CN109735558B - 一种重组car19-il24基因、慢病毒载体、car19-il24-t细胞及应用 - Google Patents
一种重组car19-il24基因、慢病毒载体、car19-il24-t细胞及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109735558B CN109735558B CN201811517078.5A CN201811517078A CN109735558B CN 109735558 B CN109735558 B CN 109735558B CN 201811517078 A CN201811517078 A CN 201811517078A CN 109735558 B CN109735558 B CN 109735558B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- car19
- cells
- gene
- recombinant
- car
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 22
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 32
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 50
- 108010005327 CD19-specific chimeric antigen receptor Proteins 0.000 description 38
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 32
- 108090000237 interleukin-24 Proteins 0.000 description 25
- 102000003898 interleukin-24 Human genes 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 101000853009 Homo sapiens Interleukin-24 Proteins 0.000 description 13
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 12
- 102100036671 Interleukin-24 Human genes 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 8
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 6
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 6
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 101150014742 AGE1 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000011523 CAR-T cell immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100165202 Caenorhabditis elegans bbs-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 1
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 1
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 1
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 108010067003 Interleukin-33 Proteins 0.000 description 1
- 102000017761 Interleukin-33 Human genes 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 101100098621 Paramecium tetraurelia T2A gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001190 Q-PCR Methods 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 230000002476 tumorcidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
- A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
- A61K40/35—Cytokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
- A61K40/41—Vertebrate antigens
- A61K40/42—Cancer antigens
- A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
- A61K40/4211—CD19 or B4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种重组CAR19‑IL24基因、慢病毒载体、CAR19‑IL24‑T细胞及应用。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤细胞免疫技术领域，具体涉及一种重组CAR19-IL24基因、慢病毒载体、CAR19-IL24-T细胞及应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy)又称 CAR-T细胞免疫疗法，是一种利用嵌合抗原受体T细胞来进行免疫治疗的新型疗法。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)即经过修饰改造在表面表达嵌合抗原受体(CAR)分子的T细胞。表达在T细胞膜上的CAR分子将对T细胞进行“重指导”，赋予其对表达CAR分子靶点的靶细胞的特异性识别和杀伤能力，从而特异性清除患者体内的肿瘤靶细胞。嵌合抗原受体(CAR)一般包括能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部(通常来源于抗体抗原结合区域的scFv段)，一个胞外铰链区、一个跨膜区和一个胞内信号转导区(通常为共刺激信号结构域和CD3ζ胞内区)，这些构件按一定顺序偶联在一起即组成为一个嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)。
1993年以色列科学家Zelig Eshhar首次提出CAR-T概念；2011年美国宾夕法尼亚大学 Carl H.June教授团队应用CAR-T疗法在1例慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的治疗中获得突破。2012年该团队成功应用CAR-T细胞治疗急性淋巴细胞性白血病(ALL)患者Emily，迄今仍未复发。2013年《Science》将CAR-T细胞免疫疗法评为全球十大科技突破之首。2017年已有两款CAR-T产品被美国FDA批准进入临床应用，国内也有相应的 CAR-T产品正在临床审批阶段。
迄今CAR-T细胞免疫疗法已经成为治疗人特定肿瘤的突破性方法。CAR-T细胞免疫疗法的治疗效果和重组CAR分子的设计密切相关，CAR分子决定了CAR-T细胞所适应的肿瘤类型以及CAR-T细胞治疗的效果。目前报道较多的CAR是第二代或第三代设计，它们的作用效果仍有待提高，如何进一步优化或这改进CAR设计是提高CART治疗效果的关键。目前已有研究报道，联合细胞因子IL12，IL15，IL18和IL33可以增强CAR-T的治疗效果，提示其它的白介素也可能增强CART的治疗效果。目前尚无自分泌IL-24的 CAR-T细胞产品。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种重组CAR19-IL24基因、慢病毒载体、CAR19-IL24-T细胞及应用。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述重组CAR19-IL24基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
所述慢病毒载体携带上述重组CAR19-IL24基因，慢病毒载体序列如SEQ ID NO.2所示。
所述表达重组CAR19-IL24基因的T细胞由上述慢病毒载体转导至T细胞中制备而成。
所述T细胞共同表达CAR和IL24。
优选地，所述T细胞是将CAR的表达基因与IL24的表达基因连接后，构建于同一载体的同一表达框中，再将载体转导至T细胞制备而成。
优选地，其特征在于，所述T细胞是将CAR的表达基因与IL24构建于同一载体的不同表达框中，再将载体转导至T细胞制备而成。
下面对本发明作进一步说明：
本发明所述的重组CAR19-IL24基因联合了白介素24(IL-24)和嵌和抗原受体(CAR)，包含编码如下部分的核酸序列：胞外区的特异性识别肿瘤抗原的抗体的抗原结合部分，跨膜部分和胞内区的CD28胞浆功能区、41BB胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区，这些胞内区可以任意顺序连接，以及可以自分泌的IL-24。使用所述的重组CAR19-IL24基因及含有该重组CAR19-IL24基因的载体转染T细胞的效率较高，且经转染后的阳性T细胞具有较好的增殖能力。此外，以特异性识别CD19分子的CAR19.IL-24为例，本发明所述的重组CAR19.IL24基因对B细胞肿瘤抗原CD19分子的特异性高，促使CAR19.IL24-T 细胞特异性地杀伤CD19+的B细胞肿瘤。
