NO179105B

NO179105B - Krystallinsk 2-0- fremtilling og anvendelse

Info

Publication number: NO179105B
Application number: NO901482A
Authority: NO
Inventors: Shuzo Sakai; Masaru Yoneyama; Toshio Miyake
Original assignee: Hayashibara Biochem Lab
Priority date: 1989-10-21
Filing date: 1990-04-02
Publication date: 1996-04-29
Also published as: KR0181013B1; EP0627441A1; KR910007950A; NO179105C; CA2013562A1; US5508391A; JP2838809B2; AU5245790A; AU630683B2; DE69033146T2; JPH03135992A; IL93978A; EP0425066B1; HK111296A; FI901646A0; FI97621B; US5432161A; US5843907A; IL93978A0; NO901482D0

Description

Oppfinnelsen angår en ny substans, en krystallinsk 2-O-a-D-glukopyranosy1-L-askorbinsyre, og dens fremstilling og anvendelser. L-askorbinsyre som har den kjemiske struktur vist ved formelen

(I) :

blir ikke syntetisert in vivo i mennesker, aper og marsvin og er derfor oppført som et essesielt ernæringselement, dvs. vitamin C. L-askorbinsyre deltar i noen fysiologiske aktiviteter in vivo, f.eks. i hydroksyleringen av prolin og lysin som er nødvendige for å syntetisere kollagen som hovedelementet i levende bindevev, oksidasjons/reduksjons-reaksjonen av cytokrom C, hvor Fe<+++> reduseres til Fe<++>, og i immunpotensieringen via økningen av leukocytt. Følgelig spiller vitamin C en betydelig rolle i å opprettholde og forbedre sunnheten av det levende legeme.

Skjørbuk har lenge vært kjent som en tilstand som skyldes

mangel på L-askorbinsyre, og er markert ved svakhet i huden, punktvise blødninger, ekkymose og blødninger i tannkjøttet og benmargen. For å hindre skjørbuk for opprettholdelse av sunnhetstilstanden, er der fastlagt en anbefalt daglig tilførsel (RDA) for L-askorbinsyre, nærmere bestemt 60 mg for voksne menn og 50 mg for voksne kvinner.

I våre dager er bruken av L-askorbinsyre ikke begrenset til agenser som anriker vitamin C som et essensielt næringsmiddel-element, men strekker seg til forskjellige anvendelser. Nærmere bestemt, pga. av dens kjemiske struktur og fysiologiske aktiviteter, er L-askorbinsyre nyttig som et syrningsmiddel, reduksjonsmiddel, antioksidasjonsmiddel, blekemiddel og stabilisator i forskjellige kjemiske reagenser, matvarer og drikker, og videre som et reduksjonsmiddel, uv-absorpsjonsmiddel og melanindannelse-inhibitor i kosmetika, innbefattet hudforbedringsmidler og hudblekingsmidler.

Den største ulempe ved L-askorbinsyre er at den lett taper de fysiologiske aktiviteter pga. dens direkte reduserende aktivitet, dårlige stabilitet og høy følsomhet for oksidasjon.

For å stabilisere L-askorbinsyre er det blitt foreslått å benytte noen derivater av L-askorbinsyre. For eksempel er der i Vitamin, Vol. 43, pp. 205-209 (1971), ibid., Vol. 47, pp. 259-2S7 (1973), og japansk patentpublikasjon nr. 38 158/73, angitt en biokjemisk syntese av L-askorbinsyreglukosider.

På grunn av at glukosidene fremstilles ved lignende metoder, at dannelsen av en eterbinding ved den primære alkoholgruppe som er anordnet på karbonatom nummer seks i L-askorbinsyre fører til de glukosider som er beskrevet i den japanske patentpublikasjon, f.eks. i spalte 2, linje 14-16, fordi sakkarid-overføringsreaksjonen fra maltose til en a-glukosylgruppe er ansvarlig for dannelsen av glukosider, og fordi glukosidene oppviser en direkte reduserende aktivitet, kan deres kjemiske struktur angis ved formelen (II).

Som det er åpenbart fra resultatene i den japanske patentpublikasjon, tabellen i eksempel 1, er stabiliteten av glukosidene overlegen i forhold til L-askorbinsyre, men ikke tilstrekkelig for deres kommersialisering.

Ishido et al. angir i japansk patentpublikasjon nr. 5 920/83

en organisk kjemisk prosess for å syntetisere sakkaridderivater av L-askorbinsyre.

Disse derivater er imidlertid slike hvor alle D-glukosene er bundet på B-måten fordi inntil 21 B-D-glukopyranosy1-type-derivater av L-askorbinsyre innbefattet 2,3-di-0-(B-D-glukopyranosyl)-L-askorbinsyre er angitt for forklaring fra kolonne 7, linje 6 til kolonne 8, linje 11.

Masamoto et al. angir i japansk patentpublikasjon nr. 198 498/83 en organisk, kjemisk prosess for å syntetisere sakkaridderivater av L-askorbinsyre som også er av B-glukosyl-typen.

Undersøkelser av B-D-glukopyranosyl-type-derivater av L-askorbinsyre bekreftet at de nesten ikke oppviste ønskede fysiologiske aktiviteter i levende legemer, særlig mennesker. Videre har de vanlige organisk-kjemiske prosesser den ulempe at de er underlegne med hensyn til økonomisk effektivitet, fordi reaksjonen er meget komplisert og gir lavt utbytte, samt at å fastslå ikke-giftighet og sikkerhet for de resulterende derivater er meget vanskelig.

Som beskrevet ovenfor har forslagene til sakkaridderivater av L-askorbinsyre i tidligere kjent teknikk vist seg utilfreds-stillende med hensyn til stabilitet, sikkerhet, fysiologisk aktivitet og økonomisk effektivitet, og er hittil ikke blitt praktisert.

Den foreliggende oppfinnelse er rettet på å overvinne de ulemper som vanlige sakkaridderivater av L-askorbinsyre har. Nærmere bestemt undersøkte man et nytt sakkaridderivat av L-askorbinsyre som er oppnåelig ved en biokjemisk prosess, som

anvender en sakkaridoverføringsreaksjon.

Som angitt i beskrivelsen i japansk patentsøknad nr. 127 072/89 er der funnet en ny substans, en a-glykosyl-L-askorbinsyre, nærmere bestemt 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre, som er fri for direkte reduserende aktivitet, har overlegen stabilitet, er lett hydrolyserbar in vivo, og har tilstrekkelig høy fysiologisk aktivitet, og dens fremstilling og bruk i matvarer, drikker, farmaka for mottagelige sykdommer og kosmetika er også blitt utviklet.

Videre ble det funnet at når L-askorbinsyre inntas sammen med et a-glukosylsakkarid, blir 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre syntetisert og deretter metabolisert in vivo, og det vil derfor være et ideelt egnet nytt sakkaridderivat av L-askorbinsyre med hensyn til sikkerhet.

Et pulver som er oppnåelig ved konsentrasjon og pulverisering av en vandig oppløsning av 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre er amorft og sterkt hygroskopisk, og har den ulempe at det lett opptar fuktighet under omgivelsebetingelser for å bevirke fuktighetsopptagning med ledsagende oppløsning (deliquescence) og konsolidering.

Den foreliggende oppfinnelse er følgelig rettet på å overvinne ulempen forbundet med en slik amorf 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre, nærmere bestemt å skaffe et tilfredsstillende frittrennende pulver som er fritt for vesentlig hygroskopisitet og konsolidering under omgivelsesbetingelser.

Man undersøkte 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre i fast form som oppviser en betydelig ikke-hygroskopisitet under omgivelsebetingelser, hvilket er tilstrekkelig til å overvinne ulempen forbundet med amorf 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre.

Som et resultat ble det funnet et nytt stoff, en krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre, samtidig som det ble funnet at den skaffer et stort sett ikke-hygroskopisk tilstrekkelig frittrennende vannfritt, krystallinsk pulver som hverken bevirker oppløsning ved fuktighetsopptagning (deliquescence) eller konsolidering under omgivelsebetingelser. Videre ble der utviklet en fremgangsmåte til fremstilling av en slik krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre, og dets anvendelse som bestandel i matvarer. Fig. 1 viser uv-absorpsjonsspektret av en krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre i henhold til oppfinnelsen i en oppløsning med pH = 2,0. Fig. 2 viser uv-absorpsjonsspektret av den krystallinske 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre når den er i en oppløsning med pH = 7,0. Fig. 3 viser det infrarøde absorpsjonsspektrum av den krystallinske 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre. Fig. 4 viser det infrarøde absorpsjonsspektrum av en amorf 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre som sammenligning. Fig. 5 er bildet tatt gjennom mikroskop av en krystall som har vokst i en overmettet oppløsning (forstørrelse = 40 ganger). Fig. 6 er ORTEP-figuren av en krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre i henhold til oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelse kan utføres med en hvilken som helst 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre uansett dens fremstillingsprosess, f.eks. biokjemiske og organisk-kjemiske prosesser.

