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CN111744007B - 一种抗tigit抗体药物组合物及其用途 - Google Patents

一种抗tigit抗体药物组合物及其用途 Download PDF

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CN111744007B CN202010228589.6A CN202010228589A CN111744007B CN 111744007 B CN111744007 B CN 111744007B CN 202010228589 A CN202010228589 A CN 202010228589A CN 111744007 B CN111744007 B CN 111744007B
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Abstract

本公开涉及一种抗TIGIT抗体药物组合物及其用途。具体地，本公开涉及一种药物组合物，其包含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段以及缓冲液。进一步地，该药物组合物还包含糖和表面活性剂。本公开中的药物组合物用于治疗T细胞功能障碍性病症。

Description

一种抗TIGIT抗体药物组合物及其用途
技术领域
本公开涉及抗TIGIT抗体联合PD-1抑制剂治疗疾病的方法和药物组合。
背景技术
这里的陈述仅是提供与本公开有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。
近年来，针对免疫细胞共抑制受体的免疫检查点治疗在肿瘤免疫治疗中取得了巨大进展，发现和验证新的共抑制性受体成为一个全球竞争性的热点。T细胞是免疫反应的关键介导者，T细胞的活化依赖TCR信号和共刺激信号。共刺激信号则是T细胞活化的限制信号，其功能失调参与自身免疫疾病的发生(Immunol Rev,2012,248:122-139；AutoimmunRev,2013,12:1171-1176)。TIGIT(T cell immunoglobulin and ITIM domain)是新发现的位于NK细胞和T细胞表面的共抑制信号分子，与T细胞、NK细胞及树突状细胞DC等的功能调节密切相关。
TIGIT基因位于人类第16号染色体，编码由244个氨基酸组成的I型跨膜蛋白。人TIGIT分子胞膜外区长141个氨基酸，有1个免疫球蛋白V样结构域；跨膜区23个氨基酸；胞质区较短，有80个氨基酸，具有1个PDZ结合结构域和1个ITIM模体。TIGIT分子属于免疫球蛋白超家族IgSF的一员，其结构较为保守，多种哺乳动物中都发现了其同源分子，人类TIGIT分子与猴、狗和小鼠的TIGIT分子分别具有88％、67％和58％的同源性(Nat Immunol，2009，10(1):48－57)。
TIGIT分子主要表达于T细胞和NK细胞表面(Nat Immunol,2009,10:48-57)。
Figure BDA0002428500490000011
T细胞和静息记忆T细胞均低表达TIGIT，体外活化后表达上调(J Immunol,2012,188:3869-3875)。NK细胞表面TIGIT则有较高水平的表达(Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(42):17858－17863)。TIGIT是极具潜力的免疫治疗新靶点。已有研究表明特异性地阻断TIGIT的单克隆抗体，在动物模型中显示了显著的抗肿瘤效果(Martinet and Smyth 2015)。目前，已有WO2009126688、WO2014089113、WO2015009856、WO2015143343、WO2015174439、WO2017053748、WO2017030823、WO2016106302、US20160176963、US20130251720等专利报道了TIGIT的抗体及相关应用。WO2018204405A1还公开一种包含抗氧化剂的抗TIGIT抗体制剂。但目前为止，尚无TIGIT抗体应用于临床。
发明内容
本公开提供一种抗TIGIT抗体药物组合物及其用途。
一方面，本公开提供一种药物组合物，其包含特异性结合人TIGIT的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，以及缓冲液，所述缓冲液选自组氨酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液，所述缓冲液的pH约为5.0至7.0；在一些可选实施方式中，所述缓冲液的pH约为5.0至6.5、约为5.0至6.0、约为5.5至6.5、约为5.0至5.7或约为5.0至5.8；在另一些实施方式中，5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0；在另一些实施方式中，所述缓冲液的pH约为5.0、约为5.5、约为5.5、约为5.7、约为5.8、约为6.0、约为6.5或约为7.0；在另一些实施方式中，所述缓冲液的pH约为5.5。
在一些实施方式中，本公开的药物组合物，其中缓冲液选自：醋酸-醋酸钠缓冲液、琥珀酸-琥珀酸钠缓冲液、组氨酸-盐酸缓冲液和组氨酸-醋酸缓冲液。在一些实施方式中，所述缓冲液选自：pH约为5.0至5.7的醋酸-醋酸钠缓冲液、pH约为5.0至6.0的琥珀酸-琥珀酸钠缓冲液、pH约为5.5至6.0的组氨酸-盐酸缓冲液、或pH约为5.0至6.0的组氨酸-醋酸缓冲液；在一些实施方式中，所述缓冲液为pH约为5.0至5.8的组氨酸-醋酸缓冲液；在一些实施方式中，所述缓冲液为pH约为5.5的组氨酸-醋酸缓冲液。在另一些实施方式中，本公开的药物组合物，其中所述缓冲液浓度为大约5mM至30mM，为大约5mM至15mM，或为大约10mM。
在一些实施方式中，前面任一所述的药物组合物，其中所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段浓度为大约1mg/ml至100mg/ml；在一些实施方式中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段浓度为大约40mg/ml至60mg/ml；在另一些实施方式中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段浓度为大约50mg/ml。
在一些实施方式中，前面任一所述的药物组合物，其还包括糖。非限制性的，所述糖可以是常规组合物(CH2O)n或其衍生物，包括单糖，二糖，三糖，多糖，糖醇，还原性糖，非还原性糖等等。在一些实施方式中，所述糖选自葡萄糖，蔗糖，海藻糖，乳糖，果糖，麦芽糖，右旋糖苷，甘油，赤藻糖醇，丙三醇，阿拉伯糖醇，木糖醇，山梨糖醇，甘露醇，密里二糖，松三糖，蜜三糖，甘露三糖，水苏糖，麦芽糖，乳果糖，麦芽酮糖，山梨醇，麦芽糖醇，乳糖醇，异-麦芽酮糖等等。在一些实施方式中，所述糖为二糖。在另一些实施方式中，所述糖为蔗糖。在一些实施方式中，所述糖浓度为大约65mg/ml至100mg/ml；在一些实施方式中，所述糖浓度为大约75mg/ml至85mg/ml；在一些实施方式中，所述糖浓度为大约65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml或85mg/ml。在一些实施方式中，所述糖浓度为大约80mg/ml。
在一些实施方式中，前面任一所述的药物组合物，其还包括表面活性剂。非限制性地，所述表面活性剂可选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚羟亚烃、Triton、十二烷基磺酸钠、月桂基磺酸钠、辛基糖甙钠、月桂基-磺基甜菜碱、肉豆蔻基-磺基甜菜碱、亚油基-磺基甜菜碱、硬脂基-磺基甜菜碱、月桂基-肌氨酸、肉豆蔻基-肌氨酸、亚油基-肌氨酸、硬脂基-肌氨酸、亚油基-甜菜碱、肉豆蔻基-甜菜碱、鲸蜡基-甜菜碱、月桂酰胺基丙基-甜菜碱、柯卡酰胺基丙基-甜菜碱、亚油酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-甜菜碱、棕榈酰胺基丙基-甜菜碱、异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-二甲基胺、棕榈酰胺基丙基-二甲基胺、异硬脂酰胺基丙基-二甲基胺、甲基可可酰基钠、甲基油基牛磺酸钠、聚乙二醇、聚丙二醇和乙烯与丙烯二醇的共聚物。在一些实施方式中，所述表面活性剂为聚山梨醇酯；在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨醇酯80。在一些实施方式中，其中表面活性剂的浓度为大约0.05mg/ml至1.5mg/ml；在另一些实施方式中，其中表面活性剂的浓度为大约0.1mg/ml至0.8mg/ml，在另一些实施方式中，其中表面活性剂的浓度为大约0.4mg/ml。
在一些实施方式中，前面任一所述的药物组合物，其中包含：a)浓度约为1mg/ml至100mg/ml的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，b)pH约为5.0至7.0的组氨酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，c)浓度约为65mg/ml至100mg/ml的蔗糖，和d)浓度约为0.05mg/ml至1.5mg/ml的聚山梨醇酯80。
在一些实施方式中，所述的药物组合物包含：a1)浓度约为40mg/ml至60mg/ml的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，b1)pH约为5.0至5.7的醋酸-醋酸钠、pH约为5.0至6.0的琥珀酸-琥珀酸钠、pH约为5.5至6.0的组氨酸-盐酸组氨酸或pH约为5.0至6.0的组氨酸-醋酸，c1)浓度约为75mg/ml至85mg/ml的蔗糖，和d1)浓度约为0.1mg/ml至0.8mg/ml的聚山梨醇酯80。
在另一些实施方式中，所述药物组合物，其包含：10mM的pH约为5.5的组氨酸-醋酸缓冲液，浓度约50mg/ml的抗TIGIT抗体，浓度约80mg/ml蔗糖，和浓度约0.4mg/ml聚山梨酯80。
在一些实施方式中，前面任一所述的药物组合物，其中所述特异性结合人TIGIT的抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、或人源化抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，前面任一所述的药物组合物，其中所述特异性结合人TIGIT的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
i)所述重链可变区包含与如SEQ ID NO：5所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO：6所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
ii)所述重链可变区包含与如SEQ ID NO：7所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO：8所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
iii)所述重链可变区包含与如SEQ ID NO：9所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含与如SEQ ID NO：10所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
iv)所述重链可变区包含与如SEQ ID NO：11所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO：12所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
v)所述重链可变区包含与如SEQ ID NO：13所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO：14所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方式中，前面任一所述的药物组合物，所述特异性结合人TIGIT的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中：
vi)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：15、16和17氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：18、19和20氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
vii)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：21、22和23氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：24、25和26氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
viii)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：27、28和29氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：30、31和32氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
ix)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：33、34和35氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：36、37和38氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
x)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：39、40和41氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：42、43和44氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方式中，前面任一所述的药物组合物，其中所述特异性结合人TIGIT的抗体是人源化抗体，其中所述特异性结合人TIGIT的抗体或其抗原结合片段含有如SEQ IDNO:45、51、56、64或71所示的重链可变区，或含有在如SEQ ID NO:45、51、56、64或71所示的重链可变区序列上具有1-10个氨基酸变化的重链可变区变体；和/或含有如SEQ ID NO:46、52、57、65或72所示的轻链可变区，或含有在SEQ ID NO:46、52、57、65或72所示的轻链可变区上具有1-10个氨基酸变化的轻链可变区变体。
在一些实施方式中，所述重链可变区变体是在SEQ ID NO:45、51、56、64或71所示的重链可变区的FR区位置上具有1-10个氨基酸的回复突变；优选的，所述回复突变选自：
在SEQ ID NO:45所示的重链可变区上具有选自N84S和S85R中的一个或多个的氨基酸回复突变；或
在SEQ ID NO:51所示的重链可变区上具有选自M48I、R72V和V79A中的一个或多个的氨基酸回复突变；或
在SEQ ID NO:56所示的重链可变区上具有选自Y27F、M48I、R72V、V79A和S84N和中的一个或多个的氨基酸回复突变；或
在SEQ ID NO:64所示的重链可变区上具有选自R38K、R67K、R72V、T74K、M48I、V68A、M70L和V79A和中的一个或多个的氨基酸回复突变；或
在SEQ ID NO:71所示的重链可变区上具有选自G27Y、M48I、L83F和A97T中的一个或多个的氨基酸回复突变。
在另一些实施方式中，所述轻链可变区变体是在SEQ ID NO:46、52、57、65或72所示的轻链可变区的FR区位置上具有1-10个氨基酸的回复突变；优选的，所述回复突变选自：
在SEQ ID NO:46所示的轻链可变区上的具有选自S60D、T85D、A43S和S63T中的一个或多个的氨基酸回复突变；或
在SEQ ID NO:52所示的轻链可变区上的具有选自A43S的氨基酸回复突变；或
在SEQ ID NO:57所示的轻链可变区上的具有选自Q3V、A43S、S60D和Y87F中的一个或多个的氨基酸回复突变；或
在SEQ ID NO:65所示的轻链可变区上的具有选自A43S和I48V中的一个或多个的氨基酸回复突变；或
在SEQ ID NO:72所示的轻链可变区上的具有选自N22S和P49S中的一个或多个的氨基酸回复突变。
在一些实施方式中，前面任一所述的药物组合物，其中所述特异性结合人TIGIT的抗体包含：
a)如SEQ ID NO:45或50所示的重链可变区，和/或如SEQ ID NO:46、47、48或49所示的轻链可变区；
b)如SEQ ID NO:51、54或55所示的重链可变区，和/或如SEQ ID NO:52或53所示的轻链可变区；
c)如SEQ ID NO:56、61、62或63所示的重链可变区，和/或如SEQ ID NO:57、58、59或60所示的轻链可变区；
d)如SEQ ID NO:64、67、68、69或70所示的重链可变区，和/或如SEQ ID NO:65或66所示的轻链可变区；或
e)如SEQ ID NO:71、75、76或77所示的重链可变区，和/或如SEQ ID NO:72、73或74所示的轻链可变区。优选地，所述的特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：51所示的重链可变区和如SEQ ID NO：53所示的轻链可变区。
在一些实施方式中，前面任一所述的药物组合物，其中所述特异性结合人TIGIT的抗体为全长抗体，其包括人抗体恒定区；优选包含如SEQ ID NO:78所示的人抗体重链恒定区，和/或如SEQ ID NO:79所示的人抗体轻链恒定区。
在一些实施方式中，前面任一所述的药物组合物，其中所述特异性结合人TIGIT的抗体包含：
f)如SEQ ID NO:83所示的重链，和/或如SEQ ID NO:82所示的轻链；
g)如SEQ ID NO:85所示的重链，和/或如SEQ ID NO:84所示的轻链；
h)如SEQ ID NO:87所示的重链，和/或如SEQ ID NO:86所示的轻链；
i)如SEQ ID NO:89所示的重链，和/或如SEQ ID NO:88所示的轻链；或
j)如SEQ ID NO:91所示的重链，和/或如SEQ ID NO:90所示的轻链。优选地，所述的特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:85所示的重链，和如SEQ ID NO:84所示的轻链；
在一些实施方式中，前面任一所述的药物组合物，所述药物组合物单位剂量中可含有0.01至99重量％的特异性结合人TIGIT的抗体或其抗原结合片段；在一些实施方式中，药物组合物单位剂量中含特异性结合人TIGIT的抗体或其抗原结合片段的量为0.1-2000mg；在另外一些实施方式中，药物组合物单位剂量中含特异性结合人TIGIT的抗体或其抗原结合片段的量为1-1000mg。
另一方面，在一些实施方式中，本公开提供制备前面任一所述的药物组合物的方法，所述方法包括将抗TIGIT抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂混合的步骤。
另一方面，在一些实施方式中，本公开提供一种含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的冻干制剂，所述冻干制剂通过将前面任一所述的药物组合物经冷冻干燥获得。在一些实施方式中，所述冷冻干燥依次包括预冻、一次干燥和二次干燥的步骤。
另一方面，在一些实施方式中，本公开提供一种含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的冻干制剂，所述冻干制剂经复溶可形成前面所述的药物组合物。
另一方面，在一些实施方式中，本公开提供一种含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的复溶溶液，所述复溶溶液通过将前面所述的含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的冻干制剂经复溶制备获得。
另一方面，在一些实施方式中，本公开提供一种制品，其包括容器，该容器中装有前面任一项所述的药物组合物、冻干制剂或复溶溶液。
另一方面，在一些实施方式中，本公开提供作为药物的前面任一项所述的药物组合物、冻干制剂、复溶溶液或制品，所述药物用于治疗与人TIGIT相关的疾病。在一些实施方式中，其中所述与人TIGIT相关的疾病为肿瘤；在一些实施方式中，所述肿瘤选自：头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝细胞瘤、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、软骨肉瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尤因氏肉瘤、全身性轻链淀粉样变性和梅克尔细胞癌；在一些实施方式中，所述淋巴瘤选自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤，所述肺癌选自：非小细胞肺癌和小细胞肺癌，所述白血病选自：慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病；在一些实施方式中，所述肿瘤选自CD155阳性或PVR阳性的肿瘤。
另一方面，在一些实施方式中，本公开提供前面任一项所述的药物组合物、冻干制剂、复溶溶液或制品在制备用于治疗与人TIGIT相关的疾病的药物中的应用。在一些实施方式中，其中所述与人TIGIT相关的疾病为肿瘤；在一些实施方式中，所述肿瘤选自：头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝细胞瘤、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、软骨肉瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尤因氏肉瘤、全身性轻链淀粉样变性和梅克尔细胞癌；在一些实施方式中，所述淋巴瘤选自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤，所述肺癌选自：非小细胞肺癌和小细胞肺癌，所述白血病选自：慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病；在一些实施方式中，所述肿瘤选自CD155阳性或PVR阳性的肿瘤。
