WO2023047010A1

WO2023047010A1 - Terapia celular para el tratamiento de disfunciones de esfínteres

Info

Publication number: WO2023047010A1
Application number: PCT/ES2022/070612
Authority: WO
Inventors: Laura LEYVA FERNÁNDEZ; Fernando DE LA PORTILLA DE JUAN; Antonio RODRÍGUEZ ACOSTA; Cecilia ARIANA FRECHA; Jesús CHAPARRO GARCÍA; Raquel MUÑOZ FERNÁNDEZ; Rafael MALDONADO SÁNCHEZ
Original assignee: Servicio Andaluz De Salud; Universidad De Málaga; Universidad De Sevilla
Priority date: 2021-09-24
Filing date: 2022-09-26
Publication date: 2023-03-30
Also published as: ES2937335A1

Abstract

Terapia celular para el tratamiento de disfunciones de esfínteres. Producto de terapia celular, procedimiento de obtención y usos médicos.

Description

TERAPIA CELULAR PARA EL TRATAMIENTO DE DISFUNCIONES DE ESFÍNTERES

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina regenerativa y de la terapia celular, y específicamente se refiere al tratamiento de deficiencias en esfínteres.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Actualmente, la causa más frecuente de incontinencia fecal es el daño esfinteñano directo, tras el parto o un procedimiento quirúrgico sobre la zona anal. Los resultados a largo plazo de la reparación del complejo esfinteñano de forma quirúrgica no son todo lo buenos que cabría esperar, disminuyendo las tasas de curación de forma alarmante a partir de los 10 años de la cirugía. Además, no existe hoy en día un tratamiento satisfactorio para estos pacientes.

Los trastornos por deficiencia de esfínteres, como la incontinencia, incluida la incontinencia urinaria y fecal persistente, se asocian con un deterioro significativo de la calidad de vida, aislamiento social y síntomas depresivos. La patología subyacente no siempre se comprende bien, pero generalmente se asocia con daño a la inervación del músculo y / o pérdida de células del músculo del esfínter relacionada con la edad o con daños estructurales de la musculatura de los esfínteres. La incontinencia fecal (IF) es la pérdida involuntaria e incontrolable de heces y/o gases y es una condición incapacitante que afecta a un amplio número de pacientes con efectos devastadores en su calidad de vida. Puede producirse raramente por malformaciones congénitas (defectos de la médula espinal y malformaciones anorectales), y más frecuentemente por causas adquiridas. La rotura del esfínter anal (EA) es una de las causas más comunes de IF estructural adquirida y puede ocurrir como resultado de una lesión obstétrica, o una cirugía ano-rectal. El daño inducido por el embarazo y el parto a menudo va más allá de la rotura muscular y afecta los nervios pudendos a través del estiramiento del nervio o la compresión / lesión isquémica. Otras causas estructurales de incontinencia fecal incluyen patologías que reducen la función del reservoño o la distensibilidad de la ampolla rectal, como la anastomosis quirúrgica después de una resección anterior baja, proctitis o prolapso rectal. La abundante pérdida de tejido disminuye las capacidades regenerativas intrínsecas del músculo esquelético, y culmina con el desarrollo de cicatrices de tejido fibroso no contráctil. La reparación quirúrgica es el tratamiento de elección en los pacientes con el esfínter dañado, pero los resultados han mostrado un rango de éxito relativamente moderado tras el procedimiento. Además, se asocia con morbilidad, complicaciones perioperatorias y con una elevada tasa de fracasos, ya que la mejoría sintomática inicial no siempre se mantiene, siendo el resultado a largo plazo insatisfactorio.

Recientemente, se han revisado los estudios preclínicos y clínicos que hay hasta la fecha sobre la administración de células troncales en humanos para el tratamiento de la IF, entre los que cabe mencionar tres estudios observacionales (dos con la misma cohorte de pacientes) y dos ensayos controlados aleatorios (Trébol et al., 2018). En cinco estudios se emplearon mioblastos autólogos y en dos CMTAd (uno con células autólogas y otro con células alogénicas). Tanto en los pacientes tratados con mioblastos, como en los ensayos con CMTAd se confirmó la seguridad del implante, la ausencia de eventos adversos relevantes y la viabilidad del empleo de la terapia celular. En todos los ensayos se han observado resultados clínicos, morfológicos y funcionales alentadores y han aparecido datos que apuntan a un aumento muscular (disminución de la puntuación en la escala de gravedad de la incontinencia fecal de Wexner, incrementos de la presión en el esfínter anal, mejoría de las submedidas de calidad de vida, etc).

El uso de los precursores (mioblastos y células progenitoras musculares) ha mostrado resultados prometedores en investigaciones preclínicas, incluso a largo plazo (Bisson et al., 2015) y resultados más variables en estudios clínicos (Frudinger et al., 2010; Frudinger et al., 2015; Romaniszyn et al., 2015; Boyer et al., 2018). No obstante, hasta la fecha, los estudios con estas células precursoras son difíciles de llevarse a cabo; la extracción y el proceso de expansión mediante cultivo no es óptimo debido a la corta vida media y baja habilidad de replicación de estas células, implicando la necesidad de un alto número de células, lo que se asocia a una alta morbilidad (De Ligny et al., 2019); además, estaría limitado a un uso autólogo debido a problemas de inmunogenicidad, comprometiendo la relación coste-efectividad del tratamiento.

Particularmente, algunos estudios han mostrado que la inyección de CMT en el músculo tiene la capacidad de injertarse y formar miotubos multinucleados participando efectivamente en la regeneración tras una lesión (LaBarge & Blau, 2002; Muguruma et al, 2003), pero en algunos casos con la necesidad de una estimulación bioquímica y mecánica para alcanzar una diferenciación miogénica completa (Helms et al., 2019; Bossolasco et al, 2004).

Con el fin de tratar la IF se han empleado estrategias terapéuticas con células musculares esqueléticas y lisas, sus precursores (mioblastos, células musculares progenitoras y células troncales miogénicas), así como con células mesenquimales troncales (CMT) de diversos orígenes, con el fin de reparar el daño en el EA (De Ligny et al., 2019; Gras et al., 2017).

Los tratamientos médicos y quirúrgicos para tales deficiencias de esfínteres no son adecuados y se necesitan alternativas. Esto ha llevado a considerar la terapia celular para apoyar la regeneración del músculo dañado, así como para restablecer la inervación y vascularización de soporte del tejido. Los estudios preclínicos y clínicos respaldan la eficacia a corto plazo de esta terapia. Sin embargo, la terapia con células autólogas requiere biopsia y protocolos de expansión celular prolongados. Generalmente, proceden de pacientes con una edad elevada y, por lo tanto, la capacidad de proliferación in vitro de sus células troncales y, muy probablemente, su funcionalidad, estaría disminuida. Además, no está claro si las células permanecen en el sitio de la inyección en cantidades suficientes para constituir la mayor parte del tejido regenerado. En consecuencia, se necesitan nuevos enfoques para el tratamiento de la incontinencia y otros trastornos por deficiencia de esfínteres.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Imágenes del procedimiento de obtención del producto. La digestión enzimática con colagenasa se realizó mediante un sistema de agitación rotatoria a 35-38,5 °C, durante 30 a 90 minutos, tras la cual se neutralizó la actividad colagenasa por dilución con un volumen igual de medio de expansión [MEM-Alpha con glutamax (Ufe Technologies), suplementado con 5% Usado plaquetario humano inactivado viralmente MultiPL’i (Macopharma), 0.6 UI/mL de Heparina sódica (Rovi) y 50 .g/mL Gentamicina (Normorí), exclusivamente en primera siembra]. Posteriormente, se procedió a la centrifugación (600xg, 10 minutos, 20°C) para obtener las diferentes fases resultantes,

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los autores de la presente invención han desarrollado una suspensión de células mesenquimales troncales adultas humanas alogénicas de tejido adiposo expandidas (CMTAd) en cultivo celular hasta alcanzar las dosis de 60 y 120 millones de CMTAd por producto terminado, acondicionadas en una matriz de medio DMEM, albúmina sérica humana y L-glutamina (denominada Solución A) y diluida a partes ¡guales (1:1 v/v) con ácido hialurónico 10 mg/mL. El producto terminado envasado consiste en 2 jeringas precargadas por lote de medicamento, listas para la administración intralesional.

