringsete), et sjeldent residu, et residu i stand til å interagere med antigenet, et residu i stand til å interagere med en CDR, et kanonisk residu, et kontaktresidu mellom tungkjede variabel region og lettkjede variabel region, et residu inne i Vernier-sonen, og et residu i regionen som overlapper mellom Chothiadefinisjonen av en variabel tungkjede CDR1 og Kabat-definisjonen av det første tungkjede rammeverket.

Som anvendt heri, er uttrykket "humanisert antistoff" et antistoff eller en variant, derivat, analog eller fragment derav som immunospesifikt binder seg til et antigen av interesse og som omfatter en rammeverk (FR)-region som har hovedsakelig aminosyresekvensen til et menneskeantistoff og en komplementærbestemmende region (CDR) som har hovedsaklig aminosyresekvensen av et ikke-humant antistoff. Som anvendt heri, refererer uttrykket "hovedsakelig" i forbindelse med en CDR til en CDR som har en aminosyresekvens som er minst 80 %, fortrinnsvis minst 85 %, minst 90 %, minst 95 %, minst 98 % eller minst 99 % identisk med aminosyresekvensen til en ikke-humant antistoff CDR. Et humanisert antistoff omfatter hovedsakelig alle av minst en, og typisk to, variable domener (Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv) hvori alle eller hovedsaklig alle av CDR-regionene tilsvarer de av et ikke-humant immunoglobulin (dvs. donorantistoff) og alle eller hovedsaklig alle av rammeverkregionene er de fra en human immunoglobulin konsensussekvens. Fortrinnsvis omfatter også et humanisert antistoff minst en del av en immunoglobulin konstant region (Fc), typisk som fra et humant immunoglobulin. I noen utførelsesformer, inneholder et humanisert antistoff både lettkjeden så vel som minst det variable domenet av en tungkjede. Antistoffet kan også inkludere CH1, hengsel, CH2, CH3, og CH4-regionene av tungkjeden. I noen utførelsesformer inneholder et humanisert antistoff bare en humanisert lettkjede. I noen utførelsesformer inneholder et humanisert antistoff bare en humanisert tungkjede. I spesifikke utførelsesformer inneholder et humanisert antistoff bare et humanisert variabelt domene av en lettkjede og/eller humanisert tungkjede.

Det humaniserte antistoffet kan bli valgt fra enhver klasse av immunoglobuliner, inkludert IgM, IgG, IgD, IgA og IgE, og enhver isotype, inkludert IgG 1, IgG2, IgG3 og IgG4. Det humaniserte antistoffet kan omfatte sekvenser fra mer enn en klasse eller isotype, og spesifikke konstantdomener kan bli valgt for å optimalisere ønskede effektorfunksjoner ved å bruke teknikker velkjent i teknikken.

Rammeverket og CDR-regioner av et humanisert antistoff behøver ikke å tilsvare nøyaktig de parenterale sekvenser, f.eks. donorantistoff CDRen eller konsensusrammeverket kan bli mutagenisert ved substitusjon, innsetting og/eller fjerning av minst et aminosyreresidu slik at CDR eller rammeverkresiduet ved dette setet ikke korresponderer til enten donorantistoffet eller konsensusrammeverket. I en foretrukket utførelsesform vil imidlertid slike mutasjoner ikke være utstrakte. Vanligvis vil minst 80 %, fortrinnsvis minst 85 %, mer fortrinnsvis minst 90 %, og mest fortrinnsvis minst 95 % av de humaniserte antistoffresiduer korresponderer med de til de parentale FR- og CDR-sekvensene. Som anvendt heri, refererer uttrykket "konsensusrammeverk" til rammeverkregionen i immunoglobulinkonsensussekvensen. Som anvendt heri, refererer uttrykket "immunoglobulinkonsensussekvens" til sekvensen dannet fra de oftest forekommende aminosyrer (eller nukleotider) i en familie av beslektede immunoglobulinsekvenser (se f.eks. Winnaker, from Gener to Kloner (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Tyskland 1987). I en familie av immunoglobuliner, er hver posisjon i konsensussekvensen okkupert av den aminosyren som forekommer oftest i den posisjonen i familien. Hvis to aminosyrer forekommer like ofte, kan hvilken som helst av dem bli inkludert i konsensussekvensen.

Som anvendt heri, refererer "Vernier" sone til en undergruppe av rammeverkresiduer som kan tilpasse CDR-struktur og finstille tilpasningen til antigen som beskrevet av Foote og Winter (1992, J. Mol. Biol.224:487-499). Vernier-sone-residuer danner et lag som ligger under CDRene og kan påvirke strukturen til CDRer og affiniteten til antistoffet.

Uttrykket "multivalent bindende protein" er anvendt i denne beskrivelsen for å betegne et bindende protein omfattende to eller fler antigenbindende seter. Det multivalent bindende protein er fortrinnsvis konstruert for å ha tre eller fler antigenbindende seter, og er generelt ikke et naturlig forkommende antistoff. Uttrykket “multispesifikt bindende protein” refererer til et bindende protein i stand til å binde to eller fler beslektede eller ubeslektede mål. Tosidig variabelt domene (DVD) bindende proteiner som anvendt heri, er bindende proteiner som omfatter to eller fler antigenbindende seter og er tetravalent- eller multivalentbindende proteiner. Slike DVDer kan være monospesifikke, dvs. i stand til å binde ett antigen, eller multispesifikt, dvs. i stand til å binde to eller fler antigener. DVD-bindende proteiner omfattende to tungkjede DVD polypeptider og to lettkjede-DVD-polypeptider er referert til som en DVD Ig. Hver halvdel av en DVD Ig omfatter et tungkjede DVD-polypeptid, og et lettkjede DVD-polypeptid, og to antigenbindende seter. Hvert bindende sete omfatter et tungkjede variabelt domene og et lettkjede variabelt domene med totalt 6 CDRer involvert i antigenbinding per antigenbindende sete.

Som anvendt heri, refererer uttrykket “nøytraliserende” til nøytralisering av biologisk aktivitet til et cytokin når et bindende protein spesifikt binder cytokinet. Fortrinnsvis er et nøytraliserende bindende protein et nøytraliserende antistoff hvis binding til hIL-13 og/eller hIL-13 resulterer i inhibering av en biologisk aktivitet til hIL-13 og/eller hIL-13. Fortrinnsvis binder det nøytraliserende bindende protein hIL-13 og/eller hIL-13 og reduserer en biologisk aktivitet av IL-13 og/eller hIL-13 med minst omtrent 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 85 % eller mer. Inhibering av en biologisk aktivitet av hIL-13 og/eller hIL-13 med et nøytraliserende bindende protein kan bli vurdert ved å måle en eller flere indikatorer for hIL-13 og/eller hIL-13 biologisk aktivitet velkjent i teknikken. For eksempel induserte inhibering av humant-IL-13 produksjonen av TARC (CCL-17) av A-549-celler (se eksempel 1.1.C).

Uttrykket "aktivitet" inkluderer aktiviteter så som bindingsspesifisitet/affinitet av et antistoff for et antigen, f.eks., et anti-hIL-13 antistoff som binder seg til et IL-13 antigen og/eller den nøytraliserende styrken til et antistoff, f.eks. et anti-hIL-13 antistoff hvis binding til hIL-13 inhiberer den biologiske aktiviteten til hIL-13, f.eks. inhibering av humant-IL-13-indusert produksjon av TARC (CCL-17) av A-549-celler (se eksempel 1.1.C).

Uttrykket "epitop" inkluderer enhver polypeptiddeterminant i stand til spesifikk binding til en immunoglobulin- eller T-cellereseptor. I visse utførelsesformer inkluderer epitopdeterminanter kjemisk aktive overflategrupperinger av molekyler så som aminosyrer, sukkersidekjeder, fosforyl eller sulfonyl, og kan i visse utførelsesformer ha spesifikke tredimensjonale strukturelle særtrekk, og/eller spesifikke ladningssærtrekk. En epitop er en region av et antigen som blir bundet av et antistoff. I visse utførelsesformer er et antistoff nevnt å spesifikt binde et antigen når det foretrukket gjenkjenner sitt målantigen i en kompleks blanding av proteiner og/eller makromolekyler.

Uttrykket "overflateplasmonresonans", som anvendt heri, refererer til et optisk fenomen som muliggjør analysen av sanntids biospesifikke interaksjoner ved detektering av forandringer i proteinkonsentrasjoner inne i en biosensormatriks, f.eks. ved å bruke BIAcore-systemet (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden og Piscataway, NJ). For ytterligere beskrivelser, se Jönsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin.51:19-26; Jönsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit.

8:125-131; og Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem.198:268-277.

Uttrykket "kon", som anvendt heri, er ment å referere til on-hastighetskonstanten for assosiasjonen av et antistoff til antigenet for å danne antistoff/antigenkomplekset som er kjent i teknikken.

Uttrykket "koff", som anvendt heri, er ment å referere til off-hastighetskonstanten for dissosiasjonen av et antistoff fra antistoff/antigenkomplekset som er kjent i teknikken.

Uttrykket "KD", som anvendt heri, er ment å refererer til dissosieringskonstanten av en spesifikk antistoff-antigen-interaksjon som er kjent i teknikken.

Uttrykket “merket bindende protein” som anvendt heri, refererer til et protein med en markør inkorporert som sørger for identifiseringen av det bindende proteinet.

Fortrinnsvis er merket en detekterbar markør, f.eks. inkorporering av en radiomerket aminosyre eller binding av biotinylenheter til et polypeptid som kan bli detektert med merket avidin (f.eks. streptavidin inneholdende en fluorescerende markør eller enzymatisk aktivitet som kan bli detektert ved optiske eller kolometriske metoder). Eksempler på markør for polypeptider inkluderer det følgende: radioisotoper eller radionuklider (f eks.<3>H,<14>C,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<U1>ln,<125>I,<133>I,<177>Lu,<166>Ho, eller<153>Sm); fluorescerende markører (f.eks. FITC, rhodamin, lantanide fosforiserende materialer), enzymatiske markører (f.eks. pepperrot peroksidase, luciferase, basisk fosfatase); kjemoluminescensmarkører; biotinylgrupper; forutbestemte polypeptid-epitoper gjenkjent av en sekundær reporter (f.eks. leucin glidelåsparsekvenser, bindende seter for sekundære antistoffer, metallbindende domener, epitop-markører); og magnetiske midler, så som gadolinium-kelater.

Uttrykket “antistoff-konjugat” refererer til et bindende protein, sånn som et antistoff, kjemisk knyttet til en andre kjemisk enhet, sånn som et terapeutisk eller cytotoksisk middel. Uttrykket "middel" er anvendt heri for å betegne en kjemisk forbindelse, en blanding av kjemiske forbindelser, et biologisk makromolekyl, eller et ekstrakt lagd av biologiske materialer. Fortrinnsvis inkluderer de terapeutiske eller cytotoksiske midler, men er ikke begrenset til, pertussis toksin, taxol, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromid, emetine, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicin, doksorubicin, daunorubicin, dihydroksy anthracindion, mitoksantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosteron, glucokortikoider, procaine, tetracaine, lidokain, propranolol, og puromycin og analoger eller homologer derav.

Uttrykket “krystall”, og “krystallisert” som anvendt heri, refererer til et antistoff, eller en antigenbindende del derav, som eksisterer i form av en krystall. Krystaller er en form for fastfase hos stoffer, som er forskjellig fra andre former så som den amorfe fastfasen eller den flytende krystall fasen. Krystaller består av vanlige, repeterende, tredimensjonale gittere av atomer, ioner, molekyler (f.eks. proteiner så som antistoffer), eller molekylære aggregater (f.eks. antigen/antistoffkomplekser). Disse tredimensjonale gitterende er arrangert ifølge spesifikke matematiske sammenhenger som er godt forstått i fagområdet. Den grunnleggende enheten, eller byggestenen, som er repetert i en krystall, blir kalt den asymmetriske enheten. Repetisjon av den asymmetriske enheten i et arrangement som samsvarer til en gitt, veldefinert krystallografisk symmetri tilveiebringer "enhetscellen" til krystallen. Repetisjon av enhetscellen ved vanlige overføringer i alle tre dimensjoner tilveiebringer krystallen.

Se Giege, R. og Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp.20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999).

Uttrykket "polynukleotid" som referert til heri, betyr en type av polymer med to eller flere nukleotider, enten ribonukleotider eller deoksynukleotider eller en modifisert form av enhver av typene nukleotid. Uttrykket inkluderer enkelt- og dobbeltkjedete former av DNA, men er fortrinnsvis dobbeltkjedet DNA.

Uttrykket "isolert polynukleotid" som anvendt heri, skal bety et polynukleotid (f.eks. av genomisk, cDNA, eller syntetisk opprinnelse, eller en kombinasjon derav) basert på dets opprinnelse, gir et "isolert polynukleotid"; er ikke assosiert med hele eller en del av et polynukleotid som det "isolerte polynukleotid" er funnet i naturen med; er funksjonelt bundet til et polynukleotid som det ikke er bundet til i naturen; eller forekommer ikke i naturen som del av en større sekvens.

Uttrykket "vektor", som anvendt heri, er ment å referere til et nukleinsyremolekyl i stand til å transportere en annen nukleinsyre som det har blitt bundet til. En type av vektor er et "plasmid", som refererer til en sirkulær dobbeltkjedet DNA-sløyfe inn i hvilken ytterligere DNA-segmenter kan bli ligert. En annen type av vektor er en viral vektor, hvori ytterligere DNA segmenter kan bli ligert inn i det virale genomet. Visse vektorer er i stand til autonom replikasjons- i en vertscelle som de er introdusert i (f.eks. bakterielle vektorer som har en bakteriell replikasjon opprinnelse og episomale mammaliske vektorer). Andre vektorer (f.eks. ikke-episomale mammaliske vektorer) kan bli integrert inn i genomet til en vertscelle ved introduksjon inn i vertscellen, og blir dermed reprodusert sammen med vertsgenomet. I tillegg er visse vektorer i stand til å styre ekspresjonen av gener som de er funksjonelt bundet til. Slike vektorer er referert til heri som "rekombinante ekspresjonsvektorer" (eller forenklet, "ekspresjonsvektorer"). Generelt er ofte ekspresjonsvektorer nyttige i rekombinante DNA-teknikker i form av plasmider. I foreliggende beskrivelse kan "plasmid" og "vektor" bli anvendt om hverandre siden plasmidet er den mest vanlig anvendte formen for vektor. Imidlertid er oppfinnelsen ment å inkludere andre former for ekspresjonsvektorer, så som viralvektorer (f.eks. replikasjonsdefekte retroviruser, adenoviruser og adeno-assosierte viruser), som virker på tilsvarende måte.

Uttrykket "funksjonelt bundet" refererer til en sammenstilling hvori komponentene beskrevet er i et forhold til hverandre som tillater dem å fungere på deres tilsiktede måte. En kontrollsekvens "funksjonelt bundet" til en kodesekvens er ligert på en slik måte at ekspresjon av kodesekvensen blir oppnådd under betingelser kompatible med kontrollsekvensene. "Funksjonelt bundne" sekvenser inkluderer både ekspresjonskontrollsekvenser som er sammenhengende med genet av interesse og ekspresjonskontrollsekvenser som virker i trans eller på en avstand for å kontrollere genet av interesse. Uttrykket "ekspresjonskontrollsekvens" som anvendt heri, refererer til polynukleotidsekvenser som er nødvendige for å oppnå ekspresjon og prosessering av kodesekvenser som de er ligert til. Ekspresjonskontrollsekvenser inkluderer passende transkripsjonsinitiering, terminering, promotering og forsterkersekvenser; effektive RNA prosesseringssignaler så som spleising- og polyadenyleringssignaler; sekvenser som stabiliserer cytoplasmisk mRNA; sekvenser som forsterker translasjonseffektivitet (dvs. Kozak konsensussekvens); sekvenser som forsterker proteinstabilitet; og når ønsket, sekvenser som forsterker proteinutsondring. Typen av slike kontrollsekvenser varierer avhengig av vertsorganismen; i prokaryoter, inkluderer slike kontrollsekvenser generelt promotor, ribosomalt bindingssete, og transkripsjonstermineringssekvens; i eukaryoter, generelt, inkluderer slike kontrollsekvenser promotorer og transkripsjonstermineringssekvens. Uttrykket "kontrollsekvenser" er ment å inkludere komponenter hvis nærvær er essensiell for ekspresjon og prosessering, og kan også inkludere ytterligere komponenter hvis nærvær er fordelaktig, f.eks. ledersekvenser og fusjonspartnersekvenser. Proteinkonstruksjoner ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan bli uttrykt, og renset ved å bruke ekspresjonsvektorer og vertsceller kjent i teknikken, inkludert ekspresjonskassetter, vektorer, rekombinante vertsceller og metoder for rekombinant ekspresjon og proteolytisk prosessering av rekombinante polyproteiner og pre-proteiner fra en enkel åpen leseramme (f.eks. WO 2007/014162).

"Transformering", som definert heri, refererer til enhver prosess ved hvilken exogen DNA går inn i en vertscelle. Transformering kan forekomme under naturlige eller kunstige betingelser ved å bruke forskjellige metoder velkjent i teknikken.

Transformering kan basere seg på enhver kjent fremgangsmåte for innsetting av fremmede nukleinsyresekvenser inn i en prokaryotisk eller eukaryotisk vertscelle.

Fremgangsmåten blir valgt basert på vertscellen som blir transformert og kan inkludere viral infeksjon, elektroporese, lipofeksjon, og partikkelbombardering. Slike "transformerte" celler inkluderer stabilt transformerte celler hvori det innsatte DNA er i stand til replikasjon enten som et autonomt reproduserende plasmid eller som del av vertskromosomet. De inkluderer også celler som midlertidig uttrykker det innsatte DNA eller RNA for begrensede tidsperioder.

Uttrykket "rekombinant vertscelle" (eller enkelt "vertscelle"), som anvendt heri, er ment å referere til en celle som exogen DNA har blitt introdusert inn i. Det skal forstås at slike uttrykk er ment å ikke bare referere til den spesifikke cellen, men også til etterkommerne av en slik celle. Fordi visse modifiseringer kan forekomme i etterfølgende generasjoner på grunn av enten mutasjon eller påvirkninger fra omgivelsene, kan det faktisk hende at slike etterkommere ikke er identiske med modercellen, men er fortsatt inkludert innen omfanget av uttrykket "vertscelle" som anvendt heri. Fortrinnsvis inkluderer vertsceller prokaryotiske og eukaryotiske celler valgt fra enhver livsform. Foretrukket inkluderer eukaryotiske celler protist, fungal, plante og dyreceller. Mest fortrinnsvis inkluderer vertsceller den prokaryotiske cellelinjen E.Coli; mammaliske cellelinjer CHO, HEK 293 og COS; insektscellelinjen Sf9; og fungalcellen Saccharomyces cerevisiae.

Standardteknikker kan bli anvendt for rekombinant DNA, oligonukleotidsyntese, og vevskultur og transformering (f.eks. elektroporese, lipofeksjon). Enzymatiske reaksjoner og renseteknikker kan bli utført ifølge fabrikantens spesifikasjoner eller som vanlig utført i teknikken eller som beskrevet heri. De forutgående teknikker og prosedyrer kan generelt bli utført ifølge konvensjonelle metoder velkjent i teknikken og som beskrevet i forskjellige generelle og mer spesifikke referanser som er sitert og diskutert gjennom hele foreliggende beskrivelse. Se f.eks. Sambrook et al. Molekylær Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).

“Transgene organismer”, som kjent i teknikken og som anvendt heri, refererer til en organisme som har celler som inneholder et transgen, hvori transgenet introdusert inn i organismen (eller en stamfar til organismen) uttrykker et polypeptid som ikke er naturlig uttrykt i organismen. Et “transgen” er en DNA-konstruksjon som er stabilt og funksjonelt integrert inn i genomet til en celle fra hvilken en transgen organisme utvikles, som styrer ekspresjonen av et kodet geneprodukt i en eller flere celletyper eller- vev hos den transgene organismen.

Uttrykket "regulere"og “modulere” er anvendt om hverandre og, som anvendt heri, refererer de til en forandring i aktiviteten til et molekyl av interesse (f.eks. den biologiske aktiviteten av hIL-13). Modulering kan være en økning eller en minsking i størrelsen av en viss aktivitet eller funksjon til molekylet av interesse. Eksempler på aktiviteter og funksjoner til et molekyl inkluderer bindingskarakteristikker, enzymatisk aktivitet, cellereseptoraktivering, og signaltransduksjon.

Tilsvarende, uttrykket "modulator," som anvendt heri, er en forbindelse i stand til å forandre en aktivitet eller funksjon til et molekyl av interesse (f.eks. den biologiske aktiviteten til hIL-13). For eksempel kan en modulator forårsake en økning eller minsking i størrelsen av en viss aktivitet eller funksjon til et molekyl sammenlignet med størrelsen av aktiviteten eller funksjonen observert i fraværet av modulatoren. I visse utførelsesformer er en modulator en inhibitor, som minsker størrelsen av minst en aktivitet eller funksjon til et molekyl. Eksempler på inhibitorer inkluderer proteiner, peptider, antistoffer, peptistoffer, karbohydrater eller små organiske molekyler.

Peptistoffer er beskrevet, f.eks. i WO01/83525.

Uttrykket "agonist", som anvendt heri, refererer til en modulator som, når den kontaktes med et molekyl av interesse, forårsaker en økning i størrelsen av en viss aktivitet eller funksjon av molekylet sammenlignet med størrelsen av aktiviteten eller funksjonen observert i fraværet av agonisten. Spesifikke agonister av interesse kan inkludere IL-13 polypeptider eller polypeptider, nukleinsyrer, karbohydrater, eller ethvert annet molekyl som binder til hIL-13.

Uttrykket "antagonist" eller "inhibitor", som anvendt heri, refererer til en modulator som, når kontaktet med et molekyl av interesse forårsaker en minsking i størrelsen av en viss aktivitet eller funksjon av molekylet sammenlignet med størrelsen av aktiviteten eller funksjonen observert i fraværet av antagonisten. Spesifikke antagonister av interesse inkluderer de som blokkerer eller modulerer den biologiske eller immunologiske aktiviteten til hIL-13 og/eller hIL-13. Antagonister og inhibitorer av hIL-13 og/eller hIL-13 kan inkludere proteiner, nukleinsyrer, karbohydrater, eller ethvert annet molekyl, som binder til hIL-13 og/eller hIL-13.

Uttrykket “inhibere binding til reseptoren” refererer til evnen til bindingsproteinet til å forhindre bindingen av IL-13 til en eller flere av dens reseptorer. Slik inhibering av å binde til reseptoren vil resultere i minsking eller fjerning av den biologiske aktiviteten mediert ved binding av IL-13 til dens reseptor eller reseptorer.

Som anvendt heri refererer uttrykket "effektiv mengde" til mengden av en behandling som er tilstrekkelig for å redusere eller forbedre alvorlighetsgraden og/eller varigheten av en forstyrrelse eller en eller flere symptomer derav, forhindre fremskridelsen av en forstyrrelse, forårsake tilbakegang av en forstyrrelse, forhindre gjentakelsen, utviklingen, starten av eller fremskidelsen av en eller flere symptomer assosiert med en forstyrrelse, detektere en forstyrrelse, eller forsterke eller forbedre den profylaktiske eller terapeutiske effekt(er) av en annen terapi (f.eks. profylaktisk eller terapeutisk middel).

Uttrykket "prøve", som anvendt heri, er anvendt i sin videste forstand. En “biologisk prøve”, som anvendt heri, inkluderer enhver mengde av en substans fra en levende organisme eller tidligere levende organisme. Slike levende organismer inkluderer mennesker, mus, rotter, aper, hunder, kaniner og andre dyr. Slike substanser inkluderer, men er ikke begrenset til, blod, serum, urin, leddvæske, celler, organer, vev, benmarg, lymfenoder og milt.

I. Antistoffer som binder humant-IL-13

Et aspekt ifølge den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer isolerte murine monoklonale antistoffer, eller antigenbindende deler derav, som binder til IL-13 med høy affinitet, en lav off-rate og høy nøytraliserende kapasitet. Et andre aspekt ifølge oppfinnelsen tilveiebringer kimeriske antistoffer som binder IL-13. Et tredje aspekt ifølge oppfinnelsen tilveiebringer humaniserte antistoffer, eller antigenbindende deler derav, som binder IL-13. Fortrinnsvis er antistoffene, eller deler derav, isolerte antistoffer. Fortrinnsvis er antistoffene ifølge oppfinnelsen nøytraliserende humane anti-IL-13 og/eller humane anti-IL-13 antistoffer.

A. Fremgangsmåte for fremstilling av anti IL-13 antistoffer

Antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan bli fremstilt ved enhver av en rekke metoder kjent i teknikken.

1. Anti-IL-13 monoklonale antistoffer ved å bruke Hybridoma-teknologi Monoklonale antistoffer kan bli fremstilt ved å bruke en rekke forskjellige metoder kjent i teknikken inkludert anvendelsen av hybridoma, rekombinant, og fagefremvisningsteknologier, eller en kombinasjon derav. For eksempel kan monoklonale antistoffer bli fremstilt ved å bruke hybridomametoder inkludert de kjent i teknikken og beskrevet, f.eks., i Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988); Hammerling, et al. i: Monoclonal antibodies and T-cell Hybridomer 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). Uttrykket "monoklonalt antistoff" som anvendt heri, er ikke begrenset til antistoffer fremstilt ved hybridomateknologi.

Uttrykket "monoklonalt antistoff" refererer til et antistoff som er avledet fra en enkelt klon, inkludert enhver eukaryotisk, prokaryotisk, eller fag-klone, og ikke fremgangsmåten som den er fremstilt ved.

Metoder for å produsere, og velgu ut, spesifikke antistoffer ved å bruke hybridomateknologi er rutine og velkjent i teknikken. I en utførelsesform tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen fremgangsmåter for å generere monoklonale antistoffer så vel som antistoffer fremstilt ved fremgangsmåten omfattende å dyrke en hybridomacelle som utsondrer et antistoff ifølge oppfinnelsen hvori, fortrinnsvis, hybridomaet er generert ved å fusjonere splenocytter isolert fra en mus immunisert med et antigen ifølge oppfinnelsen med myelomaceller og deretter undersøke hybridomaene som resultat av fusjonen for hybridomakloner som utsondrer et antistoff i stand til å binde et polypeptid ifølge oppfinnelsen (se eksempel 1.2). Kort sagt kan mus bli immunisert med et IL-13-antigen. I en foretrukket utførelsesform blir IL-13-antigenet administrert med en adjuvant for å stimulere immunresponsen. Slike adjuvanter inkluderer hele eller deler avFreund's adjuvant, RIBI (muramyl dipeptider) eller ISCOM (immunostimulerende komplekser). Slike adjuvanter kan beskytte polypeptidet fra rask spredning ved å isolere det i et lokalt depot, eller de kan inneholde substanser som stimulerer verten til å utsondre faktorer som er kjemotaktiske for makrofager og andre komponenter av immunsystemet. Fortrinnsvis, hvis et polypeptid blir administrert vil immuniseringsplanen involvere to eller flere administrasjoner av polypeptidet, spredd ut over flere uker.

Etter immunisering av et dyr med et IL-13 antigen, kan antistoffer og/eller antistoffproduserende celler bli oppnådd fra dyret. Et anti- IL-13 antistoff-inneholdende serum blir oppnådd fra dyret ved blødning eller ved å avlive dyret. Serumet kan bli anvendt som det fås fra dyret, en immunoglobulinfraksjon kan bli oppnådd fra serumet, eller anti- IL-13 antistoffene kan bli renset fra serumet. Serum eller immunoglobuliner oppnådd på denne måten er polyklonale, således har de en heterogen rekke av egenskaper.