I lys av sikkerhet og økonomisk effektivitet blir fortrinnsvis 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre dannet ved en biokjemisk prosess hvor et sakkaridoverføringsenzym tillates å virke alene eller sammen med glukoamylase på en oppløsning inneholdende L-askorbinsyre og et a-glukosylsakkarid.

Uttrykket "oppviser ingen direkte reduserende aktivitet" betyr at i motsetning til L-askorbinsyre, reduserer ikke og misfarger ikke et sakkaridderivat derav 2,6-diklorfenolindofenol intakt.

Uttrykket "L-askorbinsyre" slik det anvendes i den foreliggende oppfinnelse betyr L-askorbater såsom alkalimetallsalter, jordalkalimetallsalter og blandinger derav, og skal ikke begrenses til fri L-askorbinsyre hva oppfinnelsen angår. Således om nødvendig er f.eks. natrium-L-askorbat og kalsium-L-askorbat også egnet til bruk i sakkaridoverføringsreaksjonen såvel som fri L-askorbinsyre.

Uttrykkene "a-glukosy1-L-askorbinsyre" og "2-0-a-D-glukopyrano-sy 1-L-askorbinsyre" betyr, foruten disse, de som foreligger i fri syreform, i den grad den foreliggende oppfinnelse kan utføres med disse.

De a-glukosylsakkarider som er anvendelige i oppfinnelsen er de som tillater at et sakkaridoverføringsenzym danner fra L-askorbinsyre og en a-glykosy1-L-askorbinsyre, en forbindelse hvor ekvimolare eller mer a-D-glukosylrester er bundet til L-askorbinsyre. For eksempel maltoligosakkarider såsom maltose, maltotriose, maltoteraose, maltopentaose, maltoheksaose, maltoheptaose og maltooktaose kan passende velges såvel som partielle stivelseshydrolysater såsom dekstrin, cyklodekstrin og amylose, flytendegjort stivelse, gelatinisert stivelse og oppløseliggjort stivelse.

Følgelig, for å lette dannelsen av a-glykosyl-L-askorbinsyre, bør man velge et a-glukosylsakkarid som er mottagelig for det sakkaridoverføringsenzym som skal anvendes.

For eksempel, når en a-glukosidase (EC 3.2.1.20) anvendes som sakkaridoverføringsenzymet, er maltoligosakkarider såsom maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltoheksaose, maltoheptaose og maltooktaose egnede, såvel som partielle stivelsehydrolysater og dekstriner med en DE

(dekstrose-ekvivalent) og 5-60. Når cyklomaltodekstrin-glukano-transferase (EC 2.4.1.19) anvendes som sakkaridoverførings-enzymet, er partielle stivelsehydrolysater såsom gelatiniserte stivelser med en DE på under 1 og dekstriner med en DE på inntil 60 egnede. Når a-amylase (EC 3.2.1.1) anvendes som sakkaridoverføringsenzymet, er partielle stivelsehydrolysater såsom gelatinisert stivelse med en DE på under 1 og dekstriner med en DE på inntil 3 0 egnede.

Konsentrasjonen av L-askorbinsyre i løpet av reaksjonen er generelt 1 w/v-% eller høyere, fortrinnsvis 2-30 w/v-%, mens konsentrasjonen av et a-glukosylsakkarid generelt er 0,5-30 ganger høyere enn konsentrasjonen av L-askorbinsyre.

De sakkaridoverførende enzymer som er anvendelige i oppfinnelsen er de som overfører en eller flere a-glukosylgrupper i det minste til nummer to karbonatomet i L-askorbinsyren uten å nedbryte den når det tillates å virke på en oppløsning som inneholder L-askorbinsyre og et a-glukosylsakkarid som har en tilstrekkelig følsomhet for enzymet.

For eksempel, a-glukosidaser som fås fra dyr, planter og mikroorganismer såsom de fra musenyre, mukus fra rottetarm, tynntarm hos hund, tynntarm hos gris, riskorn, maiskorn og de fra en kultur som fås ved dyrking i et næringsmedium gjær og bakterier av slektene Mucor, Penicillium og Saccharomyces, syklomaltodekstrin-glukotransferaser fra en bakteriekultur såsom de fra slektene Bacillus og Klebsiella, og a-amylase fra en bakteriekultur såsom de fra slekten Bacillus, blir passende valgt.

Et slikt sakkaridoverføringsenzym skal ikke nødvendigvis renses før bruk, så sant det oppfyller det ovenfor angitte krav. Generelt er oppfinnelsen utførbar med et råenzym. Om nødvendig kan sakkaridoverføringsenzymer renses ved vanlige metoder før bruk. I handelen tilgjengelige sakkaridoverføringsenzymer kan selvsagt også anvendes i oppfinnelsen. Mengden av et sakkarid-overf øringsenzym og reaksjonstiden avhenger nøye av hverandre. Av økonomiske grunner blir et sakkaridoverføringsenzym anvendt i en mengde som fullfører reaksjonen i løpet av 3-80 timer.

Immobiliserte sakkaridoverføringsenzymer blir med fordel anvendt på satsvis og kontinuerlig måte.

Reaksjonsprosessen i henhold til oppfinnelsen blir vanligvis utført ved at et sakkaridoverføringsenzym settes til en oppløsning inneholdende den ovenfor beskrevne L-askorbinsyre og et a-glukosylsakkarid, og ved at blandingen holdes under betingelser hvor enzymet er stort sett aktivt, vanligvis ved en pH-verdi i området 3-9 og en temperatur i området 20-80°C. Da L-askorbinsyre i løpet av reaksjonen er tilbøyelig til å bevirke en oksidativ nedbrytning, er det ønskelig å holde blandingen under betingelser som skjermer mot lufting og lys såvidt mulig, slik at L-askorbinsyre foreligger i sin reduserende form. Reaksjonen blir med fordel utført i nærvær av forbindelser såsom tiourea og hydrogensulfid om nødvendig.

Den ønskede substans kan fås ved innlemmelse av L-askorbinsyre og et a-glukosylsakkarid i kulturen av en mikroorganisme under dyrking, som kan produsere et sakkaridoverføringsenzym.

Generelt blir reaksjonsprosessen i henhold til oppfinnelsen utført ved at et sakkaridoverføringsenzym alene eller sammen med glukoamylase tillates til å virke på en oppløsning som inneholder L-askorbinsyre og et a-glukosylsakkarid.

En slik prosess er gjennomførbar med glukoamylaser som fås fra forskjellige kilder såsom mikroorganismer og planter. Vanligvis er i handelen tilgjengelig glukoamylase som fås fra en mikroorganisme av slektene Aspergillus og Rhizopus egnet.

For dannelse av 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre, kan glukoamylase anvendes sammen med et sakkaridoverføringsenzym. For å forbedre reaksjonseffekten er det generelt ønskelig at et sakkaridoverføringsenzym først benyttes til å overføre ekvimolare eller større mengder av D-glukoseresiduer til L-askorbinsyre for å danne en a-glukosyl-L-askorbinsyre, deretter blir glukoamylase anvendt til å akkumulere 2-0-a-D-glukopyrano-sy1-L-askorbinsyre. 6-amylase (EC 3.2.1.2) kan fritt brukes sammen med glukoamylase.

De a-glukosyl-L-askorbinsyrer som dannes ved et slikt sakkarid-overf øringsenzym bærer en a-D-glukosylgruppe bestående av 1-7 glukosylgrupper koblet via a-l,4-delen og en slik a-D-glukosylgruppe er bundet i det minste til primæralkoholgruppen som er anordnet på nummer to karbonatomet. Spesielle substanser er, for eksempel, 2-0-a-D-glukosyl-L-askorbinsyre, 2-0-a-D-maltosyl-L-askorbinsyre, 2-0-a-maltotriosyl-L-askorbinsyre, 2-O-a-D-maltotetraosy1-L-askorbinsyre, 2-0-a-D-maltopentaosyl-L-askorbinsyre, 2-0-a-D-maltoheksaosyl-L-askorbinsyre og 2-0-a-D-maltoheptaosyl-L-askorbinsyre. Skjønt a-glukosidase generelt danner bare 2-0-a-D-glukosyl-L-askorbinsyre, kan 2-0-a-D-maltosy1-L-askorbinsyre og 2-0-a-D-maltotriosyl-L-askorbinsyre dannes i blandingen om nødvendig.

I det tilfelle hvor man bruker enten syklomaltodekstrin-glukanotransferase eller a-amylase, blir a-glykosyl-L-askorbinsyrer med en høyere a-D-glukosylgruppe dannet i blandingen. Avhengig av a-glukosylsakkaridet gir cyklomaltodekstrin-glukanotransferase en a-D-glukosylgruppe med en polymerisa-sjonsgradfordeling i området 1-7, mens a-amylase gir en litt snevrere fordeling. En slik blanding kan delvis hydrolyseres med enten a-amylase (EC 3.2.1.1), B-amylase (EC 3.2.1.2) eller glukoamylase (EC 3.2.1.3) for å redusere polymerisasjonsgraden av a-D-glukosylgruppen om nødvendig. For eksempel, 2-0-a-D-maltosyl-L-askorbinsyre og høyere polymerer hydrolyseres for å akkumulere 2-0-a-D-glukosyl-L-askorbinsyre når de utsettes for glukoamylase. B-amylase hydrolyserer hovedsakelig 2-0-a-D-maltotetraosyl-L-askorbinsyre og høyere polymerer for å akkumulere 2-0-a-D-glukosyl-L-askorbinsyre, 2-0-a-D-maltosyl-L-askorbinsyre og 2-0-a-D-maltotriosyl-L-askorbinsyre i blanding.