Las CMTAd son capaces de proporcionar un buen soporte trófico, introduciendo una población celular que puede promover la supervivencia de células lesionadas y la reparación y regeneración endógena de los tejidos dañados mediante la secreción paracrina de factores de crecimiento, factores inmunomoduladores, factores antifibróticos y mediadores angiogénicos. Su acondicionamiento en un gel de ácido hialurónico fomentaría los efectos beneficiosos de este polímero y favorecería la integración de las células en el tejido lesionado.

Tal y como se muestra en los ejemplos de la invención, durante la fase inicial de validación de la estabilidad del producto terminado, se compararon los efectos sobre la viabilidad celular de dos agentes aumentadores de volumen, colágeno y ácido hialurónico de bajo-medio peso molecular, añadidos en el excipiente de una suspensión celular. La suspensión era de células mesenquimales troncales derivadas de tejido adiposo (CMTAd) a una concentración de 10 millones de CMTAd/ml, en cada uno de los excipientes.

Los autores de la presente invención han comprobado que el ácido hialurónico no afecta negativamente ni a la viabilidad de las células mesenquimales, ni a su capacidad inmunomoduladora. Actuaría como scaffold, mejorando el efecto terapéutico de las células en la zona aplicada, promoviendo la migración de fibroblastos, su activación y la producción de procolágeno tipo I.

Además, otras diferencias con otros procedimientos conocidos en el estado del arte que suponen una ventaja al producto celular de la invención es el uso alogénico de la sustancia activa y la introducción de mejoras del proceso tales como la composición del medio de expansión celular (se ha sustituido el Suero Bovino Fetal -SBF-, un reactivo xenogénico, por Usado Plaquetario Humano inactivado viralmente-LPh-iv-) y a la retirada del antibiótico usado para completar la descontaminación de partida en etapas tempranas del proceso de fabricación

COMPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende: a) Al menos una célula troncal b) Un medio de cultivo con ácido hialurónico,

En una realización preferida, el medio de cultivo se selecciona de entre, DMEM, y Alpha-MEM. Aún más preferiblemente es DMEM. El medio de cultivo aquí descrito, en la presente invención, también se puede llamar medio de acondicionamiento, especialmente tras su dilución con ácido hialurónico.

El medio de cultivo o de acondicionamiento, antes de su dilución con ácido hialurónico, se suplementa con albúmina sérica preferiblemente humana (ASH) y glutamina, preferiblemente L-glutamina.

Por tanto, en otra realización más preferida, el medio de cultivo, antes de su dilución con ácido hialurónico, está suplementado con albúmina sérica humana (ASH) y L- glutamina.

El medio de cultivo o de acondicionamiento se puede suplementar con de 4 a 20 mg/ml de albúmina sérica humana (ASH), y más preferiblemente con 4mg/ml de ASH. El medio de cultivo o de acondicionamiento se puede suplementar con de 2 a 5 mM de L-glutamina, preferiblemente con 4 mM de L-glutamina.

Por tanto, el medio de cultivo o de acondicionamiento se suplementa más preferiblemente L-glutamina 4 mM, y aún más preferiblemente ASH a 4mg/ml.

El ácido hialurónico, antes de su dilución con el medio de cultivo o de acondicionamiento que lleva las células, se encuentra a una concentración de entre 5 mg/ml y 20 mg/ml, y más preferiblemente a una concentración de 10 mg/ml. En una realización preferida, la dilución del medio de cultivo con el ácido hialurónico es una dilución 1 :1 (v:v). En otra realización preferida, el ácido hialurónico (10 mg/ml) se encuentra en una concentración de 5 mg/ml tras dilución en el medio de cultivo (1:1 v/v). Todas las concentraciones indicadas, al ser diluidas a partes ¡guales con el ácido hialurónico, se quedan a la mitad (2mg/ml albúmina sérica humana, 2mM L-glutamina, 5 mg/ml de ácido hialurónico).

Durante la expansión celular en el proceso de fabricación alogénico y, con el fin de suprimir la presencia de materiales de origen animal y aumentar la seguridad de los pacientes, se ha sustituido el suplemento Suero Bovino Fetal por Usado Plaquetario humano inactivado viralmente (LPhiv).

Por tanto, en una realización preferida de este aspecto de la invención, la célula troncal mesenquimal de a) se ha expandido en un medio con Usado Plaquetario Humano inactivado viralmente (LPh-iv).

El término "célula troncal" o "célula madre" hace referencia a una célula con capacidad clonogénica, de autorrenovación y de diferenciación en múltiples linajes celulares. En particular, las células madre mesenquimales tienen la capacidad de proliferar extensamente y formar colonias de células con morfología fibroblástica. Tal como se usa en la presente invención, la expresión "célula troncal" se refiere a una célula pluripotente o multipotente, capaz de generar uno o más tipos de células diferenciadas, y que además posee la capacidad de auto regenerarse, es decir, de producir más células madre. Las "células troncales totipotentes" pueden dar lugar tanto a los componentes embrionarios (como, por ejemplo, las tres capas embrionarias, el linaje germinal y los tejidos que darán lugar al saco vitelino), como a los extraembrionarios (como la placenta). Es decir, pueden formar todos los tipos celulares y dar lugar a un organismo completo. Las "células troncales pluripotentes" pueden formar cualquier tipo de célula correspondiente a los tres linajes embrionarios (endodermo, ectodermo y mesodermo), así como el germinal y el saco vitelino. Pueden, por tanto, formar linajes celulares, pero a partir de ellas no se puede formar un organismo completo. Las "células troncales multipotentes" son aquellas que sólo pueden generar células de su misma capa o linaje embrionario de origen.

En el contexto de la presente invención, las células troncales son seleccionadas del grupo que comprende células madre mesenquimales, células madre, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas, células madre adultas, o combinaciones de las mismas. En una realización particular, las células troncales son células troncales de un mamífero, preferiblemente humanas. En una realización particular, las células troncales son células troncales mesenquimales, preferiblemente células troncales mesenquimales humanas. Aún más preferiblemente son células troncales mesenquimales humanas obtenidas de tejido adiposo.

El término "célula troncal adulta" se refiere a aquella célula madre que es aislada de un tejido o un órgano de un animal en un estado de crecimiento posterior al estado embrionario. Preferiblemente, las células madre de la invención son aisladas en un estado postnatal. Preferiblemente son aisladas de un mamífero, y más preferiblemente de un humano, incluyendo neonatos, juveniles, adolescentes y adultos. Se pueden aislar células madre adultas de una gran variedad de tejidos y órganos, como médula ósea (células madre mesenquimales, células progenitoras adultas multipotentes y células madre hematopoyéticas), tejido adiposo, cartílago, epidermis, folículo piloso, músculo esquelético, músculo cardíaco, intestino, hígado, neuronal.