本发明前期实验结果以及分析得知，IL-24的表达能增强了CART治疗潜能。一方面，IL24可以增强T细胞的增殖和活化。T细胞增殖和活化潜能是影响CART产品治疗效果的关键因素之一，具有更强增殖和活化潜能的T细胞，更容易在体外培养和回输到患者体内后大量扩增，并且更有利于在体内长期维持抗肿瘤活性。另一方面，IL24对多种肿瘤细胞展现出抗肿瘤作用，如引起肿瘤细胞特异性凋亡，抗肿瘤血管生成，抑制肿瘤细胞侵袭和转移等。此外，IL24分子比较小，比较容易向CAR序列中添加IL24表达框。基于上述实验和分析结果，本发明首次提出融合IL24的增强型CAR19(CAR19-IL24)结构设计，并构建携带该序列的慢病毒载体LV-CAR19-IL24，随后制备了表达重组CAR19-IL24 基因的CAR-T细胞。其目的在于证实该CAR19-IL24设计的有效性和安全性，为 CAR19-IL24-T细胞的临床应用奠定基础。
以特异识别CD19分子的CAR19.IL-24为例：
1)本发明首先根据已有报道以及生物信息学方式查找到特异识别CD19分子的CAR19，T2A，IL24CDS序列，通过基因合成CAR序列，CAR19-IL24序列。
2)通过分子克隆技术将CAR19序列和CAR19-IL24序列连入慢病毒载体Addgene： #12252。二者之间通过T2A连接(以上各段DNA序列暂未附录)。
3)采集正常人志愿者外周血密度梯度离心分离单个核细胞(PBMC)，然后负向分选获得总T细胞(PanT细胞)，使用CD3/28磁珠刺激并添加IL-2进行体外扩增。
4)包装携带重组CAR19-IL24基因的慢病毒，转导经CD3/28磁珠刺激24小时的PanT细胞，制备表达重组CAR19-IL24基因的增强型CART细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)通过测序证实构建好的慢病毒载体序列元件均无突变。
2)利用慢病毒载体制备的IL24增强的CAR19.IL-24-T细胞相比CAR19-T细胞具有更高的抗肿瘤活性。T细胞在经过慢病毒转导之后，通过PCR鉴定，确定成功整合了CAR序列，通过流式细胞术，Western Blot，Q-PCR检测确定成功表达CAR分子。
3)通过细胞增殖能力检测确定CAR19.IL-24-T细胞具有更强的增殖能力。
4)通过体外共培养细胞毒性检测确定CAR19.IL-24-T细胞有更强的肿瘤杀伤效果。
另外，根据本发明的思路，可以选择不同的CAR胞外区-胞内结构域与IL24组合，以适应不同的肿瘤细胞类型。可以选择不同的连接原件将IL-24与CAR分子以不同的顺序构建在同一个表达框。可以将IL-24和CAR分开放置于不同的表达框共同表达在T细胞。
总之，本发明联合白介素24和嵌合抗原受体以在肿瘤免疫治疗应用中获得更好的治疗效果，利用本发明可以有效制备CAR19-IL24-T细胞，其表达靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体和白介素24。与CD19-CART细胞相比，CAR19-IL24-T细胞有更强的杀瘤功能和更好的增殖能力。并证实CAR19-IL24-T细胞是一种安全、特异、有效的CART细胞，具有重要的临床应用价值。
附图说明
图1为CAR19和CAR19-IL24示意图；
图2为使用Western Blot检测CAR19和CAR19-IL24在细胞内的蛋白表达水平图；
图3为使用倒置荧光显微镜观察CAR19-IL24-T细胞GFP表达图；
图4为使用Flow cytometry检测CAR19-T和CAR19-IL24-T表面的CAR19分子；
图5为CAR19.IL-24-T细胞的功能检测结果图；图中，E：效用细胞，分别LV-CAR19-IL24 转导的CAR19-IL24-T细胞，LV-CAR19转导的CAR19-T细胞，和同批次的转导LV-GFP 的T细胞；T：靶细胞，为CD19阳性的Raji细胞；利用Annexin-V APC+检测CD19阳性细胞(即Raji细胞)的凋亡情况，纵坐标表示靶细胞的凋亡比例；
图6为使用PCR从已有的含IL-24序列的质粒扩增IL-24图；
图7为菌液PCR鉴定条件图。
具体实施方式
1 CAR19表达框以及慢病毒载体的构建
(1)根据已有报道以及生物信息学方式查找到特异识别CD19分子的FMC63scFv序列，设计跨膜区以及胞内信号转导区序列并基因合成序列(CAR19)，CAR19序列两端设计有Bbs1酶切位点，该序列装载于pUC57质粒(pUC57-CAR19)。
(2)Bbs1酶切pUC57-CAR19，将分别在CAR19序列5’和3’端产生BamH1和Age1粘性末端。同时使用BamH1和Age1双酶切二代慢病毒载体质粒pHQ-009。(附酶切体系)
(3)胶回收pHQ-009骨架7379bp和CAR19序列1534bp。使用T4DNA Ligase连接构建质粒pHQ-010，连接时间室温(25℃)不超过10min或者16℃水浴过夜。(附连接体系)
(4)取连接产物5μl，使用Stbl3进行转化。(附Stbl3转化体系)
(5)14小时后挑取单克隆进行菌液PCR鉴定。(附菌液PCR体系与条件)
(6)取菌液PCR阳性克隆进行Sanger测序鉴定。
(7)取Sanger测序鉴定序列与理论序列一致的克隆进行质粒大提pHQ-010，其为含有 CAR19序列的二代慢病毒载体质粒。
2 CAR19.IL-24表达框以及慢病毒载体的构建
(1)使用PCR从已有的含IL-24序列的质粒扩增IL-24，利用上下游引物分别引入Xma1 和HindIII酶切位点。(附质粒PCR体系与条件见表1，使用PCR从已有的含IL-24序列的质粒扩增IL-24图见图6)
表1
(2)将PCR产物进行胶回收纯化723bp。使用T4DNA Ligase连入pGEM-T-easy载体。
根据OD值和骨架及片段长度估算连接体系中加入的量，以插入片段:骨架的摩尔量比值在3:1～10:1之间配制体系(见表2)：
表2
(3)取连接产物5μl，使用DH5α进行转化，进行“蓝白”筛选。
取DH5α感受态置于冰浴中溶解5min。
向其中加入5μl连接产物/100μl感受态。
冰水中静置30min。
42℃水浴90S。不要摇动
快速转移到冰水中冷却3min。
加不含Amp抗性的培养基900μL，置于37℃摇床-转速150rpm*45min。
准备蓝白筛选用的平板(含IPTG/X-Gal的氨苄抗性平板)：将10μl的100mM IPTG和40μL 20mg/ml X－gal涂到氨苄抗性平板的表面上，并在室温避光正置30分钟使之吸收后备用。
取适量f)中的菌液涂布到g)中平板，置于37℃温箱，倒置培养14小时。
(4)挑取白色克隆进行Sanger测序验证。取Sanger测序鉴定序列与理论序列一致的克隆进行质粒大提pHQ-040。
(5)使用Xma1和HindIII双酶切pHQ-040；使用Age1和HindIII双酶切 pUC57-CAR19。
按下表配制pHQ-040反应体系(见表3)：
表3
按下表配制pUC57-CAR19反应体系(表4)：
表4
(6)胶回收pHQ-040中的IL-24序列723bp和pUC57-CAR19骨架4290bp。使用T4DNALigase连接构建质粒pHQ-036，连接时间室温(25℃)不超过10min或者16℃水浴过夜。(附连接体系)
根据OD值和骨架及片段长度估算连接体系中加入的量，以插入片段:骨架的摩尔量比值在 3:1～10:1之间配制体系(表5)：
表5
(7)取连接产物5μl，使用DH5α进行转化。(附DH5α转化体系)
a)取DH5α感受态置于冰浴中溶解5min。
b)向其中加入5μl连接产物/100μl感受态。
c)冰水中静置30min。
d)42℃水浴90S。不要摇动
e)快速转移到冰水中冷却3min。
f)加不含Amp抗性的培养基900μL，置于37℃摇床-转速150rpm*45min。
g)取适量f)中的菌液涂布到Amp抗性平板，置于37℃温箱，倒置培养14小时。
(8)14小时后挑取单克隆进行菌液PCR鉴定。(附菌液PCR体系与条件，PCR条件图见图7)
将单克隆用无菌小Tip挑取至300μl LB培基，置于37℃摇床-转速150rpm*45min后用于下述PCR(表 6)：
表6
(9)取菌液PCR阳性克隆进行Sanger测序鉴定。
(10)取Sanger测序鉴定序列与理论序列一致的克隆进行质粒大提pHQ-036。
(11)使用Bbs1酶切pHQ-036，胶回收CAR19.IL-24序列2215bp；同时使用BamH1和Age1双酶切二代慢病毒载体质粒pHQ-009，胶回收pHQ-009骨架7379bp；使用T4DNA Ligase连接构建质粒pHQ-035，其为含有CAR19.IL-24序列的二代慢病毒序列。
3 CAR 19和CAR19.IL-24慢病毒制备(见表7)：
表7
4 CAR 19-T细胞和CAR19.IL-24-T细胞制备
(1)采集正常人志愿者外周血密度梯度离心分离单个核细胞(PBMC)，然后负向分选获得总T细胞(PanT细胞)，使用CD3/28磁珠刺激并添加IL-2进行体外扩增。
(2)CAR 19和CAR19.IL-24慢病毒分别转导经CD3/28磁珠刺激24小时的PanT细胞，制备CAR19-T细胞和表达重组CAR19.IL-24基因的增强型CART细胞。
5 CAR19.IL-24-T细胞的检测
CAR表达水平检测
见图2，CAR19箭头指示的是CAR19蛋白的位置，IL24箭头指示的是IL24蛋白位置。结合蛋白Marker：26616(ThermoFisher)指示，提示细胞内表达的CAR19，CAR19-IL24 与预期的CAR19蛋白和IL24蛋白大小相符。
见图3，使用慢病毒载体LV-CAR19-IL24转导T细胞后，其携带的GFP将在细胞内表达。左图为明场图像，右图为同一视野下的荧光图像。提示慢病毒载体LV-CAR19-IL24 转导的T细胞表达GFP，指示病毒转导的成功和CAR19-IL24的表达。
