NO20110980L

NO20110980L - Benzotiazolavledede forbindelser, preparater og anvendelser

Info

Publication number: NO20110980L
Application number: NO20110980A
Authority: NO
Inventors: Chester A Mathis Jr; Yanming Wang; William E Klunk
Original assignee: Univ Pittsburgh
Priority date: 2003-03-14
Filing date: 2011-07-06
Publication date: 2005-12-13
Also published as: AU2004221897A2; CN102532055A; JP2006522104A; AU2011200667A1; NO2015005I2; PT1611115E; NO20054674L; PL1611115T3; CN102532055B; AU2004221897A1; NO20054674D0; CY1113334T1; ES2393921T3; RU2440995C2; BRPI0408274B1; CN1784392A; HK1086270A1; DK1611115T3; NO330861B1; JP4875487B2

Abstract

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer forbindelser som er benzotiazolderivater, sammensetninger som omfatter slike forbindelser, fremgangsmåter for fremstilling av slike forbindelser og fremgangsmåter for anvendelse av slike forbindelser for påvisning av amyloide avleiringer og for diagnose av en sykdom, lidelse eller tilstand som særpreges ved amyloide avleiringer. Forbindelsene finner spesiell anvendelse i diagnose og behandling av pasienter med sykdommer hvori akkumulering av nevrittiske plakk opptrer. Sykdomstilstandene eller syndromene omfatter, men er ikke begrenset til, 10 Alzheimers sykdom, familiær Alzheimers sykdom, Downs syndrom og homozygoti forapolipoprotein E4-allelelt.

Description

BEN ZO TIAZOLAVLEDEDE FORBINDELSER, PREPARATER OG

ANVENDELSER

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Den foreliggende oppfinnelsen gjelder tioflavinforbindelser og spesifikke derivater som er egnede for synliggjøring av amyloide avleiringer i levende pasienter. Nærmere bestemt gjelder den foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte for synliggjøring av amyloide avleiringer i hjernen in vivo for antemortem diagnose av Alzheimers sykdom med tioflavinderivater. Den foreliggende oppfinnelsen gjelder også terapeutiske anvendelser av slike forbindelser.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Alzheimers sykdom ("AD") er en nevrodegenerativ sykdom som særpreges ved hukommelsestap og andre kognitive mangler. McKhann et al, Neurology 34: 939

(1984). Sykdommen er den vanligste årsaken til demens i USA. AD kan ramme personer i alder av ned til 40-50 år, men siden nærværet av sykdommen er vanskelig å bestemme uten farlig hjernebiopsi, er tidspunktet for sykdommens begynnelse ukjent. Forekomsten av AD øker med alderen, med estimater av den rammede befolkningen på opptil 40-50% i alderen 85-90 år. Evans et al, JAMA 262: 2551 (1989; Katzman, Neurology 43: 13 (1993).

Undersøkelser antyder at avleiring av amyloid i hjernen er en tidlig, forårsakende begivenhet i patogenesen for Alzheimers sykdom (AD). Utviklingen av amyloide avleiringer fører til dannelsen av nevrittiske plakk og nevrofibrillære bunter i områder i hjernen som deltar i læring og hukommelse. En typisk Alzheimers nevrittisk plakk omfatter dystrofiske nevritter som omgir en kjerne av amyloid materiale. Hovedbestanddelen i den amyloide kjernen er et protein som kalles amyloid-beta (Ap).

I praksis oppnås en definitiv AD-diagnose ved undersøkelse av hjernevev, vanligvis ved autopsi. Khachaturian, Arch. Neurol. 42: 1097 (1985); McKhann et al, Neurology 34: 939 (1984). Nevropatologisk særpreges sykdommen ved forekomsten av nevrittiske plakk (NP), nevrofibrillære bunter (NFT) og nevrontap, sammen med en rekke forskjellige andre funn. Mann, Mech. Ageing Dev. 31: 213 (1985). Post-mortem snitt av hjernevev fra pasienter med Alzheimers sykdom viser nærvær av amyloid i form av proteinholdige, ekstracellulære kjerner i de nevrittiske plakk som særpreger AD.

De amyloide kjernene i disse nevrittiske plakkene består av et protein som kalles P-amyloid (Ap), og som hovedsakelig er arrangert i en betaplatekonfigurasjon. Mori et al, Journal of Biological Chemistry 267: 17082 (1992); Kirschner et al, PNAS 83: 503 (1985). Nevrittiske plakk er et tidlig og ikke variabelt aspekt ved sykdommen. Mann et al, J. Neurol. Sei. 89: 169; Mann, Mech. Ageing Dev. 31:213

(1985); Terry et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol 46: 262 (1987).

Den innledende deponeringen av Ap opptrer trolig lenge før kliniske symptomer kan merkes. Det i dag anbefalte "minimale mikroskopiske kriterium" for diagnosen av AD bygger på antallet nevrittiske plakk som forefinnes i hjernen. Khachaturian, Arch. Neurol., supra (1985). En vurdering av antallet nevrittiske plakk må imidlertid vente til etter døden.

Amyloidholdige nevrittiske plakk er et fremtredende trekk ved utvalgte områder i hjernen ved AD, så vel som ved Downs syndrom og hos personer som er homozygote for apolipoprotein E4-allelet og som svært sannsynligvis vil utvikle AD. Corder et al., Science 261: 921 (1993); Divry, P., J. Neurol. Psych. 27: 643-657 (1927); Wisniewski et al, i Zimmerman, H.M. (red.): PROGRESS IN NEUROPATHOLOGY (Grune og Stratton, N.Y. 1973) sidene 1-26.

Amyloid i hjernen påvises lett ved å farge hjernesnitt med tioflavin S eller kongorødt. Puchtler et al., J. Histochem. Cytochem. 10: 35 (1962). Amyloid farget med kongorødt særpreges ved et dikroisk utseende og viser en gulgrønn polariseringsfarge. Den dikroiske bindingen er en følge av betaplatestrukturen til amyloidproteinene. Glenner, G. N. Eng. J. Med. 302: 1283 (1980). En detaljert diskusjon vedrørende biokjemien og histokjemien til amyloid kan finnes i Glenner, N. Eng. J. Med., 302: 1333 (1980).

Til nå har diagnose av AD hovedsakelig blitt oppnådd ved evaluering av kliniske kriterier, hjernebiopsier og post mortem vevsundersøkelser. Forskningsretninger for utvikling av fremgangsmåter for diagnose av Alzheimers sykdom in vivo omfatter (1) genetisk analyse, (2) immunoanalysefremgangsmåter og (3) bildedanningsteknikker.

Bevis for at unormaliteter i Ap-metabolismen er nødvendige og tilstrekkelige for utvikling av AD bygger på oppdagelsen av punktmutasjoner i Ap-forløperproteinet hos flere sjeldne familier med en autosomal dominant form av AD. Hardy, Nature Genetics 1: 233 (1992); Hardy et al., Science 256: 184 (1992). Disse mutasjonene opptrer nær de N- og C-terminale kløyvingspunktene som er nødvendige for dannelse av Ap fra forløperproteinet. St. George-Hyslop et al., Science 235: 885

(1987); Kang et al., Nature 325: 733 (1987); Potter WO 92/17152. Genetisk analyse av et stort antall AD-familier har imidlertid vist at AD er en genetisk heterogen sykdom. St. George-Hyslop et al., Nature 347: 194 (1990). Kobling til kromosom 21-markører er kun vist i noen familier med tidlig utvikling av AD, og ikke i familier med sen utvikling av AD. Senere har et gen på kromosom 14 hvis produkt kan forutsies å inneholde flere transmembrane domener og som ligner et integrert membranprotein blitt påvist av Sherrington et al, Nature 375: 754-760 (1995). Dette genet kan være ansvarlig for opptil 70% av tilfellene av autosomal dominant AD med tidlig utvikling. Foreløpige resultater antyder at denne kromosom 14-mutasjonen fører til økt produksjon av Ap. Scheuner et al, Soc. Neurosci. Abstr. 21: 1500 (1995). En mutasjon i et svært likt gen har blitt påvist på kromosom 1 i etterkommere av Volgatyskere med tidlig utvikling av AD. Levy-Lahad et al, Science 269: 973-977 (1995).

Analyse av apolipoprotein E-genotypen har blitt foreslått som en hjelp ved diagnose av AD. Scott, Nature 366: 502 (1993); Roses, Ann. Neurol. 38: 6-14 (1995). Imidlertid opptrer problemer med denne teknologien, siden apolipoprotein E4-allelelt kun er en risikofaktor for AD, og ingen sykdomsmarkør. Allelet er fraværende i mange AD-pasienter og foreligger i mange eldre personer uten demens. Bird, Ann. Neurol. 38: 2-4 (1995).

Immunoanalysefremgangsmåter er blitt utviklet for påvisning av nærværet av nevrokjemiske markører i AD-pasienter og for påvisning av et AD-forbundet amyloidprotein i cerebral spinalvæske. Warner, Anal. Chem. 59: 1203A (1987); internasjonalt patent nr. 92/17152 av Potter; Glenner et al, U.S. patent nr. 4,666,829. Det har ikke blitt bevist at disse fremgangsmåtene for diagnose av AD kan påvise AD i alle pasienter, særlig ikke i tidlige stadier av sykdommen, og fremgangsmåtene er relativt invasive, idet de krever tapping av spinalvæske. Videre har det blitt gjort forsøk på å utvikle monoklonale antistoffer som prober for synliggjøring av Ap. Majocha et al, J. Nucl Med., 33: 2184 (1992), Majocha et al, WO 89/06242 og Majocha et al, U.S. patent 5,231,000. Hovedulempen med antistoffprober er problemet med å få disse store molekylene gjennom blodhjernebarrieren. Anvendelse av antistoffer for in vivo diagnose av AD vil kreve markante unormaliteter i blodhjernebarrieren for at antistoffene skal komme inn i hjernen. Det foreligger intet overbevisende funksjonelt bevismateriale for at unormaliteten i blodhjernebarrieren regelmessig opptrer ved AD. Kalaria, Cerebrovascular & Brain Metabolism Reviews 4: 226 (1992).

Radioaktivt merket Ap-peptid har blitt anvendt for merking av plakk av diffus, kompakt og nevrittisk type i snitt av AD-hjerne. Se Maggion et al, WO 93/04194. Disse peptidene har imidlertid alle de samme ulempene som antistoffer har. Nærmere bestemt krysser peptider normalt ikke blodhjernebarrieren i de mengder som er nødvendige for synliggjøring, og siden disse probene reagerer med diffuse plakk, er de ikke nødvendigvis spesifikke for AD.

Nevrittiske plakk og nevrofibrillære bunter er de to mest særpregede patologiske kjennetegnene på AD. Klunk og Abraham, Psychiatric Development, 6: 121-152

(1988). Plakk opptrer tidligst i neocortex og de er relativt jevnt fordelt. Thai et al, Neurology 58: 1791-1800 (2002). Buntene opptrer først i limbiske områder så som den transentorinale cortex og utvikles i et forutsigbart topologisk mønster til neocortex. Braak og Braak, Acta Neuropathologica 82: 239-259 (1991). Arnold et al. kartla fordelingen av NFT og nevrittiske plakk i hjernen hos pasienter med AD. Arnold et al., Cereb. Cortex 1: 103-116 (1991). Sammenlignet med NFT, var nevrittiske plakk generelt mer jevnt fordelt gjennom cortex, bortsett fra merkbart færre nevrittiske plakk i den limbiske periallocortex og allocortex (områdene med høyest NFT-tetthet). Ved tioflavin S-farging hadde de temporale og oksipitale hjernelappene den høyeste tettheten av nevrittiske plakk, limbiske og frontale hjernelapper hadde den laveste og parietallappen lå mellom disse. Arriagada et al, Neurology 42: 1681-1688 (1992). Arriagada et al undersøkte den topografiske fordelingen av patologiske endringer av AD-typen i hjernen hos eldre individer som anslagsvis ikke var demente. Deres observasjoner tyder på at de fleste individer med alder over 55 år har i det minste noen få NFT og plakk. Immunohistokjemisk definert undertyper av SP hadde klare fordelingsmønstere hvor Ap-immunoreaktive plakk forelå i neokortikale områder i mye større grad enn i limbiske områder, og hvor Alz-50-immunoreaktive plakk var sjeldne og begrenset til de områdene som inneholder Alz-50-positive nevroner og NFT. Disse mønstrene antydet felles faktorer i de patologiske prosessene som fører til NFT og SP, både hos eldre og ved

AD.

Det diskuteres fortsatt hvorvidt plakk og bunter er biprodukter fra den nevrodegenerative prosessen som opptrer ved AD eller om de er årsaken til nevronal celledød. Ross, Current Opinion in Neurobiol. 96: 644-650 (1996); Terry, J. ofNeuropath. & Exp. Neurol. 55: 1023-1025 (1996); Terry, 7 Neural Transmission - Suppl. 53: 141-145 (1998). Det er klart vist at det neokortikale og hippokampale synapsetapet korrelerer godt med den premorbide kognitive status. Noen forskere foreslår at oppbryting av mikrotubulis struktur og funksjon grunnet hyperfosforylering av det mikrotubulusassosierte proteinet tau spiller en nøkkelrolle i utviklingen av synapsetap spesielt og AD generelt. Terry, J. of Neuropath. & Exp. Neurol. 55: 1023-1025 (1996); Terry, J of Neural Transmission - Suppl. 53: 141-145 (1998). Oksidative skader og nedbrytning av membraner har blitt foreslått å spille viktige roller i AD. Perry, Free Radical Biology & Medicine 28: 831-834

(2000); Pettegrew et al, Annals of the New York Academy of Sciences 826: 282-306

(1997). Vaskulære faktorer innbefattet subtil, kronisk, cerebral hypoperfusjon, har også blitt foreslått å inngå i patogenesen av AD. De la Torre, Annals of the New York Academy of Sciences 903: 424-436 (2000); Di Iorio et al, Aging ( Milano) 11: 345-352 (1999). Selv om alle disse faktorene sannsynligvis spiller en viss rolle i sykdomsutviklingen av AD, peker stadig mer bevismateriale på unormaliteter i prosesseringen av amyloid-beta (Ap) -peptidet, et peptid på 4 kD som aggregerer i en fibrillær P-platestruktur. Glenner og Wong, Biochemical & Biophysical Research Communications 120: 885-890 (1984). Ap har blitt foreslått å spille en viktig rolle i patogenesen av AD av flere grupper: 1) Ap-avleiringer er de tidligste nevropatologiske markørene på AD i Downs syndrom og kan opptre flere tiår før NFT-dannelse, Mann et al, Neurodegeneration 1: 201-215 (1992); Naslund, et al, JAMA 283: 1571-1577 (2000); 2) p-amyloidose er relativt spesifikk for AD og nært beslektede forstyrrelser; Selkoe, Trends in Neurosciences 16: 403-409 (1993); 3) Ap er toksisk for nevroner i kultur, Yankner Neurobiol. Aging 13: 615-616 (1992); Mattson et al, J. Neuroscience 12: 376-389 (1992); Shearman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 91: 1470-1474 (1994), en toksisitet som tilsynelatende avhenger av den sekundære P-platestrukturen og aggregering til i det minste oligomerer. Lambert et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 95: 6448-6453 (1989); Pike et al, J. Neuroscience 13: 1676-1687 (1993); Simmons et al, Molecular Pharmacology 45: 373-379 (1994). Selv om Ap åpenbart foreligger i en likevekt fordelt mellom monomere, oligomere og fibrillære/plakkfraksjoner, har den oligomere formen av Ap i stor grad blitt implisert som den viktigste nevrotoksiske komponenten. Selkoe, Alzheimer disease, redigert av R.D. Terry, et al, sidene 293-310 Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia (1999); Selkoe, Science 298, 789-91 (2002). Erkjennelsen av de toksiske virkningene av oligomert Ap danner et grunnlag for kompromiss for noen motstandere av "amyloidkaskadehypotesen" for AD. Terry, Ann. Neurol. 49: 684 (2001). Det kanskje sterkeste beviset for at Ap spiller en rolle i sykdomsutviklingen av AD, er det funn at mutasjoner i genet for amyloidforløperproteinet (APP) fører til noen former for familiær AD med tidlig utvikling. Goate et al, Nature 349: 704-706 (1991). I tillegg har alle familiære former av autosomal dominant AD til felles et forhøyet nivå av den raskest aggregerende, 42 aminosyrer lange formen av Ap. Younkin Rinsho Shinkeigaku - Clinical Neurology 37: 1099 (1997). I motsetning til dette, har ingen mutasjoner i tauproteinet blitt vist å gi AD. I stedet er mutasjoner i tau (kromosom 17) koblet til frontotemporal demens med parkinsonisme. Goedert et al, Neuron 21: 955-958

(1998). Nyere bevismateriale har vist en god korrelasjon mellom nivået av Ap i hjernen og den kognitive svekkelse ved AD, og deponering av amyloid ser ut til å være en svært tidlig, kanskje den første, begivenheten ved patogenesen av AD, forut for enhver kognitiv svekkelse. Naslund, et al, JAMA 283: 1571-1577 (2000). Nærvær av Ap kan modulere en rekke biokjemiske reaksjonsveier som fører til deponering av andre proteiner, aktivering av astroglia og mikroglia og til syvende og sist, nevronal celledød og påfølgende kognitiv feilfunksjon.

Det finnes resultater som antyder at amyloidbindende forbindelser vil kunne ha terapeutisk nytte ved AD og type 2 diabetes mellitus. Morfologiske reaksjoner innbefatter reaktiv astrocytose, dystrofiske nevritter, aktiverte mikrogliaceller, synapsetap og full komplementaktivering påvist rundt nevrittiske plakk, tyder alle på at nevrotoksiske og celledegenerative prosesser opptrer i områdene nær disse Ap-avleiringene. Joachim et al, Am. J. Pathol. 135: 309 (1989); Masliah et al, loe. eit. 137: 1293 (1990); Lue og Rogers, Dementia 3: 308 (1992). Ap-indusert nevrotoksisitet og celledegenerering er blitt rapportert i en rekke celletyper in vitro. Yankner et al, Science 250: 279 (1990); Roher et al, BBRC 174: 572 (1991); Frautschy et al, Proe. Nati. Acad. Sei. 88: 83362 (1991); Shearman et al, loe. eit. 91: 1470 (1994). Det har blitt vist at aggregering av Ap-peptidet er nødvendig for in vitro nevrotoksisitet. Yankner, Neurobiol. Aging 13: 615 (1992). Nylig rapporterte tre laboratorier resultater som antyder at kongorødt inhiberer Ap-indusert nevrotoksisitet og celledegenerering in vitro. Burgevin et al, NeuroReport 5: 2429

(1994); Lorenzo og Yankner, Proe. Nati. Acad. Sei. 91: 12243 (1994); Pollack et al, Neuroscience Letters 184: 113 (1995); Pollack et al, Neuroscience Letters 197: 211 (1995). Mekanismen ser ut til å omfatte både inhibering av fibrilldannelse og forebygging av de nevrotoksiske egenskapene til dannede fibriller. Lorenzo og Yankner, Proe. Nati. Acad. Sei. 91: 12243 (1994). Kongorødt har også blitt vist å beskytte øyceller i bukspyttkjertelen mot toksisiteten som skyldes amylin. Lorenzo og Yankner, Proe. Nati. Acad. Sei. 91: 12243 (1994). Amylin er et fibrillært peptid som ligner på Ap og som akkumuleres i bukspyttkjertelen ved type 2 diabetes mellitus.

Det er kjent innen faget at visse azofargestoffer, for eksempel kongorødt, kan være carcinogene. Morgan et al. Environmental Health Perspectives, 102 (supp.) 2: 63-78, (1994). Denne mulige carcinogenisiteten ser ut til hovedsakelig å bygge på det faktum at azofargestoffer i omfattende grad metaboliseres til det frie utgangsaminet av tarmbakterier. Cerniglia et al, Biochem. Biophys. Res. Com., 107: 1224-1229,

(1982). Når det gjelder benzidinfargestoffer (og mange andre substituerte benzidiner), er det det frie aminet som er carcinogent. Disse fakta har liten betydning for undersøkelser vedrørende synliggjøring av amyloid, hvor en ekstremt liten mengde av radioaktivt merket fargestoff med høy spesifikk aktivitet vil injiseres direkte inn i blodstrømmen. I dette tilfellet vil den tilførte mengden være neglisjerbar, og fargestoffet vil ikke omsettes av tarmbakteriene.

Når det gjelder terapeutisk anvendelse, er disse fakta av avgjørende betydning. Frigjøring av et kjent carcinogen fra en terapeutisk forbindelse kan ikke aksepteres. Et andre problem med diazofargestoffmetabolismen er at mye av det tilførte medikamentet metaboliseres av tarmbakterier før det absorberes. Denne reduserte biotilgjengeligheten forblir en ulempe, selv om metabolittene som frigjøres er uskadelige.