El término "célula troncal embrionaria" o "célula madre embrionaria" o "ESC" son células derivadas de masa celular interna de embriones en estadio de blastocisto, con capacidad de auto-renovación y de diferenciación en todos los tipos de células adultas. Las células madre embrionarias son capaces de proliferar indefinidamente in vitro manteniéndose en un estado indiferenciado y con un cariotipo normal a través del cultivo prolongado. También tienen la capacidad de diferenciarse en células de las tres capas germinales embrionarias (mesodermo, endodermo y ectodermo; (Itskovitz-Eldor, et al., Mol. Med. 6:88-95, 2000) y linaje germinal.

La invención contempla el uso de células madre embrionarias obtenidas sin la destrucción del embrión, y todas las que se encuentran disponibles en repositorios públicos. Métodos para la obtención de células madre embrionarias sin la destrucción del embrión son ampliamente conocidos y pueden ser puestos en práctica por el experto sin necesidad de experimentación excesiva.

En otra realización, la presente invención no contempla el uso de células madre embrionarias. Es decir, preferiblemente las células de la invención son células troncales adultas.

Aún mucho más preferiblemente, las células troncales de la invención son células madre mesenquimales.

El término "célula troncal mesenquimal", "célula madre mesenquimal" o "MSC", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una célula de estroma multipotente, originada a partir de la capa germinal mesodérmica, que puede diferenciarse en una variedad de tipos de células, incluyendo osteocitos (células de hueso), condrocitos (células de cartílago) y adipocitos (células de grasa). Los marcadores expresados por las células madre mesenquimales incluyen CD105 (SH2), CD73 (SH3/4), CD44, CD90 (Thy-1), CD71 y Stro-1 así como las moléculas de adhesión CD106, CD166, y CD29. Entre los marcadores negativos para las MSCs (no expresados) están los marcadores hematopoyéticos CD45, CD34, CD14, CD11b, CD31 , CD43, CD56, CD68 y CD133. Las MSC pueden ser obtenidas a partir de, sin quedar limitado a, médula ósea, tejido adiposo (tal como el tejido adiposo subcutáneo), hígado, bazo, testículos, sangre menstrual, fluido amniótico, páncreas, periostio, membrana sinovial, músculo esquelético, dermis, pericitos, hueso trabecular, cordón umbilical humano, pulmón, pulpa dental y sangre periférica. Las MSC de acuerdo con la invención pueden obtenerse a partir de cualquiera de los tejidos anteriores, tal como a partir de médula ósea, de tejido adiposo subcutáneo o de cordón umbilical.

Los términos "célula madre pluripotente" o "célula troncal pluripotente" y equivalentes gramaticales se usan de forma indistinta en el contexto de la presente invención para referirse a células no diferenciadas o poco diferenciadas, de cualquier especie, con capacidad para dividirse indefinidamente sin perder sus propiedades y capaces de formar cualquier célula de los tres linajes embrionarios (mesodermo, endodermo, ectodermo), así como el linaje germinal cuando se cultivan en ciertas condiciones. La invención contempla el uso de cualquier tipo de célula madre pluripotente que sea capaz de generar una progenie de cualquiera de las tres capas germinativas incluyendo células derivadas de tejido embrionario, tejido fetal, tejido adulto y otras procedencias. Células pluripotentes adecuadas para su uso en la presente invención incluyen células madre embrionarias, células de carcinoma embrionario, células pluripotentes inducidas (¡PS) y células germinales primordiales. Asimismo, la invención contempla el uso de células madre pluripotentes de cualquier especie incluyendo, sin limitación, células humanas, de ratón, de rata, bovinas, de oveja, de hámster, de cerdo y similares.

El término "célula madre pluripotente inducida" o "¡PS", según se usa en la presente invención, se refiere a células que son sustancialmente idénticas genéticamente a una célula somática diferenciada de la que derivan pero que muestran características similares en cuanto a diferenciación y capacidad proliferativa a las células madre embrionarias pluripotentes. Típicamente, las ¡PS expresan en su superficie uno o varios marcadores seleccionados del grupo formado por SSEA-3, SSEA-4, TRA-I -60, TRA-1 -81, TRA-2-49/6E y Nanog. Típicamente, las ¡PS expresan uno o varios genes seleccionados del grupo de Oct- 3/4, Sox2, Nanog, GDF3, REXI, FGF4, ESGI, DPP A2, DPP A4 y hTERT. Las ¡PS pueden generarse usando métodos descritos en el estado de la técnica tales como los métodos descritos por Takahashi y Yamanaka (Cell, 2006, 126:663-676), Yamanaka et al. (Nature, 2007, 448:313-7), Wernig et al. (Nature, 2007, 448:318-24), Maherali (Cell Stem Cell, 2007, 1 :55-70); Maherali y Hochedlinger (Cell Stem Cell, 2008, 3:595-605), Park et al. (Cell, 2008, 134:1 -10); Dimos et al. (Science, 2008, 321 : 1218-1221 ), Blelloch et al. (Cell Stem Cell, 2007, 1 :245-247); Stadtfeld et al. (Science, 2008, 322:945-949) y Okita et al. (Science, 2008, 322: 949-953). Son células reprogramadas in vitro a partir de células somáticas diferenciadas de manera terminal mediante transducción retroviral de los factores de transcripción Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc. Típicamente, las células ¡PS se obtienen a partir de células somáticas mediante la expresión en dichas células de las proteínas Oct- 3/4 y Sox2, de las proteínas Oct-3/4, Sox2 y Klf4, de las proteínas Oct-3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc y/o de las proteínas Oct-4, Sox2, Nanog y LIN28.

En otra realización preferida, las células troncales son células troncales mesenquimales, y más preferiblemente células troncales mesenquimales obtenidas de tejido adiposo.

La célula adulta aislada de la invención, o la población celular de la invención, puede ser de origen autólogo, alogénico o xenogénico.

En otra realización preferida son células troncales alogénicas.

Si se desea, la célula adulta de la invención puede ser modificada genéticamente por cualquier método convencional incluyendo, a modo ilustrativo, no limitativo, procesos de transgénesis, delaciones o inserciones en su genoma que modifiquen la expresión de genes que sean importantes para sus propiedades básicas (proliferación, migración, transdiferenciación, etc.).

Por tanto, en otra realización preferida de este aspecto de la invención, es una población de células troncales, de ahora en adelante, población de células troncales de la invención, más preferiblemente una población de células troncales mesenquimales, y aún más preferiblemente una población de células troncales mesenquimales obtenidas de tejido adiposo. Se hace notar que la población celular referida, de ahora en adelante población celular de células mesenquimales, debe comprender al menos una célula mesenquimal, preferiblemente obtenida de tejido adiposo. En una realización preferida dicha población celular comprende al menos un 20%, preferiblemente un 30%, más preferiblemente un 40%, y aún más preferiblemente un 50%, 60%, 80%, 90%, 95%, o un 99% de células mesenquimales, preferiblemente células troncales mesenquimales obtenidas de tejido adiposo. En una realización particular de la presente invención, más de un 95% de las células tienen que expresar marcadores de células mesenquimales troncales (CD44, CD90, CD105 y CD73; y menos de un 2% debe expresar una combinación de marcadores propios de células hematopoyéticas CD11b, CD19, CD34, HLA-DR.

Aún más preferiblemente la población tiene entre 40 y 150 millones de células troncales mesenquimales, más preferiblemente se encuentran en una proporción de entre 50 y 140 millones, de entre 55 y 130 millones, y aún más preferiblemente entre 60 y 120 millones. En una realización particular la población de la invención tiene aproximadamente 60 millones de células troncales mesenquimales. En otra realización particular la población de la invención tiene aproximadamente 120 millones de células troncales mesenquimales. En una realización particular de la presente invención, la dosis es de 60 millones de células troncales mesenquimales +/- 20% (48-72 millones). En otra realización particular de la presente invención, la dosis es de 120 millones de células troncales mesenquimales +/-20% (96-144 millones).