见图4，使用慢病毒载体LV-CAR19，LV-CAR19-IL24转导T细胞后，其携带的CAR19分子将在T细胞表面表达。利用APC偶联的抗体检测CAR19分子，图中的M1区为明显的阳性信号，提示CAR19分子在T细胞表面有较高的表达水平，左图提示慢病毒载体 LV-CAR19转导后有55.96％的T细胞表达CAR19分子，右图提示LV-CAR19-IL24转导后有63.8％的T细胞表达CAR19分子。
6 CAR19.IL-24-T细胞的功能检测
细胞毒性检测
图5显示，当E:T的细胞比例为5-8时，CAR19-IL24-T细胞和CAR19-T细胞均能显示促靶细胞凋亡的效果，更重要的是，CAR19-IL24-T的促凋亡效果较CAR19-T明显更好。
SEQUENCE LISTING
<110> 中南大学
<120> 一种重组CAR19-IL24基因、慢病毒载体、CAR19-IL24-T细胞及应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2947
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gatcgccacc atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc 60
attcctcctg atcccagaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct 120
gggagacaga gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg 180
gtatcagcag aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca 240
ctcaggagtc ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat 300
tagcaacctg gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc 360
gtacacgttc ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa 420
gcccggatct ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg 480
cctggtggcg ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc 540
cgactatggt gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt 600
aatatggggt agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat 660
caaggacaac tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac 720
agccatttac tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg 780
gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc agcggccgca attgaagtta tgtatcctcc 840
tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct 900
ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg 960
gggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag 1020
gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg 1080
gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc 1140
cagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct 1200
ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg 1260
ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa 1320
tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg 1380
ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac 1440
ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctat gagggcagag gaagtctgct 1500
aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg cccaccgggt atgaattttc aacagaggct 1560
gcaaagcctg tggactttag ccagcagacc cttctgccct cctttgctgg cgacagcctc 1620
tcaaatgcag atggttgtgc tcccttgcct gggttttacc ctgcttctct ggagccaggt 1680
atcaggggcc cagggccaag aattccactt tgggccctgc caagtgaagg gggttgttcc 1740
ccagaaactg tgggaagcct tctgggctgt gaaagacact atgcaagctc aggataacat 1800
cacgagtgcc cggctgctgc agcaggaggt tctgcagaac gtctcggatg ctgagagctg 1860
ttaccttgtc cacaccctgc tggagttcta cttgaaaact gttttcaaaa actaccacaa 1920
tagaacagtt gaagtcagga ctctgaagtc attctctact ctggccaaca actttgttct 1980
catcgtgtca caactgcaac ccagtcaaga aaatgagatg ttttccatca gagacagtgc 2040
acacaggcgg tttctgctat tccggagagc attcaaacag ttggacgtag aagcagctct 2100
gaccaaagcc cttggggaag tggacattct tctgacctgg atgcagaaat tctacaagct 2160
cgagggcaga ggaagtctgc taacatgcgg tgacgtcgag gagaatcctg gcccaccggt 2220
cgccaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga 2280
gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc 2340
cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg 2400
gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca 2460
catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac 2520
catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga 2580
caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct 2640
ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca 2700
gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca 2760
gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga 2820
caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca 2880
catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta 2940
caagtaa 2947
<210> 2
<211> 9594
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agcttaatgt agtcttatgc aatactcttg tagtcttgca acatggtaac gatgagttag 60
caacatgcct tacaaggaga gaaaaagcac cgtgcatgcc gattggtgga agtaaggtgg 120
tacgatcgtg ccttattagg aaggcaacag acgggtctga catggattgg acgaaccact 180
gaattgccgc attgcagaga tattgtattt aagtgcctag ctcgatacat aaacgggtct 240
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 300
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 360
