WO2020183047A1

WO2020183047A1 - Limbo esclerocorneal descelularizado

Info

Publication number: WO2020183047A1
Application number: PCT/ES2020/070168
Authority: WO
Inventors: Manuel CARO MAGDALENO; Miguel Alaminos Mingorance
Original assignee: Universidad De Granada; Servicio Andaluz De Salud
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2020-03-09
Publication date: 2020-09-17

Abstract

La invención describe un limbo biomimético obtenido a partir de limbo esclerocorneal descelularizado, tejido artificial y composición que comprenden dicho limbo, así como su uso en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la insuficiencia limbar o como sistema de liberación de factores celulares y/o fármacos.

Description

LIMBO ESCLEROCORNEAL DESCELULA RIZADO

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuentra dentro del campo de los tratamientos médicos, la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos, y más específicamente dentro del campo del tratamiento de pacientes usando células madre y biomateriales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En las insuficiencias limbares (IL) totales unilaterales, en las que se ha demostrado que el ojo adelfo está sano, la opción óptima es el autoinjerto limbar, siempre que el paciente esté dispuesto a permitir una cirugía para extraer una parte del limbo esclerocorneal de su único ojo sano, cosa que no es frecuente. Por otro lado, en el caso de las IL totales bilaterales si es posible el alotrasplante de donante vivo histocompatible (DVH), normalmente familiar del paciente, que será de elección, buscando el mayor ajuste posible de histocompatibilidad. Igualmente es en muchos casos difícil encontrar familiares histocompatibles que permitan dicha cirugía, nunca exenta de riesgos. Como última opción, por mayor tasa de fracaso, el alotrasplante de donante cadáver (DC) ( Miri et al., 2010. Ophthalmology 117(6): 1207-13). Una de las ventajas del autoinjerto y del donante histocompatible es la frescura, ya que el tiempo desde que se extraen los explantes limbares hasta que se trasplantan es mínimo. En el de donante cadáver, pasarán mínimo 24-48h -con suerte- antes de trasplantarse. Aunque hay que destacar que la principal ventaja de éstos es la mejor histocompatibilidad entre donante y receptor, siendo perfecta en el caso del autoinjerto y peor en el DVH, tanto peor dependiendo del nivel de igualdad de los complejos de histocompatibilidad. En el caso de donante cadáver, en cuanto a la histocompatibilidad será la opción peor de las tres mencionadas. Por otro lado se evitan en el caso del autoinjerto, el problema de posibles contagios infecciosos.

Como hemos mencionado, si la insuficiencia límbica es bilateral, debido a la imposibilidad de llevar a cabo el trasplante de células autólogas, se recurre al trasplante alogénico de donante cadáver (Tan et al., 1996. Ophthalmology 1996; 103(1 ):29— 36).

Una de las ventajas es la mayor disponibilidad que tenemos de este, ya que podemos aprovechar el rodete limbar de las queratoplastias y dispondremos del limbo entero. También pueden emplearse córneas de donantes desechadas por estar operados de cirugía refractiva, tener leucomas, o cualquier otro defecto, ya que únicamente es necesario el rodete y lo vamos a descelularizar. Por el contrario, la principal desventaja es la falta de inmunocompatibilidad y de frescura, mínimo 24-48 h desde la extracción, sin contar la inadecuada manipulación del limbo en dicha extracción. En las series más largas, los alotrasplantes cadavéricos no tienen una supervivencia mayor de 5 años ( Miri et al., 2010. Ophthalmology 117(6): 1207-13).

El riesgo de rechazo y la necesidad de seguir un tratamiento inmunosupresor postoperatorio -con sus efectos secundarios- si la compatibilidad HLA no es completa es otra de sus grandes desventajas (Young et al., 1999. Br J Ophthalmol Dec;83(12):1409). Maruyama- Hosoi y cois (Cornea, 25 (2006), pp. 377-382) encontraron en una serie de 121 alotrasplantes de limbo reacciones de rechazo en un 13% de los casos a pesar del tratamiento inmunosupresor sistémico, siendo el rechazo generalizado en los que recibieron solo inmusupresión tópica salvo en un caso.