En otra realización preferida, la composición de la invención tiene un volumen de entre 3,5 y 6 mi, más preferiblemente de entre 4 y 5,5 mi, y aún más preferiblemente de aproximadamente 5 mi.

Los autores de la presente invención han desarrollado una suspensión de células mesenquimales troncales adultas humanas alogénicas de tejido adiposo expandidas (CMTAd) en cultivo celular hasta alcanzar las dosis de 60 y 120 millones de CMTAd por producto terminado, acondicionadas en una matriz de medio DMEM, albúmina sérica humana y L-glutamina (denominada Solución A) y diluida a partes ¡guales (1:1 v/v) con ácido hialurónico 10 mg/mL. El producto terminado envasado consiste en 2 jeringas precargadas por lote de medicamento, listas para la administración intralesional.

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA DE LA INVENCIÓN Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica, de ahora en adelante composición farmacéutica de la invención, que comprende una composición de la invención.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición farmacéutica de la presente invención además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden utilizar en un método de tratamiento de manera aislada o junto con otros compuestos farmacéuticos. Por tanto, en otra realización más preferida de este aspecto de la invención, la composición farmacéutica de la presente invención además comprende otro principio activo.

En este documento el término "componente activo", "sustancia activa", "sustancia farmacéuticamente activa", o "componente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporciona una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, la curación, la mitigación, el tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecte a la estructura o función del cuerpo humano u otros animales. Ejemplos de componentes activos de origen biológico incluyen a factores de crecimiento, hormonas y citoquinas. En el estado del arte se conocen una variedad de agentes terapéuticos y podrían ser identificados por sus efectos. Determinados agentes terapéuticos son capaces de regular la proliferación y la diferenciación celular. Como ejemplo se incluyen nucleótidos, fármacos quimioterapéuticos, hormonas, proteínas no específicas (que no son anticuerpos), oligonucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos anti sentido que se unen a una secuencia de ácido nucleído diana (por ejemplo, secuencia de ARN), péptidos y peptidomiméticos. También podrían actuar como componente activo otras células.

En otra realización preferida de este aspecto, la composición farmacéutica de la presente invención comprende, adicionalmente, uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables.

El término "excipiente farmacéuticamente aceptable" tal como se utiliza aquí se refiere al hecho de que debe ser aprobado por una agencia reguladora de un gobierno federal o un gobierno nacional o uno de los enumerados en la Farmacopea de Estados Unidos o de la Farmacopea Europea, o alguna otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales y en los seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, excipiente, vehículo o adyuvante con el que las células troncales, células progenitoras o células diferenciadas de la invención, las células de la invención, así como las células de la población de células de la invención, deben ser administradas; obviamente, dicho vehículo debe ser compatible con las células.

Por tanto, el vehículo de la presente invención es el medio de cultivo o medio de acondicionamiento preferiblemente suplementado con L-glutamina y albúmina sérica humana, junto con el hidrogel de ácido hialurónico (hialuronato sódico), que se ha descrito anteriormente. Así, en la presente invención, las células primero son resuspendidas en el medio de cultivo suplementado con albúmina sérica humana y L- Glutamina a una concentración de 24 y 48 millones de células/ml y luego son diluidas a la mitad con el Ácido Hialurónico.

La composición farmacéutica de la invención puede, si se desea, contener también, cuando sea necesario, aditivos para aumentar y/o controlar el efecto terapéutico deseado de las células, por ejemplo, agentes de tamponamiento, agentes de superficie activos, conservantes, etc. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede comprender un medio de cultivo celular que mantenga la viabilidad de las células. El medio estará generalmente libre de suero con el fin de evitar provocar una respuesta inmune en el receptor. El transportador será generalmente tampón y/o libre de pirógenos. Además, para la estabilización de la suspensión celular, es posible añadir agentes quelantes de metales. La estabilidad de las células en el medio líquido de la composición farmacéutica de la invención puede ser mejorada mediante la adición de sustancias adicionales, tales como, por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, etc.

Dichas sustancias farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizadas en la composición farmacéutica de la invención son generalmente conocidas por un experto en la técnica y normalmente se utilizan en la producción de composiciones celulares. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Flemington’s Pharmaceutical Sciences " por E.W. Martin. Se puede encontrar información adicional sobre dichos vehículos en cualquier manual de la tecnología farmacéutica (es decir, de farmacia galénica).

La composición farmacéutica de la invención se puede administrar en una forma farmacéutica de administración adecuada. Por lo tanto, la composición farmacéutica de la invención se formulará de acuerdo con la forma de administración elegida. La formulación se adaptará a la forma de administración. En una realización especial, la composición farmacéutica se prepara en una forma de dosificación líquida, sólida o semisólida, por ejemplo, en forma de suspensión, con el fin de ser administrada mediante la implantación, inyección o infusión al sujeto que necesita tratamiento.

Medios de administración que pueden emplearse son, por ejemplo, jeringas, catéteres, trocares, cánulas, etc. En todos los casos, la composición farmacéutica de la invención se puede administrar usando equipos, aparatos y los dispositivos adecuados para la administración de composiciones celulares y conocidas por una persona experta en la técnica. En otra realización, la administración directa de la composición farmacéutica de la invención para el sitio que se pretende beneficiar podría ser ventajosa. En este método, la administración directa de la composición farmacéutica de la invención para el órgano o tejido deseado se puede lograr mediante la administración directa (por ejemplo, por inyección, etc) en la superficie externa del órgano o tejido afectado por la inserción de un dispositivo adecuado, por ejemplo, una cánula adecuada, por infusión (incluyendo mecanismos de flujo inverso) o por otros medios descritos en esta patente o conocidos en el estado del arte.

Con el fin de adaptar el tamaño del acondicionamiento primario al volumen del medicamento a infundir y facilitar así su administración, en una realización particular, la composición farmacéutica de la invención se prepara como jeringa precargada para su administración mediante inyección intralesional, en el esfínter anal. Más preferiblemente la inyección será intralesional y en ambos extremos del defecto esfinteñano. En caso de haber defectos en ambos esfínteres, predominará el defecto del esfínter externo.

La composición farmacéutica de la invención puede almacenarse hasta el momento de su aplicación por los métodos convencionales conocidos por el experto en la materia. Preferiblemente el almacenamiento se realiza como máximo 24 horas en unas condiciones de temperatura de entre 11 y 25°C.

En otra realización, la composición farmacéutica de la invención se puede utilizar en terapia combinada. Estos medicamentos adicionales podrían formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, ser suministrado en forma de una composición separada para su administración simultánea o sucesiva (secuencial en el tiempo) a la administración de la composición farmacéutica de la invención. En otra realización, la composición farmacéutica de la invención es la única que se emplea en el tratamiento. Así, los pacientes no pueden:

1. Haber participado en cualquier otro estudio clínico durante los 3 meses anteriores a la visita pre-selección, así como durante la ejecución del ensayo.

2. Haber sido objeto de tratamiento previo, ni durante la duración de la administración con la composición de la invención, ni durante el seguimiento agentes aumentadores de volumen perianal: dextranómero en ácido hialurónico estabilizado (NASHA Dx), material de silicona (PTQ™), grasa autóloga, teflón, colágeno reticulado con glutaraldehído bovino, perlas de circonio recubiertas de carbono, elastómero de polidimetilsiloxano, hidrogel reticulado con poliacrilamida, colágeno dérmico porcino, microesferas cerámicas sintéticas de hidroxiapatita de calcio o cilindros de poliacrilonitrilo.

USOS MÉDICOS DE LA INVENCIÓN

Otro aspecto de la invención se refiere a la composición de la invención o la composición farmacéutica de la invención, para su uso en medicina.

Otro aspecto de la invención se refiere a la composición de la invención o la composición farmacéutica de la invención, para su uso en el tratamiento de una disfunción o un trastorno de un esfínter.

