MXPA05010571A - Delta-4-desaturasas a partir de euglena gracilis, que expresan plantas y aceites que comprenden pufa - Google Patents

Abstract

La invencion se relaciona a un metodo mejorado para la produccion especifica de acidos (-3-grasos insaturados y a un metodo para producir trigliceridos, que contiene un numero incrementado de acidos grasos insaturados, especificamente acidos (-3-grasos que comprenden mas de tres dobles uniones. Se describe la produccion de un organismo transgenico, de preferencia una planta transgenica, o un microorganismo transgenico, que contiene un numero incrementado de acidos grasos, aceites o lipidos que comprenden dobles uniones (-4 como un resultado de la (-4-desaturasa que se expresa de Euglena gracilis. La invencion se relaciona ademas a casetes de expresion que contienen una secuencia del acido nucleico, un vector, y organismos que contienen al menos una secuencia de acido nucleico o un casete de expresion. Se describen tambien acidos grasos insaturados y trigliceridos que tienen un contenido de acido graso incrementado y el uso de los mismos. Los acidos grasos y los trigliceridos se utilizan en una pluralidad de aplicacion en la industria alimenticia, en nutricion para animales, cosmeticos, y farmaceuticos y son adecuados para muchas aplicaciones diferentes, dependiendo de si se utilizan acidos grasos saturados o insaturados o trigliceridos que tienen un acido graso saturado o insaturado incrementado.

Description

?-4-DESATURASAS A PARTIR DE EUGLEHA GRACILIS, QUE EXPRESAN PLANTAS Y ACEITES QUE COMPRENDEN PUFA La presente invención se relaciona a un proceso mejorado para la preparación especifica de ácidos grasos co-3 insaturados, y a un proceso para - preparar triglicéridos que tiene un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados, particularmente de ácidos grasos ?-3 que tiene más de tres dobles enlaces . La invención se relaciona a la preparación de un organismo transgénico, de preferencia una planta transgénica o un microorganismo transgénico, que tiene un contenido incrementado de ácidos grasos, aceites o lipidos que tienen dobles enlaces ?-4 que se deben a la expresión de una ?-4-desaturasa a partir de Euglena gracilis. La invención se relaciona adicionalmente a los casetes de expresión que comprenden una secuencia de ácido nucleico, un vector y organismos que comprenden al menos una secuencia de ácido nucleico o un cásete de expresión. La invención se relaciona adicionalmente a ácidos grasos insaturados y a triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados y al uso de los mismos . Los ácidos grasos y los triglicéridos tienen un gran número de usos en la industria alimenticia, en la nutrición de animales, en cosméticos y en el sector de los fármacos. Estos son adecuados para una amplia variedad de usos dependiendo de si ellos son ácidos grasos saturados o insaturados libres o triglicéridos que tiene un contenido incrementado de ácidos grasos saturados o insaturados. Los ácidos grasos ?-3 de cadena larga poliinsaturados tales como ácido eicosapentanoico (EPA) o ácido docosahexaenoico (DPA) son componentes importantes de la dieta humana debido a sus diversos papeles en la salud, que comprenden aspectos tales como el desarrollo del cerebro en los niños, la funcionalidad de los ojos, la síntesis de las hormonas y otras sustancias de señales, y la prevención de padecimientos cardiovasculares, cáncer y diabetes (Poulos, A Lipids 30:1-14, 1995; Horrocks, LA y Yeo YK Pharmacol Res 40:211-225, 1999). Existe por esta razón una demanda para la producción de ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados. De este modo, por ejemplo, los ácidos grasos poliinsaturados se agregan a los alimentos para lactantes para incrementar el valor nutricional, y para el desarrollo sin impedimentos del bebé. Los diversos ácidos grasos y los triglicéridos se obtienen principalmente a partir de microorganismos tales como Mortierella o de plantas que producen aceite tales como soya, colza de oleaginosa, girasol y otros, en cuyos casos resultan usualmente en la forma de sus triacilglicéridos . Sin embargo, no hay ácidos grasos insaturados de cadena larga en plantas superiores. Los ácidos grasos de cadena larga se derivan principalmente de aceite de pescado y de la fermentación de algas apropiadas (por ejemplo Thraustochytrium) u hongos (por ejemplo Mortierella. ) Los ácidos grasos libres se preparan ventajosamente por hidrólisis . Se prefieren aceites -que tienen ácidos grasos saturados o insaturados, dependiendo del propósito de uso, y de este modo, por ejemplo, los lipidos que tienen ácidos grasos insaturados, específicamente ácidos grasos poliinsaturados, se prefieren en la dieta humana, debido a que tienen un efecto benéfico en el nivel de colesterol en la sangre y por lo tanto en la posibilidad de cardiopatias . Estos se utilizan en diversos alimentos dietéticos o medicamentos . Debido a sus propiedades benéficas, no ha habido en el pasado la falta de intentos para realizar genes disponibles implicados en la síntesis de los ácidos grasos o triglicéridos para producir aceites en diversos organismos que tienen un contenido alterado de ácidos grasos insaturados. De este modo, la WO 91/13972 y su equivalente Norteamericana describe una ?-9-desaturasa . La WO 93/11245 reclama una delta-15-desaturasa y la WO 94/11516 reclama una ?-12-desaturasa . Las desaturasas adicionales se describen por ejemplo en la EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al., J.

Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200-203 o Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659. La caracterización bioquímica de las diversas desaturasas han sido sin embargo fechadas únicamente de manera adecuada debido a que las enzimas pueden, como proteínas de unión de membrana, aislarse y caracterizarse solo con mayor dificultad (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792). Las desaturasas de unión de membrana se caracterizan usualmente por la introducción dentro de un organismo adecuado el cual se investiga subsecuentemente por la actividad enzimática a través del precursor y el análisis del producto. Las ?-6- Desaturasas se describen en WO 93/06712, US 5,614,393, US 5614393, WO 96/21022, WO 0021557 y WO 99/27111, y también el uso para la producción en organismos transgénicos se describe como en la WO 9846763, WO 9846764, WO 9846765. También descritos y reclamados en esta conexión es la expresión de diversas desaturasas, como en la WO 9964616 o WO 9846776 y la formación de ácidos grasos poliinsaturados . Diversas rutas sintéticas se sugieren para la síntesis del ácido docosahexaenoico (DHA) (Figura 1) . De este modo, el DHA se produce en bacterias marinas tales como Vibrio sp., o Shewanella sp., por la ruta poliquétida (Yu, R. et al. Lipids 36:1061-1064, 2000; Takeyama, H. Et al. Microbiology 143:2725-2731, 1197)).

Una estrategia alternativa prosigue a través de la actividad alternante de las desaturasas y elongasas (Zank, T.K. et al. Plant Journal 31:255-268, 2002; Sakuradani, E. et al. Gene 238:445-453, 1999). La última etapa en este caso es la introducción de la doble unión en la posición C4-C5 por una A4-desaturasa . Se ha demostrado en esta conexión por Sprecher et al. (Voss, A. et al., Journal of Biological Chemistry 266:19995-20000, 1991) que el DHA puede sintetizarse también independientemente de una ?-4-desaturasa en hígados de ratas. Sin embargo, la asi llamada ruta sintética Sprecher (véase la Figura 1) es inadecuada para la producción en plantas y microorganismos, debido a que los mecanismos reguladores que subyacen la a-oxidación son desconocidos . Se han descrito diversas ?-4-desaturasas en WO 200226946 y WO 2002090493. Con respecto a la eficiencia de la expresión de las desaturasas y su influencia en la formación de ácidos grasos poliinsaturados, se debe observar que únicamente contenidos pequeños de ácidos grasos delta-4-insaturados/lipidos han sido conseguidos a través de la expresión de la desaturasa correspondiente como se describe a la fecha (véase en lo anterior) . Además, ninguna especificidad para la posición sn-2, la cual es importante en términos de fisiología nutricional, en glicerolípidos se describe para las enzimas anteriormente mencionadas (Hunter, JE, Lipids 36(7) .-655-668, 2001). De este modo, existe una gran necesidad para nuevos y mejores genes adecuados, los cuales codifican para enzimas que están implicadas en la biosíntesis de los ácidos grasos insaturados y hace esto posible para producir ciertos ácidos grasos específicamente en una escala industrial sin que se formen subproductos no deseados. Dos características en particular son especialmente importantes en la selección de genes de biosíntesis. En primer lugar, existe todavía una necesidad para procesos mejorados para obtener contenidos máximos de ácidos grasos poliinsaturados. En segundo lugar, las enzimas empleadas deben ser altamente específicas para un sustrato particular, debido a que los subproductos idealmente no indeseados que tiene posiblemente efectos adversos o hasta el momento pueden originarse efectos fisiológicos no investigados en uso nutricional. A fin de hacer esto posible para enriquecer el alimento humano y el alimento para animales con los ácidos poliinsaturados específicamente preparados, existe de este modo una gran necesidad para un proceso simple, de costo efectivo para producir estos ácidos grasos poliinsaturados con la ayuda de enzimas que son tan específicas como es posible y están implicadas en la biosíntesis del ácido graso. Por lo tanto, el objeto fue aislar ácidos nucleicos novedosos, los cuales están implicados tan específicamente como es posible en la síntesis de estos ácidos grasos poliinsaturados para la producción de ácidos grasos poliinsaturados en un organismo, ventajosamente en un organismo eucariótico, de preferencia en una planta. Este objeto se ha logrado por las secuencias de ácido nucleico aisladas inventivas, las cuales codifican para los polipéptidos que tienen la actividad ?-4-desaturasa seleccionada a partir del grupo: a) de una secuencia de ácido nucleico que tiene la secuencia descrita en la SEC. DE IDENT. NO. : 1, b) las secuencias del ácido nucleico que, como un resultado de la degeneración del código genético, pueden derivarse de la secuencia de codificación comprendida en la SEC. DE IDENT. NO. : 1, o c) los derivados de la secuencia del ácido nucleico descritos en la SEC. DE IDENT. NO. : 1, los cuales codifican para polipéptidos que tiene la secuencia de aminoácido descritas en la SEC. DE IDENT. NO. : 2 y tienen al menos 40% de homología en el nivel de aminoácido con la SEC. DE IDENT. NO. : 2 y tienen una actividad ?-4-desaturasa. Se ha encontrado sorprendentemente que una ?-4-desaturasa de Euglena gracilis es particularmente específica para la conversión del ácido docopentanoico (DPA) en el ácido docohexaenoico (DHA) cuando se expresan en un sistema heterólogo. De este modo, es posible producir ácido docosahexaenoico en plantas o microorganismos, en cuyo caso la especificidad de la enzima encontrada reduce en gran medida la producción de subproductos no deseados. Además, la doble unión en la posición C4-C5 del ácido graso se introduce únicamente cuando una doble unión ya está presente en la posición C7-C8. La enzima encontrada puede de este modo utilizarse no solamente para la síntesis DHA a partir de DPA, sino también para la síntesis de los ácidos grasos específicos que ocurren en la naturaleza a solamente una extensión limitada o en absoluto. Ejemplos de tales ácidos grasos son 16:2 ?4, ?7 ó 16:3 ?4, ?7, ???, ?13. Esto distingue la ?-4-desaturasa encontrada, además de la especificidad y la actividad mejoradas, venta osamente las enzimas de la técnica anterior. Ya que los genes ?-4-desaturasa previamente descritos tiene solamente actividad y especificidad bajas, un objeto adicional de la invención se encontró por lo tanto para introducir la enzima desaturasa específica para la síntesis de los ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados dentro de las semillas de las oleaginosas y para evitar la producción de subproductos indeseados. Este objeto se ha logrado clonando el ácido nucleico descrito anteriormente. La ?-4-desaturasa encontrada difiere de las ?4-desaturasas previamente descritas por el nucleótido sustancialmente diferente y las secuencias de aminoácido. La secuencia Euglena muestra únicamente 35% de similaridad en el nivel del aminoácido a la secuencia de Thraustochytrium ( O 200226946) . La Figura 2 muestra una comparación de secuencia de la secuencia de Euglena encontrada con la secuencia de Thraustochytrium, y la Figura 3 - muestra la alineación del GAP. El término "?-4-desaturasa" para los propósitos de la invención comprende proteínas que participan en la desaturación de los ácidos grasos, ventajosamente de ácidos grasos que tiene una doble unión en la posición 7 de la cadena de ácido graso, y sus homólogos, derivados o análogos. En una modalidad adicional, los derivados de la molécula del ácido nucleico inventiva representados en la SEC. DE IDENT. NO. : 1 codifican proteínas que tienen al menos 40%, ventajosamente alrededor de 50 a 60%, de preferencia al menos aproximadamente 60 a 70% y más preferiblemente al menos aproximadamente 70 a 80%, 80 a 90%, 90 a 95% y más preferiblemente al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más homología (= identidad) a la secuencia de aminoácido completa de la SEC. DE IDENT. NO. : 2. Se calculó la homología sobre la región de la secuencia del aminoácido completo o el ácido nucleico. El programa Pile UP (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) o el programa Gap and BestFit [Needleraan y Wunsch (J. Mol. Biol 48; 443-453 (1970) y Smith y aterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)], que está comprendida en el paquete de software GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)], se utilizó para las comparaciones de secuencia. Las homologías de secuencia indicadas en porcentaje anteriormente, se encontraron con el programa BestFit sobre la región de secuencia completa, utilizando las siguientes propiedades: Peso de Abertura: 8, Peso de Longitud: 2. La invención comprende adicionalmente moléculas de ácido nucleico las cuales difieren de una de las secuencias de nucleótido mostradas en la SEC. DE IDENT. NO. : 1 (y partes de la misma) en la base de la degeneración del código genético, y de este modo codifica la misma ?-4-desaturasa como aquella codificada por la secuencia de nucleótido mostrada en la SEC. DE IDENT. NO. : 1. Además de la secuencia del nucleótido ?-4-desaturasa mostrada en la SEC. DE IDENT. NO. : 1, el técnico experimentado se da cuenta que los polimorfismos de secuencia de ADN los cuales conducen a alteraciones en las secuencias de aminoácido de la ?-4-desaturasa que pueden existir dentro de una población. Estos polimorfismos genéticos en el gen ?-4-desaturasa pueden existir entre individuos dentro de una población debido a una variación natural. Estas variantes naturales producen normalmente una variación desde 1 a 5% en la secuencia de nucleótido del gen ?-4-desaturasa . Cada una y todas de estas variaciones de nucleótido y los polimorfismos de aminoácido, que resultan de los mismos, en la ?-4- desaturasa, que son el resultado de la variación natural y no alteran la actividad funcional de la ?-4-desaturasa estarán comprendidas dentro del alcance de la presente invención. Los ácidos grasos poliinsaturados (PUTAS) significan más adelante ácidos grasos di-insaturados o poliinsaturados que tiene dobles enlaces. Los dobles enlaces pueden conjugarse o no conjugarse. La enzima ?-4-desaturasa inventiva introduce ventajosamente una doble unión cis en la posición C4-C5 en residuos de ácidos grasos de los glicerolipidos (véase la SEC. DE IDENT. NO. : 1 y la NO: 2). La enzima tiene adicíonalmente una actividad de ?-4-desaturasa que introduce ventajosamente de manera exclusiva una doble unión cis en la posición C4-C5 en los residuos del ácido graso de los glicerolipidos. La enzima tiene la secuencia especificada en la SEC. DE IDENT. NO. : 1 y la NO: 2 tiene también esta actividad. Las secuencias descritas en la SEC. DE IDENT. NO. : 1 y NO: 2 comprenden una ?-4-desaturasa monofuncional . La secuencia del ácido nucleico inventiva (o fragmentos de la misma) pueden ventajosamente utilizarse para aislar las secuencias genómicas adicionales por selección de homología .