La técnica quirúrgica de extracción del explante limbar de donante cadavérico dependerá de si disponemos del globo entero o solo del casquete esclerocorneal anterior. Este último se usa más frecuentemente en queratoplastias penetrantes y lamelares, y por tanto, disponemos de él más fácilmente. Usando el globo ocular entero y fijándolo con gasas se pueden obtener lámelas desde córnea hacia limbo con cuchíllete de Graefe. Holland, modificó esta técnica a partir de la keratoepithelioplasty de Thoft, denominando a esta técnica, lenticule (Holland EJ. Epithelial transplantation for the management of severe ocular surface disease. In: Transactions of the American Ophthalmological Society 1996. p. 677- 743). Dua y col. (2010; Clin Experiment Ophthalmol [Internet] 2010 Mar [cited 2014 Dec 2];38(2):104-17) describe otra técnica usando globo ocular entero, manteniendo la presión ocular inyectando aire con una jeringa a través el nervio óptico, para poder realizar una trepanación parcial a 200-250 mieras y luego con cuchíllete tipo crescent, disecar hacia limbo y cortar radialmente con tijeras tipo Westcott ( Dua H et al., 2010. Clin Experiment Ophthalmol 38(2): 104-17). Por otro lado, cuando se dispone solo del casquete esclerocorneal, tras trepanar el botón corneal para la queratoplastia, el rodete limbar se puede disecar de diferentes formas. Una primera forma, sería realizando una disección lamelar a partir de un corte a una profundidad marcada, con cuchíllete precalibrado, ya sea de diamante o de acero con tope, para obtener una lamela de 150-250 mieras. Tras esta disección, tiraremos con ayuda de unas pinzas de un extremo y de otro para realizar una disección mecánica por tracción, como haríamos al cortar un paño ( Dua H et al., 2010. Clin Experiment Ophthalmol 38(2): 104-17). Por último, también podemos disecar desde córnea hacia esclera, con ayuda de un asistente que nos fije el tejido, disecando una lamela con cuchíllete a una profundidad tal como para dejar el tercio anterior del espesor corneal, dividiendo cada anillo queratolimbar en dos mitades o“mediaslunas” (crescent). Holland denominó a esta última técnica de extracción corneoscleral crescent (Holland EJ. Epithelial transplantation for the management of severe ocular surface disease. In: Transactions of the American Ophthalmological Society 1996. p. 677-743)(Holland et al., 2003. Ophthalmology 110(1): 125— 30). Luego se continúa realizando la disección con cuchíllete crescent hasta pasar limbo llegando a un milímetro de esclera, dejando un pequeño colgajo de conjuntiva para conservar la estructura de las empalizadas de Vogt. Posteriormente se corta radialmente con tijeras Westcott para obtener fragmentos de la forma deseada, usando dos ojos de donante por cada uno de receptor ya que el injerto será colocado en el borde posterior del limbo del receptor aumentando así la circunferencia a cubrir, de modo que usaremos tres mitades de dos ojos o un anillo completo más una cuña del segundo ojo.

Sería necesario, por tanto, encontrar un sustituto que presente una anatomía, composición y estructura similar, que no de problemas de inmunogenicidad ni provoque rechazo a pesar del tratamiento inmunosupresor, y a ser posible, que no requiera tratamiento inmunosupresor.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Un primer aspecto de la invención se refiere a un limbo esclerocorneal humano descelularizado, preferiblemente obtenido por un método que comprende lavar el limbo con al menos un agente descelularizante.

Los agentes descelularizantes pueden ser físicos, químicos o enzimáticos.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el agente descelulairzante es un agente tensioactivo no iónico.

En otra realización preferida, el agente descelularizante se selecciona de entre sonicación, rayos UV, NaCI, tritón X-100, Cloruro de benzalconio (BAK), Igepal, o SDS. Más preferiblemente es SDS aproximadamene al 0,1%.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a un limbo esclerocorneal recelularizado que comprende el limbo esclerocorneal humano descelularizado según el primer aspecto de la invención. Preferiblemente las células que se emplean para recelularizar se seleccionan de la lista que consiste en: estromales de la córnea (queratocitos), células de tejido conectivo (fibroblastos), células madre mesenquimales, o cualquiera de sus combinaciones.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a un tejido artificial que comprende el limbo esclerocorneal humano descelularizado según el primer aspecto de la invención, o el limbo esclerocorneal recelularizado según el segundo aspecto de la invención. Un cuarto aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende el limbo esclerocorneal humano descelularizado según el primer aspecto de la invención, el limbo esclerocorneal recelularizado según el segundo aspecto de la invención, o el tejido artificial según el tercer aspecto de la invención.

Un quinto aspecto de la invención se refiere al limbo esclerocorneal humano descelularizado según el primer aspecto de la invención, el limbo esclerocorneal recelularizado según el segundo aspecto de la invención, el tejido artificial según el tercer aspecto de la invención, o la composición según el cuarto aspecto de la invención, para su uso como medicamento.

Un sexto aspecto de la invención se refiere al limbo esclerocorneal humano descelularizado según el primer aspecto de la invención, el limbo esclerocorneal recelularizado según el segundo aspecto de la invención, el tejido artificial según el tercer aspecto de la invención, o la composición según el cuarto aspecto de la invención, para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un órgano enfermo o dañado.

Un séptimo aspecto de la invención se refiere al limbo esclerocorneal humano descelularizado según el primer aspecto de la invención, el limbo esclerocorneal recelularizado según el segundo aspecto de la invención, el tejido artificial según el tercer aspecto de la invención, o la composición según el cuarto aspecto de la invención, para el tratamiento de la insuficiencia limbar unilateral o bilateral, parcial o total.

Un octavo aspecto de la invención se refiere al limbo esclerocorneal humano descelularizado según el primer aspecto de la invención, el limbo esclerocorneal recelularizado según el segundo aspecto de la invención, el tejido artificial según el tercer aspecto de la invención, o la composición según el cuarto aspecto de la invención, para el tratamiento de cualquier epiteliopatía, de una enfermedad ocular corneal que implique o no neovascularización corneal.