Otro aspecto de la invención se refiere a la composición de la invención o la composición farmacéutica de la invención, para su uso en el tratamiento de un tejido u órgano enfermo o dañado.

Otro aspecto de la invención se refiere a la composición de la invención o la composición farmacéutica de la invención, para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un órgano enfermo o dañado

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el tejido u órgano dañado es un esfínter. Más preferiblemente el esfínter es un esfínter uretral o gastrointestinal.

En algunas realizaciones, el trastorno es incontinencia urinaria y dicho esfínter es un esfínter uretral; en otras realizaciones, el trastorno es incontinencia intestinal (también denominada "incontinencia fecal") y dicho esfínter es un esfínter anal (en ocasiones llamado rectal). Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a la composición de la invención, para su uso en el tratamiento de la incontinencia fecal.

En algunas realizaciones, el esfínter comprende músculo liso; en algunas realizaciones, el esfínter comprende músculo esquelético. En algunas realizaciones, el esfínter comprende un complejo de músculo liso y esquelético (por ejemplo, el esfínter uretral, un esfínter esofágico, el esfínter pilórico, el esfínter ileocecal o el esfínter anal).

La presente invención se refiere principalmente al tratamiento de sujetos humanos, pero la invención también se puede llevar a cabo en sujetos animales, particularmente sujetos mamíferos tales como perros, gatos, ganado y caballos con fines veterinarios. Los sujetos pueden ser hombres o mujeres. Si bien los sujetos pueden tener cualquier edad adecuada, en algunas realizaciones los sujetos son sujetos neonatales, lactantes, juveniles, adolescentes, adultos o geriátricos. "Tratar" como se usa en este documento se refiere a cualquier tipo de tratamiento que imparte un beneficio a un paciente, particularmente reduciendo o mejorando la gravedad de un síntoma como se describe en este documento, retrasando o retardando la progresión o empeoramiento de un síntoma o trastorno como se describe en este documento, etc.

"Esfínter gastrointestinal", como se usa aquí, incluye el esfínter esofágico superior, el esfínter esofágico inferior, el esfínter pilórico, el esfínter ileocecal, el esfínter de Oddi (o esfínter de Glisson) y el esfínter anal (incluidos los esfínteres anales interno y externo). El esfínter esofágico inferior a veces se denomina esfínter "cardíaco", pero esto se refiere a su ubicación y no al tipo de tejido muscular a partir del cual se forma.

La "incontinencia", como se describe en el presente documento, es, en general, incontinencia de pestillo o incontinencia de urgencia, o incontinencia persistente, que puede surgir de una variedad de causas o afecciones. Ejemplos de causas o afecciones que conducen a la incontinencia (algunas, pero no todas, causan daño al músculo del esfínter) que pueden tratarse mediante los métodos y composiciones descritos en este documento incluyen, pero no se limitan a:

- para la incontinencia urinaria: embarazo y parto, envejecimiento, histerectomía, síndrome de vejiga dolorosa, prostatitis, agrandamiento de la próstata, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cálculos en la vejiga, tratamiento del cáncer (por ejemplo, quimioterapia del cáncer o radioterapia de la región pélvica), esclerosis trastornos (por ejemplo, enfermedad de Parkinson, accidente cerebrovascular, tumor cerebral o lesión de la columna, etc.) debilidad muscular idiopática, etc.

-para la incontinencia fecal o intestinal: daño muscular (p. ej., causado por estreñimiento crónico, durante el parto (particularmente derivado de una episiotomía), cirugía (p. ej., cirugía de hemorroides), prolapso rectal, quimioterapia o radioterapia de la región pélvica, etc.) , daño a los nervios (p. ej., causado por el parto, estreñimiento crónico o esfuerzo constante durante la evacuación intestinal, lesión de la médula espinal, accidente cerebrovascular, diabetes, esclerosis múltiple, cirugía (p. ej., cirugía de hemorroides), prolapso rectal, quimioterapia contra el cáncer o radioterapia de la región pélvica , etc.), pérdida de capacidad de almacenamiento en el recto (p. ej., debido a la formación de cicatrices por cirugía, radiación, tratamiento, enfermedad inflamatoria intestinal, etc.), etc.

"Farmacéuticamente aceptable" como se usa en este documento significa que el compuesto o composición es adecuado para la administración a un sujeto para lograr los tratamientos descritos en este documento, sin efectos secundarios indebidamente perjudiciales a la luz de la gravedad de la enfermedad y la necesidad del tratamiento.

"Al mismo tiempo", como se usa en este documento, significa lo suficientemente cerca en el tiempo para producir un efecto combinado (es decir, simultáneamente puede ser simultáneo, o puede haber dos o más eventos que ocurren dentro de un período corto de tiempo antes o después de uno del otro).

JERINGA PRECARGADA DE LA INVENCIÓN

Otro aspecto de la invención se refiere a una jeringa precargada que comprende la composición de la invención.

En una realización preferida de este aspecto de la invención la jeringa precargada comprende una suspensión celular a una concentración entre 9 y 29 millones de células troncales por mi de medio de cultivo o acondicionamiento.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención el volumen de la suspensión celular es de entre 2-2,5 mi por jeringa, y preferiblemente de 2,5 mi.

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN Ejemplo 1. Procedimiento de fabricación del producto y administración a los pacientes.

Selección del donante. Obtención y acondicionamiento del tejido adiposo.

Selección del donante aloqénico

La donación de los tejidos adiposos de donantes se realizó conforme a lo establecido en el Real Decreto-ley 9/2014, de 4 de julio por el que se establecen las normas de calidad y seguridad para la donación, la obtención, la evaluación, el procesamiento, la preservación, el almacenamiento y la distribución de células y tejidos humanos y se aprueban las normas de coordinación y funcionamiento para su uso en humanos para un donante de células y tejidos.

La evaluación y selección de los donantes fue realizada por la Coordinación de Trasplantes del Hospital Regional Universitario (HRU) de Málaga mediante una evaluación de Historia Clínica y entrevista personal, la obtención del consentimiento Informado del sujeto para la donación del tejido adiposo al Biobanco del Servicio de Salud Público Andaluz, la comprobación del índice de masa corporal del donante (preferentemente de 18 a 30 kg/m²) y la realización de ensayos serológicos y técnicas PCR indicadas para evaluar la seguridad del donante, según la situación epidemiológica en el momento de la donación.

Tras la aprobación del donante por parte de la Coordinación de Trasplantes del HRU de Málaga, la obtención de tejido adiposo del donante se realizó por el Servicio de Cirugía Plástica del HRU de Málaga, centro acreditado para la obtención de tejido adiposo humano.

Obtención y acondicionamiento del tejido adiposo de cada donante.

Se obtuvo un mínimo de 100 gr tejido adiposo por exéresis quirúrgica, preferentemente de grasa abdominal y, de no ser posible, de flancos o zona glútea, con anestesia local tipo mepivacaína al 3%, sin vasoconstrictor.

Con antelación al momento de la extracción, se envió a quirófano desde la Unidad de Producción Celular (UPC) un kit para el acondicionamiento e identificación del tejido adiposo: un acondicionamiento primario (contenedor de transporte estéril de polietileno de boca ancha con etiqueta identificativa del donante) y un sistema de acondicionamiento secundario (bolsa estéril con cierre de lengüeta) para proteger de eventuales derrames. Igualmente, se envió un frasco de solución descontaminante de tejidos medio BASE 128 (ALCHIMIA SRL). Una vez obtenido el material de partida, se colocó en el interior del contenedor y se añadió la solución descontaminante que debía estar en contacto con el tejido durante un mínimo de 1 hora. Finalmente se introdujo el contenedor identificado en la bolsa estéril y se cerró usando la lengüeta incorporada.