Tioflavin T er et basisk fargestoff som først ble beskrevet som et selektivt amyloidfargestoff i 1959 av Vassar og Culling, Arch. Pathol. 68: 487 (1959). Schwartz et al, Zbl Path. 106: 320 (1964) demonstrert først anvendelsen av tioflavin S, et surt fargestoff, som et amyloid fargestoff i 1964. Egenskapene til både tioflavin T og tioflavin S har senere blitt undersøkt i detalj. Kelenyi, J. Histochem. Cytochem. 15: 172 (1967); Burns et al, J. Path. Bact. 94: 337 (1967); Guntern et al, Experientia 48: 8 (1992); LeVine, Meth. Enzymol. 309: 274 (1999). Tioflavin S anvendes hyppig post mortem-undersøkelser av amyloide avleiringer i AD-hjerne hvor det har blitt vist å være en av de mest følsomme teknikkene for påvisning av senile plakk. Vallet et al., Acta Neuropathol. 83: 170 (1992). Tioflavin T har hyppig blitt anvendt som en reagens for å undersøke aggregering av løselige amyloide proteiner til betaplatefibriller. LeVine, Prot. Sei. 2: 404 (1993). Kvaternære aminderivater av tioflavin T er blitt foreslått som midler for synliggjøring av amyloid, selv om intet bevismateriale for at disse midlene kan tas opp i hjernen har blitt presentert. Caprathe et al., U.S. patent nr. 6,001,331.

Siden den innledende deponeringen av amyloid kan opptre lenge før kliniske symptomer på AD kan merkes, vil påvisning og kvantifisering av amyloide avleiringer kunne lette diagnosen av AD i de tidlige, presymptomatiske stadiene. Se U.S. patentnr. 6,417,178. Synliggjøringsteknikker så som for eksempel positronemisjonstomografi (PET) og "single photon emission computed" tomografi (SPECT) er effektive for å følge akkumuleringen av amyloide avleiringer i hjernen og korrelere denne til utviklingen av AD. Anvendelsen av disse teknikkene krever utvikling av radioaktivt merkede ligander som lett kan gå inn i hjernen og selektivt bindes til amyloide avleiringer in vivo.

Vår manglende evne til å anslå amyloid avleiring i AD før etter døden, er en hindring for videre utforsking av denne ødeleggende sykdommen. En f2emgangsmåte for kvantifisering av amyloid avleiring før døden er nødvendig, både som et klinisk verktøy i milde eller klinisk utklare tilfeller, så vel som for måling av virkningen av behandlingsformer rettet mot å forhindre Ap-avleiring. Det er følgelig uhyre viktig å utvikle en sikker og spesifikk fremgangsmåte for diagnose av AD før døden ved synliggjøring av amyloid i hjerneparenchym in vivo. Selv om forskjellige forsøk har blitt gjort på å diagnostisere AD in vivo, foreligger det i dag ingen ante mortem prober for hjerneamyloid. Ingen fremgangsmåte har benyttet en høyaffinitetsprobe for amyloid som har lav toksisitet, kan krysse blodhjernebarrieren og som bindes mer effektivt til AD-hjerne enn til normal hjerne for påvisning av AD-amyloide avleiringer i hjernen før pasienten er død. Således har ingen in vivo fremgangsmåte for AD-diagnose blitt vist å oppfylle disse kriteriene.

Det foreligger et behov for amyloidbindende forbindelser som er ikke-toksiske og som kan krysse blodhjernebarrieren og som følgelig kan anvendes i diagnose. For dette formålet har de foreliggende oppfinnerne vist at forskjellige substitusjoner i forskjellige posisjoner kan øke bindingsaffiniteten, avhengig av substituentens posisjon.

I tillegg har de foreliggende oppfinnerne utviklet en serie av uladede derivater av tioflavin T som amyloidsynliggjørende midler som viser høy affinitet for amyloide avleiringer og høy permeabilitet gjennom blodhjernebarrieren. Omfattende in vitro og in vivo undersøkelser av disse amyloidsynliggjørende midlene tyder på at de spesifikt bindes til amyloide avleiringer i konsentrasjoner som er typiske for hva som oppnås under positronemisjonstomografiundersøkelser. I det sammensatte miljøet i human hjerne, er uspesifikk binding av disse amyloidsynliggjørende forbindelsene lav, selv i kontrollhjerner som mangler amyloide avleiringer. I nanomolare konsentrasjoner ser disse forbindelsene ikke ut til å bindes til nevrofibrillære bunter.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

Det er følgelig en utførelse av den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe forbindelser som tillater en sikker og spesifikk fremgangsmåte for diagnose av AD før døden ved in vivo synliggjøring av amyloid i hjerneparenchym. Forbindelsene som er anvendbare for dette formålet kan beskrives med følgende formel:

hvori Z er S, NR', O eller C(R')2, i hvilket tilfelle den tautomere formen av den heterosykliske ringen kan bli et indol hvori R' er H eller en lavere alkylgruppe: hvori Y er NR]R2, OR2 eller SR<2>;

hvor hver R<1>og R<2>uavhengig av hverandre er valgt fra gruppen som består av H, en lavere alkylgruppe, (CH2)nOR' (hvori n = 1, 2 eller 3), CF3, CH2-CH2X, CH2-CH2-CH2X (hvori X = F, Cl, Br eller I), (COO)-R', Rphog (CH2)nRPh(hvori n = 1, 2, 3 eller 4 og RPhstår for en usubstituert eller substituert fenylgruppe, hvor substituentene på fenylgruppen er utvalgt blant alle ikke-fenylsubstituenter som er definert nedenfor for R<3->R<10>og R' er H eller en lavere alkylgruppe);

Hver R<3->R<10>er uavhengig av hverandre valgt fra gruppen som består av H, F, Cl, Br, I, en lavere alkylgruppe, (CH2)nOR' (hvori n = 1, 2 eller 3), CF3, CH2-CH2X, O-CH2-CH2X, CH2-CH2-CH2X, 0-CH2-CH2-CH2X (hvori X = F, Cl, Br eller I), CN, (C=0)-R', N(R')2, N02, (C=0)N(R'=2, 0(CO)R\ OR', SR', COOR', Rph, CR'=CR'-FPh, CR2'-RPh(hvori RPhstår for en usubstituert eller substituert fenylgruppe hvor substituentene på fenylgruppen er utvalgt blant alle ikke-fenylsubstituenter som er definert for R<1->R<10>og hvori R' er H eller en lavere alkylgruppe), trialkyltinn og en gelaterende gruppe (med eller uten en gelatert metallgruppe) på formen W-L eller V-W-L, hvori V er utvalgt fra gruppen som består av -COO-, -CO-, -CH20- og

-CH2NH-; W er -(CH2)nhvori n = 0, 1, 2, 3, 4 eller 5; og L er:

hvori M er utvalgt fra gruppen som består av Tc og Re.

En annen utførelse gjelder forbindelser med formel I:

eller et farmasøytisk akseptabelt salt, hydrat, solvat eller promedikament av forbindelsen, hvori: R<1>er hydrogen, -OH, -N02, -CN, -COOR, -OCH2OR, Ci-C6alkenyl, C2-C6alkenyl, C2-C6alkynyl, C1-C6alkoksy eller halogen, hvori ett eller flere av atomene i R<1>kan være et radioaktivt merket atom;

R er C1-C6alkyl, hvori et teller flere av karbonatomene kan være et radioaktivt atom;

R<2>er hydrogen, et ikke-radioaktivt halogen eller radioaktivt halogen;

R<3>er hydrogen, C1-C6alkyl, C2-C6alkenyl eller C2-C6alkynyl; og

R<4>er hydrogen, C1-C6alkyl, C2-C6alkenyl eller C2-C6alkynyl, hvori alkyl, alkenyl eller alkynyl omfatter et radioaktivt karbonatom eller er substituert med et radioaktivt halogenatom dersom R2 er hydrogen eller et ikke-radioaktivt halogenatom;

forutsatt at dersom R<1>er hydrogen eller -OH, R2 er hydrogen og R<4>er -<n>CH3, så er R<3>C2-C6alkyl, C2-C6alkenyl eller C2-C6alkynyl; og

videre forutsatt at dersom R<1>er hydrogen, R<2>er hydrogen og R4 er -CH2CH2CH2<I8>F, så er R<3>C2-C6alkyl, C2-C6alkenyl eller C2-C6alkynyl.

En annen utførelse gjelder forbindelser utvalgt fra gruppen som består av strukturene 1-45 som er anvendbare i de beskrevne fremgangsmåtene:

Nok en utførelse gjelder en amyloidbindende forbindelse med en struktur utvalgt fra gruppen som består av:

I nok en utførelse bindes de amyloidbindende forbindelsene ifølge oppfinnelsen til Ap med en dissosiasjonskonstant (KD) på mellom 0,0001 og 10,0^M, målt ved binding til syntetisk Ap-peptid eller hjernevev fra en pasient med Alzheimers sykdom.

En annen utførelse av oppfinnelsen gjelder en fremgangsmåte for syntese av de amyloidbindende forbindelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen hvori minst en av substituentene er utvalgt fra gruppen som består av<13>1I,I25I,I231, 7<6>Br,<75>Br, I8Fog<I9>F, som omfatter trinnet å merke den amyloidbindende forbindelsen hvori minst en av substituentene er et trialkyltinn ved en reaksjon mellom forbindelsen og en forbindelse som inneholder<131>I,<I25>I,<I23>I, 7<6>Br,<75>Br, I8Feller<I9>F.

En videre utførelse av den foreliggende oppfinnelsen gjelder en farmasøytisk sammensetning for in vivo synliggjøring av amyloide avleiringer som omfatter (a) en amyloidbindende forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen og (b) et farmasøytisk akseptabelt bærerstoff.

I en annen utførelse av oppfinnelsen er en in vivo fremgangsmåte for påvisning av amyloide avleiringer i et individ som omfatter trinnene: (a) Administrering av en påvisbar mengde av en farmasøytisk sammensetning som inneholder den merkede amyloidbindende forbindelsen og påvisning av binding av forbindelsen til amyloide avleiringer i individet. I et foretrukket aspekt av denne utførelsen, foreligger den amyloide avleiringen i hjernen til et individ. I et spesielt foretrukket aspekt av denne utførelsen, mistenkes individet for å ha en sykdom eller et syndrom utvalgt fra gruppen som består av Alzheimers sykdom, familiær Alzheimers sykdom, Downs syndrom og homozygoter for apolipoprotein E4-allelet. I et annet spesielt foretrukket aspekt av denne utførelsen, er påvisningen utvalgt fra gruppen som består av gammabildedannelse, magnetisk resonnansbildedannelse og magnetisk resonnansspektroskopi. I et foretrukket aspekt av denne utførelsen, er gammabildedannelsen enten PET eller SPECT. I et annet foretrukket aspekt av denne utførelsen, tilføres den farmasøytiske sammensetningen ved intravenøs injeksjon. I et annet foretrukket aspekt av denne utførelsen, sammenlignes forholdet mellom (i) binding av forbindelsen til et hjerneområde som er forskjellig fra cerebellum og (ii) binding av forbindelsen til cerebellum i et individ med forhold hos et normalt individ.

I en annen utførelse anvendes påvisning av amyloide avleiringer in vivo i diagnose av Alzheimers sykdom.

En annen utførelse gjelder en fremgangsmåte for påvisning av amyloide avleiringer i biopsier eller post mortem humant vev eller dyrevev som omfatter trinnene: (a) Innkubering av formalinfiksert eller friskt nedfrosset vev med en løsning av en amyloidbindende forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen slik at det dannes en merket avleiring, og (b) påvisning av de merkede avleiringene. I et foretrukket aspekt av denne utførelsen, består løsningen av 25-100% etanol, mens resten av løsningen er vann, hvori løsningen er mettet med en amyloidbindende forbindelsen ifølge den foreliggende oppfinnelsen. I et spesielt foretrukket aspekt av denne utførelsen, består løsningen av en vandig buffer (for eksempel tris eller fosfat) som inneholder 0-50% etanol, hvori løsningen inneholder fra 0,0001 til 100 av en amyloidbindende forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen. I et spesielt foretrukket aspekt av denne utførelsen, utføres påvisningen ved mikroskopiske teknikker utvalgt fra gruppen som består lysfeltsmikroskopi, fluorescensmikroskopi, laserkonfokal mikroskopi og krysspolariseringsmikroskopi.

Nok en utførelse gjelder en fremgangsmåte for kvantifisering av mengden av amyloid i en biopsi eller post portem-vev som omfatter trinnene: a) Innkubering av et radioaktivt merket derivat av en amyloidbindende forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen med et homogenat av en biopsi eller post mortem-vev, b) separasjon av vevsbundet fra ikke-vevsbundet radioaktivt merket derivat av en amyloidbindende forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen, c) kvantifisering av det vevsbundne radioaktivt merkede derivatet av en amyloidbindende forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen og d) omregning av enhetene av vevsbundet radioaktivt merket derivat av en amyloidbindende forbindelse ifølge oppfinnelsen til mikrogram amyloid pr 100 mg vev ved sammenligning med en standard.

En annen utførelse gjelder en fremgangsmåte for å skille mellom en hjerne fra en pasient med Alzheimers sykdom og en normal hjerne som omfatter trinnene: a) Erholdelse av vev fra (i) cerebellum og (ii) et annet område forskjellig fra cerebellum fra den samme hjernen, fra normale individer og fra individer som mistenkes for å ha Alzheimers sykdom; b) innkubering av vevene med et radioaktivt merket derivat av en tioflavinbasert amyloidbindende forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen slik at amyloid i vevet binder det radioaktivt merkede derivatet av en amyloidbindende forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen;

c) kvantifisering av mengden amyloid bundet til det radioaktive derivatet av amyloidbindende forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen ifølge

fremgangsmåten som er angitt ovenfor; d) beregning av forholdet mellom mengden amyloid i hjerneområdet som ikke er cerebellum med mengden av amyloid i cerebellum; e) sammenligning av forholdet for mengden amyloid i vev fra normale individer med forholdet for mengden av amyloid i vev fra individer som mistenkes for å ha Alzheimers sykdom; og f) bestemmelse av nærværet av Alzheimers sykdom dersom forholdet fra hjernen til et individ som mistenkes for å ha Alzheimers sykdom er over 90% av forholdet erholdt fra hjerner fra normale individer.

En annen utførelse av den foreliggende oppfinnelsen gjelder forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen som er anvendbare for spesifikk binding til amyloide avleiringer fremfor binding til nevrofibrillære bunter.

En annen utførelse gjelder en fremgangsmåte for selektiv binding til amyloide plakk, men ikke til nevrofibrillære bunter, i in vivo hjernevev som inneholder begge, ved administrering av en effektiv mengde av en forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen slik at konsentrasjonen i blodet av den administrerte forbindelsen forblir under 10 nM in vivo.

Nok en utførelse gjelder nye forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen hvori minst ett av atomene i formelen er erstattet med et radioaktivt atom, fortrinnsvis hvori det radioaktive atomet er<n>C.

Nok en utførelse gjelder nye forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen hvori minst ett av atomene i formelen er utvalgt fra gruppen som består av 3H,<I3I>I,<125>I,123I,7<6>Br,<75>Br,<18>F, CH2-CH2-X*, 0-CH2-CH2-X*, CH2-CH2-CH2-X*, 0-CH2-CH2-CH2-X<*>(hvoriX*=I3II,I2<3>1,<76>Br,<75>Br,I8F),I9F,I2<5>I, en karbonholdig substituent utvalgt fra gruppen som består av lavere alkyl, (CH2)nOR', CF3, CH2-CH2X, 0-CH2-CH2X, CH2-CH2-CH2X, 0-CH2-CH2-CH2X (hvori X = F, Cl, Br eller I), CN, (C=0)-R\ (C=0)N(R')2, 0(CO)R\ COOR', CR'=CR'-Rphog CR2'-Rpll hvori minst ett karbonatom er<n>C,<I3>C eller<I4>C og en gelaterende gruppe (med en gelatert metallgruppe) på formen W-L<*>eller V-W-L<*>, hvori V er utvalgt fra gruppen som består av -COO-, -CO-, -CH20- og -CH2NH-; W er -(CH2)nhvori n = 0, 1, 2, 3, 4 eller 5; og L<*>er:

hvori M<*>er<99m>Tc.

En annen utførelse gjelder anvendelse av en av forbindelsene med formel 1-45 eller en forbindelse med formel I for diagnose av Alzheimers sykdom i en pasient med behov for dette.

En annen utførelse gjelder anvendelse av en av forbindelsene med formel 1-45 eller en forbindelse med formel I for fremstilling av et medikament for diagnose av Alzheimers sykdom i en pasient med behov for dette.

Andre utførelser av oppfinnelsen vil være åpenbare for fagfolk på området ut fra den beskrivelse og utførelse av oppfinnelsen som gis heri. Det er meningen av beskrivelsen kun skal oppfattes som eksemplarisk, slik at oppfinnelsens sanne område og ånd angis av de vedlagte krav. Alle dokumenter som det refereres til heri, inkorporeres heri ved referanse.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 Viser strukturene til et tioflavin S og tioflavin T; Figur 2 Viser strukturene til to tioflavinderivater ifølge oppfinnelsen; Figur 3 Viser fire seriesnitt av fluorescensmerket fremre hjernecortex fra en AD-pasient; Figur 4 Viser foreslåtte seter for binding av krysamin G og tioflavin T i P-platefibriller; Figur 5 Viser konkurranseanalyse ved anvendelse av krysamin G, tioflavin S

og tioflavin T og derivater ifølge den foreliggende oppfinnelsen (BTA-0, BTA-1 og BTA-2);

Figur 6 Viser tidsforløpet for radioaktivitet i fremre cortex hos bavianer

injisert med merket BTA-1, 6-MeO-BTA-l og 6-Me-BTA-l; og

Figur 7 Viser et transvers positronemisjonstomografibilde av to nivåer fra

bavianhjerne etter i.v. injeksjon av [N-metyl-<n>C]BTA-l.

Figur 8 Viser post mortem-snitt av hjerne fra menneske og transgen mus

farget med et derivat ifølge den foreliggende oppfinnelsen (BTA-1).

Figur 9 Viser in vivo merking av amyloide plakk og vaskulær amyloid farget med et derivat ifølge den foreliggende oppfinnelsen (BTA-1) i levende transgene mus, synliggjort ved multifotonmikroskopi. Figur 10A Viser en sammenligning av resultater vedrørende [<3>H]binding til homogenater fra en kontrollhjerne, hjerne fra en pasient med Alzheimers sykdom og hjerne fra en pasient med demens men ikke Alzheimers sykdom. Figur 10B Viser forhold mellom resultater fra en sammenligning mellom fremre cortex og cerebellum for hver enkelt hjerne i en kontrollhjerne, hjerne fra en Alzheimerpasient og hjerne fra en pasient med demens men ikke Alzheimers sykdom. Figur 11 A-F Viser spesifisiteten av forbindelsene ifølge oppfinnelsen for amyloide plakk fremfor nevrofibrillære bunter, hvor A og B viser den entorinale cortex, C og D viser den fremre cortex og E og F viser cerebellum fra en Braak stadium II kontrollhjerne. Figur 12 Tabell som viser [<3>H] BTA-l-binding til spesifikke områder i en Braak II kontrollhjerne og en Braak VI AD-hjerne (AD02). Figur 13 Viser et Scatchard-plott over bindingen av [<3>H] BTA-1 til homogenater av AD fremre grå hjernemasse og underliggende fremre hvit hjernemasse fra samme AD-hjerne. Figur 14 Viser et autoradiogram og et fluorescensmikroskopisk bilde som viser overlapping mellom [I-125]6-OH-BTA-0-3'-I-binding til plakk og cerebrovaskulært amyloid og amyloide avleiringer farget med amyloidfargestoffet X-34. Venstre: Autoradiogram av [I-125]6-OH-BTA-0-3'-I-binding til frisk nedfrosset vev fra post mortem AD-hjerne. De mørke områdene viser lokaliseringen av [I-125]6-OH-BTA-0-3'-I og er et omriss i rødt. Strukturen av [I-125]6-OH-BTA-0-3'-I er vist nederst til venstre. Høyre: Den samme biten av post morten AD-hjernevev farget med amyloidfargestoffet X-34. Lyse områder angir plakk og cerebrovaskulært amyloid. Midten: Overlapp mellom den røde konturen fra det venstre autoradiogrammet med X-34-fargen viser tilnærmet 1:1 sammenheng mellom [I-125]6-OH-BTA-0-3'-I-binding til plakk og cerebrovaskulært amyloid. Innskudd: Viser en 2,25 gangers forstørrelse av området innenfor firkanten i midtfiguren. Bjelken representerer 1000^m. Figur 15 Viser tidsaktivitetskurver for penetrasjon og clearance av radioaktivitet fra tre områder i bavianhjerne etter injeksjon av forbindelse B (2-(3-[<18>F]fluor-4-metylaminofenyl)benzotiazol-6-ol). Figur 16 Viser tidsaktivitetskurver for penetrasjon og clearance av radioaktivitet fra cerebellum hos bavian (referanseområde fritt for spesifikk binding) etter injeksjon av de radioaktive ligandene [karbonyl-<n>C]WAY100635,[nC](+)-McN5652 og [<18>F]altanserin, sammenlignet med oppførselen til forbindelse B. Figur 17 Viser tidsaktivitetskurver for penetrasjon og clearance av radioaktivitet fra tre områder i bavianhjerne etter injeksjon av forbindelse C (2-[4-(3-<I8>F-fluorpropylamino)fenyl]benzotiazol-6-ol). Figur 18 Viser tidsaktivitetskurver for penetrasjon og clearance av radioaktivitet fra cerebellum hos bavian (referanseområde fritt for spesifikk binding) etter injeksjon av de radioaktive ligandene [karbonyl-<n>C]WAY100635, [<n>C](+)-McN5652 og [<I8>F]altanserin, sammenlignet med oppførselen til forbindelse C.