另一方面，在一些实施方式中，本公开提供一种治疗或预防TIGIT相关疾病的方法，所述方法包括给予受试者施用治疗有效量的前面任一项所述的药物组合物、冻干制剂、复溶溶液或制品。在一些实施方式中，其中所述与人TIGIT相关的疾病为肿瘤；在一些实施方式中，所述肿瘤选自：头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝细胞瘤、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、软骨肉瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尤因氏肉瘤、全身性轻链淀粉样变性和梅克尔细胞癌；在一些实施方式中，所述淋巴瘤选自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤，所述肺癌选自：非小细胞肺癌和小细胞肺癌，所述白血病选自：慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病；在一些实施方式中，所述肿瘤选自CD155阳性或PVR阳性的肿瘤。
附图说明
图1：抗TIGIT抗体结合人TIGIT蛋白的ELISA检测。
图2：抗TIGIT抗体结合猴TIGIT蛋白的ELISA检测。
图3：抗TIGIT抗体与过表达人TIGIT的CHO细胞的结合检测。
图4：抗TIGIT抗体与人PBMC的结合亲和力检测。
图5：图5A是ch1708及其人源化抗体对人TIGIT与CD155结合的阻断作用检测；图5B是抗TIGIT人源化抗体对人TIGIT与CD155结合的阻断作用检测。
图6：抗TIGIT抗体对TIGIT抗原与过表达CD155的CHO细胞结合的阻断实验。
图7：抗TIGIT抗体对CD155与过表达TIGIT的CHO细胞结合的阻断实验。
图8：抗TIGIT抗体对TIGIT抗原与过表达CD112的CHO细胞结合的阻断实验。
图9：抗TIGIT抗体在TIGIT过表达的CHO细胞中的结合内吞实验，其中内吞1小时。
图10：图10A是抗TIGIT抗体促进自然杀伤细胞(NK)的细胞杀伤实验；图10B：抗TIGIT抗体促进自然杀伤细胞(NK)的细胞杀伤实验。
图11：抗TIGIT抗体对PBMC-T淋巴细胞激活实验。
图12：抗TIGIT人源化抗体在大鼠体内的药代动力学检测。
图13：抗TIGIT抗体处方DOE筛选组氨酸-醋酸(His-AA)缓冲液的等高线刻画图，图13中各等高线刻画器参数见下表：
Figure BDA0002428500490000081
Figure BDA0002428500490000091
图14：抗TIGIT抗体处方DOE筛选组氨酸-盐酸组氨酸(His-HCl)缓冲液的等高线刻画图，图14中各等高线刻画器参数见下表：
Figure BDA0002428500490000092
图15：抗TIGIT抗体处方DOE筛选琥珀酸-琥珀酸钠(SA)缓冲液的等高线刻画图，图15中各等高线刻画器参数见下表：
Figure BDA0002428500490000093
Figure BDA0002428500490000101
发明详述
术语
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
“缓冲液”或“缓冲剂”指通过其酸-碱共轭组分的作用而耐受pH变化的缓冲液。将pH控制在适当范围中的缓冲液的例子包括醋酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、组氨酸、草酸盐、乳酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、甘氨酰甘氨酸和其它有机酸缓冲液。
“组氨酸盐缓冲剂”或“组氨酸盐缓冲液”，是包含组氨酸离子的缓冲液。组氨酸缓冲液的示例包括组氨酸-盐酸，组氨酸-醋酸，组氨酸-磷酸盐，组氨酸-硫酸盐等缓冲液。本公开的一些实施方式中，缓冲液选自组氨酸-盐酸、组氨酸-醋酸。组氨酸-醋酸缓冲液是组氨酸与醋酸或组氨酸与组氨酸-醋酸盐配制而成。
“琥珀酸盐缓冲剂”或“琥珀酸盐缓冲液”，是包括琥珀酸离子的缓冲液。琥珀酸盐缓冲液的示例包括琥珀酸-琥珀酸钠、琥珀酸-琥珀酸钾、琥珀酸-琥珀酸钙盐等。本公开在一些实施方式中，琥珀酸缓冲液是琥珀酸-琥珀酸钠。
“醋酸盐缓冲剂”或“醋酸盐缓冲液”，是包括醋酸根离子的缓冲液。醋酸盐缓冲液的示例包括醋酸-醋酸钠、醋酸组氨酸盐、醋酸-醋酸钾、醋酸醋酸钙、醋酸-醋酸镁等。本公开在一些实施方式中，醋酸缓冲液是醋酸-醋酸钠。
“磷酸盐缓冲剂”或“磷酸盐缓冲液”，是包括磷酸根离子的缓冲剂。磷酸盐缓冲剂的实例包括磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、磷酸氢二钠-枸橼酸等。本公开在一些实施方式中，磷酸氢二钠-枸橼酸。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的保持抗体活性成分的稳定性，促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。本文中，“药物组合物”和“制剂”并不互相排斥。在一些实施方式中，本公开的一种药物组合，其包含特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，本公开的药物组合物或制剂的溶液形式，其中的溶剂为水。
本公开的药物组合物或制剂可通过本领域公知的方法制备。示例性的，抗体药物组合物或制剂的制备：第一步：取一定量的纯化的抗体溶液，用不含抗体的缓冲剂(如pH5.5的10mM组氨酸-醋酸的缓冲液)进行溶剂置换(优选超滤)，经超滤膜至少6倍体积置换，抗体浓缩到约70mg/mL。加入一定体积的蔗糖母液，混匀，使最终蔗糖浓度为80mg/mL。加入一定体积的聚山梨醇酯80母液，混匀，使最终聚山梨醇酯80浓度为0.4mg/mL。加pH5.5的10mM组氨酸-醋酸缓冲剂定容，使抗体浓度为50mg/mL(其他待测试制剂或稳定性制剂可参照相似步骤进行配制)。产品经过滤后中控取样检测无菌。将原液过0.22μm PVDF滤芯，收集滤液。第二步：调节装量至2.15ml，将滤液灌装于2ml西林瓶中，加塞，分别于灌装开始、灌装中间、灌装结束时取样中控检测装量差异。第三步：开启轧盖机，加铝盖，进行轧盖。第四步：目检，确认产品无装量不准等缺陷。打印、粘贴西林瓶标签；打印纸盒标签，折叠纸盒，装盒，贴纸盒标签。
“Tm值”是指蛋白质热变性温度，即一半蛋白去折叠时的温度，此时蛋白的空间结构被破坏，所以Tm值越高，蛋白热稳定性越高。
本公开中所述药物组合物的溶液形式，若无特殊说明，其中的溶剂均为水。
“冻干制剂”表示液体或溶液形式的药物组合物或液体或溶液制剂经真空冷冻干燥步骤之后获得的制剂或药物组合物。冻干制剂可通过将药物组合物或液体或溶液制剂经冷冻干燥获得。通过冷冻制剂和随后在适于一次干燥的温度使水升华，进行冷冻干燥。在此条件下，产物温度低于制剂的低共熔点或分解温度。在通常约50-250毫托范围的合适压力下，通常，一次干燥的存放温度范围为约-30至25℃(假设产物在一次干燥过程中保持冷冻)。制剂、容纳样品的容器(例如，玻璃小瓶)的大小和类型以及液体的体积决定了干燥所需的时间，所述时间的范围可为几小时至几天(例如40-60小时)。二次干燥阶段可在约0-40℃进行，这主要取决于容器的类型和大小以及采用的蛋白的类型。二次干燥时间由产物中的期望残余湿度水平决定，通常需要至少约5小时。通常，低压冻干的制剂的含水量小于约5％，优选小于约3％。压力可与在一次干燥步骤中应用的压力相同，优选的，二次干燥的压力低于一次干燥。冷冻干燥条件可以随制剂和小瓶大小而变化。在本公开的一些实施方式中，冻干制剂是将抗TIGIT抗体制剂以2.15mL/瓶填充入6mL西林瓶中或者以12.3mL/瓶填充入15mL西林瓶中，装入冻干箱中，冻干；冻干程序为预冻、一次干燥和二次干燥；冻干程序结束后，真空加塞。
本文所用术语“约”、“大约”或“基本上包含”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)。例如，在本领域每一次实行中“约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”、“大约”或“基本上包含”可意味着至多20％的范围。此外，特别对于生物学系统或过程而言，该术语可意味着至多一个数量级或数值的至多5倍。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”、“大约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。
本公开所述的药物组合物能够达到一种稳定的效果：其中的抗体在贮藏后基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的药物组合物，优选地，药物组合物在贮藏后基本上保留其物理和化学稳定性以及其生物学活性。贮藏期一般基于药物组合物的预定保存期来选择。目前有多种测量蛋白质稳定性的分析技术，可测量在选定温度贮藏选定时间段后的稳定性。
稳定的药物抗体制剂是在下述情况下没有观察到显著变化的制剂：在冷藏温度(2-8℃)保存至少3个月、优选6个月、更优选1年，且甚至更优选地最多达2年。另外，稳定的液体制剂包括这样的液体制剂：其在包括25℃和40℃在内的温度保存包括1个月、3个月、6个月在内的时段后表现出期望的特征。稳定性的制剂例如：通过视觉分析，药物抗体制剂是无色的，或澄清至稍微乳白色。所述制剂的浓度、pH和重量克分子渗透压浓度具有不超过±10％变化。通常观察到不超过约10％、优选不超过约5％的截短。通常形成不超过约10％、优选不超过约5％的聚集。在一些实施方式中，本公开中的药物组合物或冻干制剂于2-8℃稳定至少3个月，至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月；在25℃可稳定存在至少3个月，至少6个月。
如果在目检颜色和/或澄清度后，或者通过UV光散射、尺寸排阻色谱法(SEC)和动态光散射(DLS)测得，抗体没有显示出显著的聚集增加、沉淀和/或变性，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的物理稳定性”。蛋白构象的变化可以通过荧光光谱法(其确定蛋白三级结构)和通过FTIR光谱法(其确定蛋白二级结构)来评价。
如果抗体没有显示出显著的化学改变，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的化学稳定性”。通过检测和定量化学上改变的形式的蛋白，可以评估化学稳定性。经常改变蛋白化学结构的降解过程包括水解或截短(通过诸如尺寸排阻色谱法和SDS-PAGE等方法来评价)、氧化(通过诸如与质谱法或MALDI/TOF/MS结合的肽谱法等方法来评价)、脱酰胺作用(通过诸如离子交换色谱法、毛细管等电聚焦、肽谱法、异天冬氨酸测量等方法来评价)和异构化(通过测量异天冬氨酸含量、肽谱法等来评价)。
如果抗体在给定时间的生物活性是在制备药物制剂时表现出的生物活性的预定范围内，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的生物活性”。抗体的生物活性可以例如通过抗原结合测定来确定。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
本公开所述的“抗体”指免疫球蛋白，完整抗体是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
在本公开中，本公开所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
在本公开中，本公开所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR或VL)和重链可变区(HCVR或VH)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些示范性实施例中，所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR1-3)。
“单克隆抗体”是指从基本上均质抗体的群体获得的抗体，即除可能的变体抗体(例如含有天然存在的突变或在制造单克隆抗体制剂的期间产生的突变，这些变体通常以少量存在)之外，构成所述群体的个别抗体相同和/或结合相同表位。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物(制剂)的每个单克隆抗体是针对抗原上的单一决定簇的。因此，修饰语“单克隆”指示如从基本上均质抗体群体获得的抗体的特性，且不应解释为需要通过任何特定方法来制造抗体。例如，本公开的单克隆抗体可通过各种技术制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，此类方法以及用于制备单克隆抗体的其他示例性方法在本文中进行描述。
本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体。
术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的对抗原(例如人TIGIT)的单克隆抗体。制备时用TIGIT抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本公开一个优选的实施方案中，所述的鼠源TIGIT抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中，最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。在本公开一个优选的实施方案中，所述的TIGIT嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的TIGIT嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变(如YTE突变或回复突变、S228P)的IgG1、IgG2或IgG4变体。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，包括CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。在本公开一个优选的实施方案中，所述的TIGIT人源化抗体中鼠的CDR序列选自SEQ IDNO:15-44；人的抗体可变区框架经过设计选择，其中所述抗体重链可变区上的重链FR区序列，人种系重链选自：(IGHV3-7*01和hjh2)，(IGHV1-46*01和hjh4.1)和(IGHV1-69*02和hjh4.1)的组合序列，和人种系轻链选自：(IGKV1-39*02和hjk2.1)，(IGKV1-39*01和hjk4.1)和(IGKV4-1*01和hjk4.1)的组合序列。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变(回复突变，即将人抗体来源的FR区氨基酸残基突变成原始来源抗体对应位置的氨基酸残基)，以保持活性。在本公开的其中一个实施方式中，其中，抗TIGIT人源化抗体的轻/重链可变区进行了回复突变设计，获得了优化的h1707、h1708、h1709、h17010、h17011人源化抗体的轻/重链可变区组合，具体见下表1-5，
表1：h1707人源化抗体轻/重链可变区组合表：
Figure BDA0002428500490000141
Figure BDA0002428500490000151
注：表中“h1707-02 V”表示h1707-H2重链可变区(如SEQ ID NO：50所示)和与h1707-L1轻链可变区(如SEQ ID NO：46所示)组成的轻/重链可变区对，其它依此类推。
表2：h1708人源化抗体轻/重链可变区组合表：
Figure BDA0002428500490000152
注：表中“h1708-04V”表示h1708-H1重链可变区(如SEQ ID NO：51所示)和h1708-L2轻链可变区(如SEQ ID NO：53所示)组成的轻/重链可变区对，其它依此类推。
表3：h1709人源化抗体轻/重链可变区组合表：
Figure BDA0002428500490000153
注：表中“h1709-10V”表示h1709-H2重链可变区(如SEQ ID NO：61所示)和h1709-L3轻链可变区(如SEQ ID NO：59所示)组成的轻/重链可变区对，其它依此类推。
表4：h1710人源化抗体轻/重链可变区组合表：
Figure BDA0002428500490000161
注：表中“h1710-01V”表示h1710-H1重链可变区(如SEQ ID NO：64所示)和h1710-L1轻链可变区(如SEQ ID NO：65所示)组成的轻/重链可变区对，其它依此类推。
表5：h1711人源化抗体轻/重链可变区组合表：
Figure BDA0002428500490000162
注：表中“h1711-04V”表示h1711-H4重链可变区(如SEQ ID NO：77所示)和h1711-L1轻链可变区(如SEQ ID NO：72所示)组成的轻/重链可变区对，其它依此类推。
前述表1-5的人源化抗体的轻/重链可变区组合，其重链可变区可以与人抗体的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区(例如，包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变(如YTE突变或回复突变、S228P突变、F234A突变和L235A突变中的一个或更多个突变)的IgG1、IgG2或IgG4的变体)的氨基端连接成全长抗体重链，其轻链可变区可以与人抗体的κ、λ链或其变体的轻链恒定区的氨基端连接成全长抗体轻链。例如，轻/重链可变区组合h1707-02 V，其重链可变区h1707-H2(SEQ ID NO：50)与人抗体的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体(例如YTE突变或回复突变、S228P突变、F234A突变和L235A突变中的一个或更多个突变)的氨基端连接形成抗体的重链，轻链可变区h1707-L1(SEQ ID NO：46)与人抗体的κ、λ链恒定区或其变体氨基端连接形成抗体轻链，然后重链与轻链连接形成全长人源化抗体；在其中一个实施方式中，其中轻/重链可变区组合h1707-02 V，其重链可变区h1707-H2(SEQ ID NO：50)与如SEQ ID NO：78所示的IgG4变体恒定区的氨基端连接形成抗体的重链(如SEQ ID NO:83所示)，其轻链可变区h1707-L1(SEQ ID NO：46)与人抗体的κ轻链恒定区的氨基端连接形成抗体轻链(如SEQ ID NO:82所示)。
CDR的移植可由于与抗原接触的构架残基而导致产生的TIGIT抗体或其抗原结合片段对抗原的亲和力减弱。此类相互作用可以是体细胞高度突变的结果。因此，可能仍然需要将此类供体构架氨基酸移植至人源化抗体的构架。来自非人TIGIT抗体或其抗原结合片段的参与抗原结合的氨基酸残基可通过检查鼠单克隆抗体可变区序列和结构来鉴定。CDR供体构架中与种系不同的的各残基可被认为是相关的。如果不能确定最接近的种系，那么可将序列与亚型共有序列或具有高相似性百分数的鼠序列的共有序列相比较。稀有构架残基被认为可能是体细胞高度突变的结果，从而在结合中起着重要作用。
在类似“氨基酸变化”或“氨基酸差异”是指相较于原蛋白质或多肽，变体蛋白质或多肽存在氨基酸的改变或突变，包括在原蛋白质或多肽的基础上发生1个或数个氨基酸的插入、缺失或替换。在本公开的其中一个实施方式中，其中，抗TIGIT人源化抗体的轻/重链可变区进行了回复突变设计，在一些实施方式中，本公开的
术语抗体的“抗原结合片段”或“功能片段”是指抗体的保持特异性结合抗原(例如，TIGIT)的能力的一个或多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来实现抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段；(v)单结构域或dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85:5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
本公开的抗原结合片段包括Fab、F(ab')2、Fab'、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)、包含CDR的肽等。
Fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H链的224位的氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中H链N端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。
本公开的Fab可以通过用木瓜蛋白酶处理本公开的特异性识别人TIGIT并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体来生产。此外，可以通过将编码所述抗体的Fab的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab来生产所述Fab。
F(ab')2是通过用酶胃蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量为约100,000并具有抗原结合活性并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。
本公开的F(ab')2可以通过用胃蛋白酶处理本公开的特异性识别人TIGIT并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体来生产。此外，可以通过用硫醚键或二硫键连接下面描述的Fab'来生产所述F(ab')2。
Fab'是通过切割上述F(ab')2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约50,000并具有抗原结合活性的抗体片段。本公开的Fab'可以通过用还原剂例如二硫苏糖醇处理本公开的特异性识别TIGIT并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的F(ab')2来生产。
此外，可以通过将编码抗体的Fab'片段的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab'来生产所述Fab'。
术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-4个重复的变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。可用于本公开的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno l.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
本公开的scFv可以通过以下步骤来生产：获得本公开的特异性识别人TIGIT并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达scFv。
双抗体是其中scFv被二聚体化的抗体片段，是具有二价抗原结合活性的抗体片段。在二价抗原结合活性中，两个抗原可以是相同或不同的。
本公开的双抗体可以通过以下步骤来生产：获得本公开的特异性识别人TIGIT并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA以使肽接头的氨基酸序列长度为8个残基或更少，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达双抗体。