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 420
gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 480
ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 540
ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 600
ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 660
aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 720
tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 780
caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 840
aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 900
aaagtaagac caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg 960
agggacaatt ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga 1020
gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata 1080
ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcctcaatg 1140
acgctgacgg tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg 1200
ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag 1260
ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt 1320
tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt 1380
aataaatctc tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt 1440
aacaattaca caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag 1500
aatgaacaag aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata 1560
acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 1620
agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta 1680
tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa 1740
gaaggtggag agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc tcgacggtat 1800
cggttaactt ttaaaagaaa aggggggatt ggggggtaca gtgcagggga aagaatagta 1860
gacataatag caacagacat acaaactaaa gaattacaaa aacaaattac aaaaattcaa 1920
aattttatcg atcacgagac tagcctcgag aagcttgata tcgaattcca cggggttggg 1980
gttgcgcctt ttccaaggca gccctgggtt tgcgcaggga cgcggctgct ctgggcgtgg 2040
ttccgggaaa cgcagcggcg ccgaccctgg gtctcgcaca ttcttcacgt ccgttcgcag 2100
cgtcacccgg atcttcgccg ctacccttgt gggccccccg gcgacgcttc ctgctccgcc 2160
cctaagtcgg gaaggttcct tgcggttcgc ggcgtgccgg acgtgacaaa cggaagccgc 2220
acgtctcact agtaccctcg cagacggaca gcgccaggga gcaatggcag cgcgccgacc 2280
gcgatgggct gtggccaata gcggctgctc agcagggcgc gccgagagca gcggccggga 2340
aggggcggtg cgggaggcgg ggtgtggggc ggtagtgtgg gccctgttcc tgcccgcgcg 2400
gtgttccgca ttctgcaagc ctccggagcg cacgtcggca gtcggctccc tcgttgaccg 2460
aatcaccgac ctctctcccc agggggatcg ccaccatgct tctcctggtg acaagccttc 2520
tgctctgtga gttaccacac ccagcattcc tcctgatccc agacatccag atgacacaga 2580
ctacatcctc cctgtctgcc tctctgggag acagagtcac catcagttgc agggcaagtc 2640
aggacattag taaatattta aattggtatc agcagaaacc agatggaact gttaaactcc 2700
tgatctacca tacatcaaga ttacactcag gagtcccatc aaggttcagt ggcagtgggt 2760
ctggaacaga ttattctctc accattagca acctggagca agaagatatt gccacttact 2820
tttgccaaca gggtaatacg cttccgtaca cgttcggagg ggggactaag ttggaaataa 2880
caggctccac ctctggatcc ggcaagcccg gatctggcga gggatccacc aagggcgagg 2940
tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg tccgtcacat 3000
gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc cagcctccac 3060
gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac tataattcag 3120
ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt ttcttaaaaa 3180
tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat tattactacg 3240
gtggtagcta tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcagcgg 3300
ccgcaattga agttatgtat cctcctcctt acctagacaa tgagaagagc aatggaacca 3360
ttatccatgt gaaagggaaa cacctttgtc caagtcccct atttcccgga ccttctaagc 3420
ccttttgggt gctggtggtg gttgggggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag 3480
tggcctttat tattttctgg gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactaca 3540
tgaacatgac tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac 3600
cacgcgactt cgcagcctat cgctccagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg 3660
cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt 3720
acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga 3780
agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca 3840
gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg 3900
gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc 3960
gctatgaggg cagaggaagt ctgctaacat gcggtgacgt cgaggagaat cctggcccac 4020
cgggtatgaa ttttcaacag aggctgcaaa gcctgtggac tttagccagc agacccttct 4080
gccctccttt gctggcgaca gcctctcaaa tgcagatggt tgtgctccct tgcctgggtt 4140