DETALJERT BESKRIVELSE

Den foreliggende oppfinnelsen utnytter evnen til tioflavinforbindelser og radioaktivt merkede derivater derav til å krysse blodhjernebarrieren in vivo og bindes til Ap deponert i nevrittiske (men ikke diffuse) plakk, til Ap deponert i cerebrovaskulært amyloid og til amyloid som består av proteinet som er avleiret i NFT. De foreliggende forbindelsene er ikke-kvaternære aminderivater av tioflavin S og T som vites å farge amyloid i vevssnitt og bindes til syntetisk Ap in vitro. Kelenyi, J. Histochem. Cytochem. 15: 172 (1967); Burns et al, J. Path. Bact. 94: 337 (1967); Guntern et al, Experientia 48: 8 (1992); LeVine, Meth. Enzymol. 309: 274 (1999).

Tioflavinderivatene ifølge den foreliggende oppfinnelsen har alle de påfølgende egenskaper: (1) Spesifikk binding til syntetisk Ap in vitro og (2) evnen til å krysse en ikke-kompromittert blodhjernebarriere in vivo.

Molekylær modellering

Molekylær modellering ble utført ved anvendelse av datamaskinmodellerings-programmet Alchemy2000, et produkt fra Tripost, Inc. (St. Louis, MO), for å modellering av Ap-peptidkjedene i antiparallell betaplatekonformasjon. Kirschner et al, Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 83: 503 (1986). Amyloidpeptidene ble plassert i hårnålsløkker, se Hilbich et al, J. Mol. Biol. 218: 149 (1991) og ble anvendt uten ytterligere strukturell forfining. Ap-peptidene ble sammenstilt slik at alternerende kjeder hadde en avstand på 4,76 Å, noe som er karakteristisk for betaplatefibriller. Kirschner, supra. Tioflavin T-derivater ble energiminimalisert og sammenstilt med fibrillmodellen for maksimalisering av kontakten med Asp-23/Gln-15/His-13 i Ap(l-42).

Karakterisering av spesifikk binding til syntetisk Ap-peptid: Affinitet, kinetikk, maksimal binding

Tioflavinderivatbindingskarakteristika ble analysert ved anvendelse av syntetisk Ap(l-40) og 2-(4'-[<11>C]metylaminofenyl)benzotial ([N-metyl-<n>C]BTA-l) i fosfatbufret saltløsning (pH 7,0) eller glysinbuffer/20% etanol (pH 8,0) som tidligere beskrevet for krysamin-G-binding. Klunk et al, Neurobiol. Aging 15: 691

(1994).

Aminosyresekvensen for A(3(l-40) er som følger:

DEFINISJONER

"Alkyl" viser til et mettet hydrokarbonradikal med uforgrenet eller forgrenet kjede. Eksempler omfatter, men er ikke begrenset til, metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, ter/-butyl, n-pentyl og n-heksyl.

"Alkenyl" viser til et umettet hydrokarbonradikal med uforgrenet eller forgrenet kjede som omfatter minst én karbon-til-karbon dobbeltbinding. Eksempler omfatter, men er ikke begrenset til, etenyl, propenyl, isopropenyl, butenyl, isobutenyl, tert-butenyl, n-pentenyl og n-heksenyl.

"Alkynyl" viser til et umettet hydrokarbonradikal med uforgrenet eller forgrenet kjede som omfatter minst én karbon-til-karbon trippelbinding. Eksempler omfatter, men er ikke begrenset til, etynyl, propynyl, isopropynyl, butynyl, isobutynyl, tert-butynyl, pentynyl og heksynyl.

"Alkoksy" viser til en alkylgruppe bundet via et oksygenatom.

"Halo" viser til et fluor-, klor-, brom- eller jodradikal.

"Radioaktivt halo" viser til et radioaktivt halogen, det vil si radioaktivt fluor, radioaktivt klor, radioaktivt brom eller radioaktivt jod.

"Effektiv mengde" viser til den mengden som er nødvendig for å gi en ønsket virkning. Eksempler på en "effektiv mengde" omfatter mengder som tillater synliggjøring av amyloide avleiringer in vivo, mengder som gir en akseptabel toksisitet og et akseptabelt biotilgjengelighetsnivå for farmasøytisk anvendelse og/eller mengder som forhindrer celledegenerering og toksisitet forbundet med fibrilldannelse.

"Farmasøytisk akseptabelt bærerstoff" viser til et farmasøytisk akseptabelt materiale, sammensetning eller bærerstoff, for eksempel et flytende eller fast fyllstoff, fortynningsmiddel, en eksipient eller løsemiddel som innkapsler materialet, som deltar i å bære og transportere den angjeldende forbindelsen fra ett organ eller en del av kroppen til et annet organ eller en annen del av kroppen. Hvert bærerstoff er "akseptabelt" i den forstand at det er forenlig med de andre bestanddelene i preparatet og er egnet for anvendelse med pasienten. Eksempler på materialer som kan fungere som farmasøytisk akseptable bærerer stoffer omfatter, men er ikke begrenset til: (1) Sukkere så som laktose, glukose og sukrose; (2)

stivelser så som maisstivelse og potetstivelse; (3) cellulose og cellulosederivater så som natriumkarboksymetylcellulose, etylcellulose og celluloseacetat; (4) pulverisert tragakantgummi; (5) malt; (6) gelatin; (7) talkum; (8) eksipienter så som kakaosmør og stikkpillevokser; (9) oljer så som peanøttolje, bomullsfrøolje, saflorolje, sesamolje, olivenolje, maisolje og soyabønneolje; (10) glykoler så som propylenglykol; (11) polyoler så som glyserin, sorbitol, mannitol og polyetylenglykol; (12) estere så som etyloleat og etyllaurat; (13) agar; (14) bufringsmidler så som magnesiumhydroksid og aluminiumhydroksid; (15) algininsyre; (16) pyrogenfritt vann; (17) isoton saltløsning; (18) Ringers løsning; (19) etylalkohol; (20) pH-bufrede løsninger; (21) polyestere, polykarbonater og/eller polyanhydrider; og (22) andre ikke-toksiske, forenlige forbindelser som benyttes i farmasøytiske utforminger, for eksempel som angitt i REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15. utgave (Mack Publishing Co., 1975) sidene 1405-1412 og 1461-1487 og THE NATIONAL FORMULARY XIV, 14. utgave (American Pharmaceutical Association, 1975).

"Farmasøytisk akseptabelt salt" viser til et salt av forbindelsen ifølge oppfinnelsen med syre eller en base, hvor saltet besitter den ønskede farmakologiske aktivitet og hverken er biologisk uønsket eller uønsket av andre grunner. Saltet dannet med syrer kan være, men er ikke begrenset til, et acetat, adipat, alginat, aspartat, benzoat, benzensulfonat, bisulfat, butyrat, citrat, kamferat, kamfersulfonat, syklopentanpropionat, diglukonat, dodecylsulfat, etansulfonat, fumarat, glukoheptanoat, glyserofosfat, hemisulfat, heptanoat, heksanoat, hydroklorid, hydrobromid, hydrojodid, 2-hydroksyetansulfonat, laktat, maleat, metansulfonat, 2-naftalensulfonat, nikotinat, oksalat, tiocyanat, tosylat og undekanoat. Eksempler på salter med baser omfatter, men er ikke begrenset til, ammoniumsalter,

alkalimetallsalter så som natrium- og kaliumsalter, alkaliske jordmetallsalter så som kalsium- og magnesiumsalter, salter med organiske baser så som disykloheksylaminsalter, N-metyl-D-glukamin og salter med aminosyrer så som arginin og lysin. I noen utførelser kan de basiske, nitrogenholdige gruppene være kvaternisert med midler som omfatter lavere alkylhalider så som metyl-, etyl-, propyl- og butylklorider, -bromider og -jodider; dialkylsufater så som dimetyl-, dietyl-, dibutyl- og diamylsulfater; langkjedede halider så som decyl-, lauryl-, myristyl- og stearylklorider, -bromider og -jodider; og aralkylhalider så som fenetylbromider.

"Promedikament" viser til et derivat av forbindelsen ifølge oppfinnelsen som gjennomgår en biotransformasjon så som ved metabolisme, før det viser en eller flere farmakologiske virkninger. Promedikamentet er utformet med de formål å gi forbedret kjemisk stabilitet, forbedret aksepterbarhet og forenlighet med pasienten, forbedret biotilgjengelighet, forlenget virkningstid, forbedret organselektivitet, forbedret utforming (for eksempel økt løselighet i vann) og/eller færre bivirkninger (for eksempel toksisitet). Promedikamentet kan lett fremstilles fra forbindelsen ifølge oppfinnelsen ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter, for eksempel som beskrevet i BURGER'S MEDION AL CHEMISTRY AND DRUG CHEMISTRY, 5. utgave, bind 1 (1995) sidene 172-178 og 949-982.

"Dyr" viser til en levende organisme med følelser og evnen til viljestyrt bevegelse, og som for sin eksistens krever oksygen og organisk kost. Eksempler omfatter, men er ikke begrenset til, medlemmer av artene menneske, hest, gris, storfe, mus, hund og katt. Når det gjelder et menneske, kan et "dyr" også betegnes en "pasient".

"Pattedyr" viser til et varmblodig vertebratdyr.

"Behandling" viser til:

(i) å forhindre at en sykdom, lidelse eller tilstand opptrer i et dyr som kan være predisponert for sykdommen, lidelsen og/eller tilstanden, men ennå ikke har blitt diagnostisert til å ha den; (ii) å inhibere sykdommen, lidelsen eller tilstanden, det vil si å stanse utviklingen; og/eller (iii) å lindre sykdommen, lidelsen eller tilstanden, det vil si å få sykdommen, lidelsen og/eller tilstanden til å regressere.

Dersom sammenhengen ikke klart angir noe annet, kan definisjonene av begreper i entall ekstrapoleres til å gjelde de tilsvarende begreper i flertall ettersom de opptrer i patentsøknaden; likeså kan definisjonene av begreper i flertall ekstrapoleres til å gjelde for de tilsvarende begreper i entall ettersom de opptrer i patentsøknaden.

FORBINDELSER

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer radioaktivt merkede benzotiazolderivatforbindelser som amyloidsynliggjørende midler.

Nærmere bestemt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en forbindelse med formel I

eller et farmasøytisk akseptabelt salt, hydrat, solvat eller promedikament av forbindelsen, hvori: R<1>er hydrogen, -OH, -N02, -CN, -COOR, -OCH2OR, d-C6 alkyl, C2-C6alkenyl, C2-C6alkynyl, C1-C6alkoksy eller halogen, hvor ett eller flere av atomene i R<1>kan være et radioaktivt atom;

R er C1-C6alkyl, hvori ett eller flere av karbonatomene kan være et radioaktivt atom;

R<4>er hydrogen, ikke-radioaktivt halogen eller radioaktivt halogen;

R<3>er hydrogen, O-C6 alkyl, C2-C6alkenyl eller C2-C6alkynyl; og

R<4>er hydrogen, C1-C6alkyl, C2-C6alkenyl eller C2-C6alkynyl, hvori alkyl, alkenyl eller alkynyl omfatter et radioaktivt karbonatom eller er substituert med et radioaktivt halogenatom dersom R er hydrogen eller et ikke-radioaktivt halogenatom;

forutsatt at dersom R<1>er hydrogen eller -OH, R<2>er hydrogen og R<4>er -<n>CH3, så er R<3>C2-C6alkyl, C2-C6alkenyl eller C2-C6alkynyl; og

videre forutsatt at dersom R<1>er hydrogen, R2 er hydrogen og R<4>er -(CH2)3<I8>F, så er R<3>C2-C6alkyl, C2-C6alkenyl eller C2-C6alkynyl.

Eksempler på et radioaktivt karbonatom omfatter, men er ikke begrenset til,<n>C,I3Cog<14>C. Eksempler på et radioaktivt halogenatom omfatter, men er ikke begrenset til,I3<I>I,<I2>5I,I24I, I23I, 76Br,<75>Br,<I8>F. I en utførelse er det radioaktive halogenatometI25I,I24I, I<23>I eller<I8>F. I en annen utførelse erR<1>-OH.

I nok en utførelse er R<1>hydrogen, -OH, -CN, 0-C6 alkyl, C2-C6alkenyl, C2-C6alkynyl, C1-C6alkoksy eller halogen; R2 er hydrogen; og R<4>er C1-C6alkyl, C2-C6alkenyl eller C2-C6alkynyl, hvori alkyl, alkenyl eller alkynyl omfatter et radioaktivt karbonatom. Som et eksempel på denne utførelsen, er R<1>hydrogen, -OH, -CN,

-OCH3, -CH3eller -Br; R<3>er hydrogen eller -CH3; og R<4>er -<n>CH3.

I nok en utførelse er R2 et ikke-radioaktivt halogenatom eller et radioaktivt halogenatom, hvori halogenet er jod; og R<4>er hydrogen, C1-C6alkyl, C2-C6alkenyl eller C2-C6alkynyl, hvori alkyl, alkenyl eller alkynyl omfatter et radioaktivt karbonatom dersom R2 er et ikke-radioaktivt halogenatom. Som et eksempel på denne utførelsen, er R -CH3; og det radioaktive karbonatomet i R<4>er<n>C. Som et annet eksempel, er R<1>-OH eller C1-C6alkoksy; R<2>er et radioaktivt jodatom; og R<3>og R<4>er uavhengig av hverandre hydrogen eller O-C6 alkyl. Som nok et eksempel, er R<1>-OH; R2 er -<12>3I eller -125I;og R3 og R4 er begge hydrogen.

I nok en utførelse er R2 hydrogen, radioaktivt brom, radioaktivt klor eller radioaktivt fluor.

I nok en utførelse er R2 radioaktivt fluor. Som et eksempel på denne utførelsen, er R<1>-OH eller O-C6 alkoksy; R<2>er<I8>F; og R3 og R<4>er uavhengig av hverandre hydrogen eller O-C6 alkyl. Som et annet eksempel, er R<1>-OH; R<3>er hydrogen og R4 er -CH3.

I nok en utførelse er R<4>O-C6 alkyl, C2-C6alkenyl eller C2-C6alkynyl, hvori alkyl, alkenyl eller alkynyl er substituert med et radioaktivt halogenatom. Som et eksempel på denne utførelsen, er R<1>-OH eller C1-C6alkoksy; R2 er hydrogen; R3 er hydrogen eller O-C6 alkyl; og R4 er O-C6 alkyl substituert med<18>F. Som et annet eksempel, erR<1>-OH; R3 er hydrogen; og R<4>er -CH2CH2CH2<I8>F.

I nok en utførelse bindes forbindelsene ifølge oppfinnelsen selektivt til amyloid, fortrinnsvis syntetisk Ap in vitro eller Ap avleiret i nevrittiske plakk; de kan krysse en ikke-kompromittert blodhjernebarriere in vivo; de er biotilgjengelige; og/eller ikke-toksiske.

FREMGANGSMÅTER FOR ANVENDELSE

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å bestemme nærvær, plassering og/eller mengde av en eller flere amyloidavleiringer i et organ eller område i kroppen, innbefattet hjernen, hos et dyr. Amyloidavleiringer omfatter, men er ikke begrenset til, avleiringer av Ap. Ved at tillater tidsforløpet for amyloid deponering å følges, kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen videre anvendes for å korrelere amyloid avleiring med fremkomsten av kliniske symptomer forbundet med en sykdom, lidelse eller tilstand. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan endelig anvendes for diagnose av en sykdom, lidelse eller tilstand som særpreges ved amyloide avleiringer, for eksempel AD, familiær AD, Downs syndrom, amyloidose, type II diabetes mellitus og homozygoter for apolipoprotein E4-allelet.

Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen påviser nærvær og lokalisering av amyloide avleiringer i et organ eller område av kroppen, fortrinnsvis i hjernen, hos en pasient. Den foreliggende fremgangsmåten omfatter administrering av en påvisbar mengde av en farmasøytisk sammensetning som inneholder en amyloidbindende forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen, betegnet en "påvisbar forbindelse" eller et farmasøytisk akseptabelt vannløselig salt derav til en pasient. En "påvisbar mengde" betyr at mengden av den påvisbare forbindelsen som administreres er tilstrekkelig til å tillate påvisning av binding av forbindelsen til amyloid. En "effektiv mengde for synliggjøring" betyr at mengden av den påvisbare forbindelsen som tilføres er tilstrekkelig til å tillate synliggjøring av binding av forbindelsen til amyloid.

Oppfinnelsen benytter amyloide prober som i forbindelse med ikke-invasive nevrobildedanningsteknikker så som magnetisk resonnansspektroskopi (MRS), magnetisk resonnansbildedannelse (MRI) eller gammabildedannelse så som positronemisjonstomografi (PET) eller "single-photon emission computed" tomografi (SPECT) anvendes for kvantifisering av amyloid avleiring in vivo. Begrepet " in vivo bildedannelse" viser til enhver fremgangsmåte som tillater påvisning av et merket tioflavinderivat som beskrevet heri. For gammabildedannelse måles radioaktiviteten som utsendes fra organet eller området som undersøkes og uttrykkes enten som total binding eller som et forhold hvori den totale bindingen i et vev er normalisert til (for eksempel dividert med) den totale bindingen i et annet vev i det samme individet under den samme in vivo bildedannelsesfremgangsmåten. Total binding in vivo er definert som det totale signalet som påvises i et vev ved en in vivo bildedannelsesteknikk, uten behov for korreksjon ved en ny injeksjon av en identisk mengde av den merkede forbindelsen sammen med et stort overskudd av umerket, men ellers kjemisk identisk forbindelse. Et "individ" er et pattedyr, fortrinnsvis et menneske, og mest foretrukket et menneske som mistenkes for å ha demens.

For in vivo bildedannelsesformål, er typen av påvisningsinstrument som er tilgjengelig en hovedfaktor for valg av en gitt merking. For eksempel er radioaktive isotoper og<I9>F spesielt godt egnet for in vivo bildedannelse i fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Typen av instrument som anvendes vil styre valget av radioaktiv isotop eller stabil isotop. For eksempel må den valgte radioaktive isotopen brytes ned på en måte som kan påvises med en gitt type instrument. En annen faktor å ta i betraktning, gjelder halveringstiden til den radioaktive isotopen. Halveringstiden bør være tilstrekkelig lang til at isotopen fortsatt kan påvises på det tidspunkt hvor den radioaktive forbindelsen viser maksimalt opptak, men tilstrekkelig kort til at verten ikke blir utsatt for skadelig stråling. De radioaktivt merkede forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan påvises ved anvendelse av gammabildedannelse, hvori utsendt gammastråling av den forventede bølgelengde påvises. Fremgangsmåter for gammabildedannelse omfatter, men er ikke begrenset til, SPECT og PET. For SPECT-påvisning vil den valgte radioaktive merkingen fortrinnsvis ikke sende ut partikler, men vil gi et stort antall fotoner i området 140-200 keV. For PET-påvisning vil den radioaktive merkingen være en positronemitterende radioaktiv isotop, for eksempel I9F som vil tilintetgjøres under dannelse av to 511 keV gammastråler som kan påvises av PET-kameraet.

I den foreliggende oppfinnelsen fremstilles amyloidbindende forbindelser/prober som er anvendbare for in vivo synliggjøring og kvantifisering av amyloide avleiringer. Disse forbindelsene skal anvendes i forbindelse med ikke-invasive nevrobildedannelsesteknikker så som magnetisk resonnansspektroskopi (MRS), magnetisk resonnansbildedannelse (MRI), positronemisjonstomografi (PET) og "single-photon emission computed" tomografi (SPECT). I samsvar med den foreliggende oppfinnelsen kan tioflavinderivatene merkes med<I9>F eller<I3>C for MRS/MRI ved generelle teknikker innen organisk kjemi som er kjente innen faget. Se for eksempel ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY: RE ACTION, MECHANISMS, AND STRUCTURE, 3. utgave (1985), hvis innhold inkorporeres

IO 11

heri ved referanse. Tioflavinderivatene kan også merkes radioaktivt med F, C,<75>Br eller<76>Br for PET ved teknikker som er velkjente innen faget og som beskrives av Fowler, J. og Wolf, A. i POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY AND AUTORADIOGRAPHY 391-450 (Raven Press, 1986), hvis innhold inkorporeres heri ved referanse. Tioflavinderivatene kan også merkes radioaktivt med<I23>I for SPECT ved en hvilken som helst av flere teknikker som er kjente innen faget. Se for eksempel Kulkarni, Int. J. Rad. Appl. & Inst. (Del B) 18: 647 (1991), hvis innhold inkorporeres heri ved referanse. I tillegg kan tioflavinderivatene merkes med enhver egnet radioaktiv jodisotop, for eksempel, men ikke begrenset til, I3II,I25Ieller<I>23I, ved jodinering av et diazotisert aminoderivat direkte via et diazoniumjodid, se Greenbaum, F. Am. J. Pharm. 108: 17 (1936) eller ved overføring av det ustabile diazotiserte aminet til det stabile triazenet, eller ved overføring av en ikke-radioaktiv halogenert forløper til et stabilt trialkyltinnderivat som så kan overføres

til jodforbindelsen ved flere fremgangsmåter som er kjente innen faget. Se Satyamurthy og Barrio, J. Org. Chem. 48: 4394 (1983), Goodman et al, J. Org. Chem. 49: 2322 (1984) og Mathis et al, J. Labell. Comp. and Radiopharm. 1994: 905; Chumpradit et al, J. Med. Chem. 34: 877 (1991); Zhuang et al, J. Med. Chem. 37: 1406 (1994); Chumpradit et al, J. Med. Chem. 37: 4245 (1994). For eksempel kan et stabilt triazen eller trialkyltinnderivat av tioflavin eller analoger derav få reagere med et halogeneringsmiddel som inneholder<I3I>I,<I25>I,<I23>1, 76Br, 75Br, I8Feller<I9>F. Således er de stabile trialkyltinnderivatene av tioflavin og analoger derav nye forløpere som er anvendbare for syntese av mange av de radioaktivt merkede forbindelsene som omfattes av den foreliggende oppfinnelsen. Følgelig er disse trialkyltinnderivatene en utførelse av den foreliggende oppfinnelsen.