El tejido fue así transportado en un contenedor de transporte validado y precintado, conteniendo además unos acumuladores de frío, el data logger activado para monitorizar la temperatura, y la documentación asociada.

El Departamento de Calidad de la UPC recepcionó el tejido adiposo verificando la integridad del contenedor de transporte y acondicionamiento primario, así como la identificación del tejido y documentación recibida. Se cumplimentó el formulario de registro de recepción de material de partida en el que se vincula el código del donante con los productos intermedios a fabricar.

Se comprobó que la hora de la recepción del material de partida no excediera las 24 horas desde la extracción y se obtuvo el registro de temperaturas asociadas al transporte del data-logger para verificar el mantenimiento de la temperatura en los márgenes establecidos.

La muestra de sangre periférica para la realización del ensayo de Fingerprinting y la obtenida para detección de virus adventicios por técnicas de amplificación de ácidos nucléicos (PCR) se trató según procedimiento interno para ser derivada a los centros que realizaban los ensayos subcontratados.

Al tejido adiposo (material de partida), una vez aprobado, se le asignó un código interno de lote a fin de garantizar la trazabilidad de los productos intermedios. Se emitió la orden de producción del lote y la guía de procesamiento de Material de Partida del mencionado lote y se inició el procesamiento.

Procesamiento del material de partida. Aislamiento, expansión de Células Mesenquimales Troncales de Tejido Adiposo (CMTAd) y criopreservación del Stock Celular Maestro Esta fase del proceso de fabricación se inició con la pesada del material de partida y finalizó tras la expansión de CMTAd mediante 2 ciclos completos de expansión celular. El proceso se realizó en zonas clasificadas de grado A según NCF.

El procesamiento del material de partida, con el fin de obtener la fracción vásculo- estromal (FVE) comenzó con la retirada de la solución descontaminante, el posterior lavado con fosfato salino tamponado con cloruro cálcico y cloruro de magnesio (PBS_Ca. Mg) (Sigma-Aldrich), y pesada de la pieza quirúrgica. En este momento se congeló una Muestra de Referencia del material de partida con la finalidad de garantizar la realización de los controles analíticos que se estimen oportunos tras la donación del tejido.

El tejido adiposo se disgregó de forma mecánica utilizando tijeras y bisturís estériles. El tejido resultante se transfirió a tubos estériles de 50 mi (aproximadamente 10 gr de tejido por tubo), adicionando PBS_Ca-Mg hasta un volumen de 50 mi, para su centrifugación (450xg, 10 minutos, 20°C). Terminada ésta, la capa superior de tejido y grasa de cada tubo fue transferida a nuevos tubos de 50 mi con fondo cónico. Tras la pesada de cada tubo, se añadió medio de digestión compuesto por colagenasa NB 6, grado GMP (Nordmark), reconstituida con tampón PBS_Ca-Mg (1 :1 p/v), quedando la concentración a 0,3 Ul de colagenasa por gr de tejido.

La digestión enzimática con colagenasa se realizó mediante un sistema de agitación rotatoria a 35-38,5 °C, durante 30 a 90 minutos, tras la cual se neutralizó la actividad colagenasa por dilución con un volumen igual de medio de expansión [MEM-Alpha con glutamax (Ufe Technologies), suplementado con 5% Usado plaquetaño humano inactivado viralmente MultiPL’i (Macopharma), 0.6 UI/mL de Hepahna sódica (Rovi) y 50 pg/mL Gentamicina (Normorí), exclusivamente en primera siembra]. Posteriormente, se procedió a la centrifugación (600xg, 10 minutos, 20°C) para obtener las diferentes fases resultantes (Fig. 1).

Las fases superior aceitosa y acuosa fueron eliminadas mientras que el botón celular, junto con la interfase semisólida, se diluyeron y filtraron a través de una malla estéril de 100 pm (CellStrainer, Becton Dickinson) con ayuda de Tampón fosfato salino sin Ca²⁺ ni Mg²⁺ (PBS) (Sigma-Aldrích). El producto obtenido se centrifugó (600xg, 10 minutos, 20°C) para unir el contenido de los diferentes tubos. Tras una última centrifugación (600g, 10 minutos, 20°C), se retiró el sobrenadante por decantación y se resuspendió el botón celular en medio de expansión. Al producto así obtenido lo denominamos PRODUCTO INTERMEDIO 1 (FRACCIÓN VÁSCULO ESTROMAL - FVE-) compuesto por CMTAd, células sanguíneas, fibroblastos y otros productos procedentes de la digestión tisular. Para conocer el rendimiento del proceso hasta el momento, se procedió al recuento de células nucleadas y viabilidad. A partir de este producto intermedio se obtuvieron muestras para los controles de esterilidad y cariotipo en la FVE.

Se calculó la superficie de cultivo necesaria para la adhesión y expansión celular a partir del número total de células nucleadas viables, para una concentración celular de la primera siembra de aproximadamente 30.000 a 50.000 células nucleadas viables por cm². Se añadió el volumen de medio de expansión necesario para dejar la suspensión celular a esta concentración y se sembraron en los frascos de cultivos como pase P0.

Tras 24-96 horas de la siembra inicial se realizó el primer cambio de medio de cultivo.

A partir de este momento, se comprobó la evolución del cultivo cada 48-72 horas. Cuando la confluencia celular del cultivo fue igual o superior al 80%, se procedió al subcultivo. Se despegó la monocapa celular de la superficie de cultivo utilizando una tripsina sintética TrypLESelect™ (Life Technologies)', tras la neutralización del efecto del TrypleSelect™ con PBS, las células fueron recuperadas en tubos falcon y centrifugadas (600g, 10 minutos, 20°C). Con el fin de calcular la superficie necesaria para volver a sembrar las células se realizó recuento celular y viabilidad. La concentración de siembra en esta etapa del cultivo fue de 1.500 - 2.000 CMTAd/cm². Una vez sembrados los frascos de cultivo, se introdujeron en los incubadores (37±2°C y en atmósfera 5±1% CO₂) para continuar el proceso de expansión celular.

Cada 48-72 horas se comprobó la evolución del cultivo, comprobando la turbidez y color del medio de cultivo, morfología de las células adheridas y el grado de confluencia. Una vez alcanzada una confluencia celular >80%, se procedió a la recuperación celular para crear el PRODUCTO INTERMEDIO 2 (STOCK CELULAR MAESTRO -SCM-) consistente en una serie de viales de CMTAd criopreservadas. Como se ha mencionado previamente, se procedió al subcultivo, despegando la monocapa celular de igual forma que en el paso anterior. Se procedió al recuento celular y determinación de viabilidad, y se obtuvieron las muestras destinadas a los ensayos de calidad que no precisaban ser criopreservadas en nitrógeno tales como inmunofenotipo, CGH array y control de virus adventicios. Las CMTAd obtenidas se criopreservaron a una concentración mínima de 2x10⁶ CMTAd/ml en medio de Congelación (Albúmina sérica humana al 5% (Octapharma) con un 10% de DMSO (Sigma Aldrich), creando el STOCK CELULAR MAESTRO. El SCM estaba compuesto por viales destinados al ensayo clínico y que fueron posteriormente expandidos para crear los STOCKS CELULARES DE TRABAJO, muestras de referencia, controles de calidad criopreservados (CGH array, Fingerprinting, mycoplasma y esterilidad), así como muestras destinadas a estudios de potencia del producto intermedio. El detalle de la composición del SCM y del número de células en cada vial se muestra en la siguiente Tabla:

Tabla 1 : Composición del Stock Celular Maestro y distribución de los viales criopreservados.