Un noveno aspecto de la invención se refiere al uso limbo esclerocorneal humano descelularizado según el primer aspecto de la invención, el limbo esclerocorneal recelularizado según el segundo aspecto de la invención, el tejido artificial según el tercer aspecto de la invención, o la composición según el cuarto aspecto de la invención, como sistema de liberación de factores celulares y/o fármacos.

Un décimo aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para obtener el limbo esclerocorneal humano descelularizado según el primer aspecto de la invención, el limbo esclerocorneal recelularizado según el segundo aspecto de la invención, el tejido artificial según el tercer aspecto de la invención, o la composición según el cuarto aspecto de la invención

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. (A) Limbo original. (B) Limbo descelularizado. En las figuras se puede apreciar el fragmento de limbo tallado en estado“original” previo a la descelularización (A) y posteriormente descelularizado (B). En este último, se aprecia que no hay núcleos celulares teñidos con DAPI (colorante fluorescente que se une específicamente al ADN)

Figura 2. Limbo recelularizado con WH. Se observan fragmentos descelularizados (LimboScaffoId©) y vueltos a recelularizar con células mesenquimales de la gelatina de Wharton de cordón umbilical (WH). Se observan como las células se muestran marcadas con DAPI mayoritariamente en la zona superficial, aunque algunas células aparecen en el interior del estroma del limbo.

Figura 3. Limbo recelularizado con FOM. Se observan fragmentos descelularizados (LimboScaffoId©) y vueltos a recelularizar con fibroblastos de mucosa oral humana (FOM). Se observan como las células se muestran marcadas con DAPI mayoritariamente en la zona superficial, aunque algunas células aparecen en el interior del estroma del limbo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han desarrollado un limbo artificial, que comprende un scaffold y células mesenquimales, donde el scaffold o soporte que presenta una anatomía, composición y estructura idéntica al original, puesto que se trata del libo descelularizado, pero no presenta inmunogenicidad al no presentar células del donante. Por primera vez se describe un método para obtener un limbo humano totalmente descelularizado, lo que supone un gran avance para evitar posibles rechazos. El limbo descelularizado sirve de nicho natural para células madre y otros tipos celulares, y se puede obtener tanto de cadáveres como de donantes sometidos a queratoplastias. Además, permite su uso como sistema de liberación ( delivery ) de factores celulares o fármacos.

LIMBO DESCELULARIZADO DE LA INVENCIÓN

Al ser el limbo esclerocorneal un tejido sobrante de las queratoplastias tanto penetrantes como lamelares y disponer de limbos completos, se puede disponer de gran material para usar como scaffold sin necesidad de generarlo mediante ingeniería tisular. Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un limbo esclerocorneal humano descelularizado, preferiblemente obtenido por un método que comprende lavar el limbo con al menos un agente descelularizante.

Los agentes descelularizantes son conocidos en el estado de la técnica, y pueden ser, entre otros, agentes físicos, químicos o enzimáticos.

El dodecilsulfato sódico (SDS o NaDS), es un compuesto tensioactivo aniónico con propiedades anfifílicas requeridas para todo detergente.

Aún más preferiblemente, el método de descelularización es un método in vitro que comprende: a) cortar el casquete esclerocorneal en 4 fragmentos semicirculares de similares longitudes, b) recortar la córnea clara hasta dejar sólo 1 mm de córnea y 2 mm de esclera, c) fijar cada fragmento sobre un soporte, preferiblemente una almohadilla, d) delaminar y diseccionar el 1/3 anterior del estroma corneo-escleral, e) lavar el limbo esclero-corneal resultante del paso (e) en suero fisiológico o tampón fosfato (PBS), f) sumergir en una solución de agente descelularizante, preferiblemente en SDS, y aún más preferiblemente en SDS al 0,1% en agua o en PBS, g) incubar a temperatura ambiente durante 12 a 48 horas con agitación (entre 100 y 300 rpm), renovando esta solución cada 12 horas. h) lavar con PBS durante 24-48 horas a temperatura ambiente en agitación, renovando el PBS cada 12 horas.

La fijación de los fragmentos sobre la almohadilla del paso (c) puede hacerse, entre otros medios y sin limitarse, mediante el empleo de cianocrilato estéril quirúrgico. Otras alternativas puede ser el empleo de agujas. La almohadilla puede ser cualquier cosa que sea estéril, una placa de Petri, o un soporte para un micrótomo. La delaminación del paso (d) da lugar a láminas de aproximadamente, pero sin limitarnos, entre 50 y 350 mieras, más preferiblemente entre 80 y 300 mieras, aún más preferiblemente entre 100 y 200 mieras, y en una realización particular el espesor de las láminas es de aproximadamente 150 mieras, preferiblemente 150-250 mieras. Se puede llevar a cabo, por ejemplo, usando un cuchíllete de 2,75 mm triangular de bordes cortantes que se introduce en la mitad del fragmento semicircular intentando ir a ½ o 1/3 corneal y luego diseco hacia la izquierda y hacia derecha

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el limbo esclerocorneal se obtiene a partir de un donante cadáver. En otra realización preferida, el limbo esclerocorneal puede obtenerse a partir de tejido sobrante de queratoplastias, ya sean penetrantes o lamelares. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, dicho limbo tiene una profundidad de entre 50-300 pm, más preferiblemente de entre 100-250 pm, y aún más preferiblemente aproximadamente de 200 pm.