Tioflavinderivatene kan også merkes radioaktivt med kjente radioaktive metaller så som technetium-99m(99mTc). En modifikasjon av substituentene for innføring av ligander som binder slike metallioner kan oppnås uten omfattende eksperimentering av en gjennomsnitts fagperson innen feltet radioaktiv merking. Tioflavinderivatet merket med et radioaktivt metall kan så anvendes for påvisning av amyloide avleiringer. Fremstilling av radioaktivt merkede derivater av Tc<99m>er velkjent innen faget. Se for eksempel Zhuang et al., "Neutral and stereospecific Tc-99m complexes: [99mTc]N-benzyl-3,4-di-(N-2-mercaptoethyl)-amino-pyrrolidines (P-BAT)" Nuclear Medicine & Biology 26(2): 217-24, (1999); Oya et al., "Small and neutral Tc(v)0 BAT, bisaminoethanethiol (N2S2) complexes for developing new brain imaging agents" Nuclear Medicine & Biology 25(2): 135-40, (1998); og Hom et al., "Technetium-99m-labeled receptor-specific small-molecule radiopharmaceuticals: recent developments and encouraging results" Nuclear Medicine & Biology 24(6): 485-98, (1997).

Fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan anvende isotoper som kan påvises ved kjernemagnetisk resonnansspektroskopi for in vivo bildedannelse og spektroskopi. Grunnstoffer som er spesielt anvendbare i magnetisk resonnansspektroskopi omfatter I9Fog<I3>C.

Egnede radioaktive isotoper for den foreliggende oppfinnelsens formål omfatter betaemittere, gammaemittere, positronemittere og røntgenstråleemittere. Disse radioaktive isotopene omfatterI3II,<I23>I,<I8>F,<n>C,<75>Br og<76>Br. Egnede stabile isotoper for anvendelse i magnetisk resonnansbildedannelse (MRI) eller magnetisk resonnansspektroskopi (MRS) ifølge den foreliggende oppfinnelsen, omfatter<I9>F og<I3>C. Egnede radioaktive isotoper for in vitro kvantifisering av amyloid i homogenater av biopsier eller post mortem vev omfatter I25I,<I4>C og<3>H. De foretrukne radioaktive isotopene er<n>C eller<I8>F for anvendelse i PET in vivo bildedannelse,<123>I for anvendelse i SPECT-bildedannelse,<19>F for MRS/MRI og<3>H eller<I4>C for in vitro undersøkelser. Imidlertid kan enhver konvensjonell fremgangsmåte for synliggjøring av diagnostiske prober benyttes i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen.

Ifølge det aspekt av oppfinnelsen som gjelder en fremgangsmåte for påvisning av amyloide avleiringer i biopsier eller post mortem-vev, omfatter fremgangsmåten å innkubere formalinfiksert vev med en løsning av en amyloidbindende tioflavinforbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Løsningen er fortrinnsvis i 25-100% etanol (hvor resten utgjøres av vann), mettet med en amyloidbindende tioflavinforbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Etter innkuberingen vil forbindelsen farge eller merke amyloide avleiringer i vevet, og de fargede eller merkede avleiringene kan påvises eller visualiseres ved enhver standardfremgangsmåte. Slike påvisningsmidler omfatter mikroskopiske teknikker så som lysfeltmikroskopi, fluorescensmikroskopi, laserkonfokal mikroskopi og krysspolariseringsmikroskopi.

Fremgangsmåten for kvantifisering av mengden av amyloid i biopsier eller post mortem-vev omfatter å innkubere et merket derivat av tioflavin ifølge den foreliggende oppfinnelsen eller et vannløselig, ikke-toksisk salt derav med homogenat av en biopsi eller post mortem-vev. Vevet erholdes og homogeniseres ved fremgangsmåter som er velkjente innen faget. Den foretrukne merkingen er en radioaktiv isotop, selv om andre merkingsgrupper så som enzymer, kjemiluminescerende forbindelser og immunofluorescerende forbindelser er velkjente blant fagfolk. Den foretrukne radioaktive isotopen er I25I, I4C eller 3H som foreligger i en substituent på en av forbindelsene med de formler som er beskrevet heri. Vev som inneholder amyloide avleiringer vil binde de merkede derivatene av de amyloidbindende tioflavinforbindelsene ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Bundet vev skilles så fra ubundet vev ved enhver mekanisme som er kjent blant fagfolk, for eksempel filtrering. Bundet vev kan så kvantifiseres ved et hvilket som helst middel som er velkjent blant fagfolk. Enhetene av vevsbundet radioaktivt merket tioflavinderivat omregnes så til mikrogram amyloid pr 100 mg vev ved å sammenligne med en standardkurve fremstilt ved å innkubere kjente mengder av amyloid med det radioaktivt merkede tioflavinderivatet.

Fremgangsmåten for å skille en hjerne med Alzheimers sykdom fra en normal hjerne omfatter å erholde vev fra (a) cerebellum og (b) et annet område fra den samme hjernen som ikke er cerebellum, fra normale individer og fra individer som mistenkes å ha Alzheimers sykdom. Slike vev overføres så til separate homogenater ved anvendelse av fremgangsmåter som er velkjente blant fagfolk, og innkuberes så med en radioaktivt merket amyloidbindende tioflavinforbindelse. Mengden vev som bindes til den radioaktivt merkede amyloidbindende tioflavinforbindelsen kan så beregnes for hver vevstype (for eksempel cerebellum, ikke-cerebellum, normal, unormal), og forholdet mellom binding til ikke-cerebellum og binding til cerebellum beregnes for vevet fra normale individer og for vevet fra pasienter som mistenkes å ha Alzheimers sykdom. Disse forholdene sammenlignes så. Dersom forholdet fra hjernen som mistenkes å ha Alzheimers sykdom er over 90% av forholdet erholdt fra normale hjerner, stilles diagnosen Alzheimers sykdom. De normale forholdene kan erholdes fra tidligere erholdte resultater, eller de kan alternativt rekalkuleres samtidig som det mistenkte hjernevevet undersøkes.

Evnen til de foreliggende forbindelsene til spesifikt å bindes til nevrofibrillære bunter fremfor amyloide plakk gjelder spesielt for konsentrasjoner som er lavere enn 10 nM som omfatter in vivo konsentrasjonsområdet for radioaktive isotoper for PET. I disse lave konsentrasjonene, som kun inneholder bunter og ikke plakk, opptrer ikke signifikant binding sammenlignet med kontrollhjernevev som hverken inneholder plakk eller bunter. Inkubasjon av homogenater av hjernevev som hovedsakelig inneholder plakk og noen bunter med radioaktivt merkede forbindelser formlene som beskrives heri, fører imidlertid til en signifikant binding sammenlignet med kontrollvev uten plakk eller bunter. Disse resultatene peker på den fordel at disse forbindelsene er spesifikke for Ap-avleiringer i konsentrasjon under 10 nM. Disse lave konsentrasjonene kan påvises i PET-undersøkelser, noe som gjør PET-påvisning ved anvendelse av radioaktivt merkede forbindelser med formlene som beskrives heri som er spesifikke for Ap-avleiringer, mulig. Ved anvendelse av slike forbindelser, tillater PET-påvisning i Ap-avleiringer, for eksempel avleiringene som foreligger i plakk og cerebrovaskulært amyloid. Siden det har blitt rapportert at Ap-nivået i fremre cortex er forhøyet før dannelsen av bunter, antyder dette at radioaktivt merkede forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendt som PET-prober kan være spesifikke for de tidligste endringene i AD-cortex. Naslund et al., JAMA 283: 1571 (2000).

Fremgangsmåte for påvisning av amyloide avleiringer in vivo

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for påvisning av amyloide avleiringer in vivo som omfatter: (i) administrering til et dyr av en effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen, hvori forbindelsen vil bindes til eventuelle amyloide avleiringer i dyret; og

(ii) påvisning av binding av forbindelsen til amyloide avleiringer i dyret.

Etter at tilstrekkelig tid har gått til at forbindelsen vil bindes til de amyloide avleiringene, for eksempel fra 30 minutter til 48 timer etter tilførselen, kan bindingen påvises ved ethvert middel som er kjent innen faget. Eksempler på påvisningsmidler omfatter, men er ikke begrenset til, analyser (så som immunometriske, kalorimetriske, densitometriske, spektrografiske og kromatografiske analyser), ikke-invasive nevrobildedannelsesteknikker (så som magnetisk resonnansspektroskopi (MRS), magnetisk resonnansbildedannelse (MRI) og gammabildedannelsesteknikker som "single-photon emission computed" tomografi (SPECT) og positronemisjonstomografi (PET). For gammebildedannelse måles strålingen som utsendes fra organet eller området som undersøkes, og uttrykkes enten som total binding eller som et forhold hvori den totale bindingen i ett vev er normalisert til (for eksempel dividert med) den totale bindingen til et annet vev fra det samme individet under den samme in vivo bildedannelsesfremgangsmåten. Total binding in vivo defineres som det totale signalet påvist i et vev ved en in vivo bildedannelsesteknikk, uten behov for korreksjon ved ny injeksjon av en identisk mengde merket forbindelse sammen med et stort overskudd av umerket, men ellers kjemisk identisk forbindelse.

Typen av påvisningsinstrument som er tilgjengelig kan være en faktor når det gjelder valg av radioaktiv halogen- eller karbonisotop. For eksempel bør den valgte radioaktive isotopen ha en nedbrytningstype som kan påvises med et gitt instrument. En annen faktor å ta i betraktning gjelder den radioaktive isotopens halveringstid. Halveringstiden bør være tilstrekkelig lang til at den radioaktive isotopen fortsatt kan påvises på tidspunktet for maksimalt opptak i målområdet, men tilstrekkelig kort til at verten ikke utsettes for skadelig stråling. For SPECT-påvisning kan den valgte radioaktive isotopen mangle partikkelemisjon, men kan danne et stort antall fotoner i 140-200 keV-området. For PET-påvisning kan den valgte radioaktive isotopen være en positronemitterende radioaktiv isotop som tilintetgjøres for dannelse av to 511 keV gammastråler som kan påvises med et PET-kamera.

Anvendbare radioaktive isotoper omfatter, men er ikke begrenset til:<I25>I,<I4>C og<3>H for in vitro kvantifisering av amyloid i homogenater av biopsier eller post mortem-vev;<n>C og<18>F for PET in vivo bildedannelse;<123>I for SPECT-bildedannelse;<18>F for MRS/MRI;<3>H eller I<4>C for in vitro undersøkelser; og<I8>F ogI<3>C for magnetisk resonnansspektroskopi. I en utførelse oppnås påvisningen ved gammabildedannelse, magnetisk resonnansbildedannelse eller magnetisk resonnansspektroskopi. I en annen utførelse er gammabildedannelsen PET eller SPECT.

Forbindelsen ifølge oppfinnelsen kan administreres ved et hvilket som helst middel som er kjent blant gjennomsnittsfagfolk. For eksempel kan administreringen til dyret være lokal eller systemisk og kan oppnås oralt, parenteral, ved inhaleringsspray, topisk, rektalt, nasalt, bukalt, vaginalt eller via et implantert reservoar. Begrepet "parenteralt" som anvendt heri, omfatter subkutan, intravenøs, intraarteriell, intramuskulær, intraperitoneal, intratekal, intraventrikulær, intrasternal, intrakranial og intraossal injeksjons- og infusjonsteknikker. Den nøyaktige administreringsfremgangsmåten vil variere avhengig av forskjellige faktorer innbefattet pasientens alder, kroppsvekt, generelle helsetilstand, kjønn og kosthold; fastsettelse av spesifikke administreringsfremgangsmåter vil være rutinemessig for en gjennomsnittsfagperson.

Doseringsnivåer i området fra tilnærmet 0,001 ^ g/kg/dag til tilnærmet 10000 mg/kg/dag av en forbindelse ifølge oppfinnelsen, er anvendbare i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen. I en utførelse er doseringsområdet fra tilnærmet 0,001^g/kg/dag til tilnærmet 10^g/kg/dag. I en annen utførelse er doseringsnivået fra tilnærmet 0,01^g/kg/dag til tilnærmet 1,0^g/kg/dag. I nok en utførelse er doseringsområdet fra tilnærmet 0,1^g/kg/dag til tilnærmet 100^g/kg/dag.

Det spesifikke doseringsnivået for en gitt pasient vil variere avhengig av forskjellige faktorer innbefattet aktivitet og mulig toksisitet av den angjeldende forbindelsen; pasientens alder, kroppsvekt, generelle helsetilstand, kjønn og kosthold; administrasjonstidspunktet; utskillingshastigheten; medikamentkombinasjoner; og administreringsmåten. Typisk gir in vitro dosevirkningsresultater nyttige retningslinjer for korrekte doser for administrering til pasienter. Undersøkelser i dyremodeller er også nyttige. Faktorer som må tas i betraktning for bestemmelse av de korrekte doseringsnivåene er velkjente innen faget og ligger innenfor kunnskapsområdet til en vanlig lege.

Ethvert kjent administreringsskjema for regulering av tidspunkter og rekkefølge for medikamenttilførsel kan anvendes og gjentas etter behov for å oppnå behandling i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen. Skjemaet kan omfatte forbehandling med og/eller samtidig administrering av ytterligere ett eller flere terapeutiske midler.

I en utførelse tilføres forbindelsene ifølge oppfinnelsen til et dyr som mistenkes å ha eller er utsatt for å utvikle en sykdom, lidelse eller tilstand som særpreges ved amyloid avleiring. Dyret kan for eksempel være et eldre menneske.

I en annen utførelse bindes forbindelsene ifølge oppfinnelsen til Ap med en dissosiasjonskonstant (KD) på fra tilnærmet 0,0001 til tilnærmet 10,0^M, målt ved binding til syntetisk Ap-peptid eller AD-hjernevev.

Fremgangsmåte for påvisning av amyloide avleiringer in vitro

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for påvisning av amyloide avleiringer in vitro som omfatter: (i) å sette et kroppsvev i forbindelse med en effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen, hvori forbindelsen vil bindes til eventuelle amyloide avleiringer i vevet; og

(ii) påvise binding av forbindelsen til amyloide avleiringer i vevet.

Bindingen kan påvises ved et hvilket som helst middel som er kjent innen faget. Eksempler på påvisningsmidler omfatter, men er ikke begrenset til, mikroskopiske teknikker som lysfeltmikroskopi, fluorescensmikroskopi, laserkonfokal mikroskopi og krysspolariseringsmikroskopi.

I en utførelse er vevet en biopsi eller post mortem-vev som er formalinfiksert eller nedfrosset friskt. I en annen utførelse er vevet homogenisert. I nok en utførelse er forbindelsen ifølge oppfinnelsen en løsning som videre omfatter 25-99% etanol, hvor resten av løsningen er vann. I ytterligere en utførelse omfatter løsningen 0-50% etanol og fra 0,0001 til 100 av forbindelsen. I nok en utførelse omfatter fremgangsmåten videre (iii) å separere fra vevet de amyloide avleiringene som er bundet til forbindelsen; og (iv) å kvantifisere de amyloide avleiringene som er bundet til forbindelsen ifølge oppfinnelsen. De bundne amyloide avleiringene kan separeres fra vevet ved ethvert middel som er kjent innen faget, for eksempel filtrering. Mengden bundne amyloide avleiringer kan omregnes til enhetene^g amyloid avleiring pr 100 mg vev ved sammenligning med en standardkurve fremstilt ved å innkubere kjente mengder amyloid med forbindelsen ifølge oppfinnelsen eller et farmasøytisk akseptabelt salt, hydrat, solvat eller promedikament derav.

Fremgangsmåte for å skjelne mellom hjerne med Alzheimers sykdom og normal hjerne

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for å skjelne mellom en hjerne med Alzheimers sykdom og en normal hjerne som omfatter: (i) å erholde vev fra (a) cerebellum og (b) et annet område fra samme hjerne fra et normalt dyr og et dyr som mistenkes å ha Alzheimers sykdom; (ii) å sette vevene i forbindelse med en forbindelse ifølge oppfinnelsen; (iii) å kvantifisere amyloid bundet til forbindelsen; (iv) å beregne forholdet mellom mengden av amyloid i hjerneområdet som ikke er cerebellum og mengden av amyloid i cerebellum; (v) å sammenligne forholdet for et normalt dyr med forholdet for et dyr som mistenkes å ha Alzheimers sykdom.

En diagnose på Alzheimers sykdom kan stilles som forholdet for et dyr som mistenkes å ha Alzheimers sykdom for eksempel er over 90% av forholdet for et normalt dyr. For denne fremgangsmåten er et "normalt" dyr et dyr som ikke lider av Alzheimers sykdom.

FARMASØYTISKE SAMMENSETNINGER

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer videre en farmasøytisk sammensetning som omfatter:

(i) en effektiv mengde av minst én forbindelse ifølge oppfinnelsen; og

(ii) et farmasøytisk akseptabelt bærerstoff.

Sammensetningen kan omfatte ytterligere en eller flere farmasøytisk akseptable bestanddeler innbefattet, men ikke begrenset til, ett eller flere fuktemidler, bufringsmidler, suspensjonsmidler, smøremidler, emulsjonsmidler, desintegrasjonsmidler, absorpsjonsmidler, konserveringsmidler, overflateaktive midler, fargestoffer, smaksstoffer, søtningsstoffer og terapeutiske midler.

Sammensetningen kan utformes til et fast stoff, en væske, en gel eller en suspensjon for: (1) Oral tilførsel som for eksempel en stor dose (drench) (vandig eller ikke-vandig løsning eller suspensjon), tablett (for eksempel beregnet på bukal, sublingual eller systemisk absorpsjon), bolus, pulver, granulat, masse for tilførsel til tungen, hard gelatinkapsel, myk gelatinkapsel, munnspray, emulsjon og mikroemulsjon; (2) parenteral administrering ved subkutan, intramuskulær, intravenøs eller epidural injeksjon, for eksempel en steril løsning, suspensjon eller utforming for vedvarende frigjøring; (3) topisk administrering, for eksempel som en krem, en salve, et plaster for kontroller frigjøring eller en spray som påføres huden; (4) intravaginal eller intrarektal administrering, for eksempel som et pessar, en krem eller et skum; (5) sublingual administrering; (6) okulær administrering; (7) transdermal administrering; eller (8) nasal administrering.

I en utførelse er sammensetningen utformet for intravenøs administrering, og bærerstoffet omfatter en væske og/eller et næringssupplement. I en annen utførelse kan sammensetningen bindes spesifikt til amyloid in vivo, det kan krysse blodhjernebarrieren, det er ikke-toksisk i egnede doseringsnivåer og/eller det har en tilfredsstillende varighet av virkningen. I nok en utførelse omfatter sammensetningen tilnærmet 10 mg humant serum albumin og fra omtrent 0,5 til 500 mg av forbindelsen ifølge oppfinnelsen pr milliliter fosfatbuffer tilsatt NaCl.

* * * *

De påfølgende eksemplene er gitt for å illustrere den foreliggende oppfinnelsen. Det bør imidlertid forstås at oppfinnelsen ikke skal begrenses til de spesifikke tilstandene eller detaljene som er beskrevet i disse eksemplene. Gjennom hele beskrivelsen inkorporeres alle referanser til et offentlig tilgjengelig dokument, innbefattet U.S. patenter, spesifikt heri ved referanse.

EKSEMPLER

Alle reagenser som ble benyttet i syntesen ble erholdt fra Aldrich Chemical Company og ble anvendt uten ytterligere rensing, dersom ikke annet er angitt. Smeltepunkt ble bestemt i Mel-TEMP II og ble ikke korrigert.<]>H NMR-spektrene til alle forbindelser ble målt i et Bruker 300 med TMS som intern referanse og var i samsvar med de tildelte strukturene. TLC ble utført ved anvendelse av Silica Gel 60 F254fra EM Sciences og forbindelser ble påvist under en UV-lampe. Flashkromatografi ble utført på silikagel 60 (230-400 mesh, erholdt fra Mallinckrodt Company). Revers fase TLC ble erholdt fra Whiteman Company.