dsFv是通过将其中每个VH和VL中的一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽经由半胱氨酸残基之间的二硫键相连而获得的。可以按照已知方法(ProteinEngineering,7,697(1994))基于抗体的三维结构预测来选择被半胱氨酸残基取代的氨基酸残基。
本公开的dsFv可以通过以下步骤来生产：获得本公开的特异性识别人TIGIT并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码dsFv的DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达dsFv。
包含CDR的肽是通过包含VH或VL的CDR中的一个或多个区域而构成的。包含多个CDR的肽可以被直接相连或经由适合的肽接头相连。
本公开的包含CDR的肽可以通过以下步骤来生产：构建本公开的特异性识别人TIGIT并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的CDR的编码DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达所述肽。也可以通过化学合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法来生产所述包含CDR的肽。
本文中使用的术语“抗体框架”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。
术语“互补决定区”、“CDR”或“高变区”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。通常，每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各种公知方案中的任何一种来确定CDR的氨基酸序列边界，包括“Kabat”编号规则(参见Kabat等(1991)，“Sequences ofProteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”编号规则(参见Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948)和ImMunoGenTics(IMGT)编号规则(Lefranc M.P.，Immunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)等。例如，对于经典格式，遵循Kabat规则，所述重链可变域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia规则，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过组合Kabat和Chothia两者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)构成。遵循IMGT规则，VH中的CDR氨基酸残基编号大致为26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号大致为27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。遵循IMGT规则，抗体的CDR区可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位(例如，TIGIT分子上的特定部位)。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-7M，例如大约小于10-8M、10- 9M、10-10M、10-11M或更小的亲和力(KD)结合。
术语"KD"或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本公开的抗体以小于大约10-7M，例如小于大约10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合TIGIT，例如，如使用表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE仪中测定的。
本文中使用的术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
术语“载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。
现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人TIGIT或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。
本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人TIGIT特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本公开的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床有测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology ofthe Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。
“有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：例如，待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“外源性”指根据情况在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据情况在细胞、生物或人体内产生的物质。
“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源；如果两个序列中的100个位置有95个匹配或同源，那么两个序列为95％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美国专利号4,683,195中所述扩增的程序或技术。一般来说，需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列方面与待扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring HarborSymp.Ouant.Biol.51:263；Erlich编辑，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特定部分。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
与TIGIT相关的疾病没有限制，只要它是与TIGIT相关的疾病即可，例如利用本公开的分子诱导的治疗反应可通过结合人类TIGIT然后阻遏或抑制T细胞功能障碍性病症，在一些实施方式中，所述疾病是恶性肿瘤、癌症或感染性病症，在一些实施方式中，所述疾病是在靶向免疫治疗检查点的免疫治疗药物的临床试验中观察到的有临床应答的肿瘤或癌症类型，例如CD155阳性、或PVR阳性的肿瘤、免疫性疾病或感染性病症。在一些实施方式中，其中所述肿瘤选自：头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝细胞瘤、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、软骨肉瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尤因氏肉瘤、全身性轻链淀粉样变性和梅克尔细胞癌；在一些实施方式中，所述淋巴瘤选自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤，所述肺癌选自：非小细胞肺癌和小细胞肺癌，所述白血病选自：慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病。
上述与TIGIT相关的疾病可以通过用本公开的单克隆抗体或抗体片段检测或测定表达TIGIT的细胞来诊断。
在本公开中，用于检测或测定TIGIT的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫检测或测定方法。
免疫检测或测定方法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法等。
为了检测表达多肽的细胞，可以使用已知的免疫检测方法，并优选使用免疫沉淀法、荧光细胞染色法、免疫组织染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS系统(AppliedBiosystem)的荧光抗体染色法等。
在本公开中，对用于检测或测定TIGIT的活体样品没有特别限制，只要它具有包含表达TIGIT的细胞的可能性即可，例如组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液或培养液。
根据所需的诊断方法，含有本公开的单克隆抗体或其抗体片段的诊断剂还可以含有用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测反应的试剂。用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐等。用于检测的试剂包括通常用于免疫检测或测定方法的试剂，例如识别所述单克隆抗体、其抗体片段或其结合物的标记的第二抗体和与所述标记对应的底物等。
本公开实施例提供的TIGIT单克隆抗体或抗原结合片段对TIGIT具有很高的特异性、以及与TIGIT的高亲和力，其中人源化抗体的免疫原性大大降低，同时完全保留了鼠源抗体的特异性，较高的亲和力和优异的体内外活性。在一些实施中，本公开的特异性结合人TIGIT的抗体或抗原结合片段为国际专利申请PCT/CN2018/108246(WO2019062832A1)所描述的特异性结合人TIGIT的抗体或抗原结合片段，本公开通过引用将PCT/CN2018/108246专利申请全文完整收入本文。
具体实施方式
以下结合实施例和测试例进一步描述本公开，但这些实施例和测试例并非限制着本公开的范围。本公开实施例和测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1、抗TIGIT抗体的制备
一、抗原抗体的制备
1.1蛋白设计及表达
以人TIGIT蛋白(Uniprot号：Q495A1)作为本公开TIGIT的模板，设计本公开的抗原及检测用蛋白的氨基酸序列，可选的在TIGIT蛋白基础上融合不同的标签，分别克隆到pHr载体上(自产)或pXC-17.4载体上(LONZA)上，在293细胞瞬转表达或CHO细胞稳定表达纯化，获得编码本公开抗原及检测用蛋白。以下TIGIT抗原未特殊说明的均指人TIGIT。
TIGIT胞外区与小鼠IgG2aFc段的融合蛋白：TIGIT-mFc，用于免疫和检测
Figure BDA0002428500490000241
Figure BDA0002428500490000251
注释：划横线部分为信号肽，斜体部分为mFc。
TIGIT胞外区与人IgG1 Fc段的融合蛋白：TIGIT-Fc，用于检测
Figure BDA0002428500490000252
注释：划横线部分为信号肽，斜体部分为Fc。
全长TIGIT：用于构建TIGIT过表达细胞株，用于检测
Figure BDA0002428500490000253
Figure BDA0002428500490000254
(斜体部分)cynoTIGIT胞外区与小鼠IgG2aFc段的融合蛋白：cynoTIGIT-mFc，用于检测
Figure BDA0002428500490000255
Figure BDA0002428500490000261
注释：划横线部分为信号肽，斜体部分为mFc。
1.2TIGIT相关重组蛋白的纯化，以及杂交瘤抗体、重组抗体的纯化
(1)杂交瘤上清分离纯化/ProteinG亲和层析：
对于小鼠杂交瘤细胞上清纯化首选ProteinG进行亲和层析，将培养所得杂交瘤细胞离心取上清，根据上清体积加入10-15％体积的1M Tris-HCl(pH8.0-8.5)调节上清pH。ProteinG柱利用6M盐酸胍洗3-5倍柱体积，然后利用纯水清洗3-5倍柱体积；利用如1×PBS(pH7.4)缓冲体系作为平衡缓冲液对层析柱平衡3-5倍柱体积；细胞上清利用低流速上样结合，控制流速使保留时间约1min或更长时间；利用1×PBS(pH7.4)洗涤层析柱3-5倍柱体积至紫外吸收回落至基线；利用0.1M醋酸/醋酸钠(pH3.0)缓冲液进行样品洗脱，根据紫外检测收集洗脱峰，洗脱产物利用1M Tris-HCl(pH8.0)快速调节pH至5-6暂存。对于洗脱产物可以利用本领域技术人员熟知的方法进行溶液置换，如利用超滤管进行超滤浓缩及溶液置换至所需的缓冲体系，或者利用分子排阻如G-25脱盐替换成所需的缓冲体系，或者利用如Superdex 200等高分辨率分子排阻柱去除洗脱产物中的聚体成分以提高样品纯度。
(2)Protein A亲和层析提取带Fc标签的融合蛋白或者抗体：
首先将表达Fc融合蛋白或者抗体的细胞培养上清进行高速离心收取上清。ProteinA亲和柱利用6M盐酸胍洗3-5倍柱体积，然后利用纯水清洗3-5倍柱体积。利用如1×PBS(pH7.4)缓冲体系作为平衡缓冲液对层析柱平衡3-5倍柱体积。细胞上清利用低流速上样结合，控制流速使保留时间约1min或更长时间，结合完毕后利用1×PBS(pH7.4)洗涤层析柱3-5倍柱体积至紫外吸收回落至基线。利用0.1M醋酸/醋酸钠(pH3.0-3.5)缓冲液进行样品洗脱，根据紫外检测收集洗脱峰，洗脱产物利用1M Tris-HCl(pH8.0)快速调节pH至5-6暂存。对于洗脱产物可以利用本领域技术人员熟知的方法进行溶液置换，如利用超滤管进行超滤浓缩及溶液置换至所需的缓冲体系，或者利用分子排阻如G-25脱盐替换成所需的缓冲体系，或者利用如Superdex 200等高分辨率分子排阻柱去除洗脱产物中的聚体成分以提高样品纯度。
二、抗人TIGIT杂交瘤单克隆抗体的制备
2.1免疫
抗人TIGIT单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用SJL白小鼠，雌性，6-8周龄(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001)。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。将已适应环境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原为带mFc的人TIGIT胞外区(SEQ IDNO:1)。
免疫方案：用
Figure BDA0002428500490000271
Gold Adjuvant(Sigma Cat No.T2684)与Thermo
Figure BDA0002428500490000272
Alum(Thermo Cat No.77161)佐剂交叉免疫。抗原与佐剂(
Figure BDA0002428500490000273
Gold Adjuvant)比例为1:1，抗原与佐剂(Thermo
Figure BDA0002428500490000274
Alum)比例为3:1，50μg/只/次(首次免疫)，25μg/只/次(加强免疫)。抗原乳化后进行接种，时间为第0、14、28、42、56天。第0天腹膜内(IP)注射50μg/只的乳化后抗原。第14天皮下(sc)多点(一般背部6-8点)注射25μg/只。第28，42天根据背部结块和腹部肿胀情况，选择背部或腹膜内注射抗原。于第21，35，49，63天取血，用ELISA方法确定小鼠血清中的抗体滴度。在第4-5次免疫以后，选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合。在进行脾细胞融合前3天加强免疫，腹膜内(IP)注射50μg/只的生理盐水配制的抗原溶液。
2.2脾细胞融合
采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(
Figure BDA0002428500490000275
CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞。融合好的杂交瘤细胞以0.5-1×10^6/ml的密度用完全培养基(含20％FBS、1×HAT、1×OPI的DMEM培养基)重悬，100μl/孔种于96孔板中，37℃，5％CO2孵育3-4天后，补充HAT完全培养基100μl/孔，继续培养3-4天至形成针尖般克隆。去除上清，加入200μl/well的HT完全培养基(含20％FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培养基)，37℃，5％CO2培养3天后进行ELISA检测。
2.3杂交瘤细胞筛选
根据杂交瘤细胞生长密度，用结合ELISA方法进行杂交瘤培养上清检测。并将结合ELISA检测的阳性孔细胞上清进行细胞结合实验和细胞阻断实验。结合和阻断均为阳性的孔细胞及时进行扩增冻存保种和二到三次亚克隆直至获得单细胞克隆。
每次亚克隆细胞也均需进行TIGIT结合ELISA、HTRF阻断实验、细胞结合实验和细胞阻断实验检测。通过以上实验筛选得到杂交瘤克隆，用无血清细胞培养法进一步制备抗体，按纯化实例纯化抗体，供在检测例中使用。
2.4杂交瘤阳性克隆序列测定
从阳性杂交瘤中克隆序列过程如下。收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen,Cat No.15596-018)按照试剂盒说明书步骤提取RNA，用PrimeScriptTMReverse Transcriptase试剂盒反转录(Takara,Cat No.2680A)。将反转录得到的cDNA采用小鼠Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)进行PCR扩增后测序。从得到的DNA序列获得所筛选到的阳性克隆m1707、m1708、m1709、m1710、m1711对应的抗体可变区氨基酸序列如下所示：
m1707-HCVR
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFIFSDYHMYWVRQTPEKRLEWVAYISKGGISTYYPDTVKGRFTISRDNAKHTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARQSSYDFAMDYWGRGTSVTVSS
SEQ ID NO：5
m1707-LCVR
DIVMTQSHKFMSTSVGVRVSITCKASQDVGTSVAWYQQKPGQSPKLLIYWASARHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO：6
m1708-HCVR
QVQLQQPGAELVKPGSSVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKQGPGRGLEWIGRIDPDSTGSKYNEKFKTKASLTVDTVSGTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGAYGYYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：7
m1708-LCVR
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNARTLAESVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQYHSGSPLPFGAGTKLALK
SEQ ID NO：8
m1709-HCVR
EVQLQQSGPVLVKPGPSVKISCKASGFTFTDYYMHWVKQSLGKSLEWIGLVYPYNDNTGYNRKFKGKATLTVDTSSSTAYIELNSLTSEDSAVYYCARGGPSNWNYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：9
m1709-LCVR
DIVMTQSQKFMSTTVGDRVSITCKASQNVVTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTINNVQSEDLADYFCQQYTLYPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO：10
m1710-HCVR
QVQLQQPGAELVKFGASVKLSCKASGYTFTNYYMHWVKQRPGRGLEWIGRIDPTSGATKYNDNFKGKATLTVDKPSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREGGFGYYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：11
m1710-LCVR
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRTSENIFTYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTFAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKISSLQPEDFGIYYCQHHYGIPLPFGAGTKLELK
SEQ ID NO：12
m1711-HCVR
QVQLQQSGTELVRPGTSVKMSCKASGYTFTNYWIGWAKQRPGHGLEWIGDIYPGGAYTNYNEKFKDKATLTADKSSSTAYMQFSSLTSEDSAIYYCTRGDYYDSSGRAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO：13
m1711-LCVR
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVSMSCKSSQSLLYSRNQMNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWTSTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：14
其中各抗体轻重链中CDR序列如表6所示(CDR序列由Kabat编号系统确定并注释)。
表6：抗体重链及轻链CDR区序列
Figure BDA0002428500490000291
Figure BDA0002428500490000301
三、鼠源抗人TIGIT抗体的人源化
通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库和MOE软件，分别挑选与鼠源抗体同源性高的重链和轻链可变区种系基因作为模板，将鼠源抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。根据需要，对FR区氨基酸进行回复突变，即得到人源化抗TIGIT抗体。示范性地，以下具体实施例中其中CDR区氨基酸残基的确定由Kabat编号系统确定并注释。
上述鼠源抗体的轻重链可变区与人源抗体的轻重链恒定区连接后形成嵌合抗体，m1707抗体对应的嵌合抗体命名为ch1707，其他抗体类推。
3.1杂交瘤克隆m1707的人源化