En otra realización preferida, el limbo descelularizado de la invención comprende únicamente la parte anterior del limbo esclerocorneal. En esta memoria se entiende por “parte anterior del limbo esclerocorneal” a la zona que comprende el tercio (1/3) anterior del casquete esclerocorneal que incluye el limbo esclerocorneal.

Aunque la mayoría de las afecciones lograron eliminar un porcentaje significativo de células de las córneas, muy pocos protocolos lograron eliminar más del 90% de las células de los tejidos (González-Andrades et ai, 2015. Transí Vis Sci Technol. 2015;4(2): 13).

Estos autores encontraron que la eficiencia de los protocolos más importantes no dependía del tiempo, lo que sugiere que el tipo de agente y su concentración son los factores más importantes relacionados con la eficiencia de eliminación de células. Aunque es un factor importante para la desceiularización de otros tipos de tejidos, la presencia de la barrera SCL en córneas enteras puede incluso desceiularizarse para los tiempos de incubación más elevados. Por lo tanto, la desceiularización de las córneas completas puede no depender del tiempo, a excepción de ciertos detergentes que se sabe que tienen un fuerte poder de desceiularización, como el SDS. Como se esperaba, las concentraciones más alfas de SDS se asociaron con eficiencias mejoradas de desceiularización, con una correlación positiva con la concentración del agente.

El término“limbo esclerocorneal” se refiere a la zona que se corresponde a la transición entre la esclerótica y la córnea. Tiene especial relevancia porque sus vasos sanguíneos irrigan la cornea. La importancia principal del limbo esclerocorneal es que es donde se encuentran las células madre limbares encargadas de reepitelizar la córnea en constante descamación. El epitelio corneal se recambia entero cada 7 días. La zona donde se recoge el humor acuoso esta por detrás de todo y se llama ángulo iridocorneal. Otra función importante es que es la zona donde están los vasos linfáticos además de los sanguíneos y, por supuesto, por donde penetran los nervios sensoriales que recogen la información sensitiva de la córnea y la protegen de eventuales agresiones, forzando el mecanismo de parpadeo y fenómeno de Bell, protector de la principal lente o dioptrio del ojo). De fuera hacia dentro se compone de: conjuntiva, cápsula de Tenon, lámina epiescleral, estroma del limbo esclerocorneal, sistema de drenaje del humor acuoso y el conducto de Schlemm. Por otro lado, se caracteriza porque el estroma presenta un tejido de transición entre la córnea y la esclera, y sus fibras de colágeno se van desordenando como en la esclera.

El término “descelularización” se refiere a un proceso para el aislamiento de la matriz extracelular de un tejido de las células que lo habitan, dejando un scaffold o andamio del tejido original. Es decir, se crea un biomaterial natural que soporta el crecimiento y la diferenciación celular y el crecimiento de tejidos. Son obtenidos mediante combinaciones de tratamientos físicos, químicos y enzimáticos, asegurando que no se pierde la estructura y son aptos para el tejido donde se emplean. Principalmente existen dos procesos de descelularización: por perfusión y por inmersión.

En otra realización específica de este aspecto de la invención, el scaffold contiene factores de crecimiento u otros agentes.

LIMBO ESCLEROCORNEAL RECELULARIZADO DE LA INVENCIÓN

Un segundo aspecto de la invención se refiere limbo esclerocorneal recelularizado, de ahora en adelante“limbo esclerocorneal recelularizado de la invención”, que comprende el limbo esclerocorneal humano descelularizado y, además, al menos una célula. Preferiblemente las células que se emplean para re-celularizar son células humanas, más preferiblemente las células se seleccionan de la lista que consiste en: estromales de la córnea (queratocitos), células de tejido conectivo (fibroblastos), células madre, o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, las células madre se seleccionan de la lista que consiste en células madre mesenquimales, células limbares del ojo, células madre hemotopoyéticas, células madre embrionarias no humanas, células madre pluripotentes inducidas, células madre adultas, células mesoteliales, células madre de sangre de cordón umbilical, o cualquier combinación de las mismas. Preferiblemente las células madres son células mesenquimales de cordón umbilical y/o células limbares.