Generell fremgangsmåte for syntese av forbindelse med formel I:

hvori:

R<1>er hydrogen, -OH, -N02, -CN, -COOR, -OCH2OR, Ci-Ce alkyl, C2-C6alkenyl, C2-C6alkynyl, C1-C6alkoksy eller halogen, hvori ett eller flere av atomene i R<1>kan være et radioaktivt atom;

hydrolyseres ved en av de påfølgende to fremgangsmåtene:

Fremstilling av 2- aminotiofenol ved hydrolyse:

Det 6-substituerte 2-aminobenzotiazolet (172 mmol) suspenderes i 50% KOH (180 g KOH oppløst i 180 ml vann) og etylenglykol (40 ml). Suspensjonen oppvarmes ved koking under tilbakeløp i 48 timer. Etter avkjøling til romtemperatur tilsettes toluen (300 ml) og reaksjonsblandingen nøytraliseres med eddiksyre (180 ml). Det organiske laget separeres og det vandige laget separeres med ytterligere 200 ml toluen. Toluenlagene slås sammen, vaskes med vann og tørkes over MgS04. Avdamping av løsemiddelet gir det ønskede produktet.

Fremstilling av 2- aminotiofenol ved hydrazinolyse:

Det 6-substituerte benzotiazolet (6,7 mmol) suspenderes i etanol (11 ml, vannfri) og hydrazin (2,4 ml) tilsettes under en nitrogenatmosfære ved romtemperatur. Rekasjonsblandingen kokes under tilbakeløp i 1 time. Løsemiddelet avdampes og restmaterialet løses i vann (10 ml) og justeres til pH 5 med eddiksyre. Utfelt materiale oppsamles ved filtrering og vaskes med vann for erholdelse av det ønskede produktet. Den resulterende 5-substituerte 2-amino-l-tiofenolen med formen kobles til en benzosyre med formen:

hvori R2 er hydrogen og R3 og R<4>uavhengig av hverandre er hydrogen, 0-C6 alkyl, C2-C6alkenyl eller C2-C6alkynyl.

ved følgende reaksjon:

En blanding av den 5-substituerte 2-aminotiofenolen (4,0 mmol), benzosyren (4,0 mmol) og polyfosforsyren (PPA) (10 g) oppvarmes til 220°C i 4 timer. Reaksjonsblandingen avkjøles til romtemperatur og uthelles i 10% kaliumkarbonatløsning (~400 ml). Utfelt materiale oppsamles ved filtrering under redusert trykk for erholdelse av det ønskede produktet som kan renses ved flashkromatografi eller rekrystallisering.

R<2->hydrogenet kan substitueres med enten et ikke-radioaktivt halogen eller et radioaktivt halogen ved følgende reaksjon.

En løsning av 6-substituert 2-(4'-aminofenyl)benzotiazol (1 mg) i 250^1 eddiksyre i en forseglet ampulle tilsettes 40^1 kloramin-T-løsning (28 mg løst i 500^1 eddiksyre) fulgt av 27^1 (omtrent 5 mCi) natrium[I25I]j<od>id (spesifikk aktivitet 2175 Ci/mmol). Reaksjonsblandingen omrøres ved romtemperatur i 2,5 timer og reaksjonen stanses med mettet natriumhydrogensulfittløsning. Etter fortynning med 20 ml vann, settes reaksjonsblandingen på en C8 Plus SepPak og elueres med 2 ml metanol. Avhengig av substituenten i 6-posisjonen, kan det være nødvendig å benytte beskyttelsesgrupper. For eksempel beskyttes 6-hydroksygruppen som metansulfonyl (mesyloksy) -derivatet. For avbeskyttelse av metansulfonylgruppen tilsettes 0,5 ml 1 M NaOH til den eluerte løsningen av radioaktivt jodinert mellomprodukt. Blandingen oppvarmes til 50°C i 2 timer. Etter tilsetning av 500^1 1 M eddiksyre, fortynnes reaksjonsblandingen med 40 ml vann og settes på en C8 Plus SepPak. Det radioaktivt jodinerte produktet med en radioaktivitet på omtrent 3 mCi elueres fra SepPak-kolonnen med 2 ml metanol. Løsningen oppkonsentreres med en nitrogenstrøm til 300^1 og råproduktet renses ved HPLC på en Phenomenex ODS-kolonne (MeCN/TEA-buffer, 35:65, pH 7,5, gjennomstrømningshastighet 0,5 ml/minutt opptil 4 minutter, 1,0 ml/minutt i 4-6 minutter og 2,0 ml/minutt etter 6 minutter, retensjonstid 23,6). De oppsamlede fraksjonene settes på en C8 Plus SepPak. Eluering med 1 ml etanol gir tilnærmet 1 mCi av det endelige radioaktivt jodinerte produktet.

Dersom en av eller både R3 og R<4>er hydrogen, kanR<3>ogR<4>overføres til C1-C6alkyl, C2-C6alkenyl eller C2-C6alkynyl ved reaksjon med et alkyl-, alkenyl- eller alkynylhalid under følgende betingelser: For dialkylering: En løsning av 6-substituert 2-(4'-aminofenyl)benzotiazol (0,59 mmol) i DMSO (vannfritt, 2 ml) tilsettes alkyl-, alkenyl- eller alkynylhalid (2,09 mmol) og K2CO3(500 mg, 3,75 mmol). Reaksjonsblandingen oppvarmes til 140°C i 16 timer. Etter avkjøling til romtemperatur uthelles reaksjonsblandingen i vann og ekstraheres med etylacetat (3x10 ml). De organiske lagene slås sammen og løsemiddelet avdampes. Restmaterialet renses ved flashkolonnekromatografi for erholdelse av det ønskede 6-substituerte (dimetylaminofenyi)benzotiazolet.

For monoalkylering: En løsning av 6-substituert 2-(4'-aminofenyl)benzotiazol (0,013 mmol) i DMSO (vannfritt, 0,5 ml) tilsettes alkyl-, alkenyl- eller alkynylhalid (0,027 mmol) og vannfritt K2CO3(100 mg, 0,75 mmol). Reaksjonsblandingen oppvarmes til 100°C i 16 timer. Etter avkjøling til romtemperatur renses reaksjonsblandingen direkte ved normal fase preparativ TLC for erholdelse av de ønskede 6-substituerte 2-(4'-metylaminofenyl)benzotiazolderivatene.

Dersom R<2>er hydrogen eller et ikke-radioaktivt halogenatom og R4 er C1-C6alkyl, C2-C6alkenyl eller C2-C6alkynyl, hvori alkyl, alkenyl eller alkynyl omfatter et radioaktivt karbonatom eller er substituert med et radioaktivt halogenatom, kan forbindelsen syntetiseres ved en av følgende reaksjonsveier:

For inkorporering av radioaktivt karbon:

Tilnærmet 1 Ci av [<n>C]karbondioksid fremstilles ved anvendelse av en CTI/Siemens RDS 112 negativ ion syklotron ved bestråling av et nitrogengass (<14>N2) -mål som inneholder 1% oksygengass med en 40 stråle av 11 Me V protoner i 60 minutter. [<n>C]karbondioksid overføres til [<n>C]metyljodid ved først å få reagere med en mettet løsning av litiumaluminiumhydrid i THF fulgt av tilsetning av hydrogenjodid ved koking under tilbakeløp for dannelse av [<n>C]metyljodid.

[<n>C]metyljodid føres i en strøm av nitrogengass til en reaksjonsampulle som inneholder forløperen for radioaktiv merking. Forløperen, 6-substiutert 2-(4'-

aminofenyl)benzotiazol (~3,7^mol) løses i 400^1 DMSO. Vannfri KOH (10 mg) tilsettes og V-ampulle på 3 ml virvles i 5 minutter. [<n>C]metyljodid uten tilsatt bærer blir boblet gjennom løsningen med en hastighet på 30 ml/minutt ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen oppvarmes i 5 minutter til 95°C ved anvendelse av et oljebad. Reaksjonsproduktet renses ved semipreparativ HPLC ved anvendelse av en Prodigy OSD-Prep kolonne og eluering med 60% acetonitril/40% trietylammoniumfosfatbuffer pH 7,2 (gjennomstrømningshastighet 5 ml/minutt i 0-7 minutter), så økt til 15 ml/minutt i 7-30 minutter). Fraksjonen som inneholder [N-metyl-<n>C] 6-substituert 2-(4'-metylaminofenyl)benzotiazol (etter tilnærmet 15 minutter) oppsamles, fortynnes med 50 ml vann og elueres gjennom en Waters Cl8 SepPak Plus-patron. Cl 8 SepPak-patronen vaskes med 10 ml vann og produktet elueres med 1 ml etanol (absolutt) i en steril ampulle fulgt av 14 ml saltløsning. Den radiokjemiske og kjemiske renheten >95%, bestemt ved analytisk HPLC (k' = 4,4 ved anvendelse av en Prodigy ODS(3) analytisk kolonne eluert med 65/35 acetonitril/trietylammoniumfosfatbuffer ph 7,2). Det radiokjemiske utbyttet er gjennomsnittlig 17% ved EOS basert på [<n>C]metyljodid og den spesifikke aktiviteten er gjennomsnittlig tilnærmet 160 GBq/^mol (4,3 Ci/^mol) ved fullført syntese.

For inkorporering av radioaktivt halogen:

En blanding av 6-substituert 2-(4'-aminofenyi)benzatiazol (beskyttelsesgrupper kan være nødvendige, avhengig av egenskapene til 6-substiutenten som bemerket ovenfor) (0,22 mmol), NaH (4,2 mmol) og 2-(3-brompropoksy)tetrahydro-2-H-pyran (0,22 mmol) i THF (8 ml) oppvarmes med koking under tilbakeløp i 23 timer. Løsemiddelet fjernes ved destillering og restmaterialet løses i etylacetat og vann, det organiske laget separeres og det vandige laget ekstraheres med etylacetat (10 ml x 6). Det organiske laget slås sammen, tørkes over MgS04og inndampes til tørrhet. Til restmaterialet tilsettes en løsning av ACOH/THF/H2O (5 ml, 4/2/1) og oppvarmes til 100°C i 4 timer. Løsemiddelt fjernes ved avdamping og restmaterialet løses i etylacetat (~10 ml), vaskes med en NaHC03-løsning, tørkes over MgS04og inndampes til tørrhet for erholdelse av et restmateriale som renses ved preparativ TLC (heksan:etylacetat = 60:40) for erholdelse av det ønskede 6-substituerte 2-(4'-(3"-hydroksypropylamino)fenyl)benzotiazolet (45%).

En løsning av 6-substituert 2-(4'-(3"-hydroksypropylamino)fenyl)benzotiazol (0,052 mmol) og Et3N (0,5 ml) løst i aceton (5 ml) tilsettes (Boc)20 (50 mg, 0,22 mmol). Reaksjonsblandingen omrøres ved romtemperatur i 6 timer fulgt av tilsetning av tosylklorid (20 mg, 0,11 mmol). Reaksjonsblandingen omrøres ved romtemperatur i ytterligere 24 timer. Løsemiddelet fjernes og restmaterialet løses i etylacetat (10 ml), vaskes med en NaCCvløsning, tørkes over MgSC«4, inndampes og renses ved flashkolonnekromatografi (heksan/etylacetat = 4/1) for erholdelse av det ønskede 6-substituerte 2-(4'-(3"-toluensulfonoksypropylamino)fenyl)benzotiazolet (13%). Dette 6-substituerte 2-(4'-(3"-toluensulfonoksypropylamino)fenyl)benzotiazolet fluorineres så med radioaktivt fluor ved standardfremgangsmåter som følger: Et syklotronmål inneholdende 0,35 ml 95% [O-18]-anriket vann bestråles med 11 MeV protoner ved en strålestrømstyrke på 20 i 60 minutter og innholdet overføres til en 5 ml reaksjonsampulle tilsatt Kryptofix 222 (22,3 mg) og K2CO3(7,9 mg) i acetonitril (57^1). Løsningen inndampes til tørrhet tre ganger ved 110°C under en strøm av argon etter tilsetning av 1 ml porsjoner av acetonitril. Til det tørkede [F-18]fluoridet tilsettes 3 mg 6-substituert 2-(4'-(3"-toluensulfonoksypropylamino)fenyl)benzotiazol i 1 ml DMSO, og reaksjonsampullen forsegles og oppvarmes til 85°C i 30 minutter. Reaksjonsampullen tilsettes 0,5 ml MeOH/HCl (konsentrert) (2/1 volum/volum), og ampullen oppvarmes til 120°C i 10 minutter. Etter oppvarmingen tilsettes 0,3 ml av 2 M natriumacetatbuffer til reaksjonsløsningen, fulgt av rensing ved semipreparativ HPLC ved anvendelse av en Phenomenex Prodigy ODS-prep C18-kolonne (10^m, 250 x 10 mm) og eluering med 40% acetonitril/60% 60 mM trietylaminfosfatbuffer (volum/volum) pH 7,2 ved en gjennomstrømningshastighet på 5 ml/minutt i 15 minutter, hvoretter hastigheten økes til 8 ml/minutt for resten av separasjonen. Produktet, [F-18] 6-substituert 2-(4'-(3"-fluorpropylamino)fenyl)benzotiazol, elueres etter tilnærmet 20 minutter i et volum på tilnærmet 16 ml. Fraksjonen som inneholder [F-18] 6-substituert 2-(4'-(3"-fluorpropylamino)fenyl)benzotiazol fortynnes med 50 ml vann og elueres gjennom en Waters C18 SepPak Plus-patron, SepPak-patronen vaskes så med 10 ml vann og produktet elueres ved anvendelse av 1 ml etanol (absolutt) i en steril ampulle. Løsningen fortynnes med 10 ml steril normal saltløsning for intravenøs injeksjon i dyr. Det [F-18] 6-substituerte 2-(4'-(3"-fluorpropylamino)fenyl)benzotiazolproduktet erholdes i et 2-12% radiokjemisk utbytte etter 120 minutters radioaktiv syntese (ikke korrigert for nedbrytning) med en gjennomsnittlig spesifikk aktivitet på 1500 Ci/mmol.

Synteseeksempler

Eksempel 1: [N-metyl-<11>C]2-(4f<->dimetylaminofenyl)-6-metoksybenzotiazol ble syntetisert ifølge reaksjonsskjema I.

Tilnærmet 1 Ci av [<n>C]karbondioksid ble fremstilt ved anvendelse av en CTI/Siemens RDS 112 negativ ion syklotron ved bestråling av et nitrogengass (<14>N2) -mål inneholdende 1% oksygengass med en stråle med 40 strømstyrke av 11 MeV protoner i 60 minutter. [<n>C]karbondioksid overføres til [<n>C]metyljodid ved først å få reagere med en mettet løsning av litiumaluminiumhydrid i THF fulgt av tilsetning av hydrogenjodid ved koking under tilbakeløp for dannelse av [<n>C]metyljodid. [<n>C]metyljodidet føres i en strøm av nitrogengass til en reaksjonsampulle som inneholder forløperen som skal merkes radioaktivt. Forløperen, 6-CH3O-BTA-I (1,0 mg, 3,7^mol), ble løst i 400^1 DMSO. Vannfritt KOH (10 mg) ble tilsatt, og V-ampullen på 3 ml ble virvlet i 5 minutter.

[<n>C]metyljodid uten tilsatt bærer ble boblet gjennom løsningen med en hastighet på 30 ml/minutt ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet i 5 minutter ved 95°C ved anvendelse av et oljebad. Reaksjonsproduktet ble renset ved semipreparativ HPLC ved anvendelse av en Prodigy ODS-Prep-kolonne eluert med 60% acetonitril/40% trietylammoniumfosfatbuffer pH 7,2

(gjennomstrømningshastighet 5 ml/minutt i 0-7 minutter, økt til 15 ml/minutt mellom 7 og 30 minutter). Fraksjonen som inneholdt [N-metyl-<n>C]2-(4'-dimetylaminofenyl)-6-metoksybenzotiazol (etter tilnærmet 15 minutter) ble oppsamlet, fortynnet med 50 ml vann og eluert gjennom en Waters Cl8 SepPak Plus-patron. C18 SepPak-patronen ble vasket med 10 ml vann og produktet ble eluert med 1 ml etanol (absolutt) i en steril ampulle fulgt av 14 ml saltløsning. Den radiokjemiske og kjemiske renheten var >95% bestemt ved analytisk HPLC (k' = 4,4 ved anvendelse av en Prodigy ODS(3) analytisk kolonne eluert med 65/35 acetonitril/trietylammoniumfosfatbuffer pH 7,2). Det radiokjemiske utbyttet var gjennomsnittlig 17% ved EOS, basert på [nC]metyljodid, og den spesifikke aktiviteten var gjennomsnittlig tilnærmet 160 BGq/^mol (4,3 Ci/^mol) ved avsluttet syntese.

Eksempel 2: 2-(3f<-125>I-jod-4f<->aminofenyl)benzotiazol-6-ol ble syntetisert ifølge reaksjonsskjema II.

En løsning av 2-(4'-aminofenyl)-6-metansulfonoksybenzotiazol (1 mg) i 250^1 eddiksyre i en forseglet ampulle ble tilsatt 40^1 kloramin T-løsning (28 mg løst i 500^1 eddiksyre) fulgt av 27^1 (omtrent 5 mCi) natrium[I25I]jodid (spesifikk aktivitet 2175 Ci/mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2,5 timer og reaksjonen ble stanset med mettet natriumhydrogensulfittløsning. Etter fortynning med 20 ml vann, ble reaksjonsblandingen satt på en C8 Plus SepPak-patron og eluert med 2 ml metanol. For fjerning av metansulfonylgruppen, ble 0,5 ml 1 M NaOH tilsatt til den eluerte løsningen av radioaktivt jodert mellomprodukt. Blandingen ble oppvarmet til 50°C i 2 timer. Etter tilsetning av 500 ^1 1 M eddiksyre, ble reaksjonsblandingen fortynnet med 40 ml vann og satt på en C8 Plus SepPak-patron. Det radioaktivt joderte produktet med en radioaktivitet på omtrent 3 mCi ble eluert fra SepPak-patronen med 2 ml metanol. Løsningen ble konsentrert til 300^1 med en nitrogenstrøm og råproduktet ble renset ved HPLC på en Phenomenex ODS-kolonne (MeCN/TEA-buffer, 35:65, pH 7,5, gjennomstrømningshastighet 0,5 ml/minutt opptil 4 minutter, 1,0 ml/minutt mellom 4 og 6 minutter og 2,0 ml/minutt etter 6 minutter, retensjonstid 23,6). De oppsamlede fraksjonene ble satt på en C8 Plus SepPak-patron. Eluering med 1 ml etanol ga omtrent 1 mCi av det endelige radioaktivt joderte produktet.

Fremstilling av de<I23>I-merkede derivatene forløper på tilsvarende måte som syntesen som skissert ovenfor. For eksempel vil erstatning av natrium [<I25>I]jodid med natrium [<I23I]>jodid i syntesefremgangsmåten gi den<I23>I-merkede forbindelsen. Slik erstatning av ett radioaktivt halogenatom med et annet, er velkjent innen faget, se for eksempel Mathis CA, Taylor SE, Biegon A, Enas JD. [ i fyeI]5-Iodo-6-nitroquipazine: a potent and selective ligand for the 5-hydroxytryptamine uptake complex I. In vitro studies. Brain Research 1993; 619: 229-235; Jagust W, Eberling JL, Roberts JA, Brennan KM, Hanrahan SM, Van Brocklin H, Biegon A, Mathis CA. In vivo imaging of the 5-hydroxytryptamine reuptake site in primate brain using SPECT and [<I23>I]5-Iodo-6-nitroquipazine. European Journal of Pharmacology 1993; 242:189-193; Jagust WJ, Eberling JL, Biegon A, Taylor SE, VanBrocklin H, Jordan S, Hanrahan SM, Roberts JA, Brennan KM, Mathis CA.

[Iodine-123]5-Iodo-6-Nitroquipazine: SPECT Radiotracer to Image the Serotonin Transporter. Journal of Nuclear Medicine 1996; 37: 1207-1214.

Eksempel 3: 2-(3-<18>F-fluor-4-metylaminofenyl)benzotiazol-6-ol ble syntetisert ifølge reaksjonsskjema III.