(1)m1707人源化构架选择
鼠源抗体m1707的人源化轻链模板为IGKV1-39*02和hjk2.1，人源化重链模板为IGHV3-7*01和hjh2，经人源化后得到人源化抗体h1707，人源化可变区序列如下：
h1707 VH-CDR graft
Figure BDA0002428500490000302
h1707VL-CDR graft
Figure BDA0002428500490000303
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。
(2)h1707回复突变设计如下表：
表7：h1707回复突变设计
Figure BDA0002428500490000311
注：如S60D表示依照氨基酸序列自然顺序编号，将60位S突变回D。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。
回复突变设计后的h1707人源化抗体轻/重链可变区序列如下：
>h1707-L1(同h1707 VL-CDR graft)
Figure BDA0002428500490000312
>h1707-L2
Figure BDA0002428500490000313
>h1707-L3
Figure BDA0002428500490000314
>h1707-L4
Figure BDA0002428500490000315
>h1707-H1(同h1707 VH-CDR graft)
Figure BDA0002428500490000316
>h1707-H2
Figure BDA0002428500490000317
Figure BDA0002428500490000321
3.2杂交瘤克隆m1708的人源化
(1)m1708人源化构架选择
鼠源抗体m1708的人源化轻链模板为IGKV1-39*01和hjk4.1，人源化重链模板为IGHV1-46*01和hjh4.1，经人源化后得到人源化抗体h1708，人源化可变区序列如下：
h1708VH-CDR graft
Figure BDA0002428500490000322
h1708VL-CDR graft
Figure BDA0002428500490000323
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。
(2)h1708回复突变设计如下表：
表8：h1708回复突变设计
Figure BDA0002428500490000324
注：如A43S表示依照氨基酸序列自然顺序编号，将43位A突变回S。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。
回复突变设计后的h1708人源化抗体轻/重链可变区序列如下：
>h1708-L1(同h1708 VL-CDR graft)
Figure BDA0002428500490000325
>h1708-L2
Figure BDA0002428500490000331
>h1708-H1(同h1708 VH-CDR graft)
Figure BDA0002428500490000332
>h1708-H2
Figure BDA0002428500490000333
>h1708-H3
Figure BDA0002428500490000334
3.3杂交瘤克隆m1709的人源化
(1)m1709人源化构架选择
鼠源抗体m1709的人源化轻链模板为IGKV1-39*01和hjk4.1，人源化重链模板为IGHV1-46*01和hjh4.1，经人源化后得到人源化抗体h1709，人源化可变区序列如下：
h1709VH-CDR graft
Figure BDA0002428500490000335
h1709VL-CDR graft
Figure BDA0002428500490000336
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。
(2)h1709回复突变设计如下表：
表9：h1709回复突变设计
Figure BDA0002428500490000341
注：如S60D表示依照氨基酸序列自然顺序编号，将60位S突变回A。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。
回复突变设计后的h1709人源化抗体轻/重链可变区序列如下：
>h1709-L1(同h1709 VL-CDR graft)
Figure BDA0002428500490000342
>h1709-L2
Figure BDA0002428500490000343
>h1709L3
Figure BDA0002428500490000344
>h1709-L4
Figure BDA0002428500490000345
>h1709-H1(同h1709 VH-CDR graft)
Figure BDA0002428500490000346
Figure BDA0002428500490000351
>h1709-H2
Figure BDA0002428500490000352
>h1709-H3
Figure BDA0002428500490000353
>h1709-H4
Figure BDA0002428500490000354
3.4杂交瘤克隆m1710的人源化
(1)m1710人源化构架选择
鼠源抗体m1710的人源化轻链模板为IGKV1-39*01和hjk4.1，人源化重链模板为IGHV1-46*01和hjh4.1，经人源化后得到人源化抗体h1710，人源化可变区序列如下：
h1710VH-CDR graft
Figure BDA0002428500490000355
h1710VL-CDR graft
Figure BDA0002428500490000356
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。
(2)h1710回复突变设计如下表：
表10：h1710回复突变设计
Figure BDA0002428500490000361
注：如A43S表示依照氨基酸序列自然顺序编号，将43位A突变回S。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。
回复突变设计后的h1710人源化抗体轻/重链可变区序列如下：
>h1710-L1(同h1710 VL-CDR graft)
Figure BDA0002428500490000362
>h1710-L2
Figure BDA0002428500490000363
>h1710-H1(同h1710 VH-CDR graft)
Figure BDA0002428500490000364
>h1710-H2
Figure BDA0002428500490000365
>h1710-H3
Figure BDA0002428500490000366
Figure BDA0002428500490000371
>h1710-H4
Figure BDA0002428500490000372
>h1710-H5
Figure BDA0002428500490000373
3.5杂交瘤克隆m1711的人源化
(1)m1711人源化构架选择
鼠源抗体m1711的人源化轻链模板为IGKV4-1*01和hjk4.1，人源化重链模板为IGHV1-69*02和hjh4.1，经人源化后得到人源化抗体h1711，人源化可变区序列如下：
h1711VH-CDR graft
Figure BDA0002428500490000374
h1711VL-CDR graft
Figure BDA0002428500490000375
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。
(2)h1711回复突变设计如下表：
表11：h1711回复突变设计
Figure BDA0002428500490000376
Figure BDA0002428500490000381
注：如P49S表示依照氨基酸序列自然顺序编号，将49位P突变回S。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。
回复突变设计后的h1711人源化抗体轻/重链可变区序列如下：
>h1711-L1(同h1711 VL-CDR graft)
Figure BDA0002428500490000382
>h1711-L2
Figure BDA0002428500490000383
>h1711-L3
Figure BDA0002428500490000384
>h1711-H1(同h1711 VH-CDR graft)
Figure BDA0002428500490000385
>h1711-H2
Figure BDA0002428500490000386
>h1711-H3
Figure BDA0002428500490000391
>h1711-H4
Figure BDA0002428500490000392
3.6构建和表达人源化抗体
将前述回复突变设计获得的人源化抗体重链可变区与人抗体重链恒定区的氨基端连接形成抗体重链，轻链可变区与人抗体轻链恒定区的氨基端连接形成抗体轻链；设计引物PCR搭建各人源化抗体VH/VK基因片段，再与表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-Fc/CL)片段)进行同源重组，构建抗体全长表达载体VH-CH1-Fc-pHr/VK-CL-pHr，进行人源化抗体的表达。示例性的，抗体重链可变区与带S228P(对应于序列SEQ ID NO：78的第108位)突变的IgG4重链恒定区的氨基端连接，轻链可变区与kappa轻链恒定区的氨基端连接，最终获得h1707、h1708、h1709、h1710、h1711人源化抗体，具体见下表12-16：
表12：h1707人源化抗体
Figure BDA0002428500490000393
注：表中“h1707-02”表示由h1707-H2重链可变区(如SEQ ID NO：50所示)和如SEQID NO：78所示重链恒定区的氨基端连接而成的重链，与由h1707-L1轻链可变区(如SEQ IDNO：46所示)和如SEQ ID NO：79所示的轻链恒定区的氨基端连接而成的轻链形成的全长抗体，其它依此类推。
表13：h1708人源化抗体
Figure BDA0002428500490000394
Figure BDA0002428500490000401
注：表中“h1708-04”表示由h1708-H1重链可变区(如SEQ ID NO：51所示)和如SEQID NO：78所示重链恒定区的氨基端连接而成的重链，与由h1708-L2轻链可变区(如SEQ IDNO：53所示)和如SEQ ID NO：79所示的轻链恒定区的氨基端连接而成的轻链形成的全长抗体，其它依此类推。
表14：h1709人源化抗体
Figure BDA0002428500490000402
注：表中“h1709-10”表示由h1709-H2重链可变区(如SEQ ID NO：61所示)和如SEQID NO：78所示重链恒定区的氨基端连接而成的重链，与由h1709-L3轻链可变区(如SEQ IDNO：59所示)和如SEQ ID NO：79所示的轻链恒定区的氨基端连接而成的轻链形成的全长抗体，其它依此类推。
表15：h1710人源化抗体
Figure BDA0002428500490000403
注：表中“h1710-01”表示由h1710-H1重链可变区(如SEQ ID NO：64所示)和如SEQID NO：78所示重链恒定区的氨基端连接而成的重链，与由h1710-L1轻链可变区(如SEQ IDNO：65所示)和如SEQ ID NO：79所示的轻链恒定区的氨基端连接而成的轻链形成的全长抗体，其它依此类推。
表16：h1711人源化抗体
Figure BDA0002428500490000411
注：表中“h1711-04”表示由h1711-H4重链可变区(如SEQ ID NO：77所示)和如SEQID NO：78所示重链恒定区的氨基端连接而成的重链，与由h1711-L1轻链可变区(如SEQIDNO：72所示)和如SEQ ID NO：79所示的轻链恒定区的氨基端连接而成的轻链形成的全长抗体，其它依此类推。
示例性的抗体恒定区序列如下所示：
带S228P突变的IgG4重链恒定区：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：78
kappa轻链恒定区：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：79
阳性对照抗体22G2-H3Q，其VH和VL序列(分别为US20160176963A1的SEQ ID NO：8和9)分别与上述SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79所示的重链恒定区和轻链恒定区连接形成完整全长抗体。22G2-H3Q的VH和VL具体序列如下：
22G2-H3Q VH：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGIYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYYVSGNYYNVDYYFFGVDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：80
22G2-H3Q VL：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPLFTFGPGTKVDIK
SEQ ID NO：81
示例性的抗人TIGIT抗体轻/重链全长序列如下：
>h1707-02轻链全长序列
Figure BDA0002428500490000421
>h1707-02重链全长序列
Figure BDA0002428500490000422
>h1708-04轻链全长序列
Figure BDA0002428500490000423
>h1708-04重链全长序列
Figure BDA0002428500490000424
Figure BDA0002428500490000431
>h1709-10轻链全长序列
Figure BDA0002428500490000432
>h1709-10重链全长序列
Figure BDA0002428500490000433
>h1710-01轻链全长序列
Figure BDA0002428500490000434
>h1710-01重链全长序列
Figure BDA0002428500490000435
Figure BDA0002428500490000441
>h1711-04轻链全长序列
Figure BDA0002428500490000442
>h1711-04重链全长序列
Figure BDA0002428500490000443
实施例2、抗TIGIT抗体活性测试实验
一：TIGIT抗体结合人TIGIT蛋白的ELISA实验
抗TIGIT抗体的结合力通过抗体与人TIGIT蛋白的ELISA实验来检测。用带Fc或mFc标签的TIGIT融合蛋白通过与包被在酶标板中的抗Fc或mFc抗体结合从而固定到96孔酶标板中，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和TIGIT的结合活性，阳性对照分子为22G2-H3Q和10A7 hIgG4(其中10A7 hIgG4的轻重链可变区序列来自US20130251720A1中的SEQ IDNO：21和22，与其轻重链可变区连接形成全长抗体的轻重链恒定区分别为本申请的SEQ IDNO：79和78)具体实验方法如下：
用pH7.4的PBS(上海源培，Cat No.B320)缓冲液将羊抗人Fc抗体(Jackson ImmunoResearch，Cat No.109-005-008)或羊抗鼠Fc抗体(Sigma，Cat No.M3534-1ML)稀释至2μg/ml浓度，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，Cat No.CLS3590-100EA)中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(BD skim milk,CatNo.232100)封闭液200μl/孔，37℃孵育箱孵育3小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4 PBS含0.05％tween-20)洗板5次后，加入50μl/孔用样品稀释液(pH7.4 PBS含1％BSA)稀释至0.5μg/ml的TIGIT-Fc融合蛋白(内部生产)或TIGIT-mFc融合蛋白(内部生产)，置37℃孵育箱孵育1小时或4℃放置过夜。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗板5次后，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的不同浓度待测抗体(杂交瘤纯化抗体或人源化抗体)，放于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后用PBST洗板5次，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(Jackson ImmunoResearch，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52-00-03)，于室温孵育5-10min，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应，用酶标仪(Thermoscientific Multiskan,MK3)在波长450nm处读取吸收值，用GraphPad Prism 5分析数据，计算TIGIT抗体对人TIGIT蛋白的结合EC50值。结果见图1。
二：TIGIT抗体结合食蟹猴TIGIT蛋白的ELISA实验
抗TIGIT抗体的猴交叉结合力通过抗体与食蟹猴(cynomolgus)TIGIT蛋白的ELISA实验来检测。用带Fc或mFc标签的食蟹猴TIGIT融合蛋白通过与包被在酶标板中的抗Fc或mFc抗体结合从而固定到96孔酶标板中，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和食蟹猴TIGIT的结合活性，具体实验方法如下：
用pH7.4的PBS(上海源培，Cat No.B320)缓冲液将羊抗人Fc抗体(Jackson ImmunoResearch，Cat No.109-005-008)或羊抗鼠Fc抗体(Sigma，Cat No.M3534-1ML)稀释至2μg/ml浓度，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，Cat No.CLS3590-100EA)中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(BD skim milk,CatNo.232100)封闭液200μl/孔，37℃孵育箱孵育3小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4 PBS含0.05％tweeen-20)洗板5次后，加入50μl/孔用样品稀释液(pH7.4 PBS含1％BSA)稀释至0.5μg/ml的食蟹猴TIGIT-Fc融合蛋白(内部生产)或食蟹猴TIGIT-mFc融合蛋白(内部生产)，置37℃孵育箱孵育1小时或4℃放置过夜。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗板5次后，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的不同浓度待测抗体(杂交瘤纯化抗体或人源化抗体)，放于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后用PBST洗板5次，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson ImmunoResearch，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52-00-03)，于室温孵育5-10min，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应，用酶标仪(Thermo scientific Multiskan MK3)在波长450nm处读取吸收值，用GraphPad Prism5分析数据，计算TIGIT抗体对猴TIGIT的结合EC50值。结果见图2。
三：TIGIT抗体与人TIGIT过表达CHO细胞的结合实验
抗TIGIT抗体的结合力通过抗体与过表达TIGIT蛋白的CHO细胞的结合实验来检测。通过电转染的方法将TIGIT全长质粒转进CHO细胞中加压筛选两周后，检测TIGIT的表达量。将过表达细胞固定于96孔板底后，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和TIGIT过表达CHO细胞的结合活性，具体实验方法如下：
将细胞以5×10^5/ml密度，100μl/孔接种于96孔板中过夜培养。弃上清，用PBS洗三遍后，加入100μl/孔的细胞免疫固定液(Beyotime，Cat No.P0098)室温固定半小时，PBS洗四遍。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(BD skim milk,Cat No.232100)封闭液200μl/孔，37℃孵育箱孵育3小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4 PBS含0.05％tweeen-20)洗板5次后，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的不同浓度待测抗体(杂交瘤纯化抗体或人源化抗体)，放于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后用PBST洗板5次，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(Jackson ImmunoResearch，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52-00-03)，于室温孵育5-15min，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应，用酶标仪(Thermoscientific Multiskan MK3)在波长450nm处读取吸收值，用GraphPad Prism5分析数据，计算TIGIT抗体对TIGIT过表达CHO细胞的结合EC50值。结果见图3。
四：TIGIT抗体与人PBMC的结合实验
抗TIGIT抗体的结合力通过抗体与体外激活的人PBMC的结合实验来检测。通过超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激的方法使人PBMC活化，抗体加入后荧光信号的强弱被用于判断抗体和活化的人PBMC的结合活性，具体实验方法如下：
新鲜血液利用Ficoll-Hypaque密度梯度离心(Stem Cell Technologies)得到PBMC，于RPMI 1640培养基中培养，该培养基中添加10％(v/v)FBS，同时加入超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)500ng/ml，37℃、5％CO2条件下培养4天。