El término“célula madre” hace referencia a una célula con capacidad clonogénica, de autorrenovación y de diferenciación en múltiples linajes celulares. En particular, las células madre esenqui ales tienen la capacidad de proliferar extensamente y formar colonias de células fibroblásticas. Tal como se usa en la presente invención, la expresión“célula madre” se refiere a una célula pluripotente o multipotente, capaz de generar uno o más tipos de células diferenciadas, y que además posee la capacidad de auto regenerarse, es decir, de producir más células madre. Las“células madre totipotentes” pueden dar lugar tanto a los componentes embrionarios (como por ejemplo, las tres capas embrionarias, el linaje germinal y los tejidos que darán lugar al saco vitelino), como a los extraembrionarios (como la placenta). Es decir, pueden formar todos los tipos celulares y dar lugar a un organismo completo. Las “células madre pluripotentes” pueden formar cualquier tipo de célula correspondiente a los tres linajes embrionarios (endodermo, ectodermo y mesodermo), así como el germinal y el saco vitelino. Pueden, por tanto, formar linajes celulares pero a partir de ellas no se puede formar un organismo completo. Las“células madre multipotentes” son aquellas que sólo pueden generar células de su misma capa o linaje embrionario de origen. La médula ósea alberga al menos dos poblaciones de células madre distintas: células madre mesenquimales (MSCs) y células madre hematopoyéticas (HSCs). En el contexto de la presente invención, las células madre son seleccionadas del grupo que comprende células madre mesenquimales, células madre hematopoyéticas, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas, células madre adultas, o combinaciones de las mismas. En una realización particular, las células madre son células madre de un mamífero, preferiblemente humanas.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, las células madre pluripotentes se han obtenido mediante un método que no implica la destrucción de embriones humanos.

Por su parte, las células mesenquimales presentan un efecto regenerador e inmunomodulador, y por tanto, efecto antiinflamatorio (patologías inmunes), también presentan efecto“homing” (acuden allí donde hay daño), plasticidad (conversión al fenotipo celular influenciado por el ambiente humoral donde se colocan), no son potencialmente tumorales y presentan poca o ninguna inmunogenicidad.

Por tanto, en una realización particular, las células madre son células madre mesenquimales, preferiblemente células madre mesenquimales humanas. Aún más preferiblemente son células mesenquimales humanas procedentes de tejido adiposo. En otra realización aún más preferida, son células mesenquimales humanas procedentes de cordón umbilical.

El término“célula madre adulta” se refiere a aquella célula madre que es aislada de un tejido o un órgano de un animal en un estado de crecimiento posterior al estado embrionario. Preferiblemente, las células madre de la invención son aisladas en un estado postnatal. Preferiblemente son aisladas de un mamífero, y más preferiblemente de un humano, incluyendo neonatos, juveniles, adolescentes y adultos. Se pueden aislar células madre adultas de una gran variedad de tejidos y órganos, como médula ósea (células madre mesenquimales, células progenitoras adultas multipotentes y células madre hematopoyéticas), tejido adiposo, cartílago, epidermis, folículo piloso, músculo esquelético, músculo cardíaco, intestino, hígado, neuronal.

El término“célula madre embrionaria” o“ESC” son células derivadas de masa celular interna de embriones en estadio de blastocisto, con capacidad de auto-renovación y de diferenciación en todos los tipos de células adultas. Las células madre embrionarias son capaces de proliferar indefinidamente in vitro manteniéndose en un estado indiferenciado y con un cariotipo normal a través del cultivo prolongado. También tienen la capacidad de diferenciarse en células de las tres capas germinales embrionarias (mesodermo, endodermo y ectodermo; (Itskovitz-Eldor, et al., Mol. Med.6:88-95, 2000) y linaje germinal. Las células madre embrionarias representan un modelo de sistema de gran alcance para la investigación de los mecanismos que subyacen a la biología de células pluripotentes y la diferenciación en el embrión temprano, así como proporcionar oportunidades para la manipulación genética. Las células madre embrionarias han sido aislados de la MCI de embriones en estadio de blastocisto especies múltiples (Bhattacharya, et al., BMC Dev. Biol.5:22, 2005), incluidos los ratones (Solter y Knowles, Proc. Nati. Acad.

EE.UU.75:55655569, 1978.), porcina (Chen, et al., Theriogenology 52:195-212, 1999), y los primates no humanos (Thomson, et al., Proc. Nati. Acad. EE.UU. 92 , 7844-7848, 1995).

Métodos para la obtención de células madre embrionarias son ampliamente conocidos y pueden ser puestos en práctica por el experto sin necesidad de experimentación excesiva. Células embrionarias de primates se pueden aislar de blastocistos de distintas especies de primates (Thomson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 92:7844). También son conocidos métodos de obtención de células madre embrionarias humanas sin la necesidad de destruir el embrión.

Con el fin de evitar el uso de embriones humanos, es posible el uso de animales transgénicos no humanos como fuente de células madre embrionarias. En particular, US5.523.226 describe métodos para generar cerdos transgénicos que pueden ser usados como donantes para xenotransplantes a humanos. WO97/12035 describe métodos para producir animales transgénicos adecuados para xenotransplantes. Asimismo, W001/88096 describe tejidos animales inmunocompatibles. Estos animales inmunocompatibles se pueden usar para generar células embrionarias pluripotentes tal y como se ha descrito en US6.545.199. Asimismo, es posible el uso de líneas de células troncales embrionarias, que pueden ser de distinto origen.