Et syklotronmål inneholdende 0,35 ml 95% [0-18]-anriket vann ble bestrålt med 11 MeV protoner i en stråle med en strømstyrke på 20 i 60 minutter og innholdet ble overført til en 5 ml reaksjonsampulle tilsatt 2 mg CS2CO3i acetonitril (57^1). Løsningen ble tre ganger inndampet til tørrhet ved 110°C under en argonstrøm ved anvendelse av 1 ml porsjoner av acetonitril. Det tørkede [F-18]fluoridet ble tilsatt 6 mg 6-MOMO-BT-3'-Cl-4'-N02i 1 ml DMSO og reaksjonsampullen ble forseglet og oppvarmet til 120°C i 20 minutter (den radiokjemiske inkorporeringen i dette første radioaktive syntesetrinnet var tilnærmet 20% av oppløst [F-18]fluorid). Reaksjonsblandingen ble tilsatt 8 ml vann og 6 ml dietyleter, blandingen ble omristet og fasene ble separert. Eterfasen ble fjernet og inndampet til tørrhet under en strøm av argon ved 120°C. Den tørkede prøven ble tilsatt 0,5 ml absolutt EtOH sammen med 3 mg kobber(II)acetat og 8 mg NaBH.4. Reduksjonsreaksjonen fikk forløpe i 10 minutter ved romtemperatur (utbyttet av råprodukt i reduksjonstrinnet var tilnærmet 40%). Reaksjonsblandingen ble tilsatt 8 ml vann og 6 ml dietyleter, blandingen ble omristet og eterfasen ble separert. Dietyleterfasen ble tørket under en strøm av argon ved 120°C. Reaksjonsampullen ble tilsatt 700^1 DMSO tilsatt 30 mikromol CH3I og 20 mg vannfritt KOH. Reaksjonsampullen ble oppvarmet til 120°C i 10 minutter. En løsning av 700fal 2:1 MeOH/HCl (konsentrert) ble tilsatt, og blandingen ble oppvarmet til 120°C i 15 minutter. Etter oppvarmingen ble 1 ml 2 M natriumacetatbuffer tilsatt til re aksjons løsningen fulgt av rensing ved semipreparativ HPLC ved anvendelse av en Phenomenex Prodigy ODS-prep Cl 8-kolonne (10^m, 250 x 10 mm) eluert med 35% acetonitril65% 60 mM trietylaminfosfatbuffer (volum/volum) pH 7,2 ved en gjennomstrømningshastighet på 5 ml/minutt i 2 minutter, hvoretter hastigheten ble økt til 15 ml/minutt for resten av separasjonen. Produktet, 2-(3-<I8>F-fluor-4-metylaminofenyl)benzotiazol-6-ol, ble eluert etter~15 minutter i et volum på tilnærmet 16 ml. Fraksjonen som inneholdt 2-(3-<I8>F-fluor-4-metylaminofenyl)benzotiazol-6-ol ble fortynnet med 50 ml vann og sendt gjennom en Waters Cl 8 SepPak Plus-patron. SepPak-patronen ble så vasket med 10 ml vann og produktet ble eluert ved anvendelse av 1 ml etanol (absolutt) i en steril ampulle. Løsningen ble fortynnet med 10 ml steril normal saltløsning for intravenøs injeksjon i dyr. 2-(3-<I8>F-fluor-4-metylaminofenyl)benzotiazol-6-olproduktet ble erholdt i et radiokjemisk utbytte på 0,5% (n = 4) etter 120 minutters radioaktiv syntese (ikke korrigert for nedbrytning) med en gjennomsnittlig spesifikk aktivitet på 1000 Ci/mmol. Radiokjemisk og kjemisk renhet av 2-(3-<I8>F-fluor-4-metylaminofenyi)benzotiazol-6-ol ble vurdert ved radioaktiv HPLC med UV-deteksjon ved 350 nm ved anvendelse av en Phenomenex Prodigy ODS(3) Cl 8-kolonne (5^m, 250 x 4,6 mm) eluert med 40% acetonitril/60% 60 mM trietylaminfosfatbuffer (volum/volum) pH 7,2. 2-(3-<I8>F-fluor-4-metylaminofenyl)benzotiazol-6-ol hadde en retensjonstid på~11 minutter ved en gjennomstrømningshastighet på 2 ml/minutt (k' = 5,5). Den radiokjemiske renheten var >99% og den kjemiske renheten >90%. Den radiokjemiske identiteten til 2-(3-<I8>F-fluor-4-metylaminofenyl)benzotiazol-6-ol ble bekreftet ved revers fase radioaktiv HPLC ved benyttelse av en kvalitetskontrollprøve av det endelige radioaktive produktet injisert sammen med en autentisk (umerket) standard.

Eksempel 4: 2-[4-(3-<18>F-lfuorpropylamino)fenyl]benzotiazol-6-ol ble syntetisert ifølge reaksjonsskjema IV.

Et syklotronmål inneholdende 0,35 ml 95% [0-18]-anriket vann ble bestrålt med 11 Me V protoner i en stråle med strømstyrke 20 i 60 minutter og innholdet ble overført til en 5 ml reaksjonsampulle tilsatt Kryptofix 222 (22,3 mg) og K2CO3(7,9 mg) i acetonitril (57^1). Løsningen ble tre ganger inndampet til tørrhet ved 110°C under en argonstrøm etter tilsetning av 1 ml porsjoner av acetonitril. Det tørkede [F-18]fluoridet ble tilsatt 3 mg 6-MOMO-BTA-N-Pr-Ots i 1 ml DMSO, og reaksjonsampullen ble forseglet og oppvarmet til 85°C i 30 minutter. Reaksjonsampullen ble tilsatt 0,5 ml MeOH/HCl (konsentrert) (2/1 volum/volum), og ampullen ble oppvarmet til 120°C i 10 minutter. Etter oppvarmingen ble 0,3 ml 2 M natriumacetatbuffer tilsatt til reaksjonsblandingen fulgt av rensing ved semipreparativ HPLC ved anvendelse av en Phenomenex Prodigy ODS-prep Cl 8-kolonne (10^m, 250 x 10 mm) eluert med 40% acetonitril/60% 60 mM trietylaminfosfatbuffer (volum/volum) pH 7,2 ved en gjennomstrømningshastighet på 5 ml/minutt i 15 minutter, hvoretter hastigheten ble økt til 8 ml/minutt for resten av separasjonen. Produktet, [F18]6-HO-BTA-N-PrF, ble eluert etter~20 minutter i et volum på tilnærmet 16 ml. Fraksjonen som inneholdt [F18]6-HO-BTA-N-PrF ble fortynnet med 50 ml vann og sendt gjennom en Waters C18 SepPak Plus-patron. SepPak-patronen ble så vasket med 10 ml vann, og produktet ble eluert til en steril ampulle ved anvendelse av 1 ml etanol (absolutt). Løsningen ble fortynnet med 10 ml steril normal saltløsning for intravenøs injeksjon i dyr. [F18]6-HO-BTA-N-PrF-produktet ble erholdt i et radiokjemisk utbytte på 8 + 4% (n = 8) etter 120 minutters radioaktiv syntese (ikke korrigert for nedbrytning) med en gjennomsnittlig spesifikk aktivitet på 1500 Ci/mmol. Den radiokjemiske og kjemiske renheten av [F18]6-HO-BTA-N-PrF ble anslått ved radioaktiv HPLC med UV-deteksjon ved 350 nm ved anvendelse av en Phenomenex Prodigy ODS(3) C18-kolonne (5^m, 250 x 4,6 mm) eluert med 40% acetonitril/60% 60 mM trietylaminfosfatbuffer (volum/volum) pH 7,2. [F18]6-HO-BTA-N-PrF hadde en retensjonstid på~12 minutter ved en gjennomstrømningshastighet på 2 ml/minutt (k' = 6,1). Den radiokjemiske renheten var >99% og den kjemiske renheten >90%. Den radiokjemiske identiteten til [F18]6-HO-BTA-N-PrF ble bekreftet ved revers fase radioaktiv HPLC ved benyttelse av en kvalitetskontrollprøve av det endelige radioaktive produktet injisert sammen med en autentisk (ikke radioaktiv) standard.

Eksempel 5: Syntese av 2-(3'-jod-4'-aminofenyl)-6-hydroksybenzotiazol

Fremstilling av 4-metoksy-4'-nitrobenzanilid

p-anisidin (1,0 g, 8,1 mmol) ble løst i vannfri pyridin (15 ml) og 4-nitrobenzoylklorid (1,5 g, 8,1 mmol) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble innkubert ved romtemperatur i 16 timer. Reaksjonsblandingen ble uthelt i vann og utfelt materiale ble oppsamlet ved vakuumfiltrering og vasket med 5% natriumbikarbonat (2x10 ml). Produktet ble anvendt i neste trinn uten ytterligere rensing.<]>HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 5: 10,46 (s, 1H, NH), 8,37 (d, J = 5,5 Hz, 2H, H-3',5'), 8,17 (d, J = 6,3 Hz, 2H, H-2',6'), 7,48 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 6,97 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 3,75 (s, 3H, MeO).

Fremstilling av 4-metoksy-4'-nitrotiobenzanilid

En blanding av 4-metoksy-4'-nitrotiobenzanilin (1,0 g, 3,7 mmol) og Lawessons reagens (0,89 g, 2,2 mmol, 0,6 ekv.) i klorbenzen (15 ml) ble kokt under tilbakeløp i 4 timer. Løsemiddelet ble avdampet og restmaterialet renset ved flashkromatografi (heksan:etylacetat = 4:1) for erholdelse av 820 mg (77,4%) av produktet som et oransje fast stoff.<]>HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 5: 8,29 (d, 2H, H-3',5'), 8,00 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-2',6'), 7,76 (d, 2H), 7,03 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 3,80 8,37 (d, J = 5,5 Hz, 2H, H-3',5'), 8,17 (d, J = 6,3 Hz, 2H, H-2',6'), 7,48 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 6,97 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 3,75 (s, 3H, MeO). (s, 3H, MeO).

Fremstilling av 6-metoksy-2-(4-nitrofenyl)benzotiazol

4-metoksy-4'-nitrotiobenzanilider (0,5 g, 1,74 mmol) ble fuktet med litt etanol (~0,5 ml) og 30% vandig natriumhydroksidløsning (556 mg, 13,9 mmol, 8 ekv.) ble tilsatt. Blandingen ble fortynnet med vann for erholdelse av en endelig løsning/suspensjon av 10% vandig natriumhydroksid. Uttak fra denne blandingen ble med 1 minutts mellomrom tilsatt til en omrørt løsning av kaliumjerncyanid (2,29 g, 6,9 mmol, 4 ekv.) i vann (5 ml) ved 80-90°C. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet i ytterligere 0,5 timer og så avkjølt. Utfelt materiale ble oppsamlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann og renset ved flashkromatografi (heksan:etylacetat = 4:1) for erholdelse av 130 mg (26%) av produktet.<!>HNMR (300 MHz, aceton-de) 5: 8,45 (m, 4H), 8,07 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-4), 7,69 (s, 1H, H-7), 7,22 (d, J = 9,0 Hz, 1H, H-5), 3,90 (s, 3H, MeO).

Fremstilling av 6-metoksy-2-(4-aminofenyl)benzotiazol

En blanding av 6-metoksy-2-(4-nitrofenyl)benzotiazolene (22 mg, 0,077 mmol) og tinn(II)klorid □omograf (132 mg, 0,45 mmol) i kokende etanol ble omrørt under nitrogen i 4 timer. Etanolen ble avdampet og restmaterialet løst i etylacetat (10 ml), vasket med 1 N natriumhydroksid (2 ml) og vann (5 ml) og tørket over MgS04. Avdamping av løsemiddelet ga 19 mg (97%) av produktet som et gult fast stoff.

Fremstilling av 2-(3'-jod-4'-aminofenyl)-6-metoksybenzotiazol

En løsning av 2-(4'-aminofenyl)-6-metoksybenzotiazol (22 mg, 0,09 mmol) i iseddik (2,0 ml) ble tilsatt 1 M jodkloridløsning i CH2C12(0,10 ml, 0,10 mmol, 1,2 ekv.) under N2-atmosfære ved injeksjon. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer. Iseddiken ble fjernet under redusert trykk og restmaterialet løst i CH2C12. Etter nøytralisering av løsningen med NaHC03ble det vandige laget separert og ekstrahert med CH2C12. De organiske lagene ble slått sammen og tørket over MgS04. Etter fordamping av løsemiddelet, ble restmaterialet renset ved preparativ TLC (heksanenetylacetat = 6:1) for erholdelse av 2-(4'-amino-3'-jodfenyl)-6-metoksybenzotiazol (25 mg, 76%) som et brunt fast stoff.<!>HNMR

(300 MHz, CDCI3) 5 (ppm): 8,35 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,87 (dd, Ji = 2,0 Hz, J2= 9,0 Hz, 1H), 7,31 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,04 (dd, Ji = 2,2 Hz, J2= 9,0 Hz, 1H), 6,76 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 3,87 (s, 3H).

Fremstilling av 2-(3'-jod-4'-aminofenyl)-6-hydroksybenzotiazol

En løsning av 2-(4'-amino-3'-jodfenyl)-6-metoksybenzotiazol (5) (8,0 mg, 0,02 mmol) i CH2C12(2,0 ml) ble tilsatt 1 M BBr3-løsning i CH2C12(0,20 ml, 0,20 mmol) under N2-atmosfære ved injeksjon. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer. Etter at reaksjonen var stanset med vann, ble blandingen nøytralisert med NaHC03. Det vandige laget ble ekstrahert med etylacetat (3x3 ml). De organiske lagene ble slått sammen og tørket over MgSC«4. Løsemiddelet ble så avdampet under redusert trykk og restmaterialet renset ved preparativ TLC (heksanenetylacetat = 7:3) for erholdelse av 2-(3'-jod-4'-aminofenyl)-6-hydroksybenzotiazol (4,5 mg, 58%) som et brunt fast stoff.<]>HNMR (300 MHz, aceton-d6) 5 (ppm): 8,69 (s, 1H), 8,34 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,77 (dd, Ji = 2,0 Hz, J2= 8,4 Hz, 1H), 7,76 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,40 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,02 (dd, Ji = 2,5 Hz, J2= 8,8 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,47 (br., 2H), HRMS m/ z 367,9483 (M<+>beregnet for C13H9N2OSI 367,9480).

Eksempel 6: Syntese av 2-(3'-jod-4'-metylaminofenyl)-6-hydroksybenzotiazol

Fremstilling av 6-metoksy-2-(4-metylaminofenyl)benzotiazol

En blanding av 4-metylaminobenzosyre (11,5 g, 76,2 mmol) og 5-metoksy-2-aminotiofenol (12,5 g, 80 mmol) ble oppvarmet i PPA (-30 g) til 170°C under N2-atmosfære i 1,5 timer. Reaksjonsblandingen ble så avkjølt til romtemperatur og uthelt i en 10% løsning av K2C03. Utfelt materiale ble frafiltrert under redusert trykk. Råproduktet ble rekrystallisert to ganger fra aceton/vann og THF/vann fulgt av behandling med aktivt kull for erholdelse av 4,6 g (21%) 6-metoksy-2-(4-metylaminofenyi)benzotiazol som et gult fast stoff.<1>HNMR (300 MHz, aceton-de) 5: 7,84 (d, J = 8,7 Hz, 2H, H-2' 6'), 7,78 (dd, Ji = 8,8 Hz, J2= 1,3 Hz, 1H, H-4), 7,52 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H-7), 7,05 (dd, Ji = 8,8 Hz, J2= 2,4 Hz, H-5), 6,70 (d, J = 7,6 Hz, 2H, H-3' 5'), 5,62 (s, 1H, NH), 3,88 (s, 3H, OCH3), 2,85 (d, J = 6,2 Hz, 3H, NCH3).

Fremstilling av 2-(3'-jod-4'-metylaminofenyl)-6-metoksybenzotiazol

En løsning av 2-(4'-metylaminofenyl)-6-metoksybenzotiazol (20 mg, 0,074 mmol) løst i iseddik (2 ml) ble tilsatt Ici (90 ul, 0,15 mmol, 1,2 ekv., 1 M i CH2C12) under N2. Reaksjonen ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer. Iseddiken ble så fjernet under redusert trykk. Restmaterialet ble løst i CH2C12og nøytralisert med NaHCC>3. Det vandige laget ble ekstrahert med CH2C12og de organiske lagene ble slått sammen, tørket over MgS04og inndampet. Restmaterialet ble renset ved preparativ TLC (heksan:EA = 2:1) for erholdelse av 2-(4'-metylamino-3'-jodfenyl)-6-metoksybenzotiazol (8 mg, 27%) som et brunt fast stoff.<]>HNMR (300 MHz, CDC13) 5 (ppm): 8,39 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,88 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 7,33 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,06 (dd, Ji = 2,2 Hz, J2= 9,0 Hz, 1H), 6,58 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 3,89 (s, 3H, OCH3).

Fremstilling av 2-(3'-jod-4'-metylaminofenyl)-6-hydroksybenzotiazol

En løsning av 2-(4'-metylamino-3'-jodfenyl)-6-metoksybenzotiazol (12 mg, 0,03 mmol) løst i CH2C12(4 ml) ble tilsatt BBR3(400 ul, 0,4 mmol, 1 M i CH2C12) under N2. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer. Vann ble så tilsatt for å stanse reaksjonen, og løsningen ble nøytralisert med NaHCC*3 og ekstrahert med etylacetat (3x5 ml). De organiske lagene ble slått sammen, tørket over MgSC«4 og inndampet. Restmaterialet ble renset ved preparativ TLC (heksan:EA = 7:3) for erholdelse av 2-(4'-metylamino-3'-jodfenyl)-6-hydroksybenzotiazol (5 mg, 43%) som et brunt fast stoff.<]>HNMR (300 MHz, CDCI3) 5 (ppm): 8,37 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,88 (dd, Ji = 2,0 Hz, J2= 8,4 Hz, 1H), 7,83 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,28 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,96 (dd, Jj= 2,5 Hz, J2= 8,8 Hz, 1H), 6,58 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 2,96 (s, 3H, CH3).

Eksempel 7: Radioaktiv syntese av[12<5>I]6-OH-BTA-0-3f<->I

Fremstilling av 2-(4'-nitrofenyl)-6-hydroksybenzotiazol

En suspensjon av 2-(4'-nitrofenyl)-6-metoksybenzotiazol (400 mg, 1,5 mmol) i CH2C12(10 ml) ble tilsatt BBr3(1 M i CH2C12, 10 ml, 10 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 24 timer. Reaksjonen ble så stanset med vann og blandingen ekstrahert med etylacetat (3 x 20 ml). De organiske lagene ble slått sammen, vasket med vann, tørket over MgSCvog inndampet. Restmaterialet ble renset ved flashkromatografi (silikagel, heksanenetylacetat = 1:1) for erholdelse av produktet som et gult fast stoff (210 mg, 55%).<]>HNMR (300 MHz, aceton-d6) 5 (ppm): 9,02 (s, OH), 8,41 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 8,33 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 7,96 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,53 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,15 (dd, JI = 8,6 Hz, J2 = 2,4 Hz, 1H).

Fremstilling av 2-(4,-nitrofenyl)-6-metylsulfoksybenzotiazol En løsning av 2-(4'-nitrofenyl)-6-hydroksybenzotiazol (50 mg, 0,18 mmol) løst i aceton (7 ml, vannfri) ble tilsatt K2CO3(100 mg, 0,72 mmol, pulverisert) og MsCl (200^1). Etter omrøring i 2 timer ble reaksjonsblandingen filtrert. Filtratet ble oppkonsentrert og restmaterialet renset ved flashkromatografi (silikagel, heksan:etylacetat = 4:1) for erholdelse av 2-(4'-nitrofenyl)-6-metylsulfoksybenzotiazol (44 mg, 68%) som et lysegult fast stoff.<]>HNMR (300 MHz, aceton-d6) 5 (ppm): 8,50-8,40 (m, 4H), 8,29 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 8,23 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,61 (dd, Ji = 2,3 Hz, J2= 8,9 Hz, 1H).

Fremstilling av 2-(4,-aminofenyl)-6-metylsulfoksybenzotiazol En løsning av 2-(4'-nitrofenyi)-6-metylsulfoksybenzotiazol (35 mg, 0,10 mmol) i etanol (10 ml) ble tilsatt SnCl2.2H20 (50 mg). Reaksjonsblandingen ble kokt under tilbakeløp i 1,5 timer. Løsemiddelet ble så fjernet under redusert trykk. Restmaterialet ble løst i etylacetat (10 ml), vasket med 1 N NaOH og vann og tørket over MgS04. Avdamping av løsemiddelet ga 2-(4'-aminofenyl)-6-metylsulfoksybenzotiazol (21 mg, 65%) som et lysebrunt fast stoff.<]>HNMR (300 MHz, CDCI3) 5 (ppm): 8,02 (d, 1H), 7,92 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,84 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,38 (dd, Ji = 2,4 Hz, J2= 6,2 Hz, 1H), 6,78 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 2,21 (s, 3H, CH3).

Eksempel 8: Radioaktiv syntese av ^ Iie- OH- BTA- l- a'-!

En løsning av 2-(4'-metylaminofenyl)-6-hydroksybenzotiazol (300 mg, 1,17 mmol) løst i CH2C12(20 ml) ble tilsatt Et3N (2 ml) og trifluoreddiksyre (1,5 ml). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer. Løsemiddelet ble fjernet under redusert trykk og restmaterialet ble løst i etylacetat (30 ml), vasket med en NaHC03-løsning, saltløsning og vann og tørket over MgSCv Etter avdamping av løsemiddelet, ble restmaterialet løst i aceton (30 ml, på forhånd tørket over K2C03), og K2C03(1,0 g, pulverisert) ble tilsatt fulgt av MsCl (400 mg, 3,49 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur og fulgt ved TLC inntil utgangsmaterialet var forbrukt. Restmaterialet ble så filtrert. Filtratet ble inndampet under redusert trykk. Restmaterialet ble løst i etylacetat (30 ml), vasket med NaHC03-løsning, saltløsning og vann og tørket over MgSC«4. Etter avdamping av løsemiddelet, ble restmaterialet EtOH og NaBFL; ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer. Løsemiddelet ble avdampet, restmaterialet ble løst i vann og ekstrahert med etylacetat (20 ml x 3), og ekstraktene ble slått sammen og tørket over MgSC*4. Etter avdamping av løsemiddelet, ble restmaterialet renset ved flashkromatografi (heksaner/etylacetat = 8:1) for erholdelse av produktet (184 mg, 47,0%) som et brunt fast stoff.<]>HNMR (300 MHz, CDC13) 8 (ppm): 7,94 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,87 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,77 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 7,30 (dd, Ji = 8,8 Hz, J2= 2,3 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 3,16 (s, CH3), 2,78 (s, NCH3).