Reaksjonsblandingene som fås ved disse fremgangsmåter inneholder vanligvis den resterende L-askorbinsyre, D-glukose og a-glukosylsakkarid sammen med 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre.

Når det er nødvendig blir et raffinert produkt med et høyt innhold av 2-O-a-D-glukopyranosy1-L-askorbinsyre, såsom en reaksjonsblanding underkastet en eller flere separasjonsmetoder, hvor forskjellen mellom 2-0-a-D-gluko-pyranosy1-L-askorbinsyre og forurensninger såsom gjenværende L-askorbinsyre, D-glukose og a-glukosylsakkarid er med hensyn til molekylvekt og/eller affinitet utnyttes, f.eks. membransepara-sjon, gelfiltrering, kromatografi, kolonnekromatografi, høyytelse-væskekromatografi (HPLC) og ionevekslingskromato-grafi. I dette tilfelle kan den separerte L-askorbinsyre og a-glukosylsakkaridet med fordel anvendes på nytt som et start-materiale i sakkaridoverføringsreaksjonen. Om nødvendig kan, etter fullførelse av sakkaridoverføringsreaksjonen, men før separering ved f.eks. kromatografi, kan reaksjonsblandingen behandles ved en eller flere metoder, f.eks. en metode hvor reaksjonsblandingen varmes opp og de uoppløseliggjorte stoffer fjernes ved filtrering. En annen metode er den hvor reaksjonsblandingen behandles, f.eks. med aktivkull, for å adsorbere de proteinholdige og misfargende stoffer for å fjerne disse, og nok en metode er den hvor reaksjonsblandingen demineraliseres med kationvekslingsharpiks (H+<->form) og behandles med anion-vekslingsharpiks (0H~-form) for å fjerne anioner og salter ved adsorpsjon.

Det følgende skal forklare krystallisasjonen av 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre. Krystalliserbar 2-0-a-D-glukopyranosy1-L-askorbinsyre foreligger vanligvis i form av en overmettet oppløsning, og et hvilket som helst 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre materiale kan anvendes uansett dets fremstillingsprosess så sant en 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre er oppnåelig med denne. Graden av overmettethet blir vanligvis satt til 1,05-1,5. Nærmere bestemt blir 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre med renhet på ca. 75% eller høyere, fremstilt i en 65-95 vektprosent vandig oppløsning, og temperaturen innstilles på et nivå som gjør at oppløsningen ikke fryser og bevirker et mindre varmetap i løpet av behandl-ingen, fortrinnsvis i området 0-95°C. Graden av overmettethet og viskositeten kan reguleres ved tilsetning av, f.eks. metanol, etanol og aceton. En overmettet oppløsning av 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre plasseres på en fortrinnsvis høy temperatur såsom 20-60°C i et krystalliseringsapparat, en podekrystall tilsettes, fortrinnsvis i en mengde på 0,1-10 vektprosent, og krystalliseres i en blanding av sukker og melasse (massecuite) idet krystallisasjonen akselereres ved forsiktig omrøring. På denne måte er den krystallinske 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre ifølge oppfinnelsen lett oppnåelig ved poding av en overmettet oppløsning av 2-0-a-D-glukopyranosy1-L-askorbinsyre. For å fremstille den resulterende sukker/melasse-oppløsning (massecuite) til endelig krystallinsk produkt, kan vanlige metoder, f.eks. separering, blokkpulverisering, forstøvningstørking og fluidiseringssjikt-granuleringsmetoder anvendes.

Separasjonsmetoden hvorved blandingen av sukker og melasse vanligvis separeres til krystallinsk 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre og moderlut, dvs. melasse, med en sentrifuge av kurvtypen, er passende i fremstillingen av en ikke-hygroskopisk krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre med høy renhet, og den separerte krystall kan vaskes ved at man sprøyter på denne en liten mengde vann når en langt høyere renhet er nødvendig. Den separerte moderlut renses og konsen-treres på samme måte som ovenfor til en massecuite som deretter anvendes på nytt for å utvinne andre og tredje porsjoner av krystaller. Dette forbedrer utbyttet av krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre.

Da de andre tre metoder ikke fjerner melasse, forbedrer de aldri renheten av krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre i de endelige pulverprodukter, men sørger for et høyt produktutbytte. Følgelig inneholder et slikt produkt vanligvis, f. eks., L-askorbinsyre, 2-0-a-D-maltosyl-L-askorbinsyre, høyere a-glukosyl-L-askorbinsyrer, glukose og a-glukosylsakkarider sammen med krystallinsk 2-0-a-D-glukopyrano-

syl-L-askorbinsyre.

Når det gjelder forstøvningstørking blir vanligvis en massecuite med konsentrasjon på 70-85 vektprosent og krystallinitet på 25-60 vektprosent, forstøvningstørket gjennom en høytrykks-dyse, og de dråper som fås tørkes i en luftstrøm med en temperatur på f.eks. 3 0-60°C, som ikke smelter det krystallinske pulver, og deretter finner eldning i en luftstrøm på 30-60°C sted i 1-20 timer. Således får man lett et ikke-hygroskopisk eller svakt hygroskopisk krystallinsk pulver. Når det gjelder blokkpulverisering blir vanligvis en massecuite med fuktighetsinnhold på 5-15 vektprosent og krystallinitet på 10-60 vektprosent tillatt å stå i 0,5-5 dager slik at hele innholdet krystalliseres og stivner til en blokk. Kutting og tørking av den resulterende blokk gir lett et ikke-hygroskopisk eller svakt hygroskopisk krystallinsk pulver.

Alternativt blir 2-O-0i-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre i oppløsning konsentrert ved oppvarming til en overmettet opp-løsning i smeltende form, med fuktighetsinnhold på under 5 vektprosent, som deretter knas sammen med en 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre-podekrystall ved en temperatur lavere enn dens smeltepunkt, og fremstilles til en ønsket form, f.eks. pulver, granul, stang, plate og terning. Således fås et ikke-hygroskopisk eller svakt hygroskopisk krystallinsk faststoff. Avhengig av både renhet og krystallinitet, er den krystallinske 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre som fås på denne måte stort sett ikke-hygroskopisk eller nesten ikke-hygroskopisk, frittrennende og fri for adhesjon. Noen av dens overlegne egenskaper er angitt nedenfor: (1) Den oppviser ingen direkte reduserende aktivitet, og er ekstremt stabil. I motsetning til L-askorbinsyre bevirker den nesten ingen Maillard-reaksjon. På grunn av dette er den ikke opphav til noen uønsket reaksjon når den blandes med f.eks. protein, lipid, sakkarid og fysiologisk aktiv

substans, men stabiliserer disse substanser.

(2) Den er følsom for hydrolyse for dannelse av L-askorbinsyre, og dette fremkaller de samme reduksjons- og

antioksidasjonsaktiviteter som L-askorbinsyre.

(3) Den er lett hydrolyserbar ved in vivo-enzymsystemet til D-glukose og L-askorbinsyre, og således blir de fysiologiske

aktiviteter som er iboende i L-askorbinsyre fremkalt.

(4) Den er meget sikker fordi den er syntetisert og deretter metabolisert in vivo når L-askorbinsyre inntas sammen med

et a-glukosylsakkarid.

(5) Den er stort sett ikke-hygroskopisk eller nesten ikke hygroskopisk, men oppviser en høy oppløsningshastighet eller oppløselighet i vann. På grunn av dette er den gunstig å anvende som et vitamin C-anrikningsmiddel, smakforbedringsmiddel, syrningsmiddel og stabilisator i matvarer og drikkevarer i form av pulver, granul og

tablett, såsom vitaminforbindelse, kremfylling, sjokolade,

tyggegummi, juice og smakstilsetninger.

(6) Den er stort sett ikke-hygroskopisk eller nesten ikke hygroskopisk, frittrennende og fri for konsolidering. Således er den lettere håndterlig enn et amorft produkt, og dette reduserer i høy grad kostnadene forbundet med materialet og arbeidet ved emballering, transport og lagring.

På grunn av dette kan krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre med fordel innlemmes som en stabilisator, et smaksforbedringsmiddel, syrningsmiddel, antioksidasjonsmiddel, kvalitetsforbedringsmiddel, og uv-absorpsjonsmiddel, fortrinnsvis i en mengde på 0,001 vektprosent eller mer, alene eller i kombinasjon med en eller flere ingredienser i matvarer, drikkevarer, for, kjeledyrmat, og kosmetikk såsom hudforbedringsmidler og hudblekingsmidler, samt midler som er rettet på å anrike et meget sikkert naturlig vitamin C. I dette tilfelle er L-askorbinsyre, vitamin E, rutin, a-glykosylrutin og/eller hesperidin med fordel anvendelige i kombinasjon med krystallinsk 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre.