Tales derivados pueden aislarse por ejemplo, de otros organismos eucarióticos, tales como plantas, tales como específicamente musgos, dinoflagelatos u hongos. Las variantes alélicas comprenden en particular variantes funcionales obtenibles por la eliminación, la inserción o la sustitución de nucleótidos a partir de la secuencia descrita en la SEC. DE IDENT. NO.: 1, con la actividad enzimática de las proteínas sintetizadas derivadas que se retienen. Tales secuencias de ADN pueden aislarse a partir de la secuencia del ADN descrita en la SEC. DE IDENT. NO. : 1, o partes de estas secuencias, por ejemplo, utilizando métodos de hibridización convencionales o la técnica PCR, a partir de otros eucariotes tales como, por ejemplo, aquellos mencionados anteriormente. Estas secuencias de ADN hibridizan bajo condiciones estándares con las secuencias mencionadas. Es ventajoso utilizar para la hibridización oligonucleótidos cortos, por ejemplo de las regiones conservadas, que pueden encontrarse por comparaciones con otros genes desaturasa en una manera conocida por el técnico experimentado. Las secuencias de caja de histidina se utilizan ventajosamente. Sin embargo, es también posible utilizar fragmentos más largos de los ácidos nucleicos inventivos o las secuencias completas para la hibridización. Estas condiciones estándares varían dependiendo del ácido nucleico utilizado: el oligonucleótido, el fragmentos más largo o la secuencia completa o dependiendo de qué tipo de ADN o ARN de ácido nucleico se utilizan para la hibridización. De este modo, por ejemplo, las temperaturas de fusión para los híbridos ADN:ADN son aproximadamente 10°C más bajos que aquellos de los híbridos ADN: ARN de la misma longitud. Las condiciones estándares promedian por ejemplo, dependiendo de las temperaturas del ácido nucleico entre 42 y 58 °C en una solución de tampón acuoso con una concentración de entre 0.1 a 5 x SSC (1 X SSC = 0.15 M de NaCl, 15 mM de citrato de sodio, pH 7.2) o adicionalmente en la presencia de 50% de formamida tal como por ejemplo, 42°C en 5 x SSC, 50% de formamida. Las condiciones de hibridización para los híbridos ADN:ADN están ventajosamente a 0..1 x SSC y temperaturas entre aproximadamente 20°C a 45°C, de preferencia entre aproximadamente 30°C a 45°C. Las condiciones de hibridización para los híbridos ADN:ARN están ventajosamente a 0.1 x SSC y temperaturas entre aproximadamente 30 °C a 55 °C, de preferencia entre aproximadamente 45°C a 55°C. Estas temperaturas establecidas para la hibridización son temperaturas de fusión calculadas a modo de ejemplo para un ácido nucleico que tiene una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos y un contenido G + C de 50% en la ausencia de la formamida. Las condiciones experimentales para la hibridización del AD se describen en los libros de texto relevantes de genética tales como por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, y pueden calcularse por las fórmulas conocidas por el técnico experimentado, por ejemplo, dependiendo de la longitud de los ácidos nucleicos, la naturaleza de los híbridos o el contenido de G + C. Información adicional en la hibridización puede encontrarse en los siguientes libros de texto: Ausubel et al. (eds.), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Aproach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed) , 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford. Los derivados significan adicionalmente homólogos de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 1, por ejemplo homólogos eucarióticos, secuencias truncadas, ADN de una sola hebra de la secuencia de ADN de codificación y sin codificación o ARN de la secuencia de ADN de codificación y sin codificación. Los homólogos de la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 1 significan adicionalmente derivados tales como por ejemplo, variantes promotoras . Estas variantes pueden modificarse por uno o más intercambiadores de nucleótido, por la o las inserciones y/o la o las eliminaciones, pero sin la funcionalidad o actividad de los promotores que se afectan.

Es posible adicionalmente para los promotores tener su actividad incrementada por la modificación de su secuencia o remplazarse completamente por más promotores activos, incluso desde los organismos heterólogos. Los derivados también significan ventajosamente variantes cuya secuencia de nucleótido en la región desde -1 a -2000 en frente del codón de inicio ha sido modificada de tal modo que la expresión genética y/o expresión de la proteina se altera, de preferencia se incrementa. Además, los derivados significan también variantes que han sido modificadas en el extremo 3' . Los derivados también significan los ñDN antisentido que pueden utilizarse para inhibir la biosintesis de las proteínas inventivas. Estos ADN anti-sentido están entre los derivados no funcionales inventivos tales como derivados que no tiene actividad enzimática. Los métodos adicionales conocidos por el técnico experimentado para preparar derivados no funcionales son los así llamados co-supresión, el uso de ribozimas e intrones. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas que tiene actividad ribonucleasa que son capaces de cortar los ácidos nucleicos de una sola hebra tales como ARNm, a los cuales muestran una complementariedad. De este modo, es posible para las transcripciones de ARNm desdoblarse catalíticamente con la ayuda de esta ribozima (Haselhoff y Gerlach, Nature, 334, 1988: 585-591), y de este modo la traducción de este ARNm se suprime. Tales ribozimas pueden diseñarse específicamente para sus tareas (US 4,987,071; US 5,116,742 y Bartel et al., Science 261, 1993; 1411-1418) . De este modo es posible con la ayuda del ADN anti-sentido producir ácidos grasos, lípidos o aceites que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos saturados. La secuencia del ácido nucleico inventiva la cual codifica para la ?-4-desaturasa puede prepararse sintéticamente u obtenerse de manera natural, o comprende una mezcla de los constituyentes del ADN sintéticos y naturales, y consiste de diversos segmentos del gen ?-4-desaturasa heterólogos a partir de diversos organismos. En general, las secuencias de nucleótidos sintéticas se producen utilizando codones que se prefieren por los organismos huéspedes correspondientes, por ejemplo, las plantas. Esto conduce usualmente a la expresión óptima de los genes heterólogos. Estos codones preferidos por las plantas pueden determinarse a partir de codones con la frecuencia de proteína más elevada las cuales expresan en la mayoría de las especies de plantas de interés. Un ejemplo para Corynebacterium glutamicum se da en: Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). La ejecución de tales experimentos puede llevarse a cabo con la ayuda de métodos estándares y se conoce por la persona experta en la técnica. Las secuencias funcionalmente equivalentes que codifican para el gen ?-4-desaturasa son aquellas derivadas de la secuencia inventiva que, a pesar de una secuencia de nucleótido divergente, tiene todavía las funciones deseadas, es decir la actividad enzimática en la selectividad especifica de las proteínas. Los equivalentes funcionales comprenden de este modo variantes de origen natural de las secuencias descritas en la presente, y artificiales, por ejemplo obtenidas por síntesis química, secuencias de nucleótido artificiales adaptadas al uso del codón de una planta . Las secuencias de ADN artificiales son adicionalmente adecuadas siempre y cuando les atribuyan, como se describe anteriormente, la propiedad deseada, por ejemplo al incrementar el contenido de dobles enlaces ?-4 en ácidos grasos, aceites o lipidos en la planta por la sobreexpresion del gen ?-4-desaturasa en las plantas cultivadas. Tal secuencia de ADN artificial puede, por ejemplo a través de la retrotraducción por medio de modelado molecular de las proteínas construidas, tener la actividad ?-4-desaturasa o se encuentran por selección in vitro. Las técnicas posibles para la evolución in vitro del ADN para modificar o mejorar las secuencias de ADN se describen en Patten, P.A. et al., Current Opinión in Biotechnology 8, 724-733 (1997) o en Moore, J.C. et al., Journal of Molecular Biology 272, 336-347 (1997) . Las secuencias del ADN de codificación obtenidas por la retrotraducción de una secuencia de polipéptido de acuerdo con el uso del codón especifico para la planta huésped son particularmente adecuadas. El uso del codón específico puede encontrarse fácilmente por un técnico experimentado familiarizado con los métodos en la genética de las plantas por análisis de computadora de otros genes conocidos de la planta que se transforma. Las secuencias que deben mencionarse como secuencias de ácido nucleico equivalentes adecuadas adicionales son aquellas que codifican para proteínas de fusión, en donde un polipéptido ?-4-desaturasa o una parte funcionalmente equivalente del mismo es un constituyente de la proteína de fusión. La segunda parte de la proteína de fusión puede ser por ejemplo un polipéptido adicional que tiene actividad enzimática o una secuencia de polipéptido antigénica con la ayuda de la cual es posible detectar la expresión de ?-4-desaturasa (por ejemplo, myc-tac o his-tag) . Sin embargo, es preferiblemente una secuencia de proteina regulator.ia, por ejemplo una secuencia de señal para el ER, que guía la proteína ?-4-desaturasa al sitio deseado de acción . Las secuencias del ácido nucleico aisladas, inventivas se derivan ventajosamente de una planta tal como una planta monocotiledónea o dicotiledónea. Las secuencias de ácido nucleico se derivan de preferencia de la clase de Euglenophyceae tal como las órdenes Eutreptxales, Euglenales, Rhabdomonadales, Sphenomonadales, Heteronematales o Euglenamorphales, particularmente de manera ventajosa las secuencias se derivan del género y especie Euglena gracilis, Astasia longa, Khawkinea quartana, Pnacus smulkowskianus, leopocinclis ovum, Lepocinclis .ovata, Eutreptia viridis, Distigma proteus, Distigma curvatum, Rhabdomonas intermedia, Rhabdomonas giba, Rhabdomonas spiralis, Gyropaigne lefevrei, Rhabdomonas incurva, Peranema trichopfiorum o Petalomonas cantuscygni, muy particulamente de manera ventajosa éstas se derivan de Euglena gracilis. Es posible y ventajoso para los genes ?-4-desaturasa combinarse en el proceso inventivo con genes adicionales de biosintesis de ácido graso. Ejemplos de tales genes son aciltransferasas, desaturasas o elongasas adicionales. La combinación con, por ejemplo, (NADH-citocroma B5 reductasas capaces de extraer o liberar los equivalentes de reducción es ventajoso para sííitesis in vivo y específicamente in vitro. Las secuencias de aminoácidos inventivas significan proteínas que comprenden una secuencia de aminoácido descrita en la secuencia SEC. DE IDENT. NO.: 2, o una secuencia obtenible de la misma por sustitución, inversión, inserción o eliminación de uno o más residuos de aminoácido, con la retención de, o una reducción insignificante en las actividades enzimáticas de la proteina descrita en la SEC. DE IDENT. NO.: 2. La reducción insignificante significa todas las enzimas que tiene todavía al menos 10%, de preferencia 20%, particularmente de preferencia 30% de la actividad enzimática de la enzima inicial. Es posible en esta conexión por ejemplo para ciertos aminoácidos remplazarse por aquellos que tienen propiedades fisicoquímicas similares (en volumen, alcalinidad, propiedad hidrofóbica, etc) . Por ejemplo, los residuos de arginina se remplazan por los residuos de lisina, los residuos de valina por los residuos de isoleucina o los residuos de ácido aspártico por los residuos de ácido glutámico. Sin embargo, es también posible para uno o más aminoácidos transponerse en su secuencia, agregarse o eliminarse, o es posible para una pluralidad de estas mediciones combinarse juntos. Los derivados también significan equivalentes funcionales los cuales comprenden en particular también, mutaciones naturales o artificiales de una secuencia originalmente aislada que codifica para la ?-4-desaturasa, la cual muestra todavía la función deseada, es decir, su actividad enzimática y su selectividad del sustrato se reduce en forma insignificante. tas mutaciones comprenden sustituciones, adiciones, eliminaciones, transposiciones o inserciones de uno o más residuos del nucleótido. De este modo, por ejemplo, la presente invención comprende también aquellas secuencias de nucleótido que se obtienen por la modificación de la secuencia de nucleótido ?-4-desaturasa . El propósito de tal modificación puede ser por ejemplo la localización adicional de la secuencia de codificación comprendida en la presente o, por ejemplo, también la inserción de sitios de desdoblamiento de enzima de restricción adicional. Los equivalentes funcionales son también variantes cuya función, en comparación con el gen inicial o el fragmento genético, se atenúan (= reducidos en forma insignificante) o se mejora (= actividad enzimática mayor que la actividad de la enzima inicial, es decir la actividad es más elevada del 100%, de preferencia más elevada que 110% en particularmente de preferencia más elevada que 130%) . La secuencia de ácido nucleico puede además ser ventajosamente por ejemplo una secuencia de ADN o de ADNc. Las secuencias de codificación adecuadas para la inserción en un cásete de expresión inventivo son por ejemplo aquellas que codifican para una ?-4-desaturasa que tiene la secuencias descritas anteriormente y que confieren al huésped la capacidad para sobreproducir ácidos grasos., aceites o lipidos que tienen dobles enlaces en la posición ?-4, especialmente en el caso en donde los ácidos grasos ?3 que tiene al menos cuatro dobles enlaces se producen. Estas secuencias pueden ser de origen homólogo o heterólogo.