Generelle fremgangsmåter for radioaktiv merking:

En løsning av 2-(4'-aminofenyl)-6-metansulfonoksybenzotiazol eller 2-(4'-metylaminofenyl)-6-metylsulfoksybenzotiazol (1 mg) i 250^1 eddiksyre i en forseglet ampulle ble tilsatt 40^1 kloramin T-løsning (28 mg løst i 500^1 eddiksyre) fulgt av 27^1 (tilnærmet 5 mCi) natrium [<125>I]jodid (spesifikk aktivitet 2175 Ci/mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2,5 timer og reaksjonen ble stanset med en mettet natriumhydrogensulfittløsning. Etter fortynning med 20 ml vann, ble reaksjonsblandingen sendt gjennom en C8 Plus SepPak-patron og eluert med 2 ml metanol. For fjerning av metansulfonylgruppe, ble 0,5 ml 1 M NaOH tilsatt til den eluerte løsningen av det radioaktivt joderte mellomproduktet. Blandingen ble oppvarmet til 50°C i 2 timer. Etter tilsetning av 500 ^1 1 M eddiksyre, ble reaksjonsblandingen fortynnet med 40 ml vann og satt på en C8 Plus SepPak-patron. Det radioaktivt joderte produktet med en radioaktivitet på tilnærmet 3 mCi ble eluert fra SepPak-patronen med 2 ml metanol. Løsningen ble oppkonsentrert til 300^1 med en nitrogenstrøm, og råproduktet ble renset ved HPLC på en Phenomenex ODS-kolonne (MeCN/TEA-buffer, 35:65, pH 7,5, strømningshastighet 0,5 ml/minutt opptil 4 minutter, 1,0 ml/minutt mellom 4 og 6 minutter og 2,0 ml/minutt etter 6 minutter, retensjonstid 23,6). De sammenslåtte fraksjonene ble satt på en C8 Plus SepPak-patron. Eluering med 1 ml etanol ga tilnærmet 1 mCi av det endelige radioaktivt joderte produktet.

Eksempel 9: Syntese av 2-(4,-aminofenyl)benzotiazolderivater

Reaksjonsvei 1: Eksempel på syntese av 6-MeO-BTA-O, -1,-2, som er representative for gruppen av tioflavinforbindelser (Shi et al., "Antitumor Benzothiazoles. 3. Synthesis of 2-(4-Aminophenyl)benzothiazoles and Evaluation of Their Activities against Breast Cancer Cell Lines in Vitro and in Vivo" J. Med. Chem. 39: 3375-3384, 1996).

Fremstilling av 4-metoksy-4'-nitrobenzanilid

p-anisidin (1,0 g, 8,1 mmol) ble løst i vannfri pyridin (15 ml) og 4-nitrobenzoylklorid (1,5 g, 8,1 mmol) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble innkubert ved romtemperatur i 16 timer. Reaksjonsblandingen ble uthelt i vann og utfelt materiale ble oppsamlet ved vakuumfiltrering og vasket med 5% natriumbikarbonat (2x10 ml). Produktet ble anvendt i neste trinn uten ytterligere rensing.<!>HNMR (300 MHz, DMSO-de) 5: 10,46 (s, 1H, NH), 8,37 (d, J = 5,5 Hz, 2H, H-3',5'), 8,17

(d, J = 6,3 Hz, 2H, H-2',6'), 7,48 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 6,97 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 3,75 (s, 3H, MeO).

Fremstilling av 4-metoksy-4'-nitrotiobenzanilid

En blanding av 4-metoksy-4'-nitrotiobenzanilin (1,0 g, 3,7 mmol) og Lawessons reagens (0,89 g, 2,2 mmol, 0,6 ekv.) i klorbenzen (15 ml) ble kokt under tilbakeløp i 4 timer. Løsemiddelet ble avdampet og restmaterialet renset ved flashkromatografi (heksan:etylacetat = 4:1) for erholdelse av 820 mg (77,4%) av produktet som et oransje fast stoff.<!>HNMR (300 MHz, DMSO-d6) 5: 8,29 (d, 2H, H-3',5'), 8,00 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-2',6'), 7,76 (d, J = 6,3 Hz, 2H, H-2',6'), 7,48 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 6,97 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 3,75 (s, 3H, MeO). (s, 3H, MeO).

Fremstilling av 6-metoksy-2-(4-nitrofenyl)benzotiazol

4-metoksy-4'-nitrotiobenzanilider (0,5 g, 1,74 mmol) ble fuktet med litt etanol (~0,5 ml) og 30% vandig natriumhydroksidløsning (556 mg, 13,9 mmol, 8 ekv.) ble tilsatt. Blandingen ble fortynnet med vann for erholdelse av en endelig løsning/suspensjon av 10% vandig natriumhydroksid. Uttak av denne blandingen ble med 1 minutts mellomrom tilsatt en omrørt løsning av kaliumjerncyanid (2,29 g, 6,9 mmol, 4 ekv.) i vann (5 ml) ved 80-90°C. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet i ytterligere 0,5 timer og så avkjølt. Utfelt materiale ble oppsamlet ved vakuumfiltrering, vasket med vann og renset ved flashkromatografi (heksan:etylacetat = 4:1) for erholdelse av 130 mg (26%) av produktet.<]>HNMR (300 MHz, aceton-d6) 5: 8,45 (m, 4H), 8,07 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-4), 7,69 (s, 1H, H-7), 7,22 (d, J = 9,0 Hz, 1H, H-5), 3,90 (s, 3H, MeO).

Fremstilling av 6-metoksy-2-(4-aminofenyl)benzotiazol

En blanding av 6-metoksy-2-(4-nitrofenyl)benzotiazolene (22 mg, 0,077 mmol) og tinn(II)klorid omograf (132 mg, 0,45 mmol) i kokende etanol ble omrørt under nitrogen i 4 timer. Etanolen ble avdampet og restmaterialet løst i etylacetat (10 ml), vasket med 1 N natriumhydroksid (2 ml) og vann (5 ml) og tørket over MgS04. Avdamping av løsemiddelet ga 19 mg (/97%) av produktet som et gult fast stoff.

Fremstilling av 6-metoksy-2-(4-metylaminofenyl)benzotiazol og 6-metoksy-2-(4-dimetylaminofenyl)benzotiazol

En blanding av 6-metoksy-2-(4-aminofenyl)benzotiazol (15 mg, 0,059 mmol), Mel (8,3 mg, 0,060 mmol) og K2C03(100 mg, 0,72 mmol) i DMSO (vannfri, 0,5 ml) ble oppvarmet til 100°C i 16 timer. Reaksjonsblandingen ble renset ved revers fase TLC (MeOH:H20 = 7:1) for erholdelse av 2,0 mg (13,3%) 6-metoksy-2-(4-metylaminofenyi)benzotiazol og 6 mg (40%) 6-metoksy-2-(4-dimetylaminofenyl)benzotiazol.<]>HNMR av 6-metoksy-2-(4- metylaminofenyl)benzotiazol (300 MHz, aceton-d6) 5: 7,85 (d, J = 8,7 Hz, 2H, H-2' 6'), 7,75 (dd, J = 8,8 Hz, J = 1,3 Hz, 1H, H-4), 7,49 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H-7), 7,01 (dd, J = 8,8 Hz, J = 2,4 Hz, H-5), 6,78 (d, J = 7,6 Hz, 2H, H-3' 5'), 3,84 (s, 3H, MeO), 2,91 (s, 3H, Nme),<]>HNMR av 6-metoksy-2-(4-dimetylaminofenyl)benzotiazol (300 MHz, aceton-d6) 8: 7,85 (d, J = 8,7 Hz, 2H, H-2' 6'), 7,75 (dd, J = 8,8 Hz, J = 1,3 Hz, 1H, H-4), 7,49 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H-7), 7,01 (dd, J = 8,8 Hz, J = 2,4 Hz, H-5), 6,78 (d, J = 7,6 Hz, 2H, H-3' 5'), 3,84 (s, 3H, MeO), 3,01 (s, 6H, Nme2).

Ved å følge den samme strategien som beskrevet ovenfor, kan de andre 2-(4'-aminofenyl)benzotiazolderivatene syntetiseres ved å benytte et på egnet vis substituert anilinderivat (for eksempel 2-, 3- eller 4-metylanilin) og et egnet 4-nitrobenzoylkloridderivat (for eksempel 2- eller 3-metyl-4-nitrobenzoylklorid).

Eksempel 10: Syntese av BTA-derivater uten substitusjon Reaksjonsvei 2: Eksempel på syntese av BTA-0, -1 og -2-forbindelser som er representative for gruppen av tioflavinforbindelser (Garmaise et al., "Anthelmintic Quaternary Salts. III. Benzothiazolium Salts" J. Med. Chem. 12:30-36 1969)

(referansenumrene benyttet for forbindelsene nedenfor viser til det viste synte s eskj emaet):

Fremstilling av 2-(4-nitrofenyl)benzotiazol

En løsning av 4-nitrobenzoylklorid (1,49 g, 8,0 mmol) i benzen (vannfri, 10 ml) ble dråpevis tilsatt til 2-aminotiofenol (1,0 g, 8,0 mmol i 10 ml benzen) ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 16 timer. Reaksjonen ble stanset med vann (20 ml). Det vandige laget ble separert og ekstrahert med etylacetat (3 x 10 ml). De sammenslåtte organiske lagene ble tørket og inndampet. Råproduktet ble renset ved flashkromatografi (heksan:etylacetat = 85:15) for erholdelse av 1,5 g (73,2%) av produktet som et lysegult fast stoff.

Fremstilling av 2-(4-aminofenyl)benzotiazol

En blanding av 2-(4-nitrofenyl)benzotiazol (105 mg, 0,40 mmol) og tinn(II)klorid

omograf (205 mg, 0,91 mmol) i etanol (20 ml) ble kokt under tilbakeløp under N2i 4 timer. Etter fjerning av etanol ved inndamping under vakuum, ble restmaterialet løst i etylacetat (20 ml), vasket med en NaOH-løsning (1 N, 3 x 20 ml) og vann (3 x 20 ml), tørket og inndampet til tørrhet for erholdelse av 102 mg (97%) av produktet.

Fremstilling av 2-(4-metylaminofenyl)benzotiazol og 2-(4-dimetylaminfenyl)benzotiazol

En blanding av 2-(4-aminofenyl)benzotiazol (15 mg, 0,066 mmol), Mel (9,4 mg, 0,066 mmol) og K2C03(135 mg, 0,81 mmol) i DMSO (vannfri, 0,5 ml) ble oppvarmet til 100°C i 16 timer. Reaksjonsblandingen ble renset ved revers fase TLC (MeOH:H20 = 6:1) for erholdelse av 1,5 mg (10%) 2-(4-metylaminofenyl)benzotiazol og 2,5 mg (16,7%) 2-(4-dimetylaminfenyi)benzotiazol.

Fremstilling av 2-(4-dimetylaminofenyl)benzotiazol

En blanding av 2-aminotiofenol (0,5 g, 4,0 mmol), 4-dimetylaminobenzosyre (0,66 g, 4,0 mmol) og PPA (10 g) ble oppvarmet til 220°C i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur og uthelt i en løsning av 10% kaliumkarbonat (~400 ml). Utfelt materiale ble oppsamlet ved vakuumfiltrering for erholdelse av 964 mg av produktet, som basert på 'HNMR-analyse var tilnærmet 90% rent. Rekrystallisering av 100 mg i MeOH ga 80 mg av det rene produktet.<]>HNMR (300 MHz, aceton-d6) 5: 7,12 (d, J = 7,7 Hz, 1H, H-7), 7,01 (d, J = 9,0 Hz, 1H, H-4), 6,98 (d, J = 9,1 Hz, 2H, H-2',6'), 6,56 (t, J = 7,8 Hz, J = 7,3 Hz, 1H, H-5 eller H-6), 5,92 (d, J = 8,9 Hz, 1H, H-3',5'), 2,50 (s, 6H, Nme2).

Ved å følge den samme strategien som ovenfor, kan de andre 2-(4'-aminofenyl)benzotiazolderivatene syntetiseres ved å benytte egnede 4-nitrobenzoylkloridderivater (for eksempel 2- eller 3-metyl-4-nitrobenzoylklorid) eller egnede 4-dimetylaminobenzosyrederivater (for eksempel 2- eller 3-metyl-4-dimety laminobenzosyre).

Eksempel 11. Syntese av joderte forbindelser

Reaksjonsvei 3: Eksempel på syntese av 2-(3'-jod-4'-aminofenyl)-6-hydroksybenzotiazol som er representativ for syntesen av andre joderte forbindelser (referansenumrene benyttet for forbindelsene nedenfor viser til det viste synte s eskj emaet).

Fremstilling av 2-(3'-jod-4'-aminofenyl)-6-metoksybenzotiazol

En løsning av 2-(4'-aminofenyl)-6-metoksybenzotiazol (22 mg, 0,09 mmol) i iseddiksyre (2,0 ml) ble tilsatt 1 M jodkloridløsning i CH2C12(0,10 ml, 0,10 mmol, 1,2 ekv.) under en N2-atmosfære ved injeksjon. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer. Iseddiksyren ble fjernet under redusert trykk og restmaterialet ble løst i CH2C12. Etter nøytralisering av løsningen med NaHC03, ble det vandige laget separert og ekstrahert med CH2C12. De organiske lagene ble slått sammen og tørket over MgSCu. Etter avdamping av løsemiddelet ble restmaterialet renset ved preparativ TLC (heksanenetylacetat = 6:1) for erholdelse av 2-(4'-amino-3'-jodfenyl)-6-metoksybenzotiazol (25 mg, 76%) som et brunt fast stoff.<]>HNMR (300 MHz, CDC13) 5 (ppm): 8,35 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,87 (dd, Ji = 2,0 Hz, J2= 9,0 Hz, 1H), 7,31 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,04 (dd, Jj= 2,2 Hz, J2= 9,0 Hz, 1H), 6,66 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 3,87 (s, 3H).

Fremstilling av 2-(3'-jod-4'-aminofenyl)-6-hydroksybenzotiazol

En løsning av 2-(4'-amino-3'-jodfenyl)-6-metoksybenzotiazol (8,0 mg, 0,02 mmol) i CH2C12(2,0 ml) ble tilsatt 1 M BBr3-løsning i CH2C12(0,20 ml, 0,20 mmol) under en N2-atmosfære ved injeksjon. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer. Etter stans av reaksjonen med vann ble blandingen nøytralisert med NaHCC«3. Det vandige laget ble ekstrahert med etylacetat (3x3 ml). De organiske lagene ble slått sammen og tørket over MgSC«4. Løsemiddelet ble så avdampet under redusert trykk, og restmaterialet ble renset ved preparativ TLC (heksanenetylacetat = 7:3) for erholdelse av 2-(3'-jod-4'-aminofenyl)-6-hydroksybenzotiazol (4,5 mg, 58%) som et brunt fast stoff.<]>HNMR (300 MHz, aceton-d6) 5 (ppm): 8,69 (s, 1H), 8,34 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,77 (dd, Ji = 2,0 Hz, J2= 8,4 Hz, 1H), 7,76 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,40 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,02 (dd, Ji = 2,5 Hz, J2= 8,8 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,47 (br., 2H). NRMS m/ z 367,9483 (M<+>beregnet for C]3H9N2OSI 367,9480).

Biologiske eksempler

Eksempel 1: Bestemmelse av affinitet for Ap og opptak i hjernen av tioflavinderivater

Innledende bindingsundersøkelser ved anvendelse av syntetisk AP(l-40) ble utført for å fastslå hvorvidt de fire forbindelsene vist nedenfor i signifikant grad bandt seg til seter med amyloide avleiringer i hjernen.

Resultatene vist i tabell 1 viser at disse forbindelsene viste relativt høy affinitet for Ap med Ki-verdier <10 nM, og lett gikk inn i musehjerne med opptaksverdier >0,4% ID/g<*>kg (eller >13% ID/g for dyr på 30 g). Videre var radioaktivitetskonsentrasjonen i hjernen etter 30 minutter lavere enn 0,1% ID/g<*>kg, noe som ga forhold mellom radioaktiviteten etter 2 minutter og radioaktiviteten etter 30 minutter >4.

Eksempel 2: Farging av amyloide avleiringer i post mortem AD- og Tg-musehjerne

Post mortem hjernevevssnitt fra AD-hjerne og en 8 måneder gammel transgen PSl/APP-mus ble farget med umerket BTA-1. PSl/APP-musemodellen kombinerer to humane genmutasjoner som vites å gi Alzheimers sykdom i en dobbelt transgen mus, som deponerer Ap-fibriller i amyloide plakk i hjernen allerede i en alder på 3 måneder. Typiske fluorescensmikroskopiske bilder er vist i figur 8 og fargingen av amyloide plakk med BTA-1 i både post mortem AD og PSl/APP-hjernevev er klart synlig. Cerebrovaskulært amyloid ble også klart farget (figur 8, høyre). De andre karakteristiske nevropatologiske kjennetegnene på AD-hjerne, nevrofibrillære bunter (NFT), farges svakere med BTA-1 i AD-hjerne (figur 8, venstre). NFT har ikke blitt observert i transgene musemodeller for amyloid avleiring.

Eksempel 3. In vivo merking og påvisning av amyloide avleiringer i transgene mus

Tre 17 måneder gamle PSl/APP-transgene mus ble injisert intraperitonealt (ip) med en enkelt dose på 10 mg/kg BTA-1 i en løsning av DMSO, propylenglykol og PBS med pH 7,5 (volum/volum/volum 10/45/45). 24 timer senere ble multifoton fluorescensmikroskopi benyttet for erholdelse av bilder med høy oppløsning av hjernen hos levende mus ved anvendelse av en kranievindusteknikk. Typiske in vivo bilder av BTA-1 i en levende PSl/APP-mus er vist i figur 9, og plakk og cerebrovaskulært amyloid kan klart observeres. Multifoton mikroskopiundersøkelsen viste in vivo spesifisiteten av BTA-1 for Ap i levende PSl/APP-transgene mus.

Eksempel 4. Spesifisitet av forbindelsene ifølge oppfinnelsen for Alzheimer-plakk fremfor Alzheimer-bunter

For å undersøke den relative fordelingen av [3H]BTA-1 -binding til Ap- og taudeponeringer i grå hjernemasse fra de fremre deler av AD-hjerne, ble [<3>H]BTA-1-bindingen sammenlignet i homogenater fra entorinal cortex (EC), fremre grå hjernemasse og cerebellum fra en typisk AD-hjerne og en Braak stadium II kontrollhjerne. Denne kontrollhjernen hadde et høyt antall NFT i den entorinale cortex (figur 5A), men hverken nevrittiske eller diffuse plakk i noe område av hjernen (figur 11C). NFT-tallet i EC og Cntl 04 tilsvarte tallene som forefinnes i mange AD-tilfeller (figur 11B). Bindingen av [<3>H]BTA-1 til det NFT-rike EC-området i denne Cntl 04-hjernen var ikke høyere enn bindingen av [<3>H]BTA-1 til plakk og NFT-fri cerebellum og fremre grå hjernemasse fra denne hjernen (figur 11, tabell). En tilsvarende oversikt over de samme hjerne områdene i en Braak VI AD-hjerne (figur 11, tabell) viste lav binding til cerebellum og EC og et over ti ganger høyere nivå i fremre grå hjernemasse, hvor det er et stort antall nevrittiske plakk (figur 11D). Den omfattende NFT-patologien i EC i Cntl- og AD-hjerne koblet med den lave bindingen av [<3>H]BTA-1 i EC, tyder enten på at BTA-1-binding til NFT som observeres med BTA-1 i en konsentrasjon på 100 nM ikke opptrer ved 1,2 nM eller at den absolutte mengden av [ H]BTA-1 -binding til NFT-avleiringer er lav ved lave nanomolare konsentrasjoner sammenlignet med mengden [<3>H]BTA-1 som bindes til Ap-avleiringer i plakk og cerebrovaskulært amyloid i fremre grå hjernemasse i AD-hjerne. AD-hjernen viste diffuse amyloide plakkavleiringer i EC (figur 11B) som ikke så ut til å gi signifikant [<3>H]BTA-1-binding. Fremre cortex hadde store mengder amyloide plakk som både var kompakte og diffuse og som var forbundet med høye nivåer av [<3>H]BTA-1-binding (figur 1 ID og tabell).