El término “célula madre mesenquimal” o “MSC”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una célula de estroma multipotente, originada a partir de la capa germinal mesodermal, que puede diferenciarse en una variedad de tipos de células, incluyendo osteocitos (células de hueso), condrocitos (células de cartílago) y adipocitos (células de grasa). Los marcadores expresados por las células madre mesenquimales incluyen CD105 (SH2), CD73 (SH3/4), CD44, CD90 (Thy-1), CD71 y Stro-1 así como las moléculas de adhesión CD106, CD166, y CD29. Entre los marcadores negativos para las MSCs (no expresados) están los marcadores hematopoyéticos CD45, CD34, CD14, y las moléculas coestimuladoras CD80, CD86 y CD40 así como la molécula de adhesión CD31. Las MSC pueden ser obtenidas a partir de, sin quedar limitado a, médula ósea, tejido adiposo (tal como el tejido adiposo subcutáneo), hígado, bazo, testículos, sangre menstrual, fluido amniótico, páncreas, periostio, membrana sinovial, músculo esquelético, dermis, pericitos, hueso trabecular, cordón umbilical humano, pulmón, pulpa dental y sangre periférica. Las MSC de acuerdo con la invención pueden obtenerse a partir de cualquiera de los tejidos anteriores, tal como a partir de médula ósea, de tejido adiposo subcutáneo o de cordón umbilical. La mayoría de estos métodos se basan en la capacidad de las MSC de adherirse al plástico, de forma que mientras que las células no adherentes se retiran del cultivo, las MSC adheridas pueden expandirse en placas de cultivo. Las MSC también pueden aislarse de tejido adiposo subcutáneo siguiendo un procedimiento similar, conocido para el experto en la materia. En una realización particular de la invención, las células madre mesenquimales son obtenidas a partir de cordón umbilical, preferiblemente de cordón umbilical humano.

Los términos “célula madre pluripotente” o “célula troncal pluripotente” y equivalentes gramaticales se usan de forma indistinta en el contexto de la presente invención para referirse a células no diferenciadas o poco diferenciadas, de cualquier especie, con capacidad para dividirse indefinidamente sin perder sus propiedades y capaces de formar cualquier célula de los tres linajes embrionarios (mesodermo, endodermo, ectodermo) y linaje germinal así como el linaje germinal cuando se cultivan en ciertas condiciones. La invención contempla el uso de cualquier tipo de célula madre pluripotente que sea capaz de generar una progenie de cualquiera de las tres capas germinativas incluyendo células derivadas de tejido embrionario, tejido fetal, tejido adulto y otras procedencias. Células pluripotentes adecuadas para su uso en la presente invención incluyen células madre embrionarias, células de carcinoma embrionario, células pluripotentes inducidas (iPS) y células germinales primordiales. Asimismo, la invención contempla el uso de células madre pluripotentes de cualquier especie incluyendo, sin limitación, células humanas, de ratón, de rata, bovinas, de oveja, de hámster, de cerdo y similares.

El término “célula madre pluripotente inducida” o “iPS”, según se usa en la presente invención, se refiere a células que son sustancialmente idénticas genéticamente a una célula somática diferenciada de la que derivan pero que muestran características similares en cuanto a diferenciación y capacidad proliferativa a las células madre embrionarias pluripotentes. Típicamente, las iPS expresan en su superficie uno o varios marcadores seleccionados del grupo formado por SSEA-3, SSEA-4, TRA-I -60, TRA-1-81 , TRA-2-49/6E y Nanog. Típicamente, las iPS expresan uno o varios genes seleccionados del grupo de Oct- 3/4, Sox2, Nanog, GDF3, REXI, FGF4, ESGI, DPP A2, DPP A4 y hTERT. Las iPS pueden generarse usando métodos descritos en el estado de la técnica tales como los métodos descritos por Takahashi y Yamanaka (Cell, 2006, 126:663-676), Yamanaka et al., (Nature, 2007, 448:313-7), Wernig et ai, (Nature, 2007, 448:318-24), Maherali (Cell Stem Cell, 2007, 1 :55-70); Maherali y Hochedlinger (Cell Stem Cell, 2008, 3:595-605), Park et ai, (Cell, 2008, 134:1-10); Dimos et al., (Science, 2008, 321 :1218-1221), Blelloch et al. (Cell Stem Cell,

2007, 1 :245-247); Stadtfeld et al., (Science, 2008, 322:945-949) y Okita et al., (Science,

2008, 322: 949-953). Son células reprogramadas in vitro a partir de células somáticas diferenciadas de manera terminal mediante transducción retroviral de los factores de transcripción Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc. Típicamente, las células iPS se obtienen a partir de células somáticas mediante la expresión en dichas células de las proteínas Oct- 3/4 y Sox2, de las proteínas Oct-3/4, Sox2 y Klf4, de las proteínas Oct-3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc y/o de las proteínas Oct-4, Sox2, Nanog y LIN28.

El limbo esclerocorneal recelularizado de la invención es obtenible por un método in vitro que comprende los siguientes pasos: a) obtener el limbo esclerocorneal descelularizado (scaffold) de la invención, b) cultivar una célula aislada o células aisladas en o sobre el limbo esclerocorneal descelularizado (scaffold) resultante del paso (a).