Los viales destinados a ensayo clínico del SCM se mantuvieron en estado de cuarentena, en el interior del contenedor de nitrógeno, hasta su aprobación en base a sus especificaciones, cuando finalizaron todos los ensayos de control de calidad.

Descongelación y expansión de SCM para la obtención y criopreservación de Stocks Celulares de Trabajo (SCT, producto intermedio 3).

Una vez aprobado el SCM, se descongelaron uno o vahos viales de los destinados a ensayo clínico, para su expansión. Una vez descongelados se procedió al recuento de las células recuperadas y determinación de su viabilidad.

La densidad de siembra de las células en este punto fue de 2.000 - 4.000 CMTAd/cm², incubando en las condiciones indicadas anteriormente hasta que se alcanzara una confluencia igual o superior al 80% (aproximadamente 7±2 días). Cada 48-72 horas se renovó el medio de expansión celular. Una vez alcanzada la confluencia indicada, se procedió a la recuperación celular para crear el PRODUCTO INTERMEDIO 3 (STOCK CELULAR DE TRABAJO -SCT-). Se realizó recuento celular y viabilidad. Antes de proceder a la criopreservación del SCT se obtuvo la muestra para el inmunofenotipo. La recuperación celular y su posterior criopreservación se realizó de igual forma que la creación del SCM. Las células se criopreservaron a una concentración mínima de 2x10⁶CMTAd/ml en medio de congelación preparado al efecto. Al igual que el SCM, el SCT estaba compuesto por viales destinados al ensayo clínico, muestras de referencia, controles de calidad criopreservados (CGH array, Fingerprinting, esterilidad y mycoplasma), así como muestras destinadas a estudios de potencia del producto intermedio. El detalle de la composición del SCT se muestra en la siguiente Tabla.

Tabla 2: Composición del Stock Celular de Trabajo y distribución de los viales criopreservados.

*Los viales destinados a uso en ensayo clínico se criopreservaron con dos cantidades diferentes de células. La mitad de ellos se criopreservaron a razón de 10 x 10⁶CMTAd y fueron utilizados para fabricar las SA correspondientes a las dosis de 60 millones de CMTAd; la otra mitad se criopreservó con 15 x 10⁶CMTAd con el fin de obtener las SA de los pacientes aleatorizados a la dosis de 120 millones de CMTAd.

El SCT criopreservado se mantuvo en estado de cuarentena hasta la superación de los ensayos de control de calidad.

Obtención de la sustancia activa.

Esta etapa comenzó con la notificación del Promotor del ensayo al Fabricante de la necesidad de fabricar un lote de producto terminado y con la identificación de la dosis a fabricar (60x10⁶ ó 120x10⁶ CMTAd), en caso de que se trate de un paciente aleatorizado a brazo celular. Una vez aprobado el SCT, se procedió a la descongelación de uno o dos viales destinados a ensayo clínico para la obtención de la Sustancia Activa. Se procedió al recuento y determinación de viabilidad de las células recuperadas para el cálculo de la superficie necesaria de siembra. Las células se sembraron en frascos de cultivo con medio de expansión a una densidad entre 2.000 y 4.000 CMTAd/cm²y se incubaron en las condiciones ya mencionadas durante 7±2 días, chequeando turbidez, color del medio de cultivo, morfología celular y grado de confluencia celular cada 48-72 horas. En el último cambio de medio realizado antes de la recuperación para acondicionamiento y envasado (aproximadamente 48-72 horas antes del envasado), se realizó un control de contaminación microbiológica denominado “Bioburden”, cuyos resultados se tuvieron en consideración para la liberación del producto terminado. Una vez que se alcanzó la confluencia celular necesaria (>80%) en las factorías de cultivo, se procedió a la recuperación celular y a la realización de recuento celular y viabilidad previa al acondicionamiento y envasado. Las CMTAd recuperadas componían la SUSTANCIA ACTIVA (SA). En este momento se realizó el control de inmunofenotipo.

Descripción del proceso de fabricación del lote de Producto Terminado

Una vez obtenida la Sustancia Activa y realizado el recuento de CMTAd viables disponibles, se calculó el volumen de Solución A necesario para ajustar la concentración celular al doble de concentración que la deseada en el producto terminado, con un exceso de volumen de suspensión para la realización de los ensayos de control de calidad y muestra de referencia. La concentración celular en solución A dependía de la dosis del medicamento a fabricar según el brazo de aleatorización del paciente al que iba destinado:

• 24 x 10⁶CMTAd/ml de solución A para la dosis de 60 millones.

• 48 x 10⁶CMTAd/ml de solución A para la dosis de 120 millones.

Las CMTAd sobrantes preacondicionadas en Solución A se destinaron a la realización del control de Mycoplasmas y a la creación de la Muestra de Referencia que fue criopreservada.

Para el acondicionamiento final, la mezcla de CMTAd en Solución A se combinó a partes ¡guales con hialuronato sódico AdantOne® 10 mg/mL (Meiji Pharma, S.A.) en un vial de vidrio estéril. Tras la adecuada homogeneización del producto, se realizó un control de partículas en suspensión. La sustancia activa acondicionada se envasó en 2 jeringas con 2,5 ml de producto cada una. Para el envasado por aspiración se utilizaron agujas de 14G. Finalmente se cerraron las jeringas con un dispositivo de cierre luer-lock. El sobrante se destinó a los ensayos de control de calidad (esterilidad y endotoxinas).

El producto terminado se formuló en 2 jeringas precargadas por lote de medicamento, adecuadamente etiquetadas. Cada jeringa contenía un volumen total de 2,5 mi, por lo que el volumen total del medicamento fue de 5 mi. El envasado de las jeringas se realizó mediante aspiración a través de agujas de 14G. Las jeringas se introdujeron en bolsas estériles con lengüeta para su acondicionamiento secundario, con sus correspondientes etiquetas identificativas.

Envíos de medicamentos de Terapia Celular

El medicamento se envía junto con el Manual de Uso del Medicamento y el Registro de recepción del medicamento al Hospital de destino. El medicamento debe administrarse dentro de las 24 horas siguientes al envasado.

El envío del producto terminado se realiza mediante empresa subcontratada con sistema de monitorización en continuo de la temperatura entre 11 y 25°C.

Una vez recepcionado el medicamento en el centro encargado de la infusión se cumplimenta el registro de recepción del medicamento con información sobre la comprobación de las condiciones de envío (temperatura de transporte, identificación de muestra) y hora de recepción. Una vez realizada la infusión del medicamento se cumplimenta el informe de infusión con información acerca de la fecha y hora de infusión, lote de medicamento, código de paciente, responsable de la infusión, número de unidades infundidas, infusión completa o parcial del medicamento y reacciones adversas observadas durante la infusión. Ambos documentos son devueltos al fabricante y añadidos al expediente de lote.

Procedimiento de administración del Medicamento de Terapia Celular

Preparación preoperatoria:

El paciente es preparado con un enema de limpieza la noche anterior y 30 minutos antes de la cirugía recibe profilaxis con cefoxitina IV. En caso de alergia a betalactámicos, se emplea clindamicina 600mg IV. Técnica de implantación:

1 Se procede a anestesiar al paciente por parte del Servicio de Anestesia. Para tal fin se utiliza anestesia regional. Sólo en aquellos casos en los que no sea posible, el anestesista recurre a la anestesia general.

2.- Con el paciente en litotomía, se cepilla el periné y se aplica povidona yodada o clorhexidina. Se colocan los campos.

3.- Identificación del defecto esfinteriano responsable de la incontinencia mediante ecografía anal.

4.- Resuspensión de las células mediante agitación manual suave de las jeringuillas. Una vez resuspendidas las células se utilizan inmediatamente.