Så snart en immunrespons blir detektert, f.eks. antistoffer spesifikke for antigenet IL-13 blir detektert i museserumet, blir musemilten høstet inn og splenocytter isolert.

Splenocyttene blir så fusjonert ved velkjente teknikker til hvilke som helst egnede myelomaceller, f.eks. celler fra cellelinje SP20 tilgjengelig fra ATCC. Hybridomer blir valgt og klonet ved begrenset fortynning. Hybridomakloner blir så analysert med metoder kjent i teknikken for celler som utsondrer antistoffer i stand til å binde IL-13. Bukhulevæske, som generelt inneholder høye nivåer av antistoffer, kan bli generert ved å immunisere mus med positive hybridoma-kloner.

I en annen utførelsesform kan antistoff-produserende udødeliggjorte hybridomer bli fremstilt fra det immuniserte dyr. Etter immunisering blir dyret er avlivet og milt B-celler blir fusjonert til udødeliggjorte myelomaceller noe som er velkjent i teknikken. Se f.eks. Harlow og Lane, supra. I en foretrukket utførelsesform utsondrer ikke myelomacellene immunoglobulin-polypeptider (en ikke-utsondrende cellelinje). Etter fusjon og antibiotisk utvalg, blir hybridomaene analysert ved å bruke IL-13, eller en del derav, eller en celle som uttrykker IL-13. I en foretrukket utførelsesform blir den første analysen utført ved å bruke et enzym-bundet immunoassay (ELISA) eller et radioimmunoassay (RIA), fortrinnsvis et ELISA. Et eksempel på ELISA analyse er gitt i WO 00/37504.

Anti-IL-13 antistoffproduserende hybridomer blir valgt, klonet og ytterligere analysert for ønskede egenskaper, inkludert robust hybridomavekst, høy antistoffproduksjon og ønskede antistoffegenskaper, som diskutert ytterligere under. Hybridomer kan bli dyrket og formert in vivo i syngeniske dyr, i dyr som mangler et immunsystem, f.eks. nakne mus, eller i cellekulturer in vitro. Fremgangsmåter for utvelgelse, kloning og hybridomer er velkjent for de av vanlig kunnskap innen teknikken.

I en foretrukket utførelsesform er hybridomene musehybridomer, som beskrevet over. I en annen foretrukket utførelsesform er hybridomene fremstilt i en ikke-human, ikkemus-art så som rotter, sauer, griser, geiter, kuer eller hester. I en annen utførelsesform er hybridomene humane hybridomer, hvori et humant ikke-utsondrende myelom er fusjonert med en menneskecelle som uttrykker et anti-IL-13 antistoff.

Antistoffragmenter som gjenkjenner spesifikke epitoper kan bli generert ved kjente teknikker. For eksempel kan Fab og F(ab')2 fragmenter ifølge oppfinnelsen bli fremstilt ved proteolytisk kløyving av immunoglobulinmolekyler, ved å bruke enzymer sånn som papain (for å fremstille Fab fragmenter) eller pepsin (for å fremstille F(ab')2 fragmenter). F(ab')2 fragmenter inneholder den variable regionen, lettkjede konstante regionen og CHI domenet av tungkjedet.

2. Anti-IL-13 monoklonalt antistoffer ved å bruke SLAM

I et annet aspekt ifølge oppfinnelsen blir rekombinante antistoffer generert fra enkeltstående, isolerte lymfocytter ved å bruke en prosedyre referert til i teknikken som ”the chosen lymfocyte antibody method” (SLAM), som beskrevet i U.S. Patent Nr. 5,627,052, PCT publikasjon WO 92/02551 og Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848. I denne fremgangsmåten blir enkeltstående celler som utsondrer antistoffer av interesse, f.eks. lymfocytter avledet fra ethvert av de immuniserte dyr beskrevet i Seksjon 1, analysert ved å bruke et antigen-spesifikt hemolytisk plakk-assay, hvori antigenet IL-13, en underenhet av IL-13, eller et fragment derav, blir koblet til røde blodceller fra sau ved å bruke en linker, så som biotin, og anvendt for å identifisere enkeltstående celler som utsondrer antistoffer med spesifisitet for IL-13. Etter identifisering av antistoffutsondrende celler av interesse blir tung- og lettkjede variabel region cDNAer hentet fra cellene ved revers transkriptase-PCR og disse variable regioner kan deretter bli uttrykt, i betydningen av passende immunoglobulin konstantregioner (f.eks. humane konstantregioner), i mammaliske vertsceller, så som COS eller CHO-celler. Vertscellene transfektert med de forsterkede immunoglobulinsekvenser, avledet fra in vivo utvalgte lymfocytter, kan deretter undergå ytterligere analyse og seleksjon in vitro, f.eks. ved å undersøke de transfekterte cellene for å isolere celler som uttrykker antistoffer mot IL-13. De forsterkede immunoglobulinsekvensene kan bli ytterligere manipulert in vitro, så som ved in vitro affinitetsmodningsmetoder så som dem beskrevet i PCT publikasjon WO 97/29131 og PCT publikasjon WO 00/56772.

3. Anti-IL-13 monoklonalt antistoffer ved å bruke transgene dyrs

I en annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse blir antistoffer, fremstilt ved å immunisere et ikke-humant dyr, omfattende noen, eller alle, av det humane immunoglobulin-locus med et IL-13 antigen. I en foretrukket utførelsesform er det ikke-humane dyr en XENOMOUSE transgen mus, en konstruert muserase som omfatter store fragmenter av det humane immunoglobulin loci og har manglende museantistoffproduksjon. Se f.eks. Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994) og United States patenter 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 og 6,130,364. Se også WO 91/10741, publisert 25. juli 1991, WO 94/02602, publisert 3. februar 1994, WO 96/34096 og WO 96/33735, begge publisert 31. oktober 1996, WO 98/16654, publisert 23. april 1998, WO 98/24893, publisert 11. juni 1998, WO 98/50433, publisert 12- november 1998, WO 99/45031, publisert 10. september 1999, WO 99/53049, publisert 21. oktober 1999, WO 00 09560, publisert 24. februar 2000 og WO 00/037504, publisert 29. juni 2000. Den transgene musen ”XENOMOUSE” produserer et voksen-aktig humant repertoar av helt humane antistoffer, og genererer antigen-spesifikke humane Maber. Den transgene musen ”XENOMOUSE” inneholder omtrent 80 % av det humane antistoffrepertoar gjennom introduksjon av megabase størrelse, kjønnscellelinjekonfigurasjons YAC-fragmenter av de humane tungkjede-loci og x lettkjede-loci. Se Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green og Jakobovits J. Exp. Med.188:483-495 (1998).

4. Anti-IL-13 monoklonale antistoffer ved å bruke bibliotek med rekombinante antistoffer

In vitro metoder kan også bli anvendt for å lage antistoffene ifølge oppfinnelsen, hvori et antistoffbibliotek blir screenet for å identifisere et antistoff som har den ønskede bindingsspesifisiteten. Metoder for slik screening av bibliotek med rekombinante antistofferer er velkjent i teknikken og inkluderer metoder beskrevet i, f.eks., Ladner et al. U.S. Patent Nr.5,223,409; Kang et al. PCT Publikasjon Nr. WO 92/18619; Dower et al. PCT Publikasjon Nr. WO 91/17271; Winter et al. PCT Publikasjon Nr. WO 92/20791; Markland et al. PCT Publikasjon Nr. WO 92/15679; Breitling et al. PCT Publikasjon Nr. WO 93/01288; McCafferty et al. PCT Publikasjon Nr. WO 92/01047; Garrard et al. PCT Publikasjon Nr. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Teknologi 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc acid Res 19:4133-4137; og Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982, US patent søknad publikasjon 20030186374, og PCT Publikasjon Nr. WO 97/29131.

Biblioteket med rekombinante antistoffer kan være fra et individ immunisert med IL-13 eller IL-13, eller en del av IL-13 eller IL-13. Alternativt kan biblioteket med rekombinante antistoffer være fra et naivt individ, dvs. en som ikke har blitt immunisert med IL-13, så som et bibliotek med humane antistoffer fra et menneske som ikke har blitt immunisert med humant-IL-13. Antistoffer ifølge oppfinnelsen blir valgt ved å screene biblioteket med rekombinante antistoffer mot peptidet omfattende humant-IL-13 for derved å velge de antistoffer som gjenkjenner IL-13. Metoder for å utføre slik screening og utvelgelse er velkjent i teknikken, så som beskrevet i referansene i det forutgående avsnittet. For å velge ut antistoffer ifølge oppfinnelsen som har spesifikk bindingsaffinitet for hIL-13, så som dem som dissosierer fra humant-IL-13 med en spesifikk koffhastighetskonstant, den i teknikken kjente fremgangsmåte med overflateplasmonresonans kan bli anvendt for å velge ut antistoffer som har den ønskede koffhastighetskonstanten. For å velge ut antistoffer ifølge oppfinnelsen som har en spesifikk nøytraliserende aktivitet for hIL-13, så som dem med en spesifikk IC50, kan standardmetoder kjent i teknikken for å vurdere inhiberingen av hIL-13-aktivitet bli anvendt.

I et aspekt angår oppfinnelsen et isolert antistoff, eller en antigenbindende del derav, som binder humant-IL-13. Fortrinnsvis er antistoffet et nøytraliserende antistoff. I forskjellige utførelsesformer er antistoffet et rekombinant antistoff eller et monoklonalt antistoff.

For eksempel kan antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen også bli generert ved å bruke forskjellige fagdisplay-metoder kjent i teknikken. I fagdisplay-metoder blir funksjonelle antistoffdomener vist på overflaten av fagpartikler som bærer polynukleotidsekvensene som koder for dem. I en spesifikk utførelse kan slike phage bli utnyttet for å vise antigenbindende domener uttrykt fra et repertoar eller et kombinatorisk antistoffbibliotek (f.eks, menneske eller mus). Fag som uttrykker et antigenbindende domene som binder antigenet av interesse, kan bli valgt eller identifisert med antigen, f.eks. ved å bruke merket antigen eller antigen bundet eller fanget av en fast overflate eller kule. Fag anvendt i disse metodene er typisk filamentfag inkludert fd og M13-bindende domener uttrykt fra fag med Fab, Fv eller disulfidstabilisert Fv antistoffdomener rekombinant fusjonert til enten fag gen III- eller gen VIII-proteinet. Eksempler på fagdisplay-metoder som kan bli anvendt for å lage antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen inkluderer de vist i Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT søknad Nr. PCT/GB91/01134; PCT publikasjoner WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; og U.S. Patent Nr. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780, 225; 5,658,727; 5,733,743 og 5,969,108.

Som beskrevet i referansene over, etter fag-utvelgelse kan antistoffet som koder for regioner fra fagen bli isolert og anvendt for å generere hele antistoffer inkludert humane antistoffer eller ethvert annet ønsket antigenbindende fragment, og uttrykt i enhver ønsket vert, inkludert mammaliske celler, insekt-celler, plante celler, gjær, og bakterier, f.eks. som beskrevet i detalj under. For eksempel, kan teknikker for å rekombinant produsere Fab, Fab' og F(ab')2-fragmenter også bli anvendt ved å bruke metoder kjent i teknikken så som dem beskrevet i PCT publikasjon WO 92/22324; Mullinax et al., BioTeknikker 12(6):864-869 (1992); og Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); og Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) . Eksempler på teknikker som kan bli anvendt for å fremstille enkelt-kjede Fvs og antistoffer inkluderer dem beskrevet i U.S. Pat.4,946,778 og 5,258, 498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); og Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).

Alternativt til screening av biblioteker med rekombinante antistoffer med fagdisplay, kan andre metoder kjent i teknikken for å screene store kombinatoriske biblioteker bli brukt for identifiseringen av dobbeltspesifikke antistoffer ifølge oppfinnelsen. En type av alternativt ekspresjonssystem er et hvori biblioteket med rekombinante antistoffer er uttrykt som RNA-proteinfusjoner, som beskrevet i PCT Publikasjon Nr. WO 98/31700 by Szostak og Roberts, og i Roberts, R.W. og Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302. I dette systemet blir en kovalent fusjon skapt mellom et mRNA og peptidet eller proteinet som det koder for ved in vitro translasjon av syntetiske mRNAer som bærer på puromycin, en antibiotisk peptidylakseptor, ved 3’ enden deres. Således kan et spesifikt mRNA bli oppkonsentrert fra en kompleks blanding av mRNAer (f.eks. et kombinatorisk bibliotek) basert på egenskapene av det kodete peptid eller protein, f.eks. antistoff, eller del derav, så som binding av antistoffet, eller del derav, til det dobbeltspesifikke antigenet. Nukleinsyresekvenser som koder for antistoffer, eller deler derav, gjenvunnet fra screening av slike biblioteker kan bli uttrykt ved rekombinante metoder som beskrevet over (f.eks. i mammaliske vertsceller) og kan, i tillegg, bli utsatt for ytterligere affinitetsmodning enten ved ytterligere runder med screening av mRNA-peptidfusjoner hvori mutasjoner har blitt introdusert inn i den opprinnelige valgte sekvensen(e), eller ved andre metoder for affinitetsmodning in vitro av rekombinante antistoffer, som beskrevet over.

I en annen tilnærmingsmåte kan antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen også bli generert ved å bruke gjærdisplay-metoder kjent i teknikken. I gjærdisplay-metoder blir genetiske metoder anvendt for å binde antistoffdomener til gjærcelleveggen og vise dem frem på overflaten av gjær. Spesielt kan slik gjær bli brukt for å vise frem antigenbindende domener uttrykt fra et repertoar eller et kombinatorisk antistoffbibliotek (f.eks, menneske eller mus). Eksempler på gjærdisplay-metoder som kan bli anvendt for å lage antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen inkluderer de vist i Wittrup, et al. U.S. Patent Nr.6,699,658.

B. Produksjon av rekombinante IL-13 antistoffer

Antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan bli fremstilt ved enhver av en rekke metoder kjent i teknikken. For eksempel ekspresjon fra vertsceller, hvori ekspresjonsvektoren(e) som koder for tung- og lett-kjedene blir transfektert inn i en vertscelle ved standardteknikker. De forskjellige formene av uttrykket "transfeksjon" er ment å omfatte et stort utvalg av teknikker vanligvis anvendt for introduksjonen av exogent DNA inn i en prokaryotisk eller eukaryotisk vertscelle, f.eks. elektroporese, kalsium-fosfat presipitering, DEAE-dextran transfeksjon og lignende. Selv om det er mulig å uttrykke antistoffene ifølge oppfinnelsen i enten prokaryotiske eller eukaryotiske vertsceller, er ekspresjon av antistoffer i eukaryotiske celler foretrukket, og most foretrukket i mammaliske vertsceller, fordi det er mer sannsynlig at slike eukaryotiske celler (og spesielt mammaliske celler) vil sette sammen og utsondre et korrekt foldet og immunologisk aktivt antistoff enn prokaryotiske celler.

Foretrukne mammaliske vertsceller for å uttrykke de rekombinante antistoffene ifølge oppfinnelsen inkluderer Chinese Hamster Ovary (CHO-celler) (inkludert dhfr- CHO-celler, beskrevet i Urlaub og Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, anvendt med en DHFR valgbar markør, f.eks. som beskrevet i R.J. Kaufman og P.A. Sharp (1982) Mol. Biol.159:601-621), NS0 myelomceller, COS-celler og SP2-celler.

Når rekombinante ekspresjonsvektorer som koder for antistoffgener blir introdusert inn i mammaliske vertsceller, blir antistoffene fremstilt ved å dyrke vertscellene i en tidsperiode tilstrekkelig for å tillate ekspresjon av antistoffet i vertscellene eller, mer fortrinnsvis, utsondring av antistoffet inn i dyrkingsmediumet hvori vertscellene blir dyrket. Antistoffer kan bli gjenvunnet fra dyrkingsmediumet ved å bruke standard proteinrensingsmetoder.

Vertsceller kan også bli anvendt for å fremstille funksjonelle antistoffragmenter, så som Fab-fragmenter eller scFv-molekyler. Det vil bli forstått at variasjoner i prosedyren over er innen omfanget ifølge den foreliggende oppfinnelsen. For eksempel kan det være ønskelig å transfektere en vertscelle med DNA som koder for funksjonelle fragmenter av enten lettkjeden og/eller tungkjeden av et antistoff ifølge denne oppfinnelsen.

Rekombinant DNA-teknologi kan også bli anvendt for å fjerne noe, eller allt, av DNAet som koder for en eller begge av lett- og tungkjedene som ikke er nødvendig for binding til antigenene av interesse. Molekylene uttrykt fra slike forkortede DNA-molekyler er også omfattet av antistoffene ifølge oppfinnelsen. I tillegg kan bifunksjonelle antistoffer bli fremstilt hvori en tung- og en lettkjede er et antistoff ifølge oppfinnelsen og den andre tung- og lettkjeden er spesifikk for et antigen forskjellig fra antigenene av interesse ved å krysskoble et antistoff ifølge oppfinnelsen til et andre antistoff ved standard kjemiske krysskoblingsmetoder.

I et foretrukket system for rekombinant ekspresjon av et antistoff, eller en antigenbindende del derav, ifølge oppfinnelsen, blir en rekombinant ekspresjonsvektor som koder for både antistofftungkjeden og antistofflettkjeden introdusert inn i dhfr- CHO-celler ved kalsium fosfat-mediert transfeksjon. Inne i den rekombinante ekspresjonsvektoren er antistofftung- og lettkjedegenene hver operativt bundet til CMV-forsterker/ AdMLP-promotor regulatoriske elementer for å få høye nivåer av transkripsjon av genene. Den rekombinante ekspresjonsvektoren bærer også et DHFR-gen, som tillater seleksjon av CHO-celler som har blitt transfektert med vektoren ved å bruke metotreksatseleksjon/forsterking. De valgte transformantvertsceller blir dyrket for ekspresjon av antistofftung- og lettkjedene og intakt antistoff blir gjenvunnet fra dyrkingsmediumet. Standardteknikker i molekylærbiologi blir anvendt for å fremstille den rekombinante ekspresjonsvektoren, transfektere vertscellene, velge for transformanter, dyrke vertscellene og gjenvinne antistoffet fra dyrkingsmediumet. Enda ytterligere tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å syntetisere et rekombinant antistoff ifølge oppfinnelsen ved å dyrke en vertscelle ifølge oppfinnelsen i et passende dyrkingsmedium til et rekombinant antistoff ifølge oppfinnelsen er syntetisert. Fremgangsmåten kan videre omfatte å isolere det rekombinante antistoffet fra dyrkingsmediumet.

1. Anti IL-13 antistoffer

Tabell 5 er en liste med aminosyresekvenser tilhørende VH- og VL-regioner av foretrukne anti-hIL-13 antistoffer ifølge oppfinnelsen.

Tabell 5 Liste med aminosyresekvenser tilhørende VH- og VL-regioner

De forutgående isolerte anti-IL-13 antistoff CDR-sekvenser etablerer en ny familie av IL-13-bindende proteiner, isolert i samsvar med denne oppfinnelsen, og omfattende polypeptider som inkluderer CDR-sekvensene opplistet i Tabell 6 under. For å generere, og for å velge ut, CDR’er ifølge oppfinnelsen som har foretrukket IL-13-binding og/eller nøytraliserende aktivitet med hensyn til hIL-13 og/eller hIL-13, kan standardmetoder kjent i teknikken for å generere bindende proteiner ifølge den foreliggende oppfinnelsen og for å vurdere de IL-13 og/eller IL-13-bindende og/eller nøytraliserende egenskaper av det bindende protein, bli anvendt, inkludert de spesifikt beskrevet heri.

Tabell 6: Konsensus IL-13 CDR affinitetsligander (alternative residuer er opplistet under hver aminosyreposisjon; - indikerer at residu kan være fraværende)

2. Anti IL-13 Kimeriske antistoffer

Et kimerisk antistoff er et molekyl hvori forskjellig deler av antistoffet er avledet fra forskjellige dyrearter, så som antistoffer som har en variabel region avledet fra et murint monoklonalt antistoff og en human immunoglobulin konstantregion. Metoder for å produsere kimeriske antistoffer er kjent i teknikken og diskutert i detalj i eksempel 2.1. Se f.eks. Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; U.S. Pat. Nr.5,807,715;

4,816,567; og 4,816,397. I tillegg kan teknikker utviklet for produksjonen av "kimeriske antistoffer” (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci.81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) ved å spleise gener fra et murint antistoffmolekyl med passende antigenspesifisitet sammen med gener fra et humant antistoffmolekyl av passende biologisk aktivitet, bli anvendt.

I en utførelsesform blir de kimeriske antistoffene ifølge oppfinnelsen fremstilt ved å bytte ut tungkjede konstantregionen til de murine monoklonale anti humant-IL-13 antistoffene beskrevet i seksjon 1 med en human IgG1 konstantregion. I en spesifikk utførelsesform omfatter det kimeriske antistoffet ifølge oppfinnelsen en tungkjede variabel region (VH) omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 46 og en lettkjede variabel region (VL) omfattende aminosyresekvensen av SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 43;eller SEQ ID NO: 47.

3. Anti IL-13 Humaniserte antistoffer

Humaniserte antistoffer er antistoffmolekyler fra et ikke-humant antistoff som binder det ønskede antigen som har en eller flere komplementærbestemmende regioner (CDRer) fra den ikke-humane dyreart og rammeverkregioner fra et humant immunoglobulinmolekyl. Kjente humane Ig-sekvenser er beskrevet, f.eks. www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH- 05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/immun/antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.www.immunologylink.com/; pathboks.wustl.edu/.about.hcenter/index.- html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html- ; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html; www.biodesign.com/tabell.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin- ks.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protokoll.html; www.isac-net.org/seter_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP- Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni

hd.de/immuNr.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu- blic/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mus.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOseminar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/struktur/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983). Slike importerte sekvenser kan bli anvendt for å redusere immunogenitet eller redusere, forsterke eller modifisere binding, affinitet, onrate, off-rate, aktivitet, spesifisitet, halveringstid, eller enhver annen egnet karakteristisk, som kjent i teknikken.

Rammeverkresiduer i de humane rammeverkregionene kan bli substituert med det korresponderende residu fra CDR donorantistoffet for å forandre, fortrinnsvis forbedre, antigenbindingen. Disse rammeverksubstitusjonene er identifisert med metoder velkjent i teknikken, f.eks. ved å modellere interaksjonen av CDR- og rammeverkresiduene for å identifisere rammeverkresiduer som er viktige for antigenbinding og sekvenssammenligning for å identifisere uvanlige rammeverkresiduer i spesifikke posisjoner. (Se, f.eks. Queen et al., U.S. Pat. Nr.5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988).) Tredimensjonale immunoglobulinmodeller er allment tilgjengelig og er kjent for de med kunnskap i teknikken. Dataprogrammer er tilgjengelige som illustrerer og viser bilder av sannsynlige tre-dimensjonale konformasjonsstrukturer av valgte immunoglobulinsekvenskandidater. Gransking av disse bildene tillater analyse av den sannsylige rollen til residuene i virkningen av immunoglobulinsekvenskandidaten, dvs., analysen av residuer som påvirker evnen til immunoglobulinkandidaten for å binde sitt antigen. På denne måten kan FR-residuer bli valgt og kombinert fra konsensus- og importsekvensene slik at den ønskede antistoffegenskapen, så som økt affinitet for målantigenet(ene), blir oppnådd. CDR-residuene er generelt direkte og mest hovedsaklig involvert i å påvirke antigenbinding. Antistoffer kan bli humanisert ved å bruke en rekke forskjellige metoder kjent i teknikken, så som de beskrevet i Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol.

151: 2296 (1993); Chothia og Lesk, J. Mol. Biol.196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molekylær Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al. , PNAS 91:969-973 (1994); PCT publikasjon WO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592106; EP 519596, EP 239400, U.S. Pat. Nr. 5,565,332, 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567.

C. Produksjon av antistoffer og antistoffproduserende cellelinjer

Fortrinnsvis utviser anti-IL-13 antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen en høy kapasitet for å redusere eller nøytralisere IL-13-aktivitet, f.eks., som vurdert av ethvert av flere in vitro- og in vivo-analyser kjent i teknikken (f.eks. se eksempel 1.1.C). For eksempel nøytraliserer disse antistoffene IL-13-indusert produksjon av TARC av A-549-celler med IC 9

50-verdier i området av minst omtrent 10-8 M, omtrent 10- M, eller omtrent 10-10 M.

I foretrukne utførelsesformer binder det isolerte antistoffet, eller antigenbindende del derav, humant-IL-13, hvori antistoffet, eller den antigenbindende delen derav, dissosieres fra humant-IL-13 med en koffhastighetskonstant på omtrent 0.1s-1 eller mindre, som bestemt ved overflateplasmonresonans, eller som inhiberer humant-IL-13 og/eller humant-IL-13-aktivitet med en IC50på omtrent 1 x 10-6M eller mindre.

Alternativt kan antistoffet, eller en antigenbindende del derav, dissosiere fra humant-IL-13 med en k -1

offhastighetskonstant på omtrent 1 x 10-2s eller mindre, som bestemt ved overflateplasmonresonans, eller inhibere humant-IL-13 og/eller humant-IL-13-aktivitet med en IC50på omtrent 1 x 10-7M eller mindre. Alternativt kan antistoffet, eller en antigenbindende del derav, dissosiere fra humant-IL-13 med en koffhastighetskonstant på omtrent 1 x 10-3s-1 eller mindre, som bestemt ved overflateplasmonresonans, eller inhibere humant-IL-13 og/eller humant-IL-13 med en IC50på omtrent 1 x 10-8M eller mindre. Alternativt kan antistoffet, eller en antigenbindende del derav, dissosiere fra humant-IL-13 med en koffhastighetskonstant på omtrent 1 x 10-4s-1 eller mindre, som bestemt ved overflateplasmonresonans, eller inhibere IL-13 og/eller humant-IL-13-aktivitet med en IC50på omtrent 1 x 10-9M eller mindre. Alternativt kan antistoffet, eller en antigenbindende del derav, dissosiere fra humant-IL-13 med en koffhastighetskonstant på omtrent 1 x 10-5s-1 eller mindre, som bestemt ved overflateplasmonresonans, eller inhibere IL-13 og/eller humant-IL-13 aktivitet med en IC50på omtrent 1 x 10-10M eller mindre. Alternativt kan antistoffet, eller en antigenbindende del derav, dissosiere fra humant-IL-13 med en k hastighetskonstant på omtrent 1 x 10-off

5s-1or mindre, som bestemt ved overflateplasmonresonans, eller inhibere IL-13 og/eller humant-IL-13-aktivitet med en IC -11

50på omtrent 1 x 10 M eller mindre.

IL-13 utøver sin virkning ved å binde til IL-13-reseptoren (IL-13R) på celleoverflaten, heterodimeren omfattet av IL-13R α1-kjeden (IL-13R α1) og IL-4R-kjeden (IL-4R). IL-13 binder seg til IL-13R α1 først med lav affinitet (KD= 2-10 nM) og rekrutterer deretter IL-4R til komplekset, og genererer en høyaffinitetsreseptor (KD= 0.03-0.4 nM) (Aman, M. J., et al .1996 J. Biol. Chem.271, 29265-29270; Miloux, et al .1997 FEBS Lett. 401, 163-166; Andrews, et al 2002 J. Biol. Chem.277, 46073-46078). Heterodimerisering av IL-13R forårsaker aktivering av Janus kinaser, TYK2 og JAK1, henholdsvis grunnleggende assosiert med IL-13R α1 og IL-4R, etterfulgt av aktivering av signaltransduseren og aktivatoren av transkripsjon 6 (STAT6) (Izuhara, K., og Arima, K.2004 Medicament News Perspect.17, 91-98). Det er en annen IL-13-bindende enhet, IL-13R α2-kjeden (IL-13R α2), som binder seg til IL-13 med høy affinitet (0,25-1,2 nM) (Caput, et al 1996 J. Biol. Chem.271, 16921-16926; Donaldson et al 1998 J. Immunol. 161, 2317-2324). Ingen andre reseptormolekyler er kjent å være involvert i IL-13·IL-13R2-komplekset. IL-13R2 er innledningsvis antatt å virke som en ikke-signalerende "lokke"-reseptor. Imidlertid ble det senere oppdaget at den kan binde til IL-13 og signalerer gjennom AP-1 signalveien, noe som fører til TNF-beta produksjon i visse celletyper, inkludert makrofager, som igjen leder til lungefibrose (Fichtner-Feigl, 2006 Nat Med 12:99-106). Både IL-13R α1/IL-4R α og IL-13R α2 signalveiene bidrar til den samlede patofysiologien av astma og andre pulmonære inflammatoriske tilstander. Derfor vil et terapeutisk anti-IL-13 antistoff som blokkerer IL-13-binding til begge reseptorer være mer effektivt ennn de som bare blokkerer en reseptor.