El cásete de expresión inventivo (= construcción o fragmento del ácido nucleico) significa la secuencia especificada en la SEC. DE IDENT. NO. : 1 la cual como un resultado del código genético y/o sus derivados funcionales o no funcionales que se han enlazado funcionalmente a una o más señales reguladoras ventajosamente para incrementar la expresión genética, y que controlan la expresión de la secuencia de codificación en la célula huésped. Estas secuencias reguladoras se pretenden para realizar la expresión objetivo de los genes y de la expresión de proteina posible. Esto puede significar por ejemplo dependiendo del organismo huésped que el gen se expresa y/o sobreexpresa únicamente después de la inducción, o que se expresa y/o sobreexpresa inmediatamente. Por ejemplo, estas secuencias reguladoras son secuencias a las cuales los inductores o represores se unen y de este modo regulan la expresión del ácido nucleico. Además de esta secuencia reguladora novedosa o en lugar de esas secuencias, es posible para la regulación natural de estas secuencias aún presentarse en frente de los genes estructurales actuales y, cuando es apropiado, haber sido modificadas genéticamente de manera que la regulación natural ha sido desviada y la expresión de los genes ha sido incrementada. La construcción genética puede, sin embargo tener también una estructura más simple, que significa que ninguna de las señales reguladoras adicionales ha sido insertada en frente de la secuencia de ácido nucleico o sus derivados, y el promotor natural con su regulación no ha sido eliminado. En su lugar, la secuencia reguladora natural ha sido mutada de tal modo que la regulación ya no toma lugar y/o la expresión genética se incrementa. Estos promotores modificados pueden también agregarse en la forma de secuencias parciales (= promotor con partes de las secuencias del ácido nucleico inventivas) también sólo en frente del gen natural para incrementar la actividad. La construcción genética puede comprender adicionalmente de manera ventajosa también una o más asi llamadas secuencias mejoradoras enlazadas funcionalmente al promotor, el cual realiza la expresión incrementada de la secuencia de ácido nucleico posible. Es también posible insertar frecuencias ventajosas adicionales en el extremo 3' de las secuencias del ADN, tales como los elementos reguladores adicionales o terminadores . El gen ?-4-desaturasa puede presentarse en una o más copias en el cásete de expresión (= construcción genética) . Las secuencias reguladoras o factores pueden además, como se describe anteriormente tener ventajosamente una influencia positiva en, y de este modo incrementar, la expresión genética de los genes insertados. De este modo, una mejora de los elementos reguladores puede tener lugar ventajosamente en el nivel de trascripción utilizando señales de trascripción fuertes tales como promotores y/o raej oradores . Sin embargo, es también posible además de mejorar la traducción por, por ejemplo mejorando la estabilidad del ARNm. Los promotores adecuados en el cásete de expresión son en principio, todos los promotores capaces de controlar la expresión de los genes extraños en los organismos, ventajosamente en plantas u hongos. Es ventajoso utilizar en particular, unos promotores de plantas o promotores derivados de un virus de planta. Las secuencias reguladoras ventajosas para el proceso inventivo se presentan por ejemplo en promotores tales como eos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq~, T7, T5, T3, gal, tre, ara, SP6, ?-?? o en el promotor ?-??,, que se utilizan ventajosamente en bacterias gram-negatiyas . Secuencias reguladoras ventajosas adicionales se presentan por ejemplo en los promotores gram-positivos amy y SP02, en los promotores de levadura u hongos ADC1, MFar AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH o en los promotores de planta tales como CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], SSU, OCS, lib4, STLS1, B33, nos (= promotor de la nopalina sintasa) o en el promotor de ubiquitina. El cásete de expresión puede comprender también un promotor químicamente inducible a través del cual la expresión del gen ?-4-desaturasa exógeno en los organismos, ventajosamente en las plantas, puede controlarse en un tiempo particular. Ejemplos de tales promotores de plantas ventajosos sos el promotor P P1 [Ward et al., Plarxt. Mol. Biol. 22 (1993) , 361- 366] , un promotor inducible de bencensulfonamida (EP 388186) , uno inducible de tetraciclina (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), un promotor inducible del ácido salicilico (WO 95/19443) , un promotor inducible del ácido abscisico (EP 335528) y uno inducible de etanol o ciclohexanona (WO 93/21334) . Los promotores de plantas adicionales son por ejemplo, el promotor de FPBase citosólico de papa, el promotor ST-LS1 de papa (Stock aus et al., E BO J. 8 (1989) 2445-245) , el promotor de fosforibosilpirofosfato amidotransferasa de Glicina máxima (véase también Número de Acceso Genbank U87999) o un promotor especifico de nodulo como en EP 249676 pueden utilizarse ventajosamente. Los promotores de plantas ventajosos son en particular aquellos que aseguran la expresión en los tejidos o partes/órganos de las plantas en cuya biosíntesis del ácido graso o precursores de los mismos tienen lugar, tales como por ejemplo, en el endosperma o en el embrión en desarrollo. Se debe hacer mención particular de los promotores ventajosos que aseguran la expresión específica de las semillas, tales como por ejemplo, el promotor USP o derivados de los mismos, el promotor LEB4, el promotor de faseolina o el promotor napin. El promotor USP, el cual se menciona de acuerdo con la invención y es particularmente ventajoso, o sus derivados median la expresión genética muy temprano durante el desarrollo de la semilla (Baeumlein et al.. Mol Gen Genet, 1991, 225 (3) : 459-67) . Los promotores específicos de semillas ventajosos, adicionales, los cuales pueden utilizarse para plantas monocotiledoneas y dicotiledóneas son los promotores adecuados para dicotiledones, tales como los mencionados así mismo a modo de ejemplo, el promotor genético napin de colza de oleaginosa (US 5,608,152), el promotor de oleosina de Arabidopsis ( O 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), el promotor de brassica Bce4 (WO 91/13980) o el promotor de legumina B4 (LeB4 , Baeumlein et al., Plant J. , 2, 2, 1992: 233 - 239) o los promotores adecuados para los monocotiledones tales como los promotores, los promotores del gen de cebada lpt2 o lptl (WO 95/15389 y WO 95/23230) o los promotores del gen de hordeina de cebada, del gen de glutelina de arroz, del gen de orizina de arroz, del gen de prolartiina de arroz, del gen de gliadina de trigo, del gen de glutelina de trigo, del gen de zeína de maíz, del gen de glutelina de avena, del gen de casirina de sorgo o del gen de secalina de centeno, que se describen en WO 99/16890. Además, los promotores particularmente preferidos son aquellos que aseguran la expresión en los tejidos o partes de las plantas en donde, por ejemplo, tiene lugar la biosíntesis de los ácidos grasos, aceites y lipidos o sus precursores. Se debe hacer mención particular de los 21 promotores que aseguren la expresión especifica de la semilla. Se debe hacer mención del promotor del gen napin de colza de oleaginosa (US 5,608,152), del promotor USP de Vicia faba (USP = proteina de semilla desconocida, Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991,, 225 (3): 459-67), del gen de oleosina de Arabidopsis (WO 98/45461), del promotor de faseolina (US 5,504,200) o del promotor del gen B4 de legumina (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2(2): 233-9) . Se debe hacer mención adicional de los promotores como aquel del gen de cebada lpt2 o lptl (WO 95/15389 y WO 95/23230), que median la expresión especifica de la semilla en las plantas monocotiledóneas. El cásete de expresión (= construcción genética, construcción del ácido nucleico) puede, como se describe anteriormente, comprender también genes adicionales que van a introducirse dentro de los organismos. Estos genes pueden separarse bajo regulación o bajo la misma región regaladora como el gen ?-4-desaturasa. Estos genes son por ejemplo, genes de biosintesis adicionales, ventajosamente de la biosintesis del ácido graso tal como los genes de biosintesis del ácido graso o el metabolismo de lipido, que hacen posible la síntesis incrementada, seleccionados a partir del grupo de la o las acil-CoA deshidrogenasas, la o las acil-ACP [= proteína portadora acilo] desaterasas, la o las acil-ACP tioesterasas , la o las aciltransferasas del ácido graso, la o las acil-CoA: lisofosfolípido aciltransferasas, la o las sintasas del ácido graso, la o las hidroxilasas del ácido graso, la o las acetil-coenzima A carboxilasas, la o las acil-coenzima A oxidasas, la o las desaturasas del ácido graso, las acetilenasas del ácido graso, las lipoxigenasas, triacilglicerol lipasas, óxido de aleño sintasas, hidroxiperóxido liasas o la o las elongasas del ácido graso. Ejemplos de las cuales pueden mencionarse con los genes para las ?-15-, ?-12-, ?-9, ?-6, ?-5-desaturasas, ß-cetoacil reductasas, ß-cetoacil sintasas, elongasas o las diversas hidroxilasas y acil-ACP tioesterasas . Es ventajoso utilizar genes desaturasa y elongasa en la construcción del ácido nucleico. Es particularmente ventajoso utilizar genes seleccionados del grupo de ?-4-desaturasa, ?-5-desaturasa, ?-6-desaturasa, ?-8-desaturasa, ?-9-desaturasa, ?-12-desaturasa, ?-5-elongasa, ?-6-elongasa o ?-9-elongasa en la construcción . Es también posible en principio utilizar todos los promotores naturales con sus secuencias reguladoras como aquellas mencionadas anteriormente para el cásete de expresión inventivo y el proceso inventivo como se describe posteriormente. Es posible adicionalmente y ventajoso utilizar promotores sintéticos. Es posible en la preparación de un cásete de expresión para manipular diversos fragmentos de ADN para obtener una secuencia de nucleótido la cual se lee convenientemente en la dirección correcta y la cual se equipa con un marco de lectura correcto. Los adaptadores o enlazadores pueden unirse a los fragmentos uniendo los fragmentos de ADN (= ácidos nucleicos inventivos) entre sí. Es convenientemente posible para las regiones promotoras y terminadoras proporcionarse en la dirección de trascripción con un enlazador o polienlazador el cual comprende uno o más sitios de restricción para la inserción de esta secuencia. El enlazador usualmente tiene desde 1 a 10, principalmente 1 a 8, de preferencia 2 a 6, sitios de restricción. El enlazador generalmente tiene un tamaño dentro de las regiones reguladoras de menos de 100 pb, frecuentemente menos de 60 pb, pero al menos 5 pb. El promotor puede ser tanto natural u homólogo como heterólogo al organismo huésped, por ejemplo a la planta huésped. El cásete de expresión comprende en la dirección de trascripción 5' -3' el promotor, una secuencia de ADN la cual codifica para un gen ?-4-desaturasa, y una región para la terminación de la trascripción. Diversas regiones de terminación son recíprocamente intercambiables como se desea. Una posibilidad adicional es emplear manipulaciones que proporcionan sitios de desdoblamiento de restricción apropiados o los cuales eliminan el ADN superfluo o los sitios de desdoblamiento de restricción. Donde las inserciones, eliminaciones o sustituciones tales como por ejemplo transiciones y transversiones que entran en consideración, es posible utilizar mutagénesis in vitro, reparación, restricción o ligación de cebador. En el caso de las manipulaciones adecuadas tales, como por ejemplo, restricción, masticación inmersa o relleno en salientes para extremos ásperos, es posible proporcionar extremos complementarios de los fragmentos para la ligación. Puede ser importante para la expresión elevada ventajosa ínter alia unir la señal de retención ER específica SE DEL (Schouten, A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781- 792) en que el nivel promedio de expresión se triplica o cuadruplica por consiguiente. Es también posible emplear otras señales de retención las cuales ocurren naturalmente en asociación con las proteínas de plantas y animales ubicadas en el ER para la construcción del cásete. Las señales de poliadenilación preferidas son señales de poliadenilación de plantas, de preferencia aquellas esencialmente que corresponden a señales de poliadenilación de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens, especialmente del gen 3 del ADN-T (octopina sintasa) del pTiACH5 plásmido Ti (Gielen et al., EMBO J.3 (1984), 835 ff) o equivalentes funcionales apropiados. Se prepara un cásete de expresión combinando un promotor adecuado a una secuencia de ADN ?-4-desaturasa y a una señal de poliadenilación por técnicas convencionales de recombinación y clonación como se describe por ejemplo en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), y en T.J. Silhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Susubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Bioiogy, Greene Publishing Assoc. y Wiley-Intescience (1987) . Es posible en la preparación de un cásete de expresión manipular diversos fragmentos de ADN para obtener una secuencia de nucleótido la cual se lee convenientemente en la dirección correcta y la cual se equipa con. un marco de lectura correcto. Los adaptadores o enlazadores pueden unirse a los fragmentos uniendo los fragmentos de ADN entre si. Es convenientemente posible para las regiones promotoras y terminadoras proporcionarse en la dirección de la trascripción con un enlazador o polienlazador el cual comprende uno o más sitios de restricción para la inserción de esta secuencia. El enlazador usualmente tiene desde 1 a 10, principalmente 1 a 8, de preferencia 2 a 6, sitios de restricción. El enlazador generalmente tiene un tamaño dentro de las regiones reguladoras de menos de 100 pb, frecuentemente menos de 60 pb, pero al menos 5 pb. El promotor puede ser tanto natural u homólogo y heterólogo al organismo huésped, por ejemplo a la planta huésped. El cásete de expresión comprende en la dirección de trascripción 5' -3' el promotor, una secuencia de ADN la cual codifica para un gen ?-4-desaturasa y una región para la terminación de la trascripción. Diversas regiones de terminación son reciprocamente intercambiables como se desea. Es posible en la preparación de un cásete de expresión manipular diversos fragmentos de ADN para obtener una secuencia de nucleótido la cual se lee convenientemente en la dirección correcta y la cual se equipa con un marco de lectura correcto. Los adaptadores o enlazadores pueden unirse a los fragmentos uniendo los fragmentos de ADN entre si. Es posible convenientemente para las regiones promotoras y terminadoras proporcionarse en la dirección de trascripción con un enlazador o polienlazador el cual comprende uno o más sitios de restricción para la inserción de esta secuencia. El enlazador usualmente tiene desde 1 a 10, principalmente 1 a 8, de preferencia 2 a 6, sitios de restricción. El enlazador generalmente tiene un tamaño dentro de las regiones reguladoras de menos de lOOpb, frecuentemente menos de 60 pb, pero al menos 5 pb. El promotor puede ser tanto natural u homólogo como heterólogo al organismo huésped, por ejemplo a la planta huésped. El cásete de expresión comprende en la dirección de trascripción 5' -3' el promotor, una secuencia de ADN que codifica para el gen ?-4- desaturasa, y una región para la terminación de la trascripción. Diversas regiones de terminación son reciprocamente intercambiables como se desea. Las secuencias de ADM que codifican para dos ?-4- desaturasas a partir de Euglena gracilis comprenden todas las características . de secuencias necesarias para lograr la localización correcta para el sitio del ácido graso, lípido o biosíntesis del aceite. Por esta razón, ninguna de las secuencias objetivo son necesarias per se. Sin embargo, tal localización puede ser deseable y ventajosa y por lo tanto puede modificarse artificialmente o mejorarse de manera que tales construcciones de fusión son también una modalidad ventajosa preferida de la invención. Las secuencias particularmente preferidas son aquellas que aseguran que el objetivo en los plástidos. El objetivo en otros compartimientos puede también en ciertas circunstancias ser deseable (referencia: Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423), por ejemplo dentro de la vacuola, dentro del mitocondrion, dentro del retículo endoplásmico (ER) , peroxisomas, cuerpos de lípidos o de otra manera debido a la ausencia de secuencias operativas correspondientes que permanecen en el compartimiento de producción, el citosol. Es ventajoso para las secuencias de ácido nucleico inventivas clonarse juntas con al menos un gen reportero dentro de un cásete de expresión el cual se introduce dentro del organismo a través de un vector o directamente dentro del genoma . Este gen reportero debe realizar la detectabilidad fácil a través de un crecimiento, fluorescencia, quimio- bioluminiscencia o ensayo de resistencia o a través de una medición fotométrica. Ejemplos de los cuales pueden mencionarse de los genes reporteros son genes resistentes a antibióticos o herbicidas, genes de hidrolasa, genes de proteina fluorescente, genes bioluminiscentes, genes de metabolismo de azúcar o nucleótido o genes de biosintesis tales como el gen Ura3, el gen Ilv2, el gen luciferasa, el gen a-galactosidasa, el gen gfp, el gen 2-desoxiglucosa-6-fosfato fosfatasa, el gen ß-glucuronidasa, el gen ß-lactamasa, el gen neomicin fosfotransferasa, el gen de higromicina fosfotransferasa o el gen BASTA (= resistencia al glufosinato) . Estos genes realizan fácil mensurabilidad y cuantificabilidad de la actividad de la transcripción, y de este modo de la expresión de los genes posibles. De este modo es posible identificar los sitios de los genomas que muestran diferencias en la productividad . En una modalidad preferida, un cásete de expresión comprende corriente arriba, es decir en el extremo 5' de la secuencia de codificación, un promotor y corriente abajo, es decir en el extremo 3' , una señal de poliadenilación y, donde sea apropiado, elementos reguladores adicionales que se enlazan operativamente a la secuencia de codificación para la secuencia del ADN ?-4-desaturasa y/o ?-4-desaturasa que se sitúa entre ellas. La conexión operativa significa la disposición secuencial del promotor, la secuencia de codificación, el terminador y, · donde sea apropiado, los elementos reguladores adicionales de tal modo que cada uno de los elementos reguladores puede llevar a cabo su función en la expresión de la secuencia de codificación como se pretende. Las secuencias preferidas para la conexión operativa son secuencias objetivo para asegurar la localización subcelular en las plástidas. Sin embargo, las secuencias objetivo para asegurar la localización subcelular en el mitocondrion, en el retículo endoplásmico (ER) , en el núcleo celular, en los elaioplastos u otros compartimientos puede emplearse si se requiere, como pueden los mej oradores de traducción tales como la secuencia 5' -líder a partir del virus de mosaico del tabaco (Gallie et al., Nucí. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711). Un cásete de expresión puede comprender por ejemplo un cásete constitutivo (de preferencia el USP o promotor napin) , el gen que se expresa y la señal de retención de CR. La señal de retención de CR preferiblemente utilizada es la secuencia KDEL amino (lisina, ácido aspártico, ácido glutámico, leucina) .