Da krystallinsk 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre er meget motstandsdyktig for syre og varme og går godt sammen med forskjellige stoffer som har en sur, salt, bitter, lekker eller skarp smak, er det gunstig å anvende den som et vitamin C-anrikningsmiddel, smakforbedringsmiddel, antioksidasjonsmiddel, og kvalitetsforbedringsmiddel i matvarer og drikker generelt, f.eks. smakstilsetninger såsom soyasaus, soyasauspulver, miso, misopulver, "moromi", "hishio", "furikake", majones, dressing, eddik, "sanbai-zu", "funmatsu-sushi-su", "chuka-no-moto", "tentsuyu (suppe for tenpura)", "mentsuyu (suppe for japanske nudler)", Worcester sauce, ketchup, "yakiniku-no-tare (suppe for grillet kjøtt)", karrijevning, forblanding for stuing, forblanding for suppe, "dashi-no-moto", blandet krydder, "mirin (sterkt søtet sake)", "shin-mirin (syntetisk mirin)", bordsuk-ker og kaffesukker, japansk-stil konditorvarer såsom "senbei (riskjeks)", "arare (pelletformet senbei)", "okoshi (hirse- og riskjeks)", "karinto (stekt deigkake)", "gyuhi (stivelses-pasta)", rispasta, "manju (bolle med fylling av bønnesylte-tøy)", "uiro (søt risgele)", "an (bønnesyltetøy)", "yokan (søt gele av bønner)", "mizu-yokan (myk adzuki-bønnegele)", "kingyoku", gele, castella og "amedama (japansk-stil karamell)", vestlig-stil konditorvarer såsom bolle, biskuit, kjeks, småkake, pai, pudding, krembolle, vaffel, sukkerbrød, smult-ring, sjokolade, tyggegummi, karamell og sukkertøy, frosne desserter såsom iskrem og saftis, siruper såsom de som anvendes til preservering av frukt og "kaki-gori (tynne flak av is)", smørbrødpålegg og pasta såsom smørkrem, eggekrem, melpasta og fruktpasta, bearbeidet frukt såsom syltetøy, marmelade, frukt nedlagt i sirup og krystallisert frukt, behandlede matvarer såsom frukt og grønnsaker, cerealer såsom bakeriprodukter, nudler, vermicelli, kokt ris og syntetisk kjøtt, fete matvarer såsom salatolje og margarin, nedlagte produkter såsom "fukujin-zuke (oppskårede grønnsaker nedlagt i soyasaus)", "bettara-zuke (ferske nedlagte redikker)", "senmai-zuke" og "rakkyo-zuke (nedlagte sjallotløker)", forblandinger for nedlagte produkter såsom (takuan-zuke-no-moto" og "hakusai-zuke-no-moto", kjøttprodukter såsom skinke og pølse, fiskeprodukter såsom fiskekjøttskinke, fiskeskjøttpølse, "kamaboko (kokt fiske-pasta)", "chikuwa (bokstavelig talt bambushjul)" og ""hanpen", apetittvekkere såsom "uni-no-shiokara (saltet innmat av sjøpinnsvin)", "ika-no-shiokara (saltet innmat av blekksprut)", "su-konbu", "saki-surume" og "fugu-no-mirinboshi", "tsukudani (mat kokt i soyasaus)" såsom "nori (tørket tang)", "sansai (fjellgrønnsaker)", "surume (tørket blekksprut)", liten fisk og skalldyr, daglige retter såsom "nimame (kokte bønner)", potetsalat, "konbu-maki (tarerull)" og "tenpura (dypfryste matvarer)", egg- og melkeprodukter såsom "kinshi-tamago", melkedrikker, smør og ost, produkter på flasker og hermetiserte produkter såsom de fra kjøtt, fisk, frukt og grønnsaker, alkoholholdige drikker såsom syntetisk sake, "zojo-shu", likør, vin og whisky, drikker såsom kaffe, kakao, saft, karbonatiserte drikker, melkesyredrikker og lactobacillus-drikker og forblandinger og hurtigmatvarer såsom pudding-forblanding, pannekake-forblanding, pulversaft (instant juice), pulverkaffe "sokuseki-shiruko (forblanding av adzukibønnesuppe med riskake) og pulversuppe. Videre kan krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre fordelaktig innlemmes i matvarer, og mat for kjeledegger, husdyr og fjærkre innbefattet honningbier, silkeormer og akvarifisk (pet fish) for vitamin C-anrikning, forbedring av smakskvaliteter og forhindring av oksidasjon.

2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre kan også fordelaktig innlemmes i spesialmatvarer og -drikker, kosmetikk innbefattet hudforbedringsmiddel og hudblekingsmiddel, f.eks. sigarer, sigaretter, pastiller, tranpastiller, vitaminforbindelser, munnvask, pastiller som fjerner dårlig ånde, gurglevann, tannpasta, lebestift, øyenskygge, melkelotion, fuktighetsvæske, kosmetisk krem, underlagskrem, solbeskyttelsesmiddel, rensende sepe, shampoo og balsam, foruten anvendelser som uv-absorpsjonsmiddel og nedbrytningshindrende middel for plast og også som et underlag for analyse av glykosidhydrolaser.

Krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre innlemmes i produkter på vanlig måte, f.eks. blanding, knaiing, opp-løsning, smelting, bløting, inntrengning, spredning, belegging, påføring, spraying, injisering, krystallisering og stivning før deres bearbeiding fullføres.

Krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre blir med fordel anvendt som et materiale for kjemiske reaksjoner som utføres under vannfrie betingelser, fordi det er stort sett vannfritt og dets fullstendige vannfrihet er oppnåelig med en kort lufting i varm luft. Således kan man, ved underkastelse av en krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre for vanlig kjemisk reaksjon under vannfrie betingelser, med letthet fremstilles f.eks. dens eter- og ester-derivater. Disse derivater er egnet til bruk f.eks. i overflateaktive midler, emulgatorer, stabilisatorer og lipofilt vitamin C.

Når en krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre foreligger i fri syreform, kan den om nødvendig omdannes, f.eks. til natriumsalt, kalsiumsalt, magnesiumsalt, jernsalt, kobbersalt og zinksalt ved at den tillates å reagere med en vandig oppløsning av f.eks. metallhydroksid og metallkarbonat, slik at den resulterende substans meddeles evnen til passende å justere pH-verdien og også oppviser aktivitene av mineraler og vitamin C. En slik substans blir fortrinnsvis anvendt i forsterkende næringsmiddeltilsetninger og kjemiske agenser.

De følgende eksperimenter vil beskrive i detalj en typisk krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre i henhold til oppfinnelsen.

Forsøk 1

Fremstilling av en krystallinsk 2- O- a- D- qlukopyranosy1- L-askorbinsyre

Ni vektdeler dekstrin (DE ca. 6) ble oppløst i 15 vektdeler vann ved oppvarming, og til oppløsningen ble der satt 3 vektdeler L-askorbinsyre under reduserende betingelser, videre ble der tilsatt 4 00 enheter pr. g dekstrin av cyklomalto-dekstrin-glukanotransferase tilgjengelig i handelen fra Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, og dette ble tillatt å reagere i 24 timer, idet. oppløsningen ble holdt på pH 5,5 og 60°C. Reaksjonsblandingen ble matet til et "AQ-3 03 ODS" HPLC-system, et produkt fra Yamamura Chemical Laboratories Co., Ltd., Kyoto, Japan, utstyrt med "LC-6" kolonne, et produkt fra Shimadzu Seisakusho Ltd., Kyoto, Japan, og eluert med 0,1 M KH2P04/H3P04-buffer (pH 2,0) ved en strømningshastighet på 0,5 ml/min under overvåkning med et "MULT-34 0" detektorsystem, et produkt fra Japan Spectroscopic Co., Ltd., Tokyo, Japan. Som et resultat kom L-askorbinsyre til syne ved en retensjonstid på 9,5 min, mens den nylig dannede a-D-glukosy1-L-askorbinsyre, a-D-maltosy1-L-askorbinsyre, a-D-maltotriosy1-L-askorbinsyre, a-D-maltotetraosy1-L-askorbinsyre, a-D-maltopentaosyl-L-askorbinsyre, a-D-maltoheksaosyl-L-askorbinsyre og a-D-maltoheptaosyl-L-askorbinsyre kom til syne ved tilbakeholdelsestider på henholdsvis 11,2 min, 15,7 min, 20,6 min, 24,9 min, 28,1 min, 32,1 min og 38,6 min. Ca. 60% av L-askorbinsyren ble omdannet til a-glykosy1-L-askorbinsyre. Deretter ble reaksjonsblandingen filtrert med UF-membran for å fjerne enzymet, justert på pH 5,0 og 55°C, der ble tilsatt 10 enheter pr. g dekstrin av glukoamylase (EC 3.2.1.3) tilgjengelig i handelen fra Seikagaku Kogyo Ltd., Tokyo, Japan, og tillatt å reagere i 24 timer. HPLC-analyse av reaksjonsblandingen avslørte at a-D-maltosyl-L-askorbinsyre og høyere a-glykosyl-L-askorbinsyrer ble hydrolysert til 2-O-a-D-gluko-pyranosy1-L-askorbinsyre.