激活后的PBMC细胞以5×10^6/ml密度，100μl/孔接种于96孔圆底板(Corning，CatNo.32915001)中，离心机(Beckman Coulter,Allegra X-15R Centrifuge)1500rpm离心5分钟，弃上清；用200μl PBS重悬细胞，离心，弃上清，重复一遍。加入100μl/孔已用样品稀释液(pH7.4 PBS含1％BSA)梯度稀释的待测抗体溶液重悬细胞，4℃孵育1小时。孵育结束后，1500rpm离心5分钟，弃上清，用样品稀释液洗两遍细胞后，加入PE-山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearch，109-115-098)稀释液100μl重悬细胞，4℃孵育1小时。孵育结束后，1500rpm离心5分钟，弃上清，用样品稀释液洗两遍细胞，最后用200μl/孔样品稀释液重悬细胞，在流式细胞仪(BD FACS CantoⅡ)上检测荧光信号强弱，用GraphPad Prism 5分析数据，计算TIGIT抗体对人PBMC细胞结合的EC50值。结果见图4。
五：Biacore测定
用Biacore，GE仪器测定待测抗TIGIT抗体与人、猴TIGIT的亲和力。
用Protein A生物传感芯片(Cat.#29127556,GE)亲和捕获或按照人抗捕获试剂盒(Cat.#28-9538-28，GE)说明书中的方法将人抗捕获抗体共价偶联于生物传感芯片(Cat.#28-9538-28，GE)上，从而亲和捕获一定量的待测抗体，然后于芯片表面流经一系列浓度梯度下的人、猴TIGIT抗原，人源TIGIT可选自义翘神州生物公司(Cat.10917-H08-H，Sino.Biol)，猴TIGIT由实施例1及实施例2表达纯化而得，利用Biacore仪器(BiacoreT200，GE)实时检测反应信号从而获得结合和解离曲线。在每个循环解离完成后，用人抗捕获试剂盒里配置的再生溶液或pH1.5的甘氨酸-盐酸再生溶液(Cat.#BR-1003-54,GE)将生物芯片洗净再生。实验中用到的氨基偶联试剂盒购自GE公司(Cat.#BR-1000-50，GE)，缓冲液为HBS-EP+10×缓冲溶液(Cat.#BR-1006-69，GE)用D.I.Water稀释至1×(pH 7.4)。
实验得到的数据用BIAevaluation version 4.1，GE软件以(1:1)Langmuir模型进行拟合，得出亲和力数值，结果见表17-19。
表17、待测分子与人TIGIT蛋白的反应亲和力
Figure BDA0002428500490000471
表18、待测分子与cynoTIGIT蛋白的反应亲和力
Figure BDA0002428500490000472
表19、ch1711及其人源化抗体与人TIGIT蛋白的反应亲和力
Figure BDA0002428500490000481
六：TIGIT抗体对TIGIT抗原与CD155蛋白结合的阻断试验
抗TIGIT抗体的阻断能力通过抗体阻断TIGIT与CD155蛋白结合的HTRF实验来检测。用Pab Anti-Human IgG-Tb(Cisbio，Cat No.61HFCTAA)和Streptavidin-XL665(Cisbio，Cat No.610SAXLA)这对供体和受体与TIGIT-Fc和biotinylated CD155(R&D，CatNo.2530-CD-050/CF)结合，或者Pab Anti-mouse-IgG-XL665(Cisbio，Cat No.61PAMXLA)和Streptavidin-Tb(Cisbio，Cat No.610SATLA)与TIGIT-mFc和biotinylated CD155(R&D，Cat No.2530-CD-050/CF)结合，杂交瘤纯化抗体或人源化抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体阻断TIGIT与CD155的活性，具体实验方法如下：
将稀释液(pH7.4 PBS含1％BSA)稀释的不同浓度待测抗体(杂交瘤纯化抗体或人源化抗体)10μl/孔加入384孔实验板(Corning,Cat No.3706)，1000rpm离心1min后加入2.5μl/孔用样品稀释液稀释至2μg/ml的TIGIT-Fc或TIGIT-mFc，1000rpm离心1min后加入2.5μl/孔稀释至4μg/ml的biotin-CD155，1000rpm离心1min后室温预孵育10min，然后加入2.5μl/孔的样品稀释液稀释至3.2μg/ml的Pab Anti-Human IgG-Tb(Cisbio，Cat No.61HFCTAA)和2.5μl/孔的0.08μg/ml的Streptavidin-XL665(Cisbio，Cat No.610SAXLA)，或者2.5μl/孔的样品稀释液稀释至3.2μg/ml的Pab Anti-mouse-IgG-XL665(Cisbio，CatNo.61PAMXLA)和2.5μl/孔的0.08μg/ml的Streptavidin-Tb(Cisbio，Cat No.610SATLA)，室温放置1小时，用PHEARstar FS酶标仪(BMG LABTECH)检测665nm与620nm的发射光值，用GraphPad Prism 5分析数据，计算TIGIT抗体对人TIGIT与CD155蛋白的抑制活性。结果见图5A和图5B。
七、TIGIT抗体对TIGIT抗原与过表达CD155的CHO细胞结合的阻断实验
抗TIGIT抗体的阻断能力通过抗体阻断TIGIT与过表达CD155的CHO细胞结合的ELISA实验来检测。通过电转染的方法将CD155全长质粒转染进CHO细胞中加压筛选两周后，检测CD155的表达量。将过表达细胞固定于96孔板底后，TIGIT与稀释好的不同浓度抗TIGIT抗体预孵育后加入孔板，加入二抗后通过信号的强弱被用于判断抗体阻断TIGIT与过表达CD155的CHO细胞结合的能力，具体实验方法如下：
CD155-CHO细胞以5×10^5/ml密度，100μl/孔接种于96孔板中过夜培养。弃上清，用PBS洗三遍后，加入100μl/孔细胞免疫固定液(Beyotime，Cat No.P0098)室温固定半小时，PBS洗四遍。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(BD skim milk,CatNo.232100)封闭液200μl/孔，37℃孵育箱孵育3小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4 PBS含0.05％tweeen-20)洗板5次后，加入50μl/孔用样品稀释液(pH7.4 PBS含1％BSA)稀释的已预混合孵育1小时的终浓度为0.2μg/ml的human TIGIT-hFc(内部生产)或human TIGIT-mFc(内部生产)与梯度浓度的待测抗体的抗原抗体混合液，置37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗板5次后，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)或羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52-00-03)，于室温孵育5-15分钟，加入50μl/孔1M H2SO4溶液终止反应，用酶标仪(Thermo scientific Multiskan，MK3)在波长450nm处读取吸收值，用GraphPad Prism 5分析数据，计算TIGIT抗体对抗原与过表达CD155的CHO细胞结合的阻断作用。结果见图6。
八、TIGIT抗体对CD155蛋白与过表达TIGIT的CHO细胞结合的阻断实验
抗TIGIT抗体的阻断能力通过抗体阻断CD155与TIGIT过表达CHO细胞结合的FACS实验来检测。通过电转染的方法将TIGIT全长质粒转染进CHO细胞中加压筛选两周后，检测TIGIT的表达量。将过表达细胞与不同浓度的抗TIGIT抗体预孵育后，再加入荧光标记的CD155-Fc进行孵育，通过信号的强弱用于判断抗体阻断CD155与过表达TIGIT的CHO细胞结合的能力，具体实验方法如下：
先将CD155-Fc(Sino Biological，Cat No.10109-H02H)标记CFTM633(SigmaAldrich,Cat No.MX633S100)的荧光染料。将CD155-Fc用PBS溶解至浓度为0.5-1mg/ml，加入9倍样品体积的10×Mix-n-Stain Reaction Buffer，混匀；然后加入CFTM633荧光染料，避光室温孵育30分钟后，荧光标记完成。
TIGIT-CHO细胞以5×10^6/ml密度，100μl/孔接种于96孔圆底板(Corning，CatNo.32915001)中，离心机(Beckman Coulter,Allegra X-15R Centrifuge)1500rpm离心5分钟，弃上清；用200μl PBS重悬细胞，离心，弃上清，重复一遍。加入100μl/孔已用样品稀释液(pH7.4 PBS含1％BSA)梯度稀释的待测抗体溶液重悬细胞，4℃孵育1小时。孵育结束后，1500rpm离心5分钟，弃上清，用样品稀释液洗两遍细胞后，加入100μl 2μg/ml的CFTM633荧光标记的CD155-Fc溶液重悬细胞，4℃孵育1小时。孵育结束后，1500rpm离心5分钟，弃上清，用样品稀释液洗两遍细胞，最后用200μl/孔样品稀释液重悬细胞，在流式细胞仪(BD FACSCantoⅡ)上检测荧光信号强弱，用GraphPad Prism 5分析数据，计算TIGIT抗体对CD155与TIGIT-CHO细胞结合的阻断能力。结果见图7。
九、TIGIT抗体对TIGIT抗原与过表达CD112的CHO细胞结合的阻断实验
抗TIGIT抗体的阻断能力通过抗体阻断TIGIT与CD112过表达CHO细胞结合的FACS实验来检测。通过电转染的方法将CD112全长质粒转染进CHO细胞中加压筛选两周后，检测CD112的表达量。将TIGIT-mFc蛋白与稀释好的不同浓度抗TIGIT抗体预孵育后加入CD112过表达的CHO细胞中进行孵育，加入PE label的抗体检测TIGIT信号的强弱被用于判断抗体阻断TIGIT与过表达CD112的CHO细胞结合的能力，具体实验方法如下：
1％BSA稀释人源化抗体样品，从20μg/mL起始浓度两倍稀释九个浓度点，同时稀释TIGIT-mFc至2μg/mL，将抗原和不同浓度的抗体按1:1体积比混匀，37℃预孵育30分钟；收集CD112-CHOs细胞，PBS洗涤一次，按0.5*10^6/test分配；用150μl的抗原抗体混合液重悬细胞，4℃孵育60分钟，1％BSA洗涤3次；PE-山羊抗小鼠IgG(Biolegend,405307)稀释液100μl重悬细胞，4℃孵育40分钟，1％BSA洗涤3次，用200μl 1％BSA重悬细胞，在流式细胞仪BDFACSCantoⅡ上读取各样品MFI，GraphPad Prism 5分析数据，判断TIGIT抗体对抗原与CD112-CHO细胞结合的阻断作用。结果见图8。
十、TIGIT抗体在TIGIT过表达CHO细胞的结合内吞实验
为了研究TIGIT抗体与细胞表面抗原结合后发生内吞的能力，用过表达全长TIGIT的CHO细胞进行TIGIT抗体的内吞能力的FACS实验。具体实验方法如下：
TIGIT-CHO细胞以2×10^6/ml密度，100μl/孔接种于96孔圆底板(Corning，CatNo.32915001)中，离心机(Beckman Coulter,Allegra X-15R Centrifuge)1500rpm离心5分钟，弃上清；用200μl 1％BSA重悬细胞，离心，弃上清，重复一遍。1％BSA稀释人源化抗体样品至4μg/mL浓度，100μl/孔加入细胞中重悬细胞，冰上孵育1小时。孵育结束后，1500rpm离心5分钟，弃上清，用1％BSA洗三遍细胞后，用10％FBS-DMEM/F-12培养基重悬细胞并将细胞分为两部分，一部分放到37℃培养箱中孵育1小时(内吞组，Internalization group)，另一部分继续在冰上孵育1小时(结合亲和力组，Binding affinity group)。孵育结束后，用1％BSA洗一遍细胞后加入用1％BSA稀释的PE-anti-Fc抗体(Jackson，109-115-098)冰上孵育一小时后，1％BSA洗涤3次，用1％BSA重悬细胞，在流式细胞仪BD FACSCantoⅡ上读取各样品MFI，按照如下计算公式计算抗体的内吞率。注：Black是不加抗TIGIT抗体孵育，只加用1％BSA稀释的PE-抗Fc抗体冰上孵育一小时后洗涤3次重悬读取MFI。结果见图9。
内吞比率(Internalization Ratio)％＝(结合亲和力组-内吞组)*100/(结合亲和力组-空白组)
十一、自然杀伤细胞(NK)的细胞杀伤实验
为了研究TIGIT抗体对NK细胞杀伤功能的影响，收集和纯化人外周血单核细胞(PBMC)，提取自然杀伤细胞(NK)，与人大肠癌细胞WiDr共培养4h，检测乳酸脱氢酶(LDH)的分泌水平。具体实验过程如下：
人大肠癌细胞系WiDr于MEM培养基中培养，该培养基中添加10％(v/v)胎牛血清(FBS)，37℃、5％CO2条件下培养。新鲜血液利用Ficoll-Hypaque密度梯度离心(Stem CellTechnologies)得到PBMC，人原代NK细胞从新鲜分离的PBMC中提取(Miltenyi,CAT#130-092-657)，于RPMI 1640培养基中培养，该培养基中添加10％(v/v)FBS，37℃、5％CO2条件下培养。
人原代NK细胞接种至6孔细胞培养板，细胞密度约为2×10^6/ml，加入100U/mL人IL-2过夜培养后，利用无酚红RPMI 1640培养基洗涤，重悬，并接种至96孔U底板中，细胞密度约为3×10^5/孔，同时加入梯度稀释的抗体样品(用PBS稀释)或等量的同型IgG作为空白对照。37℃，5％CO2培养箱孵育1h后，靶标细胞WiDr以1:1比例与人原代NK细胞共培养，37℃，5％CO2培养箱培养4h后，收集细胞培养上清。采用CytoTox
Figure BDA0002428500490000511
Non-RadioactiveCytotoxicity Assay(Promega,CAT#G1780)说明书方法检测细胞培养上清内LDH分泌水平。特异性细胞溶解的百分比以下式决定：％溶解＝100×(ER-SR1-SR2)/(MR-SR1)，其中ER、SR(1&2)及MR分别代表实验、自发(1为靶标细胞，2为人原代NK细胞)及最大LDH释放。自发释放系由单独培养于培养基中的靶标细胞或人原代NK细胞所释放的LDH，最大释放系利用裂解液裂解所有靶标细胞时所测定的LDH。结果如图10A或图10B所示，TIGIT人源化候选抗体h1707-02、h1708-04、h1710-01等抗体均能够不同程度增强人原代NK细胞对靶细胞的杀伤，并且有药物浓度剂量效应。
十二、PBMC-T淋巴细胞激活实验
为了研究TIGIT抗体对人原代T淋巴细胞功能的影响，收集和纯化人外周血单核细胞(PBMC)，采用结核菌素(TB)体外刺激5天后，检测细胞因子IFNγ分泌水平。具体实验过程如下：
新鲜血液利用Ficoll-Hypaque密度梯度离心(Stem Cell Technologies)得到PBMC，于RPMI 1640培养基中培养，该培养基中添加10％(v/v)FBS，37℃、5％CO2条件下培养。
新鲜分离纯化的PBMC以RPMI 1640培养基调整密度为2×10^6/ml，20mL细胞悬液中加入25μl结核菌素，37℃、5％CO2培养箱培养5天。第5天，在96孔细胞培养板中加入CD155(重组CD155/PVR Protein，R&D，2530-CD-050/CF)，每孔0.25μg，4℃包被过夜。第6天，收集上述培养的细胞离心，用PBS洗一次，重悬至新鲜的RPMI 1640培养基中，调整密度为1×10^6/ml，接种至CD155包被的96孔细胞培养板，每孔90μl。同时加入梯度稀释的抗体样品(用PBS稀释)或等量的同型IgG作为空白对照，每孔10μl。细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱孵育3天。取出细胞培养板，离心(4000rpm，10min)收集细胞培养上清，采用ELISA的方法(人IFN-γ检测试剂盒，欣博盛，EHC102g.96)检测IFN-γ的水平。具体操作参考试剂说明书。结果如图11所示，TIGIT人源化候选抗体h1708-04，h1710-01等抗体能够不同程度增强激活的原代T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ，并且有药物浓度剂量效应。
十三、人源化TIGIT抗体大鼠药代动力学评价
SD雄性大鼠，体重180-240g，购自西普尔-必凯实验动物有限公司。饲养期间自由摄取饲料和水，实验室环境适应性饲养不小于3天，12/12小时光/暗周期调节，温度16-26℃，相对湿度40-70％。实验开始前一天，对SD大鼠进行编号，随机分组，每组3只。实验当天，五组大鼠分别静脉注射或皮下注射受试药物h1707-02、h1708-04、h1710-01、h1711-04和h1709-10，22G2-H3Q为阳性对照，给药剂量为3mg/kg；注射体积均为5ml/kg。
静脉注射给药方式于给药前及给药后5min,8h,1d,2d,4d,7d,10d,14d,21d,28d各时间点采血。皮下注射给药方式于给药前及给药后1h,4h,8h,1d,2d,4d,8d,11d,14d,21d,28d各时间点采血。每只动物取全血0.2ml，不加抗凝剂，取血后在4℃放置30min，1000g离心15min，取上清置于EP管中，-80℃保存。
采用ELISA方法(见前述实施例2.一)检测血清中的抗体浓度，采用Winnolin软件计算受试药物的药动学参数。所得部分主要药动学结果见图12。
经检测，SD大鼠静脉注射给予3mg/kg抗TIGIT抗体h1707-02,h1708-04，h1710-01，h1709-10，h1711-04后，在大鼠体内的暴露量相近；皮下给药生物利用度高，接近100％；各抗体的消除半衰期均较长，优于22G2-H3Q抗体。
以下通过试验配制抗TIGIT抗体稳定制剂(示例性的，下述实施例3-11中的抗TIGIT抗体为前述的h1708-04抗体)
实施例3.TIGIT抗体Tm值的测定
配制不同pH值的10mM磷酸氢二钠-枸橼酸(PB-CA)缓冲液(见下面1)～6)组)，制备抗TIGIT抗体浓度为1mg/ml的抗体制剂：
1)10mM磷酸氢二钠-枸橼酸，pH4.5
2)10mM磷酸氢二钠-枸橼酸，pH5.0
3)10mM磷酸氢二钠-枸橼酸，pH5.5
4)10mM磷酸氢二钠-枸橼酸，pH6.0
5)10mM磷酸氢二钠-枸橼酸，pH6.5
6)10mM磷酸氢二钠-枸橼酸，pH7.0
用差式扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)测定抗TIGIT抗体在每组制剂中的热稳定性。试验结果见表20，结果表明，抗TIGIT抗体在pH5.0～7.0之间较稳定。
表20.抗TIGIT抗体不同pH制剂Tm值
组别 pH Tm Onset℃ Tm℃
1 4.5 51.16 75.49
2 5.0 54.68 76.86
3 5.5 58.06 77.73
4 6.0 62.56 77.74
5 6.5 63.29 77.62
6 7.0 63.69 77.20
实施例4.抗TIGIT抗体制剂缓冲体系pH值的筛选
配制不同缓冲液(见下面的1)～12)组)，制备抗TIGIT抗体浓度为50mg/ml的抗体制剂：
1)10mM醋酸-醋酸钠，pH5.0；
2)10mM醋酸-醋酸钠，pH5.5；
3)10mM醋酸-醋酸钠，pH5.7；
4)10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH5.0；
5)10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH5.5；
6)10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH6.0；
7)10mM组氨酸-盐酸组氨酸，pH5.5；
8)10mM组氨酸-盐酸组氨酸，pH6.0；
9)10mM组氨酸-盐酸组氨酸，pH6.5；
10)10mM组氨酸-醋酸，pH5.0；
11)10mM组氨酸-醋酸，pH5.5；
12)10mM组氨酸-醋酸，pH6.0。
取各组抗TIGIT抗体制剂样品进行高温(40℃)稳定性研究，试验结果见表21。结果表明：pH在5.0～6.0范围内，4个缓冲体系SEC单体纯度值差别不大，CE-SDS(NR)的主峰变化在2％以内，ICE中性峰的变化在13.1％～17.5％区间内，相对于pH6.5的缓冲液更稳定。
表21.TIGIT抗体制剂缓冲体系pH值筛选结果
Figure BDA0002428500490000531
Figure BDA0002428500490000541
注：M表示月，例如M0表示保存0个月，40℃M1表示40℃条件下保存1个月
实施例5.抗TIGIT抗体制剂中表面活性剂种类的筛选
选择10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH6.0的缓冲体系、80mg/ml蔗糖以及不同种类表面活性剂(见下面1)～2)组)，制备抗TIGIT抗体浓度为50mg/ml的制剂：
1)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH6.0，0.4mg/ml聚山梨酯80，80mg/ml蔗糖；
2)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH6.0，0.4mg/ml聚山梨酯20，80mg/ml蔗糖。
观察40℃、25℃及2～8℃不同表面活性剂的抗TIGIT抗体制剂的外观稳定性，实验结果见表22。结果显示，含聚山梨酯80的抗TIGIT抗体制剂在40℃、25℃及2～8℃下均保持稳定。
表22.TIGIT抗体表面活性剂种类筛选稳定性结果
Figure BDA0002428500490000542
Figure BDA0002428500490000551
注：M表示月，D表示天，例如M0表示保存0个月，40℃D20表示40℃条件下保存20天，25℃M6表示25℃条件下保存6个月，2～8℃M6表示2～8℃条件下保存6个月。
实施例6.TIGIT抗体制剂中表面活性剂浓度的筛选
选择10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5的缓冲体系、80mg/ml蔗糖以及不同浓度的聚山梨酯80(见下面1)～6)组)，制备抗TIGIT抗体浓度为50mg/ml的抗体制剂：
1)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，不含聚山梨酯80；
2)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，0.1mg/ml聚山梨酯80；
3)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，0.2mg/ml聚山梨酯80；
4)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，0.4mg/ml聚山梨酯80；
5)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，0.6mg/ml聚山梨酯80；
6)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，0.8mg/ml聚山梨酯80。