Para la expresión en organismos huéspedes procarióticos o eucarióticos, por ejemplo un microorganismo tal como un hongo o una planta, el cásete de expresión se inserta ventajosamente dentro de un vector tal como, por ejemplo, un plásmido, un fago u otro ADN el cual realiza la expresión óptima de los genes · en el organismo huésped posible. Los plásmidos adecuados están por ejemplo en las series E. coli pLG338, pACYC184, pBR tales como por ejemplo, las series pBR322, pUC, tales como las series püC18 o pUC19, M113mp, pKC30, pRep4, pHSl, pH32, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-Bl, gtll o pBdCl, en estreptomices pIJIOl, pIJ364, pIJ702 o pIJ361, en bacilos pUBllO, pC194 o pBD214, en corinebacterias pSA77 o pAJ667 en hongos pALSl, pIL2 o pBB116; se describen además vectores fúngicos ventajosos por Romanos, .A. et al., [(1992) "Foreign gene expresión in yeast: a review", Yeast 8: 423-488] y por van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. [(1991) "Heterologous gene expresión in filamentous fungí] y en More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds . , p. 396-428: ikcademic Press: San Diego] y en "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi" [van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.j. (1991) en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., eds., p 1-28, Cambridge University Press: Cambridge] . Los promotores de levadura ventajosos son por ejemplo 2<x , pAG-1, YEp6, YEpl3 o pEMBLYe23. Ejemplos de promotores de algas o plantas son pLGV23r pGHIac+, pBIN19, pAK2004, pVKH o pDH51 (véase Schmidt, R. y Willmitzer, L., 1988) . Los vectores o derivados antes mencionados de los vectores antes mencionados representan una pequeña selección de los posibles plásmidos. Los plásmidos adicionales son bien conocidos por el técnico experimentado y pueden encontrarse por ejemplo en el libro Cloning Vectors {Eds. Pouwels P.H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 90 018) . Los vectores de planta adecuados se describen ínter alia en "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Capítulos 6/7r páginas 71-119. Los vectores ventajosos son asi llamados vectores de plataforma o vectores binarios que replican en E. coli y agrobacterium. Los vectores significan aparte de los plásmidos también, todos los otros vectores conocidos por el técnico experimentado, tales como por ejemplo, fagos, virus tales como SW40, CMV, báculovirus, adenoviriis, transposcnes, elementos de IS, fásmidos, fagémidos, cósmidos, ADN lineal o circular. Esos vectores pueden experimentar replicación autónoma en el organismo huésped o replicación cromosomal; se prefiere la replicación cromosomal. En una modalidad adicional del vector, el cásete de expresión inventivo puede también introducirse ventajosamente en la forma de un ADN lineal dentro de los organismos, e integrarse por recombinación heteróloga u homologa dentro del genoma del organismo huésped. Este ADN lineal puede componerse de un plásmido linesrizado o únicamente del cásete de expresión como el vector o las secuencias de ácido nucleico inventivas. En una modalidad ventajosa adicional, las secuencias de ácido nucleico inventivas pueden también introducirse solas dentro de un organismo. Si los genes adicionales además de la secuencia del ácido nucleico inventiva ¾ran a introducirse dentro del organismo, éstas pueden introducirse juntas con un gen reportero en un solo vector o cada gen individual con un gen reportero en un vector en cada caso, dentro del organismo, siendo posible introducir los diferentes vectores al mismo tiempo o sucesivamente. El vector comprende ventajosamente al menos una copia de las secuencias de ácido nucleico inventivas y/o del cásete de expresión inventivo. Es posible a modo de ejemplo, incorporar el cásete de expresión de las plantas en el vector de transformación PRT ((a) Toepfer et al., 1993, Methods Enzymol., 217: 66-78; (b) Toepfer et al. 1987, Nucí. Acids . Res. 15:5890 ff.). Alternativamente, un vector recombinante {= vector de expresión) puede transcribirse también y traducirse in vitro, por ejemplo a través del uso del promotor T7 y de la polimerasa de ARN T7. Los vectores de expresión utilizados en procariotes utilizan frecuentemente sistemas inducibles con y sin proteínas de fusión u oligopéptidos de fusión, siendo posible para estas fusiones tener lugar tanto Kn-terminalmente y C- terminalmente u otros dominios usables de una proteína. Tales vectores de fusión se utilizan de manera ordinaria para: i.) incrementar la velocidad de expresión del ARN ii.) incrementar la velocidad de síntesis de proteína alcanzable, iii.) incrementar la solubilidad de la proteína, iv.) o simplificar la purificación a través de una secuencia de unión, la cual puede utilizarse para cromatografía de afinidad. Los sitios de desdoblamiento proteolíticos se introducen también con frecuencia a través de las proteínas de fusión, permitiendo la eliminación de parte de la proteína de fusión también de purificación. Tales secuencias de reconocimiento para las proteasas reconocidas son por ejemplo el factor Xa, la trombina y la enteroquinasa. Los vectores de expresión y de fusión ventajosos típicos son pGEX [Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. y Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40], p AL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , que comprende glutation S-transferasa (GST) , proteína de unión de maltosa, o proteína A. Ejemplos adicionales de los vectores de expresión E. coli son pTrc [Amann et al., (1988) Gene 69:301-315] y los vectores pET [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; Stratagene, Ámsterdara, The Netherlands] . Los vectores ventajosos adicionales para uso en levadura son pYepSecl (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6:229- 234), pMFa ( urjan y Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), y Derivado de pYES (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . Los vectores para uso en hongos filamentosos se describen en: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy, et al., eds., pp. 1-28, Cambridge Uni e sity Press: Cambridge. Una posibilidad alternativa es también para utilizar ventajosamente vectores de expresión de células de insectos, por ejemplo para expresión en células Sf 9. Ejemplos de los mismos son los vectores de la serie pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y de la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170:31-39). Las células de las plantas o las células de las algas pueden utilizarse además ventajosamente para la expresión genética. Ejemplos de los vectores de expresión de plantas que van encontrarse en Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located próxima1 to the left border", Plant Mol. Biol 20: 1195-1197 o en Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucí. Acid. Res. 12:8711-8721. Las secuencias del ácido nucleico inventivas pueden expresarse adicionalmente en células de mamiferos . Ejemplos de vectores de expresión correspondientes son pCDM8 y pMT2PC mencionados en: Seed, B (1987) ííature 329:840 o Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187- 195). Los promotores que se utilizan de preferencia en este caso son de origen viral tales como por ejemplo, los promotores del polioma, adenovirus 2, citomegalovirus o virus 40 de simio. Los sistemas de expresión procarióticos y eucarióticos adicionales se mencionan en los Capítulos 16 y 17 en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. La introducción de los ácidos nucleicos inventivos, del cásete de expresión o del vector en los organismos, por ejemplo, en las plantas, puede tener lugar por todos los métodos conocidos por el técnico experimentado . Los métodos apropiados para microorganismos pueden encontrarse por el técnico experimentado en los libros de texto por Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Sprin Harbor Laboratory Press, por F.M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, por D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9) por Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press o Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press. La transferencia de los genes extraños dentro del genoma de una planta se refiere como la transformación. En este caso, los métodos descritos para la transformación y la regeneración de las plantas a partir de tejidos de plantas o células de plantas se utilizan para transformación transitoria o estable. Los métodos adecuados son la transformación del protoplasto por la incorporación del ADN inducido por polietilenglicol, el método biolístico con el cañón genético - el asi llamado método de bombardeo de partícula, electroporación, incubación de embriones secos en solución que contiene el ADN, microinyección y transferencia genética mediada por agrobacterium. Tales procesos se describen por ejemplo en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S.D. ung y R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol 42 (1991) 205-225). La construcción que se expresa se clona de preferencia dentro de un vector el cual es adecuado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBinl9 (Bevan et al., Nucí. Acids Res. 12 (1984) 8711) . La agrobacteria transformada con tal vector puede utilizarse entonces en una manera conocida para transformar plantas, especialmente plantas cultivadas tales como por ejemplo, plantas de tabaco por ejemplo, bañando hojas dañadas o piezas de hojas en una solución de agrobacteria y luego cultivando en medios adecuados. La transformación de las plantas con Agrobacterium tumefaciens se describe por ejemplo por Hofgen y Willmitzer en Nucí. Acid Res. (1988) 16, 9877, o se describe Ínter alia en F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, páginas 15-38. La agrobacteria transformada con un vector de expresión inventivo puede asi mismo utilizarse en una manera conocida para transformar plantas tales como plantas de prueba tales como arabidopsis o plantas cultivadas tales como cereales, maíz, avenas, centeno, cebada, trigo, soya, arroz, algodón, remolacha azucarera, cañóla, girasol, lino, cáñamo, papa, tabaco, tomate, zanahoria, pimentón, colza de oleaginosa, tapioca, mandioca, arrurruz, tagetes, alfalfa, lechuga y las diversas especies de árboles, nueces y vides, en particular plantas cultivadas que producen aceite tales como soya, cacahuete, ricino, girasol, maíz, " algodón, lino, colza de oleaginosa, coco, palma de aceite, cártamo (Carthamus tinctorius) o granos de cacao, por ejemplo, bañando las hojas dañadas o piezas de hojas en una solución de agrobacteria y luego cultivándolas en medios adecuados. Particularmente adecuados para producir PUFAS, por ejesplo, ácido estearidónico, ácido eicosapentaenoico y ácido docosahexaenoico, son la borraja o la primulaceae. El lino es en particular, ventajosamente adecuado para producir PUFAS que tienen las secuencias del ácido nucleico inventivas ventajosamente en combinación con desaturasas y elongasas adicionales. Las células de las plantas genéticamente modificadas pueden regenerarse por todos los métodos conocidos por el técnico experimentado. Los métodos apropiados pueden encontrarse en las publicaciones antes mencionadas por S.D. Kung y R. Wu, Potrykus o Hofgen y Willmitze . Los organismos transgénicos o huéspedes adecuados y ventajosos en principio para el ácido nucleico inventivo-, el cásete de expresión o el vector son todos los organismos capaces de sintetizar ácidos grasos, específicamente ácidos grasos insaturados y adecuados para la expresión de genes recombinantes , tales como microorganismos, animales no humanos o plantas. Ejemplos que pueden mencionarse son plantas tales como arabidopsis, asteraceae tales como caléndula o plantas cultivadas tales como soya, cacahuete, ricino, girasol, maíz, algodónr lino, colza de oleaginosa, coco, palma de aceite, cártamo (Carthamus tinctorius) o granos de cacao, microorganismos tales como hongos por ejemplo, el género Mortiereilar Saprolegnia o Pythium, bacterias tales como el género Escherichia, levaduras tales como el género Saccharomyces, cianobacterias, ciliatos, algas o protozoarios tales como dinoflagelatos tales como Crypthecodinium. Se da preferencia a los organismos capaces de sintetizar naturalmente aceites en cantidades relativamente grandes, tales como hongos tales como Mortierella alpina, Pythium insidiosum o plantas tales como soya, colza de oleaginosa, coco, palma de aceite, cártamo, ricino, caléndula, cacahuete, granos de cacao o girasol o levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, y se da preferencia particular a la soya, a la colza de oleaginosa, al girasol, al lino, a la caléndula o a Saccharomyces cerevisiae. Los animales transgénicos son en principio también adecuados como organismos huéspedes, por ejemplo, C. elegans . Por organismo transgénico o planta transgénica para los propósitos de la invención se quiere decir que los ácidos nucleicos utilizados en el proceso no están en su sitio natural en el genoma de un organismo, y los ácidos nucleicos pueden expresarse homologa o heterólogamente. Transgénico significa también, sin embargo como se menciona, que los ácidos nucleicos inventivos están en su lugar natural en el genoma de un organismo, pero que la secuencia ha sido modificada por comparación con la secuencia natural y/o las secuencias reguladoras han sido modificadas de las secuencias naturales. Transgénico es preferiblemente la expresión de los ácidos nucleicos inventivos en un sitio no natural en el genoma, significando que la expresión homologa o de preferencia heteróloga de los ácidos nucleicos ocurre. Los organismos transgénicos preferidos son hongos tales como Mortierella o las plantas son las plantas de semillas oleosas . "Transgénico" de este modo significa por ejemplo en relación a una secuencia del ácido nucleico, un cásete de expresión o un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico la cual codifica para la ?-4-desaturasa o derivados de la misma, o un organismo transformado con esta secuencia de ácido nucleico, un c sete de expresión o un vector, todas las construcciones que se han agrupado por métodos de ingeniería genética y en donde ya sea a) la secuencia de ácido nucleico ?-4-desaturasa, o b) una secuencia de control genético enlazada funcionalmente a la secuencia de ácido nucleico ?-4-desaturasa, por ejemplo un promotor, o c) (a) y (b) 41 no están en su ambiente genético natural o se han modificado por métodos de ingeniería genética, en donde la modificación puede ser por ejemplo sustituciones, adiciones, eliminaciones, inversiones o inserciones de uno o más residuos de nucleótido. El ambiente genético natural significa el lugar cromosomal · natural en el organismo original o la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, el ambiente genético natural de la secuencia de ácido nucleico es de preferencia al menos parcialmente retenida. El ambiente flanquea a la secuencia de ácido nucleico en al menos un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 pb, de preferencia al menos 500 pb, particularmente de preferencia al menos 1000 pb, muy particularmente de preferencia al menos 5000 pb. Las células huéspedes las cuales pueden utilizarse se mencionan además en: Goeddel, Gene Expresión Technology: Methods in Enzy ology 185, Academia Press, San Diego, CA (1990) . Las cepas de expresión que pueden utilizarse, por ejemplo, aquellas que tienen actividad de proteasa inferior, se describen en: Gottesman, S., Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128. ün aspecto adicional de la invención se relaciona al uso de un cásete de expresión que comprende las secuencias de ADN que codifican para un gen ?-4-desaturasa o secuencias de ADN que hibridizan con la misma para la transformación de células de plantas y tejidos o partes de plantas. El propósito del uso es incrementar el contenido de ácidos grasos, aceites o lipidos que tienen un contenido incrementado de y dobles enlaces en la posición ?-4. Es posible en esta conexión, dependiendo de la elección del promotor, para la expresión del gen ?-desaturasa tener lugar específicamente en las hojas, en las semillas, los tubérculos u otras partes de la planta. Tales plantas transgénicas que sobreproducen ácidos grasos, aceites o lipidos tienen dobles enlaces ?-4, su material de propagación, y su célula de planta, tejidos o partes son un aspecto adicional de la invención. Un aspecto preferido de acuerdo a la invención son plantas transgénicas que comprenden una secuencia de ácido nucleico funcional inventiva o no funcional (= >N antisentido o enzima inactiva enzimática) o un cásete de expresión funcional o no funcional . El cásete de expresión o la secuencia de ácido nucleico inventiva que comprenden una secuencia genética ?-4-desaturasa pueden además emplearse también para la transformación de los organismos mencionados a modo de ejemplo anteriormente, tales como bacterias, cianobacterias, levaduras, hongos filamentosos, ciliatos y algas, con el propósito de incrementar el contenido de dobles enlaces ?-4 en ácidos grasos, aceites o lípidos. Incrementar el contenido de ácidos grasos, aceites o lípidos que tiene dobles enlaces ?-4 significa para los propósitos de la presente invención por ejemplo, la capacidad artificialmente adquirida de la eficiencia biosintética incrementada a través de la sobreexpresión funcional del gen ?-4-desaturasa en los organismos inventivos, ventajosamente en las plantas transgénicas inventivas comparadas con las plantas iniciales que no han sido modificadas por ingeniería genética cuando menos para la duración de al menos una generación de planta. El sitio de biosíntesis de los ácidos grasos, aceites o lípidos por ejemplo es generalmente la semilla o las capas celulares de la semilla, de manera que la expresión específica de las semillas del gen ?-4-desaturasa es importante. Sin embargo, es obvio que la biosíntesis de los ácidos grasos, aceites o lípidos no necesita confinarse al tejido de la semilla, sino puede también tener lugar específicamente en el tejido en todas las otras partes de la planta- por ejemplo en las células epidemiales o en los tubérculos . Además, la expresión constitutiva del gen ?.-4-desaturasa exógeno es ventajosa. Sin embargo, por otro lado, la expresión inducible puede parecer también ser deseable.