Vi har isolert monoklonale antistoffer som blokkerer IL-13-binding til både IL-13R α1 og IL-13R α2. Både ELISA-basert reseptorbindingsassay og 125-I-merket IL-13 bindingsassay på celleoverflate demonstrerte at 13C5, både murin versjon og humanisert versjon (dvs. 13C5.5), var i stand til effektiv blokkering av IL-13-binding til begge reseptorene. Antistoffer av den samme slekten som 13C5, inkludert 25C8 og 33C3, var også i stand til å blokkere IL-13-binding til begge reseptorene. Epitopkartlegging av 13C5 indikerte at dets bindende sete(r) inkluderte den C-terminale Helix D-regionen av humant-IL-13 (residuer VRDTK IEVAQ FVKDL LLHLK KLFRE GR, tilsvarende aminosyre 104-130 av SEQ ID NR.1). Den C-terminale helix D-regionen har blitt foreslått å være involvert i interaksjoner med IL-13-reseptoren (Zuegg et al 2001 Immunol Cell Biol.79:332-9). Krystallstrukturen av humant-IL-13-kompleksert med Fab-delen av 13C5.5 antistoffet indikerte at 13C5.5 binder den C-terminale Helix D-regionen så vel som den N-terminale Helix A-regionen hos humant-IL-13. Fortrinnsvis binder antistoffet, eller det antigenbindende fragmentet derav, humant-IL-13 slik at IL-13 med nevnte antistoff, eller det antigenbindende fragmentet derav, bundet til epitopen definert ved de topografiske regionene Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 og Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu-128-Gly129-Arg130 av SEQ ID Nr.1 er inhibert fra å binde til IL-13-reseptoren. Fortrinnsvis binder antistoffet, eller det antigenbindende fragmentet derav, humant-IL-13 slik at IL-13 med nevnte antistoff, eller det antigenbindende fragmentet derav, bundet til epitopen definert ved de topografiske regionene Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 og Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127 av SEQ ID Nr.

1 er inhibert fra å binde til IL-13 α2-reseptoren.

I visse utførelsesformer omfatter antistoffet en tungkjede konstant region, så som en IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM eller IgD konstant region. Fortrinnsvis er tungkjede konstant regionen en IgG1 tungkjede konstant region eller en IgG4 tungkjede konstant region. Videre kan antistoffet omfatte en lettkjede konstant region, enten en kappa lettkjede konstant region eller en lambda lettkjede konstant region. Fortrinnsvis omfatter antistoffet en kappa lettkjede konstant region. Alternativt kan antistoffdelen være f.eks., et Fab-fragment eller et enkelkjede Fv-fragment.

Utskiftninger av aminosyreresiduer i Fc-delen for å forandre antistoff effektorfunksjon er kjent i teknikken (Winter, et al. U.S. Patent Nr.5,648,260; 5624821). Fc-delen av et antistoff formidler flere viktig effektorfunksjoner f.eks. cytokininduksjon, ADCC, fagocytose, komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) og halveringstid/fjerning av antistoff og antigen-antistoffkomplekser. I noen tilfeller er disse effektorfunksjonene ønskelige for terapeutiske antistoffer, men kan i andre tilfeller være unødvendig eller til og med skadelige, avhengig av de terapeutiske formål. Visse humane IgG isotyper, spesielt IgG1 og IgG3, formidler ADCC og CDC via binding til henholdsvis Fc�Rs og komplement C1q. Neonatale Fc-reseptorer (FcRn) er de avgjørende komponenter som bestemmer den sirkulerende halveringstiden til antistoffer. I en ytterligere annen utførelsesform blir minst ett aminosyreresidu byttet ut i konstantregionen til antistoffet, f.eks. Fc-regionen til antistoffet, slik at effektorfunksjoner til antistoffet blir forandret.

En utførelsesform tilveiebringer et merket bindende protein hvori et antistoff eller en antistoffdel ifølge oppfinnelsen er derivatisert eller bundet til et annet funksjonelt molekyl (f.eks. et annet peptid eller protein). For eksempel kan et merket bindende protein ifølge oppfinnelsen bli derivert ved å funksjonelt knytte et antistoff, eller en antistoffdel, ifølge oppfinnelsen (ved kjemisk kobling, genetisk fusjon, ikke-kovalent assosiasjon eller på annen måte) til en eller flere andre molekylære enheter, så som et annet antistoff (f.eks. et bispesifikt antistoff eller et diastoff), et detekterbart middel, et cytotoksisk middel, et farmasøytisk middel, og/eller et protein eller peptid som kan formidle assosiering av antistoffet eller antistoffdelen med et annet molekyl (så som en streptavidin kjerneregion eller en polyhistidinmarkør).

Nyttige detekterbare midler som et antistoff, eller en antistoffdel, ifølge oppfinnelsen kan bli derivatisert med, inkluderer fluorescerende forbindelser. Eksempler på fluorescerende detekterbare midler inkluderer fluorescein, fluorescein isotiocyanat, rhodamin, 5-dimetylamin-1-naftalenesulfonylklorid, phycoerythrin og lignende. Et antistoff kan også bli derivatisert med detekterbare enzymer, så som alkalisk fosfatase, pepperrot peroksidase, glukose oksidase og lignende. Når et antistoff blir derivatisert med et detekterbart enzym, blir det detektert ved å tilsette ytterligere reagenser som enzymet anvender for å fremstille et detekterbart reaksjonsprodukt. For eksempel når det detekterbare midlet pepperrot peroksidase er til stede, leder tilsetningen av hydrogenperoksid og diaminobenzidin til et farget reaksjonsprodukt som er detekterbart. Et antistoff kan også bli derivatisert med biotin, og detektert gjennom indirekte måling av avidin- eller streptavidinbinding.

En annen utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringer et krystallisert bindende protein. Fortrinnsvis angår oppfinnelsen krystaller av hele anti-IL-13 antistoffer og fragmenter derav som beskrevet heri, og formuleringer og sammensetninger omfattende slike krystaller. I en utførelsesform har det krystalliserte bindende protein en lengre halveringstid in vivo enn den løselige motpart av bindingsproteinet. I en annen utførelsesform beholder bindingsproteinet biologisk aktivitet etter krystallisering.

Krystallisert bindende protein ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt ifølge metoder kjent i teknikken og som vist i WO 02072636.

En annen utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringer et glykosylert bindende protein hvori antistoffet eller antigenbindende del derav omfatter en eller flere karbohydratresiduer. Begynnende in vivo proteinproduksjon kan undergå ytterligere prosessering, kjent som post-translasjonsmodifisering. Spesielt kan sukker (glykosyl)-residuer bli tilsatt enzymatisk, en prosess kjent som glykosylering. De resulterende proteiner som har kovalent bundet oligosakkaridsidekjeder, er kjent som glykosylerte proteiner eller glykoproteiner. Antistoffer er glykoproteiner med en eller flere karbohydratresiduer i Fc-domenet, så vel som det variable domenet. Karbohydratresiduer i Fc-domenet har en viktig effekt på effektorfunksjonen til Fc-domenet, med minimal effekt på antigenbindingen eller halveringstiden til antistoffet (R. Jefferis, Biotechnol. Prog.21 (2005), pp. 11–16), i motsetning til glykosylering av det variable domenet som kan ha en effekt på den antigenetbindende aktiviteten til antistoffet. Glykosylering i det variable domenet kan ha en negativ effekt på antistoffbindingsaffiniteten, sannsynligvis på grunn av sterisk hindring (Co, M.S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30:1361- 1367), eller resultere i økt affinitet for antigenet (Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:27172723).

Et aspekt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er rettet mot å generere glykosyleringssetemutanter hvori det O- eller N-koblede glykosyleringssetet til bindingsproteinet har blitt mutert. En fagmannn kan generere slike mutanter ved å bruke standard velkjente teknikker. Glykosyleringssetemutanter som beholder den biologiske aktiviteten, men har økt eller nedsatt bindende aktivitet, er et annet mål ifølge den foreliggende oppfinnelsen.

I enda en annen utførelsesform er glykosyleringen av antistoffet, eller antigenbindende del, ifølge oppfinnelsen modifisert. For eksempel kan et aglykosylert antistoff bli lagd (dvs., antistoffet mangler glykosylering). Glykosylering kan bli forandret for å, f.eks., øke affiniteten til antistoffet overfor et antigen. Slike karbohydratmodifiseringer kan bli oppnådd ved, f.eks., å forandre en eller flere seter for glykosylering inne i antistoffsekvensen. For eksempel kan en eller flere aminosyresubstitusjoner bli lagd som resulterer i eliminering av en eller flere variabel region glykosyleringsseter for på den måten å eliminere glykosylering ved dette setet. Slik aglykosylering kan øke affiniteten til antistoffet for antigenet. Slik en tilnærmingsmåte er beskrevet i ytterligere detalj i PCT Publikasjon WO2003016466A2, og U.S. Pat. Nr.5,714,350 og 6,350,861.

Ytterligere, eller alternativt, kan et modifisert antistoff ifølge oppfinnelsen som har en forandret type av glykosylering bli lagd, så som et hypofucosylert antistoff som har reduserte mengder av fucosylresiduer eller et antistoff som har økt antall todelende GlcNAc strukturer. Slike forandrede glykosyleringsmønstre har blitt demonstrert å øke ADCC-evnen til antistoffer. Slike karbohydratmodifiseringer kan bli oppnådd ved, f.eks., å uttrykke antistoffet i en vertscelle med forandret glykosyleringsmaskineri. Celler med forandret glykosyleringmaskineri har blitt beskrevet i teknikken og kan bli anvendt som vertsceller for å uttrykke rekombinante antistoffer ifølge oppfinnelsen for derved å produsere et antistoff med forandret glykosylering. Se f.eks. Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem.277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech.17:176-1, så vel som, Europeisk Patent Nr: EP 1,176,195; PCT Publikasjoner WO 03/035835; WO 99/54342 80.

Proteinglykosylering avhenger av aminosyresekvensen til proteinet av interesse, så vel som vertscellen hvori proteinet er uttrykt. Forskjellig organismer kan produsere forskjellige glykosyleringsenzymer (f.eks. glykosyltransferaser og glykosidaser), og har forskjellige substrater (nukleotidsukkere) tilgjengelig. På grunn av slike faktorer kan proteinglykosyleringsmønster, og sammensetning av glykosylresiduer, variere avhengig av vertssystemet hvori det spesifikke proteinet blir uttrykt. Glykosylresiduer som er nyttige i oppfinnelsen kan inkludere, men er ikke begrenset til, glukose, galaktose, mannose, fucose, n-acetylglukosamin og sialinsyre. Fortrinnsvis omfatter det glykosylerte bindende protein glykosylresiduer slik at glykosyleringsmønsteret er humant.

Det er kjent for fagmannen at forskjellig proteinglykosylering kan resultere i forskjellige proteinegenskaper. For eksempel kan effektiviteten av et terapeutisk protein fremstilt i en mikroorganismevert, så som gjær, og glykosylert ved å utnytte gjærens endogene reaksjonsveier, bli redusert sammenlignet med den til det samme proteinet uttrykt i en mammalisk celle, sånn som en CHO-cellelinje. Slike glykoproteiner kan også være immunogene i mennesker og vise redusert halveringstid in vivo etter administrering. Spesifikke reseptorer i mennesker og andre dyr kan gjenkjenne spesifikke glykosylresiduer og fremme rask fjerning av proteinet fra blodomløpet. Andre ugunstige effekter kan inkludere forandringer i proteinfolding, løselighet, følsomhet for proteaser, ”trafficking”, transport, kompartementalisering, utsondring, gjennkjenning av andre proteiner eller faktorer, antigenitet, eller allergenitet. Følgelig kan en praktiserende lege foretrekke et terapeutisk protein med en spesifikk sammensetning og mønster for glykosylering, f.eks. glykosyleringssammensetning og mønster identisk, eller minst lignende, det fremstilt i menneskelige celler eller i de artsspesifikke celler til det tilsiktede dyret.

Ekspresjon av glykosylerte proteiner forskjellige fra de av en vertscelle kan bli oppnådd ved å genetisk modifisere vertscellen for å uttrykke heterologe glykosyleringsenzymer.

Ved å bruke metoder kjent i teknikken kan en praktiserende lege generere antistoffer eller antigenbindende deler derav som uttrykker menneskelig proteinglykosylering. For eksempel har gjærstammer blitt genetisk modifisert for å uttrykke ikke-naturlig forkommende glykosyleringsenzymer slik at glykosylerte proteiner (glykoproteiner) fremstilt i disse gjærstammene fremviser proteinglykosylering identisk med de fra dyreceller, spesielt menneskeceller (U.S. patentsøknader 20040018590 og 20020137134 og PCT publikasjon WO2005100584 A2).

I tillegg til bindingssproteinene er den foreliggende oppfinnelsen også rettet mot et antiidiotypisk (anti-Id) antistoff spesifikt for slike bindende proteiner ifølge oppfinnelsen. Et anti-Id antistoff er et antistoff, som gjenkjenner unike determinanter generelt assosiert med den antigenbindende regionen til et annet antistoff. Anti-Id kan bli fremstilt ved å immunisere et dyr med bindingsproteinet eller en CDR-inneholdende region derav. Det immuniserte dyret vil gjenkjenne, og svare på de idiotypiske determinantene til det immuniserende antistoffet og produsere et anti-Id antistoff. Anti-Id antistoffet kan også bli anvendt som et "immunogen" for å indusere en immunrespons i nok et annet dyr, produserende et såkalt anti-anti-Id antistoff.

Videre vil det bli forstått av en fagmann at et protein av interesse kan bli uttrykt ved å bruke et bibliotek av vertsceller genetisk konstruert for å uttrykke forskjellige glykosyleringsenzymer, slik at medlemsvertscellene til biblioteket produserer proteinet av interesse med forskjellige glykosyleringsmønstre. En praktiserende lege kan så velge å isolere proteinet av interesse med et spesifikt nytt glykosyleringsmønster. Fortrinnsvis utviser proteinet som har et spesielt valgt nytt glykosyleringsmønster, forbedrede eller forandrede biologiske egenskaper.

D. Anvendelser av Anti-IL-13 antistoffer

Gitt deres evne til å binde humant-IL-13, kan anti-humant-IL-13 antistoffene, eller deler derav, ifølge oppfinnelsen bli anvendt for å detektere humant-IL-13 (f.eks. i en biologisk prøve, så som serum eller plasma), ved å bruke et konvensjonelt immunoassay, så som et enzymbundet immunosorbent assay (ELISA), et radioimmunoassay (RIA) eller vev immunohistokjemi. Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å detektere 1umant-IL-13 i en biologisk prøve omfattende å bringe i kontakt en biologisk prøve med et antistoff, eller antistoffdel, ifølge oppfinnelsen og å detektere enten antistoffet (eller antistoffdelen) bundet til humant-IL-13 eller ikke-bundet antistoff (eller antistoffdel), for derved å detektere humant-IL-13 i den biologiske prøven. Antistoffet er direkte eller indirekte merket med en detekterbar substans for å forenkle deteksjonen av bundet eller ubundet antistoff. Egnede detekterbare substanser inkluderer forskjellige enzymer, protesegrupper, fluorescerende materialer, luminescerende materialer og radioaktive materialer. Eksempler på egnede enzymer inkluderer pepperrot peroksidase, alkalisk fosfatase, β-galaktosidase, eller acetylkolinesterase; eksempler på egnede protesegruppekomplekser inkluderer streptavidin/biotin og avidin/biotin; eksempler på egnede fluorescerende materialer inkluderer umbelliferon, fluorescein, fluorescein isotiocyanat, rhodamin, diklorotriazinylamin fluorescein, dansylklorid eller fykoerytrin; et eksempel på et luminescerende materiale inkluderer luminol; og eksempler på egnede radioaktive materialer inkluderer

Alternativt til merking av antistoffet kan humant-IL-13 bli analysert i biologiske væsker ved et konkuranseimmunoassay som bruker rhIL- 13 -standarder merket med en detekterbar substans og et umerket anti-humant-IL-13 antistoff. I dette assayet blir den biologiske prøven, de merkede rhIL- 13 -standardene og det anti- humant-IL-13 antistoffet kombinert og mengden av merket rhIL- 13 standard bundet til det umerkede antistoffet blir bestemt. Mengden av humant-IL-13 i den biologiske prøven er invers proporsjonal til mengden av merket rhIL- 13 -standard bundet til anti-IL-13 antistoffet. Likeledes kan også humant-IL-13 bli analysert i biologiske væsker ved et konkuranseimmunoassay som bruker rhIL- 13 -standarder merket med en detekterbar substans og et umerket anti- humant-IL-13 antistoff.

Antistoffene og antistoffdel er ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis i stand til å nøytralisere humant-IL-13 -aktivitet både in vitro og in vivo. Følgelig kan slike antistoffer og antistoffdeler ifølge oppfinnelsen bli anvendt for å inhibere hIL- 13 -aktivitet, f.eks. i en cellekultur inneholdende hIL-13, i mennesker eller i andre pattedyr som har IL- 13 som et antistoff ifølge oppfinnelsen kryssreagerer med. I en utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å inhibere hIL-13 aktivitet omfattende å bringe i kontakt hIL-13 med et antistoff eller antistoffdel ifølge oppfinnelsen slik at hIL-13-aktivitet blir inhibert. For eksempel til en cellekultur inneholdende, eller mistenkt å inneholde hIL-13, kan et antistoff eller antistoffdel ifølge oppfinnelsen bli tilsatt til dyrkingsmediumet for å inhibere hIL-13 aktivitet i kulturen.

Det bindende proteinet ifølge oppfinnelsen gjør det mulig å redusere hIL-13-aktivitet i et individ, fordelaktig i et individ som lider av en sykdom eller forstyrrelse hvori IL-13-aktivitet er skadelig. Disse proteinene gjør det mulig å redusere IL-13-aktivitet i et individ som lider av en slik sykdom eller forstyrrelse. Fortrinnsvis er IL-13 humant-IL-13, og individet et menneske. Alternativt kan individet være et pattedyr som uttrykker en IL-13 til hvilket et antistoff ifølge oppfinnelsen er i stand til å binde. Enda videre kan individet være et pattedyr hvori IL-13 har blitt introdusert (f.eks. ved administrering av IL-13 eller ved ekspresjon av et IL-13 transgen). Et antistoff ifølge oppfinnelsen kan bli administrert til et menneske for terapeutiske formål. I tillegg kan et antistoff ifølge oppfinnelsen bli administrert til et ikke-humant pattedyr som uttrykker en IL-13 til hvilken antistoffet er i stand til å binde for veterinærformål eller som en dyremodell for menneskelig sykdom. I forbindelse med sistnevnte kan slike dyremodeller være nyttige for å evaluere den terapeutiske effektiviteten til antistoffer ifølge oppfinnelsen (f.eks. testing av doser og timeplaner for administrering).

Som anvendt heri, er uttrykket "en forstyrrelse hvori IL-13-aktivitet er skadelig" ment å inkludere sykdommer og andre forstyrrelser hvori nærværet av IL-13 i et individ som lider av forstyrrelsen har blitt vist å være eller er mistenkt for å være enten ansvarlig for patofysiologien til forstyrrelsen eller en faktor som bidrar til en forverring av forstyrrelsen. Følgelig er en forstyrrelse hvori IL-13-aktivitet er skadelig en forstyrrelse hvori reduksjon av IL-13-aktivitet er forventet å minske symptomene og/eller progresjonen av forstyrrelsen. Slike forstyrrelser kan vise seg, f.eks., ved en økning i konsentrasjonen av IL-13 i en biologisk væske fra et individ som lider av forstyrrelsen (f.eks. en økning i konsentrasjonen av IL-13 i serum, plasma, leddvæske, osv. hos individet), som kan bli detektert, f.eks., ved å bruke et anti-IL-13 antistoff som beskrevet over. Eksempler på forstyrrelser som kan bli behandlet med antistoffene ifølge oppfinnelsen, inkluderer de forstyrrelser diskutert i seksjonen under som handler om farmasøytiske sammensetninger med antistoffene ifølge oppfinnelsen.

IL-13 har blitt implisert for å ha en sentral rolle i å forårsake patologiske responser assosiert med astma. Imidlertid er også andre mediatorer av forskjellige immunologiske reaksjonsveier involvert i astma patogenese, og å blokkere disse mediatorene, i tillegg til IL-13, kan gi ytterligere terapeutisk fordel. Således kan bindende proteiner ifølge oppfinnelsen bli inkorporert inn i DVD-Ig-proteiner hvor DVDen er i stand til å binde målpar inkludert IL-13 og et pro-inflammatorisk cytokin, så som svulstnekrosefaktor-α (TNF-α). TNF-α kan forsterke den inflammatoriske responsen i astma og kan bli knyttet til sykdomsalvorlighetsgrad (McDonnell, et al., Progress in Respiratoric Research (2001), 31 (New Medicaments for Asthma, Allergy and COPD), 247-250.). Dette peker mot at å blokkere både IL-13 og TNF-α kan ha fordelaktige effekter, spesielt i alvorlige luftveissykdommer. I en foretrukket utførelsesform binder DVD-Ig ifølge oppfinnelsen målene IL-13 og TNF α og blir anvendt for å behandle astma.

I en annen utførelsesform kan bindende proteiner ifølge oppfinnelsen bli anvendt for å generere DVD-Ig molekyler som binder IL-13 og IL-1beta, IL-13 og IL-9; IL-13 og IL-4; IL-13 og IL-5; IL-13 og IL-25; IL-13 og TARC; IL-13 og MDC; IL-13 og MIF; IL-13 og TGF- β; IL-13 og LHR agonist; IL-13 og CL25; IL-13 og SPRR2a; IL-13 og SPRR2b; og IL-13 og ADAM8. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også DVD-Iger i stand til å binde IL-13 og en eller flere mål involvert i astma valgt fra gruppen bestående av CSF1 (MCSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFNA1, IFNB1, IFNG, histamin og histaminreseptorer, IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, KITLG, PDGFB, IL2RA, IL4R, IL5RA, IL8RA, IL8RB, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24,CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR, og kitinase.

D. Farmasøytisk sammensetning

Oppfinnelsen tilveiebringer også farmasøytiske sammensetninger omfattende et antistoff, eller antigenbindende del derav, ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer. De farmasøytiske sammensetningene omfattende antistoffer ifølge oppfinnelsen er for bruk i diagnostisering, detektering, eller å overvåke en forstyrrelse, å forhindre, å behandle, håndtere, eller forbedre en forstyrrelse eller en eller flere symptomer derav, og/eller i forskning. En spesifikk utførelsesform omfatter en sammensetning med en eller flere antistoffer ifølge oppfinnelsen. I en annen utførelsesform omfatter den farmasøytiske sammensetningen en eller flere antistoffer ifølge oppfinnelsen og en eller flere profylaktiske eller terapeutiske midler forskjellig fra antistoffene ifølge oppfinnelsen for å behandle en forstyrrelse hvori IL-13-aktivitet er skadelig. Fortrinnsvis er de profylaktiske eller terapeutiske midlene kjent for å være nyttige for, eller som har blitt eller for tiden blir anvendt i, forhindring, behandling, håndtering, eller forbedring av en forstyrrelse eller en eller flere symptomer derav. I samsvar med disse utførelsesformer kan sammensetningene videre omfatte en bærer, tynningsmiddel eller eksipient.

Antistoffene og antistoffdeler ifølge oppfinnelsen kan bli inkorporert i farmasøytiske sammensetninger egnet for administrering til et individ. Typisk omfatter den farmasøytiske sammensetningen et antistoff, eller antistoffdel, ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer. Som anvendt heri inkluderer "farmasøytisk akseptabel bærer" ethvert og alle løsemidler, dipersjonsmedium, belegningsmidler, antibakterielle og antifungale midler, isotoniske og absorpsjonsforsinkende midler, og lignende som er fysiologisk kompatible. Eksempler på farmasøytisk akseptable bærere inkluderer en eller flere av vann, saltløsning, fosfatbufret saltløsning, dekstrose, glyserol, etanol og lignende, så vel som kombinasjoner derav. I mange tilfeller vil det være foretrukket å inkludere isotoniske midler, f.eks., sukkere, polyalkoholer så som mannitol, sorbitol, eller natriumklorid i sammensetningen. Farmasøytisk akseptable bærere kan videre omfatte små mengder av hjelpestoffer sånn som fuktings- eller emulsjonsmidler, konserveringsmidler eller buffere, som forbedrer holdbarheten eller effektiviteten til antistoffet eller antistoffdelen.

Forskjellige leveringsystemer er kjent og kan bli anvendt for å administrere en eller flere antistoffer ifølge oppfinnelsen eller kombinasjonen av en eller flere antistoffer ifølge oppfinnelsen og et profylaktisk middel eller terapeutisk middel nyttig for å forhindre, håndtere, behandle, eller forbedre en forstyrrelse eller en eller flere symptomer derav, f.eks. innkapsling i liposomer, mikropartikler, mikrokapsler, rekombinante celler i stand til å uttrykke antistoffet eller antistofffragmentet, reseptormediert endocytose (se f.eks. Wu og Wu, J. Biol. Chem.262:4429-4432 (1987)), konstruksjon av en nukleinsyre som del av en retroviral eller andre vektorer, osv. Fremgangsmåter for å administrere et profylaktisk eller terapeutisk middel ifølge oppfinnelsen inkluderer parenteral administrering (f.eks. intradermal, intramuskulær, intraperitoneal, intravenøs og subkutan), epidural administrering, intratumoral administrering, og mukosal administrasjon (f.eks. intranasal og oral). I tillegg kan pulmonær administrering bli anvendt, f.eks. ved bruk av en inhalator eller forstøver, og formulering med et aerosolerende middel. Se f.eks. U.S. Pat. Nos.6, 019,968, 5,985, 320, 5,985,309, 5,934, 272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290, 540, og 4,880,078; og PCT Publikasjon Nr. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, og WO 99/66903. I en utførelsesform blir et antistoff ifølge oppfinnelsen, en kombinasjonsterapi, eller en sammensetning ifølge oppfinnelsen administrert ved å bruke Alkermes AIR® pulmonær medikamentleveringsteknologi (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.). I en spesifikk utførelsesform blir profylaktiske eller terapeutiske midler ifølge oppfinnelsen administrert intramuskulært, intravenøst, intratumoralt, oralt, intranasalt, pulmonært, eller subkutant. De profylaktiske eller terapeutiske midlene kan bli administrert via enhver praktisk form, f.eks. ved infusjon eller bolusinjeksjon, ved absorpsjon gjennom epiteliske eller mukokutane hinner (f.eks. oral slimhinne, rektal og intestinal slimhinne, osv.) og kan bli administrert sammen med andre biologisk aktive midler. Administrering kan være systemisk eller lokal.