ttaccctgct tctctggagc caggtatcag gggcccaggg ccaagaattc cactttgggc 4200
cctgccaagt gaagggggtt gttccccaga aactgtggga agccttctgg gctgtgaaag 4260
acactatgca agctcaggat aacatcacga gtgcccggct gctgcagcag gaggttctgc 4320
agaacgtctc ggatgctgag agctgttacc ttgtccacac cctgctggag ttctacttga 4380
aaactgtttt caaaaactac cacaatagaa cagttgaagt caggactctg aagtcattct 4440
ctactctggc caacaacttt gttctcatcg tgtcacaact gcaacccagt caagaaaatg 4500
agatgttttc catcagagac agtgcacaca ggcggtttct gctattccgg agagcattca 4560
aacagttgga cgtagaagca gctctgacca aagcccttgg ggaagtggac attcttctga 4620
cctggatgca gaaattctac aagctcgagg gcagaggaag tctgctaaca tgcggtgacg 4680
tcgaggagaa tcctggccca ccggtcgcca ccatggtgag caagggcgag gagctgttca 4740
ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg 4800
tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca 4860
ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc 4920
agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc 4980
ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc 5040
gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg 5100
acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca 5160
acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc 5220
acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg 5280
gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca 5340
aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga 5400
tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aaagcggccg cgtcgacaat caacctctgg 5460
attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat 5520
gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt 5580
tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca 5640
ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg 5700
ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg 5760
aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca 5820
attccgtggt gttgtcgggg aagctgacgt cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca 5880
cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc 5940
ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc 6000
agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct ccccgcctgg aattcgagct cggtaccttt 6060
aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg 6120
actggaaggg ctaattcact cccaacgaag acaagatctg ctttttgctt gtactgggtc 6180
tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct 6240
taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga 6300
ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtag 6360
tagttcatgt catcttatta ttcagtattt ataacttgca aagaaatgaa tatcagagag 6420
tgagaggaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 6480
tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 6540
tgtatcttat catgtctggc tctagctatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat 6600
tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc 6660
tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcgtcgag 6720
acgtacccaa ttcgccctat agtgagtcgt attacgcgcg ctcactggcc gtcgttttac 6780
aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc 6840
ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc 6900
gcagcctgaa tggcgaatgg cgcgacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg 6960
tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg 7020
ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg 7080
ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt 7140
agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt 7200
tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta 7260
tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa 7320
atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt 7380
cccaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 7440
acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg 7500
aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc 7560
attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga 7620
tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga 7680
gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg 7740
cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc 7800
tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac 7860
agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact 7920
tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca 7980
tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg 8040
tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact 8100
acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg 8160
accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg 8220
tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat 8280
cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc 8340
tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat 8400
actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt 8460
tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 8520
cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 8580
gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 8640
tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt 8700
gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 8760
gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 8820
ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 8880
acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 8940
agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 9000
cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 9060
tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 9120
gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc 9180
ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc 9240
ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag 9300
cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca 9360
ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat 9420
taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg 9480
tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaccatga 9540
ttacgccaag cgcgcaatta accctcacta aagggaacaa aagctggagc tgca 9594
Claims (3)
1. 一种重组CAR19-IL24基因，其特征在于，所述重组CAR19-IL24基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 一种慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体携带权利要求1所述的重组CAR19-IL24基因，所述慢病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种表达重组CAR19-IL24基因的T细胞，其特征在于，所述表达重组CAR19-IL24基因的T细胞由权利要求2所述的慢病毒载体转导至T细胞中制备而成。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210613661.6A CN116479022A (zh) | 2018-12-12 | 2018-12-12 | 一种重组car19-il24基因、慢病毒载体、car19-il24-t细胞及应用 |
| CN201811517078.5A CN109735558B (zh) | 2018-12-12 | 2018-12-12 | 一种重组car19-il24基因、慢病毒载体、car19-il24-t细胞及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811517078.5A CN109735558B (zh) | 2018-12-12 | 2018-12-12 | 一种重组car19-il24基因、慢病毒载体、car19-il24-t细胞及应用 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210613661.6A Division CN116479022A (zh) | 2018-12-12 | 2018-12-12 | 一种重组car19-il24基因、慢病毒载体、car19-il24-t细胞及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109735558A CN109735558A (zh) | 2019-05-10 |
| CN109735558B true CN109735558B (zh) | 2022-04-15 |
Family
ID=66358786
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210613661.6A Pending CN116479022A (zh) | 2018-12-12 | 2018-12-12 | 一种重组car19-il24基因、慢病毒载体、car19-il24-t细胞及应用 |
| CN201811517078.5A Active CN109735558B (zh) | 2018-12-12 | 2018-12-12 | 一种重组car19-il24基因、慢病毒载体、car19-il24-t细胞及应用 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210613661.6A Pending CN116479022A (zh) | 2018-12-12 | 2018-12-12 | 一种重组car19-il24基因、慢病毒载体、car19-il24-t细胞及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN116479022A (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111423517B (zh) * | 2020-04-15 | 2023-05-12 | 赛德特生物制药有限公司 | 一种肿瘤细胞干性限制型car及其应用 |
Citations (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107995913A (zh) * | 2015-05-18 | 2018-05-04 | T细胞受体治疗公司 | 使用融合蛋白对tcr重编程的组合物和方法 |
| CN108218999A (zh) * | 2018-01-02 | 2018-06-29 | 广东省人民医院(广东省医学科学院) | 分泌il-7的嵌合抗原受体、病毒载体、表达细胞及制备方法与药物 |
| CN108220247A (zh) * | 2018-03-20 | 2018-06-29 | 杭州史迪姆生物科技有限公司 | 一种双car-t细胞及其制备方法和应用 |
| CN108948182A (zh) * | 2018-07-25 | 2018-12-07 | 中国人民解放军第四军医大学 | Tigit-ecd重组蛋白抗同种异体免疫排斥反应的应用 |
| CN109957546A (zh) * | 2017-12-25 | 2019-07-02 | 深圳宾德生物技术有限公司 | 一种靶向cd317的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 |
| CN109957547A (zh) * | 2017-12-25 | 2019-07-02 | 深圳宾德生物技术有限公司 | 一种靶向cd317的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 |
| CN109988242A (zh) * | 2018-01-02 | 2019-07-09 | 武汉波睿达生物科技有限公司 | 联合嵌合抗原受体、表达载体、慢病毒及t细胞 |
| WO2019139888A1 (en) * | 2018-01-09 | 2019-07-18 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. | Compositions and methods for targeting clec12a-expressing cancers |
| CN111051502A (zh) * | 2017-09-06 | 2020-04-21 | 亘喜生物科技（上海）有限公司 | 通用型嵌合抗原受体t细胞制备技术 |
| CN111542601A (zh) * | 2017-11-08 | 2020-08-14 | 国立大学法人鹿儿岛大学 | 确保安全并且能够有效地治疗甚至转移性癌症的、具有提供装载的免疫诱导基因的最佳表达水平的表达控制系统的肿瘤溶解性病毒(肿瘤溶解性免疫治疗) |