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, las células puede ser modificadas genéticamente mediante cualquier método convencional incluyendo, por ejemplo, aunque sin limitarnos, por procesos de transgénesis, deleciones o inserciones en su genoma, etc.

Las células aisladas pueden ser células de origen autólogo, alogénico o xenogénico. En una realización preferida de la invención, dichas células son de origen autólogo y están aisladas del sujeto al que se administrarán, reduciendo de este modo las posibles complicaciones asociadas con respuestas antigénicas y/o inmunogénicas a dichas células.

En general hay ventajas asociadas con el uso de células o tejidos autólogos, o con el contenido intracelular de células autólogas, que incluyen: (a) una reducción significativa del número de infecciones desde el donante al receptor por agentes infecciosos, y (b) la ausencia del efecto de rechazo inmunitario, por lo tanto, el paciente no tiene que someterse a otros tratamientos, y se previenen los efectos y problemas asociados con la inmunodepresión.

Cuando se usan donantes para obtener las células madre, la respuesta inmune se puede minimizar haciendo coincidir los haplotipos de los donantes a los de los destinatarios. En una realización preferida de la invención, la población de células madre se considera que no desencadena una respuesta inmune si al menos aproximadamente un 70% de las células de la población de células madre aislada no desencadenan una respuesta inmune. En otra realización preferida al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90% o al menos aproximadamente 95%, 99% o más de las células de la población de células madre aislada no desencadenan una respuesta inmune. Preferiblemente las células de la invención no desencadenan una respuesta inmune mediada por anticuerpos y/o no desencadenan una respuesta inmune humoral y/o no desencadenan una respuesta inmune de linfocitos mixtos.

Si se desea, las células aisladas se pueden expandir por clonación usando método adecuados para la clonación de poblaciones de células. Las células aisladas pueden clonarse a baja densidad (por ejemplo, en una placa de Petri) y se pueden aislar de otras células usando dispositivos adecuados (por ejemplo, anillos de clonación). La población clonal puede ser expandida en un medio de cultivo adecuado.

El término "aislado" indica que la célula o población celular a la que se refiere no está dentro de su entorno natural. La célula o población celular se ha separado sustancialmente de los tejidos circundantes. En una realización preferida de la invención, la célula o población de células se separa sustancialmente de tejido circundante si la muestra contiene al menos aproximadamente 75%, y al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, y al menos aproximadamente 95% de las células. En otras palabras, la muestra se separa sustancialmente del tejido circundante si la muestra contiene menos de aproximadamente 25%, menos de aproximadamente 15%, y menos de aproximadamente el 5% de materiales distintos a las células. Estos valores porcentuales se refieren al porcentaje en peso o en número de células. El término comprende células que han sido retiradas del organismo del que se derivan, y existen en el cultivo. El término también comprende células que han sido retiradas del organismo del que se originaron, y posteriormente son reinsertadas en un organismo. El organismo que contiene las células reinsertadas puede ser el mismo organismo del que se retiraron las células, o puede ser un organismo diferente, es decir, un individuo diferente de la misma especie.

El limbo de la invención presenta cavidades para alojar a las células y que estas puedan anidar fácilmente. Adicionalmente a las cavidades naturales que ya presenta, se pueden hacer más microcavidades mediante métodos conocidos en el estado del arte, como por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante el empleo de microagujas. Así, por ejemplo, las células mesenquimales puedan transformarse en células limbares madre, que son muy sensibles a luz ultravioleta, y normalmente están ocultas en criptas dentro de la esclera.

TEJIDO ARTIFICIAL DE LA INVENCIÓN

Un tercer aspecto de la invención se refiere a un tejido artificial, de ahora en adelante tejido artificial de la invención, que comprende el limbo esclerocorneal humano descelularizado de la invención, o el limbo esclerocorneal recelularizado de la invención.

COMPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende el limbo esclerocorneal humano descelularizado según el primer aspecto de la invención, el limbo esclerocorneal recelularizado según el segundo aspecto de la invención, o el tejido artificial según el tercer aspecto de la invención.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la composición es una composición farmacéutica.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición de la invención comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición de la invención comprende, además, otro principio activo.

El término "principio activo", "sustancia activa", "sustancia activa farmacéuticamente", "ingrediente activo" o "ingrediente farmacéuticamente activo" se refiere a cualquier componente que potencialmente proporciona una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, la curación, mitigación, tratamiento o prevención de una enfermedad, que afecta a la estructura o función del cuerpo humano o el cuerpo de otros animales. Ejemplos de principios activos de origen biológico incluyen factores de crecimiento, hormonas y/o citoquinas. Una variedad de agentes terapéuticos se conoce en la técnica y puede ser identificado por sus efectos. Ciertos agentes terapéuticos son capaces de regular la proliferación y diferenciación celular. Por ejemplo: nucleótidos, fármacos quimioterapéuticos, hormonas, no específicas (que no son anticuerpos), proteínas, oligonucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido que se unen a una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, secuencia de ARNm), péptidos, y peptidomiméticos.