I en spesifikk utførelsesform kan det være ønskelig å administrere de profylaktiske eller terapeutiske midler ifølge oppfinnelsen lokalt til området som trenger behandling; dette kan bli oppnådd ved, f.eks. lokale infusjoner, ved injeksjon, eller ved hjelp av et implantat, nevnte implantat er av et porøst eller ikke-porøst materiale, inkludert membraner og matrikser, så som sialinmembraner, polymerer, fibrøse matrikser (f.eks.

Tissuel®), eller kollagenmatrikser. I en utførelsesform blir en effektiv mengde av en eller flere antistoffer ifølge oppfinnelsen antagonister administrert lokalt til det angrepne området til et individ for å forhindre, behandle, håndtere, og/eller forbedre en forstyrrelse eller et symptom derav. I en annen utførelsesform blir en effektiv mengde av et eller flere antistoffer ifølge oppfinnelsen administrert lokalt til det angrepne området hos et individ i kombinasjon med en effektiv mengde av en eller flere terapier (f.eks. en eller flere profylaktiske eller terapeutiske midler) forskjellig fra et antistoff ifølge oppfinnelsen, for å forhindre, behandle, håndtere, og/eller forbedre en forstyrrelse eller en eller flere symptomer derav.

I en annen utførelsesform kan det profylaktiske eller terapeutiske middel ifølge oppfinnelsen bli levert i et kontrollert frigjørelses- eller vedvarende frigjørelsessystem. I en utførelsesform kan en pumpe bli anvendt for å oppnå kontrollert eller vedvarende frigjørelse (se Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.14:20;

Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med.321:574). I en annen utførelsesform kan polymermaterialer bli anvendt for å oppnå kontrollert eller vedvarende frigjørelse av medikamentene ifølge oppfinnelsen (se f.eks. Medical Applications of Controlled Release, Langer og Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controled Medicament Biotilgjengelighet, Medicament Product Design and Performance, Smolen og Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger og Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem.23:61; se også Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. nevrol.25:351; Howard et al., 1989, J. neurosurg.7 1:105); U.S. Pat. Nr.5,679,377; U.S. Pat. Nr.5, 916,597; U. S. Pat. Nr.5,912,015; U.S. Pat. Nr.5,989,463; U.S. Pat. Nr.5,128,326; PCT Publikasjon Nr. WO 99/15154; og PCT Publikasjon Nr. WO 99/20253. Eksempler på polymerer anvendt i vedvarende frigjørelsesformuleringer inkluderer poly(2-hydroksyetylmetakrylat), poly(metyl metakrylat), poly(akrylsyre), poly(etylene-co-vinylacetat), poly(metakrylsyre), polyglykolider (PLG), polyanhydrider, poly(N- vinylpyrrolidon), poly(vinylalkohol), polyakrylamid, poly(etylenglykol), polylactider (PLA), poly(lactide-co-glykolider) (PLGA), og polyortoestere. I en foretrukket utførelsesform er polymeren anvendt i en formulering for vedvarende frigjørin inert, fri for utvaskbare urenheter, stabil ved lagring, steril og biodegraderbar. I nok en annen utførelsesform kan et system for kontrollert eller vedvarende frigjørelse bli plassert i nærheten av det profylaktiske eller terapeutiske mål, for således bare å trenge en brøkdel av den systemiske dosen (se f.eks. Goodson, i Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, s.115-138 (1984)).

Systemer for kontrollert frigjørelse er diskutert i review-artikkelen av Langer (1990, Science 249:1527-1533). Enhver teknikk kjent for fagmann kan bli anvendt for å fremstille formuleringer for vedvarende frigjørelse omfattende en eller flere terapeutiske midler ifølge oppfinnelsen. Se f.eks. U.S. Pat. Nr.4,526, 938, PCT publikasjon WO 91/05548, PCT publikasjon WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a human colon cancer Xenograft by using a Sustained-release Gel," Radiotherapy &Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal av farmasøytisk Science &Teknologi 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymer Carriers for an bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Controll. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, og Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Controll Rel. Bioact. Mater.24:759- 760.

I en spesifikk utførelsesform, hvor sammensetningen ifølge oppfinnelsen er en nukleinsyre som koder for et profylaktisk eller terapeutisk middel, kan nukleinsyren bli administrert in vivo for å frembringe ekspresjon av dens kodete profylaktiske eller terapeutiske middel, ved å konstruere den som en del av en passende nukleinsyre ekspresjonsvektor og å administrere den slik at den blir intracellulær, f.eks. ved bruk av en retroviral vektor (se U.S. Pat. Nr.4,980,286), eller ved direkte injeksjon, eller ved bruk av mikropartikkelbombardering (f.eks. en genpistol; Biolistic, Dupont), eller belegg med lipider eller celleoverflatereseptorer eller transfekterende midler, eller ved å administrere den bundet til et homeoboks-lignende peptid som er kjent å gå inn i kjernen (se f.eks. Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868).

Alternativt kan en nukleinsyre bli introdusert intracellulært og inkorporert inne i vertscelle DNAet for ekspresjon ved homolog rekombinasjon.

En farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen blir formulert for å være kompatibel med dens tilsiktede administreringsform. Eksempler på former for administrering inkluderer parenteral, f.eks. intravenøs, intradermal, subkutan, oral, intranasal (f.eks. inhalering), transdermal (f.eks. topisk), transmukosal, og rektal administrering. I en spesifikk utførelsesform blir sammensetningen formulert i samsvar med rutineprosedyrer som en farmasøytisk sammensetning tilpasset for intravenøs, subkutan, intramuskulær, oral, intranasal, eller topisk administrering til mennesker. Typisk er sammensetninger for intravenøs administrering løsninger i steril isotonisk vandig buffer. Hvor nødvendig kan sammensetningen også inkludere et løsningshjelpemiddel og et lokalt bedøvelsesmiddel sånn som lignocamne for å minske smerte ved injeksjonsstedet.

Hvis sammensetningene ifølge oppfinnelsen skal bli administrert topisk kan sammensetningene bli formulert i form av en salve, krem, transdermalt plaster, lotion, gel, shampoo, spray, aerosol, løsning, emulsjon, eller andre former velkjent for fagmann. Se f.eks. Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Doseforms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). For ikkespraybare topiske doseformer blir det typisk brukt viskøse til halvfaste eller faste former omfattende en bærer eller en eller flere eksipienter kompatible med topisk bruk og som har en dynamisk viskositet fortrinnsvis større enn vann. Egnede formuleringer inkluderer, uten begrensning, løsninger, suspensjoner, emulsjoner, kremer, salver, pulvere, linimenter og lignende, som er, hvis ønsket, sterilisert eller blandet med hjelpemidler (f.eks. konserveringsmidler, stabilisatorer, fuktingsmidler, buffere, eller salter) for å påvirke forskjellige egenskaper, så som, f.eks., osmotisk trykk. Andre egnede topiske doseformer inkluderer spraybare aerosolpreparater hvori de aktive ingredienser, fortrinnsvis i kombinasjon med en fast eller flytende inert bærer, er pakket i en blanding med et flyktig middel under trykk (f.eks. en gassaktig drivmiddel, så som freon) eller i en trykkeflaske. Fuktighetskremer eller fuktmidler kan også bli satt til farmasøytiske sammensetninger og doseformer hvis ønsket. Eksempler på slike ytterligere ingredienser er velkjent i teknikken.

Hvis sammensetningene ifølge oppfinnelsen omfatter midler for intranasal administrering av en slik sammensetning, kan sammensetningen bli formulert i en aerosolform, spray, tåke eller i form av dråper. Spesielt kan profylaktiske eller terapeutiske midler for bruk ifølge den foreliggende oppfinnelsen bli passende levert i form av en aerosolsprayoverlevering fra trykksatte pakker eller en forstøver, med anvendelsen av et egnet drivmiddel (f.eks. diklordifluormetan, triklorfluormetan, diklortetrafluoretan, karbondioksid eller andre egnede gasser). I tilfellet av trykksatt aerosol kan doseenheten bli bestemt ved å tilveiebringe en ventil for å levere en utmålt mengde. Kapsler og kassetter (bestående av f.eks. gelatin) for bruk i en inhalator eller insufflator kan bli formulert inneholdende en pulverblanding av forbindelsen og en egnet pulverbase så som laktose eller stivelse.

Hvis den aktuelle administrasjonsmåten omfatter oral administrering, kan sammensetninger bli formulert oralt i form av tabletter, kapsler, gelkapsler, løsninger, suspensjoner, og lignende. Tabletter eller kapsler kan bli fremstilt ved konvensjonelle metoder med farmasøytisk akseptable eksipienter så som bindingsmidler (f.eks. pregelatinisert maisstivelse, polyvinylpyrrolidon, eller hydroksypropylmetylcellulose); fyllstoff (f.eks. laktose, mikrokrystalinsk cellulose, eller kalsiumhydrogenfosfat); smøremidler (f.eks. magnesiumstearat, talkum, eller silika); disintegreringsmidler (f.eks. potetstivelse eller natriumstivelseglykolat); eller fuktingsmidler (f.eks. natriumlaurylsulfat). Tablettene kan bli belagt ved metoder velkjent i teknikken. Flytende preparater for oral administrering kan ta formen av løsninger, siruper eller suspensjoner, eller de kan bli presentert som et tørt produkt for konstitusjon med vann eller andre egnede løsemidler før bruk. Slike flytende preparater kan bli fremstilt ved konvensjonelle metoder med farmasøytisk akseptable tilsetningsstoffer så som suspensjonsmidler (f.eks. sorbitolsirup, cellulosederivater, eller hydrogenerte spiselige fett); emulgatorer (f.eks. lekitin eller acacia); ikke-vandige løsemidler (f.eks. mandelolje, oljeestere, etylalkohol eller fraksjonerte vegetabilske oljer); og konserveringsmidler (f.eks. metyl eller propylp- hydroksybenzoater eller sorbinsyre). Preparatene kan også inneholde buffersalter, smaksstoffer, farge og søtningsmidler som det passer. Preparater for oral administrering kan bli passende formulert for sakte frigjøring, kontrollert frigjøring eller vedvarende frigjøring av et profylaktisk eller terapeutisk middel(er).

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan omfatte pulmonær administrering, f.eks. ved bruk av en inhalator eller forstøver, av en sammensetning formulert med et aerosolerende middel. Se, f.eks. U.S. Pat. Nr.6,019, 968, 5,985, 320, 5, 985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, og 4,880,078; og PCT Publikasjon Nr. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, og WO 99/66903. I en spesifikk utførelsesform blir et antistoff ifølge oppfinnelsen, kombinasjonspreparat, og/eller sammensetning ifølge oppfinnelsen administrert ved å bruke Alkermes AIR® pulmonær medikamentleveringsteknologi (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).

Administrering av det aktuelle preparat kan omfatte administrering av en sammensetning formulert for parenteral administrering ved injeksjon (f.eks. ved bolusinjeksjon eller kontinuerlig infusjon). Formuleringer for injeksjon kan bli presentert i enhetsdoseformer (f.eks. i ampuller eller i multi-dose beholdere) med et tilsatt konserveringsmiddel. Sammensetningene kan ta slike former som suspensjoner, løsninger eller emulsjoner i oljete eller vandige løsemidler, og kan inneholde formuleringsmidler så som suspenderende, stabiliserende og/eller dispergerende midler. Alternativt kan de aktive ingrediensene være i pulverform for konstitusjon med et egnet løsemiddel (f.eks. sterilt pyrogenfritt vann) før bruk.

De aktuelle administrasjonsformer kan ytterligere omfatte administrering av sammensetninger formulert som depotpreparater. Slike langtvirkende formuleringer kan bli administrert ved implantering (f.eks. subkutant eller intramuskulært) eller ved intramuskulær injeksjon. Således kan, f.eks., sammensetningene bli formulert med egnede polymere eller hydrofobe materialer (f.eks. som en emulsjon i en akseptabel olje) eller ionebytter polymer, eller som svakt løselige derivater (f.eks. som et svakt løselig salt).

Administrering av de aktuelle preparater kan også omfatte administrering av sammensetninger formulert nøytralt eller på saltformer. Farmasøytisk akseptable salter inkluderer de dannet med anioner så som de derivert fra salt-, fosfor-, eddik-, oksal-, vinsyre, osv., og de dannet med kationer så som de derivert fra natrium, kalium, ammonium, kalsium, jernhydroksider, isopropylamin, trietylamin, 2- etylaminetanol, histidin, procain, osv.

Generelt blir ingrediensene av sammensetningene forsynt enten separat eller blandet sammen i enhetsdoseform, f.eks., som et tørt frysetørket pulver eller vannfritt konsentrat i en hermetisk forseglet beholder så som en ampulle eller kapsel som indikerer mengden av aktivt middel. Hvor administreringsmodusen er infusjon kan sammensetningen bli utdelt med en infusjonsflaske inneholdende sterilt vann eller saltløsning av farmasøytisk kvalitet. Hvor administreringsmodusen er ved injeksjon kan en ampulle med sterilt vann for injeksjon eller saltløsning bli tilveiebrakt slik at ingrediensene kan bli blandet før administrering.

Spesielt er det mulig at en eller flere av de profylaktiske eller terapeutiske midlene, eller farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen, er pakket i en hermetisk forseglet beholder så som en ampulle eller kapsel som indikerer mengden av midlet. I en utførelsesform blir en eller flere av de profylaktiske eller terapeutiske midler, eller farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen, forsynt som et tørt sterilisert frysetørket pulver eller vannfritt konsentrat i en hermetisk forseglet beholder og kan bli rekonstituert (f.eks. med vann eller saltløsning) til den passende konsentrasjon for administrering til et individ. Fortrinnsvis blir en eller flere av de profylaktiske eller terapeutiske midlene, eller farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen, forsynt som et tørt sterilt frysetørket pulver i en hermetisk forseglet beholder ved en enhetsdose på minst 5 mg, mer fortrinnsvis minst 10 mg, minst 15 mg, minst 25 mg, minst 35 mg, minst 45 mg, minst 50 mg, minst 75 mg, eller minst 100 mg. De frysetørkede profylaktiske eller terapeutiske midler, eller farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen, bør bli lagret ved mellom 2 °C og 8 °C i sin opprinnelige beholder og de profylaktiske eller terapeutiske midlene, eller farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen, bør bli administrert innen 1 uke, fortrinnsvis innen 5 dager, innen 72 timer, innen 48 timer, innen 24 timer, innen 12 timer, innen 6 timer, innen 5 timer, innen 3 timer, eller innen 1 time etter å ha blitt rekonstituert. I en alternativ utførelsesform blir en eller flere av de profylaktiske eller terapeutiske midlene eller farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen forsynt i flytende form i en hermetisk forseglet beholder som indikerer mengden og konsentrasjonen til midlet. Fortrinnsvis blir den flytende formen til den administrerte sammensetninge forsynt i en hermetisk forseglet beholder minst 0,25 mg/ml, mer fortrinnsvis minst 0,5 mg/ml, minst 1 mg/ml, minst 2,5 mg/ml, minst 5 mg/ml, minst 8 mg/ml, minst 10 mg/ml, minst 15 mg/kg, minst 25 mg/ml, minst 50 mg/ml, minst 75 mg/ml eller minst 100 mg/ml. Den flytende formen bør bli lagret ved mellom 2 °C og 8 °C i dens opprinnelige beholder.

Antistoffene og antistoffdelene ifølge oppfinnelsen kan bli inkorporert inn i en farmasøytisk sammensetning egnet for parenteral administrering. Fortrinnsvis vil antistoffet, eller antistoffdelene, bli fremstilt som en injiserbar løsning inneholdende 0,1-250 mg/ml antistoff. Den injiserbare løsningen kan bestå av enten en flytende eller frysetørket doseform i en blank eller gul liten medisinflaske, ampulle eller ferdigfylt sprøyte. Bufferen kan være L-histidin (1-50 mM), optimalt 5-10 mM, ved pH 5,0 til 7,0 (optimalt pH 6,0). Andre egnede buffere inkluderer natriumsuksinat, natriumsitrat, natriumfosfat eller kaliumfosfat. Natriumklorid kan bli anvendt for å modifisere toksisiteten av løsningen ved en konsentrasjon på 0-300 mM (optimalt 150 mM for en flytende doseform). Kryobeskyttere kan bli inkludert for en frysetørket doseform, især 0-10 % sukrose (optimalt 0,5-1,0 %). Andre egnede kryobeskyttere inkluderer trehalose og laktose. Fyllmidler kan bli inkludert for en frysetørket doseform, hovedsakelig 1-10 % mannitol (optimalt 2-4 %). Stabilisatorer kan bli anvendt i både flytende og frysetørkede doseformer, hovedsakelig 1-50 mM L-Metionin (optimalt 5-10 mM). Andre egnede fyllmidler inkluderer glysin, arginin som kan bli inkludert som 0-0,05 % polysorbate-80 (optimalt 0,005-0,01 %). Ytterligere surfaktanter inkluderer polysorbat 20 og BRIJ surfaktanter. Den farmasøytiske sammensetningen omfattende antistoffene og antistoffdelene ifølge oppfinnelsen fremstilt som en injiserbar løsning for parenteral administrering, kan videre omfatte et middel nyttig som en adjuvant, så som dem anvendt for å øke absorpsjonen eller dispersjonen av et terapeutisk protein (f.eks. antistoff). En spesielt nyttig adjuvant er hyaluronidase, så som Hylenex® (rekombinant human hyaluronidase). Tilsetning av hyaluronidase i den injiserbare løsningen forbedrer human biotilgjengelighet etter parenteral administrering, spesielt subkutan administrering. Det gjør det også mulig med større injeksjonsstedvolumer (dvs. større enn 1 ml) med mindre smerte og ubehag, og minimalt med tilfeller av injeksjonsstedreaksjoner (se WO2004078140, US2006104968).

Sammensetningene ifølge denne oppfinnelsen kan være i en rekke forskjellige former. Disse inkluderer f.eks. flytende, halvfaste og faste doseformer, så som flytende løsninger (f.eks. injiserbare og infusjonsbare løsninger), dispersjoner eller suspensjoner, tabletter, piller, pulvere, liposomer og stikkpiller. Den foretrukne formen avhenger av den tilsiktede metoden for administrering og den terapeutiske anvendelsen. Typisk foretrukne sammensetninger er form av injiserbare eller infusjonsbare løsninger, så som sammensetninger lignende de anvendt for passiv immunisering av mennesker med andre antistoffer. Den foretrukne administrasjonsformen er parenteral (f.eks. intravenøs, subkutan, intraperitonal, intramuskulær). I en foretrukket utførelsesform blir antistoffet administrert ved intravenøs infusjon eller injeksjon. I en annen foretrukket utførelsesform blir antistoffet administrert ved intramuskulær eller subkutan injeksjon.

Terapeutiske sammensetninger må typisk være sterile og stabile under betingelsene for fremstilling og lagring. Sammensetningen kan bli formulert som en løsning, mikroemulsjon, dispersjon, liposom, eller andre ordnede strukturer egnet for høy medikamentkonsentrasjon. Sterile injiserbare løsninger kan bli fremstilt ved å inkorporere den aktive forbindelsen (dvs. antistoff eller antistoffdel) i den nødvendige mengde i et passende løsemiddel med en, eller en kombinasjon av, ingredienser fortegnet over, som nødvendig, etterfulgt av filtrert sterilisering. Generelt blir dispersjoner fremstilt ved å inkorporere den aktive forbindelsen inn i et sterilt løsemiddel som inneholder et grunnleggende dispergeringsmedium og de nødvendige andre ingredienser fra de opplistet over. I tilfellet av sterile, frysetørkede pulvere for fremstillingen av sterile injiserbare løsninger, er de foretrukne fremgangsmåtene for fremstilling vakuumtørking og spraytørking som gir et pulver av de aktive ingrediensene pluss enhver ytterligere ønsket ingrediens fra en tidligere sterilfiltrert løsning derav. Den riktige fluiditeten til en løsning kan bli opprettholdt f.eks. ved anvendelsen av et belegg sånn som lekitin, ved vedlikeholdet av den nødvendige partikkelstørrelsen i tilfellet av dispersjon og ved anvendelsen av surfaktanter. Forlenget absorpsjon av injiserbare sammensetninger kan bli oppnådd ved å inkludere, i sammensetningen, et middel som forsinker absorpsjon f.eks. monostearatsalter og gelatin.

Antistoffene og antistoffdeler ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan bli administrert ved en rekke forskjellige metoder kjent i teknikken, selv om for mange terapeutiske anvendelser er den foretrukne måten/metoden for administrering subkutan injeksjon, intravenøs injeksjon eller infusjon. Som det vil forstås av fagmann, vil måten og/eller metoden for administrering variere avhengig av det ønskede resultat. I visse utførelsesformer kan den aktive forbindelsen bli fremstilt med en bærer som vil beskytte forbindelsen mot rask frigjøring, så som en kontrollert frigjøringsformulering, inkludert implantater, transdermale plastere, og mikroinnkapslede leveringssystemer.

Biodegraderbare, biokompatible polymere kan bli anvendt, så som etylenvinylacetat, polyanhydrider, polyglykolsyre, kollagen, polyortoestere, og polymelkesyre. Mange metoder for fremstillingen av slike formuleringer er patentert eller generelt kjent for fagmenn. Se f.eks. Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems, J.R.

Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

I visse utførelsesformer kan et antistoff eller antistoffdel ifølge oppfinnelsen bli oralt administrert, f.eks., med et inert tynningsmiddel eller en assimilerbar spiselig bærer. Forbindelsen (og andre ingredienser, hvis ønsket) kan også bli lukket inn i en hard- eller mykskallet gelatinkapsel, komprimert til tabletter, eller inkorporert direkte inn i pasientens diett. For oral terapeutisk administrering kan forbindelsen bli inkorporert med eksipienter og anvendt i form av inntagbare tabletter, bukkale tabletter, pastiller, kapsler, eliksirer, suspensjoner, siruper, oblater, og lignende. For å administrere en forbindelse ifølge oppfinnelsen ved annet enn parenteral administrering, kan det være nødvendig å belegge forbindelsen med, eller ko-administrere forbindelsen med, et materiale for å forhindre dets inaktivering.

Supplementære aktive forbindelser kan også bli inkorporert i sammensetningene. I visse utførelsesformer blir et antistoff, eller antistoffdel, ifølge oppfinnelsen koformulert med og/eller koadministrert med en eller flere ytterligere terapeutiske midler som er nyttige for å behandle forstyrrelser hvori IL-13-aktivitet er skadelig. For eksempel kan et anti-hIL-13 antistoff, eller antistoffdel, ifølge oppfinnelsen bli koformulert og/eller koadministrert med en eller flere ytterligere antistoffer som binder andre mål (f.eks. antistoffer som binder andre cytokiner eller som binder celleoverflatemolekyler).

Videre kan en eller flere antistoffer ifølge oppfinnelsen bli anvendt i kombinasjon med to eller flere av de foregående terapeutiske midler. Slike kombinasjonsterapier kan fordelaktig benytte lavere doser av de administrerte terapeutiske midler, for således å unngå mulige toksisiteter eller komplikasjoner assosiert med de forskjellige monoterapier.

I visse utførelsesformer blir et antistoff til IL-13, eller fragment derav, bundet til en halveringstidsforlengende vehikkel kjent i teknikken. Slike vehikler inkluderer Fcdomenet, polyetylenglykol, og dekstran. Slike vehikler er beskrevet, f.eks. i U.S. søknad Serie Nr.09/428,082 og publisert PCT søknad nr. WO 99/25044.

I en spesifikk utførelsesform blir nukleinsyresekvenser omfattende nukleotidsekvenser som koder for et antistoff ifølge oppfinnelsen eller et annet profylaktisk eller terapeutisk middel ifølge oppfinnelsen administrert for å behandle, forhindre, håndtere, eller forbedre en forstyrrelse eller en eller flere symptomer derav ved hjelp av genterapi. Genterapi refererer til terapi utført ved administreringen til et individ av en uttrykt eller uttrykkbar nukleinsyre. I denne utførelsesformen ifølge oppfinnelsen produserer nukleinsyrene deres kodete antistoff eller profylaktiske eller terapeutiske middel ifølge oppfinnelsen som formidler en profylaktisk eller terapeutisk effekt.

Enhver av metodene for genterapi tilgjengelig i teknikken kan bli anvendt. For generelle oversiktsartikler om fremgangsmåtene for genterapi, se Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu og Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toksicol.32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993); og Morgan og Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; Kan, 1993, TIBTECH 11(5):155-215. Metoder vanlig kjent i teknikken om rekombinant DNA-teknologi som kan bli anvendt er beskrevet i Ausubel et al. (eds.), Current Protokoller in Molekylær Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); og Kriegler, Gene Transfer and expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Detaljert beskrivelse av forskjellige fremgangsmåter for genterapi er vist i US20050042664 A1.

Eksempler på IL-13-assosierte forstyrrelser inkluderer, men er ikke begrenset til, en forstyrrelse valgt fra en eller flere av: respiratoriske forstyrrelser, f.eks. astma (f.eks. allergisk og ikke-allergisk astma (f.eks. astma på grunn av infeksjon med, f.eks. respiratorisk syncytialt virus (RSV), f.eks. i yngre barn)), kronisk obstruktiv pulmonær sykdom (COPD), og andre tilstander som involverer luftveisinflammasjon, eosinofili, fibrose og overdreven mukusproduksjon, f.eks. cystisk fibrose og pulmonær fibrose; atopiske forstyrrelser, f.eks. som resultat av en økt følsomhet for IL-13 (f.eks. atopisk dermatitt, urtikaria, eksem, allergisk rinitt, og allergisk enterogastritt); inflammatoriske og/eller autoimmune tilstander av, huden (f.eks. atopisk dermatitt), gastrointestinale organer (f.eks. inflammatoriske tarmsykdommer (IBD), så som ulcerøs kolitt og/eller Crohn's sykdom), lever (f.eks. kirrose, hepatocellulært karsinom), og skleroderma; svulster eller krefttyper (f.eks. mykvev eller faste svulster), så som leukemi, glioblastom, og lymfom, f.eks. Hodgkin's lymfom; virale infeksjoner (f.eks. fra HTLV-1); fibrose av andre organer, f.eks. fibrose av leveren, (f.eks. fibrose forårsaket av en hepatitt B og/eller C virus); og undertrykking av ekspresjon av beskyttende type 1 immunresponser (f.eks. under vaksinasjon) som beskrevet heri.

I andre utførelsesformer tilveiebringer proteinene ifølge oppfinnelsen en mulighet for å behandle (f.eks. å redusere, forbedre) eller forhindre en eller flere symptomer assosiert med en respiratorisk forstyrrelse, f.eks. astma (f.eks. allergisk og ikke-allergisk astma); allergier; kronisk obstruktiv pulmonær sykdom (COPD); en tilstand som involverer luftveisinflammasjon, eosinofili, fibrose og overdreven mukusproduksjon, f.eks. cystisk fibrose og pulmonær fibrose. For eksempel inkluderer symptomer på astma gisping, kortpustethet, fortetting av bronkiene, luftveishyperaktivitet, nedsatt lungekapasitet, fibrose, luftveisinflammasjon, og mukusproduksjon.

I et annet aspekt tilveiebringer denne søknaden en fremgangsmåte for å detektere nærværet av IL-13 i en prøve in vitro (f.eks. en biologisk prøve, så som serum, plasma, vev, biopsi). Denne fremgangsmåte kan bli anvendt for å diagnostisere en forstyrrelse, f.eks. en immuncelle-assosiert forstyrrelse. Fremgangsmåten inkluderer: (i) å bringe prøven eller en kontrollprøve i kontakt med anti-IL-13 antistoffet eller fragment derav som beskrevet heri; og (ii) å detektere dannelse av et kompleks mellom anti-IL-13 antistoffet eller fragment derav, og prøven eller kontrollprøven, hvori en statistisk signifikant forandring i dannelsen av komplekset i prøven i forhold til kontrollprøven er indikerende for nærværet av IL-13 i prøven.