放置振摇稳定性试验(25℃，300rpm)，振摇7天，实验结果见表23，结果表明，未添加聚山梨酯80的制剂在振摇7天之后，外观明显变差，说明表面活性剂聚山梨酯80的加入对制剂具有稳定作用，含0.1mg/ml～0.8mg/ml的聚山梨酯80各组制剂无明显差别，各组制剂均稳定。
表23.TIGIT抗体聚山梨酯80浓度筛选振摇实验结果
Figure BDA0002428500490000552
注：ShakingD7表示振摇7天，0h表示振摇0小时。
实施例7.抗TIGIT抗体制剂中糖浓度的筛选
选择10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5的缓冲体系、0.4mg/ml聚山梨酯80以及不同浓度的蔗糖(见下面1)～5)组)，制备抗TIGIT抗体浓度为50mg/ml的抗体制剂：
1)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，65mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80；
2)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，70mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80；
3)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，75mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80；
4)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80；
5)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，85mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80；
检测各组样品渗透压，实验结果见表24，实验结果表明，蔗糖浓度为80mg/ml时制剂等渗。
表24.抗TIGIT抗体不同蔗糖浓度渗透压结果
组别 蔗糖浓度 渗透压值(mOsm)
1 65mg/ml 244
2 70mg/ml 264
3 75mg/ml 286
4 80mg/ml 304
5 85mg/ml 319
实施例8.抗TIGIT抗体不同缓冲体系稳定性
用下列缓冲体系(见下面1)～3)组)，制备含50mg/ml抗TIGIT抗体，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80的抗体制剂：
1)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5；
2)10mM组氨酸-醋酸pH5.5；
3)10mM琥珀酸-琥珀酸钠pH5.5。
测试在25℃及2～8℃不同缓冲体系中的抗TIGIT抗体制剂的稳定性，实验结果见表25、表26所示，结果表明，25℃放置6个月和2～8℃放置6个月，10mM醋酸-醋酸钠、10mM组氨酸-盐酸组氨酸和10mM琥珀酸缓冲体系的抗TIGIT抗体制剂均具有的良好的稳定性，相互之间未见明显差异。
表25.不同缓冲体系25℃稳定性结果
Figure BDA0002428500490000561
注：M表示月，例如M6表示6个月。
表26.不同缓冲体系2～8℃稳定性结果
Figure BDA0002428500490000571
注：M表示月，例如M6表示6个月。
实施例9.抗TIGIT抗体制剂成分的综合筛选
为了进一步对抗体浓度(40～60mg/ml)、pH(5.0～6.0)和缓冲体系(His-HCl、His-AA、SA)进行综合筛选，运用JMP软件进行DOE设计，应用RSM模型得到一系列处方(见下面1)～13)组)，在不同的缓冲体系中，制备含0.4mg/ml聚山梨酯80和80mg/ml蔗糖的抗TIGIT抗体制剂：
1)10mM组氨酸-盐酸组氨酸，pH5.5，43mg/ml抗TIGIT抗体；
2)10mM组氨酸-盐酸组氨酸，pH5.55，58mg/ml抗TIGIT抗体；
3)10mM组氨酸-盐酸组氨酸，pH6.0，47mg/ml抗TIGIT抗体；
4)10mM组氨酸-醋酸，pH5.0，40mg/ml抗TIGIT抗体；
5)10mM组氨酸-醋酸，pH5.0，60mg/ml抗TIGIT抗体；
6)10mM组氨酸-醋酸，pH5.5，50mg/ml抗TIGIT抗体；
7)10mM组氨酸-醋酸，pH5.5，50mg/ml抗TIGIT抗体(备注：对中值的第6组设计一个重复试验)；
8)10mM组氨酸-醋酸，pH6.0，40mg/ml抗TIGIT抗体；
9)10mM组氨酸-醋酸，pH6.0，60mg/ml抗TIGIT抗体；
10)10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH5.0，50mg/ml抗TIGIT抗体；
11)10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH5.5，40mg/ml抗TIGIT抗体；
12)10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH5.5，60mg/ml抗TIGIT抗体；
13)10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH6.0，50mg/ml抗TIGIT抗体；
将各组抗体制剂样品保存于40℃或光照(5±3℃，4500lx)条件下进行稳定性分析，实验结果见表27及附图13-15。结果表明，组氨酸-醋酸(His-AA)的可选pH范围最大，可选5.0～5.8；组氨酸-盐酸组氨酸(His-HCl)的可选pH范围在5.5～6.0；琥珀酸-琥珀酸钠(SA)可选的pH范围比较窄。另外，SA纯度数据下降相对His-AA和His-AA较大。因此，抗TIGIT抗体制剂的缓冲液可选His-AA，pH范围为5.0～5.8，抗TIGIT抗体浓度为40～60mg/ml。
表27.DOE筛选实验结果
Figure BDA0002428500490000581
Figure BDA0002428500490000591
注：40℃D25表示40℃条件下保存25天，0h表示保存0小时，LightD10表示光照(5±3℃，4500lx)条件保存10天。
实施例10.抗TIGIT抗体制剂的冻干
用pH5.5的含10mM组氨酸-醋酸的缓冲液，制备含80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨醇酯80的抗TIGIT抗体浓度为50mg/ml的抗体制剂。将抗体以2.15mL/瓶填充入6mL西林瓶中，装入冻干箱中，冻干。冻干程序为预冻、一次干燥和二次干燥。冻干程序结束后，真空加塞。复溶样品进行冻干前后对比。结果表明，复溶溶液可保持液体制剂良好的性能。
表28.制剂的冻干步骤
Figure BDA0002428500490000592
注：N/A(Not applicable)表示本表对其不适用
实施例11.其它可选择制剂配方
此外，本公开还提供其它制剂配方的抗TIGIT抗体药物制剂，包含但不限于：
(1)100mg/ml抗TIGIT抗体，95mg/ml蔗糖，1.5mg/ml聚山梨酯80，和30mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.6；
(2)1mg/ml抗TIGIT抗体，100mg/ml蔗糖，0.05mg/ml聚山梨酯80，和5mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.9；
(3)20mg/ml抗TIGIT抗体，90mg/ml蔗糖，1.0mg/ml聚山梨酯80，和15mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.7；
(4)80mg/ml抗TIGIT抗体，81mg/ml蔗糖，0.6mg/ml聚山梨酯80，和20mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.6；
(5)50mg/ml抗TIGIT抗体，83mg/ml蔗糖，1.2mg/ml聚山梨酯80，和25mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.5；
(6)55mg/ml抗TIGIT抗体，78mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80，和9mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.4；
(7)30mg/ml抗TIGIT抗体，75mg/ml蔗糖，1.4mg/ml聚山梨酯80，和8mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.3；
(8)70mg/ml抗TIGIT抗体，82mg/ml蔗糖，0.8mg/ml聚山梨酯80，和11mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.2；
(9)50mg/ml抗TIGIT抗体，77mg/ml蔗糖，1.3mg/ml聚山梨酯80，和12mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.1；
(10)50mg/ml抗TIGIT抗体，80mg/ml蔗糖，0.5mg/ml聚山梨酯80，和13mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.2；
(11)52mg/ml抗TIGIT抗体，84mg/ml蔗糖，1.1mg/ml聚山梨酯80，和14mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.5；
(12)48mg/ml抗TIGIT抗体，79mg/ml蔗糖，0.7mg/ml聚山梨酯80，和12mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH6.1；
(13)49mg/ml抗TIGIT抗体，74mg/ml蔗糖，0.3mg/ml聚山梨酯80，和15mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH6.2；
(14)45mg/ml抗TIGIT抗体，80mg/ml蔗糖，0.9mg/ml聚山梨酯80，和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH6.3；
(15)65mg/ml抗TIGIT抗体，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80，和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH6.4；
虽然为了清楚的理解，已经借助于附图和实例详细描述了上述发明，但是描述和实例不应当解释为限制本公开的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地清楚结合。
序列表
<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司、上海恒瑞医药有限公司
<120> 一种抗TIGIT抗体药物组合物及其用途
<130> 2019
<150> 201910252404.2
<151> 2019-03-29
<160> 91
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 372
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> TIGIT胞外区与小鼠IgG2aFc段的融合蛋白：TIGIT-mFc
<400> 1
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser
20 25 30
Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu
50 55 60
Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys
65 70 75 80
Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu
85 90 95
Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro
100 105 110
Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser
115 120 125
Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Glu Pro Arg Gly Pro
130 135 140
Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu
145 150 155 160
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu
165 170 175
Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
180 185 190
Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu
195 200 205
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr
210 215 220
Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser
225 230 235 240
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro
245 250 255
Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln
260 265 270
Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val
275 280 285
Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val
290 295 300
Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu
305 310 315 320
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg
325 330 335
Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val
340 345 350
Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg
355 360 365
Thr Pro Gly Lys
370
<210> 2
<211> 371
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> TIGIT胞外区与人IgG1 Fc段的融合蛋白：TIGIT-Fc
<400> 2
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser
20 25 30
Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu
50 55 60
Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys
65 70 75 80
Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu
85 90 95
Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro
100 105 110
Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser
115 120 125
Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Glu Pro Lys Ser Ser
130 135 140
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
145 150 155 160
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
165 170 175
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
180 185 190
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
195 200 205
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
210 215 220
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
225 230 235 240
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
245 250 255
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
260 265 270
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
275 280 285
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
290 295 300
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
305 310 315 320
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
325 330 335
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
340 345 350
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
355 360 365
Pro Gly Lys
370
<210> 3
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 全长TIGIT
<400> 3
Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala
1 5 10 15
Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn
20 25 30
Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser
35 40 45
Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln
50 55 60
Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser
65 70 75 80
Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln
85 90 95
Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr
100 105 110
Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu
115 120 125
Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly
130 135 140
Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val
145 150 155 160
Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu
165 170 175
Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser
180 185 190
Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala
195 200 205
Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp
210 215 220
Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe
225 230 235 240
Thr Glu Thr Gly
<210> 4
<211> 373
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> cynoTIGIT胞外区与小鼠IgG2aFc段的融合蛋白：cynoTIGIT-mFc
<400> 4
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser
20 25 30
Ala Lys Lys Gly Gly Ser Val Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr
35 40 45
Met Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln His Asp His Ser Leu
50 55 60
Leu Ala Ile Arg Asn Ala Glu Leu Gly Trp His Ile Tyr Pro Ala Phe
65 70 75 80
Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser
85 90 95
Leu Thr Met Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Thr Tyr His Thr Tyr
100 105 110
Pro Asp Gly Thr Tyr Arg Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser
115 120 125
Ser Val Ala Glu His Ser Ala Arg Phe Gln Ile Pro Glu Pro Arg Gly
130 135 140
Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu
145 150 155 160
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val
165 170 175
Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
180 185 190
Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val