5.- Inyección de la suspensión celular con aguja fina y larga (de al menos 18G) en la zona del defecto bajo control ecográfico, colocando 5 mL de la solución. La inyección es intralesional y en ambos extremos del defecto esfinteriano. En caso de haber defectos en ambos esfínteres, predomina el defecto del esfínter externo.

6.- Los restos celulares y los viales utilizados se eliminan siguiendo los procedimientos habituales utilizados para la gestión de residuos quirúrgicos hospitalarios o se cederán al laboratorio de Terapia Celular para investigación en modelos de cicatrización o bioseguridad celular (si lo permite la paciente).

Postoperatorio:

1. El paciente, siempre que sea posible, es dado de alta el mismo día del implante.

2. Se prescribirá analgesia oral, así como profilaxis antibiótica con metronidazol 250mg/8h y ciprofloxacino 500mg/12h durante 7 días. Se le dará la cita de la primera consulta, así como información para acceder al médico encargado en caso de necesitarlo.

Ejemplo 2. Comparación de las propiedades del producto con diferentes agentes aumentadores del volumen, y ensayo de condiciones de almacenamiento. Durante la fase inicial de validación de la estabilidad del producto terminado, se compararon los efectos sobre la viabilidad celular de dos agentes aumentadores de volumen, colágeno y ácido hialurónico de bajo-medio peso molecular, añadidos en el excipiente de una suspensión celular. La suspensión era de células mesenquimales troncales derivadas de tejido adiposo (CMTAd) a una concentración de 10 millones de CMTAd/ml, en cada uno de los siguientes excipientes:

• Ácido Hialuronico 10mg/ml (Adant One) diluido (60:40) en Ringer Lactato suplementado con 2,5% glucosa y 1% albúmina sérica humana o

• Colágeno Hidrolizado inyectable (Maxilaria, España) diluido (60:40) en Ringer Lactato suplementado con 2,5% glucosa y 1% albúmina sérica humana

Las diferentes suspensiones se mantuvieron durante 24h a dos condiciones de temperatura - 4-8°C, en frigorífico

- 25±1°C, en estufa controlada.

El criterio de aceptación a las 24 horas fue que la viabilidad celular >75%.

Tabla 3: Viabilidad celular.

RGL 4°C 94,68 83,27

La conclusión es que el ácido hialuronico es un excipiente más idóneo que el Colágeno para asegurar el mantenimiento de la viabilidad de la suspensión de CMTAd dentro de los límites de aceptación establecidos por nuestra Unidad de Producción Celular. El colágeno, tanto a diluciones 60:40, como a diluciones 50:50 en experimentos posteriores provocaba una gran mortalidad celular, con viabilidades celulares en torno al 40%.

Modificaciones posteriores sustituyendo el Ringer Lactato por medio de cultivo DMEM suplementado con 4 mg/ml albúmina sérica humana y 4mM L-glutamina diluidos 1/2 con el Ácido Hialurónico 10 mg/ml, consiguieron viabilidades superiores al 85% a las 24h de envasado a 11-13°C de las dosis finales (dos dosis de 120 millones y una de 60 millones, a 24 millones y 12 millones CMTAd/mL, respectivamente) y una mayor manejabilidad de la muestra a la hora de inyectarla. Condiciones de almacenamiento.

Según el estudio de estabilidad realizado, suspensiones de CMTAd a 10 millones/ml resuspendidas a partes ¡guales en DMEM suplementado con 4 mg/ml Albúmina sérica humana y 4mM L-Glutamina y diluido a partes ¡guales con Ácido Hialurónico 10mg/ml, proporcionan las siguientes viabilidades celulares a lo largo del tiempo: Tabla 4: Viabilidades celulares.

La temperatura de transporte y/o almacenamiento de 2-8°C es la menos adecuada para mantener una óptima viabilidad celular. El Producto Terminado es estable durante 24 horas cuando se mantiene en unas condiciones de temperatura de entre 11 y 25°C.

Un estudio posterior, a las concentraciones establecidas de 60 y 120 millones de CMTAd en 2 jeringas proporcionó los siguientes resultados:

Tabla 5: Viabilidades obtenidas en el estudio de estabilidad del producto terminado, según las diferentes condiciones de temperatura. Criterio de aceptación mínimo (>80%).

A las 24 horas tras el envasado, los 3 lotes a temperatura de 11-13°C y los 3 lotes a temperatura 20-25°C mantuvieron la viabilidad mínima del 80%. La viabilidad media tras 24 horas a 11-13°C fue del 84,8 % y a 20-25°C del 85,1%.

Los resultados obtenidos confirman los resultados previos, permitiendo asegurar que el producto se mantiene en óptimas condiciones de viabilidad durante 24 horas cuando se conserva en el rango de temperatura de entre 11 y 25°C.

Se realizó estudio inmunofenotípico en los 3 lotes en cada uno de los puntos de control establecidos. Los resultados de pureza (expresión de marcadores CD90, CD44, CD105 y CD73) e impurezas (expresión de marcadores CD11b, CD19, CD45, CD34 y HLA-DR) en cada uno de los replicados realizados se muestran en las siguientes Tablas:

Tabla 6: Expresión de marcadores (%) durante el estudio de estabilidad a 11-13°C.

Tabla 7: Expresión de marcadores (%) durante el estudio de estabilidad a 20-25°C.

Tabla 8: Expresión de marcadores (%) durante el estudio de estabilidad a 20-25°C.

Según los datos obtenidos, podemos observar que a las 24 horas tras el envasado del producto terminado todos los marcadores de pureza se expresan en más de un 95% y los marcadores de impurezas no superan el 2%.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Una composición que comprende: a) al menos una célula troncal mesenquimal. b) Un medio de cultivo con ácido hialurónico,

2.- La composición según la reivindicación 1 , donde el medio de cultivo es DMEM suplementado con 4 - 20 mg/ml de albúmina sérica humana, 2 - 5 mM de L- glutamina, y diluido con 5 - 20 mg/ml de ácido hialurónico.

3.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el medio de cultivo está diluido 1 :1 (v:v) con el ácido hialurónico.

4.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el medio de cultivo es DMEM suplementado con 4 mg/ml de albúmina sérica humana y 4 mM de L- glutamina, y diluido a partes ¡guales con 10mg/ml de ácido hialurónico.

5.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la célula troncal mesenquimal de a) se ha expandido en un medio con Usado Plaquetario Humano inactivado viralmente (LPh-iv).

6.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la célula troncal mesenquimal es una célula troncal mesenquimal obtenida de tejido adiposo.

7.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la célula troncal mesenquimal es alogénica.

8.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende una población celular de células troncales mesenquimales.

9.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la población tiene entre 40 y 150 millones de células troncales mesenquimales.

10.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde la composición es una composición farmacéutica.

11.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para su uso en medicina.

12.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-11 , para su uso en el tratamiento de un tejido u órgano enfermo o dañado.

13.- La composición para su uso según la reivindicación 12, donde el tejido u órgano dañado es un esfínter.

14.- La composición para su uso según la reivindicación 13, donde el esfínter es un esfínter uretral o gastrointestinal.

15.- La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 13-14, donde el esfínter es el esfínter anal.

16.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o la composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 11-15, para el tratamiento de la incontinencia fecal.

17.- Una jeringa precargada que comprende una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-16.

18.- Una jeringa precargada según la reivindicación anterior, que comprende una suspensión celular a una concentración entre 9 y 29 millones de células mesenquimales troncales.

19.- La jeringa precargada según cualquiera de las reivindicaciones 17-18, donde el volumen de la suspensión celular es de entre 2-2,5 mi por jeringa,

20.- La jeringa precargada según cualquiera de las reivindicaciones 17-18, donde el volumen de la suspensión celular es de 2,5 mi.