I nok et annet aspekt tilveiebringer denne søknaden en mulighet for å detektere nærværet av IL-13 in vivo (f.eks. in vivo "imaging" i et subjekt). Denne detekteringen kan bli anvendt for å diagnostisere en forstyrrelse, f.eks. en IL-13- assosiert forstyrrelse. Detekteringen inkluderer: (i) å administrere anti-IL-13 antistoffet eller fragment derav som beskrevet heri til et individ eller et kontrollindivid under betingelser som tillater binding av antistoffet eller fragment til IL- 13; og (ii) å detektere dannelse av et kompleks mellom antistoffet eller fragment og IL-13, hvori en statistisk signifikant forandring i dannelsen av komplekset i individet i forhold til kontrollindividet er indikerende for nærværet av IL-13.

Antistoffer ifølge oppfinnelsen, eller antigenbindende deler derav kan bli anvendt alene eller i kombinasjon for å behandle slike sykdommer. Det skal forstås at antistoffene ifølge oppfinnelsen eller en antigenbindende del derav kan bli anvendt alene eller i kombinasjon med et ytterligere middel, f.eks. et terapeutisk middel, hvor nevnte ytterligere middel er valgt av fagpersonen for dets tiltenkte formål. For eksempel kan det ytterligere midlet være et terapeutisk middel kjent i teknikker som å være nyttig for å behandle sykdommen eller tilstanden som blir behandlet ved antistoffet ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Det ytterligere midlet kan også være et middel som gir en fordelaktig egenskap til den terapeutiske sammensetningen f.eks. et middel som påvirker viskositeten til sammensetningen.

Det skal videre forstås at kombinasjonene som skal være inkludert i denne oppfinnelsen er de kombinasjoner nyttige for deres tilsiktede formål. Kombinasjonene, som er del av denne oppfinnelsen, kan være antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelsen og minst et ytterligere middel valgt fra listene under. Kombinasjonen kan også inkludere mer enn et ytterligere middel, f.eks. to eller tre ytterligere midler hvis kombinasjonen er slik at den dannede sammensetningen kan utføre dens tilsiktede funksjon.

Kombinasjonsterapien kan inkludere en eller flere IL-13 antagonister, f.eks. anti-IL-13 antistoffer eller fragmenter derav, koformulert med, og/eller koadministrert med, en eller flere ytterligere terapeutiske midler, f.eks, en eller flere cytokin- og vekstfaktorinhibitorer, immunundertrykkere, anti-inflammatoriske midler (f.eks. systemiske antiinflammatoriske midler), anti-fibrotiske midler, metabolske inhibitorer, enzyminhibitorer, og/eller cytotoksiske eller cytostatiske midler, som beskrevet mer heri.

Eksempler på ytterligere foretrukne terapeutiske midler som kan bli koadministrert og/eller koformulert med en eller flere IL-13 antagonister, f.eks. anti- IL-13 antistoffer eller fragmenter derav, inkluderer en eller flere av: innhalerte steroider; beta-agonister, f.eks. korttidsvirkende eller langtidsvirkende beta-agonister; antagonister av leukotriener eller leukotrienreseptorer; kombinasjonsmedikamenter så som ADVAIR; IgE inhibitorer, f.eks. anti-IgE antistoffer (f.eks, XOLAIR); fosfodiesteraseinhibitorer (f.eks. PDE4 inhibitorer); xantiner; antikolinergiske medikamenter; mastcelle-stabiliserende midler så som cromolyn; IL-4 inhibitorer; IL-5 inhibitorer; eotaxin/CCR3 inhibitorer; antagonister av histamin eller dens reseptorer inkludert H1, H2, H3, og H4, og antagonister av prostaglandin D eller dens reseptorer (DP1 og CRTH2). Slike kombinasjoner kan bli anvendt for å behandle astma og andre respiratoriske forstyrrelser. Ytterligere eksempler på terapeutiske midler som kan bli koadministrert og/eller koformulert med en eller flere anti-IL-13 antistoffer eller fragmenter derav, inkluderer en eller flere av: TNF-antagonister (f.eks. et løselig fragment av en TNF-reseptor, f.eks. p55 eller p75 human TNF-reseptor eller derivater derav, f.eks.75 kD TNFR-IgG (75 kD TNF-reseptor-IgG fusjonsprotein, ENBREL)); TNF-enzymantagonister, f.eks. TNF konverterende enzym (TACE) inhibitorer; muskarinreseptorantagonister; TGF-beta-antagonister; interferon gamma; perfenidon; kjemoterapeutiske midler, f.eks. metotreksat, leflunomid, eller en sirolimus (raparnycin) eller en analog derav, f.eks. CCI-779; Cox2 og cPLA2 inhibitorer; NSAIDs; immunomodulatorer; p38-inhibitorer, TPL-2, MK-2 og NFkB-inhibitorer.

Andre foretrukne kombinasjoner er cytokinundertrykkende anti-inflammatoriske medikament(er) (CSAIDs); antistoffer til eller antagonister av andre humane cytokiner eller vekstfaktorer, f.eks., IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL18, IL-21, IL-31, interferoner, EMAP-II, GM-CSF, FGF, EGF, PDGF, og edotelin-1, så vel som reseptorene til disse cytokinene og vekstfaktorene. Antistoffer ifølge oppfinnelsen, eller antigenbindende deler derav, kan bli kombinert med antistoffer til celleoverflatemolekyler så som CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA eller deres ligander inkludert CD154 (gp39 eller CD40L).

Foretrukne kombinasjoner av terapeutiske midler kan interferere ved forskjellige steder i den inflammatoriske kaskaden; foretrukne eksempler inkluderer TNF-antagonister som kimeriske, humaniserte eller humane TNF antistoffer, D2E7, (PCT publikasjonsnr. WO 97/29131), CA2 (RemicadeTM), CDP 571, og løselig p55 eller p75 TNF reseptorer, derivater, derav, (p75TNFR1gG (EnbrelTM) eller p55TNFR1gG (Lenercept), og også TNF konverterende enzym (TACE) inhibitorer; likekedes kan IL-1-inhibitorer (Interleukin-1-konverterende enzym inhibitorer, IL-1RA osv.) være effektive av samme grunn. Andre foretrukne kombinasjoner inkluderer Interleukin 4. Nok en annen foretrukket kombinasjon er andre nøkkelspillere i den astmatiske responsen som kan virke parallelt til, avhengig av eller i samspill med IL-13-funksjonen; spesielt foretrukket er IL-9-antagonister inkludert IL-9 antistoffer. Det har blitt vist at IL-13 og IL-9 har overlappende, men distinkte funksjoner og en kombinasjon av antagonister overfor begge kan være mest effektiv. Nok en annen foretrukket kombinasjon er anti-IL-5 antistoffer. Nok andre foretrukne kombinasjoner inkluderer antagonister av chemokiner inkludert MCP-1, MCP-4, eotaksiner, RANTES, MDC, CCL-12 og CCL-17 (TARC) og kjemokinreseptorer inkludert CCR2, CCR3, CCR4, og CXCR4.

Ytterligere kombinasjoner kan inkludere antagonister mot astmamediatorer inkludert sur mammalisk kitinase, CRHT2, kymase, S1P1, S1P2, Tyk2, ROCKII, Stat6, p38, NFkB, fosfodiesterase 4 (PDE-4), mastcelle trytase, NO, adenosin, IKK2, GATA3, ICAM-1, VCAM-1, og ICOS.

De farmasøytiske sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan inkludere en "terapeutisk effektiv mengde" eller en "profylaktisk effektiv mengde" av et antistoff eller antistoffdel ifølge oppfinnelsen. En "terapeutisk effektiv mengde" refererer til en mengde effektiv, ved doser og for tidsperioder nødvendig, for å oppnå det ønskede terapeutiske resultat.

En terapeutisk effektiv mengde av antistoffet eller antistoffdel kan bli bestemt av en person dyktig i teknikken og kan variere ifølge faktorer så som sykdomstilstand, alder, kjønn, og vekten til individet og evnen til antistoffet eller antistoffdelen til å fremkalle en ønsket respons i individet. En terapeutisk effektiv mengde er også en hvori enhver toksisk eller skadelig effekt av antistoffet, eller antistoffdelen, er oppveid av de terapeutisk fordelaktige effektene. En "profylaktisk effektiv mengde" refererer til en mengde effektiv, ved doser og tidsperioderfor nødvendig for å oppnå det ønskede profylaktiske resultat. Siden en profylaktisk dose blir anvendt i individer i forkant av eller på et tidligere stadium av sykdom, vil typisk den profylaktisk effektive mengde være mindre enn den terapeutisk effektive mengden.

Doseregimer kan bli justert for å gi den optimale ønskede respons (f.eks. en terapeutisk eller profylaktisk respons). For eksempel kan en enkelt bolus bli administrert, flere oppdelte doser kan bli administrert over tid eller dosen kan bli proporsjonalt redusert eller økt alt ettersom hva som blir indikert ved kravene til den terapeutiske situasjon. Det er spesielt fordelaktig å formulere parenterale sammensetninger i doseenhetsformer for å lette administrering og doseenhetlighet. Doseenhetsform som anvendt heri, refererer til fysisk adskilte enheter egnet som enhetsdoser for pattedyrindividene som skal bli behandlet; hver enhet inneholdende en forutbestemt mengde av aktiv forbindelse kalkulert for å gi den ønskede terapeutiske effekt i assosiasjon med den nødvendige farmasøytiske bærer. Spesifikasjonen for enhetsdoseformene ifølge oppfinnelsen er styrt av og direkte avhengig av de unike egenskapene til den aktive forbindelsen og den spesifikke terapeutiske eller profylaktiske effekten som skal bli oppnådd, og (b) begrensningene iboende i teknikken for å blande slik en aktiv forbindelse for behandlingen av følsomhet i individer.

Et eksempel på et ikke-begrensende område for en terapeutisk eller profylaktisk effektiv mengde av et antistoff eller antistoffdel ifølge oppfinnelsen er 0,1-20 mg/kg, mer fortrinnsvis 1-10 mg/kg. Det skal legges merke til at doseverdier kan variere med typen og alvorlighetsgraden av tilstanden som skal lindres. Det skal videre forstås at for ethvert spesifikt individ, burde spesifikke doseregimer bli justert over tid ifølge det individuelle behov og den professjonelle vurderingen til personen som administrerer eller overser administreringen av sammensetningene, og at doseområder satt fram heri er bare ment som eksempler og er ikke ment å begrense omfanget eller utøvelsen av den krevde sammensetning.

Eksempler

eksempel 1: Generering og isolering av anti humant-IL-13 monoklonale antistoffer

eksempel 1.1: Assayer for å identifisere anti humant-IL-13 antistoffer Gjennom hele eksempel 1 ble de følgende assayer anvendt for å identifisere og karakterisere anti humant-IL-13 antistoffer med mindre annet er angitt.

eksempel 1.1.A: ELISA

Enzymbundet Immunosorbent Assayer for å screene for antistoffer som binder humant-IL-13 ble utført som følger.

ELISA plater (Corning Costar, Acton, MA) ble belagt med 50 μL/brønn av 5 μg/ml geit anti-mus IgG Fc spesifikk (Pierce # 31170, Rockford, IL.) i fosfatbufret Saltløsning (PBS) over natten ved 4 grader Celsius. Plater ble vasket én gang med PBS inneholdende 0,05 % Tween-20. Plater ble blokkert ved tilsetning av 200 μL/brønn blokkeringsløsning fortynnet til 2 % i PBS (BioRad #170-6404, Hercules, CA.) i 1 time ved romtemperatur. Plater ble vasket en gang etter blokkering med PBS inneholdende 0,05 % Tween-20.

Femti mikroliter per brønn med musesera eller hybridoma-supernatanter fortynnet i PBS inneholdende 0,1 % Bovine Serum Albumin (BSA) (Sigma, St. Louis, MO.) ble tilsatt til ELISA-platen fremstilt som beskrevet over og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Brønner ble vasket tre ganger med PBS inneholdende 0,05 % Tween-20. Femti mikrolitere med biotinylert rekombinant renset humant-IL-13 variant (R110Q) fortynnet til 100 ng/mL i PBS inneholdende 0,1 % BSA ble tilsatt hver brønn og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Plater ble vasket 3 ganger med PBS inneholdende 0,05 % Tween-20. Streptavidin HRP (Pierce # 21126, Rockland, IL.) ble fortynnet 1:20000 i PBS inneholdende 0,1 % BSA; 50 μL/brønn ble tilsatt og platene inkubert i 1 time ved romtemperatur. Plater ble vasket 3 ganger med PBS inneholdende 0,05 % Tween-20. Femti mikroliter med TMB-løsning (Sigma # T0440, St. Louis, MO.) ble tilsatt hver brønn og inkubert i 10 minutter ved romtemperatur. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 1N svovelsyre. Plater ble lest spektrofotometrisk ved en bølgelengde på 450 nm.

eksempel 1.1.B: Affinitetsbestemmelser ved å bruke BIACORE teknologi BIACORE assayet (Biacore, Inc, Piscataway, NJ) bestemmer affiniteten til antistoffer med kinetiske målinger av on-, off-rate konstanter. Bindingen av antistoffer til rekombinant renset humant-IL-13 eller rekombinant renset humant-IL-13 variant (R110Q) ble bestemt ved overflateplasmonresonans-baserte målinger med et Biacore® 3000 instrument (Biacore® AB, Uppsala, Sverige) ved å bruke løpende HBS-EP (10 mM HEPES [pH 7,4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, og 0,005 % surfaktant P20) ved 25 oC. Alle kjemikalier ble anskaffet fra Biacore® AB (Uppsala, Sverige) eller i motsatt fall fra en annen kilde som beskrevet i teksten. Omtrent 5000 RU av geit anti-mus IgG, (Fc у), fragment spesifikt polyklonalt antistoff (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL) fortynnet i 10 mM natriumacetat (pH 4,5) ble direkte immobilisert over en CM5 research grade biosensor chip ved å bruke et standard aminkoblingskit ifølge produsentens instruksjoner og prosedyrer ved 25 μg/ml. Ureagerte enheter på biosensoroverflaten ble blokkert med etanolamin. Modifisert karboksymetyldekstranoverflate i flowcelle 2 og 4 ble anvendt som en reaksjonsoverflate. Umodifisert karboksymetyldekstran uten geit anti-mus IgG i flowcelle 1 og 3 ble anvendt som referanseoverflaten. For kinetisk analyse, ble hastighetslikninger derivert fra 1:1 Langmuir bindingsmodellen simultant tilpasset til assosiasjon- og dissosiasjonsfaser for alle åtte injeksjoner (ved å bruke ”global fit” analyse) ved anvendelse av Biaevaluation 4.0.1 dataprogram. Rensede antistoffer ble fortynnet i HEPES-bufret saltløsning for oppfanging over geit anti-mus IgG spesifikke reaksjonsoverflater. Museantistoffer som skulle fanges opp som en ligand (25 μg/ml), ble injisert over reaksjonsmatrikser med en strømningshastighet på 5 μl/min. Assosiasjons- og dissosiasjonshastighetskonstantene, kon(unit M-1s-1) og koff(unit s-1) ble bestemt under en kontinuerlig strømningshastighet på 25 μl/min.

Hastighetskonstanter ble utarbeidet ved å gjøre kinetiske bindingsmålinger ved ti forskjellige antigenkonsentrasjoner varierende fra 10 – 200 nM. Likevektsdissosieringskonstanten (unit M) til reaksjonen mellom museantistoffer og rekombinant renset humant-IL-13 eller rekombinant renset humant-IL-13 ble så kalkulert fra de kinetiske hastighetskonstantene ved å følge formelen: KD= koff/kon. Binding ble målt som en funksjon av tid og kinetiske hastighetskonstanter ble kalkulert. I dette assayet kan onhastigheter så raske som 106 M-1s-1 og off-hastigheter så sakte som 10-6 s-1 bli målt.

eksempel 1.1.C: Funksjonell aktivitet av anti humant-IL-13 antistoffer

For å undersøke den funksjonelle aktiviteten til anti humant-IL-13 antistoffene ifølge oppfinnelsen ble antistoffene anvendt i de følgende assayene som måler evnen til et antistoff til å inhibere IL-13-aktivitet.

eksempel 1.1.C 1A-549 bioassay

Evnen til anti humant-IL-13 antistoffer til å inhibere humant-IL-13-indusert produksjon av TARC (CCL-17) av A-549-celler ble analysert som følger. A-549-celler ble sådd på dag en i 96-brønns plate (2E5 celler/brønn) i RPMI vekstmedium (med 10 % FBS). På dag to ble mediumet byttet ut med nytt RPMI vekstmedium inneholdende 400 ng/ml rhTNF (100 μl/brønn). I mellomtiden ble forskjellige konsentrasjoner av immunisert museserum, murint hybridomsupernatant eller renset anti humant-IL-13 antistoffer preinkubert i en time ved 37 ºC med 10 ng/ml rekombinant renset humant-IL-13 eller IL-13-variant i 100 μL RPMI komplett medium i en mikrotiterplate (U-bunn, 96-brønn, Costar). En blanding av antistoffet pluss rekombinant renset humant-IL-13 ble så tilsatt (100 μl/brønn) til de TNF-behandlede A-549-cellene, med sluttvolum på 200� μl/brønn (sluttkonsentrasjoner av IL-13 og TNF var henholdsvis 5 ng/ml og 200 ng/ml), og inkubert i 18 timer ved 37 ºC. Etter inkubering ble 150 μL med cellefri supernatant trukket fra hver brønn og nivået av fremstilt humant TARC ble målt ved å bruke et menneske TARC ELISA (R&D Systemer Cat#DDN00).

A-549-cellene responderer også ovenfor IL-13 av andre arter, inkludert cynomolgus apekatt, mus, rotte og sau, med ED50-verdier lignende de til humant-IL-13. De ble derfor anvendt for kryssreaktiv analyse av anti-hIL-13 mAber i forhold til IL-13 av andre arter ved å bruke den samme eksperimentelle protokollen.

eksempel 1.2: Generering av anti humant-IL-13 monoklonale antistoffer

Anti humant-IL-13 monoklonale antistoffer fra mus ble oppnådd som følger: eksempel 1.2.A: Immunisering av mus med humant-IL-13 antigen

Tjue mikrogram av rekombinant renset humant-IL-13 variant (Peprotech) blandet med komplett Freund’s adjuvant eller Immunoeasy adjuvant (Qiagen, Valencia, CA) ble injisert subkutant inn i fem 6-8 uker-gamle Balb/C, fem C57B/6 mus, og fem AJ mus på Dag 1. På dagene 24, 38, og 49, ble tjue mikrogram av rekombinant renset humant-IL-13-variant blandet med ukomplett Freund’s adjuvant eller Immunoeasy adjuvant injisert subkutant inn i de samme musene. På dag 84 eller dag 112 eller dag 144, ble mus injisert intravenøst med 1 µg rekombinant renset humant-IL-13-variant.

eksempel 1.2.B: Generering av Hybridom

Splenocytter oppnådd fra de immuniserte mus beskrevet i eksempel 1.2.A ble fusjonert med SP2/O-Ag-14-celler ved et forhold på 5:1 ifølge den etablerte fremgangsmåten beskrevet i Kohler, G. og Milstein 1975, Nature, 256:495 for å generere hybridomer. Fusjonsprodukter ble platet i seleksjonsmedia inneholdende azaserin og hypoksantin i 96-brønn plater ved en tetthet på 2.5x106 miltceller per brønn. Syv til ti dager postfusjon, ble makroskopiske hybridomkolonier observert. Supernatant fra hver brønn inneholdende hybridomkolonier ble testet med ELISA for nærværet av antistoff til IL-13-variant (som beskrevet i eksempel 1.1.A). Supernatanter som fremviste IL-13-variant-spesifikk aktivitet ble så testet for evnen til å nøytralisere IL-13-variant og IL-13 vil-type i A-549 bioassayet for TARC (som beskrevet i eksempel 1.1.C).

eksempel 1.2.C: Identifisering og karakterisering av anti humant-IL-13 monoklonale antistoffer

Hybridomer produserende antistoffer som bandt IL-13-variant, generert ifølge eksempler 1.2.B og 1.2.C, og i stand til å binde IL-13-variant spesifikt og spesielt de med IC50verdier i A-549 bioassayet på 5 nM eller mindre enn 5 nM, ble oppskalert og klonet ved begrnsende fortynning.

Hybridomceller ble ekspandert inn i media inneholdende 10 % lav IgG føtalt bovint serum (Hyclone #SH30151, Logan, UT.). Gjennomsnitlig 250 mL av hver hybridomsupernatant (avledet fra en klonepopulasjon) ble høstet inn, konsentrert og renset med protein A affinitetskromatografi, som beskrevet i Harlow, E. og Lane, D. 1988 “Antibodies: A Laboratory Manual”. Evnen av renset mAbs til å inhibere IL-13-aktivitet ble bestemt ved å bruke A-549 bioassayet som beskrevet i eksempler 1.1.C. Tabell 7 viser IC50-verdier fra A-549 bioassayene for 17 monoklonale antistoffer.

Tabell 7: Nøytralisering av IL-13 med anti IL-13 mAbs i A-549 bioassay

Bindingsaffiniteter av monoklonale antistoffer for rekombinant renset humant-IL-13-variant og vill-type ble bestemt ved å bruke overflateplasmonresonans (Biacore®)-måling som beskrevet i eksempel 1.1.B. Tabell 8 viser affiniteten av de 18 monoklonale antistoffer beskrevet over for humant-IL-13.

Tabell 8: Affinitet av anti IL-13 mAb’er ovenfor human wild-type- og variant-IL-13

eksempel 1.2.C.1:Spesie spesifisitet av murine monoklonalt anti-humant-IL-13 antistoffer

For å bestemme om de 17 monoklonale antistoffene beskrevet over gjenkjenner murin-IL-13, ble et indirekte ELISA satt opp ved å belegge ELISA plater med 5ug/ml med geit anti-mus IgG, Fc-fragment-spesifikke antistoffer (Pierce # 31170, Rockland, IL).

Murine anti-humant-IL-13 mAbs ble fremstilt ved forskjellige konsentrasjoner varierende fra 0,1 til 100 ng/ml i PBS inneholdende 0,1 % BSA; 50 µl av hver antistoffortynning ble tilsatt til de belagte ELISA platene og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Brønner ble vasket 3 ganger med PBS inneholdende 0,05 % Tween-20. Rekombinant biotinylert muse-IL-13 (R&D Systemer) ble fortynnet ved 0,1 ug/ml i PBS inneholdende 0,1 % BSA; 50 µl/brønn ble tilsatt og platene inkubert i 1 time ved romtemperatur. Brønner ble vasket 3 ganger med PBS inneholdende 0,05 % Tween-20. Streptavidin HRP (Pierce # 21126, Rockland, IL.) ble fortynnet 1:20000 i PBS inneholdende 0,1 % BSA; 50 ml/brønn ble tilsatt og platene inkubert i 1 time ved romtemperatur. Plater ble vasket 3 ganger med PBS inneholdende 0,05 % Tween-20. Femti mikroliter med TMB-løsning (Sigma # T0440, St. Louis, MO.) ble tilsatt hver brønn og inkubert i 10 minutter ved romtemperatur. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 1N svovelsyre. Plater ble lest spektrofotometrisk ved en bølgelengde på 450 nm. Resultater fra det indirekte ELISA indikerte at mAb 3H7 var i stand til å binde mIL-13. I etterfølgende bioassay ble det vist at 3H7 kunne inhibere mIL-13-stimulert TARC-produksjon på en dose-avhengig måte, med en IC50på 2.4nM. Biacore analyse demonstrerte også positiv binding av 3H7 til mIL-13, med en KDpå 12nM. Ingen andre mAb’er i tabell 8 viste noen positiv binding til muse-IL-13.

Nøytraliseringsstyrken til anti-hIL-13 mAbs mot ikke-human primat(cynomolgus )-IL-13 og sau-IL-13 ble også målt i A-548-bioassayet. For å generere cyno- og sau-IL-13, ble cDNA for hvert protein oppnådd ved PCR på genomiske DNA-templater ved å bruke degenererte primere basert på den humane IL- 13-sekvensen. Rekombinante cyno- og sau-IL-13-proteiner ble deretter uttrykt i transient transfekterte COS-celler. Vill-type humant-IL-13 ble også generert parallelt som en kontroll i alle funksjonelle studier. A-549-celler responderte på både cyno- og sau-IL-13 med en lignende ED50som ved humant-IL-13. Mesteparten av mAb’ene nøytraliserte aktiviteten til cyno-IL-13, noe som demonstrerte kryssreaktivitet for cyno IL-13 (Tabell 7). Imidlertid viste ingen av antistoffene signifikant nøytralisering av sau-IL-13.

eksempel 1.2.C.2:Murine monoklonale anti-humant-IL-13 antistoffers blokkering av IL-13-binding til IL-13-reseptorer (IL-13R α1 og IL-13R α2)

IL-13-aktivitet er mediert gjennom et reseptorkompleks bestående av IL-13Rα1- og IL-4Rα-kjedene. Cytokinet undergår først en relativt lav affinitetsinteraksjon med IL-13Rα1 på overflaten av celler. IL-13/IL-13Rα1-komplekset rekrutterer deretter IL-4Rα for å danne den komplette IL-13-reseptoren, som blir bundet til sin ligand (IL-13) med høy affinitet (Zurawski et al. (1993) EMBO J.12:2663; Zurawski et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:23869). Bindingen av IL-13 med høy-affinitetsreseptoren sender deretter nedstrømssignaler gjennom IL-4Rα-kjeden som involverer Janus kinase-signaltransduseren og aktivatoren av transkripsjons (JAK-STAT) signalveien, f.eks. via fosforylering av STAT6, som kan bli sporet som en av de tidligste cellulære responsene ovenfor IL-13 (Murata et al., supra).

Det finnes en annen IL-13-bindende reseptor, IL-13R α2-kjeden (IL-13Ra2), som binder seg til IL-13 med høy affinitet (0,25-1,2 nM) (Caput, et al 1996 J. Biol. Chem.271, 16921-16926; Donaldson et al 1998 J. Immunol.161, 2317-2324). Ingen andre reseptormolekyler er kjent å være involvert i IL-13/IL-13R α2-komplekset. IL-13R α2 ble til å begynne med antatt å virke som en ikke-signalerende "narre"-reseptor.

Imidlertid ble det senere oppdaget at det kan binde til IL-13, og signalerer gjennom AP-1 reaksjonsveien, noe som leder til TGF-beta-produksjon i visse celletyper inkludert makrofager, som igjen leder til lungefibrose (Fichtner-Feigl. 2006 Nat Med 12:99-106). Både IL-13R α1/IL-4R-komplekset og IL-13R α2-reaksjonsveiene bidrar derfor til den totale patofysiologien til astma og andre IL-13-medierte sykdommer. Flere tilnærminger, så som epitopkartlegging, reseptorbindingsassayer, størrelseseksklusjonskromatografi (SEC), og videre BIACORE-analyse, ble anvendt for å klargjøre interaksjonen mellom anti-IL-13 antistoffene ifølge oppfinnelsen og humant-IL-13.