| CN111566124A (zh) * | 2017-10-25 | 2020-08-21 | 诺华股份有限公司 | 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法 |
| WO2020219425A1 (en) * | 2019-04-25 | 2020-10-29 | Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) | Combinatorial car t cell and hematopoeitic stem cell genetic engineering for specific immunotherapy of myeloid leukemias |
| WO2020223327A1 (en) * | 2019-04-30 | 2020-11-05 | Atara Biotherapeutics, Inc. | Antigen specific cd19-targeted car-t cells |
| CN112210539A (zh) * | 2020-10-12 | 2021-01-12 | 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 | 一种第四代car-t细胞及其应用 |
| KR102311895B1 (ko) * | 2020-06-12 | 2021-10-14 | 주식회사 젠셀메드 | 재표적화를 위한 변형된 당단백질 gH를 가지는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 그 용도 |
Family Cites Families (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090180989A1 (en) * | 2005-10-05 | 2009-07-16 | Synageva Biopharma Corp. | Compositions and methods for delivering nucleotide sequences to vertebrates |
| TWI496790B (zh) * | 2006-09-08 | 2015-08-21 | 艾伯維巴哈馬有限公司 | 介白素-１３結合蛋白質 |
| AU2012240135B2 (en) * | 2011-04-08 | 2016-09-08 | Baylor College Of Medicine | Reversing the effects of the tumor microenvironment using chimeric cytokine receptors |
| SG11201404769UA (en) * | 2012-02-22 | 2014-11-27 | Univ Pennsylvania | Use of icos-based cars to enhance antitumor activity and car persistence |
| CN105418765B (zh) * | 2014-08-26 | 2019-09-06 | 西比曼生物科技（上海）有限公司 | Cd19靶向性的嵌合抗原受体和nkt细胞及其制法和应用 |
| CN108289912A (zh) * | 2015-09-01 | 2018-07-17 | 先天肿瘤免疫公司 | 具有提高的免疫力或免疫抑制性细胞因子抗性的免疫细胞及其用途 |
| KR102674362B1 (ko) * | 2015-09-08 | 2024-06-13 | 신라젠(주) | 사이토카인 및 카르복실에스테라제를 발현하는 변형된 종양용해성 백시니아 바이러스 및 이의 사용 방법 |
| WO2017069958A2 (en) * | 2015-10-09 | 2017-04-27 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Modulation of novel immune checkpoint targets |
| CN108884159A (zh) * | 2015-11-07 | 2018-11-23 | 茂体外尔公司 | 用于癌症治疗的包含肿瘤抑制基因治疗和免疫检查点阻断的组合物 |
| KR20180101417A (ko) * | 2016-01-11 | 2018-09-12 | 아르모 바이오사이언시스 인코포레이티드 | 항원-특이적 cd8+ t 세포의 제조에서 인터루킨-10 및 이의 사용 방법 |
| US10201592B2 (en) * | 2016-06-07 | 2019-02-12 | The Pacific Heart, Lung, & Blood Institute | Compositions and methods for treating mesothelioma post-surgery |
| KR20240111740A (ko) * | 2016-06-08 | 2024-07-17 | 프레시전 인코포레이티드 | Cd33 특이적 키메라 항원 수용체 |
| WO2018156711A1 (en) * | 2017-02-22 | 2018-08-30 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Il13ra2-binding chimeric antigen receptors |
| JP7341900B2 (ja) * | 2017-03-03 | 2023-09-11 | オブシディアン セラピューティクス， インコーポレイテッド | 免疫療法のためのｃｄ１９組成物及び方法 |
| JP2020511528A (ja) * | 2017-03-03 | 2020-04-16 | オブシディアン セラピューティクス， インコーポレイテッド | 免疫療法のための組成物及び方法 |
| CN107058234B (zh) * | 2017-05-12 | 2019-09-13 | 常州市第一人民医院 | Car.il-33-t及其制备与应用 |
| US20220002384A1 (en) * | 2017-06-16 | 2022-01-06 | Protelica, Inc. | Fibronectin binding domain chimeric antigen receptors and methods of use thereof |
| CN107805627B (zh) * | 2017-09-28 | 2020-11-06 | 中南大学 | 特异性示踪内皮细胞分化的hESC指示细胞系的构建方法 |
| CN107827991B (zh) * | 2017-11-20 | 2020-10-09 | 英普乐孚生物技术(上海)有限公司 | 靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞及其应用 |
| CN108276497A (zh) * | 2018-01-26 | 2018-07-13 | 英普乐孚生物技术(上海)有限公司 | 靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞及其应用 |
| CN108383914A (zh) * | 2018-02-23 | 2018-08-10 | 北京美康基免生物科技有限公司 | 一种基于cd19的嵌合抗原受体及其应用 |
| CN108396060A (zh) * | 2018-03-09 | 2018-08-14 | 中南大学 | 基于实时荧光定量pcr技术的脊肌萎缩症致病基因smn1拷贝数检测试剂盒及方法 |
| JP2022516389A (ja) * | 2018-05-31 | 2022-02-28 | ワシントン・ユニバーシティ | 血液悪性腫瘍を治療するためのゲノム編集インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞 |
| EP3802578A4 (en) * | 2018-06-01 | 2022-03-23 | Washington University | SUPPRESSION OF CYTOKINE RELEASE SYNDROME IN CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR CELL THERAPY |
| CN112533943B (zh) * | 2018-06-01 | 2024-03-05 | 利兰斯坦福初级大学董事会 | Il-13/il-4超级因子：免疫细胞靶向性构建体及其使用方法 |
| MX2021006399A (es) * | 2018-11-30 | 2021-07-15 | Windmil Therapeutics Inc | Linfocitos infiltrantes de medula osea (mils) que expresan receptores de antigenos quimericos (car), metodo de fabricacion de los mismos y metodo de uso en terapia. |
| EP4031168A4 (en) * | 2019-09-18 | 2023-10-11 | Intergalactic Therapeutics, Inc. | SYNTHETIC DNA VECTORS AND METHODS OF USE |
| CN111423517B (zh) * | 2020-04-15 | 2023-05-12 | 赛德特生物制药有限公司 | 一种肿瘤细胞干性限制型car及其应用 |