La efectividad de la expresión del gen ?-4-desaturasa puede determinarse por ejemplo in vltro por la propagación de los brotes de meristemo. Además, un cambio en la naturaleza y el nivel de expresión del gen ?-4- desaturasa y el efecto del mismo en la eficiencia de la biosintesis del ácido graso, aceite o lipido puede probarse en plantas de prueba en experimentos de invernadero . La invención se relaciona adicionalmente a plantas transgénicas transformadas con un cásete de expresión que comprende una secuencia genética ?-4-desaturasa o secuencias de ADN que hibridizan con eso, y a células transgénicas, tejidos, partes y material de propagación de tales plantas. Se da preferencia particular en este enlace a las plantas cultivadas transgénicas tales como, por ejemplo, cebada, trigo, centeno, avenas, maíz, soya, arroz, algodón, remolacha azucarera, colza de oleaginosa y cañóla, girasol, lino, cáñamo, papa, tabaco, tomate, colza, tapioca, mandioca, arrurruz, alfalfa, lechuga y diversas especies de árbol, nuez y vid. Las plantas para los propósitos de la invención son plantas mono y dicotiledóneas, musgos o algas. Un desarrollo inventivo adicional son, como se describe anteriormente, plantas transgénicas que comprenden una secuencia de ácido nucleico inventiva funcional o no funcional o un cásete de expresión inventivo funcional o no funcional. No funcional significa que la proteína enzimáticamente activa no se sintetiza más. Además, los ácidos nucleicos no funcionales o las construcciones de ácido nucleico también significan un ADN antisentido así llamado, el cual conduce a las plantas transgénicas las cuales tienen una reducción en la actividad enzimática o la actividad no enzimática. Es posible con la ayuda de la técnica antisentido, específicamente si la secuencia de ácido nucleico inventiva se combina con otros genes de síntesis del ácido graso en el ADN antisentido, para sintetizar triglicéridos que tiene un contenido incrementado de ácidos grasos saturados o para sintetizar ácidos grasos. Las plantas transgénicas significan células de plantas sencillas y cultivos de las mismas en medios sólidos o en cultivos líquidos, partes de las plantas y plantas completas. Los aspectos adicionales de la invención, son: - El proceso para la transformación de una planta que comprende introducir los casetes de expresión inventivos que comprenden una secuencia de gen ?-4-desaturasa a partir del primulaceae o secuencias de ADN que hibridizan con el mismo dentro de una célula de planta, dentro del tejido calloso, una planta completa o protoplastos de plantas. - El uso de una secuencia del gen de ADN ?-4-desaturasa o secuencias de ADN que hibridizan con el mismo para producir plantas que tiene un contenido incrementado de ácidos grasos, aceites o lipidos que tiene dobles uniones ?-4 a través de la expresión de esta secuencia de ADN ?-4- desaturasa en plantas. Las proteínas comprenden las secuencias de aminoácido descritas en la SEC. DE IDENT. SO. : 2. - El uso de las proteínas que tienen la secuencias de la SEC. DE IDENT. NO.: 2 para producir ácidos grasos no saturados . Un aspecto adicional de acuerdo a la invención es un proceso para producir ácidos grasos no saturados, el cual comprende colocar al menos una secuencia de ácido nucleico inventivo descrita anteriormente o al menos una construcción de ácido nucleico inventivo dentro de un organismo que produce de preferencia aceite, cultivar este organismo y aislar aquel aceite presente en el organismo, y liberar los ácidos grasos contenidos en el aceite. Estos ácidos grasos insaturados comprenden ventajosamente dobles uniones ?-4. Los ácidos grasos pueden ser liberados desde los aceites o lipidos por ejemplo por hidrólisis básica, por ejemplo con NaOH o KOH. Los aspectos de la invención incluyen también un proceso para producir triglicéridos que tiene un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados, los cuales comprenden colocar al menos una secuencia de ácido nucleico inventiva descrita anteriormente o al menos un cásete de expresión inventivo dentro de un organismo que produce aceite, cultivar este organismo y aislar aquel aceite presente en el organismo. Un aspecto adicional de acuerdo a la invención es un proceso para producir triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados incubando triglicéridos que tienen ácidos grasos saturados o insaturados o saturados e insaturados con al menos la proteina codificada por la secuencia SEC. DE IDENT. NO. : 1. El proceso se lleva a cabo ventajosamente en la presencia de compuestos capaces de extraer o liberar equivalentes de reducción. Los ácidos grasos pueden liberarse entonces a partir de los triglicéridos. Las plantas transgénicas se utilizan ventajosamente como organismos en el proceso inventivo. Estas plantas comprenden los ácidos grasos poliinsaturados sintetizados en el proceso inventivo y pueden ventajosamente comercializarse directamente sin la necesidad de aislar los aceites sintéticos, lipidos o ácidos grasos. Bajo las plantas en el proceso inventivo están las plantas completas y todas las partes de las plantas, órganos de las plantas o partes de las plantas tales como el follaje, el tallo, la semilla, la raíz, los tubérculos, las anteras, las fibras, los conjuntos de las raices, los troncos, los embriones, los callos, los cotiledones, los peciolos, el material cosechado, el tejido de planta, el tejido reproductivo, los cultivos celulares los cuales se derivan de las plantas transgénicas y/o pueden utilizarse para producir la planta transgénica. La semilla comprende en este enlace todas las partes de semillas tales como las vainas de las semillas, las células de semillas y epidérmicas, el tejido endospérmico o embriónico. Los compuestos producidos en el proceso inventivo pueden, sin embargo, también aislarse a partir de los organismos, venta osamente plantas, en la forma de sus aceites, grasa, lipidos y/o ácidos grasos libres. Los ácidos grasos poliinsaturados producidos por este proceso pueden cosecharse cosechando los organismos ya sea desde el cultivo en el cual se están cultivando, o desde el campo. Esto puede tener lugar por el prensado o por la extracción de las partes de las planta, de preferencia de las semillas de las plantas. Es posible además para los aceites, grasas, lipidos y/o ácidos grasos libres ser obtenidos prensando la asi llamada replantación en frió o prensado en frió sin la entrada de calor. Para que las partes de las plantas, específicamente las semillas, puedan desestabilizarse más fácilmente, estas se desmenuzan previamente, se tratan con vapor o se asan. Las semillas pre-tratadas de esta manera pueden prensarse o extraerse con un solvente tal como hexano caliente. El solvente se remueve entonces de nuevo. En el caso de los microorganismos, después de la cosecha se extraen por ejemplo directamente sin operaciones adicionales o de otra manera se extraen después de la interrupción por diversos métodos conocidos por un técnico experimentado. Es posible de esta manera aislar más del 96% de los compuestos producidos en el proceso. Subsecuentemente, los productos obtenidos de esta forma se procesan adicionalmente, · es decir, se refinan. Esto implica inicialmente por ejemplo los mucilagos de la planta y la materia suspendida se remueve. El desencalado así llamado puede tener lugar enzimáticamente o por ejemplo química/físicamente por la adición del ácido tal como ácido fosfórico. Los ácidos grasos libres se remueven entonces por el tratamiento con una base, por ejemplo una solución de hidróxido de sodio. El producto resultante se lava completamente con agua para remover el álcali que permanece en el producto y se seca. Los productos se someten a decoloración con por ejemplo, tierra de batán o carbono activado para remover pigmentos aún presentes en el producto. Finalmente, el producto se desodoriza también por ejemplo con vapor. Las PUFAS producidas en el proceso resultan ventajosamente en los organismos en la forma de sus aceites, lípidos o ácidos grasos o fracciones de los mismos. Una modalidad inventiva adicional es el uso del aceite, lipido de los ácidos grasos y/o de la composición de ácido graso en piensos, alimentos humanos, cosméticos o farmacéuticos . El término "aceite", "lipido" o "grasa" significa una mezcla de ácido graso la cual comprende el o los ácidos grasos insaturados, saturados de preferencia esterificados . Se prefiere para el aceite, lipido o la grasa tener un contenido elevado del o de los ácidos grasos poliinsaturados libres o ventajosamente esterificados, en particular ácido linoléico, ácido y-linoléico, ácido dihomo-y-linoléico, ácido araquidónico, ácido a-linolénico, ácido estearidónico, ácido eicosatetraenoico, ácido eicosapentanoico, ácido docosapentanoico o ácido docosaheanoico. El contenido de los ácidos grasos insaturados esterificados es de preferencia aproximadamente 30%, más preferiblemente el contenido es 50%, aún más preferiblemente el contenido es 60%, 70%, 80% o más. Para la determinación, por ejemplo el contenido del ácido graso puede determinarse por la cromatografía de gas después que los ácidos grasos han sido convertidos en los metilésteres por trans-esterificación. El aceite, lipido o grasa pueden comprender diversos de los otros ácidos grasos saturados o insaturados, por ejemplo ácido calendúlico, ácido palmítico, palmitoleico, esteárico, oleico, etc. Es posible, en particular para el contenido de los diversos ácidos grasos en el aceite o la grasa variar dependiendo del organismo inicial . Los ácidos grasos poliinsaturados producidos en el proceso son, por ejemplo, esfingolípidos, fosfoglicéridos, lípidos, glicolípidos, fosfolipidos, monoacilglicerol, diacilglicerol, triacilglicerol u otros ésteres del ácido graso . Los ácidos grasos poliinsaturados presentes pueden liberarse desde los ácidos grasos- poliinsaturados los cuales han sido producidos de esta manera en el proceso inventivo y tienen ventajosamente al menos dos dobles enlaces como se describe anteriormente por ejemplo por un tratamiento con álcali, por ejemplo OH o NaOH acuoso o hidrólisis ácida ventajosamente en la presencia de un alcohol tal como metanol o etanol o por una eliminación enzimática, y se aislan por, ejemplo, por separación de fase y acidificación subsiguiente con, por ejemplo, H2SO4. La liberación de los ácidos grasos puede tener lugar directamente sin el desarrollo descrito anteriormente . Los procesos anteriormente mencionados hacen ventajosamente esto posible para sintetizar los ácidos grasos o triglicéridos que tiene un contenido incrementado de ácidos grasos que tiene dobles enlaces ?-4. Los procesos anteriormente mencionados hacen ventajosamente esto posible para sintetizar los ácidos grasos o triglicéridos que tiene un contenido incrementado de ácidos grasos que tiene dobles enlaces ?-4, utilizando el sustrato para la reacción de la ?-4-desaturasa de preferencia el ácido docosapentaenoico . El proceso anteriormente mencionado de este modo hace esto posible ventajosamente en particular para sintetizar los ácidos grasos tales como por ejemplo, ácido docosahexaenoico . Es también posible con la ayuda de la asi llamada tecnología anti-sentido para producir ácidos grasos o triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos saturados en un proceso. Ejemplos de organismos que pueden mencionarse para tales procesos son plantas tales como arabidopsis, primulaceae, borraja, cebada, trigo, centeno, avena, maíz, soya, arroz, algodón, remolacha azucarera, colza de oleaginosa y cañóla, girasol, lino, cáñamo, papa, tabaco, tomate, colza de oleaginosa, tapioca, mandioca, arrurruz, alfalfa, cacahuate, ricino, coco, palma de aceite, cártamo (Carthamus tinctorius) o granos de cacao, microorganismos tales como hongos Mortierella, Saprolegnia o Pythium, bacterias tales como el género Escherichia, cianobacterlas, levaduras tales como el género Saccharomyces, algas o protozoarios tales como dinoflagelatos tales como Crypthecodinium. Los organismos preferidos son aquellos capaces de sintetizar naturalmente aceites en grandes cantidades, tales como microorganismos tales como hongos tales como Mortierella alpina, Pythium insidiosum o plantas tales como soya, colza de oleaginosa, coco, palma de aceite, cártamo, ricino, caléndula, cacahuate, granos de cacao o girasol o levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, particularmente de preferencia soya, colza de oleaginosa, girasol, Cártamo o Saccharomyces cerevisiae. • Los organismos utilizados en los procesos se cultivan o cosechan en una manera conocida por el técnico experimentado dependiendo del organismo huésped. Los microorganismos se cultivan usualmente en un medio liquido el cual comprende una fuente de carbono, usualmente en la forma de azúcares, una fuente de nitrógeno, usualmente en la forma de fuentes orgánicas de nitrógeno, tales como extracto de levadura o sales tales como sulfatos de amonio, elementos de traza tales como sales de hierro, manganeso y magnesio y, cuando sea apropiado, vitaminas a temperaturas entre 0°C y 100 °C, de preferencia entre 10°C a 60°C mientras se pasa en el oxigeno. Es posible en estos casos para el pH del fluido nutriente mantenerse en un valor fijo, es decir controlado durante el cultivo, o no. El cultivo puede tener lugar en forma de lotes, en forma de semi-lotes o continuamente. Los nutrientes pueden introducirse en el inicio de la fermentación o subsecuentemente alimentarse semicontinua o continuamente . Las plantas son, después de la transformación, inicialmente regeneradas como se describe anteriormente y luego se cosechan o se cultivan como es usual.

Después que los organismos se han cultivado, se obtienen los lipidos en la manera usual. Esto se hace por los organismos después de la recolección que se interrumpe inicialmente o se utiliza directamente- Los lipidos se extraen ventajosamente con solventes adecuados tales como solventes apolares tales como hexano o etanol, isopropanol o mezclas tales como hexano/isopropanol, fenol/cloroformo/alcohol isoamilico a temperaturas entre 0°C a 80°C, de preferencia entre 20°C a 50°C. La biomasa se extrae de manera ordinaria con un exceso de solvente, por ejemplo un exceso de solvente a biomasa de 1:4. El solvente se remueve entonces por ejemplo por destilación. La expresión puede tener lugar con C02 supercrítico. La biomasa que permanece después de la expresión puede removerse por ejemplo por filtración. El aceite sin purificar obtenido de esta manera puede purificarse entonces además, por ejesiplo removiendo la materia suspendida mezclando con solventes polares tales como acetona o cloroformo y filtración subsecuente o centrifugación. La purificación adicional en columnas es posible también. Los ácidos grasos libres se obtienen a partir de triglicéridos por hidrólisis de los mismos en una manera usual . La invención se relaciona además a ácidos grasos insaturados y triglicéridos que tienen un contenido incrementado de ácidos grasos insaturados, que han sido producidos por los procesos anteriormente mencionados, y al uso de los mismos para producir alimentos humanos, piensos, cosméticos y farmacéuticos. Para este propósito, se agregan a los alimentos humanos, piensos, cosméticos o farmacéuticos en las cantidades usuales. La invención se explica además por los siguientes ej emplos : Ej emplos Ejemplo 1: Métodos Generales de Clonación Los métodos de clonación tales como por ejemplo, desdoblamientos de restricción, electroforesis en gel de agarosa, purificación de los fragmentos de ADN, transferencia de los ácidos nucleicos a nitrocelulosa y a membranas de nylon, conexión de los fragmentos de ADN, transformación de células Escherichia coli, el cultivo de bacterias y análisis de secuencia del ADN recombinante se llevaron a cabo como se describe en Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6).

Ejemplo 2: Análisis de Secuencia del ADN recombinante: Se secuenciaron las moléculas del ADN recombinante utilizando un secuenciador de ADN de fluorescencia láser ABI por el método de Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Nati. Acad. Sci. USA74, 5463-5467). Los fragmentos que resultan de una reacción de cadena de polimerasa se secuenciaron y verificaron para evitar los errores de polimerasa en las construcciones que se expresan.

Ejemplo 3: Clonación de la ?-4-desaturasa a partir de Euglena gracilis Se obtuvo la cepa 1224-5/25 de. Euglena gracilis de Sammlung für Algenkulturen Góttingen (SAG) . Para el aislamiento, la cepa se cultivó en un medio II (Calvayrac R y Douce R, FEBS Letters 7:259-262, 1970) a 23 °C con un intervalo de luz/oscuridad de 8 horas/16 horas (intensidad de luz 35 mol s-1 m-2) durante 4 días. Se aisló el ARN total a partir de un cultivo de Euglena cuatro días con la ayuda del equipo RMAeasy de Qiagen (Valencia, CA, US) . Se aisló el Poly-A+ RNA (ARNm) del ARN total con la ayuda de la celulosa oligo-dT (Sambrook et al., 1989) . El equipo del sistema de transcripción inversa de Promega se utilizó para transcripción inversa del ARN, y el ADNc sintetizado se clonó en el vector lambda ZAP (lambda ZAP Gold, Stratagene) . El ADNc se desempacó de acuerdo con las instrucciones del fabricante para dar el ADN plásmido, y los clones se secuenciaron parcialmente para la secuenciación aleatoria. Una secuencia mostró similaridad a las ?-4- desaturasas . La secuencia encontrada se utilizó como sonda para clasificar el ADNc fago (2*105 placas) . Después de dos ciclos de clasificación, fue posible identificar un ADNc con la secuencia de longitud total.

Ejemplo 4: Clonación de los plésmidos de expresión para expresión heteróloga en levaduras El ADNc clonado comprende dos codones de inicio putativos los cuales resultan en dos marcos de lectura abiertos con una diferencia de 9 bases. Solamente el marco de lectura más corto (SEC. DE IDENT. NO. : 1 mostró actividad después. El siguiente par de cebadores se utilizó para clonar este marco de lectura dentro del vector pYES2 (Invitrogen) : Hacia adelante: 5' -GGTACCATGTTGGTGCTGTTTGGCAA Inverso : 5 ' -CTCGAGTTATGACTTTTTGTCCCCG Composición de la mezcla de PCR (50 µ?) : 5.00 µ? del ADNc de plantilla 5.00 µ? 10x del tampón (ventaja de la polimerasa) + 5 mM de MgC12 5.00 µ? de 2 mM de dNTP 1.25 µ? cada cebador (10 pmoles/µ??) 0.50 µ?. de Ventaja de polimerasa Se empleó la ventaja de la polimerasa de Clontech. Condiciones de reacción del PCR: Temperatura de Recocido: 1 minuto, 55°C Temperatura de desnaturalización: 1 minuto, 94°C. Temperatura de alargamiento: 2 minutos, 72°C. Número de ciclos: 35 Se incubó el producto PCR con las enzimas de restricción Kpnl y Xhol a 37°C durante 2 horas. El vector pYES2 de expresión de levadura se- incubó en la misma forma. El producto de PCR 1638 pb en tamaño, y el rector se fraccionaron entonces por electroforesxs de gel en agarosa, y los fragmentos de ADN correspondientes se cortaron. El ADN se purificó utilizando un equipo de purificación de gel Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se ligaron entonces el vector y el ADNc de la ?-4-desaturasa. El equipo de ligación rápido de Roche se utilizó para este propósito. El plásmido pYES2-EGD4-2 resultante se verificó por secuenciación y se transformó en la cepa SC334 de saccharomyces por electroporación (1500 V) . Las levaduras se colocaron en placas en un medio mínimo sin uracilo. Las células capaces de crecer en un medio mínimo sin. uracilo comprenden de este modo el plásmido pYES2-EGD4-2.

Ejemplo 5: Clonación de los plásmidos de expresión para la expresión específica de semillas en plantas Un vector de transformación adicional basado en pSUN-USP se generó para la transformación de plantas. Para este propósito, los sitios de desdoblamiento Notl se introdujeron en el extremo 5' y 3' de la secuencia de codificación utilizando el par de cebadores siguientes: Hacia delante: 5 ' -GCGGCCGCATGTTGGTGCTGTTTGGCAA Inverso : 5 ' -GCGCCGCATGACTTTTTGTCCCCG Composición de la mezcla de PCR (50 µ? 5.00 ]iL del ADNc de plantilla 5.00 pL de lOx del tampón (Ventaja de la polimerasa) + 25 mM de MgC12 5.00 µ? de 2 mM de dNTP 1.25 µ? de cada cebador (10 pmoles/pL) 0.50 ]i de la ventaja de polimerasa Se empleó la ventaja de la polimerasa de Clontech. Condiciones de reacción de PCR: Temperatura de recocido: 1 minuto, 55 °C Temperatura de desnaturalización: 1 minuto, 9 °C Temperatura de alargamiento: 2 minutos, 72 °C Número de ciclos: 35 Se incubó el producto PCR con la enzima de restricción Notl a 37 °C durante 16 horas- El vector de expresión de planta pSUN300-USP se incubó de la misma forma. El producto PCR de 1642 pb en tamaño, y el vector de 7624 pb en tamaño, se fraccionaron entonces por eletroforesis en gel de agarosa, y los fragmentos de ADN correspondientes se cortaron. El ADN se purificó utilizando un equipo de purificación de gel Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se ligaron entonces el vector y el ADNc de ?- 4-desaturasa . El equipo de ligación rápida de Roche se utilizó para este propósito. El plásmido resultante pSUN- EGD4-2 se verificó por secuenciación . pSUN300 es un derivado del plásmido pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994). La familia versátil pequeña pPZP de los vectores binarios de Agrobacterium para la transformación de la planta. Plant Mol Biol 25:989-994). Se produjo pSÜN-USP a partir de pSON300 insertando un promotor US como el fragmento EcoRI en pSUN300. La señal de poliadenilación es aquel del gen octopina sintasa del plásmido Ti de A. Tumefaciens (terminador oes Genbank Acceso V00088) (De Greve, H., Dhaese, P. Seurick, J. , Lemmers, M., Van Montagur M. y Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1(6), 499-511 (1982). El promotor de USP corresponde a los nucleotidos 1-684 (Genbaak Acceso X56240) , con la parte de la región no codificante del gen USP que se presenta en el promotor. El fragmento promotor el cual es de 684 pares de bases en tamaño se amplificó por una reacción de PCR utilizando cebadores estándares T7 comercialmente disponibles (Stratagene) y con la ayuda de un cebador sintetizado por métodos estándares (secuencia cebadora: 5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA- 3' ) · El fragmento PCR se cortó entonces con EcoRI/Sall y se insertó dentro del vector pSUN300 con el terminador OCS. El resultado fue el plásmido llamado pSUN-USP. La construcción se utilizó para transformar Arabidopsis thaliana, colza de oleaginosa, tabaco y linaza.

Ejemplo 6: Generación de plastas transgénicas a) Generación de plantas de colza de oleaginosa transgénica (modificación de Moloney et al., 1992, Plant cell Reports, 8:238-242) Se generaron las plantas de colza de oleaginosa transgénicas utilizando vectores binarios en Agrobacterium tumefaciens C58Cl:pGV2260 o Escherichia coli (Deblaere et al, 1984, Nucí. Acids. Res. 13, 4777-4788). Para transformar plantas de colza de oleaginosa (Var. Drakkar, NPZ Norddeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Alemania) , una dilución 1:50 de un cultivo durante la noche de una colonia agrobacteriana positivamente transformada en un medio Murashige-Skoog ( urashige y Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473) con 3% de sacarosa (un medio 3MS) se utilizó. Los petioles o hipocotilos de las plantas de colza de oleaginosa estériles recientemente germinados (cada uno de aproximadamente 1 cm2) se incubaron con una dilución agrobacteriana 1:50 en un plato de Petri durante 5-10 minutos. Esto se siguió por co-incubación en un medio 3MS con 0.8% de agar Bacto a 25°C en la oscuridad durante 3 días. Se continuó el cultivo después de 3 días con 16 horas de luz/8 horas de oscuridad y se continuó en un ritmo semanal en un medio MS con 500 mg/l de Claforan (cefotaxima de sodio) , 50 mg/l de canamicina, 20 microM de bencilamonipourina (BAP) y 1.6 g/1 de glucosa. Los brotes cultivados se transfirieron a un medio MS con 2% de sacarosa, 250 mg/l de Claforan y 0.8% de agar Bacto. Si no se formaron brotes después de tres semanas, se agregó ácido 2- indolbutirico como la hormona de crecimiento al medio para enraizar. Los brotes regenerados se mantienen en un medio 2?? con canamicina y Claforan, se transfirieron en el suelo después del enraizado y, después del cultivo durante dos semanas, se hicieron crecer en una caja en un ambiente controlado o en un invernadero y se les permitió florecer, las semillas maduras se cosecharon e investigaron para la expresión de ?-4-desaturasa por análisis de lipido. Las lineas con contenidos incrementados de, o dobles uniones en la posición ?-4- comparado con las plantas control no transformadas pueden encontrarse en las lineas transgénicas establemente transformadas que expresan funcionalmente el transgen . b) Las plantas de linaza transgénicas pueden producirse por ejemplo por el método de Bell et al., 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 35 ( 6) : 56- 65 por medie de bombardeo de partículas. Las transformaciones mediadas por agrobacterias pueden producirse por ejemplo por el método de Mlynarova et al. (1984), Plant Cell Report 13:282-285.

Ejemplo 7: Extracción de lípido a partir de levaduras: Las levaduras transformadas con el plásmido pYES- EGD4-2 como en el Ejemplo 4 se analizaron en la siguiente forma : Se cultivaron las células de levadura en 1 mi de un medio mínimo con 0.2% de rafinosa durante dos días y luego se transfirieron en 5 mi del mismo medio. Este cultivo se cultivó a 30 °C durante 6 horas hasta que el OD600 fue 0.05. Luego, 100 µ de los sustratos del ácido graso (67 µ? para 16:1 ?7) se agregaron y la expresión de la ?-4-desaturasa se indujo agregando 2% de galactosa. Las células se incubaron entonces a 15 °C durante 4 días, se cosecharon y se lavaron con 100 m de NaHC03 y se emplearon para el análisis del ácido graso por GC. La Figura 4 muestra el resultado del análisis del ácido graso. Fue posible demostrar en este caso que, comparado con la cepa de levadura control, la cual no tiene el gen ?-4-desaturasa, el DPA del ácido graso (ácido docosapentaenoico) el cual se alimentó, se desaturó al DHA (ácido docosahexaenoico) en la cepa de levadura con la construcción pYES-EGD4-2. Las especificidades del sustrato se encontraron alimentando las cepas de levadura transformadas con diferentes ácidos grasos (Tabla 1) . La conversión de los ácidos grasos alimentados a sus productos A4-desaturados se determinó entonces. El método se describe por ejemplo en Napier y Michaelson, 2001, Lipids. 36 (8) : 761-766; Sayanova et al.f 2001, Journal of Experimental Botany. 52 (360) : 1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388 (2) .293-298 y Michaelson et al., 1998, FEBS Letters. 439 (3) .215-218. El análisis de la especificidad del sustrato mostró que la doble unión C7-C8 es necesaria para el reconocimiento del sustrato. Tabla 1: Especificidad del sustrato de la ?-4-desaturasa de Euglena gracilis Ácido Graso Alimentado Conversión (en %) 22.5 ?7, 10, 13, 16, 19 29.7 (±2.8) 22:4 ?7, 10, 13, 16 28.7 (±2.5) 20:3 ?8, 11, 14 No detectable 18:3 ?6, 9, 12 No detectable 18:2 ?9, 12 No detectable 18:1 ?9 No detectable 18:0 No detectable 16:3 ?7, 10, 13 21.4 (± 3.3) 16:1 ?7 7.4 (±0.8) 16:1 ?9 No detectable 16:0 No detectable Ejemplo 8: Análisis de posición de los ácidos grasos de la ?- 4-desaturados Además de la especificidad del sustrato, la posición de los ácidos grasos ?-4-desaturados se analizó también. La posición de los ácidos grasos poliinsaturados es importante desde los puntos de vista de la fisiología nutricional. Se ha reportado que los ácidos grasos insaturados particularmente en la posición sn-2 de los triacilglicéridos se absorben rápidamente en el intestino de los mamíferos. El procedimiento para investigar la especificidad posicional de la ?-4-desaturasa a partir de Euglena gracilis fue como sigue: Como se describe en el Ejemplo 4, 100 mi del cultivo de levadura que expresa la ?-4-desaturasa a partir de levadura se alimentó con 16:1 ?7 y con 22:4 ?7, 10, 13, 16 y luego se incubó. Los lípidos totales se aislaron de las levaduras por extracción de cloroformo/metanol/agua (Bligh, E.G. y Dyer, W.J. Can J Biochem Physiol 37:911-917, 1959) y se fraccionaron con cromatografía de capa fina (cloforomo/metanol/ácido acético 65:25:81- Las placas de capa delgada se rasparon de la fosfatidilcolina y se extrajeron con 2 mi de cloroformo/metanol (2/1) . La fosfatidilcolina extraída se secó y se volvió a suspender en 50 µ? de 100% de Trition-100. 1 mi de 50 mM de HEPES, 2 mM de CaCl2 y 10 000 unidades de lipasa (Rhizopus arrhizus delemar, Sigma) se agregó a la solución. Después de la incubación a 37ttC durante 2 horas, la solución se acidificó con ácido acético (100%), y los lipidos y los ácidos grasos libres se extrajeron con cloroformo/metanol. Los ácidos grasos libres y la lisofosfatidilcolina resultante se separaron por cromatografía de capa delgada, se. rasparon de la placa y se analizaron por GC. Los resultados se describen en la Figura 5. Es evidente a partir de esto que la posición sn-2 se prefiere por un factor de 20 sobre la posición sn-1. Fue de este modo posible demostrar que la desaturación de la posición C4-C5 tiene lugar para la mayor parte en los ácidos grasos en la posición sn-2.

Ejemplo 9: Extracción de lípido a partir de levaduras y semillas : El efecto de la modificación genética en plantas, hongos, algas, ciliatos o en la producción de un compuesto deseado (tal como ácido graso) puede determinarse cultivando los microorganismos modificados o la planta modificada bajo condiciones adecuadas (tales como aquellas descritas anteriormente) e investigando el medio y/o los componentes celulares para la producción incrementada del producto deseado (es decir de lipidos o de un ácido graso) . Estas técnicas analíticas se conocen por un técnico experimentado y comprende espectroscopia, cromatografía de capa delgada, métodos de tinción de diversos tipos, métodos enzimáticos y microbiológicos, y cromatografía analítica tal como cromatografía líquida de alto rendimiento (véase por ejemplo, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol . A2, pp. 89-90 y pp. 443-613, VCH; Weinheim (1985); Fallón, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Vol. 3, Chapter III: "Product recovery and purification", pp. 469-714, VCH; Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John ífiley and Sons; Kennedy, J.F., y Cabral, J.M.S. (1992) recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., y Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, en: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. B3; Chapter 11, pp. 1-27, VCH: Weinheim, y Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications) . Además de los métodos antes mencionados, se extraen lípidos de plantas a partir del material de la planta como se describe por Cahoon et al. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96 (22) : 12935-12940, y Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145. El análisis del ácido graso o el lípido cuantitativo y cualitativo se describe en Christie, William W. , Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie, Williant W., Gas Chromatography and Lipids . A Practlcal Guide - Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (Oily Press Lipid Library; 1); "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (197.7) bajo el titulo: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN. Además de medir el producto final de la fermentación, es también posible analizar otros componentes de las trayectorias metabólicas utilizadas para producir el compuesto deseado, tal como intermediarios y subproductos, para determinar la eficiencia total de la producción del compuesto. Los métodos analíticos comprenden mediciones de las cantidades de nutrientes en el medio (por ejemplo, azúcares, hidrocarburos, fuentes de nitrógeno, fosfato y otros iones), las mediciones de la composición de biomasa y del crecimiento, el análisis de la producción de los metabolitos usuales de las trayectorias biosintéticas y las mediciones de gases producidos durante la fermentación. Los métodos estándares de estas mediciones se describen en Applied Microbial Physiology; A Practica! Approach, P.M. Rodees y P.F. Stanbury, Editors, IRL Press, pp. 103-129; 131-163 y 165-192 (ISBN: 0199635773) y referencias citadas en la presente . Un ejemplo es el análisis de los ácidos grasos (abreviaturas: FA E, metilésteres del ácido graso; GC-MS, espectrometría de masa de la cromatografía líquida de gas; TAG, triacilglicerol; TLC, cromatografía de capa delgada) . La detección inequívoca de la presencia de los productos del ácido graso analizando los organismos recombinantes por métodos analíticos estándares: GC, GC-MS o TLC como se describe di ersamente por Christie y las referencias en la presente (1997, en: Advances on Lipid Methodology, Fourth edition: Christie, Oily Press, Dundee, 119-169, 1998, Gas chromatography-mass spectrometry methods, Lipide 33:343-353) . El material que se analiza puede desestabilizarse por tratamiento de ultrasonido, moliendo en un molino de vidrio, nitrógeno líquido y moliendo o por otros métodos aplicables. El material debe centrifugarse después de la ruptura. El sedimento se vuelve a suspender en agua destilada, se calienta a 10Q*C durante 10 minutos, se enfría en hielo y de nuevo se centrifuga, seguido por la extracción en 0.5 M de ácido sulfúrico en metanol con 2% de dimetoxipropano a 90 °C durante 1 hora, conduciendo a aceite hidrolizado y los compuestos de lípido que producen lípidos transmetilados . Estos metilésteres del ácido graso se extraen en éter de petróleo y finalmente se someten a un análisis de GC utilizando una columna capilar (Chrompack, Sílice Fundida WCOT, Cera CP-52 CB, 25 mieras, 0.32 mm) con un gradiente de temperatura entre 170°C y 240°C durante 20 minutos y 5 minutos a 240°C. La identidad de los metilésteres del ácido graso resultantes debe definirse por el uso de estándares que son obtenibles a partir de fuentes comerciales (es decir Sigma) . El material de planta se homogenxza inicialmente de manera mecánica moliendo en un mortero para hacerlo más tratable a la extracción. Se calentó entonces a 100°C durante 10 minutos, y después del enfriamiento en hielo, se sedimentó de nuevo. El sedimento celular se hidroliza, y los lipidos se transmetilan, con 1 M de ácido sulfúrico metanólico 1 M y 2% de dimetoxipropano a 90°C durante 1 hora. Los metilésteres del ácido graso resultantes (FAME) se extraen en éter de petróleo. Los FAME extraidos se analizan por cromatografía líquida de gas utilizando una columna capilar (Chrompack, Sílice Fundida WCOT, Cera CP-52 CB, 25 m, 0.32 mm) y un gradiente de temperatura de 170 °C a 240 °C en 20 minutos y 5 minutos a 240°C. La identidad de los metilésteres del ácido graso se confirma por la comparación con los estándares de los FAME apropiados (Sigma) . La identidad y la posición de la doble unión puede analizarse además por derivación química adecuada de las mezclas de FAME, por ejemplo, para dar derivados de 4 , 4-dimetoxioxazolina (Christie, 1998) por medio de GC-MS.

USTA DE SECUENCIA <110> BASF Plant Science (SnbH <120> Delta-4-Desaturasas a partir de Euglina glacilis, que expresan pfentasy aceites que comprenden PUFAS <130> 20030192 <160> 2 <170> -Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 1626 <212> DNA <213> Euglena gracilis <220> <221> CDS <222> (1) .. (1623) <223> Delta-4-Desaturase <400> 1 atg ttg gtg ctg ttt ggc aat ttc tat gtc aag caá tac tcc ca aag 48 Met Leu Val Leu Phe Gly Asn Phe Tyr Val Lys Gln Tyr Ser Gln. Lys 1 5 10 15 aac ggc aag ccg gag aac gga gcc acc cct gag aac gga gcg aag ccg 96 Asn Gly Lys Pro Glu Asn Gly Ala Thr Pro Glu Asn Gly Ala Lys Pro 20 25 30 caá cct tgc gag aac ggc acg gtg gaa aag cga gag aat gac acc gcc 144 Gln Pro Cys Glu Asn Gly Thr Val Glu Lys Arg Glu Asn Asp> Thr Ala 35 40 45 aac gtt cgg ccc acc cgt cea gct gga ccc ccg ccg gcc acg tac tac 192 Asn Val Arg Pro Thr Arg Pro Ala Gly Pro Pro Pro Ala Thr Tyr Tyr 50 55 60 gac tcc ctg gca gtg teg ggg eag ggc aag gag cgg ctg ttc acc acc 2 0 Asp Ser Leu Ala Val Ser Gly Gln Gly Lys Glu Arg Leu Phe Thr Thr 65 70 75 80 gat gag gtg agg cgg cae ate ctc ecc acc gat ggc tgg ctg acg tgc 288 Asp Glu Val Arg Arg His lie Leu Pro Thr Asp Gly Trp Leu Thr Cys 85 90 95 cae gaa gga gtc tac gat gtc act gat ttc ctt gee aag cae cct ggt 336 His Glu Gly Val Tyr Asp Val Thr Asp Phe Leu Ala Lys His Pro Gly 100 105 110 ggc ggt gtc ate acg ctg ggc ctt gga agg gac tgc acá ate ctc ate 384 Gly Gly Val lie Thr Leu Gly Leu Gly Arg As Cys Thr lie Leu lie 115 120 125 gag tea tac cae cct gct ggg cgc ccg gac aag gtg atg gag aag tac 432 Glu Ser Tyr His Pro Ala Gly Arg Pro Asp Lys Val Met Glu Lys Tyr 130 135 140 cgc att ggt acg ctg eag gac ecc aag acg ttc tat gct tgg gga gag 480 Arg lie Gly Thr Leu Gln Asp Pro Lys Thr Phe Tyr Ala Trp Gly Glu 145 150 155 160 tec gat ttc tac cct gag ttg aag cgc cgg gee ctt gca agg ctg aag 528 Ser Asp Phe Tyr Pro Glu Leu Lys Arg Arg Ala Leu Ala Arg Leu Lys 165 X70 175 gag gct ggt cag gcg cgg cgc ggc ggc ctt ggg gtg aag gee ctc ctg 576 Glu Ala Gly Gln Ala Arg Arg Gly Gly &eu Gly Val Lys Ala Lea Leu 180 185 190 gtg ctc acc ctc ttc ttc gtg tcg tgg tac atg tgg gtg gee cae aag 624 Val Leu Thr Leu Phe Phe Val Ser Trp Tyr Met Trp Val Ala His Lys 195 200 205 tec ttc ctc tgg gee gee gtc tgg ggc ttc gee ggc tec cae gtc ggg 672 Ser Phe Leu Trp Ala Ala Val Trp Gly She Ala Gly Ser His Val Gly 210 215 220 ctg age ate cag cae gat ggc aac cae ggc gcg ttc age cgc aac acá 720 Leu Ser lie Gln His Asp Gly Asn His Gly Ala Phe Ser Arg Asa Thr 225 230 235 240 ctg gtg aac cgc ctg gcg ggg tgg ggc atg gac ttg ate ggc gcg tcg 768 Leu Val Asn Arg Leu Ala Gly Trp Gly Met Asp Leu lie Gly Ala Ser 245 250 255 tec acg gtg tgg gag tac cag cae gtc ate ggc cae cae cag tac acc 816 Ser Thr Val Trp Glu Tyr Gln His Val He Gly His His Gln Tyr Thr 260 265 270 aac ctc gtg tcg gac acg cta ttc agt ctg cct gag aac gat ccg gac 864 Asn Leu Val Ser Asp Thr Leu Phe Ser Leu Pro Glu Asn Asp Pro Asp 275 280 285 gtc ttc tcc age tac ccg ctg atg cgc atg cae ccg gat acg grg tgg 912 Val Phe Ser Ser Tyr Pro Leu Met Arg Met His Pro Asp Thr Ala Trp 290 295 300 cag ccg cae cae cgc ttc cag cae ctg ttc gcg ttc cea ctg ttc gee 960 Gln Pro His His Arg Phe Gln His Leu Phe Ala Phe Pro Leu Pie Ala 305 310 315 320 ctg atg ac ate age aag gtg ctg acc age gat ttc gct gtc tg etc 1008 Leu Met Thr lie Ser Lys Val Leu Thr Ser Asp Phe Ala Val C¾s Leu 325 330 335 age atg aag aag ggg tcc ate gac tgc tcc tcc agg etc gtc cea ctg 1056 Ser Met Lys Lys Gly Ser lie Asp Cys Ser Ser Arg Leu Val Ezo Leu 340 345 350 gag ggg cag ctg ctg ttc tgg ggg gee aag ctg gcg aac ttc ctg; ttg 1104 Glu Gly Gln Leu Leu Phe Trp Gly Ala Lys Leu Ala Asn Phe Le* Leu 355 360 365 cag att gtg ttg cea tgc tac etc cae ggg acá gct atg ggc ctff gee 1152 Gln lie Val Leu Pro Cys Tyr Leu His Gly Thr Ala Met Gly Lea Ala 370 375 380 etc ttc tet gtt gct cae ctt gtg teg ggg gag tac etc gcg ats tgc 1200 Leu Phe Ser Val Ala His Leu Val Ser Gly Glu Tyr Leu Ala lie Cys 385 390 395 400 ttc ate ate aac cae ate age gag tet tgt gag ttt atg aat acá age 1248 Phe He lie Asn His lie Ser Glu Ser Cys Glu Phe Met Asn Thr Ser 405 410 435 ttt caá acc gee gee cgg agg acá gag atg ctt cag gca gca cae cag 1296 Phe Gln Thr Ala Ala Arg Arg Thr Glu Met Leu Gln Ala Ala His Gln. 420 425 430 gca gcg gag gee aag aag gtg aag ecc acc ect cea ccg aac gat tgg 1344 Ala Ala Glu Ala Lys Lys Val Lys Pro Thr Pro Pro Pro Asn Asa Trp 435 440 445 gct gtg acá cag gtc caá tgc tgc gtg aat tgg aga tea ggt ggc gtg 1392 Ala Val Thr Gln Val Gln Cys Cys Val Asn Trp Arg Ser Gly Gil Val 4S0 455 460 ttg gee aat cae etc tet gga ggc ttg aac cae cag ate gag cat cat 1440 Leu Ala Asn His Leu Ser Gly Gly Leu Asn His Gln lie Glu His His 465 470 475 48Q ctg ttc ecc age ate teg cat gee aac tac ecc acc ate gee ect gtt 1488 Leu Phe Pro Ser lie Ser His Ala Asn Tyr Pro Thr lie Ala Pro Val 485 490 495 gtg aag gag gtg tgc gag gag tac ggg ttg ccg tac aag aat tac gtc 1536 Val Lys Glu Val Cys Glu Glu Tyr Gly Leu Pro Tyr Lys Asn Tyr Val 500 505 510 acg Ctc Cgg gat gca gtc tgt ggc atg gtt cag cac ctc cgg £tg acg 1584 Thr Phe Trp Asp Ala Val cys Gly et Val Gln His Leu Arg leu Met 515 520 525 ggc gct cea ceg gtg cea acg aac ggg gac aaa aag cea aá 1626 Gly Ala Pro Pro Val Pro Thr Asn Gly Asp Lys Lys Ser 530 535 540 <210> <211> <212> <213> Euglena gracilis <400> 2 MeC Leu Val Leu Phe Gly Asn Phe Tyr Val Lys Gln Tyr Ser Gln Lys 1 5 10 15 Asn Gly Lys Pro Glu Asn Gly Ala Thr Pro Glu Asn Gly Ala Lys Pro 20 25 30 Gln Pro Cys Glu Asn Gly Thr Val Glu Lys Arg Glu Asn Asp Ha Ala 35 40 45 Asn Val Arg Pro Thr Arg Pro Ala Gly Pro Pro Pro Ala Thr Tyr Tyr 50 55 60 Asp Ser Leu Ala Val Ser Gly Gln Gly Lys Glu Arg Leu Phe Thr Thr 65 70 . 75 80 Asp Glu Val Arg Arg His lie Leu Pro Thr Asp Gly Trp Leu Títr Cys 85 90 95 His Glu Gly Val Tyr Asp Val Thr Asp Phe Leu Ala Lys His Pro Gly 100 105 110 Gly Gly Val lie Thr Leu Gly Leu Gly Arg Asp Cys Thr lie Leu. He 115 120 125 Glu Ser Tyr His Pro Ala Gly Arg Pro Asp Lys Val Met Glu Lys Tyr 130 135 140 Arg lie Gly Thr Leu Gln Asp Pro Lys Thr Phe Tyr Ala ?e? Gly Glu 145 150 155 160 Ser Asp Phe Tyr Pro Glu Leu Lys Arg Arg Ala Leu Ala AJKJ Leu Lys 165 170 175 Glu Ala Gly Gln Ala Arg Arg Gly Gly Leu Gly Val Lys Ma. Leu Leu 180 185 1?0 Val Leu Thr Leu Phe Phe Val Ser Trp Tyr Met Trp Val Alia. His Lys 195 200 205 Ser Phe Leu Trp Ala Ala Val Trp Gly Phe Ala Gly Ser H2s Val Gly 210 215 220 Leu Ser lie Gln His Asp Gly Asn His Gly Ala Phe Ser Arg Asn Thr 225 230 235 240 Leu Val Asn Arg Leu Ala Gly Trp Gly Met Asp Leu He G2Ly Ala Ser 245 250 255 Ser Thr Val Trp Glu Tyr Gln His Val lie Gly His His Gln Tyr Thr 260 265 2¾0 Asn Leu Val Ser Asp Thr Leu Phe Ser Leu Pro Glu Asn Asp- Pro Asp 275 290 285 Val Phe Ser Ser Tyr Pro Leu Met Arg Met His Pro Asp TJsr Ala Trp 290 295 300 Gln Pro His His Arg Phe Gln His Leu Phe Ala Phe Pro LES Phe Ala 305 310 315 320 Leu Met Thr lie Ser Lys Val Leu Thr Ser Asp Phe Ala Val Cys Leu 325 330 335 Ser Met Lys Lys Gly Ser lie Asp Cys Ser Ser Arg Leu Val Pro Leu 340 345 350 Glu Gly Gln Leu Leu Phe Trp Gly Ala Lys Leu Ala Asn Phe Leu Leu 355 360 365 Gln lie Val Leu Pro Cys Tyr Leu His Gly Thr Ala Met Gly Leu Ala 370 375 380 Leu Phe Ser Val Ala His Leu Val Ser Gly Glu Tyr Leu Ala lie Cys 385 390 395 400 Phe lie lie Asn His lie Ser Glu Ser Cys Glu Phe Met Asn Thr Ser 405 410 415 Phe Gln Thr Ala Ala Arg Arg Thr Glu Met Leu Gln Ala Ala His Gln 420 425 430 Ala Ala Glu Ala Lys Lys Val Lys Pro Thr Pro Pro Pro Asn Asp Trp 435 440 445 Ala Val Thr Gln Val Gln Cys Cys Val Asn Trp Arg Ser Gly Gly Val 450 455 460 Leu Ala Asn His Leu Ser Gly Gly Leu Asn His Gln lie Glu His His 465 470 475 480 Leu Phe Pro Ser lie Ser His Ala Asn Tyr Pro Thr lie Ala Pro Val 485 490 495 Val Lys Glu Val Cys Glu Glu Tyr Gly Leu Pro Tyr Lys Asn Tyr Val 500 505 510 Thr Phe Trp Asp Ala Val Cys Gly Met Val Gln His Leu Arg Leu Met 515 520 525 Gly Ala Pro Pro Val Pro Thr Asn Gly Asp Lys Lys Ser 530 535 540

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES 1. Una secuencia de ácido nucleico aislada, la cual codifica para los polipéptidos que tienen actividad ?-4- desaturasa, seleccionada del grupo: a) de una secuencia del ácido nucleico que tiene la secuencia descrita en la SEC. DE IDENT. 130. : 1, b) las -secuencias del ácido nucleico que, como un resultado de la degeneración del código genético, pueden derivarse de la secuencia de codificación comprendida en la SEC. DE IDENT. NO. : 1, o c) los derivados de la secuencia del ácido nucleico descritos en la SEC. DE IDENT. NO. : 1, que codifica para polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácido descritas en la SEC. DE IDENT. NO. : 2, y tiene al menos 40% de homología en el nivel de aminoácido con la SEC. DE IDENT. NO. : 2 y tienen una actividad ?-4-desaturasa.
2. 2. La secuencia del ácido nucleico aislada, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia se deriva de una planta.
3. 3. La secuencia del ácido nucleico aislada, de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde la secuencia se deriva de la clase de Euglenophyceae.
4. 4. Una secuencia del aminoácido la cual se codifica por una secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 83
5. 5. Una construcción genética que comprende un ácido nucleico aislado de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el ácido nucleico se conecta funcionalmente a una o más señales reguladoras.
6. 6. La construcción genética de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la construcción del ácido nucleico comprende genes de biosíntesis adicionales del ácido graso o el metabolismo de lipido seleccionado del grupo de la o las acil-CoA deshidrogenasas, la o las acil-ACP [= proteina portadora de acilo] desaturasas, la o las acil-ACP tioesterasas, la o las aciltransferasas del ácido graso, la o las acil-CoA: lisofosfolipido aciltransferasas, la o las sintasas del ácido graso, la o las hidroxilasas del ácido graso, la o las acetil-coenzima A carboxilasas, la o las acil-coenzima A oxidasas, la o las desaturasas del ácido graso, acetilenasas del ácido graso, lipoxigenasas, triacilglicerol lipasas, alenóxido sintasas, hidroxiperóxido liasas o la o las elongasas del ácido graso.
7. 7. La construcción, genética de acuerdo con la reivindicación 5 6 6, en donde la construcción del ácido nucleico comprende genes de biosíntesis adicionales del ácido graso o el metabolismo de lipido seleccionados del grupo de ?-4-desaturasa, ?-5-desaturasa, ?-6-desaturasa, ?-8-desaturasa, ?-9-desaturasa, ?-12-desaturasa, ?-5-elongasa, ?-6-elongasa o ?-9-elongasa .
8. 8. Un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 3, o una construcción genética de acuerdo con la reivindicación 5.
9. 9. Un organismo no humano transgénico que comprende al menos un ácido nucleico de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 3, una construcción genética de acuerdo con la reivindicación 5 o un vector de acuerdo con la reivindicación 8.
10. 10. El organismo no humano transgénico de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el organismo es un microorganismo, un animal no humano o una planta.
11. 11. El organismo no humano transgénico de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, en donde el organismo es una planta.
12. 12. Un proceso para producir ácidos grasos poliinsaturados, en donde el proceso comprende el cultivo de un organismo transgénico el cual comprende un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, una construcción genética de acuerdo con la reivindicación 5 o un vector de acuerdo con la reivindicación 8, que codifica una ?-4-desaturasa, la cual desatura específicamente ácidos ?-3-grasos, y en donde los ácidos grasos poliinsaturados que tienen un contenido incrementado de ácidos ?-3-grasos se forman en el organismo a través de la actividad de la ?-4-desaturasa. 85
13. 13. El proceso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el ácido docosahexaenoico se produce en el proceso.
14. 14. El proceso de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, en donde las moléculas del ácido graso poliinsaturadas se aislan desde el organismo en la forma de un aceite, un lipido o un ácido graso libre.
15. 15. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde el organismo es un microorganismo, un animal no humano o una planta.
16. 16. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en donde el organismo es una planta transgénica.
17. 17. Un aceite, lipidos o ácidos grasos o una fracción de los mismos producidas por el proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16.
18. 18. Una composición de aceite, lipido o ácido graso la cual comprende PUFAS producidas, por un proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, y se deriva de plantas transgénicas .
19. 19. El uso de aceite, lipidos o ácidos grasos de acuerdo con la reivindicación 17 o la composición de aceite, lipido o ácido graso de acuerdo con la reivindicación 18, en piensos, alimento humano, cosméticos o farmacéuticos.