Reaksjonsblandingen ble deretter varmet opp for å inaktivere det gjenværende enzym, fargen ble fjernet, og blandingen filtrert med aktivkull og filtratet ble konsentrert til ca. 50 vektprosent.

Konsentratet ble underkastet kolonnekromatografi på "XT-1016 (Na<+->form)", en sterkt sur kationvekslerharpiks tilgjengelig i handelen fra Tokyo Chemical Industries, Tokyo, Japan, i henhold til den fremgangsmåte som er angitt i japansk ut-legningsskrift nr. 23 799/83 med en liten modifikasjon for å eluere å utvinne en fraksjon rik på 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre med en renhet på 94%, som deretter ble renset ved demineralisering under anvendelse av en kationvekslerharpiks (H+-form), konsentrert til ca. 80 vektprosent, anbragt i en glassbeholder og tillatt å henstå ved 20-35°C i ca. 1 måned. Således fant krystallisering sted. En porsjon av krystallene ble satt til et nylig fremstilt preparat av den samme rensede og konsentrerte fraksjon rik på 2-O-a-D-glukopyranosy1-L-askorbinsyre og krystallisert ved forsiktig omrøring. Den resulterende massecuite ble separert i melasse og krystaller og de sistnevnte ble deretter vasket ved at der på disse ble sprayet en liten mengde hurtigavkjølt vann for høyere renhet, deretter ble de oppløst i vann og rekrystallisert. Således ble en meget ren krystall med renhet på ca. 99,9% eller høyere oppnådd.

Forsøk 2

Fysiokjemiske egenskaper av krystallinsk 2- 0- a- D- glukopyrano-sy1- L- askorbinsyre

Karakterisering av en krystall oppnådd ved rekrystallisasjon i henhold til fremgangsmåten angitt i forsøk 1, viste at det var en ny vannfri krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre.

Egenskapene av krystallen var som følger.

(1) Grunnstoffanalyse

Funnet, C=42,6%, H=5,36%

Beregnet, C=42,4%, H=5,37%, N<0,01% (for kjemisk formel <C>12<H>18°ll)

(2) Molekylvekt

FD-massespektrometisk analyse med "M-80B", en masse-spektrometri kommersialisert av Hitachi Ltd., Tokyo, Japan, viste en (M+H)<+> topp ved 339 (molekylvekt for den kjemiske formel C12<H>18<0>11 er 338)• (3) Smeltepunkt 158,5-159,5°C

(4) Oppløsningsvarme

Endoterm (27,2 kcal/g)

(5) Spesifikk rotasjon [a]x>°=+189, 6° (H20, pH 1,98)

[a]|>°=+246, 3° (H20, pH 7,10)

(6) uv-absorpsjonsspektrum uv-absorps jons spektrum ble bestemt i 50 /xM oppløsning. Spektret ved pH 2,0 var som vist på fig. 1, mens det ved pH 7,0 var som vist på fig. 2.

X(maks)=238nm, e=0,93xl0<4> (pH 2,0)

X(maks)=260nm, e=l,50xl0<4> (pH 7,0)

(7) Infrarødt absorpsjonsspektrum

KBr-tablettmetoden ble brukt. Det infrarøde spektrum for krystallen var som vist på fig. 3, mens det for den amorfe

substans brukte som sammenligning var som vist på fig. 4. (8) Oppløselighet 125 g av krystallene løses opp i 100 g vann ved 25°C.

(9) Oppløselighet i oppløsningsmidler

Lett oppløselig i vann, 0,1 N natriumhydroksid og 0,1 N eddiksyre, oppløselig i metanol og etanol, og uoppløselig

i eter, benzen, kloroform og etylacetat.

(10) Dissosiasjonskonstant pKa er 3,0. Sammenligning av denne med den for forskjellige derivater av L-askorbinsyre i tabell 1 hos J. Jernow et al., Tetrahedron, Vol. 35, pp. 1483-1486 (1979) og i tabell 2 hos Pao-Wen Lu et al., Journal of Agricultural Food Chemistry, Vol. 32, pp. 21-28 (1984) antyder at i substansen ifølge oppfinnelsen, er alkoholgruppen, som er anordnet på nummer to karbonatomet i askorbinsyredelen, ansvarlig for a-D-glukosylkoblingen, mens alkoholgruppen som er anordnet på nummer tre karbonatomet foreligger i

fri form.

(11) Metyleringsanalyse

Krystallen ble metylert ved den fremgangsmåte som er beskrevet hos Pao-Wen Lu et al., Journal of Agricultural Food and Chemistry, Vol. 32, pp. 21-28 (1984) hvor L-askorbinsyre ble metylert med diazometan for dannelse av stort sett 3-0-mety1-L-askorbinsyre. En etterfølgende hydrolyse av resultatet førte til dannelsen av 3-0-metyl-L-askorbinsyre og D-glukose som de dominerende produkter.

(12) Fysiske egenskaper og farge

Fargeløs og gjennomsiktig krystall. Når den er pulveri-sert har krystallen en sur smak men oppviser ingen lukt. Fri for hygroskopisitet og istykkerdeling ved opptagelse av fuktighet (deliquescence). Tap ved tørking ved 130°C i 2 timer er mindre enn 0,5 vektprosent.

Fig. 5 er et bilde sett gjennom mikroskop av en

krystall som vokser i en overmettet oppløsning.

(13) Fargereaksjon

Oppviser ingen direkte reduserende aktivitet, og gir ingen reduksjon eller avfarging av 2,6-diklorfenolindofenol. Negativ for 2,4-dinitrofenylhydrazin-reaksjonen.

Blir grønn i antron/svovelsyre-reaksjonen.

(14) Strukturelement

Hydrolyserbar ved a-glukosidase eller ved behandling med IN saltsyre ved 100°C i 5 min for dannelse av L-askorbinsyre og D-glukose ved et molforhold på 1:1.

(15) Pulver-røntgendifraksjonsanalyse

Ved pulver-røntgendiffraksjonsanalyse ved anvendelse av "GEIGERFLEX RAD-II B (CuKa-stråle)", et produkt fra Rigaku Corp., Tokyo, Japan, oppviser krystallen dominante diffraksjonsvinkler (20) på 10,3°, 14,8°, 16,2°, 18,4° og

24,5°.

(16) Røntgenanalyse på enkeltkrystall

Røntgen-diffraksjonsanalyse på et enkelt krystall dyrket i en overmettet oppløsning viste at den var gruppert i det ortorombiske system, og dens romgruppe var P212122 med toppunktkonstanter på a=ll,929Å, b=24,351Å og c=4,864Å

(0=3=7=90°).

Disse data viser klart at i den kjemiske struktur av krystallen er en a-glukosylbinding dannet mellom alkoholgruppen på karbonatom nummer to og alkoholgruppen som er anordnet på karbonatom nummer en i D-glukose.

Fig. 6 viser ORTEP-figuren av krystallen.

De ovenfor angitte data antyder at krystallen er en ny krystallinsk 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre som vist ved formelen (III):

Følgelig er det antydet at a-glykosyl-L-askorbinsyre hvor ekvimolare eller større mengder D-glukoserester er bundet til L-askorbinsyre har den kjemiske struktur som er vist ved formelen (IV):

hvor n er et helt tall fra 0 til 6.

Forsøk 3

Stabilitet av krystallinsk 2- O- a- D- glukopyranosvl- L- askorbinsyre i oppløsning

2-O-a-D-glukosyl-L-askorbinsyre ble sammenlignet med henholdsvis 6-0-a-D-glukosy1-L-askorbinsyre angitt i japansk patent-publikas jon nr. 38 158/73 og L-askorbinsyre, for stabilitet i vandig oppløsning. Nærmere bestemt ble hver prøve justert til en konsentrasjon på 70 /im og pH 7,0 eller 2,0, anbragt i en kuvette, og målt for sin absorbans ved enten 260nm og pH 7,0 eller ved 245nm og pH 2,0 idet oppløsningen ble holdt på 45°C. De resterende forhold (%) ble beregnet ved absorbansen.

Resultatene var som vist i tabell I.

Som det klart fremgår fra resultatene i tabell I var krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre i motsetning til 6-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre og L-askorbinsyre, meget stabilt selv i vandig oppløsning.

Forsøk 4

Akutt giftighet

En prøve av 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre fremstilt ved fremgangsmåten ifølge eksempel 1, ble gitt oralt til 7 uker gamle dd-mus for akutt giftighetstest. Resultatet var at ingen mus døde når de ble tilført inntil 5 g av materialet og høyere dose var vanskelig.