| CN112522208A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-03-19 | 赜誉(上海)生物科技有限公司 | 一种转基因肿瘤浸润淋巴细胞及其用途 |
-
2018
- 2018-12-12 CN CN202210613661.6A patent/CN116479022A/zh active Pending
- 2018-12-12 CN CN201811517078.5A patent/CN109735558B/zh active Active
Patent Citations (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107995913A (zh) * | 2015-05-18 | 2018-05-04 | T细胞受体治疗公司 | 使用融合蛋白对tcr重编程的组合物和方法 |
| CN111051502A (zh) * | 2017-09-06 | 2020-04-21 | 亘喜生物科技（上海）有限公司 | 通用型嵌合抗原受体t细胞制备技术 |
| CN111566124A (zh) * | 2017-10-25 | 2020-08-21 | 诺华股份有限公司 | 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法 |
| CN111542601A (zh) * | 2017-11-08 | 2020-08-14 | 国立大学法人鹿儿岛大学 | 确保安全并且能够有效地治疗甚至转移性癌症的、具有提供装载的免疫诱导基因的最佳表达水平的表达控制系统的肿瘤溶解性病毒(肿瘤溶解性免疫治疗) |
| CN109957546A (zh) * | 2017-12-25 | 2019-07-02 | 深圳宾德生物技术有限公司 | 一种靶向cd317的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 |
| CN109957547A (zh) * | 2017-12-25 | 2019-07-02 | 深圳宾德生物技术有限公司 | 一种靶向cd317的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 |
| CN109988242A (zh) * | 2018-01-02 | 2019-07-09 | 武汉波睿达生物科技有限公司 | 联合嵌合抗原受体、表达载体、慢病毒及t细胞 |
| CN108218999A (zh) * | 2018-01-02 | 2018-06-29 | 广东省人民医院(广东省医学科学院) | 分泌il-7的嵌合抗原受体、病毒载体、表达细胞及制备方法与药物 |
| WO2019139888A1 (en) * | 2018-01-09 | 2019-07-18 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. | Compositions and methods for targeting clec12a-expressing cancers |
| CN108220247A (zh) * | 2018-03-20 | 2018-06-29 | 杭州史迪姆生物科技有限公司 | 一种双car-t细胞及其制备方法和应用 |
| CN108948182A (zh) * | 2018-07-25 | 2018-12-07 | 中国人民解放军第四军医大学 | Tigit-ecd重组蛋白抗同种异体免疫排斥反应的应用 |
| WO2020219425A1 (en) * | 2019-04-25 | 2020-10-29 | Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) | Combinatorial car t cell and hematopoeitic stem cell genetic engineering for specific immunotherapy of myeloid leukemias |
| WO2020223327A1 (en) * | 2019-04-30 | 2020-11-05 | Atara Biotherapeutics, Inc. | Antigen specific cd19-targeted car-t cells |
| KR102311895B1 (ko) * | 2020-06-12 | 2021-10-14 | 주식회사 젠셀메드 | 재표적화를 위한 변형된 당단백질 gH를 가지는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 그 용도 |
| CN112210539A (zh) * | 2020-10-12 | 2021-01-12 | 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 | 一种第四代car-t细胞及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| "Engineering T Cells to Express Tumoricidal MDA-7/IL24 Enhances Cancer Immunotherapy";Zheng Liu等;《TUMOR BIOLOGY AND IMMUNOLOGY》;20210501;第2429-2441页 * |
| "Interleukin-24 Regulates T Cell Activity in Patients With Colorectal Adenocarcinoma";Yang Zhang等;《Frontiers in Oncology》;20191210;第9卷(第1401期);第1-13页 * |
| "带有IL-24的腺病毒扩增及其在小鼠树突状细胞中的表达";许云树等;《四川生理科学杂志》;20130924;第35卷(第3期);第99-102页 * |
| "白细胞介素24抗肿瘤及免疫调节作用的研究进展";米运强等;《河北北方学院学报（自然科学版）》;20210108;第37卷(第2期);第54-59页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116479022A (zh) | 2023-07-25 |
| CN109735558A (zh) | 2019-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2020201190B2 (en) | Compositions useful in treatment of ornithine transcarbamylase (OTC) deficiency | |
| CN110650975B (zh) | 双顺反子嵌合抗原受体及其用途 | |
| KR101258949B1 (ko) | 활성형 재조합 혈액응고 9인자의 대량생산 방법 | |
| KR102662049B1 (ko) | 암 치료용 보체 불활성화 내성의 외피 바이러스 | |
| KR20220066914A (ko) | 부정맥 유발성 우심실 심근병증의 유전자 요법 조성물 및 치료 | |
| CN112680466B (zh) | 一种表达人源ace2的动物模型及其用途 | |
| CN112522271B (zh) | 一种sgRNA及其应用 | |
| CN110438053B (zh) | 一种适用于聚球藻的生物封存系统、构建方法及应用 | |
| CN112877351A (zh) | 一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其应用 | |
| CN114107390B (zh) | 一种用于表达抗体IgG1的rAAV载体及其应用 | |
| KR101885438B1 (ko) | 유전자치료 벡터시스템 및 전구약물 유전자 | |
| KR102673828B1 (ko) | off-the-shelf 줄기세포 및 면역세포, 이를 포함하는 약학적 조성물 | |
| CN109735558B (zh) | 一种重组car19-il24基因、慢病毒载体、car19-il24-t细胞及应用 | |
| CN110184292B (zh) | 一种利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性Infliximab Fab片段的方法 | |
| CN104403998A (zh) | 一种用于表皮损伤修复的改良式脂肪干细胞 | |
| CN112301058B (zh) | 一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用 | |
| CN115161294B (zh) | 新城疫疫苗株及其构建方法、禽类免疫识别方法、应用 | |
| CN110225977B (zh) | 基因治疗载体系统和药物前体基因 | |
| CN110679606B (zh) | dsRNA及其在防治埃及伊蚊中的应用 | |
| CN110938648B (zh) | 一种真菌分泌表达载体、构建方法及其应用 | |
| CN111088204A (zh) | 表达Caspase-3重组scFv78的重组大肠杆菌及其功能验证方法 | |
| CN112342228B (zh) | 表达抗vegf融合蛋白的aav病毒载体及其应用 | |
| CN112301057B (zh) | 一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用 | |
| US20020103144A1 (en) | Retroviral gene transfer vectors | |
| CN109872774A (zh) | 一种基于yess分析原核生物中蛋白相互作用的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |