WO2024175105A1

WO2024175105A1 - 一种fap/cd40结合分子的药物组合物及其医药用途

Info

Publication number: WO2024175105A1
Application number: PCT/CN2024/078357
Authority: WO
Inventors: 吴慧; 闫艺洁; 赵志龙; 李磊
Original assignee: 上海迈晋生物医药科技有限公司
Priority date: 2023-02-24
Filing date: 2024-02-23
Publication date: 2024-08-29

Abstract

一种FAP/CD40结合分子的药物组合物及其医药用途。具体地，药物组合物包含FAP/CD40结合分子和缓冲剂。药物组合物具有良好的生物活性和稳定性。

Description

一种FAP/CD40结合分子的药物组合物及其医药用途

本公开要求2023年02月24日提交的中国专利申请202310174524.1的优先权，前述专利申请的全部内容通过引用并入本公开。

技术领域

本公开涉及药物制剂领域，具体涉及一种包含FAP/CD40结合分子的药物组合物，及其药物用途。

背景技术

CD40(TNFRSF5)是一种跨膜磷酸化糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRS)成员。CD40在多种细胞类型中表达，包括B细胞、滤泡树突细胞(DC)、上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞和肿瘤细胞。其配体CD40L主要表达在激活的T细胞、激活的B细胞、血小板和平滑肌细胞等。CD40L结合使CD40多聚化，产生下游激活、生长和分化信号。CD40信号转导激活多种下游信号通路，如NF-κB、MAPK和STAT3(Pype S,et al.J Biol Chem.2000 Jun.16；275(24):1858693)，这些途径通过调节激活蛋白c-Jun、ATF2和Rel转录因子来调节基因表达。CD40与CD40L结合诱导静息B细胞增殖，免疫球蛋白转换，抗体分泌，并在组织生发中心发育和B细胞存活发挥重要作用，所有这些对于体液免疫反应是必不可少的(Kehry M R.J Immunol 1996；156:2345-2348)。CD40L与DC上的CD40结合，诱导DC成熟，表现为共刺激因子B7家族(CD80，CD86)的表达上调和促炎细胞因子如白细胞介素12(IL-12)的分泌增加。CD40和CD40L相互作用为T细胞激活提供共刺激信号，并促进DC细胞递呈抗原给T细胞。

随着以CD40、CTLA-4和PD-L1为靶点的免疫检查点抑制(ICI)疗法在肿瘤治疗中取得的临床胜利，免疫治疗已成为第三代肿瘤治疗中最令人期待的研究领域。其中通过激活CD40从而增加DC细胞对T细胞的抗原递呈及激活为机制的抗肿瘤免疫疗法已展示出临床有效性。但是，CD40存在系统性激活，这会导致一些靶点特异的毒性，如细胞因子风暴、肝毒性、血液毒性以及外周CD40激活导致的静脉血栓。这些毒性限制了CD40激动型抗体的治疗窗口。Pfizer公司的CD40激动剂CP-870、893和Medimmune公司的CD40L-Fc融合蛋白MEDI5083(AstraZeneca公司的可激活CD40信号通路的新型融合蛋白，由3个串联的CD40L与IgG4-Fc的融合蛋白)先后终止了临床研究。因此。在第二代CD40激动剂抗体的研发中，研究者期望通过肿瘤抗原(Tumor-associated antigen，TAA)介导CD40激活，使得CD40在肿瘤内部特异性激活，同时降低外周CD40的激活，从而提高CD40激动型抗体的治疗窗。

成纤维细胞活化蛋白FAP(fibroblast activation protein)α是肿瘤相关抗原，FAP在健康成年人的正常组织中表达量较低，选择性地表达在93％的肿瘤组织中，其中30％为高表达，例如结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌和口腔鳞癌。WO2023025194提供了一种抗FAP抗体、抗CD40抗体及两者的双特异性抗体，所述双特异性抗体能通过FAP介导针对肿瘤特异性的CD40激活，对APC(例如树突细胞DC)具有促成熟、激活作用，能去除肝毒性、外周血液毒性及其它外周毒性，具有优良的给药窗口和成药性。

抗体药物其分子量大，结构复杂，容易降解、聚合或发生不希望发生的化学修饰等而变得不稳定。为了使抗体适合于给药，并且在储存及随后使用过程中能保持稳定性，发挥更好的效果，抗体药物的稳定制剂研究显得尤为重要。对于新的FAP/CD40结合分子，仍需要研制合适的药物组合物。

发明内容

本公开提供了一种含FAP/CD40结合分子的药物组合物，该组合物具有优异的稳定性。

本公开提供了一种药物组合物，其包含FAP/CD40结合分子和缓冲剂，其中所述缓冲剂选自醋酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、组氨酸盐缓冲剂或磷酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，所述缓冲剂为组氨酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，所述缓冲剂为组氨酸-盐酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，所述缓冲剂为组氨酸-醋酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，所述缓冲剂为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂。在一些实施方案中，所述缓冲剂为组氨酸-醋酸缓冲剂。

在一些实施方案中，所述FAP/CD40结合分子包含特异性结合FAP的第一抗原结合结构域和特异性结合CD40的第二抗原结合结构域，所述特异性结合CD40的第二抗原结合结构域包含(至少一个)免疫球蛋白单一可变结构域。

一些实施方案中，所述FAP/CD40结合分子包含一个特异性结合CD40的免疫球蛋白单一可变结构域。在另一些实施方案中，所述FAP/CD40结合分子包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个特异性结合CD40的免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域可以是相同的或不同的。

一些实施方案中，所述FAP/CD40结合分子包含至少一个(例如2、3、4个)特异性结合FAP的抗原结合结构域。

一些实施方案中，所述FAP/CD40结合分子中，特异性结合CD40的免疫球蛋白单一可变结构域包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:12、13、14所示。

一些实施方案中，前述FAP/CD40结合分子中，所述特异性结合CD40的免疫球蛋白单一可变结构域包含或如SEQ ID NO:11、16至19任一所示，或与SEQ ID NO:23、35至38任一具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的序列同一性。

一些实施方案中，所述FAP/CD40结合分子包含特异性结合FAP的第一抗原结合结构域和特异性结合CD40的第二抗原结合结构域，所述特异性结合FAP的第一抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中：

1)HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、4、5所示；LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、7、8所示，或者2)HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、4、5所示；LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、32、8所示。

一些实施方案中，前述FAP/CD40结合分子中，所述特异性结合FAP的第一抗原结合结构域的重链可变区包含如SEQ ID NO：1所示或与之具有至少80％同一性的氨基酸序列，轻链可变区包含如SEQ ID NO：2所示或与之具有至少80％同一性的氨基酸序列。

一些实施方案中，所述FAP/CD40结合分子还包含人免疫球蛋白Fc区(例如人IgG1或IgG4的Fc区)。

一些实施方案中，前述FAP/CD40结合分子中，所述特异性结合FAP的第一抗原结合结构域包含重链(HC)和轻链(LC)；

例如，重链为IgG1或IgG4同种型，轻链为Kappa同种型。

一些具体实施方案中，重链为SEQ ID NO：24所示或与之具有至少80％同一性的氨基酸序列，轻链为SEQ ID NO：25所示或与之具有至少80％同一性的氨基酸序列。

一些实施方案中，前述FAP/CD40结合分子中，所述特异性结合FAP的第一抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，其中：

所述特异性结合CD40的第二抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合FAP的第一抗原结合结构域的重链可变区的N端；

所述特异性结合CD40的第二抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合FAP的第一抗原结合结构域的重链可变区的C端；

所述特异性结合CD40的第二抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合FAP的第一抗原结合结构域的轻链可变区的N端；和/或

所述特异性结合CD40的第二抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合FAP的第一抗原结合结构域的轻链可变区的C端。

一些实施方案中，前述特异性结合CD40的第二抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域与特异性结合FAP的第一抗原结合结构域直接或通过连接子相连接；例如，所述连接子为具有如(G₄S)_x所示的氨基酸序列，其中，x独立地选自1-20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；例如，所述连接子为(G₄S)₂、(G₄S)₃、(G₄S)₄所示的氨基酸序列。

一些实施方案中，前述FAP/CD40结合分子中，特异性结合CD40的第二抗原结合结构域为多价(例如，一个前述FAP/CD40结合分子中含有1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10个特异性结合CD40的第二抗原结合结构域)。一些具体实施方案中，特异性结合CD40的第二抗原结合结构域为二价、四价或六价。一些具体实施方案中，特异性结合CD40的第二抗原结合结构域包含2、3、4、5或6个所述免疫球蛋白单一可变结构域。

一些实施方案中，所述的FAP/CD40结合分子包含第一多肽链和第二多肽链，其中，第一多肽链包含如SEQ ID NO：21-23中任一所示或与之具有至少80％同一性的氨基酸序列，第二多肽链包含如SEQ ID NO：20所示或与之具有至少80％同一性的氨基酸序列。一些具体实施方案中，所述FAP/CD40结合分子中包含两条第一多肽链和两条第二多肽链；一些具体实施方案中，所述两条第一多肽链是相同的，所述两条第二多肽链是相同的。

一些实施方案中，前述FAP/CD40结合分子能够抑制肿瘤生长(例如体积增大、瘤重增加)和/或转移(例如多器官或多组织转移、远端转移)至少约10％，例如至少约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％。

一些实施方案中，前述FAP/CD40结合分子为抗FAP/CD40双特异性抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段包括但不限于：Fab、Fv、sFv、Fab’、F(ab’)₂、线性抗体、单链抗体、scFv、sdAb、sdFv、纳米抗体、肽抗体(peptibody)、结构域抗体和多特异性抗体(双特异性抗体、diabody、triabody和tetrabody、串联二-scFv、串联三-scFv)，例如为scFv、Fv、Fab或Fab’片段。

一些实施方案中，抗FAP/CD40双特异性抗体含有前述的特异性结合CD40的第二抗原结合结构域中的免疫球蛋白单一可变结构域，和前述的特异性结合FAP的第一抗原结合结构域中的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。

一些实施方案中，抗FAP/CD40双特异性抗体中：

特异性结合FAP的第一抗原结合结构域为第一抗体，其包括重链(HC)和轻链(LC)；和

特异性结合CD40的第二抗原结合结构域为第二抗体，其是VHH，具有前述CD40结合分子中的CDR1、CDR2、CDR3。

一些具体实施方案中，所述VHH作为第二抗体位于第一抗体的重链或轻链的N端和/或C端。

一些具体实施方案中，抗FAP/CD40双特异性抗体包含1个第一抗体和1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个(例如2个、4个、6个)VHH的第二抗体；所述第一抗体包括两条HC和两条LC，第一抗体的一条HC的VH与一条LC的VL形成抗原结合部位，另一条HC的VH与另一条LC的VL形成抗原结合部位。

一些具体实施方案中，抗FAP/CD40双特异性抗体或其抗原结合片段的第一抗体可以连接有1、2、3、4、5、6、7、8个VHH的第二抗体，所述VHH的第二抗体可以是相同的或不同的，可以均连接在第一抗体的重链N端，或均连接在第一抗体的重链C端，或均连接在第一抗体的轻链N端，或均连接在第一抗体的轻链C端，或重链N端、重链C端、轻链N端、轻链C端的任意组合。

一些具体实施方案中，抗FAP/CD40双特异性抗体包含第一多肽链和第二多肽链：

(i)第一多肽链从N端至C端为：[第一抗体的重链]-接头1-[第二抗体]；第二多肽链为第一抗体的轻链；

(ii)第一多肽链从N端至C端为：[第一抗体的重链]-接头1-[第二抗体]₁-接头2-[第二抗体]₂；第二多肽链为第一抗体的轻链；

(iii)第一多肽链从N端至C端为：[第一抗体的重链]-接头1-[第二抗体]₁-接头2-[第二抗体]₂-接头3-[第二抗体]₃；第二多肽链为第一抗体的轻链；

(iv)第一多肽链从N端至C端为：[第二抗体]-接头1-[第一抗体的重链]；第二多肽链为第一抗体的轻链；

(v)第一多肽链从N端至C端为：[第二抗体]₂-接头2-[第二抗体]₁-接头1-[第一抗体的重链]；第二多肽链为第一抗体的轻链；

(vi)第一多肽链从N端至C端为：[第二抗体]₃-接头3-[第二抗体]₂-接头2-[第二抗体]₁-接头1-[第一抗体的重链]；第二多肽链为第一抗体的轻链；

(vii)第一多肽链从N端至C端为：[第二抗体]₁-接头1-[第一抗体的重链]-接头2-[第二抗体]₂；第二多肽链为第一抗体的轻链；

(viii)第一多肽链从N端至C端为：[第二抗体]₁-接头1-[第二抗体]₂-接头2-[第一抗体的重链]-接头3-[第二抗体]₃；第二多肽链为第一抗体的轻链；

(ix)第一多肽链从N端至C端为：[第二抗体]₁-接头1-[第一抗体的重链]-接头2-[第二抗体]₂-接头3-[第二抗体]₃；第二多肽链为第一抗体的轻链；

其中，[第二抗体]₁、[第二抗体]₂、[第二抗体]₃可以相同或不同。

一些实施方案中，前述抗FAP/CD40双特异性抗体中的VHH的第二抗体直接或通过连接子与第一抗体连接。所述连接子(接头)选自：如(G_mS_n)_x或(GGNGT)_x或(YGNGT)_x所示的氨基酸序列，其中m、n各自独立地选自1-8的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)，x独立地选自1-20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。例如，连接子为G₄S、(G₄S)₂、(G₄S)₃、(G₄S)₄、(G₄S)₅、(G₄S)₆所示的氨基酸序列。一些实施方案中，接头1、接头2、接头3可以相同或不同。

一些实施方案中，抗FAP/CD40双特异性抗体的第一抗体的重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)，轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。第一抗体可以为全长抗体。

一些实施方案中，抗FAP/CD40双特异性抗体第一抗体的重链为IgG同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，例如为IgG1同种型；和/或，所述第一抗体的轻链为Kappa同种型。

一些实施方案中，抗FAP/CD40双特异性抗体的两条HC包含相同的CDR和 /或两条LC包含相同的CDR。一些具体实施方案中，第一抗体的两条HC包含相同的VH和/或两条LC包含相同的VL。一些具体实施方案中，第一抗体的两条HC具有相同的氨基酸序列和/或两条LC具有相同的氨基酸序列。

一些实施方案中，抗FAP/CD40双特异性抗体两个VHH的第二抗体具有相同或不相同的氨基酸序列。例如，两个所述VHH的第二抗体具有相同的氨基酸序列。

一些实施方案中，抗FAP/CD40双特异性抗体包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，其中对于每条多肽链：a)第一多肽链各自独立地包含VHH的第二抗体和第一抗体的重链(HC)；和b)第二多肽链各自独立地包含第一抗体的轻链(LC)；其中，VHH通过接头与第二抗体的HC的N端和/或C端相连；

或者，i)第一多肽链各自独立地包含第一抗体的重链(HC)；和ii)第二多肽链各自独立地包含VHH的第二抗体和第一抗体的轻链(LC)；其中，VHH直接或通过连接子与第一抗体的LC的N端和/或C端相连。

一些具体实施方案中，抗FAP/CD40双特异性抗体包含两条相同的第一多肽链和两条相同的第二多肽链。

一些实施方案中，所述FAP/CD40结合分子或抗FAP/CD40双特异性抗体的Fc区引入突变。所述突变例如是使得IgG的Fc效应器功能去除或降低的突变，包括但不限于：IgG1的N297A或D265A/N297A，或IgG1上的L234A/L235A、L234A/L235A/P329G、L234E、L234F、L234E/L235F、L234E/L235F/P329G，IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S，IgG4上的F234A/L235A，IgG4上的S228P/F234A/L235A，IgG2或IgG4上的N297A，IgG2上的V234A/G237A，IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M，IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S，IgG1上的S267E/L328F，IgG1上的L234F/L235E/D265A，IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S，IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S。

在本文中Fc区所包含的突变的上下文中，“/”表示“和”，例如，“D265A/N297A”表示“D265A和N297A”，即，Fc中包含D265A和N297A突变；突变的氨基酸位置是根据EU编号系统编号的。

一些实施方案中，前述FAP/CD40结合分子或抗FAP/CD40双特异性抗体具有如下的一项或多项特征：

(a)以≤10^-7的K_D值与人FAP或其表位结合；

(b)以≤10^-7的K_D值与人CD40或其表位结合；

(c)诱导CD40表达性抗原呈递细胞(APC)的免疫刺激；

(d)增加APC(例如树突细胞)的活化，和/或促进APC(例如树突细胞)的增殖；

(e)刺激肿瘤特异性T细胞应答；

(f)引起或促进肿瘤细胞的凋亡；和/或

(g)抑制肿瘤生长和/或转移。

在一些实施方案中，药物组合物中FAP/CD40结合分子的浓度为0.01mg/mL-500mg/mL，例如0.05mg/mL-450mg/mL、0.05mg/mL-400mg/mL、0.05mg/mL-350mg/mL、0.05mg/mL-300mg/mL、0.05mg/mL-250mg/mL、0.05mg/mL-200mg/mL、0.05mg/mL-150mg/mL、0.05mg/mL-140mg/mL、0.05mg/mL-130mg/mL、0.05mg/mL-120mg/mL、0.05mg/mL-110mg/mL、0.05mg/mL-100mg/mL、0.1mg/mL-400mg/mL、0.1mg/mL-350mg/mL、0.1mg/mL-300mg/mL、0.1mg/mL-250mg/mL、0.1mg/mL-200mg/mL、0.1mg/mL-150mg/mL、0.1mg/mL-140mg/mL、0.1mg/mL-130mg/mL、0.1mg/mL-120mg/mL、0.1mg/mL-110mg/mL、0.1mg/mL-100mg/mL、0.5mg/mL-350mg/mL、0.5mg/mL-300mg/mL、0.5mg/mL-250mg/mL、0.5mg/mL-200mg/mL、0.5mg/mL-150mg/mL、0.5mg/mL-140mg/mL、0.5mg/mL-130mg/mL、0.5mg/mL-120mg/mL、0.5mg/mL-110mg/mL、0.5mg/mL-100mg/mL、1mg/mL-300mg/mL、1mg/mL-250mg/mL、1mg/mL-200mg/mL、1mg/mL-150mg/mL、1mg/mL-140mg/mL、1mg/mL-130mg/mL、1mg/mL-120mg/mL、1mg/mL-110mg/mL、1mg/mL-100mg/mL、1mg/mL-95mg/mL、1mg/mL-90mg/mL、1mg/mL-85mg/mL、1mg/mL-80mg/mL、1mg/mL-75mg/mL、1mg/mL-70mg/mL、1mg/mL-65mg/mL、1mg/mL-60mg/mL、1mg/mL-55mg/mL、1mg/mL-50mg/mL、1mg/mL-45mg/mL、1mg/mL-40mg/mL、1mg/mL-35mg/mL、1mg/mL-30mg/mL、1mg/mL-25mg/mL、1mg/mL-20mg/mL、1mg/mL-15mg/mL、5mg/mL-90mg/mL、5mg/mL-85mg/mL、5mg/mL-80mg/mL、5mg/mL-75mg/mL、5mg/mL-70mg/mL、5mg/mL-65mg/mL、5mg/mL-60mg/mL、5mg/mL-55mg/mL、5mg/mL-50mg/mL、5mg/mL-45mg/mL、5mg/mL-40mg/mL、5mg/mL-35mg/mL、5mg/mL-30mg/mL、5mg/mL-25mg/mL、5mg/mL-20mg/mL、5mg/mL-15mg/mL、8mg/mL-12mg/mL、30mg/mL-250mg/mL、30mg/mL-200mg/mL、30mg/mL-190mg/mL、30mg/mL-180mg/mL、30mg/mL-170mg/mL、30mg/mL-160mg/mL、30mg/mL-150mg/mL、30mg/mL-140mg/mL、30mg/mL-130mg/mL、30mg/mL-120mg/mL、30mg/mL-110mg/mL、30mg/mL-100mg/mL、50mg/mL-200mg/mL、50mg/mL-190mg/mL、50mg/mL-180mg/mL、50mg/mL-170mg/mL、50mg/mL-160mg/mL、50mg/mL-150mg/mL、50mg/mL-140mg/mL、50mg/mL-130mg/mL、50mg/mL-120mg/mL、50mg/mL-110mg/mL、50mg/mL-100mg/mL、70mg/mL-180mg/mL、70mg/mL-170mg/mL、70mg/mL-160mg/mL、70mg/mL-150mg/mL、70mg/mL-140mg/mL、70mg/mL-130mg/mL、70mg/mL-120mg/mL、70mg/mL-110mg/mL、70mg/mL-100mg/mL、90mg/mL-110mg/mL、95mg/mL-105mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中FAP/CD40结合分子的浓度为0.1mg/mL-400mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中FAP/CD40结合分子的浓度为0.5mg/mL-200mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中FAP/CD40结合分子的浓度为1mg/mL-150mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中FAP/CD40结合分子的浓度为5mg/mL-45mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中FAP/CD40 结合分子的浓度为50mg/mL-110mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中FAP/CD40结合分子的浓度为约1mg/mL、约5mg/mL、约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约40mg/mL、约45mg/mL、约50mg/mL、约55mg/mL、约60mg/mL、约70mg/mL、约75mg/mL、约80mg/mL、约85mg/mL、约90mg/mL、约95mg/mL或者约100mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中FAP/CD40结合分子的浓度为约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或者约100mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中FAP/CD40结合分子的浓度为约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约25mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中FAP/CD40结合分子的浓度为约50mg/mL、约80mg/mL或者约100mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中FAP/CD40结合分子的浓度为至少500mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中FAP/CD40结合分子的浓度为至少450mg/mL、至少400mg/mL、至少350mg/mL、至少300mg/mL、至少250mg/mL、至少200mg/mL、至少150mg/mL、至少100mg/mL、至少50mg/mL、至少10mg/mL、至少1mg/mL、至少0.1mg/mL或者至少0.01mg/mL。

在一些实施方案中，药物组合物中缓冲剂的浓度为0.1mM-50mM，例如0.1mM-45mM、0.1mM-40mM、0.1mM-35mM、0.1mM-30mM、0.1mM-25mM、0.1mM-20mM、0.1mM-15mM、0.1mM-10mM、0.5mM-45mM、0.5mM-40mM、0.5mM-35mM、0.5mM-30mM、0.5mM-25mM、0.5mM-20mM、0.5mM-15mM、0.5mM-10mM、1mM-40mM、1mM-35mM、1mM-30mM、1mM-25mM、1mM-20mM、1mM-15mM、1mM-10mM、5mM-35mM、5mM-30mM、5mM-25mM、5mM-20mM、5mM-15mM、5mM-10mM、8mM-30mM、8mM-25mM、8mM-20mM、8mM-15mM、8mM-12mM。在一些实施方案中，药物组合物中缓冲剂的浓度为0.5mM-40mM。在一些实施方案中，药物组合物中缓冲剂的浓度为1mM-30mM。在一些实施方案中，药物组合物中缓冲剂的浓度为5mM-20mM。在一些实施方案中，药物组合物中缓冲剂的浓度为约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM或者约30mM。在一些实施方案中，药物组合物中缓冲剂的浓度为约10mM。在一些实施方案中，药物组合物中缓冲剂的浓度为至少50mM。在一些实施方案中，药物组合物中缓冲剂的浓度为至少10mM。

在一些实施方案中，药物组合物还包含表面活性剂。在一些实施方案中，所述表面活性剂选自聚山梨酯和泊洛沙姆中的一种或多种。在一些实施方案中，所述聚山梨酯选自聚山梨酯20和聚山梨酯80中的一种或多种。在一些实施方案中，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188。在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯。在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯80。

在一些实施方案中，药物组合物中表面活性剂的浓度为0.01mg/mL-10mg/mL，例如0.01mg/mL-9mg/mL、0.01mg/mL-8mg/mL、0.01mg/mL-7mg/mL、0.01mg/mL-6mg/mL、0.01mg/mL-5mg/mL、0.01mg/mL-4mg/mL、0.01mg/mL-3mg/mL、0.01mg/mL-2mg/mL、0.01mg/mL-1mg/mL、0.01mg/mL-0.5mg/mL、0.05mg/mL-8mg/mL、0.05mg/mL-7mg/mL、0.05mg/mL-6mg/mL、0.05mg/mL-5mg/mL、0.05mg/mL-4mg/mL、0.05mg/mL-3mg/mL、0.05mg/mL-2mg/mL、0.05mg/mL-1mg/mL、0.05mg/mL-0.5mg/mL、0.1mg/mL-6mg/mL、0.1mg/mL-5mg/mL、0.1mg/mL-4mg/mL、0.1mg/mL-3mg/mL、0.1mg/mL-2mg/mL、0.1mg/mL-1mg/mL、0.1mg/mL-0.5mg/mL、0.2mg/mL-5mg/mL、0.2mg/mL-4.5mg/mL、0.2mg/mL-4mg/mL、0.2mg/mL-3.5mg/mL、0.2mg/mL-3mg/mL、0.2mg/mL-2.5mg/mL、0.2mg/mL-2mg/mL、0.2mg/mL-1.5mg/mL、0.2mg/mL-1mg/mL、0.2mg/mL-0.5mg/mL、0.3mg/mL-4.5mg/mL、0.3mg/mL-4mg/mL、0.3mg/mL-3.5mg/mL、0.3mg/mL-3mg/mL、0.3mg/mL-2.5mg/mL、0.3mg/mL-2mg/mL、0.3mg/mL-1.5mg/mL、0.3mg/mL-1mg/mL、0.3mg/mL-0.5mg/mL、0.7mg/mL-3.5mg/mL、0.7mg/mL-3mg/mL、0.7mg/mL-2.5mg/mL、0.7mg/mL-2mg/mL、0.7mg/mL-1.5mg/mL、0.7mg/mL-1mg/mL、0.7mg/mL-0.9mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中表面活性剂的浓度为0.05mg/mL-5mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中表面活性剂的浓度为0.1mg/mL-3mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中表面活性剂的浓度为0.2mg/mL-2mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中表面活性剂的浓度为约0.1mg/mL、约0.2mg/mL、约0.3mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.6mg/mL、约0.7mg/mL、约0.8mg/mL、约0.9mg/mL、约1mg/mL、约1.1mg/mL、约1.2mg/mL、约1.3mg/mL、约1.4mg/mL、约1.5mg/mL、约1.6mg/mL、约1.7mg/mL、约1.8mg/mL、约1.9mg/mL或者约2mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中表面活性剂的浓度为约0.2mg/mL、约0.4mg/mL、约0.6mg/mL或者约0.8mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中表面活性剂的浓度为约0.4mg/mL、约0.6mg/mL或者约0.8mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中表面活性剂的浓度为约0.4mg/mL或者约0.6mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中表面活性剂的浓度为约0.4mg/mL或者约0.8mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中表面活性剂的浓度为至少10mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中表面活性剂的浓度为至少0.4mg/mL、至少0.6mg/mL或者至少0.8mg/mL。

在一些实施方案中，药物组合物还包含糖类。在一些实施方案中，所述糖类选自蔗糖、葡萄糖、海藻糖和麦芽糖中的一种或多种。在一些实施方案中，所述糖类为蔗糖。

在一些实施方案中，药物组合物中糖类的浓度为1mg/mL-200mg/mL，例如1mg/mL-150mg/mL、1mg/mL-140mg/mL、1mg/mL-130mg/mL、1mg/mL-120mg/mL、1mg/mL-110mg/mL、1mg/mL-100mg/mL、1mg/mL-95mg/mL、1mg/mL-90mg/mL、1mg/mL-85mg/mL、1mg/mL-80mg/mL、10mg/mL-150mg/mL、10mg/mL-140mg/mL、 10mg/mL-130mg/mL、10mg/mL-120mg/mL、10mg/mL-110mg/mL、10mg/mL-100mg/mL、10mg/mL-95mg/mL、10mg/mL-90mg/mL、10mg/mL-85mg/mL、10mg/mL-80mg/mL、20mg/mL-130mg/mL、20mg/mL-120mg/mL、20mg/mL-110mg/mL、20mg/mL-100mg/mL、20mg/mL-95mg/mL、20mg/mL-90mg/mL、20mg/mL-85mg/mL、20mg/mL-80mg/mL、30mg/mL-120mg/mL、30mg/mL-110mg/mL、30mg/mL-100mg/mL、30mg/mL-95mg/mL、30mg/mL-90mg/mL、30mg/mL-85mg/mL、30mg/mL-80mg/mL、50mg/mL-110mg/mL、50mg/mL-100mg/mL、50mg/mL-95mg/mL、50mg/mL-90mg/mL、50mg/mL-85mg/mL、50mg/mL-80mg/mL、60mg/mL-100mg/mL、60mg/mL-95mg/mL、60mg/mL-90mg/mL、60mg/mL-85mg/mL、60mg/mL-80mg/mL、70mg/mL-95mg/mL、70mg/mL-90mg/mL、70mg/mL-85mg/mL或者70mg/mL-80mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中糖类的浓度为10mg/mL-150mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中糖类的浓度为30mg/mL-120mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中糖类的浓度为50mg/mL-100mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中糖类的浓度为约30mg/mL、约35mg/mL、约40mg/mL、约45mg/mL、约50mg/mL、约55mg/mL、约60mg/mL、约65mg/mL、约70mg/mL、约75mg/mL、约80mg/mL、约85mg/mL、约90mg/mL、约95mg/mL、约100mg/mL、约105mg/mL、约110mg/mL、约115mg/mL或者约120mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中糖类的浓度为约80mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中糖类的浓度为至少200mg/mL。在一些实施方案中，药物组合物中糖类的浓度为至少80mg/mL。

在一些实施方案中，药物组合物还任选包含选自多元醇和金属螯合剂中的一种或多种的其他辅料。在一些实施方案中，所述多元醇选自甘油、甘露醇和山梨醇中的一种多种。在一些实施方案中，所述金属螯合剂选自乙二胺四乙酸或其药用盐。在一些实施方案中，所述多元醇为甘露醇。在一些实施方案中，所述金属螯合剂为乙二胺四乙酸。

在一些实施方案中，药物组合物中所述的其他辅料浓度为0.001％w/v-20％w/v，例如0.005％w/v-20％w/v、0.005％w/v-15％w/v、0.005％w/v-10％w/v、0.005％w/v-9％w/v、0.005％w/v-8％w/v、0.005％w/v-7％w/v、0.005％w/v-6％w/v、0.005％w/v-5％w/v、0.005％w/v-4％w/v、0.005％w/v-3％w/v、0.005％w/v-2％w/v、0.005％w/v-1％w/v、0.005％w/v-0.1％w/v、0.005％w/v-0.05％w/v、0.008％w/v-15％w/v、0.008％w/v-10％w/v、0.008％w/v-9％w/v、0.008％w/v-8％w/v、0.008％w/v-7％w/v、0.008％w/v-6％w/v、0.008％w/v-5％w/v、0.008％w/v-4％w/v、0.008％w/v-3％w/v、0.008％w/v-2％w/v、0.008％w/v-1％w/v、0.008％w/v-0.1％w/v、0.008％w/v-0.05％w/v、0.01％w/v-10％w/v、0.01％w/v-9％w/v、0.01％w/v-8％w/v、0.01％w/v-7％w/v、0.01％w/v-6％w/v、0.01％w/v-5％w/v、0.01％w/v-4％w/v、0.01％w/v-3％w/v、0.01％w/v-2％w/v、0.01％w/v-1％w/v、0.01％w/v-0.1％w/v、0.01％w/v-0.05％w/v、0.1％w/v-15％w/v、0.1％w/v-10％w/v、0.1％w/v-10％w/v、0.1％w/v-9％w/v、0.1％w/v-8％w/v、 0.1％w/v-7％w/v、0.1％w/v-6％w/v、0.1％w/v-5％w/v、1％w/v-15％w/v、1％w/v-10％w/v、1％w/v-9％w/v、1％w/v-8％w/v、1％w/v-7％w/v、1％w/v-6％w/v、1％w/v-5％w/v、0.001％w/v-5％w/v、0.001％w/v-4％w/v、0.001％w/v-3％w/v、0.001％w/v-2％w/v、0.001％w/v-1％w/v、0.001％w/v-0.1％w/v或者0.001％w/v-0.05％w/v。在一些实施方案中，药物组合物中所述的其他辅料浓度为0.005％w/v-15％w/v。在一些实施方案中，药物组合物中所述的其他辅料浓度为0.008％w/v-10％w/v。在一些实施方案中，药物组合物中所述的其他辅料浓度为0.01％w/v-8％w/v。

在一些实施方案中，药物组合物中甘露醇的浓度为0.1％w/v-15％w/v，例如0.5％w/v-12％w/v、0.5％w/v-11％w/v、0.5％w/v-10％w/v、0.5％w/v-9％w/v、0.5％w/v-8％w/v、0.5％w/v-7％w/v、0.5％w/v-6％w/v、0.5％w/v-5％w/v、1％w/v-10％w/v、1％w/v-9％w/v、1％w/v-8％w/v、1％w/v-7％w/v、1％w/v-6％w/v或者1％w/v-5％w/v。在一些实施方案中，药物组合物中甘露醇的浓度为0.5％w/v-12％w/v。在一些实施方案中，药物组合物中甘露醇的浓度为1％w/v-10％w/v。在一些实施方案中，药物组合物中甘露醇的浓度为约1％w/v、约2％w/v、约3％w/v、约4％w/v、约5％w/v、约6％w/v、约7％w/v、约8％w/v、约9％w/v或者约10％w/v。在一些实施方案中，药物组合物中甘露醇的浓度为约4％w/v。在一些实施方案中，药物组合物中甘露醇的浓度为至少15％w/v。在一些实施方案中，药物组合物中甘露醇的浓度为至少4％w/v。