195 200 205
Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser
210 215 220
Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met
225 230 235 240
Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala
245 250 255
Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro
260 265 270
Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln
275 280 285
Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr
290 295 300
Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr
305 310 315 320
Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu
325 330 335
Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser
340 345 350
Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser
355 360 365
Arg Thr Pro Gly Lys
370
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1707-HCVR 序列
<400> 5
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
His Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Lys Gly Gly Ile Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys His Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Ser Ser Tyr Asp Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1707-LCVR序列
<400> 6
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Val Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Ala Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 7
<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1708-HCVR序列
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Gly Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asp Ser Thr Gly Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Thr Val Ser Gly Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ala Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1708-LCVR序列
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Ser Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln Tyr His Ser Gly Ser Pro Leu
85 90 95
Pro Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ala Leu Lys
100 105
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<211> 120
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1709-HCVR序列
<400> 9
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Leu Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Val Tyr Pro Tyr Asn Asp Asn Thr Gly Tyr Asn Arg Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Pro Ser Asn Trp Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1709-LCVR序列
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Val Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Thr Leu Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 11
<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1710-HCVR序列
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Phe Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Thr Ser Gly Ala Thr Lys Tyr Asn Asp Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Phe Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
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<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1710-LCVR序列
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Phe Thr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Phe Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ile Pro Leu
85 90 95
Pro Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 13
<211> 122
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1711-HCVR序列
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Arg Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1711-LCVR序列
<400> 14
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Ser Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Arg Asn Gln Met Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
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Asp Tyr His Met Tyr
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
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Tyr Ile Ser Lys Gly Gly Ile Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
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<400> 17
Gln Ser Ser Tyr Asp Phe Ala Met Asp Tyr
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1707 LCDR1序列
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Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1707 LCDR2序列
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Trp Ala Ser Ala Arg His Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1707 LCDR3序列
<400> 20
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
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Asn Tyr Trp Met His
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1708 HCDR2序列
<400> 22
Arg Ile Asp Pro Asp Ser Thr Gly Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Thr
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1708 HCDR3序列
<400> 23
Glu Gly Ala Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1708 LCDR1序列
<400> 24
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
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Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
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Gln Tyr His Ser Gly Ser Pro Leu Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1709 HCDR1序列
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Asp Tyr Tyr Met His
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1709 HCDR2序列
<400> 28
Leu Val Tyr Pro Tyr Asn Asp Asn Thr Gly Tyr Asn Arg Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1709 HCDR3序列
<400> 29
Gly Gly Pro Ser Asn Trp Asn Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1709 LCDR1序列
<400> 30
Lys Ala Ser Gln Asn Val Val Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1709-LCDR2序列
<400> 31
Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1709-LCDR3序列
<400> 32
Gln Gln Tyr Thr Leu Tyr Pro Leu Thr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1710-HCDR1序列
<400> 33
Asn Tyr Tyr Met His
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1710-HCDR2序列
<400> 34
Arg Ile Asp Pro Thr Ser Gly Ala Thr Lys Tyr Asn Asp Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1710-HCDR3序列
<400> 35
Glu Gly Gly Phe Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1710-LCDR1序列
<400> 36
Arg Thr Ser Glu Asn Ile Phe Thr Tyr Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1710-LCDR2序列
<400> 37
Asn Ala Lys Thr Phe Ala Glu
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1710-LCDR3序列
<400> 38
Gln His His Tyr Gly Ile Pro Leu Pro
1 5
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1711-HCDR1序列
<400> 39
Asn Tyr Trp Ile Gly
1 5
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1711-HCDR2序列
<400> 40
Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 41
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1711-HCDR3序列
<400> 41
Gly Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Arg Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1711-LCDR1序列
<400> 42
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Arg Asn Gln Met Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1711-LCDR2序列
<400> 43
Trp Thr Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 1711-LCDR3序列
<400> 44
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 45
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1707 VH-CDR graft,h1707-H1序列
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
His Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Lys Gly Gly Ile Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Ser Ser Tyr Asp Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1707 VL-CDR graft,h1707-L1序列
<400> 46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Ala Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1707-L2序列
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Ala Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1707-L3序列
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Ala Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1707-L4序列
<400> 49
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Ala Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 50
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1707-H2序列
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
His Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Lys Gly Gly Ile Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Ser Ser Tyr Asp Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1708 VH-CDR graft,h1708-H1序列
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asp Ser Thr Gly Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ala Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1708 VL-CDR graft,h1708-L1序列
<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Tyr His Ser Gly Ser Pro Leu
85 90 95
Pro Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1708-L2序列
<400> 53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Tyr His Ser Gly Ser Pro Leu
85 90 95
Pro Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<210> 54
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asp Ser Thr Gly Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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<221> DOMAIN
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Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asp Ser Thr Gly Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<221> DOMAIN
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> DOMAIN
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Phe Thr Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> DOMAIN
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1710-H3序列
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Asp Pro Thr Ser Gly Ala Thr Lys Tyr Asn Asp Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Gly Gly Phe Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1710-H4序列
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> DOMAIN
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<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Arg Ile Asp Pro Thr Ser Gly Ala Thr Lys Tyr Asn Asp Asn Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1711 VH-CDR graft,h1711-H1序列
<400> 71
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr
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Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1711 VL-CDR graft,h1711-L1序列
<400> 72
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<223> h1711-L2序列
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Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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Lys
<210> 74
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1711-L3序列