For å bestemme om de monoklonale antistoffene beskrevet over er i stand til å blokkere IL-13-binding til IL-13-reseptorer (IL-13R α1 og IL-13R α2), ble et reseptorbindings ELISA utviklet som følger. Høy-bindende 96-brønn ELISA-plater ble belagt med 4 ug/ml av rekombinant IL-13R α1/Fc eller IL-13R α2/Fc (R&D Systemer) i 100 µl/brønnbeleggende buffer (karbonat-bikarbonat buffer, Pierce) ved 4 °C. Etter 16 timer ble beleggingsløsningen fjernet ved å kaste plateinnholdet i vasken og platene ble vasket og blokkert 4 ganger med Superblock Blokkeringsbuffer (240 µl/brønn) (Pierce). Anti-IL13 mAbs (1:4 serielt fortynnet fra 40 µg/ml, 50 µl/brønn) og Biotin-IL-13 (50 µl/brønn, sluttkonsentrasjoner på 5 nM for hIL-13R α1/Fc, og 0,5 nM for hIL-13R α2/Fc) ble tilsatt og inkubert i 2 timer ved romtemperatur (RT). Plater ble vasket 5 ganger med 300 µl 0,1 % PBST, og deretter ble 100ul med 1:5000 fortynnet muse-anti-Biotin MAb (Jackson Immunosciences) tilsatt og inkubert ved RT i 45 min. Platene ble vasket igjen 5 ganger med 300 µl 0,1 % PBST, etterfulgt av tilsetning av TMB substratreagens (100 µl/brønn, Pharmingen); utviklet i 5 min, og stoppet ved å tilsette 50 µl med 2M H2SO4(VWR). OD-verdier ved 450nm ble bestemt med spektrofotometri.

Ytterligere ble reseptorblokkeringsegenskapene til mAb’ene også vurdert ved reseptorbindingsassay ved å bruke IL-13Rα2-transfekterte COS-celler. Rekombinant humant-IL-13 ble merket med 125I (Amersham, Arlington Heights, IL), ved å bruke IODO-GEN-reagens (Pierce, Rockford, IL) som tidligere beskrevet (Obiri NI et al., (1995) J Biol Chem.270:8797-8804). Den spesifikke aktiviteten til det radiomerkede IL-13 ble estimert å være 158 µCi/µg protein. Det merkede IL-13 fremviste lignende bioaktivitet som umerket IL-13, som vurdert ved A-549-bioassayet. For bindingseksperimentene ble COS-celler transient transfektert med humant IL-13R α2 av Lipofectamine 2000 (Invitrogen), og inkubert i 48 timer. Transfekterte COS-celler (5 × 105 celler i 100 µL bindende buffer: RPMI 1640 inneholdende 0,2 % humant serum albumin og 10 mmol HEPES) ble inkubert med 1,0 nM 125I-IL-13 med eller uten 1 µM umerket IL-13 ved 4 °C i 2 timer. Cellebundet 125I-IL-13 ble separert fra ubundet 125I-IL-13 ved sentrifugering gjennom en ftalatolje-gradient, og radioaktivitet ble bestemt med en gammateller (Wallac, Gaithersburg, MD). For antistoffortrengningsassay ble transfekterte COS-celler inkubert med 125I-IL-13 (1,0 nM) med eller uten økende konsentrasjoner (opp til 50 µg/ml) av anti-IL-13 antistoffer, som beskrevet over. Begge former for reseptorbindingsassay demonstrerte det følgende: for det første, 13C5 og 9C11 blokkerte IL-13-binding til IL-13R α1; for det andre, 13C5 blokkerte sterkt IL-13binding til IL-13R α2 (IC50~ 1-3 nM i både celleoverflate RBA og RB ELISA), mens 9C11 blokkerte IL-13-binding av IL-13R α2 med en lavere styrke (IC50> 10 nM); og for det tredje, 5G1 og 3E5 mislyktes i å blokkere IL-13-binding til enten IL-13R α1 eller IL-13R α2. Tre andre anti-IL-13 antistoffer, BAK502G9 (CAT PCT WO 2005/007699), mAb13.2 (Wyeth PCT WO 2005/123126A2) og MJ2-7 (Wyeth PCT WO 2006/0073148A1) ble også analysert for deres evne til å blokkere humant-IL-13-binding til humant-IL-13-R α2 i både reseptorbindings-ELISA og celleoverflate RBA. Antistoff mAb13.2 blokkerte ikke IL-13-binding til verken IL-13R α1 eller IL-13R α2.

BAK502G9 og MJ2-7 var i stand til å blokkere IL-13-binding til IL-13R α1; imidlertid oppviste de lav styrke i blokkering av IL-13-binding til IL-13R α2 med antistoffkonsentrasjoner opp til 50 μg/ml (330 nM).

Interaksjonen mellom IL-13 og IL-13R α1/ α2 i nærvær av anti-IL-13 mAb’er ble også analysert ved BIACORE. Denne analysen ble gjort i flere formater. Først ble IL-13R α1/Fc bundet til Biacore chip’en og IL-13 ble kjørt over chip’en, i nærvær og fravær av anti-IL-13 mAb’er. MAb’ene 13C5 og 9C11, blant andre, var i stand til å blokkere IL-13-binding til IL-13R α1, mens 5G1 og 3E5 misslyktes i å inhibere IL-13-binding til IL-13R α1, i samsvar med reseptorbindingsassayene. For det andre ble IL-4R bundet til BIACORE chip’en, og et kompleks av IL-13 prebundet til IL-13Rα1 ble kjørt over chip’en. I fravær av anti-IL-13 mAb’er ble dannelse av et trimolekylært kompleks demonstrert. Imidlertid forhindret tilsetningen av anti-IL-13 antistoffet 5G1 til blandingen av IL-13 prebundet til IL-13Rα1 binding til IL-4R på chip’en. Dette indikerte at selv om 5G1 ikke kunne blokkere IL-13-binding til IL-13R α1, kunne det blokkere bindingen av IL-13 til IL-4R, som tilveiebringer en mekanistisk basis for dets IL-13-nøytraliserende aktivitet. Disse observasjonene ble videre bekreftet ved størrelseseksklusjonskromatografi (SEC), hvor heterotrimere komplekser (mAb-IL-13-IL-13R α1/Fc) ble observert for 5G1, men ikke for 13C5. Etterfølgende epitopkartleggingsstudier ved å bruke proteinaseprosessering av mAb-IL-13-kompleks etterfulgt av massespektrometer-analyse indikerte det følgende: for det første, binder 5G1 seg til IL-13-residuer inkludert det N-terminale 11-aa peptidet (GPVPPSTALRE), som dekker deler av Helix-A-regionen som har blitt vist å interagere med IL-4R (Moy et al 2001J Mol Biol.310:219 og Horita et al., (2001) J Mol Biol.310:231); for det andre, antistoff 9C11 interagerer med en region mellom Helix C og Helix D (VSAGQFSSLHVR); og for det tredje, antistoff 13C5 interagerer med IL-13-residuer inkludert en region som dekker Helix D (VRDTK IEVAQ FVKDL LLHLK KLFRE GR tilsvarende aminosyre 104-130 av SEQ ID NR.1). Helix D har blitt vist å interagere med IL-13-reseptorer (Moy et al 2001J Mol Biol.310:219; Horita et al 2001 J Mol Biol.310:231; og Madhankumar et al 2002 JBC 277:43194). Siden 13C5 binder humant-IL-13-variant (KD=50 pM) mye sterkere enn cynomolgus-IL-13 (KD=1800 pM), og den eneste sekvensforskjellen mellom humant-IL-13 variant og cynomolgus-IL-13 i denne potensielle 13C5 epitopregionen er L i mennesker, men V i cyno-IL-13 ved posisjon 120, genererte vi en V120L mutant cyno-IL-13 og testet om denne mutasjonen ville ha økt bindingsaffinitet til 13C5 i forhold til wild-type cyno-IL-13. Basert på Biacore og bioassayresultater, ble bindingsaffiniteten så vel som nøytraliseringsstyrken overfor 13C5 for V120L-mutant cyno-IL-13-ekvivalent med den for vill-type cyno-IL-13, noe som indikerer at denne V/L forskjellen ved posisjon 120 i den C-terminale regionen ikke bidrar til 13C5 affinitetsforskjellen for humant-IL-13-variant i forhold til cyno IL-13, og at det må være andre residuer utenfor den C-terminale regionen som bidrar til den forskjellige bindingsaffiniteten for 13C5 overfor human- og cyno IL-13. Dette er i overensstemmelse med observasjonen at 13C5 ikke gjenkjenner denaturert humant-IL-13 ved Western blot analyse, noe som indikerer at bindingsepitopen til 13C5 på humant-IL-13 er sterkt konformel.

Bindings- og epitopkartleggingsstudier indikerte at 5G1 ikke inhiberte IL-13-interaksjon med IL-13Rα1, men forstyrret interaksjonen av IL-13/IL-13Rα1 med IL-4Rα. Denne forstyrrelsen er antatt å blande seg inn i dannelsen av et funksjonelt IL-13-signaliseringskompleks. Disse observasjonene tilveiebringer en teoretisk modell for den nøytraliserende aktiviteten til dette antistoffet i et IL-13R α1/IL-4R-mediert system så som A-549-celler. I kontrast blokkerte 13C5 bindingen av IL-13 til både IL-13R α1 og IL-13R α2. Interessant nok, selv om 9C11 var i stand til å blokkere IL-13-binding til IL-13R α1, viste det bare delvis (eller lav styrke) inhibering av IL-13-binding til IL-13R α2. Selv om IL-13R α1 og R α2 inntar lignende 3-dimensjonal folding og IL-13-bindingsorientering, har de en lav sekvensidentitet og derfor kan spesifikke residuer ansvarlige for IL-13-binding variere (Arima 2005 JBC 280:24915; og Madhankumar et al 2002 JBC 277:43194). Følgelig kan spesifikke residuer på IL-13 for binding til IL-13R α1 og IL-13R α2 være forskjellige, dette kan forklare de forskjellige reseptorblokkerende egenskapene til 9C11.

Reseptorbindingsassayene, epitopkartlegging, Biacore, og bioassay beskrevet over indikerer til sammen at et nøytraliserende anti-IL-13 antistoff kan inhibere IL-13-assosiert aktivitet gjennom de følgende mekanismer:

1) Inhiberer IL-13-binding til både IL-13R α1 og IL-13R α2 ved å interagere med IL-13 i regionen involvert i reseptorbinding til både IL-13R α1 og IL-13R α2. Et eksempel på et slikt antistoff er 13C5. Slike antistoffer vil inhibere IL-13-signalisering gjennom både IL-13R α1/IL-4R kompleks og IL-13R α2.

2) Inhiberer ikke IL-13-binding til verken IL-13R α1 eller IL-13R α2. Imidlertid inhiberer antistoffet interaksjonen med IL-4-reseptoren, og inhiberer derfor IL-13-signalisering gjennom IL-13R α1/IL-4R kompleks. Slike antistoff kan ikke inhibere IL-13R α2-signalisering. Eksempler på slike antistoffer er 5G1 og mAb13.2 (Wyeth PCT WO 2005/123126).

3) Inhiberer IL-13-binding til IL-13R α1 men inhiberer ikke effektivt IL-13-binding til IL-13R α2. Dette kan forekomme av følgende grunner: a) epitop: en region som er involvert i IL-13R α1-binding, men ikke i IL-13Ra2-binding eller ikke så sterkt involvert i IL-13R α2-binding. Et eksempel er 9C11; b) affinitet: siden IL-13R α2 har mye høyere affinitet enn IL-13R α1 overfor IL-13, kan et lavaffinitets antistoff være i stand til å blokkere IL-13-binding til IL-13R α1, men ikke til IL-13R α2 ved fysiologiske konsentrasjoner av et terapeutisk antistoff. Et eksempel er BAK502G9, som viste en 2.11nM affinitet overfor rekombinant vill-type humant-IL-13 som vurdert ved Biacore (CAT PCT WO 2005/007699). Et annet eksempel er MJ2-7, som viste en 1.4 nM affinitet ovenfor rekombinant wild-type humant-IL-13 og en høyere affinitet (43 pM) overfor ape-IL-13 som vurdert ved Biacore (Wyeth PCT WO 2006/0073148A1). På grunn av affinitetsforskjellen kan dette mAb effektivt inhibere ape-IL-13-binding til IL-13R α2; imidlertid inhiberer det humant-IL-13-binding til den samme reseptoren med mye mindre styrke.

mAb’ene BAK502G9 og MJ2-7 har lignende epitoper (CAT PCT WO 2005/007699 og Wyeth PCT WO 2006/0073148A1) og de konkurerer om binding til IL-13 som vurdert ved konkurranse-ELISA. Kort sagt, ble BAK502G9 immobilisert på ELISA-plate etterfulgt av vask og blokkering. Deretter ble biotinylert humant-IL-13 (10 ng/ml) tilsatt til platen i nærværet av forskjellige konsentrasjoner av MJ2-7 (0,2 ng/ml to 20 µg/ml), etterfulgt av vask og detektering ved å bruke HRP-konjugert anti-biotin antistoff. Dette studiet demonstrerte at MJ2-7 konkurrerte dose-avhengig med BAK502G9 for binding til humant-IL-13. En negativ kontroll IgG viste ikke konkurranse med BAK502G9.

eksempel 1.2.D Bestemmelse av aminosyresekvensen til den variable regionen for hvert murine anti-humant-IL-13 mAb

For hver aminosyresekvensbestemmelse ble omtrent 10x106 hybridomceller isolert ved sentrifugering og prosessert for å isolere total RNA med Trizol (Gibco BRL/Invitrogen, Carlsbad, CA.) ved å følge produsentens instruksjoner. Total RNA ble utsatt for første DNA-kjede-syntese ved å bruke ”SuperScript First-Strand Synthesis System” (Invitrogen, Carlsbad, CA) etter produsentens instruksjoner. Oligo(dT) ble anvendt for å prime første-tråd-syntese for å velge ut for poly(A)+ RNA. Første-tråd cDNA-produktet ble deretter forsterket ved PCR med primere designet for forsterking av murine immunoglobulin variable regioner (Ig-Primer Sets, Novagen, Madison, WI). PCR-produkter ble løst på en agarosegel, skjært ut, renset, og deretter subklonet med ”TOPO Cloning kit” inn i ”pCR2.1-TOPO”-vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) og transformert inn i TOP10 kjemisk kompetent E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA). Koloni PCR ble utført på transformantene for å identifisere kloner inneholdende innsettinger. Plasmid-DNA ble isolert fra kloner inneholdende innsettinger ved å bruke et QIAprep Miniprep kit (Qiagen, Valencia, CA). Innsettinger i plasmidene ble sekvensert på begge kjedene for å bestemme de variable tung eller lettkjede DNA-sekvenser ved å bruke M13 forover- og M13 reversprimere (Fermentas Life Sciences, Hanover MD). Variable tungog lettkjedesekvenser av de 17 monoklonale antistoffene beskrevet i eksempel 1.2.C er beskrevet i Tabell 5.

Eksempel 2: Rekombinant anti humant-IL-13 antistoffer

Eksempel 2.1: Konstruksjon og ekspresjon av rekombinante kimeriske anti humant-IL-13 antistoffer

DNA’et som koder for tungkjede konstant regionen til de murine anti-humant-IL-13 monoklonale antistoffene 5G1, 13C5, 9C11, 21D9, og 3H7 ble byttet ut med et cDNA-fragment som koder for den humane IgG1 konstante regionen inneholdende 2 hengselregion aminosyremutasjoner ved homolog rekombinasjon i bakterier. Disse mutasjonene er en leucin til alaninforandring i posisjon 234 (EU-nummerering) og en leucin til alanin forandring i posisjon 235 (Lund et al., 1991, J. Immunol., 147:2657). Lettkjede konstant regionen til hvert av disse antistoffene ble byttet ut med en human kappa konstant region. Fullengde kimeriske antistoffer ble transient uttrykt i COS-celler ved kotransfeksjon av kimeriske tung og lettkjede cDNA’er ligert inn i pBOS ekspresjonsplasmid (Mizushima og Nagata, Nukleinsyrer Research 1990, Vol 18, pg 5322). Cellesupernatanter inneholdende rekombinant kimerisk antistoff ble renset med Protein A Sepharose kromatografi og bundet antistoff ble eluert ved tilsetning av syrebuffer. Antistoffer ble nøytralisert og dialysert inn i PBS.

De rensede kimeriske anti-humant-IL-13 monoklonale antistoffer ble deretter testet for sin evne til å inhibere den IL-13-induserte produksjonen av TARC av A-549-celler som beskrevet i eksempler 1.1.C 2 og 1.1.C3. Tabell 12 viser IC50verdier fra A-549 bioassayene for tre kimeriske antistoffer.

Tabell 9 Nøytralisering av rhIL-13 wt by anti IL-13 Kimeriske antistoffer i A-549 bioassay

Eksempel 2.2: Konstruksjon og ekspresjon av humaniserte anti humant-IL-13 antistoffer

Eksempel 2.2.1: Seleksjon av humane antistoff rammeverk

Hver murine variable tung og variable lett kjedegensekvens (som beskrevet i Tabell 3) ble hver for seg målt mot 44 humane immunoglobulin kjønnscellelinje variable tungkjede- eller 46 kjønnscellelinje variable lettkjedesekvenser (utledet fra NCBI Ig Blast nettsted ved http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/retrieveig.html.) ved å bruke vektor NTI programvare.

Humanisering bvar basert på aminosyresekvenshomologi, CDR cluster analyse, hyppighet av bruk blant uttrykte humane antistoffer, og tilgjengelig informasjon om krystallstrukturen av humane antistoffer. Ved å ta hensyn til mulige effekter på antistoffbinding, VH- VL parring, og andre faktorer, ble murine residuer mutert til humane residuer hvor murine og humane rammeverkresiduer var forskjellige, med noen få unntak. Ytterligere humaniseringsstrategier ble designet basert på en analyse av humane kjønnscellelinje antistoffsekvenser, eller en undergruppe derav, som hadde en høy grad av homologi, dvs. sekvenslikhet med den virkelige aminosyresekvensen til de murine antistoff variable regioner.

Homologimodellering ble anvendt for å identifisere residuer unike for de murine antistoffsekvensene som er forutsagt å være kritiske for strukturen av det kombinerende setet hos antistoffet (CDRer). Homologimodellering er en datafremgangsmåte hvor omtrentlige tredimensjonale koordinater blir generert for et protein. Kilden for startkoordinater og retningslinjer for deres videre forfining er et andre protein, referanseproteinet, for hvilket de tredimensjonale koordinatene er kjent og hvis sekvens er beslektet med sekvensen til det første proteinet. Forholdet mellom sekvensene til de to proteinene blir anvendt for å generere en korrespondanse mellom referanseproteinet og proteinet som koordinater er ønsket for, målproteinet. De primære sekvensene til referanse- og målproteinene blir tilpasset med koordinatene til identiske deler av de to proteinene overført direkte fra referanseproteinet til målproteinet. Koordinater for ikkepassende deler til de to proteinene, f.eks. fra residumutasjoner, insettinger, eller slettinger, ble konstruert fra generiske strukturelle templater og energi blir tilpasset for å sørge for samsvar med de allerede overførte modellkoordinater. Denne beregnede proteinstrukturen kan bli ytterligere forfinet eller anvendt direkte i modelleringsstudier. Det burde være klart fra denne beskrivelse at kvaliteten til modellstrukturen er bestemt av nøyaktigheten til påstanden om at referanse- og målproteinene er beslektede og presisjonen som sekvenstilpasningen er konstruert med.

For de murine sekvensene 5G1, 13C5 og 9C11, ble en kombinasjon av BLAST-søking og visuell inspeksjon anvendt for å identifisere egnede referansestrukturer.

Sekvensidentitet på 25 % mellom referanse- og målaminosyresekvenser er ansett som det nødvendige minimum for å forsøke en homologimodelleringsøvelse. Sekvenstilpasninger ble konstruert manuelt og modellkoordinater ble generert med programmet Jackal (se Petrey, D., Xiang, Z., Tang, C.L., Xie, L., Gimpelev, M., Mitros, T., Soto, C.S., Goldsmith-Fischman, S., Kernytsky, A., Schlessinger, A., et al.2003. By using multiple structure alignments, fast model building, and energetic analysis in fold recognition and homology modeling. Proteins 53 (Suppl.6): 430–435).

De primære sekvensene til de murine og humane rammeverkregioner til de valgte antistoffer deler signifikant identitet. Residuposisjoner som skiller seg er kandidater for inkludering av det murine residuet i den humaniserte sekvensen for å beholde den observerte bindingsstyrken til det murine antistoffet. En liste med rammeverkresiduer som er forskjellige mellom de humane og murine sekvensene ble konstruert manuelt.

Sannsynligheten for at et gitt rammeverkresidu vil påvirke bindingsegenskapene av antistoffet avhenger av dets nærhet til CDR-residuene. Derfor, ved å bruke modellstrukturene, ble residuene som er forskjellige mellom de murine og humane sekvensene rangert ifølge deres avstand fra ethvert atom i CDR’ene. De residuer som falt innen 4.5 Å fra ethvert CDR-atom ble identifisert som mest viktige og ble anbefalt som kandidater for beholdelse av det murine residuet i det humaniserte antistoffet (dvs.

tilbakemutasjon).

For humanisering av de 5G1 variable regionene, ble den generelle tilnærmingsmetoden tilveiebrakt i den foreliggende beskrivelsen fulgt. Først ble en molekylmodell av de 5G1 variable regionene konstruert med hjelp av dataprogrammene ABMOD og ENCAD (Levitt, M., J. Mol. Biol.168: 595-620 (1983)). Deretter, basert på et homologisøk mot humane V og J segmentsekvenser, ble VH-segmentet 21/28 (Dersimonian, H., et al., J. Immunol. 139: 2496-2501 (1987)) og J-segmentet JH4 (Ravetch, J.V., et al., celle 27: 583-591 (1981)) valgt for å tilveiebringe rammeverkene for den Hu5G1 tungkjede variable regionen. For den 5G1 lettkjede variable regionen, ble VL-segmentet HF-21/28 (Chastagner, P., et al., Gene 101: 305-306 (1991)) og J-segmentet JK4 (Hieter, P.A., et al., J. Biol. Chem.257: 1516-1522 (1982)) anvendt. Identiteten til rammeverkaminosyrene mellom 5G1 VH og akseptoren human 21/28 og JH4-segmentene ble 72 %, mens identiteten mellom 5G1 VL og akseptoren human HF21/28 og JK4 segmentene ble 83%. Ved rammeverkposisjoner hvori datamodellen foreslo signifikant kontakt med CDR’ene, ble aminosyrene fra mus-V-regionene substituert for de opprinnelige humane rammeverkaminosyrene. Dette ble gjort ved residuene 48, 67, 68, 70, 72, 74 og 97 i tungkjeden. For lettkjeden ble utbyttingen innført ved residu 50. Rammeverkresiduer som bare inntraff sjeldent ved deres respektive posisjoner i de korresponderende human V-region undergrupper ble byttet ut med humane konsensusaminosyrer ved de posisjoner. Dette ble gjort ved residuer 44 og 76 i tungkjeden, og ved residuene 2, 15, 41, 42, 44 og 51 i lettkjeden.

For humanisering av de 13C5 variable regionene, ble den generelle tilnærmingsmetoden tilveiebrakt i den foreliggende oppfinnelsen fulgt. Først ble en molekylmodell av de 13C5 variable regionene konstruert med hjelp av dataprogrammene ABMOD og ENCAD (Levitt, M., J. Mol. Biol.168: 595-620 (1983)). Deretter, basert på et homologisøk mot humane V og J segmentsekvenser, ble VH-segmentet M60 (Schroeder, Jr., H.W. og Wang, J.Y., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6146-6150 (1990)) og J-segmentet JH4 (Ravetch, J.V., et al., celle 27: 583-591 (1981)) valgt for å tilveiebringe rammeverkene Hu13C5 tungkjede variabel regionen. For Hu13C5 lettkjede variabel regionen, ble VL-segmentet III-3R (Manheimer-Lory, A., et al., J. Exp. Med.174: 1639-1652 (1991)) og J-segmentet JK4 (Hieter, P.A., et al., J. Biol. Chem. 257: 1516-1522 (1982)) anvendt. Identiteten til rammeverkaminosyrene mellom 13C5 VH og akseptoren human M60 og JH4-segmentene ble 74%, mens identiteten mellom 13C5 VL og akseptoren human III-3R og JK4-segmentene ble 75%.

Ved rammeverkposisjoner hvori datamodellen foreslo signifikant kontakt med CDR’ene, ble aminosyrene fra mus-V-regionene substituert for de opprinnelige humane rammeverkaminosyrene. Dette ble gjort ved residuene 22, 49 og 71 for lettkjeden. Rammeverkresiduer som bare inntraff sjeldent ved deres respektive posisjoner i de korresponderende human V region undergrupper ble byttet ut med humane konsensusaminosyrer ved de posisjoner. Dette ble gjort ved residuer 10, 46, 83, 84, 86 og 87 i tungkjeden, og ved residuer 62 og 73 i lettkjeden.

Aminosyresekvenser av VL og VH av humaniserte mAb’er er vist i Tabell 10.

Tabell 10: Liste med aminosyresekvenser av humaniserte mAb’er

Eksempel 2.2.2: Konstruksjon av humaniserte antistoffer

In silico konstruerte humaniserte antistoffer beskrevet over ble konstruert de novo ved å bruke oligonukleotider. For hver variable region cDNA ble 6 oligonukleotider, bestående av 60-80 nukleotider hver, designet for å overlappe hverandre med 20 nukleotider ved 5’ og/eller 3’ enden til hvert oligonukleotid. I en samstillingsreaksjon ble alle 6 oligoene kombinert, kokt, og samstilt i nærværet av dNTP’er. Deretter ble DNA polymerase I, store (Klenow) fragment (New England Biolabs #M0210, Beverley, MA.) tilsatt for å fylle i de omtrent 40bp gapene mellom de overlappende oligonukleotidene. PCR ble deretter utført for å forsterke hele det variable regiongenet ved å bruke to ytterste primere inneholdende overhengende sekvenser som er komplementære til det multiple kloningssetet i en modifisert pBOS vektor (Mizushima, S. og Nagata, S., (1990) Nucleic Acids Research Vol.18, Nr.17)). PCR-produktene avledet fra hver cDNA-samling ble separert på en agarosegel og båndet tilsvarende den forutsagte variable region cDNA-størrelsen ble skåret ut og renset. Den variable tungregionen ble innsatt ”in-frame” på et cDNA-fragment som koder for den humane IgG1 konstantregionen som inneholder 2 hengsel-region aminosyremutasjoner ved homolog rekombinasjon i bakterier. Disse mutasjoner er en leucin til alanin forandring i posisjon 234 (EU-nummerering) og en leucin til alaninforandring i posisjon 235 (Lund et al., 1991, J. Immunol., 147:2657). Den variable lettkjede-regionen ble innsatt ”in-frame” med den humane kappa konstantregionen ved homolog rekombinasjon. Bakterielle kolonier ble isolert og plasmid-DNA ekstrahert; cDNA-innsettinger ble sekvensert i sin helhet. Korrekte humaniserte tung- og lett-kjeder tilsvarende hvert antistoff ble kotransfektert inn i COS-celler for forbigående å produsere fullengde humanisert antihumant-IL-13 antistoffer. For 13C5 ble pBOS-vektorer inneholdende 13C5 tungkjede manipulert cDNA’et og 13C5 lettkjede-manipulert cDNA’et ko-transfektert inn i COS-celler. Cellesupernatanter inneholdende rekombinant kimerisk antistoff ble renset med Protein A Sepharose-kromatografi og bundet antistoff ble eluert ved tilsetning av syrebuffer. Antistoffer ble nøytraliserte og dialysert inn i PBS. Flere humaniserte antistoffer er beskrevet i Tabell 10.

Evnen til rensede humaniserte antistoffer til å inhibere IL-13-aktivitet ble bestemt ved å bruke A-549-bioassayet som beskrevet i eksempler 1.1.C. Bindingsaffiniteter til de humaniserte antistoffene til rekombinant humant-IL-13 ble bestemt ved å bruke overflateplasmonresonans (Biacore®)-måling som beskrevet i eksempel 1.1.B. Tabell 11 viser IC50-verdier fra A-549-bioassayene og affiniteten til de første seks humaniserte antistoffene beskrevet i Tabell 10 for human-IL-13wt og variant.