Eksempel 5: Undersøkelser av inngang i musehjerne in vivo

Eksperimenter for å anslå penetrasjonen i hjerne av 2- (3'-I25I-jod-4'-aminofenyl)benzotiazol-6-ol (forbindelse A), 2-(3-[<I8>F]fluor-4-metylaminofenyl)benzotiazol-6-ol (forbindelse B) og 2-[4-(3-I8F-fluorpropylamino)fenyl]benzotiazol-6-ol (forbindelse C) ble utført i unge villtypemus uten amyloide avleiringer i hjernen. Denne undersøkelsen gjenspeiler inngang i hjernen og clearance fra normalt hjernevev. Et nødvendig kriterium for et godt PET-bildedannelsesmiddel er hurtig clearance fra hjerneområdet som ikke inneholder bindingssetet. Et mål på clearance av uspesifikk binding gis av forholdet mellom (%ID-kg)/g-verdiene etter 2 og 3 minutter.

Undersøkelsene ble utført i Swiss-Webster hunnmus (23-35 g) i samsvar med retningslinjene for stell og anvendelse av forsøksdyr som benyttes av NIH og med godkjenning av den lokale komité for dyrestell og bruk. Musene ble injisert i en lateral halevene med 0,37-3,7 MBq (10-100^Ci) av forbindelse A, forbindelse B eller forbindelse C med høy spesifikk aktivitet (~2,0/^moi) i <10 ml av en blanding av 95% isoton saltløsning og 5% etanol. Musene ble bedøvet og avlivet ved hjerteeksisjon etter hjertepunksjon for erholdelse av arterielle blodprøver 2 minutter eller 30 minutter etter injeksjonen. Musehjernene ble hurtig tatt ut og oppdelt i cerebellum og den gjenværende hele hjernen (innbefattet hjernestammen). Radioaktiviteten i hjerneprøvene ble bestemt i en gammabrønteller og målingene ble korrigert for isotopnedbrytning til injeksjonstidspunktet relativt til 1 0 SI- eller<I8>F-standarder fremstilt fra injeksjonsløsingen, for bestemmelse av prosent av den injiserte dosen (%ID) i prøvene. Hjerneprøvene ble veid for bestemmelse av prosent av injisert dose pr gram vev (%ID/g) og denne størrelsen ble multiplisert med den totale kroppsvekten (i kg) for bestemmelse av den kroppsvektsnormaliserte radioaktivitetskonsentrasjonen [(%ID-kg)/g] for hver vevsprøve. Forbindelse A, forbindelse B og forbindelse C viste relativt høy inngang i hjernen på tidlige tidspunkter og hurtig clearance på senere tidspunkter. Radioaktivitetskonsentrasjonene (%ID-kg/g) etter 2 minutter og 30 minutter og forholdet mellom verdien etter 2 minutter og 30 minutter er vist i tabell 2 nedenfor. Eksempel 7: In vivo bildedannelsesundersøkelser i bavian PET-bildedannelsesundersøkelser i voksne bavianer { Papio anubis) (kroppsvekt 15-35 kg, alder 6-12 år) ble utført med forbindelse B og forbindelse C i samsvar med retningslinjer for stell og anvendelse av forsøksdyr som benyttes av NIH og med godkjenning av den lokale institusjonskomite for stell og anvendelse av dyr. Før PET-bildedannelsen ble dyrene først bedøvet med ketamin (10-15 mg/kg, i.m.), gitt atropin (0,5 mg, i.m.) for kontroll av spyttdannelse og hjertefrekvens, og intubert. Bavianene ble deretter koblet til en ventilator med isofluoran (0,5-1,25%) bedøvelse og medisinsk luft. Pancuroniumbromid ble administrert etter behov (intravenøst, opptil 0,06 mg/kg/time, titrert til ønsket virkning) for å holde dyrene immobiliserte under undersøkelsen. Et lårarteriekateter ble innsatt for å måle blodtrykk og for uttak av arterieblod, og et intravenøst kateter ble plassert i en antecubital vene for injeksjon av radioaktiv forbindelse og for administrering av væske etter behov under bildedannelsesundersøkelsen. Blodtrykk, hjertefrekvens og respirasjonsfrekvens samt utåndet CO2og oksygenmetningsnivå ble målt kontinuerlig under PET-undersøkelsen. Den basale rektale kroppstemperaturen (~37°C) ble opprettholdt ved anvendelse av et varmeteppe (Gaymar, Orchard Park, NY) og en temperaturregulator (Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, OH). Før skanningen ble bavianens hode fiksert slik at bildeplanene ble erholdt tilnærmet parallelt med orbital-meatuslinjen.

PET-resultater ble oppsamlet ved anvendelse av en ECAT HR+PET-skanner (CTI PET Systems, Knoxville, TN) i tredimensjonal bildedannelsesmodus (63 parallelle snitt; 15,2 cm aksialt synsfelt; 4,1 mm fullvidde halvmaksimal i-plan oppløsning). En Neuro-Insert (CTI PET Systems) ble anvendt for å redusere bidraget fra spredte fotoner. Etter plassering av bavianene i PET-skanneren, ble et avgrenset transmisjonsskann (10-15 minutter) er holdt for dumpingskorreksjon av PET-emisjonsverdiene ved anvendelse av roterende Ge/ GA-staver. Forbindelse B og forbindelse C ble administrert intravenøs over et tidsrom på 20 sekunder, og en dynamisk serie av PET-skanninger ble oppsamlet over 90 minutter ved anvendelse av 26 tidsrammer med økende lengde (6 x 20 sekunder; 4x30 sekunder; 6 x 60 sekunder; 4x5 minutter; 6x10 minutter). Tilnærmet 185 MBq (~5 mCi) av forbindelse B eller forbindelse C med høy spesifikk aktivitet (>14,8 GBq/^mol) ble injisert i en bavian. I andre undersøkelser ble 148-296 MBq (4-8 mCi) av en radioaktiv PET-referanseforbindelse med høy spesifikk aktivitet (>18,5 GBq/^mol) injisert, innbefattet enten [<n>C](+)-McN5652, [karbonyl-<n>C]WAY100635 eller [<I8>F]altanserin. PET-resultatene ble rekonstruert ved anvendelse av et Hanningfilter (Nyquist avkutting) og korrigert for nedbrytning, fotondemping og spredning.

Et MRI-skann ble erholdt for hver bavian ved anvendelse av en 1,5 T GE Signa skanner (GE Medical Systems, Milwaukee, WI) utstyrt med en standard hodespole. En volumetrisk "spoiled gradient recalled" (SPGR) MR-sekvens med parametere for høy kontrast i grå hjernemasse, hvit hjernemasse og cerebral spinalvæske (CSF) ble oppsamlet i koronalplanet (TE = 5, TR = 24, vippevinkel = 40°, snittykkelse = 1,5 mm, NEX = 2, synsfelt 12 cm, voxelstørrelse = 0,94 x 1,25 x 1,5 mm). MRI-bilder fra hver enkelt bavian ble samregistrert til PET-verdiene ved anvendelse av den automatiske bilderegistrerings (AIR) -algoritmen for tverrmodal bildesammenstilling og gjensnitting. De første 16 tidsrammene (0-9 minutter etter injeksjon) av de dynamiske PET-bildene ble summert til bilder som omfattet et enkelt tidsrom. Før samregistreringen, ble både MR-bilder og summerte PET-bilder redigert ved anvendelse av programvarepakken ANALYZE (Mayo Clinic, Rochester, MN) for fjerning av ekstracerebrale vev som kunne tenkes å forstyrre samregistreringsprosessen. De redigerte MR-bildene ble så samregistrert med det summerte PET-bildet og gjensnittet for erholdelse av MR-bilder i samme romlige orientering og med samme oppløsning som de summerte PET-bildene. Samregistrering av MR- og PET-verdisettene i bavian har blitt vist å være en pålitelig og robust anvendelse av AIR-fremgangsmåten.

Områder av interesse (ROI) ble definert i det samregistrerte MR-bildet og anvendt på de dynamiske PET-verdisettene for bestemmelse av regionale tidsaktivitetsverdier for hvit hjernemasse (cerebral hvis masse bak den prefrontale cortex og foran de laterale ventrikler), temporal cortex, cerebellum (cerebellum cortex) og andre hjerneområder (resultater ikke vist). PET-tidsaktivitetsverdiene ble omregnet til mikrocurie pr milliliter ved anvendelse av en fantombasert kalibrerings faktor, og ble så normalisert til den injiserte dosen og dyrets kroppsvekt ((%ID-kg)/g).

Figur 15 viser en representativ PET-tidsaktivitetskurve (TAC) for radioaktivitet i de tre hjerneområdene hos en bavian etter intravenøs injeksjon av forbindelse B. Disse TAC viser utmerket hjernepenetrasjon av radioaktiviteten ved tidlige tidspunkter (tilnærmet 0,40% ID-kg/g, i rimelig samsvar med hjernepenetreringen av forbindelse B i mus 2 minutter etter injeksjon) i alle tre områder, og relativt hurtig clearance av den regionale radioaktiviteten 0-90 minutter etter injeksjon i hjernen hos denne kontrollbavianen. Områder i hjernen som inneholdt høyere nivåer av hvit hjernemasse viste noe høyere (~30%) radioaktivitetskonsentrasjon etter 90 minutter enn områder som var dominert av grå hjernemasse, for eksempel den temporale cortex. Radioaktivitetskonsentrasjonen i baviancortex var nesten identisk med konsentrasjonen i cerebellumcortex ved alle tidspunkter. Clearancehastigheten for radioaktiviteten var betydelig langsommere fra bavianhjerne enn fra musehjerne, med en halveringstid for clearance av forbindelse B på tilnærmet 17 minutter fra grå hjernemasse i bavianhjerne. Den radioaktivt merkede forbindelse B viste et forhold mellom radioaktivitetskonsentrasjon tidlig og sent i bavianhjernen på tilnærmet 4, noe som viser at kun tilnærmet 25% av den høyeste maksimale radioaktiviteten forble i hjernen ved senere tidspunkter. Disse resultatene var i samsvar med det forventede fravær av amyloide plakk i hjernene hos disse kontrolldyrene, og viste at svært lite radioaktivitet ble tilbakeholdt i normal bavianhjerne. En sammenligning av oppførselen til forbindelse B in vivo i bavianhjerne med inngang og clearance av andre vellykkede PET-radioliganer i et referansehjerneområde som manglet spesifikke bindingsseter (det vil si cerebellum) var nyttig. Figur 16 sammenligner TAC i cerebellum hos bavianer for [karbonyl-<n>C]WAY100635, [<n>C](+)-McN5652, [<I8>F]altanserin og forbindelse B. Den relativt hurtige clearance fra uspesifikke bindingsseter av [karbonyl-<n>C]WAY100635 og [<I8>F]altanserin er viktig for disse PET-radioligandenes gode evne til å synliggjøre reseptorsystemene for serotonin 5-HTiaog serotonin 5-HT2A-I motsetning til dette, har den relativt langsomme clearance in vivo av [<n>C](+)-McN5652 redusert anvendbarheten av denne radioaktive liganden for synliggjøring av serotonintransportersystemet. Egenskapene til forbindelse B når det gjelder clearance fra hjernen, viste at den relativt hurtige clearance av denne radioaktive forbindelsen fra uspesifikke seter (ti/2= 17 minutter) tilsvarte den til andre anvendbare PET-synliggjøringsmidler for nevroreseptorer. Figur 17 viser en representativ PET TAC for radioaktivitet i tre hjerneområder hos en bavian etter intravenøs injeksjon av forbindelse C. Disse TAC viser utmerket hjernepenetrasjon av radioaktiviteten ved tidlige tidspunkter (tilnærmet 0,22% ID-kg/g i god samsvar med hjernepenetrasjonen av forbindelse C i mus 2 minutter etter injeksjon) i alle tre områder, og relativt hurtig clearance av den regionale radioaktiviteten 0-90 minutter etter injeksjonen i hjernen til denne kontrollbavianen. Hjerneområder med høyere nivå av hvit hjernemasse viste noe høyere (<10%) radioaktivitetskonsentrasjoner etter 90 minutter enn områder som var dominert av grå hjernemasse, for eksempel den temporale cortex.

Radioaktivitetskonsentrasjonen i baviancortex var nærmest identisk med konsentrasjonen i cerebellumcortex på alle tidspunkter. Hastigheten for clearance av radioaktivitet var betydelig lavere fra bavianhjerne enn fra musehjerne, med en halveringstid for clearance av forbindelse C på tilnærmet 10 minutter fra grå hjernemasse i bavianhjerne. Radioaktiv merket forbindelse C viste et forhold mellom tidlig og sen radioaktivitetskonsentrasjon i bavianhjerne på tilnærmet 6, noe som viser at kun omkring 15% av den maksimale radioaktiviteten forelå i hjernen på senere tidspunkter. Disse resultatene var i samsvar med det forventede fravær av amyloide plakk i hjernen hos disse kontrolldyrene og viste at svært lite radioaktivitet ble tilbakeholdt i normal bavianhjerne. En sammenligning av oppførselen av forbindelse C in vivo i bavianhjerne med inngang og clearance av andre vellykkede PET-radioligander i et referansehjerneområde som mangler spesifikke bindingsseter (det vil si cerebellum) var nyttig.

Figur 18 sammenligner TAC i cerebellum hos bavianer for [karbonyl-<n>C]WAY100635, [<n>C](+)-McN5652, [<18>F]altanserin og forbindelse C. Den relativt hurtige clearance fra uspesifikke bindingsseter for [karbonyl-11 C]WAY 100635 og [<I8>F]altanserin er viktig for disse PET-radioligandenes gode evne til å synliggjøre reseptorsystemene for serotonin 5-HT]Aog serotonin 5-HT2a-I motsetning til dette, har den relativt langsomme in vivo clearance av [<n>C](+)-McN5652 redusert anvendbarheten av denne radioaktive liganden for synliggjøring av serotonintransportersystemet. Egenskapene til forbindelse C når det gjelder clearance fra hjerne viste at den relativt hurtige clearance av denne radioaktive forbindelsen fra uspesifikke seter (ti/2= 10 minutter) tilsvarte den til andre anvendbare PET-synliggjøringsmidler for nevroreseptorer.

Alle publikasjoner, patenter og patentsøknader som er angitt ovenfor, inkorporeres heri ved referanse.

Når oppfinnelsen nå er beskrevet, vil det være åpenbart for fagfolk at den kan varieres på mange måter uten å avvike fra oppfinnelsens ånd og område. Slike variasjoner omfattes innenfor omfanget av oppfinnelsen ifølge kravene.

Claims

PATENTKRAV ,. ^«bindende f<— valg fra gruppen beånde av:
2. Amyloidbindende forbindelse valg fra gruppen bestående av:

hvori i det minste ett av atomene i formelen er valg fra gruppen bestående av: (a ) <3> H,1 31I,125 I,123 I, 76Br, 75Br, <18> F, CH2 -CH2 -X <*> , 0-CH2 -CH2 -X <*> , CH2 -CH2 -CH2 -X <*> , O- CH2 -CH2 -CH2 -X <*> hvori X* er I3II, I23I, 76Br, 75Br or I8F, (b) en karboninneholdende substituent valgt fra gruppen bestående av lavere alkyl, (CH2)nOR\ CF3 , CH2 -CH2 X, 0-CH2 -CH2 X, CH2 -CH2 -CH2 X, O-CH2 -CH2 -CH2 X, hvori X=F, Cl, Br or I, CN, (C=0)-R\ (C=0)N(R')2 , 0(CO)R', COOR', CR'=CR'-Rph and CR2 '-CR2 '-Rph , hvori i det minste ett karbon er<n>C ,I3C orI4C ; and (c) en chelaterende gruppe (med chelatert metalgruppe) med formel W-L <*> eller V-W-L <*> , hvori V er valgt fra gruppen bestående av -COO-, -CO-, - CH2 0- og -CH2 NH-; W er -(CH2 )n hvor n=0,1,2,3,4, eller 5; og L <*> er:

hvori M <*> er <99m> Tc.
3. Farmasøytisk preparat omfattende (a) en forbindelse i følge krav 1 eller 2 og (b) en farmasøytisk akseptabel bærer.
4. Fremgangsmåte for å påvise amyloide avleiringer in vivo i et individ, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter trinnene: (a) å administrere til individed en påvisbar mengde av en forbindelse i følge krav 2, hvori forbindelsen vil binde til hvilke som helst amyloid(e) avleiring(er) i individet; og b) påvise binding av forbindelsen til amyloid(e) avleiring(er) i individet.
5. Fremgangsmåte i følge 4, hvori den amyloide avleiringen er lokalisert i hjernen til et individ.
6. Fremgangsmåte i følge 4, hvori individet mistenkes å ha en sykdom eller et syndrome valgt fra gruppen bestående av Alzheimers sykdom, familiær Alzheimers sykdom, Downs syndrom og homozygot for apolipoprotein E4 allelet.
7. Anvendelse av en forbindelse i følge krav 2 for fremstilling av et medikament for påvisning av amyloide avleiringer in vivo.
8. Forbindelse i følge krav 2 for bruk ved påvisning av amyloide avleiringer in vivo.
9. Fremgangsmåte for å påvise amyloide avleiringer i biopsy eller humant post-morten- eller animalsk vev, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter trinnene: (a) å inkubere formalinfiksert eller friskt frossent veve med en løsning av en forbindelse i følge krav 2 for å danne en merket avleiring og deretter (b) å påvise de merkede avleringene.
10. Anvendelse av en forbindelse i følge 2 for fremstilling av et medikament for påvisning av amyloide avleiringer i biopsi eller humant post mortem- eller animalsk vev.
11. Forbindelse i følge krav 2 for bruk ved påvisning av amyloide avleiringer i biopsi eller humant post- mortem- eller animalsk vev.
12. Fremgangsmåte for å kvantifisere mengden amyloid i biopsi eller post-mortem- wev omfattende trinnene: (a) å inkubere en forbindelse i følge krav 2 med et homogenat av biopsi eller post- mortem- YQY, (b) å separere den vevsbundede fra vevsubundede forbindelse, (c) å kvantifisere den vevsbundende forbindelse, og (d) å konvertere enhetene av vevsbundet forbindelse til mikrogramenheter av amyloid per mg vev ved sammenligning med en standard.
13. Anvendesle av en forbindelse i følge krav 2 for fremstilling av et medikament for kvantifisering av mengden amyloid i biopsi eller post- mortem- wQv:
14. Forbindelse i følge krav 2 for bruk til kvantifisering av amyloid i biopsi eller i post- morten- wQw.
15. Fremgangsmåte for å skille en hjerne rammet av Alzheimers sykdom fra en en normal hjerne, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter trinnene: (a) å oppnå vev fra (i) cerebellum og (ii) et annet område fra samme hjerne forskjellig fra cerebellum, fra normale individer og fra individer som mistenkes å ha Alzheimers sykdom; (b) inkubere vevet med en forbindelse i følge krav 2 slik at amyloidet I vevet binder forbindelsen, deretter separerer vevsbundet fra vevsubundet forbindelse; (c) kvantifisere mengden amyloid som er bundet til forbindelsen; (d) beregne forholdet mellom mengden amyloid i områder av hjernen som er forskjellig fra cerebellum med mengde amyloid I cerebellum; (e) sammenligne forholdet av mengde amyloid i vevet fra normale individer med forholdet av mengden amyloid I vev fra individer som mistenkes å ha Alzheimers sykdom; og (f) bestemme nærvær av Alzheimers sykdom dersom forholdet fra hjernen til et individ som mistenkes å ha Alzheimers sykdom er over 90% sammenliknet med forholdet oppnådd fra hjernen til normale individer.
16. Anvendelse av en forbindelse i følge krav 2 for fremstilling av et medikament for å skille en hjerne rammet av Alzheimers sykdom fra en normal hjerne.
17. Forbindelse i følge krav 2 for bruk til å skille en hjerne rammet av Alzheimers sykdom fra en normal hjerne.
18. Fremgangsmåte for selektiv binding av en forbindelse til amyloide plakk men ikke nevrofibrillære bunter i hjernevev som inneholder begge deler, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter å bringe vevet i kontakt med en forbindelse i følge krav 2 ved en konsentrasjon som er under 10 nM i in vitro bindings- og fargeanalyser.
19. Anvendelse av en forbindelse i følge krav 2 til fremstilling av et medikament for selektiv binding in vitro av en forbindelse til amyloide plakk, men ikke til nevrofibrillære bunter, i hjernevev som inneholder begge deler.
20. Forbindelse i følge krav 2 for bruk ved selektiv binding in vitro av en forbindelse til amyloide plakk, men ikke til nevrofibrillære bunter, hvori hjernevevet inneholder begge deler.
21. Fremgangsmåte for selektiv binding av en forbindelse til amyloide plakk, men ikke til nevrofibrillære plakk i hjernevev som inneholder begge deler, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter å administrere til et individ en effektiv mengde av en forbindelse i følge krav 2, slik at blodkonsentrasjonen av den administrerte forbindelse forblir under 10 mM in vivo.
22. Anvendelse av en forbindelse i følge krav 2 til fremstilling av et medikament for selektiv binding in vivo av en forbindelse til amyloide plakk, men ikke nevrofibrillære bunter i hjernevev som inneholder begge deler.
23. Forbindelse i følge krav 2 for bruk ved selektiv binding in vivo av en forbindelse til amyloide plakk, men ikke til nevrofibrillære plakk, i hjernevev som inneholder begge deler.