Dette bekreftet at materialet hadde ekstremt lav giftighet.

De følgende eksempler A og B viser henholdsvis den krystallinske 2-O-a-D-glukopyranosy1-L-askorbinsyre og dens anvendelser.

Eksempel A- I

Krystallinsk 2- O- a- D- glukopyranosy1- L- askorbinsyre

Ni vektdeler a-cyklodekstrin ble oppløst i 2 0 vektdeler vann ved oppvarming og oppløsningen ble tilsatt 3 vektdeler L-askorbinsyre under reduserende betingelser, deretter, mens oppløsningen ble holdt på pH 5,5 og 65°C, ble der tilsatt 100 enheter pr. g a-cyklodekstrin av cyklomaltodekstrin-glukano-transferase, tilgjengelig i handelen fra Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, og blandingen ble tillatt å reagere i 40 timer. HPLC-analyse av reaksjonsblandingen viste at ca. 50% av L-askorbinsyren var omdannet til a-glykosy1-L-askorbinsyre samtidig som i forsøk 1.

Deretter ble reaksjonsblandingen varmet opp for å inaktivere det gjenværende enzym, blandingen ble justert pH 4,5 og 55°C, og 50 enheter glukoamylase pr. g a-cyklodekstrin ble tilsatt og tillatt å reagere i 24 timer. HPLC-analyse av den nylig dannede reaksjonsblanding viste at a-maltosyl-L-askorbinsyre og høyere a-glukosyl-L-askorbinsyre ble hydrolysert til 2-O-a-D-glukopyranosy 1-L-askorbinsyre .

Reaksjonsblandingen ble deretter varmet opp for å inaktivere det gjenværende enzym, avfarget og filtrert med aktivkull og filtratet ble ført til en kolonne med en kationvekslerharpiks (H+<->form) for demineralisering, videre ført til en kolonne med en anionvekslerharpiks (OH~-form) for å adsorbere anioner. Deretter ble kolonnen vasket med vann og tilført 0,5N saltsyre for eluering og eluatet ble underkastet gelfiltreringskromato-grafi på "HW-40", et gelprodukt fra Tosoh Corp., Tokyo, Japan, for å utvinne en fraksjon som var rik på 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre som deretter ble konsentrert i vakuum til ca. 73 vektprosent, anbragt i et krystalliseringsapparat, tilført 1 vektprosent 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre-podekrystall, justert på 40°C, gradvis avkjølt til 25°C over en periode på 2 dager mens krystalliseringen ble akselerert ved forsiktig omrøring, og matet til en sentrifuge av kurvtypen for å fjerne melassene. De gjenværende krystaller ble vasket ved at de ble sprayet med en liten mengde vandig etanol for oppnåelse av en krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre med renhet ca. 99% og utbytte på 35 vektprosent i forhold til utgangs-L-askorbinsyren.

Skjønt produktet var litt forskjellig med hensyn til smeltepunkt og spesifikk rotasjon fra en krystall som ble oppnådd ved fremgangsmåten ifølge forsøk 1, var de andre egenskaper stort sett de samme.

Produktet er stort sett ikke-hygroskopisk, lett håndterlig, fritt for reduserende aktivitet, og har tilfredsstillende høy stabilitet og fysiologiske aktiviteter. Således er produktet gunstig for bruk som et smaksforbedrende middel, syrningsmiddel, stabilisator, kvalitetsforbedrende middel, antioksidasjonsmiddel, fysiologisk aktivt middel, uv-absorpsjonsmiddel, kjemikalium i matvarer, drikkevarer, kosmetika og kjemiske reagenser samt som agenser rettet på anrikning av vitamin C.

Forsøk A- 2

Krystallinsk 2- 0- a- D- glukopyranosyl- L- askorbinsvre

Tredve vektdeler dekstrin (DE ca. 6) ble oppløst i 40 vektdeler vann ved oppvarming og til oppløsningen ble der satt 7 vektdeler L-askorbinsyre under reduserende betingelser, deretter mens oppløsningen ble holdt på pH 5,6 og 60°C, ble der tilsatt 250 enheter pr. g dekstrin av cyklodekstrin-glukano-transferase og blandingen ble tillatt å reagere i 40 timer. Etter analyse av reaksjonsblandingen ved HPLC på samme måte som i eksempel A-I, var 65% av L-askorbinsyren omdannet til a-glykosy1-L-askorbinsyre på samme måte som i forsøk 1.

Deretter ble reaksjonsblandingen filtrert med UF-membran for å fjerne enzymet, justert på pH 5,0 og 50°C, 100 enheter pr. g dekstrin av glukoamylase ble tilsatt og blandingen ble tillatt å reagere i 6 timer. HPLC-analyse av reaksjonsblandingen viste at a-D-maltosyl-L-askorbinsyre og høyere a-glykosyl-D-askorbinsyrer var omdannet til 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre.

Deretter ble reaksjonsblandingen varmet opp for å inaktivere det gjenværende enzym og filtrert hvoretter filtratet ble konsentrert og kromatografert på en kolonne av "DOWEX 50WX4 (Ca<++->form)", en sterkt sur kationvekslerharpiks tilgjengelig fra Dow Chemical Co., Midland, Michigan, USA, i henhold til fremgangsmåten i forsøk 1 med en liten modifikasjon. Den eluerte 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre-rike fraksjon ble renset ved demineralisering med en kationvekslerharpiks (H+<->form), konsentrert i vakuum til ca. 77 vektprosent, anbragt i et krystalliseringsapparat, 2 vektprosent podekrystall ble tilsatt, blandingen ble justert på 45°C, og gradvis avkjølt til 28°C over en periode på 2 dager idet krystallisasjonen ble akselerert ved forsiktig omrøring. Den resulterende massecuite ble separert på samme måte som i eksempel 1 for oppnåelse av en krystallinsk 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre med renhet på ca. 9 8%, idet utbyttet var ca. 4 5 vektprosent i forhold til utgangs-L-askorbinsyren.

På samme måte som produktet i eksempel A-I, er produktet stort sett ikke-hygroskopisk, lett å håndtere, fritt for direkte reduserende aktivitet, og har tilfredsstillende høy stabilitet og fysiologiske aktiviteter. Således er produktet gunstig å anvende som et smaksforbedringsmiddel, syrningsmiddel, fuktighetsbevarende middel, stabilisator, kvalitetsforbedringsmiddel, antioksidasjonsmiddel, biologisk aktivt middel, uv-absorps jonsmiddel, kjemikalium i matvarer, drikker, og kosmetika samt i agenser direkte for anrikning av vitamin C.

Eksempel A- 3

Krystallinsk 2- O- a- D- glukopyranosy1- L- askorbinsvre

På samme måte som i eksempel A-2, ble cyklomaltodekstrin-glukanotransferase og glukoamylase tillatt å reagere for oppnåelse av en reaksjonsblanding inneholdende 2-0-a-D-glukopyranosy1-L-askorbinsyre som deretter ble varmet opp for å inaktivere enzymene, avfarget og filtrert med aktivkull. Det resulterende filtrat ble demineralisert med en kationvekslerharpiks (H+<->form) og kromatografert på en kolonne med en sterkt sur kationvekslerharpiks (H+<->form) i henhold til fremgangsmåten i forsøk 1 med en liten modifikasjon, fulgt av eluering. Fraksjonen rik på 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre ble utvunnet, konsentrert til ca. 90 vektprosent, anbragt i et krystalliseringsapparat, 2 vektprosent podekrystall ble tilsatt, og blandingen ble forsiktig omrørt i 3 0 min og overført til et brett, og krystallisert og stivnet ved 3 dagers henstående ved 25°C. Innholdet ble deretter fjernet fra

brettet, matet til et kuttende pulveriseringsapparat og tørket for oppnåelse av en krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre med renhet på ca. 95% og utbytte på ca. 70 vektprosent i forhold til utgangs-L-askorbinsyren.

På samme måte som produktet i eksempel A-I, er produktet stort sett ikke-hygroskopisk, lett å håndtere, fritt for direkte reduserende aktivitet og har tilfredsstillende høy stabilitet og fysiologiske aktiviteter. Således er produktet gunstig å anvende som et smaksforbedringsmiddel, syrningsmiddel, stabilisator, kvalitetsforbedringsmiddel, antioksidasjonsmiddel, fysiologisk aktiv agens, uv-absorpsjonsmiddel, og kjemikalium i matvarer, drikker, kosmetika og kjemiske reagenser såvel som i agenser rettet på anrikning av vitamin C.

Eksempel A- 4

Krystallinsk 2- O- a- D- glukopyranosy1- L- askorbinsyre

En fraksjon rik på 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre, fremstilt ved fremgangsmåten i henhold til eksempel A-3, ble konsentrert til ca. 80 vektprosent, anbragt i et krystalliseringsapparat, 2 vektprosent podekrystall ble tilsatt og blandingen ble gradvis avkjølt fra 50°C idet krystallisasjonen ble akselerert ved forsiktig omrøring. Den resulterende massecuite med krystallinitet på ca. 35%, ble forstøvet gjennom en dyse med diameter på l,5mm, anordnet øverst i et forstøv-ningstårn med en høytrykkspumpe og trykk på 14,7 MPa.