Tabell 11: Nøytraliseringsstyrke og affinitet til humaniserte anti IL-13 mAb’er

CDR-sekvensene til det humaniserte antistoffet 13C5.5 ble videre mutert ved å bruke metoder kjent i teknikken, og tre ytterligere humaniserte antistoffer ble generert. Evnen til disse ytterligere humaniserte antistoffene til å inhibere human, cynomolgus og rhesus IL-13-aktivitet ble bestemt ved å bruke A-549-bioassayet som beskrevet i eksempler 1.1.C. Bindingsaffiniteter til de ytterligere humaniserte antistoffene overfor rekombinant human, cynomolgus og rhesus IL-13 ble bestemt ved å bruke overflateplasmonresonans (Biacore®)-måling som beskrevet i eksempel 1.1.B. I tillegg til å binde og inhibere humant-IL-13, viste disse tre ytterligere antistoffer forbedret affinitet for cynomolgus og rhesus IL-13. Tabell 12 viser IC50-verdier fra A-549 bioassayet, og Tabell 13 viser affiniteten til de ytterligere humaniserte antistoffene overfor human, cynomolgus og rhesus IL-13.

Tabell 12: Nøytraliseringsstyrke av ytterligere humaniserte anti IL-13 mAb’er

Tabell 13: Bindingsaffinitet til ytterligere humanisert anti IL-13 mAb’er

Eksempel 2.2.3: Karakterisering av humaniserte anti IL-13 antistoffer

Vi har isolert monoklonale antistoffer som blokkerer IL-13-binding til både IL-13R α1 og IL-13R α2. Både ELISA-basert reseptorbindingsassay og 125-I-merket IL-13-bindingsassay på celleoverflate demonstrerte at 13C5, både murin versjon og humanisert versjon (dvs. 13C5.5), var i stand til effektiv blokkering av IL-13-binding til begge reseptorene. Antistoffer i samme familie som 13C5, inkludert 25C8 og 33C3, var også i stand til blokkering av IL-13-binding til begge reseptorene.

Eksempel 2.2.3.a: Humaniserte anti IL-13 antistoffer blokkerer binding av IL-13 til IL-13-reseptor

For å bestemme evnen til humanisert antistoff 13C5.5 til å blokkere IL-13-binding til IL-13-reseptorer (IL-13R α1 og IL-13R α2), ble et ELISA-basert reseptorbindingsassay anvendt. Høy-bindende 96-brønn ELISA-plater ble belagt med 4 µg/ml av rekombinant human IL-13Ra1/Fc eller IL-13Ra2/Fc (R&D Systemer) i 100 µl/brønnbeleggende buffer (Karbonat-bikarbonat-buffer, Pierce) ved 4 °C. Etter 16 timer ble beleggingsløsningen fjernet ved å kaste plateinnholdet i vasken, og plater ble vasket og blokkert 4 ganger med Superblock Blokkeringsbuffer (240 µl/brønn) (Pierce).

Humanisert anti-IL-13 mAb 13c5.5 og kontroll mAb’er (1:4 serielt fortynnet fra 40 µg/ml, 50 µl/brønn) og Biotin-IL-13 (50 µl/brønn, sluttkonsentrasjoner på 5 nM for hIL-13Ra1/Fc, og 0,5 nM for hIL-13Ra2/Fc) ble tilsatt og inkubert i 2 timer ved romtemperatur (RT). Plater ble vasket 5 ganger med 300 µl 0,1 % PBST, og deretter ble 100 µl av 1:5000 fortynnet mus anti-Biotin MAb (Jackson Immunosciences) tilsatt og inkubert ved RT i 45 min. Platene ble vasket igjen 5 ganger med 300 µl 0,1 % PBST, etterfulgt av tilsetning av TMB substratreagens (100 µl/brønn, Pharmingen); utviklet for 5 min, og stoppet ved å tilsette 50 µl med 2M H2SO4(VWR). OD-verdier ved 450 nm ble bestemt med spektrofotometri. Resultatene er vist i Tabell 14.

Ytterligere ble også reseptorblokkeringsegenskapene til de humanisert mAb’ene vurdert med celleoverflate-basert reseptorbindingsassay ved å bruke IL-13Rα2-transfekterte COS-celler. Rekombinant humant-IL-13 ble merket med 125I (Amersham, Arlington Heights, IL), ved å bruke IODO-GEN-reagens (Pierce, Rockford, IL) som tidligere beskrevet (Obiri NI et al., (1995) J Biol Chem.270:8797-8804). Den spesifikke aktiviteten til det radiomerkede IL-13 ble anslått til å være 158 µCi/µg protein. Det merkede IL-13 utviste bioaktivitet tilsvarende umerket IL-13, som vurdert med A-549-bioassayet. For bindingseksperimenter ble COS-celler forbigående transfektert med humant IL-13Ra2 fra Lipofectamine 2000 (Invitrogen), og inkubert i 48 timer.

Transfekterte COS-celler (5 × 105 celler i 100 µL bindingsbuffer: RPMI 1640 inneholdende 0,2 % humant serum albumin og 10 mmol HEPES) ble inkubert med 1,0 nM 125I-IL-13 med eller uten 1 µM umerket IL-13 ved 4 °C for 2 timer. Cellebundet 125I-IL-13 ble separert fra ubundet 125I-IL-13 ved sentrifugering gjennom en ftalatolje gradient, og radioaktivitet ble bestemt med en gammateller (Wallac, Gaithersburg, MD). For antistoff fortrengningsassay ble transfekterte COS-celler inkubert med 125I-IL-13 (1,0 nM) med eller uten økende konsentrasjoner (opp til 50 ug/ml) av humanisert anti-IL-13 antistoff 13C5.5, som beskrevet over. Resultatene er vist i Tabell 14.

Tabell 14: Styrke av mAb’er i blokkering av humant-IL-13 (wt) binding til humant IL-13R α2 i celleoverflate-baserte og ELISA-baserte reseptorbindingsassayer

P.B. Delvis blokkering som ikke når 50 % inhibering.

Tabell 15 viser bindingsaffiniteten til det humaniserte 13C5.5 antistoffet og andre anti-IL-13 antistoffer.

Tabell 15: Bindingsaffinitet til anti-IL-13 mAb’er som vurdert ved Biacore

I både celleoverflate-baserte og ELISA-baserte reseptorbindingsassayer utviser 13C5.5 høy styrke i blokkering av humant-IL-13-binding til humant IL-13R α2, med en IC50mellom 1 og 3 nM. Mens både BAK502G9 og MJ2-7 også var i stand til å redusere bindingssignal, var deres styrke mye lavere enn den til 13C5.5 (se Tabell 14), ihvertfall delvis på grunn av deres lavere affinitet overfor humant wt IL-13 (se Tabell 15).

MAb13.2 var ikke i stand til å inhibere IL-13-binding til IL-13Ra2, i samsvar med dets epitop. I tillegg kunne 13C5.5 oppnå 100 % inhibering i begge assayer ved en konsentrasjon på 100 nM (eller 15 µg/ml). Ved den samme konsentrasjonen utviste henholdsvis BAK502G9 og MJ2-7 bare 40 % og 70 % inhibering i det celleoverflatebaserte reseptorbindingsassayet, og begge utviste bare 60 % inhibering i det ELISA-baserte reseptorbindingsassayet.

For en terapeutisk mAb med serumhalveringstid i et menneske på mellom 10 og 20 dager er serumkonsentrasjonen normalt mellom 5-15 ug/ml, med en ukentlig eller biukentlig IV eller SC 3mpk eller mindre doseregime. Basert på denne beregningen er 13C5.5 for tiden det eneste anti-IL-13 mAb som er trolig å komplett (100 %) blokkere humant-IL-13-binding til IL-13R α2 in vivo som en terapeutisk mAb, ved en serumkonsentrasjon på 100 nM (eller 15µg/ml), under et konvensjonelt doseregime med et monoklonalt antistoff.

Eksempel 2.2.3.b: Binding av anti IL-13 antistoffer til spesifikk epitop på IL-13 Epitopene på humant-IL-13 som anti-IL-13 mAb’ene 13C5, 13C5.5, 9C11 og 5G1 binder, ble kartlagt ved å bruke en epitoputskjæringsteknikk, etterfulgt av peptidanalyse med masse-spektrometri (MS). I epitoputskjæringen ble proteinet først bundet til et immobilisert mAb og deretter spaltet med proteolytiske enzymer. Epitopregioner på proteinet ble bestemt ved å bruke MS og MS/MS for å identifisere epitop-inneholdende peptider. CNBr-aktiverte Sepharose-kuler (Amersham Biosciences, 10 mg/reaksjon) ble suspendert i 500 µl med 0,1 M HCl og ekvilibrert i 15 min. Kulene ble overført til kompakte reaksjonskolonner (USB Corporation) og vasket med 0,1 M HCl etterfulgt av 0,1 M NaHCO3koblingsbuffer. mAb’en (100 µg) ble tilsatt til suspensjonen og inkubert i 2 timer med sakte rotasjon ved romtemperatur. Kuler med de kovalent koblede mAb’ene ble vasket med 0,1 M Tris-HCl-buffer ~pH 8,0. Blokkering av ureagerte grupper på CNBr Sepharose-kulene ble oppnådd ved inkubering i 2 timer med en 0,1 M Tris-HCl-buffer ~pH 8,0. Ukoblet mAb ble fjernet ved sekvensiell vasking med to buffere med forskjellig pH; 1) 0,1 M Na-acetat, 0,5 M NaCl ~pH 4,0 buffer og, 2) 0,1 M Tris-HCl, 0,5M NaCl ~pH 8.0 buffer. Kulene ble ekvilibrert i PBS ~0,14 M NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, pH 7,2 og inkubert i 2 timer ved romtemperatur, med og uten IL-13. Etter vasking av kulene med PBS ~pH 7,2, ble en liten del av suspensjonen fjernet for MALDI-TOF-analyse.

Det affinitetsbundne proteinet ble fordøyd med forskjellige proteaser (1:100~1:20 enzym:substratforhold) i 12 timer. Proteaser som ble anvendt inkluderer: Trypsin, GluC, Chymotrypsin, Karboksypeptidase Y og Aminopeptidase M. Ved å følge proteolysen ble kulene vasket med 500 µl med spaltningsbuffer. De siste 100 µl av vaskeløsningen ble tatt vare på som kontroll. Omtrent 100 µl av 2 % TFA ble tilsatt til kulene og samlet. Både kontroll- og syrevaskløsningene ble først konsentrert til omtrent 20 µl under vakuum. Peptidene ble deretter avsaltet med C18 ziptips. Prøvene ble analysert med MALDI-ToF MS, ved å bruke enten et Voyager DE eller et Voyager DE-Pro-system. Analyse med nano-ESI-LC-MS/MS ble utført på et Agilent 1100 Capillary HPLC-system knyttet sammen med et Sciex Q-Star Pulsar in MS-system.

Ved studiet av epitopene til 13C5, ga to proteaser anvendt i sekvensielle trinn de beste resultatene. Med chymotrypsin, ble et hovedpeptid bestående av aminosyreresiduer 100-130 av SEQ ID NR.1 detektert, noe som indikerer at det kan inneholde epitopen(e). Små mengder med peptider av aminosyreresiduer 103-130 og 104-130 av SEQ ID NR.1 ble også detektert. Aminopeptidase M ble anvendt etter Chymotrypsin-spaltingen.

Hovedpeptidet detektert var aminosyreresiduer 104-130 av SEQ ID NR.1, noe som tyder på at de 4 N-terminale aminosyreresiduer (80-83) ikke var en del av epitopen. Videre spaltning med karboksypeptidase Y resulterte i tap av affinitet. Intet peptid ble observert etter spaltning og vasking. Alle peptidsekvenser ble bekreftet ved å bruke nano-ESI-LC-MS/MS.

Epitopkartlegging av 13C5 og 13C5.5 indikerte at dets bindingssete(r) inkluderte den C-terminale Helix D-regionen av humant-IL-13 (residuer VRDTK IEVAQ FVKDL LL HLK KLFRE GR, tilsvarende aminosyre 104-130 av SEQ ID NR.1). Den C-terminale Helix D-regionen har blitt foreslått å være involvert i interaksjoner med IL-13-reseptoren (Zuegg et al 2001 Immunol celle Biol.79:332-9).

Eksempel 2.3: Krystallisering av anti-IL-13 kompleksert til IL-13

Fab-delen av 13C5.5 ble kompleksert med humant-IL-13 og krystaller av komplekset ble generert som følger.

Eksempel 2.3.1: Fremstilling og rensing av 13C5.5 Fab fragment

For å fremstille 13C5.5 Fab-fragmentet ble 13C5.5 IgG i 0,15 M PBS buffer først konsentrert til 2 mg/ml ved å bruke en Ultrafree-15 Biomax 10 kDa molekylvekt cut-off (MWCO) sentrifugeringsfilteranordning (Millipore). Papain gelslurry (Pierce) ble forvasket og ladet i 2-3X med Buffer A (20 mM Na2HPO4, 10 mM EDTA, 20 mM cystein) ved et 1:1 volumforhold. Det konsentrerte antistoffet ble deretter blandet med 50 % papain gelslurry og inkubert ved 37 ºC i 24 timer med kraftig risting.

Antistoffet/slurryblandingen ble sentrifugert (Beckman 6KR) og supernatanten ble lastet på en PBS forekvilibrert Superdex 75. En hovedtopp eluerte ut og protein ble samlet. En 25 ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow affinitetskolonne (Amersham Pharmacia) ble fremstilt ved vasking med 100 mL PBS. De samlede antistoff-fragmentene ble satt til affinitetkolonnnen (2 ml/min strømningshastighet). Fraksjoner inneholdende 13C5.5 Fab-fragmenter (overvåket med UV-absorbans ved 280 nm) ble samlet i gjennomløpet. Fraksjoner inneholdende en 13C5.5 Fab-fragmentkonsentrasjon større enn 0,3 mg/ml (bestemt med UV-absorbans ved 280 nm) ble samlet og fryst ved –80 °C. Prøverenhet ble vurdert med SDS-PAGE.

Eksempel 2.3.2: IL-13/13C5.5 Fab-kompleksfremstilling

Rekombinant humant-IL-13 ble uttrykt i et mammalisk ekspresjonssystem og deretter renset ved å bruke metoder velkjent i teknikken. Rekombinant humant-IL-13 og 13C5.5 Fab-protein ble blandet i et 1:1 molforhold og inkubert i 1 time ved 4 ºC. Kompleksprøven ble lastet på en forekvilibrert (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl) Superdex 200-kolonne ved 0,5 ml/min. Kompleks ble samlet og konsentrert til 24 mg/ml ved å bruke en Ultrafree-15 Biomax 10 kDa molekylvekt cut-off (MWCO) sentrifugeringsfilteranordning (Millipore) og fryst ved –80°C. Prøverenhet ble vurdert med SDS-PAGE.

Eksempel 2.3.3: Krystallisering av IL-13/13C5.5 Fab-kompleks

Fryst IL-13/13C5.5 kompleksløsning (~24 mg/ml) ble tint på is. Komplekset (1,0 μl) ble blandet med 1,0 μl med reservoarløsning (1,75 M Ammoniumsulfat, 100 mM MES pH 6,5, 10 mM CaCl2). Den resulterende dåpen ble blandet i en sittende-dråpe brønn (CrysChem sittende-dråpe-plate) over reservoaret ved omtrent 18 °C. Diamantlignende krystaller oppsto innen en uke.

Eksempel 2.3.4: Cryobeskyttelse og Flashkjøling av IL-13/13C5.5 Fab-komplekskrystaller

Krystaller av IL-13/13C5.5 Fab-kompleks ble høstet ved å bruke en fiberløkke i moderluten 20 % glycerol. Krystallene ble deretter flashkjølt ved neddypping i flytende nitrogen.

Eksempel 2.3.5: Røntgendiffraksjondatainnsamling for IL-13/13C5.5 Fabkompleks

Røntgendiffraksjonsdata fra IL-13/13C5.5 Fab-krystaller ble samlet ved IMCA strålingslinjen ved ”the Advanced Photon Source” i Argonne, IL. Krystallene ble holdt ved en temperatur på 100 K med en Oxford Cryosystems Cryostream-kjøler under datainnsamling. Totalt 180 rammer ble samlet i et oscilleringsområde på 1,0°. Data ble prosessert med HKL2000-pakken med programmer (Otwinowski og Minor, 1997). Etter å ha bestemt krystallorienteringen, ble dataene integrert med DENZO og skalert og slått sammne med SCALEPACK, og plassert på en absolutt skala og redusert til strukturfaktoramplituder med TRUNCATE (French og Wilson, 1978). Fem prosent av de unike refleksjonene ble tilordnet, på en tilfeldig måte, til det “frie” settet, for beregning av den frie R-faktoren (Rfree) (Brünger, 1992); de gjenværende 95 % av refleksjonene utgjorde “arbeids”-settet, for beregning av R-faktoren (R). Røntgendiffraksjonsdataene er oppsummert i Tabell 16. Den følgende listen indekserer for krystallformen: (1) IL-13/13C5.5 Fab: rom gruppe P2(1)2(1)2(1), en = 163.578 Å, b = 163.318 Å, c = 228.627 Å, α� =�90,0º, β= 90,0°, у� =90,0º. Tabell 17 lister opp røntgendiffraksjonsstatistikk for datasettet.

Tabell 16: Sammendrag av Krystallografisk Enhetscellinformasjon for IL-13/13C5.5 Fab-komplekset

Tabell 17: Sammendrag av Røntgendiffraksjonsdatastatistikk for IL-13/13C5.5 Fab-komplekset.

*Høyeste oppløsningsskall i parentes.

Eksempel 2.3.6: Molekylær Utbyttingsløsning og Raffinering av Krystallstruktur av IL-13/13C5.5 Fab-kompleks

En maksimalt sannsynlig molekylær utbyttingsløsning ble bestemt ved å bruke programmet PHASER (Lest, 2001). Totalt seks 13C5.5 monomerer ble løst ved 3,0 Å oppløsning i romgruppen P2(1)2(1)2(1). Søkemodellen var krystallstrukturen av Fab rapportert tidligere (Protein Data Bank entry 1BJ1; Muller et al.1998). Koordinater ble generert basert på den molekylære utbytttingsløsningen.

Raffineringen av IL-13/13C5.5 Fab-kompleks krystallstrukturen begynte med den molekylære utbyttingsløsningens koordinater, beskrevet over, i romgruppe P2(1)2(1)2(1). Raffinering begynte ved å bruke ”stivt-legeme”-raffinering ved programmet REFMAC tilgjengelig i CCP4-pakken med programmer (Murshudov et al., 1997, Collaborative Computational Project, 1994), som resulterte i de følgende statistikker ved 2,6 Å: R av 40,00 % (Rfree 39,00 %). De novo IL-13 elektrontetthet ble observert. Manuell bygging av seks IL-13 monomere ble styrt av den offentlige IL-13 NMR-strukturen 1IJZ (Moy et al., 2001) ved å bruke det molekylære grafikkprogrammet O (Jones et al., 1991) og ved gransking av 2Fo-Fc og Fo-Fc elektrontetthetskart. Raffineringsprogrammet REFMAC (Murshudov et al., 1997) ble anvendt for gjentagende runder med kontrollert raffinering resulterende i følgende statistikk: R av 25,8 % (Rfree 30,5 %). Resultater er vist i Tabell 18.

Tabell 18: Sammendrag av Krystallografisk Raffineringsstatistikk IL-13/13C5.5 Fab-kompleks

Eksempel 2.3.6: IL-13/13C5.5 Fab-kompleksstruktur

Omfattende kontakt er observert mellom humant-IL-13 og flere 13C5.5 CDR’er. Det begravde overflatearealet ved antistoff-antigenkontaktflaten er 1415.50 Å2. Kontaktene er omfattet av kritiske hydrogenbindinger og hydrofobiske interaksjoner som stabiliserer kontaktflaten. De to minimums sekvenssegmentene som omfatter de fleste av overflatekontaktene, er på IL-13 helikser A og D (for struktur av IL-13 se U.S. Patent publikasjon Nr.2003-0013851 A1). Disse kontaktene involverer CDR’ene L1 og L3, og H2 og H3. Basert på det foregående, omfatter epitop 13C5.5 bindingsområdet den topografiske regionen definert ved Ser26-Asn38, Lys123-Arg130 av SEQ ID NR.1. Mer fortrinnsvis omfatter epitop 13C5.5 bindingsområdet den topografiske regionen definert ved Arg30-Asn38, Lys123-Arg127 av SEQ ID NR.1.

Eksempel 2.4: In vivo effekt av humanisert IL-13-antistoffer

In vivo effekten av anti-hIL-13 antistoffer ble vurdert som følger.

Eksempel 2.4.1: In vivo effekt av humanisert IL-13-antistoffer i humant-IL-13-indusert astmamodell

Effekten av anti-hIL-13 antistoffene 5G1, 13C5, og 13C5.5 ble utprøvd i en humant-IL-13-indusert astmamodell i mus. Mus ble stimulert med rekombinant humant-IL-13 ved en dose på 1 μg i 50 μl steril PBS, levert inn i trakea med en mikrospray ved å bruke et laryngoskop for gnagere for å se den trakeale åpning. Totalt 2 doser med IL-13 ble gitt på dag 1 og 2 av studien og luftveishyperresponsivitet (AHR; Hoymann, H.G.; J Pharmacol Toksicol Methods.2007 Jan-Feb; 55(1):16-26) så vel som mukus, sur mammalisk kitinase (AMCase, Donnelly L.E., Barnes P.J., 1: Trends Pharmacol Sci. 2004 Oct; 25(10):509-11) og tymus og aktiveringsregulert kemokin (TARC; Bisset L.R., Schmid-Grendelmeier P., Curr Opin Pulm Med.2005 Jan; 11(1):35-42) ble målt i den bronko-alveolære vaskevæsken 24 timer etter den siste stimuleringen. Antistoffdoser på 100, 300, og 1000 μg ble administrert ved intra-peritoneal injeksjon 1 dag før den første stimuleringen med IL-13 og resultatene er oppsummert i Tabell 19.5G1 antistoff, som ikke blokkerer binding av IL-13 til verken IL-13Rα1 eller IL-13Rα2, var ikke i stand til å nøytralisere IL-13-bioaktivitet i denne in vivo modellen med sammenlignbare nivåer av AHR, AMCase, og Muc5ac detektert i dyr behandlet med 5G1 sammenlignet med PBS-behandlede kontrolldyr. Derimot var 13C5 antistoffet som blokkerer binding til både α1- og α2-reseptorene effektivt til å redusere alle parametere. Behandling med IL-13 økte luftveismotstanden fra 3,6 cm H2O/ml/s til 5,7 cm H2O/ml/s. Behandling med 13C5 (1000 μg) reduserte luftveisresistansen overfor 4,3 cm H2O/ml/s. Mukushyper-utsondring som målt ved muc5ac-nivåer, ble nedsatt fra 356.5 enheter til maksimum 211 U med antistoffbehandling tilsvarende en 40 % reduksjon. Tilsvarende ble AMCase-nivåer redusert fra 202 U til 68 U tilsvarende en 66 % reduksjon med sammenlignbar reduksjon sett i TARC nivåer (n=10, p < ,05, alle doser). Det rekombinante humaniserte antistoffet 13C5.5 demonstrerte lignende resultater i denne modellen. IL-13 induserte en økning i luftveismotstand ved å følge stimulering med 30 μg/ml metacholin fra 3,9 til 5,5 cm H2O/ml/s. Antistoffet 13C5.5 inhiberte luftveismotstanden overfor 4,1, 4,45, og 4,3 cm H2O/ml/s ved henholdsvis 100, 300 og 1000 μg doser. Mukushyperutsondring som målt ved muc5ac nivåer, ble redusert fra 247 U, indusert ved IL-13 behandling, til 154, 30.2, og 11.1 U ved henholdsvis 100, 300, og 1000 μg doser med antistoffbehandling. Dette representerer en 38, 88, og 96 % inhibering av mukusproduksjon med dette antistoffet. IL-13-behandling induserte 130 U AMCase-aktivitet som ble redusert til 113, 98, og 55 U med antistoffbehandling (100, 300, og 1000 μg doser) noe som represenerer en 14, 24, og 68 % inhibering. Disse data demonstrerer at 13C5 og det rekombinante humaniserte antistoffet 13C5.5 som blokkerer bindingen av IL-13 til både IL-13Rα1 og α2, kan nøytralisere IL-13-induserte responser hos AHR, mukus, og AMCase-produksjon i lungen mens antistoffer som ikke blokkerer binding av IL-13 til α1- og α2-reseptorer ikke er effektive i blokkering av alle disse biologiske responsene.

Tabell 19: Effekt av anti-humant-IL-13 antistoffer i IL-13 indusert astmamodell

*p<0,05, Students T-test

**p<0,05, ANOVA, Bonferroni’s

***p<0,01,ANOVA, Bonferroni’s

I et annet studie ble effekten av anti-hIL-13 antistoffer BAK502G9, MJ2-7 og 13C5.5 sammenlignet i den humant-IL-13-induserte astmamodellen i mus. Mus ble stimulert med rekombinant humant-IL-13 ved en dose på 1 μg i 50 μl steril PBS, levert intranasalt under lett bedøving. Totalt 2 doser av IL-13 ble gitt på dagene 1 og 2 av studiet og luftveishyperresponsivitet, så vel som mukus, og AMCase, ble målt i den bronko-alveolære vaskevæsken 24 timer etter den siste stimuleringen. Antistoff doser på 1000 μg ble administrert ved intraperitoneal injeksjon 1 dag før den første stimuleringen med IL-13. Resultater av studiet er oppsummert i Tabell 20.13C5.5-antistoffet som blokkerer bindingen av IL-13 til både IL-13 α1- og α2-reseptorene, var effektiv i å signifikant redusere alle parametere. Behandling med IL-13 økte luftveismotstanden ved følgende stimulering med 30 mg/ml metacholin fra 4,2 cm H2O/ml/s to 7,2 cm H2O/ml/s. Behandling med 13C5.5 (1000 μg) reduserte luftveismotstanden med 86,8 % til 4,6 cm H2O/ml/s. Mukushyperutsondring som målt ved muc5ac-nivåer ble nedsatt fra 768.2 U til 412.9 U med antistoffbehandling tilsvarende en 58,8 % reduksjon. Tilsvarende ble AMCase-nivåer redusert fra 316.5 U til 147 U tilsvarende en 52 % reduksjon (n=10, p < ,001). Både BAK502G9 og the MJ2-7 antistoffene, som inhiberer IL-13-binding til IL-13R α1 men som ikke effektivt inhiberer IL-13-binding til IL-13R α2, demonstrerte sammenlignbar evne for å nøytralisere IL-13-indusert AHR i denne modellen. Antistoffene BAK502G9 og MJ2-7 inhiberte bare luftveismotstanden fra 7.2 til henholdsvis 5,96 cm H20/ml/s og 5,93 cm H2O/ml/s, noe som representerer en 42 % og 41,5 % reduksjon i AHR. Mukushyperutsondring som målt ved muc5ac-nivåer ble redusert fra 768.2 U indusert ved IL-13-behandling til 627.8 og 380 U ved 1000 μg doser av antistoff tilsvarende en 23 % og 64 % inhibering med henholdsvis BAK502G9 eller MJ2-7 antistoffet. BAK502G9 antistoffet var mindre effektivt i å inhibere AMCase sammenlignet med enten 13C5.5 eller MJ2-7 antistoffene. IL-13-behandling induserte 316.5 U AMCase-aktivitet som ble redusert til 279, og 169 U ved enten BAK502G9 eller MJ2-7 antistoffbehandling (1000 μg doser)noe som henholdsvis representerer en 8 % og 45 % inhibering. Disse data demonstrerer at det rekombinante humaniserte antistoffet 13C5.5 som blokkerer binding av IL-13 til både IL-13Rα1 og α2, er mest effektivt for å nøytralisere IL-13-induserte responser av AHR, mukus, og AMCase-produksjon i lungen, mens antistoffer som blokkerer binding av IL-13 til IL-13 α2-reseptoren med lavere affinitet ikke er like effektive til å blokkere disse biologiske responsene som bidrar til patogenesen til astma.