<400> 74
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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100 105 110
Lys
<210> 75
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1711-H2序列
<400> 75
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr
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<210> 76
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1711-H3序列
<400> 76
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
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100 105 110
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115 120
<210> 77
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1711-H4序列
<400> 77
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 78
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 带S228P突变的人IgG4重链恒定区序列
<400> 78
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 79
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> kappa轻链恒定区
<400> 79
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 80
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 22G2-H3Q VH序列
<400> 80
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Val Ser Gly Asn Tyr Tyr Asn Val Asp Tyr
100 105 110
Tyr Phe Phe Gly Val Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 81
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 22G2-H3Q VL序列
<400> 81
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Leu Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 82
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1707-02轻链全长序列
<400> 82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Ala Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 83
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1707-02重链全长序列
<400> 83
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
His Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Lys Gly Gly Ile Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Ser Ser Tyr Asp Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 84
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1708-04轻链全长序列
<400> 84
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Tyr His Ser Gly Ser Pro Leu
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Pro Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 85
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1708-04重链全长序列
<400> 85
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asp Ser Thr Gly Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ala Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 86
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1709-10轻链全长序列
<400> 86
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Val Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Thr Leu Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 87
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1709-10重链全长序列
<400> 87
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Tyr Pro Tyr Asn Asp Asn Thr Gly Tyr Asn Arg Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Pro Ser Asn Trp Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 88
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1710-01轻链全长序列
<400> 88
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Phe Thr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Phe Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ile Pro Leu
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Pro Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 89
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1710-01重链全长序列
<400> 89
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Asp Pro Thr Ser Gly Ala Thr Lys Tyr Asn Asp Asn Phe
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Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Gly Gly Phe Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
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Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 90
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1711-04轻链全长序列
<400> 90
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Arg Asn Gln Met Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
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115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
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Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 91
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1711-04重链全长序列
<400> 91
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
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195 200 205
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Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
Lys

Claims (43)

1.一种药物组合物，其包含特异性结合人TIGIT的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，以及缓冲液，所述缓冲液选自组氨酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液，所述缓冲液的pH为5.0至7.0；
所述的特异性结合人TIGIT的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：21、22和23氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：24、25和26氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述缓冲液的pH为5.0至6.0。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述缓冲液选自醋酸-醋酸钠缓冲液、琥珀酸-琥珀酸钠缓冲液、组氨酸-盐酸缓冲液和组氨酸-醋酸缓冲液。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述缓冲液选自pH为5.0至5.7的醋酸-醋酸钠缓冲液、pH为5.0至6.0的琥珀酸-琥珀酸钠缓冲液、pH为5.5至6.0的组氨酸-盐酸缓冲液或pH为5.0至6.0的组氨酸-醋酸缓冲液。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述缓冲液为pH为5.5的组氨酸-醋酸缓冲液。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述缓冲液浓度为5mM至30mM。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述缓冲液浓度为5mM至15mM。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述缓冲液浓度为10mM。
9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段浓度为1mg/ml至100mg/ml。
10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段浓度为40mg/ml至60mg/ml。
11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗TIGIT抗体或其抗原结合片段浓度为50mg/ml。
12.根据权利要求1所述的药物组合物，其还包括糖。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述糖为二糖。
14.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述糖为蔗糖。
15.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述糖浓度为65mg/ml至100mg/ml。
16.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述糖浓度为75mg/ml至85mg/ml。
17.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述糖浓度为80mg/ml。
18.根据权利要求1所述的药物组合物，其还包括表面活性剂。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯。
20.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯80。
21.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述表面活性剂的浓度为0.05mg/ml至1.5mg/ml。
22.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述表面活性剂的浓度为0.1mg/ml至0.8mg/ml。
23.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述表面活性剂的浓度为0.4mg/ml。
24.根据权利要求1所述的药物组合物，其中包含：
a)浓度为1mg/ml至100mg/ml的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，
b)pH为5.0至7.0的组氨酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，
c)浓度为65mg/ml至100mg/ml的蔗糖，和
d)浓度为0.05mg/ml至1.5mg/ml的聚山梨醇酯80。
25.根据权利要求1所述的药物组合物，其中包含：
a1)浓度为40mg/ml至60mg/ml的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，
b1)pH为5.0至5.7的醋酸-醋酸钠、pH为5.0至6.0的琥珀酸-琥珀酸钠、pH为5.5至6.0的组氨酸-盐酸组氨酸或pH为5.0至6.0的组氨酸-醋酸，
c1)浓度为75mg/ml至85mg/ml的蔗糖，和
d1)浓度为0.1mg/ml至0.8mg/ml的聚山梨醇酯80。
26.根据权利要求1所述的药物组合物，其中包含：
10mM的pH为5.5的组氨酸-醋酸缓冲液，浓度为50mg/ml的特异性结合人TIGIT的抗TIGIT抗体或其抗原结合片段，浓度为80mg/ml蔗糖，以及浓度为0.4mg/ml聚山梨酯80。
27.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述特异性结合人TIGIT的抗体或其抗原结合片段含有如SEQ ID NO:51、54或55所示的重链可变区，和/或如SEQ ID NO:52或53所示的轻链可变区。
28.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述特异性结合人TIGIT的抗体或其抗原结合片段含有如SEQ ID NO：51所示的重链可变区和如SEQ ID NO：53所示的轻链可变区。
29.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述特异性结合人TIGIT的抗体为全长抗体，其包括人抗体恒定区。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述特异性结合人TIGIT的抗体为全长抗体，其包含如SEQ ID NO:78所示的人抗体重链恒定区，和/或如SEQ IDNO:79所示的人抗体轻链恒定区。
31.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述特异性结合人TIGIT的抗体为全长抗体，包含如SEQ ID NO:85所示的重链，和/或如SEQ ID NO:84所示的轻链。
32.制备如权利要求1至31中任一项所述的药物组合物的方法，所述方法包括将抗TIGIT抗体或其抗原结合片段与缓冲液混合的步骤；所述缓冲液选自组氨酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液，所述缓冲液的pH为5.0至7.0。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述缓冲液的pH为5.0至6.0。
34.一种含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的冻干制剂，所述冻干制剂通过将权利要求1至31中任一项所述的药物组合物经冷冻干燥获得。
35.一种含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的冻干制剂，所述冻干制剂经复溶可形成如权利要求1至31中任一项所述的药物组合物。
36.一种含抗TIGIT抗体或其抗原结合片段的复溶溶液，所述复溶溶液通过将权利要求34或35所述的冻干制剂经复溶制备获得。
37.一种制品，其包括容器，该容器中装有如权利要求1至31任一项所述的药物组合物，或如权利要求34或35所述的冻干制剂，或如权利要求36所述的复溶溶液。
38.如权利要求1至31任一项所述的药物组合物、或如权利要求34或35所述的冻干制剂、或如权利要求36所述的复溶溶液、或如权利要求37所述的制品在制备用于治疗与人TIGIT相关的肿瘤的药物中的应用。
39.如权利要求38所述的应用，所述肿瘤选自：头和颈癌、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝胆癌、胰腺癌、胃肠道癌、肾癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、骨癌、骨髓瘤、鳞状细胞癌和全身性轻链淀粉样变性。
40.如权利要求39所述的应用，所述淋巴瘤选自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤，所述肺癌选自：非小细胞肺癌和小细胞肺癌，所述白血病选自：慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病。
41.如权利要求40所述的应用，所述淋巴瘤选自CD155阳性或PVR阳性的肿瘤。
42.如权利要求38所述的应用，所述肿瘤选自：头和颈鳞状细胞癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、肝癌、胃癌、肠癌、结肠直肠癌、透明细胞肾细胞癌、黑色素瘤、软骨肉瘤、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、尤因氏肉瘤和梅克尔细胞癌。
43.如权利要求42所述的应用，所述的肝癌为肝细胞瘤；所述的结肠直肠癌为结肠癌；所述的骨髓增生性肿瘤为多发性骨髓瘤。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11028172B1 (en) * 2020-11-10 2021-06-08 Lepu Biopharma Co., Ltd. Anti-TIGIT antibodies and uses thereof
WO2022152245A1 (zh) * 2021-01-14 2022-07-21 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗tigit抗体药物组合物及其用途
CN114790241A (zh) * 2021-01-26 2022-07-26 北京免疫方舟医药科技有限公司 抗tigit抗体及其应用
TW202241513A (zh) * 2021-04-21 2022-11-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 一種包含抗體融合蛋白的醫藥組成物及其用途
CN113150156B (zh) * 2021-04-22 2022-06-07 浙江博锐生物制药有限公司 抗tigit抗体及其用途
WO2023036340A1 (en) * 2021-09-13 2023-03-16 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Protein complexes targeting il21 pathway
CN117858903A (zh) * 2021-09-15 2024-04-09 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种含抗pvrig/tigit双特异性抗体的药物组合物
TW202321307A (zh) * 2021-09-24 2023-06-01 大陸商廣東菲鵬製藥股份有限公司 抗tigit人源化抗體或其抗原結合片段及其應用
WO2023214212A2 (en) * 2022-05-06 2023-11-09 Virtuoso Binco, Inc. Compositions and uses of cd38 and icam1 antibodies
CN115806628A (zh) * 2022-08-03 2023-03-17 深圳市先康达生命科学有限公司 一种自分泌IL-15与anti-TIGIT结合的融合蛋白及其应用
WO2024140651A1 (zh) * 2022-12-27 2024-07-04 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 包含抗tigit抗体的药物制剂

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI790593B (zh) * 2014-08-19 2023-01-21 美商默沙東有限責任公司 抗tigit抗體

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