Samtidig ble luft på 85°C ført fra toppen av tårnet mot et samlebånd i form av et nett som var anordnet ved bunnen av tårnet for å samle opp det pulveriserte produkt på samlebåndet og også gradvis føre det resulterende krystallinske pulver ut av tårnet over en periode på ca. 30 min, idet en strøm på 40°C ble ført oppover gjennom samlebåndet.

Det krystallinske pulver ble deretter anbragt i et eldningstårn og eldnet i 10 dager for krystallisering og dehydratisering. Således ble en krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre med renhet på ca. 9 5% oppnådd, med utbytte på ca. 7 0 vektprosent i forhold til utgangs-L-askorbinsyren.

På samme måte som produktet i eksempel A-I er produktet stort sett ikke-hygroskopisk, lett håndterbart, fritt for direkte reduserende effekt, og med tilstrekkelig høy stabilitet og fysiologiske aktiviteter. Således er produktet gunstig å anvende som et smaksforbedringsmiddel, syrningsmiddel, stabilisator, kvalitetsforbedringsmiddel, antioksidasjonsmiddel, fysiologisk aktiv agens, uv-absorpsjonsmiddel, og kjemikalium i matvarer, drikke, og kosmetika såvel som i angenser rettet på anrikning av vitamin C.

Eksempel A- 5

Krystallinsk 2- O- a- D- glukopvranosy1- L- askorbinsyre

Eksempel A5dV

Fremstilling av a- glukosidase

Mucor javanicus IFO 4570 ble inokulert og dyrket ved 30°C i 44 timer under betingelser av gjennomlufting-agitasjon i 500 vektdeler av et flytende dyrkningsmedium som inneholdt vann sammen med 4,0 w/v % maltose, 0,1 w/v % monobasisk kalium-fosfat, 0,1 w/v % ammoniumnitrat, 0,05 w/v % magnesiumsulfat, 0,05 w/v % kaliumklorid, 0,2 w/v % polypepton og 1 w/v % kalsiumkarbonat som var blitt sterilisert ved oppvarming og tilsatt sterilt til vannet straks før inokulasjonen. Etter fullførelse av dyrkingen ble mycelia utvunnet og immobilisert på vanlig måte.

Eksempel A- 5( 2)

Fremstilling av krystallinsk 2- 0- a- D- qlukopyranosyl- L- askorbinsyre 40 vektdeler "SUNMALT®" en krystallinsk maltose tilgjengelig i handelen fra Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japan, ble oppløst 1 70 vektdeler vann ved oppvarming, og til oppløsningen ble der satt 10 vektdeler L-askorbinsyre under reduserende betingelser, videre ble der tilsatt 10 enheter pr. g maltose av en immobilisert a-glukosidase fremstilt ved fremgangsmåten ifølge eksempel A-5(l), og blandingen ble tillatt å reagere ved pH 5,5 og 50°C i 3 timer under lysskjermende betingelser.

En enhet av a-glukosidase er definert som den mengde enzym som frigjør 1 /im glukose ved 37°C over et tidsrom på 1 min målt under de følgende betingelser: Etter riktig fortynning blir 100 /il av en enzymoppløsning satt til en blandingsoppløsning på 250 /il 4 w/v % maltose og 750 jul av en 0, IM acetatbuffer (pH 6,0) inneholdende l,3 5mM EDTA, og blandingen tillates å reagere ved 37°C i 3 0 min, inkuberes i kokende vann i 3 min for å sus-pendere reaksjonen, og sentrifugeres. Deretter blir en prøve på 2 0 /il av supernatanten tatt, til denne settes 1 ml "GLUKOSE B TEST", en fargereagens for glukoseoksidasemetoden, kommersialisert av Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan, blandingen inkuberes ved 37°C i 20 min for fargeutvikling, og målt for absorbans ved 505 nm.

Deretter ble reaksjonsblandingen filtrert for å utvinne det immobiliserte a-glukosidase som ble brukt på nytt i en annen reaksjonssats. Filtratet ble avfarget ved aktivkull og kromatografert på en kolonne av sterkt sur ioneveksleharpiks ved fremgangsmåten ifølge eksempel A-2 for utvinning av en fraksjon rik på 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre som deretter ble renset med en kationvekslerharpiks, deretter i henhold til fremgangsmåten i eksempel A-3, konsentrert i vakuum til ca. 90 vektprosent, plassert i et krystalliseringsapparat, tilført en podekrystall, krystallisert og bragt til å størkne i et brett, matet til et kuttende pulveriseringsapparat og tørket for oppnåelse av en krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre med renhet på ca. 88% med et utbytte på ca. 20 vektprosent i forhold til utgangs L-askorbinsyren.

Ved sammenligning av produktet i eksempel A-I, er produktet litt dårligere, men stort sett ikke-hygroskopisk, lett håndterbart, fritt for direkte reduserende aktivitet og med tilstrekklig høy stabilitet og fysiologiske aktiviteter. Således er produktet gunstig å anvende som et smaksforbedringsmiddel, syrningsmiddel, stabilisator, kvalitetsforbedringsmiddel, antioksidasjonsmiddel, fysiologisk aktiv agens, uv-absorps j onsmiddel , og kjemikalium i matvarer, drikker, og kosmetika samt agenser rettet på anrikning av vitamin C.

Eksempel B- l

Tyggegummi

25 vektdeler gummibase og 20 vektdeler krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre oppnådd ved fremgangsmåten ifølge eksempel A-2 ble knadd ved 60°C med et blandeapparat, og til blandingen ble der satt 50 vektdeler "MABIT®", et vannfritt krystallinsk maltitol, tilgjengelig i handelen fra Hayashibara Shoji Inc., Okayama, Japan, 1,5 vektdeler kalsiumfosfat og 0,1 vektdeler av et L-mentol innbefattet fi-cyklodekstrin. Dette ble videre blandet med en liten mengde krydder, rullet og kappet for oppnåelse av det nevnte produkt. Produktet er en vitamin C-anriket tyggegummi med lav kreftfremkallende evne og lavt kaloriinnhold.

Eksempel B- 2

" Gyuhi ( stivelsepasta)"

En vektdel av vokslignende ristivelse ble blandet med 1,2 vektdeler vann og blandingen ble omrørt til homogenitet med 1,5 vektdeler sakkarose, 0,7 vektdeler "SUNMALT®", en krystallinsk B-maltose tilgjengelig i handelen fra Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japan, 0,1 vektdeler av en krystallinsk 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre oppnådd ved fremgangsmåten ifølge eksempel A-5 under gelatinisering ved oppvarming. Deretter ble den resulterende blanding formet og pakket på vanlig måte for oppnåelse av "gyuhi".

Produktet er en vitamin C-anriket konditorvare i japansk stil, med utmerket smaks- og biteegenskaper, og ser ut som "kibi-dango (hirsebolle)". Produktet oppviser god holdbarhet fordi degenerering av produktet er effektivt undertrykket.

Eksempel B- 3

Blandet søtningsmiddel

Et blandet søtningsmiddel ble oppnådd ved blanding av 100 vektdeler honning, 50 vektdeler isomerisert sukker, 2 vektdeler "kurozato (uraffinert sukker)" og 1 vektdel krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre oppnådd ved fremgangsmåten ifølge eksempel A-3.

Produktet er et vitamin- C-anriket søtningsmiddel og egnet for helsekost.

Eksempel B- 4

Si okolade

4 0 vektdeler kakaopasta, 10 vektdeler kakaosmør, 50 vektdeler vannfritt krystallinsk maltitol og 1 vektdel krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre oppnådd ved fremgangsmåten ifølge eksempel A-2 ble blandet til homogenitet, og blandingen ble matet til en raffinør for å redusere partikkelstørrelsen, overført til en conche, og knadd deri ved 50°C i 2 dager. I knatrinnet ble 0,5 vektdeler lecitin tilsatt og dispergert til homogenitet. Deretter ble innholdet justert til 31°C med en termoregulator, og anbragt i en form like før smøret stivnet, luft ble fjernet med en vibrator og massen størknet ved passasje av denne gjennom en 10°C kjøletunnel over en periode på 20 min. Innholdet ble fjernet fra formen og pakket for oppnåelse av det nevnte produkt.

Produktet er fritt for hygroskopisitet og utmerket med hensyn til farge, glans og struktur, samtidig som det smelter jevnt i munnen for å oppvise en moderat og middel søthet og smak. Produktet er en vitamin-C-anriket sjokolade som er lavt kreftfremkallende og har lavt kaloriinnhold.

Eksempel B- 5

Kremfylling

En kremfylling ble oppnådd ved blanding på vanlig måte 1.200 vektdeler "FINETOSE®", en krystallinsk a-maltose tilgjengelig i handelen fra Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japan, 1.000 vektdeler smult, 10 vektdeler krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre oppnådd ved fremgangsmåten ifølge eksempel A-4, 1 vektdel lecitin, 1 vektdel sitronolje og 1 vektdel vaniljeolje til homogenitet.