在一些实施方案中，药物组合物中乙二胺四乙酸的浓度为0.001％w/v-5％w/v，例如0.001％w/v-4％w/v、0.001％w/v-3％w/v、0.001％w/v-2％w/v、0.001％w/v-1％w/v、0.001％w/v-0.1％w/v、0.001％w/v-0.05％w/v、0.005％w/v-4％w/v、0.005％w/v-3％w/v、0.005％w/v-2％w/v、0.005％w/v-1％w/v、0.005％w/v-0.1％w/v或者0.005％w/v-0.05％w/v。在一些实施方案中，药物组合物中乙二胺四乙酸的浓度为0.001％w/v-1％w/v。在一些实施方案中，药物组合物中乙二胺四乙酸的浓度为0.005％w/v-0.1％w/v。在一些实施方案中，药物组合物中乙二胺四乙酸的浓度为约0.005％w/v、约0.006％w/v、约0.007％w/v、约0.008％w/v、约0.009％w/v、约0.01％w/v、约0.02％w/v、约0.03％w/v、约0.04％w/v、约0.05％w/v、约0.06％w/v、约0.07％w/v、约0.08％w/v、约0.09％w/v或者约0.1％w/v。在一些实施方案中，药物组合物中乙二胺四乙酸的浓度为约0.01％w/v。在一些实施方案中，药物组合物中乙二胺四乙酸的浓度为至少5％w/v。在一些实施方案中，药物组合物中乙二胺四乙酸的浓度为至少0.01％w/v。

在一些实施方案中，药物组合物中缓冲剂的pH为3.5-9，例如3.5-8.5、3.5-8、3.5-7.5、3.5-7、3.5-6.9、3.5-6.8、3.5-6.7、3.5-6.6、3.5-6.5、3.5-6.4、3.5-6.3、3.5-6.2、3.5-6.1、3.5-6、3.5-5.9、3.5-5.8、3.5-5.7、3.5-5.6、3.5-5.5、4-5.4、4-5.3、4-5.2、4-5.1、4-5.0、4-8.5、4-8、4-7.5、4-7、4-6.9、4-6.8、4-6.7、4-6.6、4-6.5、4-6.4、4-6.3、4-6.2、4-6.1、4-6、4-5.9、4-5.8、4-5.7、4-5.6、4-5.5、4-5.4、4-5.3、 4-5.2、4-5.1、4-5.0、4.2-8、4.2-7.5、4.2-7、4.2-6.9、4.2-6.8、4.2-6.7、4.2-6.6、4.2-6.5、4.2-6.4、4.2-6.3、4.2-6.2、4.2-6.1、4.2-6、4.2-5.9、4.2-5.8、4.2-5.7、4.2-5.6、4.2-5.5、4.2-5.4、4.2-5.3、4.2-5.2、4.2-5.1、4.2-5.0、4.5-8、4.5-7.5、4.5-7、4.5-6.9、4.5-6.8、4.5-6.7、4.5-6.6、4.5-6.5、4.5-6.4、4.5-6.3、4.5-6.2、4.5-6.1、4.5-6、4.5-5.9、4.5-5.8、4.5-5.7、4.5-5.6、4.5-5.5、4.5-5.4、4.5-5.3、4.5-5.2、4.5-5.1、4.5-5.0、4.6-7.5、4.6-7、4.6-6.9、4.6-6.8、4.6-6.7、4.6-6.6、4.6-6.5、4.6-6.4、4.6-6.3、4.6-6.2、4.6-6.1、4.6-6、4.6-5.9、4.6-5.8、4.6-5.7、4.6-5.6、4.6-5.5、4.6-5.4、4.6-5.3、4.6-5.2、4.6-5.1、4.6-5.0、4.8-7、4.8-6.9、4.8-6.8、4.8-6.7、4.8-6.6、4.8-6.5、4.8-6.4、4.8-6.3、4.8-6.2、4.8-6.1、4.8-6、4.8-5.9、4.8-5.8、4.8-5.7、4.8-5.6、4.8-5.5、5-6.5、5-6.4、5-6.3、5-6.2、5-6.1、5-6、5-5.9、5-5.8、5-5.7、5-5.6或者5-5.5。在一些实施方案中，药物组合物中缓冲剂的pH为3.5-7。在一些实施方案中，药物组合物中缓冲剂的pH为4.0-6.5。在一些实施方案中，药物组合物中缓冲剂的pH为4.2-6.2。在一些实施方案中，药物组合物中缓冲剂的pH为4.5-6.0。在一些实施方案中，药物组合物中缓冲剂的pH为约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4或者约6.5。在一些实施方案中，药物组合物中缓冲剂的pH为约5.0、约5.2、约5.3、约5.5、约5.6、约5.8或者约6.0。在一些实施方案中，药物组合物中缓冲剂的pH为约5.0、约5.2、约5.3或者约5.5。

在一些实施方案中，药物组合物还包含pH调节剂，例如氢氧化钠和/或盐酸。

在一些实施方案中，所述药物组合物的pH相比其含有的缓冲剂的pH具有不超过±0.5的差异。在一些实施方案中，药物组合物的pH为3.5-9，例如3.5-8.5、3.5-8、3.5-7.5、3.5-7、3.5-6.9、3.5-6.8、3.5-6.7、3.5-6.6、3.5-6.5、3.5-6.4、3.5-6.3、3.5-6.2、3.5-6.1、3.5-6、3.5-5.9、3.5-5.8、3.5-5.7、3.5-5.6、3.5-5.5、4-5.4、4-5.3、4-5.2、4-5.1、4-5.0、4-8.5、4-8、4-7.5、4-7、4-6.9、4-6.8、4-6.7、4-6.6、4-6.5、4-6.4、4-6.3、4-6.2、4-6.1、4-6、4-5.9、4-5.8、4-5.7、4-5.6、4-5.5、4-5.4、4-5.3、4-5.2、4-5.1、4-5.0、4.2-8、4.2-7.5、4.2-7、4.2-6.9、4.2-6.8、4.2-6.7、4.2-6.6、4.2-6.5、4.2-6.4、4.2-6.3、4.2-6.2、4.2-6.1、4.2-6、4.2-5.9、4.2-5.8、4.2-5.7、4.2-5.6、4.2-5.5、4.2-5.4、4.2-5.3、4.2-5.2、4.2-5.1、4.2-5.0、4.5-8、4.5-7.5、4.5-7、4.5-6.9、4.5-6.8、4.5-6.7、4.5-6.6、4.5-6.5、4.5-6.4、4.5-6.3、4.5-6.2、4.5-6.1、4.5-6、4.5-5.9、4.5-5.8、4.5-5.7、4.5-5.6、4.5-5.5、4.5-5.4、4.5-5.3、4.5-5.2、4.5-5.1、4.5-5.0、4.6-7.5、4.6-7、4.6-6.9、4.6-6.8、4.6-6.7、4.6-6.6、4.6-6.5、4.6-6.4、4.6-6.3、4.6-6.2、4.6-6.1、4.6-6、4.6-5.9、4.6-5.8、4.6-5.7、4.6-5.6、4.6-5.5、4.6-5.4、4.6-5.3、4.6-5.2、4.6-5.1、4.6-5.0、4.8-7、4.8-6.9、4.8-6.8、4.8-6.7、4.8-6.6、4.8-6.5、4.8-6.4、4.8-6.3、4.8-6.2、4.8-6.1、4.8-6、4.8-5.9、4.8-5.8、4.8-5.7、4.8-5.6、4.8-5.5、5-6.5、5-6.4、5-6.3、5-6.2、5-6.1、5-6、5-5.9、5-5.8、5-5.7、5-5.6或者5-5.5。在一些实施方案中，药物组合物的pH为3.5-7。在一些实施方案中，药物组合物的 pH为4.0-6.5。在一些实施方案中，药物组合物的pH为4.2-6.2。在一些实施方案中，药物组合物的pH为4.5-6.0。在一些实施方案中，药物组合物的pH为约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4或者约6.5。在一些实施方案中，药物组合物的pH为约5.0、约5.2、约5.3、约5.5、约5.6、约5.8或者约6.0。在一些实施方案中，药物组合物中缓冲剂的pH为约5.0、约5.2、约5.3或者约5.5。

在一些实施方案中，本公开提供一种包含FAP/CD40结合分子(例如重链、轻链序列分别为SEQ ID NO:22和20的Ab10-A297V3-4)的药物组合物，其包含以下1)-4)中任一组：

1)FAP/CD40结合分子；

组氨酸盐缓冲剂，例如组氨酸盐酸缓冲剂或组氨酸醋酸盐缓冲剂，组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂或组氨酸-醋酸缓冲剂；

2)FAP/CD40结合分子；

组氨酸盐缓冲剂；

聚山梨酯，例如聚山梨酯80；

蔗糖；

任选地，所述组合物进一步包含甘露醇或乙二胺四乙酸；

3)FAP/CD40结合分子；

组氨酸盐酸盐缓冲剂，例如组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂；

聚山梨酯，例如聚山梨酯80；

蔗糖；

任选地，所述组合物进一步包含甘露醇或乙二胺四乙酸；

4)FAP/CD40结合分子；

组氨酸醋酸盐缓冲剂，例如组氨酸-醋酸缓冲剂；

聚山梨酯，例如聚山梨酯80；

蔗糖；

任选地，所述组合物进一步包含甘露醇或乙二胺四乙酸；

在一些实施方案中，本公开提供一种含FAP/CD40结合分子(例如重链、轻链序列分别为SEQ ID NO:22和20的Ab10-A297V3-4)的药物组合物，其为以下1)-4)中的任一组：

1)FAP/CD40结合分子；组氨酸盐缓冲剂；聚山梨酯；蔗糖和注射用水。

2)FAP/CD40结合分子；组氨酸盐酸盐缓冲剂；聚山梨酯；蔗糖和注射用水。

3)FAP/CD40结合分子；组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂；聚山梨酯；蔗糖和注射用水。

4)FAP/CD40结合分子；组氨酸-醋酸缓冲剂；聚山梨酯；蔗糖和注射用水。

5)上述1)-4)任一项所述的药物组合物，其中聚山梨酯为聚山梨酯80。

在一些实施方案中，本公开提供一种含FAP/CD40结合分子(例如重链、轻链序列分别为SEQ ID NO:22和20的Ab10-A297V3-4)的药物组合物，其包含以下1)-5)中的任一组：

1)0.01mg/mL-500mg/mL FAP/CD40结合分子；

0.1mM-50mM组氨酸盐酸盐缓冲剂，例如组氨酸盐酸盐缓冲剂或组氨酸醋酸盐缓冲剂，组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂或组氨酸-醋酸缓冲剂；

0.01mg/mL-10mg/mL聚山梨酯；

1mg/mL-200mg/mL蔗糖；

任选地，所述药物组合物进一步包含0.1％w/v-15％w/v甘露醇或0.001％w/v-5％w/v乙二胺四乙酸；

且所述药物组合物的pH为3.5-7；

2)0.1mg/mL-400mg/mL FAP/CD40结合分子；

0.5mM-40mM组氨酸盐酸盐缓冲剂，例如组氨酸盐酸盐缓冲剂或组氨酸醋酸盐缓冲剂，组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂或组氨酸-醋酸缓冲剂；

0.05mg/mL-5mg/mL聚山梨酯；

10mg/mL-150mg/mL蔗糖；

任选地，所述药物组合物进一步包含0.5％w/v-12％w/v甘露醇或0.001％w/v-1％w/v乙二胺四乙酸；

且所述药物组合物的pH为4-6.5；

3)0.5mg/mL-200mg/mL FAP/CD40结合分子；

1mM-30mM组氨酸盐酸盐缓冲剂，例如组氨酸盐酸盐缓冲剂或组氨酸醋酸盐缓冲剂，组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂或组氨酸-醋酸缓冲剂；

0.1mg/mL-3mg/mL聚山梨酯；

30mg/mL-120mg/mL蔗糖；

任选地，所述药物组合物进一步包含1％w/v-10％w/v甘露醇或0.005％w/v-0.1％w/v乙二胺四乙酸；

且所述药物组合物的pH为4.2-6.2；

4)1mg/mL-150mg/mL FAP/CD40结合分子；

5mM-20mM组氨酸盐酸盐缓冲剂，例如组氨酸盐酸盐缓冲剂或组氨酸醋酸盐缓冲剂，组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂或组氨酸-醋酸缓冲剂；

0.2mg/mL-2mg/mL聚山梨酯；

50mg/mL-100mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为4.5-6；

5)1mg/mL-40mg/mL FAP/CD40结合分子；

5mM-20mM组氨酸盐酸盐缓冲剂，例如组氨酸盐酸盐缓冲剂；

0.2mg/mL-2mg/mL聚山梨酯；

50mg/mL-100mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为4.5-6。

6)50mg/mL-150mg/mL FAP/CD40结合分子；

5mM-20mM组氨酸醋酸盐缓冲剂，例如组氨酸-醋酸缓冲剂；

0.2mg/mL-2mg/mL聚山梨酯；

50mg/mL-100mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为4.5-6。

7)上述1)-6)中任一项所述的药物组合物，其进一步包含注射用水。

8)上述1)-4)任一项所述的药物组合物，其中聚山梨酯为聚山梨酯80。

在一些实施方案中，本公开提供一种含FAP/CD40结合分子(例如重链、轻链序列分别为SEQ ID NO:22和203的Ab10-A297V3-4)的药物组合物，其包含或为以下1)-25)中的任一组：

1)1-150mg/mL FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸盐酸盐缓冲剂或组氨酸醋酸盐缓冲剂，例如组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂或组氨酸-醋酸缓冲剂；

0.2mg/mL-2mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为4.5-6；

2)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约 80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子，例如约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约25mg/mL；

约10mM组氨酸盐酸盐缓冲剂，例如组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂；

约0.4mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.5；

3)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子，例如约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约25mg/mL；

约0.4mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.3；

4)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子，例如约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约25mg/mL；

约0.4mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.2；

5)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子，例如约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约25mg/mL；

约0.4mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5；

6)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子，例如约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约25mg/mL；

约0.6mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.5；

7)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子，例如约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约25mg/mL；

约0.6mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.3；

8)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子，例如约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约25mg/mL；

约0.6mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.2；

9)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子，例如约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约25mg/mL；

约0.6mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5；

10)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.4mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5；

11)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.4mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.2；

12)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.4mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.3；

13)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.4mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.5；

14)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.6mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5；

15)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.6mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.2；

16)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.6mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.3；

17)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.6mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.5；

18)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.8mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5；

19)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.8mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.2；

20)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.8mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.3；

21)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.8mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.5；

22)1-45mg/mL FAP/CD40结合分子，例如约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL 或约25mg/mg；

0.2mg/mL-2mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为4.5-6；

23)50-120mg/mL FAP/CD40结合分子，例如约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL；

约10mM组氨酸醋酸盐缓冲剂，例如组氨酸-醋酸缓冲剂；

0.2mg/mL-2mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为4.5-6；

24)为1)-23)中的药物组合物，其进一步包含4％w/v甘露醇或0.01％w/v乙二胺四乙酸；

25)为1)-24)中的药物组合物，其终体积为1mL；在需要定容的情况下，是采用注射用水定容至1mL。

另一方面，本公开提供一种含低浓度FAP/CD40结合分子(例如1-45mg/mL，约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约25mg/mg)的药物组合物或其制备方法，其通过将含高浓度FAP/CD40结合分子(例如50-120mg/mL，约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL)的药物组合物用稀释剂稀释后获得。在一些实施方案中，稀释剂包括但不限于是水、生理盐水、葡萄糖溶液。

本公开的药物组合物已具有足够的成药稳定性，可以长期稳定放置。

在一些实施方案中，所述药物组合物于2-8℃稳定至少3个月，至少6个月，至少12个月，至少18个月，至少24个月或至少36个月。在一些实施方案中，所述药物组合物于25℃稳定至少3个月，至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月。在一些实施方案中，所述药物组合物于40℃稳定至少7天，至少14天，至少28天，至少1个月，至少3个月，至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月。

本公开提供了一种制备前述药物组合物的方法，包括将所述FAP/CD40结合分子溶解的步骤。

为便于药品运输的方便，本公开药物组合物可以进一步的做成冻干制剂。

在某些实施方案中，如上任一项所述的药物组合物，所述药物组合物是液体制剂。在一些实施方案中，所述液体制剂的溶剂是水、生理盐水或葡萄糖溶液。

本公开还提供了一种冻干制剂，其特征在于所述冻干制剂复溶后可形成如上任一项所述的药物组合物。

本公开还提供了一种冻干制剂，所述的冻干制剂通过将如上任一项所述的药物组合物经冷冻干燥获得。

本公开提供了一种复溶溶液，所述复溶溶液是通过将前述冻干制剂经复溶制备获得。在某些实施方案中，所述的复溶溶液选自但不限于注射用水，生理盐水或葡萄糖溶液。

本公开还提供一种制品，其包括容器，该容器中装有如前述的药物组合物、如前述的冻干制剂或如前述的复溶溶液。在某些实施方案中，所述容器为中性硼硅玻璃管制注射剂瓶。在某些实施方案中，所述制品中包含药品说明书。

本公开还提供药物组合物或冻干制剂或冻干制剂的复溶溶液，其用于治疗或缓解疾病或病症的药物。

治疗疾病的方法和制药用途

一些实施方案中，本公开提供一种预防和/或治疗癌症或肿瘤的方法，包括给患者或受试者施用预防和/或治疗有效量的前述药物组合物或冻干制剂或冻干制剂的复溶溶液，抑制患者或受试者中的肿瘤细胞生长。一些具体实施方案中，所述癌症优选但不限于对免疫治疗有应答的癌症。

以上方法或用途中，癌症或肿瘤的非限制性的例子包括肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤(例如转移的恶性黑色素瘤)、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤和骨肉瘤。可以用本公开的方法治疗的其它癌症的例子包括：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症，以及所述癌症的组合。一些实施方案中，上述肿瘤或癌症是转移性的和/或晚期的。

此外，本公开还提供一种预防和/或治疗受试者或患者中的感染性疾病的方法，包括给该受试者或患者施用前述的药物组合物或冻干制剂或冻干制剂的复溶溶液，使得所述对象的感染性疾病得到预防和/或治疗。类似于对于如上所述的癌症或肿瘤的应用，可以单独使用，或者与疫苗组合使用来刺激对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。特别可以应用该治疗方法的病原体的示例包括当前没有有效疫苗的病原体，或常规疫苗不完全有效的病原体。其中包括但不限于HIV、肝炎病毒(甲、乙、丙)、流感病毒、疱疹病毒、贾第虫、疟疾、利什曼原虫、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌。

本公开含有FAP/CD40结合分子的药物组合物可以通过胃肠外给药的方式用于治疗需要这种治疗的患者。胃肠外给药途径可选择皮下注射、肌肉注射或静脉注射。

附图说明

图1为抗FAP抗体Ab9、Ab10、Ab14、Ab15与细胞表面人FAP的结合，使用28H1作为阳性对照，IgG1同种型(作为阴性对照)。

图2为抗FAP抗体Ab9、Ab10、Ab14、Ab15与细胞表面小鼠FAP的结合，使用28H1作为阳性对照，IgG1同种型作为阴性对照。

图3为抗CD40抗体A12、A297与Raji细胞表面人CD40的结合，使用9E5-SELFNS作为阳性对照，IgG1作为阴性对照。

图4为抗CD40抗体A12、A297与HEK293细胞表面人CD40的结合，使用9E5-SELFNS作为阳性对照，IgG1作为阴性对照，纵坐标为相对于200nM 9E5-SELFNS的激动活性百分比。

图5为人源化抗CD40抗体A297_V1、A297_V2、A297_V3、A297_V4与过表达人CD40的HEK293细胞的亲和力流式检测结果，均使用9E5-SELFNS作为阳性对照，hIgG作为阴性对照。

图6为人源化抗CD40抗体A297_V1、A297_V2、A297_V3、A297_V4通过FcγRIIb介导的HEK-Blue^TMCD40L细胞的活化作用，均使用9E5-SELFNS作为阳性对照，hIgG作为阴性对照。

图7为抗FAP/CD40双特异性抗体结构示意图。

图8A为抗FAP/CD40双特异性抗体Ab10-A12V2-2、Ab10-A12V2-4、Ab10-A297V3-2、Ab10-A297V3-4与高表达人FAP抗原的CHOK1/FAP稳转株的亲和力流式检测结果；图8B、图8C分别为前述抗FAP/CD40双特异性抗体与高表达鼠FAP抗原、食蟹猴FAP抗原的CHOK1/FAP稳转株的亲和力流式检测结果。

图9A为抗FAP/CD40双特异性抗体Ab10-A12V2-2、Ab10-A12V2-4、Ab10-A297V3-2、Ab10-A297V3-4与高表达人CD40抗原的HEK-BlueTMCD40L稳转株的亲和力流式检测结果；图9B为前述抗FAP/CD40双特异性抗体与高表达食蟹猴CD40抗原的HEK293细胞的亲和力流式检测结果。

图10为抗FAP/CD40双特异性抗体Ab10-A297V3-2、Ab10-A297V3-4与人未成熟DC上CD40亲和力流式检测结果。

图11为浓度梯度的抗FAP/CD40双特异性抗体Ab10-A12V2-2、Ab10-A12V2-4、Ab10-A297V3-2、Ab10-A297V3-4在没有CHOK1/FAP稳转细胞交联情况下促DC成熟作用，使用LPC、hIgG1、载剂作为对照。

图12为浓度梯度的抗FAP/CD40双特异性抗体Ab10-A12V2-2、Ab10-A12V2-4、Ab10-A297V3-2、Ab10-A297V3-4在CHOK1/FAP稳转细胞交联情况下促DC成熟作用，使用LPC、hIgG1、载剂作为对照。

图13A为向mFAP-MC38荷瘤hCD40人源化小鼠注射单剂量抗体Ab10-A297V3-2或Ab10-A297V3-4后小鼠肿瘤生长曲线；图13B为小鼠相应外周血B细胞的激活；图13C为小鼠相应体重变化曲线；图13D为小鼠相应血小板计数的变化；图13E为小鼠相应肝功能的影响。

图14A为向mFAP-MC38荷瘤hCD40人源化小鼠注射多剂量抗体Ab10-A297V3-2或Ab10-A297V3-4后小鼠肿瘤生长曲线；图14B为小鼠相应外周血B细胞的激活；图14C为小鼠相应体重变化曲线；图14D为小鼠相应血小板计数的变化；图14E为小鼠相应肝功能的影响。

其中，图13A至图14E中，除图中另有标识外，P值均是相对于对照hIgG1计算。使用统计学方法Student’t-test，其中，ns是指不具有显著性差异，*为p<0.05，**为p<0.01，***为p<0.001，****为p<0.0001。

具体实施方式

一、术语

为了更容易理解本披露，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本披露所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

“CD40”和“CD40抗原”是指在正常和赘生性B细胞表面上表达的约48kD糖蛋白，其充当参与细胞增殖和分化的信号的受体(Ledbetter等人,1987,J.Immunol.138:788-785)。内源性表达CD40的细胞是特征在于CD40的表面表达的任何细胞，包括但不限于正常和赘生性B细胞、交错突细胞、基底上皮细胞、癌细胞、巨噬细胞、内皮细胞、滤泡树突细胞、扁桃体细胞和骨髓来源的浆细胞。本公开“CD40”指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物例如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然CD40,除非另有说明。已从由伯基特氏淋巴瘤细胞系Raji制备的文库中分离出编码CD40的cDNA分子(Stamenkovic等人,1989,EMBO J.8:1403)。序列信息可参见本公开表8。本公开“CD40”涵盖全长未加工的CD40以及源自细胞中的加工的任何形式的CD40，还涵盖CD40的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中，本公开的CD40结合分子能够特异性结合人，小鼠和/或食蟹猴CD40。

“成纤维细胞激活蛋白(FAP)”和“FAP抗原”，也称作脯氨酰内肽酶FAP或分离酶(Seprase)(EC 3.4.21)，指来自任何脊椎动物来源的任何天然FAP，包括哺乳动物，例如灵长类(例如人)，非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。本公开“FAP”涵盖全长未加工的FAP以及源自细胞中的加工的任何形式的FAP，还涵盖FAP的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中，本公开的FAP结合分子能够特异性结合人，小鼠和/或食蟹猴FAP。人FAP的氨基酸序列在UniProt(www.uniprot.org)登录号Q12884(版本149，SEQ ID NO:2)，或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2、GeneBank Accession NO.AAC51668中显示。人FAP的细胞外结构域(ECD)自氨基酸位置26延伸至760。带His标签的人FAP ECD等氨基酸序列在本公开表2中显示。小鼠FAP的氨基酸序列在UniProt登录号P97321(版本126，SEQ ID NO:143)，或NCBI RefSeq NP_032012.1中显示。小鼠FAP的细胞外结构域(ECD)自氨基酸位置26延伸至761。一些实施方案中，本公开的FAP结合分子结合FAP的细胞外结构域。

“抗体”以最广义使用，涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体；单特异性抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，全长抗体和抗体片段(或抗原结合片段，或抗原结合部分)，只要它们展现出期望的抗原结合活性。抗体可以指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(CDR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1，LCDR2，和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1，HCDR2和HCDR3。

“双特异性抗体”涵盖对两个不同抗原或同一抗原的至少两个不同抗原表位特异性结合的抗体(包括抗体或其抗原结合片段，如单链抗体)。典型的双特异性抗体结构模型如KiH、CrossMAb、Triomab quadroma、FcΔAdp、ART-Ig、BiMAb、Biclonics、BEAT、DuoBody、Azymetric、XmAb、2:1TCBs、1Fab-IgG TDB、FynomAb、two-in-one/DAF、scFv-Fab-IgG、DART-Fc、LP-DART、CODV-Fab-TL、HLE-BiTE、F(ab)2-CrossMAb、IgG-(scFv)2、Bs4Ab、DVD-Ig、Tetravalent-DART-Fc、(scFv)4-Fc、CODV-Ig、mAb2、F(ab)4-CrossMAb等双特异性抗体(参见Aran F.Labrijn等，Nature Reviews Drug Discovery volume 18，pages585–608(2019)；Chen S1等，J Immunol Res.2019 Feb 11；2019:4516041)。

对于CDR的确定或定义，能够通过分辨抗体的结构和/或分辨抗体-配体复合物的结构来完成CDR的确定性描绘和包含抗体的结合位点的残基的鉴定。这可通过本领域技术人员已知的各种技术中的任一种，例如X射线晶体学来实现。多种分析方法可用于鉴定CDR，包括但不限于Kabat编号系统、Chothia编号系统、AbM编号系统、IMGT编号系统、接触定义、构象定义。

Kabat编号系统是用于编号抗体中残基的标准并且通常用于鉴定CDR区域(参见例如Johnson&Wu，2000，Nucleic Acids Res.，28：214-8)。Chothia编号系统与Kabat编号系统类似，但Chothia编号系统考虑了某些结构环区域的位置。(参见例如Chothia等，1986，J.Mol.Biol.，196：901-17；Chothia等人，1989，Nature，342：877-83)。AbM编号系统使用建模抗体结构的由Oxford Molecular Group生产的计算机程序集成套件(参见例如Martin等，1989，ProcNatl Acad Sci(USA)，86：9268-9272；“AbMTM，A Computer Program for ModelingVariable Regions of Antibodies，”Oxford，UK；Oxford Molecular，Ltd)。AbM编号系统使用知识数据库和从头开始方法的组合，从基本序列建模抗体的三级结构(参见Samudrala等，1999，在PROTEINS，Structure，Function and Genetics Suppl.，3：194-198中的“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined HierarchicalApproach”描述的那些)。接触定义基于可用复杂晶体结构的分析(参见例如MacCallum等，1996，J.Mol.Biol.，5：732-45)。构象定义中，CDR的位置可鉴定为对抗原结合做出焓贡献的残基(参见例如Makabe等，2008，Journal ofBiological Chemistry，283：1156-1166)。另外其它的CDR边界定义可能不严格遵循上述方法之一，但仍然与Kabat CDR的至少一部分重叠，尽管根据特定残基或残基组不显著影响抗原结合的预测或实验结果，它们可缩短或延长。如本公开使用的，CDR可指通过本领域已知的任何方法(包括方法的组合)定义的CDR。各种编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的，示例性的，如下表1中所示。

表1.CDR编号系统之间的关系

本公开的抗体的VL区和VH区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号系统。

多肽或蛋白的“结构域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，结构域负责蛋白的单个功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其它蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或结构域的功能。

“免疫球蛋白结构域”是指抗体链(例如常规四肽链结构抗体的链或重链抗体的链)的球形区域，或是指基本上由这类球形区域组成的多肽。免疫球蛋白结构域的特征在于其维持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，其由排列在两个β折叠中任选由保守二硫键稳定的约7个反平行β折叠股的2层夹层组成。

“免疫球蛋白可变结构域”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白结构域，其中所述框架区由本领域及下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔开。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变结构域因具有抗原结合位点而赋予其对抗原的特异性。

“抗体框架(FR)”，是指可变结构域的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。

“免疫球蛋白单一可变结构域”通常用于指可以在不与其他可变结构域相互作用的情况下(例如在没有如常规四链单克隆抗体的VH和VL结构域之间所需要的VH/VL相互作用的情况下)，形成功能性抗原结合位点的免疫球蛋白可变结构域(其可以是重链或轻链结构域，包括VH、VHH或VL结构域)。“免疫球蛋白单一可变结构域”的实例包括纳米抗体(包括VHH、人源化VHH和/或骆驼化VH，例如骆驼化人VH)、IgNAR、结构域、作为VH结构域或衍生自VH结构域的(单结构域)抗体(诸如dAbs^TM)和作为VL结构域或衍生自VL结构域的(单结构域)抗体(诸如dAbs^TM)。基于和/或衍生自重链可变结构域(诸如VH或VHH结构域)的免疫球蛋白单一可变结构域通常是优选的。免疫球蛋白单一可变结构域的一个具体实例为如下文定义的“VHH结构域”(或简称为“VHH”)。

“VHH结构域”，亦称为重链单域抗体、VHH、V_HH结构域、VHH抗体片段、VHH抗体、纳米抗体，是称为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白的可变结构域(Hamers-Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R.:“Naturally occurring antibodies devoid of light chains”；Nature363，446-448(1993))。使用术语“VHH结构域”以将所述可变结构域与存在于常规四肽链结构抗体中的重链可变结构域(其在本公开中称为“VH结构域”)以及轻链可变结构域(其在本公开中称为“VL结构域”)进行区分。VHH结构域特异性结合表位而无需其他抗原结合结构域(此与常规四肽链结构抗体中的VH或VL结构域相反，在该情况下表位由VL结构域与VH结构域一起识别)。VHH结构域为由单一免疫球蛋白结构域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。术语“重链单域抗体”、“VHH结构域”、“VHH”、“V_HH结构域”、“VHH抗体片段”、“VHH抗体”、以及““结构域””(“Nanobody”为Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商标)可互换使用。“VHH结构域”包括但不限于经骆驼科动物产生的天然抗体，也可以是骆驼科动物产生的抗体后再经人源化的，也可以是经噬菌体展示技术筛选获得的。VHH结构域中的氨基酸残基的总数将通常在110至120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意较小及较长序列也可适于本公开所述的目的。获得结合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已公开于以下文献中：R.van der Linden et al.，Journal of Immunological Methods，240(2000)185-195；Li et al.，J Biol Chem.，287(2012)13713-13721；Deffar et al.，African Journal of Biotechnology Vol.8(12)，pp.2645-2652，17June，2009和WO94/04678。

如本领域中对于VH结构域及VHH结构域所公知的，各CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即根据Kabat编号的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat编号所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据Kabat的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。其它的编号系统或编码规则包括Chothia、IMGT、AbM。

“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)，是指将非人CDR序列移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量非人蛋白成分，从而诱导的强烈的免疫应答反应。为避免在免疫原性下降的同时引起活性的下降，可对所述的全人抗体可变区可进行最少反向突变，以保持活性。“人源化”的例子包括可将源自骆驼科的VHH结构域通过以人常规四肽链结构抗体VH结构域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换原始VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基而“人源化”(本公开中亦称为“序列优化”，除人源化外，“序列优化”也可涵盖通过提供VHH改良性质的一个或多个突变对序列进行的其它修饰，例如移除潜在的翻译后修饰位点)。人源化VHH结构域可含有一个或多个完全人框架区序列。此外，为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。

“全人抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本公开的全人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)。“全人抗体”不包括“人源化抗体”。

通常，本公开的CD40结合分子、FAP结合分子将以如于Biacore或KinExA或Fortibio测定中测量的优选10^-7至10^-10摩尔/升(M)、更优选10^-8至10^-10摩尔/升、甚至更优选10^-9至10^-10或更低的解离常数(K_D)，和/或以至少10^-7M、优选至少10^- ⁸M、更优选至少10^-9M，更优选至少10^-10M的缔合常数(KA)结合所要结合的抗原(即CD40或FAP)。任何大于10^-4M的K_D值一般都视为指示非特异性结合。抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以以已知的任何适合方式来测定，包括例如本公开所述的表面等离子体共振术(SPR)测定、Scatchard测定和/或竞争性结合测定(例如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)及夹心式竞争性测定)。

当“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)的情况中时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如CD40或其片段)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，Cold Spring Harbor Press)；用I-125标记物的固相直接标记RIA(参见例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常所述测定法涉及使用能与带有未标记的检测抗原结合蛋白及标记的参考抗原结合蛋白结合的纯化抗原(所述抗原在固态表面或细胞表面上)。在待测抗原结合蛋白存在下，测量结合于固态表面或细胞的标记的量，来测量竞争性抑制。通常，待测抗原结合蛋白是过量存在的。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：与参考抗原结合蛋白相同的表位发生结合的抗原结合蛋白；以及，与充分接近参考抗原结合蛋白结合的表位所邻近的表位发生结合的抗原结合蛋白，所述两个表位在空间上互相妨碍结合的发生。通常当竞争的抗原结合蛋白过量存在时，其将抑制(例如降低)至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或更多参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合。在某些情况下，结合被抑制至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或更多。

可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利公开WO03/48731中。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得与本公开的抗体分子竞争结合CD40或FAP上的相同表位的抗体。

“CD40结合分子”意指任何能够特异性结合CD40的蛋白或包含所述蛋白的任何分子。CD40结合分子可以包括针对CD40的如本公开定义的抗体或其缀合物。CD40结合分子还涵盖免疫球蛋白超家族抗体(IgSF)或CDR移植分子。本公开的“CD40结合分子”可以包含至少一个结合CD40的免疫球蛋白单一可变结构域(如VHH)。在一些实施方案中，“CD40结合分子”可以包含2、3、4或更多个结合CD40的免疫球蛋白单一可变结构域(如VHH)。本公开的CD40结合分子除结合包含CD40的免疫球蛋白单一可变结构域外，也可包含接头和/或具有效应器功能的部分，例如半衰期延长部分(如结合血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域)、和/或融合配偶体(如血清白蛋白)和/或缀合的聚合物(如PEG)和/或Fc区。在一些实施方案中，本公开的“CD40结合分子”还涵盖双/多特异性抗体，其含有结合不同抗原的免疫球蛋白(如结合第一抗原(如CD40)的第一抗体和结合第二抗原(如FAP)的第二抗体，可选的，包括结合第三抗原的第三抗体，进一步可选的，包括结合第四抗原的第四抗体。

“FAP结合分子”意指任何能够特异性结合FAP的蛋白或包含所述蛋白的任何分子。FAP结合分子可以包括针对FAP的如本公开定义的抗体或其缀合物。

“FAP/CD40结合分子”意指任何能够特异性结合CD40和FAP的蛋白或包含所述蛋白的任何分子。FAP/CD40结合分子可以包括针对CD40和FAP的如本公开定义的抗体或其缀合物。

“与CD40结合”或“结合CD40”，指能与CD40或其表位相互作用，所述CD40或其表位可以是人源的。“与FAP结合”或“结合FAP”，指能与FAP或其表位相互作用，所述FAP或其表位可以是人源的。本公开的“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本公开抗体识别的三维空间位点。

“抗原”指用于免疫接种免疫活性的脊椎动物的分子，以产生识别抗原的抗体，或筛选表达文库(例如尤其是噬菌体、酵母或核糖体展示文库)。在本公开中，抗原被更广义地定义，包括由抗体特异性识别的靶分子，以及包括用于产生抗体的免疫接种过程或用于选择抗体的文库筛选中使用的分子的一部分或模拟物。例如，对于本公开的与人CD40结合的抗体，人CD40的单体和多聚体(例如二聚体、三聚体等)，以及人CD40的截短变体和其它变体均被称为抗原。

“表位”是指抗原上与免疫球蛋白或抗体结合的位点。表位可以由相邻的氨基酸、或通过蛋白质的三级折叠而并列的不相邻的氨基酸形成。由相邻的氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保持，而通过三级折叠形成的表位通常在变性溶剂处理后丧失。表位通常以独特的空间构象包括至少3-15个氨基酸。确定什么表位由给定的抗体结合的方法在本领域中是熟知的，包括免疫印迹和免疫沉淀检测分析等。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术和本公开所述的技术，例如X射线晶体分析法和二维核磁共振等。

“特异性结合”、“选择性结合”是指抗体与预定的抗原上的表位结合。例如，当使用人CD40或其表位作为分析物并使用抗体作为配体，在仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术测定时，抗体以大约低于10^-7M或甚至更小的平衡解离常数(K_D)与预定的抗原或其表位结合，并且其与预定抗原或其表位结合的亲和力是其与预定抗原(或其表位)或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(如BSA等)结合的亲和力的至少两倍。“识别抗原的抗体”在本公开中可以与“特异性结合的抗体”互换使用。

“结合亲和力”或“亲和力”在本公开中用作两个分子(例如抗体或其部分与抗原)之间的非共价相互作用的强度量度。两个分子之间的结合亲和力可通过确定解离常数(KD)来量化。可通过使用例如表面等离子共振(SPR)方法(Biacore)测量复合物形成和解离的动力学来确定KD。对应于单价复合物的结合和解离的速率常数分别被称为结合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd(或koff)。K_D通过方程K_D＝kd/ka与ka和kd有关。解离常数的值可通过众所周知的方法直接确定，并且可通过方法例如Caceci等人(1984，Byte 9：340-362)中所述的那些甚至对于复杂混合物进行计算。例如，可使用双重过滤硝化纤维素滤器结合测定如Wong&Lohman(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5428-5432)中公开的那种来确定K_D。评估抗体针对靶抗原的结合能力的其它标准测定是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析、以及本公开其它地方例举的其它测定。抗体的结合动力学和结合亲和力也可通过本领域已知的标准测定，例如表面等离子共振(SPR)，例如通过使用Biacore^TM系统或KinExA来评价。可通过比较各个抗体/抗原复合物的K_D值来比较与不同分子相互作用相关的结合亲和力，例如，不同抗体对于给定抗原的结合亲和力的比较。类似地，相互作用的特异性可通过确定和比较目的相互作用(例如抗体和抗原之间的特异性相互作用)的K_D值与非目的相互作用(例如已知不结合CD40的对照抗体)的K_D值进行评价。

“保守性置换”指置换为具有与原始氨基酸残基相似的特性的另一个氨基酸残基。例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸具有相似的特性，在于它们具有碱性侧链，并且天冬氨酸和谷氨酸具有相似的特性，在于它们具有酸性侧链。此外，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和色氨酸具有相似的特性，在于它们具有不带电荷极性侧链，并且丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸具有相似的特性，在于它们具有非极性侧链。另外，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸具有相似的特性，在于它们具有芳族侧链。因此，本领域技术人员将显而易见，甚至当置换如上文所述的显示相似特性的组中的氨基酸残基时，它将不显示特性的特定变化。

“同源性”、“同一性”或“序列同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同核苷酸或氨基酸单体占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被相同核苷酸占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100％的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。

“抑制”或“阻断”可互换使用，并涵盖部分和完全抑制/阻断这两者。“抑制生长”(例如涉及细胞)旨在包括细胞生长任何可测量的降低。

“激动活性”、“激动剂活性”或“激动性”指作为激动剂的物质功能。激动剂与细胞受体的结合引起了与该受体的天然配体所引起的相类似或相同的反应或活性。例如，CD40激动剂或CD40激动型抗体可诱导任何或全部的下列应答：细胞增殖和/或分化；通过例如ICAM-1、E-选凝素、VCAM等分子上调细胞之间的粘附；分泌促炎性细胞因子，例如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF等；经CD40受体通过以下途径转导信号，例如TRAF(例如，TRAF2和/或TRAF3)、MAP激酶，如NIK(NF-κB诱导激酶)、1-κB激酶(IKKα/β)、转录因子NF-κB、Ras和MEK/ERK途径、PI3K/Akt途径、P38MAPK途径等；通过XIAP、Mcl-1、BCLx等分子转导抗-凋亡信号；B和/或T细胞记忆的产生；B细胞抗体产生；B细胞同种型转换；上调II类MHC和CD80/86的细胞表面表达等。

“CD40相关疾病”或“CD40相关病症”指示表达CD40的细胞的被修饰或消除的病症。这些细胞包括表现出异常增殖的表达CD40的细胞或与癌性或恶性生长相关联的表达CD40的细胞。表现出CD40抗原的异常表达的癌症的更具体例子包括B淋巴母细胞、伯基特氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、T细胞淋巴瘤、卡波西氏肉瘤、骨肉瘤、表皮和内皮肿瘤、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、头颈癌、皮肤癌(黑色素瘤)、膀胱癌和肾癌。此类障碍包括但不限于白血病、淋巴瘤(包括B细胞淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特罗姆巨球蛋白血症；实体瘤，包括肉瘤，例如骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性黑色素瘤、腺癌(包括卵巢腺癌)、卡波西氏肉瘤/卡波西氏肿瘤和鳞状细胞癌。

“增殖性疾病”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，增殖性病症指癌症。

“癌症”、“癌性”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本公开中提到时并不互相排斥。

“预防癌症”是指在受试者中延迟、抑制或防止癌症发作，所述受试者中癌症发生或肿瘤发生的起始尚未得到证实，但是通过例如遗传筛查或其它方法确定，已鉴定了癌症易感性。该还包括治疗具有癌变前病症的受试者以终止所述癌变前病症向恶性肿瘤的进展或导致其消退。

“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选地包含甘露醇或乙二胺四乙酸”意味着药物组合物中可以但不必须存在。

本文所用术语“约”或“大约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)。例如，在本领域每一次实行中“约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”或“基本上包含”可意味着至多±30％的范围，例如，约5.5的pH意指pH5.5±1.65。此外，特别对于生物学系统或过程而言，该术语可意味着至多一个数量级或数值的至多5倍。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。

“缓冲剂”指通过其酸-碱共轭组分的作用而耐受pH变化的缓冲剂。将pH控制在适当范围中的缓冲剂的例子包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)、醋酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、组氨酸盐、草酸盐、乳酸盐、磷酸盐、枸橼酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、甘氨酰甘氨酸和其它有机酸缓冲剂。

“醋酸盐缓冲剂”是包括醋酸根离子的缓冲剂。醋酸盐缓冲剂的实例包括醋酸-醋酸钠、组氨酸-醋酸组氨酸、醋酸-醋酸钾、醋酸-醋酸钙、醋酸-醋酸镁等。优选的醋酸盐缓冲剂是醋酸-醋酸钠。

“琥珀酸盐缓冲剂”是包括琥珀酸根离子的缓冲剂。琥珀酸盐缓冲剂的实例包括琥珀酸-琥珀酸钠盐、琥珀酸-琥珀酸钾、琥珀酸-琥珀酸钙盐等。优选的琥珀酸盐缓冲剂是琥珀酸-琥珀酸钠盐。示例性的，所述的琥珀酸-琥珀酸钠可由琥铂酸与氢氧化钠配制而成，或由琥铂酸与琥珀酸钠盐配制而成。

“组氨酸盐缓冲剂”是包含组氨酸根离子的缓冲剂。组氨酸盐缓冲剂的实例包括组氨酸-盐酸盐，组氨酸-醋酸盐，组氨酸-磷酸盐，组氨酸-硫酸盐等缓冲剂，优选组氨酸-盐酸盐缓冲剂或组氨酸-醋酸盐缓冲剂，组氨酸-醋酸盐缓冲剂是组氨酸与醋酸配制而成，组氨酸-盐酸盐缓冲剂是组氨酸与组氨酸盐酸盐配制而成，或组氨酸与盐酸配制而成。

“磷酸盐缓冲剂”是包括磷酸根离子的缓冲剂。磷酸盐缓冲剂的实例包括磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、磷酸氢二钠-枸橼酸等。优选地磷酸盐缓冲剂是磷酸氢二钠-磷酸二氢钠。

“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述抗体与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是保持活性成分的稳定性，促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

本公开中，“药物组合物”和“制剂”并不互相排斥。

本公开中所述药物组合物的溶液形式，若无特殊说明，其中的溶剂均为水。

“冻干制剂”表示液体或溶液形式的药物组合物或液体或溶液制剂经真空冷冻干燥步骤之后获得的制剂或药物组合物。

本公开所述的药物组合物能够达到一种稳定的效果：其中FAP/CD40结合分子在贮藏后基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性，例如药物组合物在贮藏后基本上保留其物理和化学稳定性以及其生物学活性。贮藏期一般基于药物组合物的预定保存期来选择。目前有多种测量蛋白质稳定性的分析技术，可测量在选定温度贮藏选定时间段后的稳定性。

稳定的药物抗体制剂是在下述情况下没有观察到显著变化的制剂：在冷藏温度(2-8℃)保存至少3个月、至少6个月、至少1年、至少2年、最多达2年。另外，稳定的液体制剂包括这样的液体制剂：其在包括25℃保存包括1个月、3个月、6个月或在40℃保存1个月在内的时段后表现出期望的特征。稳定性的典型的可接受的标准如下：通过SEC-HPLC测得，通常不超过约10％、优选不超过约5％的抗体单体发生降解。通过视觉分析，药物抗体制剂是无色的，或澄清至稍微乳白色。所述制剂的浓度、pH和重量克分子渗透压浓度具有不超过±10％变化。通常观察到不超过约10％、优选不超过约5％的截短，通常形成不超过约10％、优选不超过约5％的聚集。

如果在目检颜色和/或澄清度后，或者通过UV光散射、尺寸排阻色谱法(SEC)和动态光散射(DLS)测得，抗体没有显示出显著的聚集增加、沉淀和/或变性，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的物理稳定性”。蛋白构象的变化可以通过荧光光谱法(其确定蛋白三级结构)和通过FTIR光谱法(其确定蛋白二级结构)来评价。

如果抗体没有显示出显著的化学改变，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的化学稳定性”。通过检测和定量化学上改变的形式的蛋白，可以评估化学稳定性。经常改变蛋白化学结构的降解过程包括水解或截短(通过诸如尺寸排阻色谱法和 SDS-PAGE等方法来评价)、氧化(通过诸如与质谱法或MALDI/TOF/MS结合的肽谱法等方法来评价)、脱酰胺作用(通过诸如离子交换色谱法、毛细管等电聚焦、肽谱法、异天冬氨酸测量等方法来评价)和异构化(通过测量异天冬氨酸含量、肽谱法等来评价)。

如果抗体在给定时间的生物活性是在制备药物制剂时表现出的生物活性的预定范围内，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的生物活性”。抗体的生物活性可以例如通过抗原结合测定来确定。

“施用”、“给予”和“处理”，当其应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”、“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“施用”、“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当其应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。

“治疗”意指给予受试者内用或外用治疗剂，例如包含本公开的任一种抗体或其药物组合物作为治疗剂，所述受试者已经患有、疑似患有、倾向于患有一种或多种增殖性疾病或其症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗受试者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床能测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如受试者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在受试者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解某个受试者中目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的受试者中应当减轻目标疾病症状。

“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、受试者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。本公开的受试者可以是动物或人类受试者。

本公开的“受试者”、“患者”意指哺乳动物，尤其灵长类动物，尤其是人。

检测过程中使用的设备及方法如下：

外观：

采用目视法，将样品瓶擦拭干净，在1000～1500lx的光照强度下，分别于澄明度检测仪白背景和黑背景下观察样品颜色、澄清度和可见异物。

外观检测仪器：精拓仪器YB-2A澄明度检测仪。

SEC分子排阻色谱法：

根据凝胶孔隙的孔径大小与高分子样品分子的线团尺寸间的相对关系而对溶质进行分离的分析的方法。

SEC单体含量百分比＝A单体/A总*100％(A单体为样品中主峰单体的峰面积，A总为所有峰面积之和。)

SEC测定用仪器：安捷伦1260-Bio；色谱柱：Waters，XBrigeSEC(300×7.8m m 3.5μm)

NR-CE毛细管凝胶电泳：

将凝胶移到毛细管中作为支持介质进行的一种电泳，并在一定的电压下根据样品分子量的大小进行分离的方法。

非还原CE纯度百分比＝A主峰/A总*100％(A主峰为样品中主峰的峰面积，A总为所有峰面积之和。

CE测定用仪器：Sciex型号PA800plus

icIEF成像毛细管等点聚焦电泳：

根据蛋白质等电点pI不同进行分离的技术。

icIEF主峰含量百分比＝主峰峰面积/总面积*100％(总面积为酸性峰、主峰和碱性峰面积之和)。

icIEF测定所用仪器厂家Protein Si mple，型号Muarice。

蛋白浓度测定：

蛋白浓度测定仪器：紫外可见分光光度计，型号：Nano Drop 2000，光程为1mm。

示例性抗体药物组合物(制剂)制备工艺

第一步：FAP/CD40结合抗体(例如Ab10-A297V3-4，其重链、轻链序列分别为SEQ ID NO:22和20)与下述处方量的辅料混合配制成含FAP/CD40结合分子的制剂原液，经过滤后中控取样检测无菌。将原液过0.22μm滤芯过滤，收集滤液。

第二步：调节装量至1.15mL，将滤液灌装于2mL西林瓶中，加塞，分别于灌装开始、灌装中间、灌装结束时取样中控检测装量差异。

第三步：开启轧盖机，加铝盖，进行轧盖。

第四步：目检，确认产品无装量不准等缺陷。打印、粘贴西林瓶标签；打印纸盒标签，折叠纸盒，装盒，贴纸盒标签。

二、实施例与测试例

通过以下实施例进一步详细说明本披露。这些实施例仅用于说明性目的，而并不用于限制本披露的范围。

本披露实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例

本申请中FAP/CD40结合分子的制备、纯化方法已在申请号为WO2023025194 专利文件中记载，前述申请文件的全部内容均可引入本公开。

实施例1.抗FAP单克隆抗体的筛选和制备

1.1筛选抗原、检测抗原的序列和制备

人成纤维细胞激活蛋白(FAP；GeneBank登录号AAC51668)是一种分子量约为170kDa的丝氨酸寡肽酶，是同源二聚体。本公开使用的重组FAP蛋白序列、来源和用途如表2。