Tabell 20: Sammenligning av 13C5.5, BAK502G9, og MJ2-7 antistoffer i den IL-13-induserte astmamodellen

Eksempel 2.4.2: In vivo effekt av IL-13 antistoffer i en OVA-indusert astma musemodell

For å bestemme hvilke reseptorblokkeringsegenskaper (spesielt med hensyn til IL-13R α2) som påvirker vivo-effekten til mAb’ene i astma-musemodeller, ble et panel av rotte anti-mus IL-13 antistoffer som utviste forskjellige reseptorblokkeringsegenskaper, som bestemt ved reseptorbindings-ELISA ved å bruke mIL-13R α1/Fc- og mIL-13R α2/Fc-proteiner (R&D Systemer) (se Tabell 21), generert. Siden anti-hIL-13 mAb 3H7 kryssreagerer med mus-IL-13, er dets anti-mIL-13-egenskaper også inkludert i Tabell 21. Bindingsaffinitetene til antistoffene overfor mus-IL-13 ble målt ved å bruke BIACORE assay mot rekombinant mus-IL-13 (R&D Systemer), og styrken (IC50) til antistoffene mot mus-IL-13 ble bestemt med A-549 bioassay mot rekombinant mus-IL-13. De variable domenesekvensene til 51D9 og 48D3 er vist i Tabell 22.

Tabell 21. Karakteriserin av anti-mIL-13 monoklonale antistoffer

Tabell 22. Liste av aminosyresekvenser til VH og VL regionene til rotte anti-mIL-13 mAb’er

For in vivo effekt-studiet i en murin astmamodell, ble dyr (hunkjønnede Balb/c mus) kjøpt fra Taconic, holdt i bur ved Abbott Bioresearch Center, og anvendt ved 8-12 ukers alder. Alle protokoller var godkjent av IACUC. A-mus ble sensibilisert ovenfor OVA (Sigma, endotoksin ble fjernet fra ovalbumin ved å bruke DetoksiGel (Pierce) ifølge produsentens protokoll og sluttmaterialet inneholdt mindre enn 0,1 EU/mg protein) på dag 0 og 7 med en intra-peritoneal injeksjon av 8 µg OVA i 2 mg alum (Pierce). På dagene 14 og 16, fikk dyrene intranasal stimulering med 0,3 mg OVA i 50 ml steril PBS. Antistoffene 51D9 og 48D3 (renset fra supernatanten fra hybridomklonene 51D9 og 48D3 ifølge standard prosedyrer, som inneholdt mindre enn 0,1 EU/mg av protein og var negative for gnagerpatogener ifølge PCR-prøving) ble administrert på dag 13 som en enkelt intraperitoneal injeksjon i steril PBS. Dexametason (Sigma) ble administrert oralt en gang om dagen på dagene 13-17 ved en dose på 3 mg/kg. Alle endepunkter ble analysert på dag 17, 24 timer etter den andre OVA-stimuleringen. Luftveishyperresponsivitet (AHR) ble vurdert ved å bruke hel-kropp pletysmografi. Raskt ble en kirurgisk flate med anestesi indusert med en intraperitonal injeksjon av ketamin og xylazin. En trakeal kanyle ble satt inn kirurgisk mellom den tredje og fjerde trakeale ringen. Spontan pusting ble forhindret ved intravenøs halsveneinjeksjon av pancuroniumbromid og dyrene ble plassert i en hel-kropp pletysmograf (Buxco) og mekanisk ventilert med 0,2 ml romluft ved 150 pust per minutt med en volumkontrollert ventilator (Harvard Apparatus). Trykk i lungen og gjennomstrømning inne i pletysmografen ble målt ved å bruke transdusere og lungemotstand ble beregnet som trykk/gjennomstrømning ved å bruke Biosystem Xa programvare. Grunnlinjemotstand så vel som motstand etterfølgende stimulering med metacholin (3, 10, & 30 mg/ml) som ble levert med en ”in-line” ultrasonisk forstøver, ble målt. Når pulmonær funksjonstesting var ferdig ble lungene vasket 4 ganger med 0,5 ml steril PBS.

Vaskevæske ble analysert for TARC, AMCase og cellulært infiltrat. Serum ble samlet for kvantifisering av antistoffnivåer ved avslutningen av studien.

Murine TARC-nivåer ble bestemt med ELISA (R&D) ifølge produsentens protokoll. AMCase-aktivitet ble bestemt i bronkoalveolær vaske (BAL) (1 til 10 fortynning med 0,01% BSA, 30 mM natriumsitrat, 60 mM natriumfosfat, pH 5,2 i nærværet av 80 uM 4-metylumbelliferyl β-D-N,N'-diacetylkitobiosid. Reaksjoner ble inkubert i 15 minutter ved romtemperatur og stanset ved tilsetning av 100 µl med 1 M glysin/NaOH pH 10,6. Produktdannelse ble bestemt ved fluorescensemisjon ved 460 nm ved å bruke eksitering ved 385 nm på et Fluoroscan Ascent fluorometer. For å vurdere goblet-celle hyperplasi ble lunger blåst opp med 10 % nøytral bufret formalin til 22 cm høyde i 15 minutter for å oppnå stabilt areale av lungeoverflaten. Seksjoner ble lagt i paraffin, seksjonert, og farget med ”periodic acid schiff” (PAS). Arealet av PAS-positive celler langs hovedbronkien til den venstre lungen ble kvantifisert ved å bruke ImagePro Plus programvare. Muc5ac-nivåer ble bestemt med ELISA. En 96-brønn plate blir belagt med BAL-væske, tørket over natten, og deretter blir et biotinylert anti-Muc5ac antistoff tilsatt og detektert med HRP-konjugert streptavidin, etterfulgt av spalting av kolometrisk substrat TMB.

Det relative bidraget av IL-13R α1 og α2 til patogenesen til astma ble utprøvd i en standard modell av ovalbumin-indusert astma i mus. Antistoffer som blokkerte bindingen av IL-13 til både α1- og α2-reseptorene (51D9, 54D1, og 3H7 med en styrke på henholdsvis 340, 24, og 2430 pM) så vel som et antistoff som blokkerte bindingen av IL-13 til bare α1-reseptoren (48D3, styrke på 50 pM) ble utprøvd ved å behandle dyr med antistoffene en dag før de lokale stimuleringene med ovalbumin og resultatene er presentert i Tabell 23. OVA stimulering induserte økninger i lungemotstand ved å følge stimulering med metacholin, mukushyperutsondring som målt ved økte nivåer av Muc5ac i BAL-væsken så vel som økt PAS-positiv farging av epitelceller ifølge histologisk vurdering, infiltrering av lungen med eosinofiler & T-celler, og produksjon av astma-beslektede proteiner AMCase og TARC.

Alle antistoffene som blokkerte bindingen av IL-13 til både IL-13 R α1 og α2 demonstrerte effekt, og in vivo-styrken av reagensene forandret seg i samsvar med deres målte styrke in vitro. 51D9 ble utprøvd ved doser på 100, 300, og 1000 µg/mus. OVA-behandling forårsaket en økning i luftveismotstand ved å følge stimulering med 30mg/ml metacholin til 6,2 cm H2O/ml/s sammenlignet med 3,6 cm H2O /ml/s i ikkeastmatiske dyr. Behandling av mus med 51D9 forhindret komplett økningen i lungemotstand med verdier sammenlignbare med de observert i ikke-astmatiske kontrolldyr på 4,1, 4,0, og 3,5 cm H2O/ml/s for doser på henholdsvis 100, 300, og 1000 μg (n=8-10/gruppe; p < ,05). Mengden av inhibering observert med 51D9 var sammenlignbar med den oppnådd med steroidbehandling (3,3 cm H2O/ml/s).

Behandling med 51D9 inhiberte også doseavhengig mukushyperutsondring fra 404 U Muc5ac ned til 55 U i dyr behandlet med 1000 μg av 51D9. Inhibering av mukus hyperutsondring ble også observert ved histologisk vurdering av PAS-reaktive epitelceller. Arealet med positive celler ble nedsatt fra 1,0 % til 0,6 % og 0,5 % med henholdsvis 300 og 1000 µg doser med 51D9 antistoff, noe som representerer en minsking på 47-65 % (n=8, p < ,01). 51D9-behandling inhiberte også TARC og AMCase. OVA-stimulering induserte 61 pg/ml av TARC som ble redusert til 7,8 pg/ml med 1000 µg 51D9-behandling (n=10, p < ,05). OVA-stimulering induserte 96 vilkårlige enheter av AMCase-aktivitet som ble doseavhengig redusert med 51D9 til 52, 45 og 21 U med henholdsvis 100, 300 og 1000 μg med antistoff (n=9-10, p < ,01).

54D1, som har en 10 ganger større in vitro styrke (24 pM), demonstrerte inhibering av AHR ved 30 µg-dosen med reduksjon av luftveismotstand fra 6,58 cm H2O/ml/s til 4,4 cm H2O/ml/s og maksimal inhibering observert ved behandling med 300 µg av antistoff for å redusere luftveismotstanden overfor en verdi av 3,65 cm H2O /ml/s. Lignende styrke ble observert ved inhibering av mukus, AMCase- og TARC-produksjon. Et tredje antistoff 3H7, som har en styrke på 2,5 nM, demonstrerte allikevel inhibering av AHR, mukus, og AMCase-nivåer, men bare ved en dose på 1000 μg antistoffbehandling i samsvar med en 10 gangers forandring i styrke beskrevet i in vitro bioassayer.

Effekten av antistoffer som blokkerer bindingen av IL-13 til bare IL-13R α1 ble utprøvd med antistoffet 48D3. Dyr ble behandlet med 30, 100, 300, og 1000 μg/mus. OVA-stimulering induserte en økning i luftveismotstand til 5,69 cm H20/ml/s sammenlignet med 4,1 cm H20/ml/s i ikke-astmatiske PBS-behandlede dyr. Behandling med 30 μg 48D3 hadde ingen effekt på OVA-indusert lungemotstand mens behandling med 100, 300 og 1000 µg 48D3 inhiberte OVA-induserte forandringer i lungemotstand overfor til maksimalt 4,4 cm H2O/ml/s eller til ~80 % av OVA-kontrollnivåene (n=10, p < ,05). I motsetning til effektene observert med 51D9, inhiberte ikke 48D3 OVA-indusert mukushyperutsondring som målt ved enten Muc5ac ELISA eller PAS-reaktive epitelceller. En liten, men statistisk signifikant reduksjon i mukus (30 %) ble observert med 48D3-behandling ved 30 μg dosen, mens alle andre doser var ekvivalente til OVA-stimulerte dyr. Histologisk kvantifisering av PAS-positiv farging demonstrerte 0,6 % i OVA-stimulerte dyr vs 0,8 % i dyr stimulert med OVA og behandlet med 1000 µg 48D3. I disse studiene inhiberte 48D3 OVA-indusert AMCase ekspresjon fra 196 U detektert i OVA-behandlede dyr til 63, 90, 87, og 96 U ved henholdsvis 30, 100, 300 og 1000 µg doser. Analyse av antistoffnivåer indikerte at sammenlignbare nivåer av 48D3 og 51D9 var detekterbare i både serum og BAL-væske hos antistoffbehandlede mus. Til tross for den 7-ganger større styrke av 48D3 antistoffet sammenlignet med 51D9 antistoffet, og ekvivalent eksponering av de to antistoffene, var 48D3 antistoffet ikke i stand til å inhibere AHR eller AMCase i samme omfang som antistoffet som blokkerte bindingen av IL-13 til IL-13R α1 og α2 og var ikke i stand til å minske mukusproduksjon. Tilsammen tyder disse data på at IL-13R α2 spiller en sentral rolle i å formidle OVA-indusert mukushyperutsondring og at IL-13R α2 bidrar til å regulere den astmatiske fenotypen in vivo.

Tabell 23: Effekt av anti-mus IL-13 antistoffer i murin-modell av ovalbuminindusert astma

* betegner p < ,05, ANOVA

Claims

Patentkrav

1. Bindende protein omfattende et antigenbindende domene, hvor nevnte antigenbindende domene er i stand til å binde IL-13, idet nevnte antigenbindende domene omfatter seks CDR: CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 og CDR-L3, hvor nevnte seks CDR er valgt fra sett av CDR (a) til og med (f) som følger:

(a)

CDR-H1 er: S-S-W-I-H (residuer 31-35 av SEQ ID NO:32),

CDR-H2 er: M-I-H-P-S-D-S-E-T-R-L-N-Q-K-F-K-D (residuer 50-66 av SEQ ID NO:32),

CDR-H3 er: T-A-T-D-F-D-Y (residuer 99-105 av SEQ ID NO:32),

CDR-L1 er: K-S-T-K-S-L-L-N-S-D-G-F-T-Y-L-D (residuer 24-39 av SEQ ID NO:33), CDR-L2 er: L-V-S-N-R-F-S (residuer 55-61 av SEQ ID NO:33), og

CDR-L3 er: F-Q-H-N-Y-L-P-L-T (residuer 94-102 av SEQ ID NO:33);

(b)

CDR-H1 er: T-S-D-M-G-V-D (residuer 31-37 av SEQ ID NO:46),

CDR-H2 er: H-I-W-W-D-D-V-K-R-Y-N-P-A-L-K-S (residuer 52-67 av SEQ ID NO:46),

CDR-H3 er: T-V-S-S-G-Y-I-Y-Y-A-M-D-Y (residuer 100-112 av SEQ ID NO:46), CDR-L1 er: R-A-S-Q-D-I-R-N-Y-L-N (residuer 24-34 av SEQ ID NO:47),

CDR-L2 er: Y-T-S-K-L-H-S (residuer 50-56 av SEQ ID NO:47), og

CDR-L3 er: Q-Q-G-N-T-L-P-L-T (residuer 89-97 av SEQ ID NO:47);

(c)

CDR-H1 er: T-S-D-L-G-V-G (residuer 31-37 av SEQ ID NO:50),

CDR-H2 er: H-I-W-W-D-D-V-K-R-Y-N-P-A-L-K-S (residuer 52-67 av SEQ ID NO:50),

CDR-H3 er: I-G-S-S-G-Y-I-Y-Y-E-M-D-Y (residuer 100-112 av SEQ ID NO:50), CDR-L1 er: R-A-S-Q-D-I-R-N-Y-L-N (residuer 24-34 av SEQ ID NO:51),

CDR-L2 er: Y-T-S-R-L-H-S (residuer 50-56 av SEQ ID NO:51), og

CDR-L3 er: Q-Q-G-N-T-L-P-L-T (residuer 89-97 av SEQ ID NO:51);

(d)

CDR-H1 er: T-S-D-M-G-V-D (residuer 31-37 av SEQ ID NO:80),

CDR-H2 er: H-I-W-W-D-D-V-K-R-Y-N-P-A-L-K-S (residuer 52-67 av SEQ ID NO:80),

CDR-H3 er: T-V-S-S-G-Y-I-Y-Y-A-M-D-Y (residuer 100-112 av SEQ ID NO:80), CDR-L1 er: R-A-S-Q-D-I-R-N-Y-L-N (residuer 24-34 av SEQ ID NO:92), CDR-L2 er: Y-T-S-M-K-P-R (residuer 50-56 av SEQ ID NO:92), og

CDR-L3 er: Q-Q-G-N-T-L-P-L-T (residuer 89-97 av SEQ ID NO:92);

(e)

CDR-H1 er: T-S-D-M-G-V-D (residuer 31-37 av SEQ ID NO:80),

CDR-H2 er: H-I-W-W-D-D-V-K-R-Y-N-P-A-L-K-S (residuer 52-67 av SEQ ID NO:80),

CDR-H3 er: T-V-S-S-G-Y-1-Y-Y-A-M-D-Y (residuer 100-112 av SEQ ID NO:80), CDR-L1 er: R-A-S-Q-D-I-R-N-Y-L-N (residuer 24-34 av SEQ ID NO:93), CDR-L2 er: Y-T-S-K-L-H-S (residuer 50-56 av SEQ ID NO:93), og

CDR-L3 er: Q-Q-G-L-T-P-P-L-T (residuer 89-97 av SEQ ID NO:93); eller

(f)

CDR-H1 er: T-S-D-M-G-V-D (residuer 31-37 av SEQ ID NO:80),

CDR-H2 er: H-I-W-W-D-D-V-K-R-Y-N-P-A-L-K-S (residuer 52-67 av SEQ ID NO:80),

CDR-H3 er: T-V-S-S-G-Y-I-Y-Y-A-M-D-Y (residuer 100-112 av SEQ ID NO:80), CDR-L1 er: R-A-S-Q-D-I-R-N-Y-L-N (residuer 24-34 av SEQ ID NO:94), CDR-L2 er: Y-T-S-M-K-P-R (residuer 50-56 av SEQ ID NO:94), og

CDR-L3 er: Q-Q-G-L-T-P-P-L-T (residuer 89-97 av SEQ ID NO:94).

2. Bindende protein ifølge krav 1, hvor nevnte seks CDR er:

CDR-H1 er: T-S-D-M-G-V-D (residuer 31-37 av SEQ ID NO:46),

CDR-H2 er: H-I-W-W-D-D-V-K-R-Y-N-P-A-L-K-S (residuer 52-67 av SEQ ID NO:46),

CDR-H3 er: T-V-S-S-G-Y-I-Y-Y-A-M-D-Y (residuer 100-112 av SEQ ID NO:46), CDR-L1 er: R-A-S-Q-D-I-R-N-Y-L-N (residuer 24-34 av SEQ ID NO:47), CDR-L2 er: Y-T-S-K-L-H-S (residuer 50-56 av SEQ ID NO:47), og

CDR-L3 er: Q-Q-G-N-T-L-P-L-T (residuer 89-97 av SEQ ID NO:47).

3. Bindende protein ifølge krav 2, hvor nevnte bindende protein omfatter to variable domener og hvor nevnte variable domener har aminosyresekvenser av SEQ ID NO:80 og SEQ ID NO:81.

4. Bindende protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, hvor nevnte bindende protein er i stand til å bind et humant IL-13 (SEQ ID NO:1).

5. Bindende protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, hvor nevnte bindende protein er i stand til å binde en human IL-13-variant hvor et arginin-residuum ved 130 av SEQ ID NO:1 er erstattet med et glutamin-residuum.

6. Bindende protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, hvor det bindende protein er i stand til å modulere eller nøytralisere en biologisk funksjon av IL-13.

7. Bindende protein ifølge krav 6, hvor det bindende protein inhiberer IL-13-binding til både IL-13Rα1 og IL-13Rα2.

8. Bindende protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, hvor nevnte bindende protein har en påbindingskonstant (Kon) til nevnte IL-13 valgt fra gruppen bestående av: minst omkring 102M-1s-1; minst omkring 103M-1s-1; minst omkring 104M-1s-1; minst omkring 105M-1s-1 og minst omkring 106M-1s-1 som målt med plasmonresonens; eller

nevnte bindende protein har en avbindingskonstant (Koff) til nevnte målmateriale valgt fra gruppen bestående av: høyst omkring 10-3s-1; høyst omkring 10-4s-1; høyst omkring 10-5s-1 og høyst omkring 10-6s-1 , som målt med overflate plasmonresonans;

eller

nevnte bindende protein har en dissosiasjonskonstant (KD) til nevnte målmateriale valgt fra gruppen bestående av: høyst omkring 10-7M; høyst omkring 10-8 M; høyst omkring 10-9 M; høyst omkring 10-10 M; høyst omkring 10-11 M; høyst omkring 10-12 M og høyst 10-13 M.

9. Antistoffkonstrukt omfattende et bindende protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8, hvor nevnte antistoffkonstrukt ytterligere omfatter et linker-polypeptid eller et immunoglobulin konstant domene.

10. Antistoffkonstrukt ifølge krav 9, hvor nevnte bindende protein er valgt fra gruppen bestående av: et immunoglobulin-molekyl, et disulfid-bundet Fv, et monoklonalt antistoff, et scFv, et chimerisk antistoff, et CDR-podet antibody, et humanisert antistoff, et multispesifikt antistoff, et Fab, et dobbelt spesifikt antistoff, et Fab', et bispesifikt antistoff, et F(ab')2, et Fv.

11. Antistoffkonstrukt ifølge krav 9 eller 10, hvor nevnte bindende protein omfatter et tung kjede immunoglobulin konstant domene valgt fra gruppen bestående av: et humant IgM konstant domene, et humant IgG4 konstant domene, et humant IgG1 konstant domene, et humant IgE konstant domene, et humant IgG2 konstant domene, et humant IgG3 konstant domene, et humant IgA konstant domene.

12. Isolert nukleinsyre som koder for det bindende protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8 eller et antistoffkonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 9-11.

13. Vektor omfattende en isolert nukleinsyre ifølge krav 12.

14. Vektor ifølge krav 13, hvor nevnte vektor er valgt fra gruppen bestående av pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV og pBJ.

15. Vertscelle omfattende en vektor ifølge krav 13 eller 14.

16. Vertscelle ifølge krav 15, hvor nevnte vertsceller en prokaryot celle eller en eukaryot celle.

17. Vertscelle ifølge krav 16, hvor nevnte eukaryote celle er valgt fra gruppen bestående av: en protist-celle, en animalsk celle, en plante-celle og en fungal celle.

18. Vertscelle ifølge krav 17, hvor nevnte eukaryote celle er en animalsk celle valgt fra gruppen bestående av: en pattedyrcelle, en fuglecelle og en insektcelle.

19. Vertscelle ifølge krav 16, hvor nevnte vertscelle er en eukaryot celle valgt fra gruppen bestående av: en CHO-celle, en COS-celle eller en gjærcelle.

20. Fremgangsmåte for fremstilling av et protein som er i stand til å binde IL-13 ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8, omfattende å dyrke en vertscelle ifølge et hvilket som helst av kravene 15-19 i et dyrkningsmedium under betingelser som er tilstrekkelige til å danne et bindende protein som er i stand til å binde IL-13.

21. Protein fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 20.

22. Bindende protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8 eller antistoffkonstrukt ifølge et hvilket som helst av kravene 9-11 for anvendelse ved reduksjon av human IL-13-aktivitet I et menneske som lider av en sykdom hvor IL-13-aktivitet er skadelig, hvor nevnte sykdommen er valgt fra gruppen bestående av respiratoriske sykdommer; astma; allergisk og ikke-allergisk astma; astma grunnet infleksjon; astma grunnet infleksjon med respiratorisk syncytial-virus (RSV); kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS); andre tilstander som involverer luftveisinflammasjon; eosinofilia; fibrose og for sterk mukus-produksjon; cystisk fibrose; pulmonar fibrose; atopiske lidelser; atopisk dermatitt; urticaria; eksem; allergisk rhinitt og allergisk enterogastritt; inflammatoriske og eller autoimmune tilstander i huden; inflammatoriske og/eller autoimmune tilstander hos gastrointestinale organer; inflammatoriske tarmsykdommer (IBD); ulcerativ kolitt; Crohns sykdom; inflammatoriske og/eller autoimmune tilstander i leveren; levercirrhose; lever-fibrose; lever-fibrose forårsaket av hepatitt B- og/eller C-virus; skleroderma; svulster eller kreft; hepatocellulær karsinoma; glioblastom; lymfom;

Hodgkin's lymfom; virale infeksjoner; HTLV-1-infeksjon (f.eks. fra HTLV-1); suppresjon av ekspresjon av beskyttende type 1 immunresponser og suppresjon av ekspresjon av beskytende type 1 immunresponser under vaksinasjon.

23. Bindende protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1-7, hvor nevnte bindende protein er et isolert antistoff eller et antigenbindende fragment derav, hvor nevnte antistoff eller antigenbindende fragment derav:

binder humant IL-13 og inhiberer bindingen av nevnte IL-13 til IL-13α2-reseptoren I et celleoverflate-basert reseptor bindingsassay med en IC50valgt fra gruppen bestående av omkring 1,5 x 10-8 til 1 x 10-8 M, 1 x 10-8 to 1 x 10-9 M, 10-9 til 10-10 M og 10-10 til 10-11 M eller i et ELISA-basert reseptor bindingsassay med en IC50valgt fra gruppen bestående av omkring 1,8 x 10-8 til 1 x 10-8 M, 1 x 10-8 til 1 x 10-9M, 10-9 til 10-10 M og 10-10 to 10-11 M;

eller

binder IL-13 med bindingskarakteristika valgt fra gruppen bestående av:

a) en på-hastighetskonstant (kon) mellom omkring 105 M-1s-1 til 106M-1s-1 eller omkring 106 M-1s-1 til 107 M-1s-1;

b) en av-hastighetskonstant (koff) på omkring 10-4 s-1 til 10-5 s-1 eller på omkring 10-5 s-1 til 10-6 s-1 som målt med overflate plasmonresonans; og

c) en dissosiasjonskonstant (KD) på omkring 1,5 x 10-10 til 1 x 10-10 M, eller omkring or 10-10 til 10-11 M.

24. Isolert antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 23, hvor nevnte antistoff eller antigenbindende fragment derav binder humant IL-13 og inhiberer AHR med minst omkring 50 % i en human IL-13-indusert astmamodell.

25. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 23, hvor nevnte antistoff eller antigenbindende fragment derav har en på-hastighetskonstant (kon) til IL-13 valgt fra gruppen bestående av: 6,68 x 105 M-1s-1 , 7,86 x 105 M-1s-1 , 8,35 x 105 M-1s-1 , 8,69 x 105 M-1s-1 , 9,15 x 105 M-1s-1 , 1,26 x 106 M-1s-1 , 1,7 x 106 M-1s-1 og 2,51 x 106 M-1s-1;

eller

hvor nevnte antistoff eller antigenbindende fragment derav har en av-hastighets-konstant (koff) til IL-13 valgt fra gruppen bestående av: 1,23 x 10-4s-1 , 1,76 x 10-4s-1 , 4,74 x 10-4s-1 , 1,91 x 10-5s-1 , 2,14 x 10-5s-1 , 3,82 x 10-5s-1 , 8,81 x 10-5s-1 og 9,65 x 10-5s-1 som målt ved overflate plasmonresonans;

eller

hvor nevnte antistoff eller antigenbindende fragment derav har en disosiasjons-konstant (KD) til IL-13 valgt fra gruppen bestående av: 1,05 x 10-10 M, 7,10 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 2,20 x 10-11 M, 2,72 x 10-11 M, 4,17 x 10-11 M, 5,68 x 10-11 M, 7,01 x 10-11 M, 7,10 x 10-11 M og 9,79 x 10-11 M.

26. Antistoff eller antigenbindende fragment derav ifølge krav 23, hvor nevnte antistoff eller antigenbindende fragment derav omfatter to variable domener, hvor nevnte to variable domener har aminosyresekvenser av SEQ ID NO:80 og SEQ ID NO:81.

27. Farmasøytisk sammensetning omfattende det bindende protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1-8 eller antistoffkonstruktet ifølge et hvilket som helst av kravene 9-11 samt et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel.

28. Farmasøytisk sammensetning omfattende antistoffet eller det antigen-bindende fragment derav ifølge et hvilket som helst av kravene 23-26, samt et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel.

29. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 27 eller 28, hvor nevnte farmasøytisk akseptable bæremiddel virker som en adjuvant som er anvendelig til å øke absorpsjonen eller dispersjonen av nevnte bindende protein.