Produktet er en vitamin- C-anriket kremfylling som har utmerket smak, aroma, smelte- og tyggeegehskaper.

Eksempel B- 6

Tablett

2 0 vektdeler krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre oppnådd ved fremgangsmåten ifølge eksempel A-I ble blandet til homogenitet med 13 vektdeler krystallinsk 3-maltose, 4 vektdeler kornstivelse, 1 vektdel rutin og 0,5 vektdeler riboflavin og den resulterende blanding ble tablettert for oppnåelse av det angitte produkt, 150 mg hver.

Produktet er en stabil og lett svelgbar vitaminforbindelse av vitamin C, vitamin P og vitamin B2.

Eksempel B- 7

Intubasi onsnæringsmidde1

24 g's porsjoner av en blanding bestående av 20 vektdeler krystallinsk a-maltose, 1,1 vektdeler glycin, 0,18 vektdeler natriumglutamat, 1,2 vektdeler natriumklorid, 1 vektdel sitronsyre, 0,4 vektdeler kalsiumlaktat, 0,1 vektdel magnesium-karbonat, 0,1 vektdel av en krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre oppnådd ved fremgangsmåten ifølge eksempel A-3, 0,01 vektdel tyamin og 0,01 vektdel riboflavin ble pakket i laminerte aluminiumsposer og varmeforseglet for oppnåelse av det nevnte produkt.

Ved bruk blir en pose av produktet oppløst i 300-500 mm vann, og oppløsningen kan med fordel anvendes som et intubasjons-næringsmiddel rettet på oral og parenteral tilførsel til nesehulen, maven og tarmen.

Eksempel B- 8

Badevæske

En badevæske ble oppnådd ved blanding av 21 vektdeler DL-natriumlaktat, 8 vektdeler natriumpyruvat, 5 vektdeler krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre som pulver oppnådd ved fremgangsmåten ifølge eksempel A-5 og 40 vektdeler etanol med 2 6 vektdeler raffinert vann og riktige mengder fargestoff og smaksstoff.

Produktet er egnet som et hudforbedringsmiddel og hudblekingsmiddel, som fortynnes 100-10.000 ganger i badevann når det anvendes. I dette tilfelle kan vannet erstattes med rensevæske, sammentrekkende middel (astringent) og fuktighetsbevarende væske.

Eksempel B- 9

Melkeaktiq lotion

1/2 vektdel polyoksyetylenbehenyleter, 1 vektdel polyoksy-

etylensorbitoltetraoleat, 1 vektdel oljeoppløselig glyceryl-monostearat, 0,5 vektdeler pyrodruesyre, 0,5 vektdeler behenylalkohol, 1 vektdel avokadoolje, 1 vektdel krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre oppnådd ved fremgangsmåten ifølge eksempel A-4 og passende mengder vitamin E og antiseptisk middel ble oppløst på vanlig måte ved oppvarming, og til oppløsningen ble der satt 1 vektdel L-natriumlaktat, 5 vektdeler 1,3-butylenglykol, 0,1 vektdel karboksyvinylpolymer og 85,3 vektdeler raffinert vann, emulgert med et homo-geniser ingsapparat , og passende mengde smaksmiddel ble tilsatt og blandingen ble omrørt for oppnåelse av det nevnte produkt.

Produktet kan med fordel anvendes som et høykvalitets solbeskyttelsesmiddel, et hudforbedringsmiddel og et hudblekingsmiddel.

Eksempel B- 10

Kosmetisk krem

2 vektdeler polyoksyetylenglykolmonostearat, 5 vektdeler selvemulgerende glycerinmonostearat, 2 vektdeler av en krystallinsk 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre oppnådd ved fremgangsmåten ifølge eksempel A-3, 1 vektdel flytende parafin, 10 vektdeler glyceryltrioktanat og en passende mengde antiseptisk middel ble oppløst på vanlig måte ved oppvarming, og til blandingen ble der satt 2 vektdeler L-melkesyre, 5 vektdeler 1,3-butylenglykol og 66 vektdeler raffinert vann, emulgert med et homogeniseringsapparat, og en passende mengde smaksmiddel ble tilsatt og blandingen ble omrørt for oppnåelse av det nevnte produkt.

Produktet kan med fordel anvendes som en høykvalitets solbe-skyttelseskrem, hudforbedringsmiddel og hudblekingsmiddel.

Som beskrevet ovenfor, er krystallinsk 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre, en ny substans ifølge oppfinnelsen, stort sett ikke-hygroskopisk, går ikke i oppløsning ved opptagelse av vann, er fri for konsolidering og direkte reduserende aktivitet, er lett håndterbar, har overlegen stabilitet og er lett hydrolyserbar in vivo for å oppvise de antioksidasjonsaktiviteter og fysiologiske aktiviteter som er iboende i L-askorbinsyre. Videre er 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre en meget sikker substans fordi den syntetiseres og meta-boliseres in vivo.

Krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre er lett krysta11iserbar i en overmettet oppløsning som fås ved at man tillater et sakkaridoverføringsenzym å virke alene eller sammen med glukoamylase på en oppløsning inneholdende L-askorbinsyre og et a-glukosylsakkarid, og renser og konsentrerer den resulterende 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre. Således har man en krystallisasjonsprosess som er overlegen med hensyn til økonomisk effektivitet og som lett kan kommersialiseres.

Da krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre har tilfredsstillende høy stabilitet og fysiologiske aktiviteter, kan den med fordel anvendes som en stabilisator, kvalitetsforbedringsmiddel , antioksidasjonsmiddel, fysiologisk aktivt middel, uv-absorbsjonsmiddel, og kjemikalier i matvarer innbefattet drikker og bearbeidede matvarer, og kosmetika innbefattet hudforbedringsmiddel og hudblekingsmiddel. Således har krystallinsk 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre en utstrakt bruk og er av stor betydning for disse industrier.

Claims

1. Forbindelse, karakterisert ved at den er en krystallinsk 2-O-a-D-glukopyranosy1-L-askorbinsyre, og at den oppviser dominante diffraksjonsvinkler (2 0) på 10,3°, 14,8°, 16,2°, 18,4° og 24,5° ved pulver-røntgendiffraksjonsanalyse.

2. Fremgangsmåte til å fremstille krystallinsk 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre som utviser predominante diffraksjonsvinkler (20) på 10,3°, 14,8°, 16,2°, 18,4° og 24,5° ved pulverrøntgendiffraksjonsanalyse, karakterisert ved at den omfatter: a) å tillate et sakkaridoverførende enzym alene eller sammen med glukoamylase (EC 3.2.1.3) å virke på en oppløsning som inneholder L-askorbinsyre og et a-glukosylsakkarid ved en pH-verdi i området 3-9 og en temperatur i området 20-80°C for å danne 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre hvor konsentrasjonen av a-glukosylsakkarid er 0,5 - 3 0 ganger høyere enn konsentrasjonen av L-askorbinsyre; b) å konsentrere den resulterende oppløsning til en overmettet oppløsning; c) å krystallisere 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre i den overmettede oppløsning; og d) å gjenvinne og rense den resulterende 2-0-a-D-gluko-pyranosy1-L-askorbinsyre.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at det sakkaridoverførende enzym er valgt fra gruppen som består av cyklomaltodekstrin-glukanotransferase (EC 2.4.1.19) og a-glukosidase.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at a-glukosylsakkaridet er valgt fra gruppen som består maltooligosakkarid, partiell stivelseshydrolysat, flytendegjort stivelse, gelatinisert stivelse, oppløseliggjort stivelse og blandinger derav.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at det sakkaridoverførende enzym blir anvendt i en mengde som fullstendiggjør reaksjonen innen 3-80 timer.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at konsentrasjonen av L-askorbinsyren er minst 1 vekt%.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at krystallisasjonstrinnet blir utført i nærvær av et såkrystall.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at mengden av nevnte såkrystall er 0,1 - 10 vekt%.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at graden av overmettethet i oppløsningen er 1,05 - 1,5.

10. Anvendelse av et krystallinsk 2-O-a-D-glukopyranosy1-L-askorbinsyre som angitt i krav 1 som bestandel i et næringsmid-del.

11. Anvendelse som angitt i krav 10 hvori innholdet av 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre er minst 0,001 vekt%.

12. Anvendelse som angitt i krav 10 hvori 2-O-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyren er fremstilt ved fremgangsmåten angitt i krav 2.

13. Anvendelse som angitt i krav 10 hvori 2-O-a-D-glukopy-ranosy1-L-askorbinsyren blir innbefattet i nevnte næringsmidler sammen med en forbindelse valgt fra gruppen som består av vitamin E, vitamin P og blandinger derav.

14. Anvendelse som angitt i krav 10 hvori den krystallinske 2-0-a-D-glukopyranosyl-L-askorbinsyre blir innbefattet i næringsmiddelet intakt eller etter oppløsning.