表2.重组蛋白氨基酸序列来源

1.2从人天然Fab噬菌体展示库中筛选h-FAP特异性结合抗体片段

以h-FAP-biotin抗原为靶分子，采用表面带有亲和素的磁珠捕获抗原特异性噬菌体，并用磁力架进行噬菌体的富集。用pH2.2的甘氨酸溶液洗脱抗原特异性噬菌体。

经二轮筛选，随机挑选284个克隆，采用噬菌体ELISA筛选阳性克隆，包括如下具体步骤：计数铺皿生长菌落，共计284个，接种96孔板，每孔含有400μL培养液(2YT+Amp+0.2％葡萄糖)，37℃下250rpm振摇培养6h。用抗原h-FAP-His包板，100ng/100μL/孔，4℃过夜。第二天，洗涤封闭96孔板后，每孔加100μL过夜培养的菌液，37℃下孵育1h，洗涤，加二抗(HRP标记的抗人IgG-Fab的抗体)，37℃下孵育40min，洗涤，加显色液，避光保存30min，酶标仪读取OD600数值。测序经两次筛选得到的共计122个阳性克隆，得到74个独特的VH(构成了VH富集库)、48个独特的κ轻链(构成了KLC富集库)和10个独特的λ轻链(构成了LLC富集库)。

1.3构建CHO细胞表面全长抗体展示库

1)构建全长抗体CHO细胞展示基因库，包括：用三套引物分别PCR扩增VH富集库、KLC富集库和LLC富集库。将三个富集库经酶切后插入相应的组件载体，构建相应的组件库。酶切KLC、LLC、VH组件库，电泳分析纯化酶切后的KLC片段库、LLC片段库和VH片段库。酶切全长抗体细胞展示载体，纯化载体片段。将酶切纯化的载体片段、KLC片段库、LLC片段库、VH片段库混合并连接。纯化连接产物，电转进入大肠杆菌，铺皿，37℃培养过夜，计数菌落。经检测，库容达到3.6×10E6，是理论多样性(74×58＝4292)的800倍以上。收集全部菌落，提取载体DNA，得到全长抗体细胞展示基因库。

2)构建h-FAP抗原特异性全长抗体细胞展示库，包括：用全长抗体细胞展示基因库载体DNA转化，构建全长抗体CHO细胞展示库。用潮霉素加压筛选细胞库。得到稳定转化细胞库，用PE标记的鼠抗人κ(或者λ)轻链抗体和FITC标记的h-FAP抗原双染细胞库，FACS分选PE和FITC双阳性细胞，每孔一个细胞，κ轻链库分选2块96孔板，λ轻链库分选1块96孔板，潮霉素加压培养。

3)FACS分析鉴定展示h-FAP抗原特异性抗体单细胞克隆，包括：潮霉素加压培养14天，得到稳定转化κ链单细胞克隆153个，λ链单细胞克隆50个。用0.5mM EDTA-PBS缓冲液消化细胞，用PE标记的鼠抗人κ(或者λ)轻链抗体和FITC标记的h-FAP抗原双染单细胞克隆，经FACS分析，得到PE和FITC荧光双阳性单细胞克隆138个。

4)克隆抗体基因，包括：通过FACS检测分析阳性克隆的亲和力，决定对45个克隆进行抗体基因PCR扩增。离心收集阳性克隆，弃上清，提取细胞基因组DNA，PCR扩增VH和LC，电泳分离扩增片段，测序分析，确定6个独特VH和6个独特κ，组合可得到12个有独特序列的克隆，其中的1个克隆的VH和VL的序列参见表3。

表3.h-FAP抗体VH及VL(KLC的κ)氨基酸序列

注：下划线为Kabat编号规则的CDR。

本公开还提供Ab10的重链全长和轻链全长序列。

>Ab10重链全长

>Ab10轻链全长

表4.抗FAP抗体的CDR

1.4构建CHO细胞表面全长抗体展示库

1)构建可溶性抗体表达载体，包括：分别酶切纯化具有独特序列阳性VH片段和LC片段。将VH片段插入可溶性重链表达载体(IgG1)，将LC片段插入可溶性轻链表达载体，送菌落测序确定并提取DNA。

2)表达纯化可溶性抗体，包括：悬浮培养扩增Expi293细胞。按上述确定的轻重链配对，轻链表达载体18μg，重链表达载体12μg的比例混合。将载体DNA与PEI以重量比1：2.5的比例混合，转化Expi293细胞，第六天收集培养液上清，Protein-A法纯化抗体。SDS-PAGE变性凝胶电泳分析，抗体纯度均达到90％以上，-80℃保存。

1.5ELISA结合测试

直接包被带His标签的FAP重组蛋白，加入抗体后，通过加入二抗(HRP偶联的抗人IgG的抗体)和HRP底物TMB检测抗体与抗原结合的活性。包括：用人FAP-His蛋白包被96孔酶标板，按0.5μg/mL浓度每孔100μL，4℃孵育过夜。充分洗涤，加入200μL/孔封闭液室温孵育2h。充分洗涤，每孔加入100μL用稀释液稀释好的抗FAP待测抗体。室温孵育1h，充分洗涤，每孔加入100μL用稀释液按1：20000倍稀释的HRP标记的羊抗人IgG二抗。室温孵育1h，充分洗涤，每孔加入100μL TMB，避光反应15min。加入50μL/孔的0.16M硫酸。Thermo MultiSkanFc酶标仪读取450nm OD值，计算抗FAP抗体的结合EC₅₀值，结果见表5。

表5.抗FAP抗体与人FAP抗原结合的亲和力EC₅₀值

1.6表面等离子共振技术(surface plasmon resonance,SPR)结合测试

选用CM5传感器芯片，流动相采用HBS-EP+缓冲溶液(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％surfactant P20)。抗人IgG(Fc)抗体用10mM醋酸钠缓冲液(pH 5.0)配制成30μg/mL溶液，进行氨基偶联固定。用HBS-EP+缓冲溶液配制各待测抗体，通过芯片通道上的抗人IgG(Fc)抗体进行捕获。用HBS-EP+缓冲溶液配制h-FAP-His作为分析物，2倍梯度稀释。将稀释好的抗体在30μL/min的流速下流过实验通道和参比通道，结合1min，解离15min。用10mM Glycine pH1.5作为再生缓冲液，10μL/min的流速下运行30秒。分析数据，表6结果显示，与对照抗FAP抗体28H1(专利US9266938B2的序列219和序列233)相比较，Ab10与抗原FAP的亲和力要高3-6倍。

表6.抗FAP抗体的SPR亲和力Ka、Kd及K_D值

其中，对照抗体28H1的重链轻链可变区序列如下：

>28H1的VH

>28H1的VL

1.7 FACS结合测试

用FACS实验检测抗FAP抗体在细胞上的结合特性。包括：构建过表达人FAP的CHO细胞系，铺板(1E5/孔)。加入待测抗体，100μL/孔，最高浓度为100nM，5倍稀释，共8个浓度，4℃孵育1h。加入抗hIgG Alexa Fluor-647作为二抗，按1:500比例4℃孵育30min，利用FACS进行检测。能结合FAP的抗体可以标记细胞。被标记的过表达人FAP的细胞的数量占所有细胞的百分比与抗体浓度之间的关系如图1所示，人FAP与抗体的结合EC₅₀值参见表7；被标记的过表达小鼠FAP的细胞的数量占所有细胞百分比与抗体浓度之间的关系如图2所示，其中Ab9、Ab14、Ab15为本申请筛选获得的另外3种抗FAP抗体。

表7.抗FAP抗体与人FAP抗原结合的亲和力EC₅₀值

实施例2.抗CD40纳米抗体(VHH)的筛选和制备

2.1免疫抗原，筛选抗原的序列和制备

选择带His标签的人CD40重组蛋白(h-CD40-His)，C端生物素标签的人CD40重组蛋白(h-CD40-biotin)，C端带His标签的猴CD40重组蛋白(cyno-CD40-His)。序列和来源见表8。所述蛋白试剂可用于下述各实施例实验中。

表8.重组蛋白氨基酸序列及来源

2.2羊驼免疫流程及效价检测

用h-CD40-his免疫羊驼，每两周免疫一次，共免疫四次。首次免疫时，将0.5mg抗原与弗氏完全佐剂(CFA)1mL混匀皮下注射，后三次免疫将0.25mg抗原与弗氏不完全佐剂(IFA)1mL混匀皮下注射。免疫前采集空白血清，第3次免疫后一周和第4次免疫后一周分别采50mL外周血分离淋巴细胞，检测血清效价。

2.3效价检测及噬菌体文库构建

羊驼经四次免疫后检测血清效价。效价合格后，分离PBMC，提取总RNA，检测纯度，反转录为DNA，两轮巢式PCR后将纯化载体与VHH目的片段酶切连接。电转，挑选克隆，获得噬菌体文库A库和B库。

2.4噬菌体文库亲和淘选及ELISA鉴定

以h-CD40抗原为靶分子，采用Gly-HCL酸洗脱方法进行筛选，洗脱特异噬菌体。经二轮筛选，从第一、二轮滴度测定平板随机挑选384个克隆，采用噬菌体ELISA筛选阳性克隆，检测450nm下光密度。根据测序结果，对序列进行序列比对和进化树分析，筛选出16条序列，其中功能较好的抗CD40抗体的氨基酸序列见表9和表10。

表9.抗CD40单域抗体序列

注:下划线为Kabat编号规则下的CDR。

表10.抗CD40抗体的CDR

2.5抗CD40单域抗体-Fc融合蛋白的表达纯化

将以上2条VHH分别与含有N297A突变的人IgG1-Fc进行连接，连接后的VHH-Fc融合蛋白序列见表11。下划线为人IgG1-Fc，加粗为N297A突变。

采用9E5-SELFNS作为CD40激动剂阳性对照(参见WO2020108611A1的序列58和序列59)。

表11.抗CD40单域抗体与人IgG1-Fc的融合蛋白序列

构建质粒，瞬时转染细胞，表达抗体，并纯化。经检测，获得目的抗体。

2.6 FACS结合测试

用FACS实验检测抗CD40抗体在细胞上的结合特性。包括：获得Raji单细胞，铺板。加入待测抗体，100μL/孔，最高浓度点为100nM，5倍稀释，获得共8个梯度点，4℃孵育1h。加入抗hIgG Alexa Fluor-647作为二抗，按1:500比例4℃孵育30min。FACS检测。使用CD40激动剂为阳性对照，各抗体EC₅₀见图3及表12。其中，A12为本申请筛选获得的另外一种抗CD40抗体。

表12.抗CD40抗体与人CD40抗原结合的亲和力EC₅₀值

对于用做FAP/CD40双特异性抗体中的CD40激动性抗体而言，其对CD40的亲和力EC₅₀不宜太高，否则会导致双特异性抗体优先结合CD40，更期望的是，双特异性抗体优先结合FAP，进而发挥作用。因此，A297具有更符合以上特性的优势，这在表13中也有所体现。

2.7抗CD40纳米抗体的活性检测

检测抗CD40抗体对CD40报告基因细胞的活化作用，根据EC₅₀评价CD40抗体的激动剂活性。包括：制备HEK-Blue^TMCD40L细胞(购自Invivogen Cat#hkb-cd40，该细胞稳定转染了人CD40基因和NF-κB介导的SEAP基因组，可以通过SEAP底物QUANTI-Blue检测上清中分泌的SEAP含量来表征CD40信号通路的活化水平)，培养基为含10％FBS、100μg/mL Normocin、100μg/mL Zeocin和30pg/mL Blasticidin的DMEM。将细胞以5E4/孔铺入96孔板，培养基为含10％FBS 和100μg/mL Normocin的DMEM，培养过夜，细胞贴壁后，每孔加入100μL梯度稀释的待测抗体，37℃过夜培养。将细胞离心，转移细胞上清到一个新96孔板中，加入180μL QUANTI-Blue底物溶液，避光孵育15分钟，用Envision酶标仪测定在620nm处的吸光度，计算EC₅₀值。使用CD40激动剂(9E5-SELFNS)为阳性对照，相对激动活性百分比(与200nM 9E5-SELFNS相比)与抗体浓度之间的关系EC₅₀见图4和表13。其中，A12为本申请筛选获得的另外一种抗CD40抗体。

表13.抗CD40抗体的激动活性EC₅₀值及其与阳性对照的相对激活活性百分比％

2.8抗CD40纳米抗体的人源化

根据以上结果，将A297进行人源化。在所获得的纳米抗体A297的VHH典型结构的基础上，将VHH可变区序列与抗体种系数据库比较，获得同源性高的人种系模板。本公开抗体A297优选人种系模板为IGHV3-48*03。再把CDR移植到人FR中，对影响抗体结构和功能的关键氨基酸进行回复突变，以恢复结合力和活性。各人源化序列如表14所示。

表14.抗CD40人源化抗体序列

将以上4条VHH分别连入含有S267E/L328F突变(根据EU编号)的人IgG1-Fc。连接后的VHH-Fc融合蛋白序列见表15。下划线为人IgG1-Fc，加粗为S267E/L328F突变。

表15.人源化抗CD40单域抗体与人IgG1-Fc(S267E/L328F)的融合蛋白序列

将以上4条VHH-Fc瞬时转染细胞并表达，纯化抗体。经检测，获得目标抗体蛋白。

2.9人源化CD40抗体对CD40高表达细胞株的亲和力

采用FACS检测人源化抗体与高表达人抗原蛋白CD40的细胞的结合能力。用CD40质粒(CD40 cDNA ORF Clone,Human,C-DYKDDDDKTag；Sino Biological；HG10774-CF)瞬时转染HEK293细胞，获得高表达CD40的HEK293细胞，用流式染色液(PBS+2％FBS)重悬，加入梯度稀释后的不同浓度的待检测抗体。冰上孵育1h后，PBS洗涤，400g离心5min。加入带有荧光基团Alexa Fluor 647 标记的羊抗人Fc抗体作为二抗，冰浴染色1h，PBS清洗两遍后用FACS检测细胞表面的荧光信号。结果如图5所示，EC₅₀值见表16。本公开人源化抗体对CD40高表达细胞株均有较高的亲和力。

表16.各人源化抗CD40抗体与人CD40高表达细胞株的亲和力EC₅₀值

2.10人源化CD40抗体对HEK-Blue^TM CD40L细胞的活化作用

通过检测CD40抗体在被FcγRIIb交联的情况下对HEK-Blue^TMCD40L细胞的活化作用来评价CD40抗体的体外激动活性。人源化CD40抗体的Fc中带有的S267E/L328F突变，增强了IgG1Fc与FcγRIIb的亲合力，因此也增强了FcγRIIb对抗体的交联。通过FcγRIIb介导的CD40抗体对HEK-Blue^TM CD40L细胞的活化作用模拟了CD40抗体在被完全交联的情况下的激动剂活性。用FcγRIIb质粒(CD32B/Fcgr2b cDNA ORF Clone,Human,N-His tag；Sino Biological；HG10259-NH)瞬时转染HEK293细胞，获得高表达FcγRIIb的HEK293细胞。将HEK-Blue^TMCD40L细胞以5E4/孔铺入96孔细胞培养板(培养基为DMEM，10％FBS，100μg/mL Normocin)，加入5E4/孔表达FcγRIIb的HEK293细胞,每孔加入100μL梯度稀释的待测抗体，37℃过夜培养。将细胞离心，转移20μL细胞上清到一个新96孔板中，加入180μL QUANTI-Blue底物溶液，避光孵育30min，用Envision酶标仪测定在620nm处的吸光度，计算EC₅₀值以及Emax值(相对无抗体组荧光强度)，以EC₅₀值来评价CD40抗体的体外细胞激动剂活性。

CD40抗体通过FcγRIIb介导的HEK-Blue^TMCD40L细胞的活化作用如图6所示,EC₅₀值及Emax值(相对荧光强度)见表17。

结果显示，在上述报告基因细胞体系下，人源化CD40抗体在被FcγRIIb交联的情况下，人源化CD40抗体的激动剂活性均较强。

表17.各人源化抗CD40抗体对HEK-Blue^TMCD40L细胞的活化作用

实施例3.抗FAP/CD40双特异性抗体的设计和制备

3.1抗FAP/CD40双特异性抗体的设计及表达纯化

根据人源化后的抗CD40抗体筛选结果，选择A297V3；根据抗FAP抗体的筛选结果，选择Ab10，进行抗FAP/CD40双特异性抗体的构建。双特异性抗体采用Ab10为IgG骨架，在Ab10的两条重链的C端各串联1个或2个或3个抗CD40纳米抗体。CD40纳米抗体之间以及与Ab10重链C端的连接子采用“GGGGSGGGGS”。每个双特异性抗体分别含有2价、4价和6价的CD40纳米抗体，如图7所示。对于抗体名称，例如，对于Ab10-A297V3-2，Ab10代表采用的抗FAP抗体，A297V3代表采用的人源化抗CD40抗体，最后的2代表CD40的价数为2价。其它抗体均采用该命名规则。瞬时转染与表达、纯化抗体采用实施例2的2.5中方法。经检测，获得目的双特异性抗体分子。各双特异性抗体分子氨基酸序列如下。

>Ab10-A12V2-2的轻链

>Ab10-A297V3-2的重链

>Ab10-A297V3-4的重链

>Ab10-A297V3-6的重链

Ab10-A297V3-2、Ab10-A297V3-4、Ab10-A297V3-6的轻链均为SEQ ID NO：20所示。

注：重链的下划线为CH1和Fc区，轻链的下划线为CL区，斜体为连接子，加粗为LALA(L234A和L235A突变)。

3.2抗FAP/CD40双特异性抗体的抗原结合亲和力检测

采用SPR(GE Healthcare；Biacore 8K)检测抗FAP/CD40双特异性抗体与其抗原人FAP蛋白(Acro公司，FAP-H5244)、人CD40蛋白(Acro公司，CD0-H5228)之间的亲和力。选用CM5传感器芯片，流动相采用HBS-EP+缓冲溶液(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％surfactant P20)。将抗人IgG(Fc)抗体通过氨基偶联固定。用HBS-EP+缓冲溶液分别配制各待测抗体作为配体，通过芯片通道上的抗人IgG(Fc)抗体进行捕获。不同种属的抗原蛋白作为分析物。结果见表18、表19，显示制备成双特异性抗体后，不影响抗体与FAP的结合，且双特异性抗体对CD40的亲和力更低，将优先结合FAP，进而发挥作用。

表18.抗FAP/CD40双特异性抗体与人FAP的亲和力

表19.抗FAP/CD40双特异性抗体与人CD40的亲和力

3.3抗FAP/CD40双特异性抗体对高表达FAP细胞株的亲和力检测

本实验通过FACS检测抗FAP/CD40双特异性抗体对高表达人FAP、食蟹猴FAP和小鼠FAP的CHOK1细胞稳转株的结合情况。显示双特异性抗体能结合人、小鼠、食蟹猴的细胞表面FAP抗原，且结合能力与单抗相类似，参见图8A-8C，EC₅₀值见表20。其中，Ab10-A12V2-2和Ab10-A12V2-4为本申请筛选获得的另外2种抗FAP/CD40双特异性抗体。

表20.抗FAP/CD40双特异性抗体与人、鼠细胞表面FAP抗原结合的EC₅₀值

3.4抗FAP/CD40双特异性抗体对高表达CD40细胞株的亲和力检测

利用FACS检测双特异性抗体对于细胞表面CD40的结合情况，包括高表达人CD40的HEK-BlueTMCD40L细胞(Invivogen,Cat#hkb-cd40)，瞬转食蟹猴CD40质粒(Sino Biological,cat#CG90970-UT)使其高表达食蟹猴CD40的HEK293细胞。结果显示，双特异性抗体能够结合人和食蟹猴的细胞膜表面CD40。详见图9A、9B，图11和表21。其中，Ab10-A12V2-2和Ab10-A12V2-4为本申请筛选获得的另外2种抗FAP/CD40双特异性抗体。

表21.双特异性抗体与人细胞表面CD40抗原结合的EC₅₀值

3.5人源化抗FAP/CD40双特异性抗体FAP依赖性促DC成熟活性检测

为了验证抗FAP/CD40双特异性抗体对树突状细胞成熟的影响，利用CD14阳性磁珠从新鲜PBMC中分离单核细胞，用含50ng/mL的GM-CSF和50ng/mL的 hIL-4的1640培养基培养5天。每2-3天半数换液，第5天将诱导成的树突状细胞以1E5/孔的密度加入96孔板中，再分别加入处于对期生长的CHOK1和过表达人FAP的CHOK1细胞。同时加入梯度稀释好的待测抗体，1μg/mL LPS作为阳性对照，100nM hIgG1和无抗体组作为阴性对照。培养48h后，用FACS检测树突状细胞表面分子CD83的表达。

如图11(无CHOK1/FAP)和图12(有CHOK1/FAP)，结果显示，2价分子Ab10-A297V3-2在没有CHOK1/FAP情况下不能活化DC，其CD40激动剂活性完全依赖于FAP介导的交联(crosslink)。而4价分子Ab10-A297V3-4在没有CHOK1/FAP细胞存在情况下能进够诱导DC细胞的成熟，在有CHOK1/FAP存在的情况下，DC细胞的激活能进一步增强。因此，无论对于2价分子和4价分子而言，树突细胞表面表达的FAP均能提供双特异性抗体的激活窗口。其中，Ab10-A12V2-2和Ab10-A12V2-4为本申请筛选获得的另外2种抗FAP/CD40双特异性抗体。

实施例4.抗FAP/CD40双特异性抗体Ab10-A297V3-2/4的小鼠体内药效

B-hCD40人源化小鼠来自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司(种属Mus muscμLus，品系C57BL/6，雌性)。在小鼠肠癌MC38细胞中转染小鼠全长FAP质粒，构建稳转株，接种细胞5×10⁵/0.1mL/只于小鼠右腋皮下，当平均肿瘤体积长至80-100mm³时，挑选个体肿瘤体积合适的小鼠，随机分组，每组6只。小鼠腹腔注射给药，每周两次，首次给药48h后抽取外周血检测B细胞数目及细胞表面CD86表达，分组后第8天检测血液中的谷丙转氨酶ALT(Alanine Aminotransferase)和谷草转氨酶AST(Aspartate aminotransferase)浓度，给药4次后停止给药，直至hIgG1对照组有小鼠肿瘤体积超过2000mm³给药最后一次，最后一次给药24h后检测血常规。

4.1 Ab10-A297V3-2或Ab10-A297V3-4单剂量小鼠体内药效及毒性

在单一剂量的情况下比较了Ab10-A297V3-2或Ab10-A297V3-4与CD40激动剂单抗9E5-mIgG1的抗肿瘤活性。9E5-mIgG1与9E5-SELFNS具有相同的可变区，只是重、轻链恒定区采用小鼠mIgG1重链的恒定区以及小鼠kappa链的恒定区。由于CD40激动剂单抗的活性依赖于FcγRIIb对其Fc的交联，因此采用了小鼠IgG1重链恒定区的9E5-mIgG1可以更好地在小鼠体内展示CD40的激动剂活性。在小鼠体内药效实验中，9E5-mIgG1是比9E5-SELFNS更好的对照抗体。

Ab10-A297V3-4抗肿瘤活性无论是从TGI(Tumor growth inhibition，肿瘤生长抑制)还是CR(Complete Response，完全响应)的角度上，均强于同摩尔剂量的CD40单抗9E5-mIgG1，序列如下：

>9E5-mIgG1重链

>9E5-mIgG1轻链

两倍摩尔浓度下的Ab10-A297V3-2的抗肿瘤活性依然弱于Ab10-A297V3-4，与9E5-mIgG1相当。

通过检测小鼠外周血B淋巴细胞的激活来检测双特异性抗体分子对于外周CD40的激活，结果与体外实验一致。Ab10-A297V3-4由于具有部分不依赖于FAP的CD40激活活性，所以能部分激活外周B淋巴细胞，而Ab10-A297V3-2由于对CD40的激活完全依赖于FAP，所以未检测到显著的外周B细胞的激活(One-Way ANOVA)。所测抗体信息如表22，体内药效结果如图13A(各组抗体相对hIgG1对照组均P<0.0001)和图13B。

表22.所测试抗体信息

从小鼠毒性上来看，Ab10-A297V3-2和Ab10-A297V3-4都未产生小鼠体重上的变化，参见图13C。

从血常规的检测来看，与同摩尔剂量hIgG1对照组相比，9E5-mIgG1能引发一定程度的血小板下降，与肝毒性相类似；Ab10-A297V3-2没有引发血小板下降；Ab10-A297V3-4能引发与9E5-mIgG1同等程度的血小板下降，参见图13D。Ab10-A297V3-2/4的小鼠体内给药剂量和肿瘤生长抑制率统计详见表23。

其中，TGI的计算公式为：

TGI＝(空白组当天肿瘤体积-给药当天组肿瘤体积)/(空白组当天肿瘤体积)*100％

表23.Ab10-A297V3-2或4的小鼠体内给药剂量和肿瘤生长抑制率

从ALT和AST的检测中可以看出，9E5-mIgG1通过CD32B(即FcγRIIB)介导的交联，在给药后第8天显示出一定的肝毒性。Ab10-A297V3-4由于具有一定的本底激活，所以也具有一定的肝毒性，但是由于其激活不依赖于CD32B，所以肝毒性低于9E5-mIgG1；Ab10-A297V3-2由于依赖FAP才能激活CD40，因此完全没有肝毒性，参见图13E。

4.2 Ab10-A297V3-2或Ab10-A297V3-4多剂量小鼠体内药效和毒性

为了摸索Ab10-A297V3-2或4的治疗窗，进一步提高了Ab10-A297V3-2的剂量，并降低了Ab10-A297V3-4分子的剂量，详见表24。当继续升高2价Ab10-A297V3-2分子的给药剂量时，其抗肿瘤活性并能没有得到进一步的提高，也没有观测到外周B淋巴细胞的激活。降低Ab10-A297V3-4的给药剂量至1.3mg/kg(即9E5-mIgG1的1/3摩尔剂量)时，其仍有92.6％的TGI，远远好于9E5-mIgG1。

为了在体内实验中评估4价CD40双特异性抗体中FAP抗体的作用，比较了Ab10-A297V3-4和另一个没有FAP结合功能的4价CD40双特异性抗体(同种型-A297V3-4)的抗肿瘤活性。同种型-A297V3-4与Ab10-A297V3-4的构造完全一致，除了将抗FAP部分的Ab10替换为另一个不结合任何鼠源蛋白的同种型抗体。

图14A-14E的结果显示，4价CD40双特异性抗体即使不结合FAP就有较好的抗肿瘤活性，而结合FAP则抗肿瘤活性更强。从毒性上来看，Ab10-A297V3-2提高剂量后仍未见体重、ALT/AST以及血小板数目的异常，而对于Ab10-A297V3-4，在降低剂量后，之前在高剂量下观测到的ALT/AST以及血小板数目上的异常消失了，而仍保留了很强的抗肿瘤效果(P<0.0001)，说明对比CD40单抗9E5-mIgG1，无论是Ab10-A297V3-2和Ab10-A297V3-4都具有更宽的治疗窗。抗体信息见表24，Ab10-A297V3-2或Ab10-A297V3-4多剂量体内药效统计数据见表25。

表24.所测试抗体信息

表25.Ab10-A297V3-2/4多剂量体内药效统计

以下实施例中所使用的抗FAP/CD40双特异性抗体为前述Ab10-A297V3-4，其重链、轻链氨基酸序列分别为SEQ ID NO:22和20。

实施例5.抗FAP/CD40双特异性抗体制剂缓冲体系和pH值的筛选

配制下列缓冲液，制备抗FAP/CD40双特异性抗体浓度为20mg/mL的抗体制剂，进行高温(40℃)稳定性研究。

1)10mM醋酸-醋酸钠，pH5.5

2)10mM组氨酸-盐酸组氨酸，pH5.5

3)10mM组氨酸-盐酸组氨酸，pH6.0

4)10mM组氨酸-盐酸组氨酸，pH6.5

5)10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH5.0

6)10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH5.5

7)10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH6.0

8)10mM磷酸盐缓冲液，pH6.5

9)10mM磷酸盐缓冲液，pH7.0

10)10mM磷酸盐缓冲液，pH7.5

表26.缓冲体系和pH值筛选结果-1

表27.缓冲体系和pH值筛选结果-2

实验结果：

外观结果显示：处方F1～F10经40℃存放4周后，处方F2(组氨酸盐缓冲液，pH 5.5)、F3(组氨酸盐缓冲液，pH 6.0)和F5(琥珀酸盐缓冲液，pH 5.0)未见明显颗粒；其余处方均发现可见颗粒。表明组氨酸盐缓冲液(pH 5.5、pH 6.0)和琥珀酸盐缓冲液(pH 5.0)优于其它缓冲体系。

SEC结果显示：40℃高温存放4周后，所有处方的SEC纯度均有所下降，其中组氨酸盐体系(F2～F4)和醋酸盐体系(F1)的下降程度小于琥珀酸盐体系(F5～F7)和磷酸盐缓冲体系(F8～F10)，且处方F2和F3的单体纯度变化不明显。

CEX结果显示：经由40℃存放4周后，处方F1和F3主峰下降约为20％，处方F2主峰下降程度仅次于F1和F3，约为24％，其他处方主峰下降更为明显。

NR-CE结果显示：在40℃存放4周后，处方F1、F2、F5、F6与T0相比纯度下降最少，约为6％；处方F3次之；其余处方纯度下降更为明显。

综上所述，在制剂外观、SEC、CEX和NR-CE检测结果上，处方F2和F3较其他处方更优，展示出更好的稳定性。因此选用组氨酸盐缓冲体作为最终的缓冲体系。选用F2(10mM组氨酸盐缓冲液，pH 5.5)和F3(10mM组氨酸盐缓冲液，pH 6.0)作为下一轮pH细筛所用缓冲体系。

实施例6.抗FAP/CD40双特异性抗体制剂中表面活性剂的筛选

选择10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.0和pH5.5的缓冲体系，制备含25mg/mL抗FAP/CD40双特异性抗体，80mg/mL蔗糖，不同种类和浓度的表面活性剂的制剂，考察反复冻融和震荡的稳定性：

15)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.0，0.2mg/mL聚山梨酯80；

16)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，0.4mg/mL聚山梨酯80；

17)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，0.8mg/mL聚山梨酯80；

18)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，2mg/mL泊洛沙姆188。

表28.表面活性剂种类及浓度筛选结果

备注：LY＝淡黄色；SO＝微乳光；PF＝无可见颗粒；AFP＝少量颗粒。*：1表示1个颗粒。

实验结果

外观结果表明：经冻融5轮后，处方F16观察到1个颗粒，处方F15，F17和F18外观均出现少量可见颗粒。经振摇3天后，处方F15～F17未见可见颗粒，处方F18出现少量可见颗粒。

不溶性微粒结果表明：经振摇3天、冻融5轮后，处方F15～F18的颗粒数未见明显变化，且各处方之间差异不大。

SEC结果表明：经冻融5轮、振摇3天后，处方F15～F18SEC单体含量未见明显变化，处方之间差异不大。

CEX结果表明：经由振摇3天、冻融5轮后，处方F15～F18主峰、酸峰、碱峰无明显变化，处方之间差异不大。

NR-CE结果表明：经冻融5轮、振摇3天后，处方F15～F18纯度含量未见明显变化。处方间差异不大。

综上所述，在组氨酸盐缓冲体系、pH 5.0～5.5范围内：从外观结果来看，冻融5轮后，处方F15～F18均观察到可见颗粒，其中处方F16只有1个颗粒相较于其他处方更好；振摇3天后，处方F18观察到少量颗粒，其他处方均未见可见颗粒。不同处方的不溶性微粒以及各纯度结果均未见明显差异。因此选取聚山梨酯80作为表面活性剂，含量为0.04％(w/v)。

实施例7.抗FAP/CD40双特异性抗体制剂中辅料的筛选

选择10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲体系，制备含0.4mg/mL聚山梨酯80，不同辅料及不同抗体浓度的抗FAP/CD40双特异性抗体制剂：

19)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.0，8％蔗糖，25mg/mL抗FAP/CD40双特异性抗体；

20)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，8％蔗糖，25mg/mL抗FAP/CD40双特异性抗体；

21)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，1％蔗糖+4％甘露醇，25mg/mL抗FAP/CD40双特异性抗体；

22)10mM精氨酸-谷氨酸pH5.0，8％蔗糖，25mg/mL抗FAP/CD40双特异性抗体；

23)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，8％蔗糖+0.01％EDTA，25mg/mL抗FAP/CD40双特异性抗体；

24)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，8％蔗糖+0.01％EDTA，5mg/mL抗FAP/CD40双特异性抗体；

25)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，8％蔗糖，5mg/mL抗FAP/CD40双特异性抗体；

将上述处方放置在2～8℃、25℃和40℃条件下，考察其稳定性，同时考察反复冻融稳定性。

表29.抗FAP/CD40双特异性抗体辅料筛选结果

备注：LY＝淡黄色；SO＝微乳光；O＝乳光；PF＝无可见颗粒；AFP＝少量颗粒。N/A：未
检测。

实验结果

外观结果表明：经冻融后，处方F21出现可见颗粒，并且随冻融次数的增加，乳光程度逐渐增加，其余处方无可见颗粒。经过40℃存放4周后，处方F19和F21出现少量可见颗粒，其余处方无可见颗粒。经过2～8℃和25℃存放4周后，所有处方均未见可见颗粒。

SEC结果表明：经由40℃存放4周后，所有处方单体含量未见明显变化。经冻融5轮后，SEC单体含量未见明显变化。

CEX结果表明：经由40℃存放4周后，处方F22～F24主峰下降较少，其余处方主峰下降更明显。经冻融5轮，CEX主峰、酸峰和碱峰含量未见明显变化。

NR-CE结果表明：经40℃存放4周后，处方F19下降最多，其他处方纯度也略有下降，但下降幅度相当。冻融5轮后，所有处方纯度含量未见明显变化，处方间差异不大。

综上所述，从外观结果来看，冻融5轮后，处方F21较其他处方相比，观察到少量颗粒且乳光程度增强；经40℃孵育4周后，处方F19和F21观察到少量颗粒，其他处方未见明显变化。各处方SEC单体纯度未见明显变化。从CEX的结果来看，样品经40℃孵育4周后，处方F20～F24相比其他处方主峰含量下降较少。从NR-CE结果来看，经40℃孵育4W后，处方F19下降最多，其他处方纯度均略有下降。因此，选择处方F20(10mM组氨酸缓冲液，8％蔗糖，0.04％PS80，pH 5.5，蛋白浓度25mg/mL)。

实施例8.抗FAP/CD40双特异性抗体制剂中蛋白浓度的筛选

选择10mM醋酸-组氨酸pH5.0和pH5.5的缓冲体系，制备8％蔗糖，0.8mg/mL聚山梨酯80，不同抗体浓度的抗FAP/CD40双特异性抗体制剂：

26)10mM醋酸-组氨酸pH5.0，50mg/mL抗FAP/CD40双特异性抗体；

27)10mM醋酸-组氨酸pH5.0，80mg/mL抗FAP/CD40双特异性抗体；

28)10mM醋酸-组氨酸pH5.0，100mg/mL抗FAP/CD40双特异性抗体；

29)10mM醋酸-组氨酸pH5.5，50mg/mL抗FAP/CD40双特异性抗体；

分别考察各个处方在5℃、25℃条件下的稳定性。

表30.抗FAP/CD40双特异性抗体浓度筛选结果

外观结果表明：不同抗体浓度的处方在5℃和25℃放置3个月后，均未发生明显变化，稳定性较好。

SEC结果表明：F27和F28高浓度处方25℃放置3个月后单体含量出现下降趋势，且随着浓度越高，下降越明显，其中F28处方(100mg/mL)25℃放置3个月后，单体纯度下降至95％左右。5℃放置3个月后各处方均未见明显变化。

CEX结果表明：5℃放置3个月或者25℃放置3个月后各处方主峰含量均略有下降，各处方间差异不大；

NR-CE结果表明：在25℃放置3个月后F29处方主峰下降约5％，其他处方均未出现明显下降趋势。

综上所述，蛋白浓度在高达100mg/mL且pH在5.0时稳定性较好。

实施例9.其它可选择制剂配方

此外，本发明还提供其它制剂配方的抗FAP/CD40双特异性抗体药物制剂，其中抗FAP/CD40双特异性抗体为本申请的Ab10-A297V3-4，其重链、轻链序列分别为SEQ ID NO:22和20，包含但不限于：

(1)25mg/mL FAP/CD40双特异性抗体，80mg/mL蔗糖，0.6mg/mL聚山梨酯80，和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH5.5；

(2)25mg/mL FAP/CD40双特异性抗体，80mg/mL蔗糖，0.6mg/mL聚山梨酯80，和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH5.3；

(3)25mg/mL FAP/CD40双特异性抗体，80mg/mL蔗糖，0.6mg/mL聚山梨酯80，和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH5.2；

(4)25mg/mL FAP/CD40双特异性抗体，80mg/mL蔗糖，0.6mg/mL聚山梨酯80，和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH5.0；

(5)25mg/mL FAP/CD40双特异性抗体，80mg/mL蔗糖，0.4mg/mL聚山梨酯80，和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH5.5；

(6)25mg/mL FAP/CD40双特异性抗体，80mg/mL蔗糖，0.4mg/mL聚山梨酯80，和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH5.3；

(7)25mg/mL FAP/CD40双特异性抗体，80mg/mL蔗糖，0.4mg/mL聚山梨酯80，和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH5.2；

(8)25mg/mL FAP/CD40双特异性抗体，80mg/mL蔗糖，0.4mg/mL聚山梨酯80，和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH5.0；

(9)25mg/mL FAP/CD40双特异性抗体，80mg/mL蔗糖，0.4mg/mL聚山梨酯80，和10mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.0；

(10)25mg/mL FAP/CD40双特异性抗体，80mg/mL蔗糖，0.4mg/mL聚山梨酯80，和10mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.5；

(11)25mg/mL FAP/CD40双特异性抗体，80mg/mL蔗糖，0.4mg/mL聚山梨酯80，和10mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.3；

(12)25mg/mL FAP/CD40双特异性抗体，80mg/mL蔗糖，0.4mg/mL聚山梨酯80，和10mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.2；

(13)25mg/mL FAP/CD40双特异性抗体，80mg/mL蔗糖，0.6mg/mL聚山梨酯80，和10mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.0；

(14)25mg/mL FAP/CD40双特异性抗体，80mg/mL蔗糖，0.6mg/mL聚山梨酯80，和10mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.5；

(15)25mg/mL FAP/CD40双特异性抗体，80mg/mL蔗糖，0.6mg/mL聚山梨酯80，和10mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.3；

(16)25mg/mL FAP/CD40双特异性抗体，80mg/mL蔗糖，0.6mg/mL聚山梨酯80，和10mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.2；

(17)10mg/mL FAP/CD40双特异性抗体，80mg/mL蔗糖，0.4mg/mL聚山梨酯80，和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH5.5；

实验结果表明，上述制剂配方的FAP/CD40双特异性抗体制剂均具有良好的稳定性，可应用于FAP/CD40双特异性抗体药物的配制。

Claims

一种药物组合物，其包含FAP/CD40结合分子和缓冲剂，其中所述FAP/CD40结合分子包含特异性结合FAP的第一抗原结合结构域和特异性结合CD40的第二抗原结合结构域，所述特异性结合FAP的第一抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，其中：

1)所述HCDR1、HCDR2、HCDR3分别包含如SEQ ID NO:3、4、5所示的氨基酸序列；所述LCDR1、LCDR2、LCDR3分别包含如SEQ ID NO:6、7、8所示的氨基酸序列；

或2)所述HCDR1、HCDR2、HCDR3分别包含如SEQ ID NO:3、4、5所示的氨基酸序列；所述LCDR1、LCDR2、LCDR3分别包含如SEQ ID NO:6、32、8所示的氨基酸序列，

其中所述缓冲剂选自醋酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、组氨酸盐缓冲剂或磷酸盐缓冲剂，优选为组氨酸盐缓冲剂，更优选地为组氨酸-盐酸盐缓冲剂或组氨酸-醋酸盐缓冲剂，最优选地为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂或组氨酸-醋酸缓冲剂。
如权利要求1所述的药物组合物，其中所述FAP/CD40结合分子中特异性结合CD40的第二抗原结合结构域包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:12、13、14所示的氨基酸序列。
如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述FAP/CD40结合分子中特异性结合FAP的第一抗原结合结构域中：

所述重链可变区包含如SEQ ID NO：1所示或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：2所示或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列。
如权利要求2或3所述的药物组合物，其中所述FAP/CD40结合分子中特异性结合CD40的第二抗原结合结构域中的免疫球蛋白单一可变结构域包含如SEQ ID NO：11、16至19任一所示或与SEQ ID NO：11、16至19任一具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
如权利要求2至4任一项所述的药物组合物，其中所述FAP/CD40结合分子中特异性结合CD40的第二抗原结合结构域包含2、3、4、5或6个所述免疫球蛋白单一可变结构域。
如权利要求2至5中任一项所述的药物组合物，其中所述FAP/CD40结合分子中所述特异性结合FAP的第一抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，其中，

所述特异性结合CD40的第二抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合FAP的第一抗原结合结构域的重链可变区的N端；

所述特异性结合CD40的第二抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合FAP的第一抗原结合结构域的重链可变区的C端；

所述特异性结合CD40的第二抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合FAP的第一抗原结合结构域的轻链可变区的N端；和/或

所述特异性结合CD40的第二抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合FAP的第一抗原结合结构域的轻链可变区的C端。
如权利要求2至6中任一项所述的药物组合物，其中所述FAP/CD40结合分子中特异性结合CD40的第二抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域与特异性结合FAP的第一抗原结合结构域直接或通过连接子相连接；

优选地，所述连接子为具有如(G₄S)_x所示的氨基酸序列，其中，x独立地选自1-20的整数；

更优选地，所述连接子为(G₄S)₂、(G₄S)₃或(G₄S)₄所示的氨基酸序列。
如权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述FAP/CD40结合分子还包含人免疫球蛋白Fc区；

优选地，所述Fc区是人IgG1或IgG4的Fc区；

更优选地，所述人IgG1具有去除或降低Fc效应器功能的突变；

最优选地，所述人IgG1具有选自N297A、D265A/N297A、L234A/L235A、L234A/L235A/P329G、L234E、L234F、L234E/L235F和L234E/L235F/P329G的突变。
如权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其中所述FAP/CD40结合分子中特异性结合FAP的第一抗原结合结构域包含重链和轻链：

优选地，所述重链为IgG1或IgG4同种型，所述轻链为Kappa同种型；

更优选地，所述重链为SEQ ID NO：24所示或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述轻链为SEQ ID NO：25所示或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列。
如权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，其中所述FAP/CD40结合分子包含第一多肽链和第二多肽链，其中：

所述第一多肽链包含如SEQ ID NO：21-23中任一所示或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列，第二多肽链包含如SEQ ID NO：20所示或与之具有至少90％同一性的氨基酸序列；

优选地，所述FAP/CD40结合分子中含有两条相同的第一多肽链和两条相同的第二多肽链。
如权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，其中所述FAP/CD40结合分子为抗FAP/CD40双特异性抗体。
如权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含表面活性剂，优选地所述表面活性剂选自聚山梨酯和泊洛沙姆中的一种或多种，更优选地所述表面活性剂为聚山梨酯，最优选地所述表面活性剂为聚山梨酯80。
如权利要求1至12中任一项所述的药物组合物，其中药物组合物还包含糖类，优选地所述糖类选自蔗糖、葡萄糖、海藻糖和麦芽糖中的一种或多种，更优选地所述糖类为蔗糖。
如权利要求1至13中任一项所述的药物组合物，其还包含选自多元醇和金属螯合剂中的一种或多种的辅料，

优选地，其中所述多元醇选自甘油、甘露醇和山梨醇中的一种多种；所述金属螯合剂选自乙二胺四乙酸或其药用盐；

更优选地，其中所述多元醇为甘露醇；所述金属螯合剂为乙二胺四乙酸。
如权利要求1至14中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为3.5-7，优选地为4-6.5，更优选地为4.2-6.2，最优选地为4.5-6。
如权利要求1至15中任一项所述的药物组合物，其中所述FAP/CD40结合分子的浓度为0.01mg/mL-500mg/mL，优选地为0.1mg/mL-400mg/mL，更优选地为0.5mg/mL-200mg/mL，最优选地为1mg/mL-150mg/mL。
如权利要求1至16中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂的浓度为0.1mM-50mM，优选地为0.5mM-40mM，更优选地为1mM-30mM，最优选地为5mM-20mM。
如权利要求12至17中任一项所述的药物组合物，其中所述表面活性剂的浓度为0.01mg/mL-10mg/mL，优选地为0.05mg/mL-5mg/mL，更优选地为0.1mg/mL-3mg/mL，最优选地为0.2mg/mL-2mg/mL。
如权利要求13至18中任一项所述的药物组合物，其中所述糖类浓度为1mg/mL-200mg/mL，优选地为10mg/mL-150mg/mL，更优选地为30mg/mL-120mg/mL，最优选地为50mg/mL-100mg/mL。
如权利要求14至19中任一项所述的药物组合物，其中所述辅料的浓度为0.001％w/v-20％w/v，优选地为0.005％w/v-15％w/v，更优选地为0.008％w/v-10％w/v，最优选地为0.01％w/v-8％w/v。
一种药物组合物，其包含：

如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；

组氨酸盐缓冲剂，优选地为组氨酸盐酸盐缓冲剂或组氨酸醋酸盐缓冲剂，更优选地为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂或组氨酸-醋酸缓冲剂；

聚山梨酯；

蔗糖；

任选地，所述组合物进一步包含甘露醇或乙二胺四乙酸。
如权利要求21所述的药物组合物，其包含以下1)-4)中任一组：

1)0.01mg/mL-500mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；

0.1mM-50mM组氨酸盐缓冲剂，优选地为组氨酸盐酸盐缓冲剂或组氨酸醋酸盐缓冲剂，更优选地为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂或组氨酸-醋酸缓冲剂；

0.01mg/mL-10mg/mL聚山梨酯；

1mg/mL-200mg/mL蔗糖；

任选地，所述药物组合物进一步包含0.1％w/v-15％w/v甘露醇或0.001％w/v-5％w/v乙二胺四乙酸；

且所述药物组合物的pH为3.5-7；

2)0.1mg/mL-400mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；

0.5mM-40mM组氨酸盐缓冲剂，优选地为组氨酸盐酸盐缓冲剂或组氨酸醋酸盐缓冲剂，更优选地为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂或组氨酸-醋酸缓冲剂；

0.05mg/mL-5mg/mL聚山梨酯；

10mg/mL-150mg/mL蔗糖；

任选地，所述药物组合物进一步包含0.5％w/v-12％w/v甘露醇或0.001％w/v-1％w/v乙二胺四乙酸；

且所述药物组合物的pH为4-6.5；

3)0.5mg/mL-200mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；

1mM-30mM组氨酸盐缓冲剂，优选地为组氨酸盐酸盐缓冲剂或组氨酸醋酸盐缓冲剂，更优选地为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂或组氨酸-醋酸缓冲剂；

0.1mg/mL-3mg/mL聚山梨酯；

30mg/mL-120mg/mL蔗糖；

任选地，所述药物组合物进一步包含1％w/v-10％w/v甘露醇或0.005％w/v-0.1％w/v乙二胺四乙酸；

且所述药物组合物的pH为4.2-6.2；

4)1mg/mL-150mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；

5mM-20mM组氨酸盐缓冲剂，优选地为组氨酸盐酸盐缓冲剂或组氨酸醋酸盐缓冲剂，更优选地为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂或组氨酸-醋酸缓冲剂；

0.2mg/mL-2mg/mL聚山梨酯；

50mg/mL-100mg/mL蔗糖；

任选地，所述药物组合物进一步包含1％w/w-10％w/w甘露醇或0.005％w/w-0.1％w/w乙二胺四乙酸；

且所述药物组合物的pH为4.5-6。
如权利要求21所述的药物组合物，其包含以下1)-21)中任一组：

1)1-150mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸盐酸盐缓冲剂或组氨酸醋酸盐缓冲剂，优选地为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂或组氨酸-醋酸缓冲剂；

0.2mg/mL-1mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为4.5-6；

2)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；优选地为约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约25mg/mL；

约10mM组氨酸盐酸盐缓冲剂，优选地为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂；

约0.4mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.5；

3)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；优选地为约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约25mg/mL；

约10mM组氨酸盐酸盐缓冲剂，优选地为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂；

约0.4mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.3；

4)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；优选地为约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约25mg/mL；

约10mM组氨酸盐酸盐缓冲剂，优选地为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂；

约0.4mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.2；

5)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；优选地为约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约25mg/mL；

约10mM组氨酸盐酸盐缓冲剂，优选地为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂；

约0.4mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5；

6)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；优选地为约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约25mg/mL；

约10mM组氨酸盐酸盐缓冲剂，优选地为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂；

约0.6mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.5；

7)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；优选地为约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约25mg/mL；

约10mM组氨酸盐酸盐缓冲剂，优选地为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂；

约0.6mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.3；

8)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；优选地为约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约25mg/mL；

约10mM组氨酸盐酸盐缓冲剂，优选地为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂；

约0.6mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.2；

9)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；优选地为约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约25mg/mL；

约10mM组氨酸盐酸盐缓冲剂，优选地为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲剂；

约0.6mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5；

10)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.4mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5；

11)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.4mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.2；

12)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.4mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.3；

13)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.4mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.5；

14)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.6mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5；

15)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.6mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.2；

16)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.6mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.3；

17)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.6mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.5；

18)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.8mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5；

19)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.8mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.2；

20)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.8mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.3；

21)约5mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约50mg/mL、约80mg/mL或约100mg/mL如权利要求1至11中任一项所述的FAP/CD40结合分子；

约10mM组氨酸-醋酸缓冲剂；

约0.8mg/mL聚山梨酯80；

约80mg/mL蔗糖；

且所述药物组合物的pH为约5.5。
一种冻干制剂，所述冻干制剂复溶后可形成权利要求1至23中任一项所述的药物组合物，或所述冻干制剂通过将权利要求1至23中任一项所述的药物组合物经冷冻干燥获得。
一种复溶溶液，其中所述复溶溶液是通过将权利要求24所述的冻干制剂经复溶制备获得。
一种制品，其包括容器，该容器中装有如权利要求1至23中任一项所述的药物组合物，权利要求24所述的冻干制剂，或权利要求25所述的复溶溶液。
权利要求1至23中任一项所述的药物组合物、权利要求24所述的冻干制剂或权利要求25的复溶溶液在制备治疗或缓解疾病或病症的药物中的用途；

所述疾病或病症优选为肿瘤或癌症；

更优选为肺癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、肾癌、鳞状细胞癌、血液系统癌症。
治疗或缓解肿瘤或癌症的方法，所述方法包括：

向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至23中任一项所述的药物组合物、权利要求24所述的冻干制剂或权利要求25的复溶溶液；

所述肿瘤或癌症优选为肺癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、肾癌、鳞状细胞癌、血液系统癌症。