La composición farmacéutica de la presente invención se puede usar en un método de tratamiento de una manera aislada o junto con otros compuestos farmacéuticos.

Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas.

El término "excipiente farmacéuticamente aceptable", se refiere al hecho de que debe ser aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o un gobierno nacional o uno que aparece en la Farmacopea de Estados Unidos o de la Farmacopea Europea, o alguna otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y en seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, excipiente, vehículo o adyuvante con la que la célula o las células del paso (b) deben ser administradas; Obviamente, dicho vehículo debe ser compatible con las células. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, incluye cualquier vehículo fisiológicamente compatible, por ejemplo, soluciones isotónicas (por ejemplo, solución salina estéril (0,9% NaCI), solución salina -buffer fosfato (PBS), solución de Ringer- lactato, etc.), opcionalmente suplementada con suero, preferiblemente con suero autólogo; medios de cultivo (por ejemplo, DMEM, RPMI, McCoy, etc.); o, preferiblemente, un material sólido, semisólido, medio de soporte gelatinoso o viscoso, tal como colágeno, colágeno- glicosamina-glicano, fibrina, cloruro de polivinilo, ácidos poli-amino, tales como polilisina, o poliornitina, hidrogeles, agarosa, silicona sulfato de dextrano.

La composición farmacéutica de la invención puede, si se desea, contener también cuando sea necesario, aditivos para aumentar y/o controlar el efecto terapéutico deseado de las células, por ejemplo, agentes tampón, agentes de superficie activos, conservantes, etc. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede comprender un medio de cultivo celular que soporta la viabilidad de las células. El medio estará generalmente libre de suero con el fin de evitar provocar una respuesta inmune en el receptor. El vehículo estará generalmente tamponado y/o libre de pirógenos. Además, para la estabilización de la suspensión celular, es posible añadir agentes quelantes de metales. La estabilidad de las células en el medio líquido de la composición farmacéutica de la invención se puede mejorar mediante la adición de sustancias adicionales, tales como, por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, etc. Las sustancias farmacéuticamente aceptables que pueden utilizarse en la composición farmacéutica de la invención son conocidas generalmente por una persona experta en la técnica y se usan normalmente en la producción de composiciones celulares. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington Pharmaceutical Sciences" por EW Martin. Se puede encontrar información adicional sobre dichos vehículos en cualquier manual de la tecnología farmacéutica (es decir, farmacia galénica).

La composición farmacéutica de la invención se administra en una forma farmacéutica de administración adecuada. Para ello, la composición farmacéutica de la invención se formulará de acuerdo con la forma de administración elegida. La formulación se adaptará a la forma de administración. En una realización específica, la composición farmacéutica se prepara en un líquido, forma de dosificación sólida o semisólida, por ejemplo, en forma de suspensión, con el fin de ser administrado mediante la implantación, inyección o infusión al sujeto que necesita tratamiento.

La administración de la composición farmacéutica de la invención al sujeto que lo necesita se llevará a cabo utilizando medios convencionales. En todos los casos, la composición farmacéutica de la invención se administrará utilizando equipos, aparatos y los dispositivos adecuados para la administración de composiciones celulares y conocidos por una persona experta en la técnica. En otra realización preferida, la administración directa de la composición farmacéutica de la invención al sitio que donde se pretenda que se produzca el beneficio puede ser ventajoso. En este método, la administración directa de la composición farmacéutica de la invención al órgano o tejido deseado se puede lograr mediante la administración directa (por ejemplo, por inyección, etc.) en la superficie externa del órgano o tejido afectado por la inserción de un dispositivo adecuado, por ejemplo, una cánula adecuada, por infusión (incluyendo mecanismos de flujo inversa) o por otros medios descritos en esta patente o conocidos en la técnica.

La composición farmacéutica de la invención puede almacenarse hasta el momento de su aplicación por los métodos convencionales conocidos por una persona experta en la técnica. Para el almacenamiento a corto plazo (menos de 6 horas), la composición farmacéutica de la invención puede almacenarse a o por debajo de temperatura ambiente en un recipiente sellado, suplementado o no con una solución de nutrientes. El almacenamiento a medio plazo (menos de 48 horas) se lleva a cabo preferiblemente entre 2-8 °C, y la composición farmacéutica de la invención incluye, además, una solución tamponada isosmótica en un recipiente hecho o recubierta con un material que impide la adhesión celular. Almacenamiento a más largo plazo se efectúa preferiblemente por medio de la criopreservación y almacenamiento adecuado en condiciones que promueven la retención de la función celular.

En una realización concreta, la composición farmacéutica de la invención se puede utilizar en terapia combinada. Dichos medicamentos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o pueden, alternativamente, ser suministrado en forma de una composición separada para simultánea o sucesiva (secuencial en el tiempo) la administración con respecto a la administración de la composición farmacéutica de la invención.

USOS MÉDICOS DE LA INVENCIÓN

Un octavo aspecto de la invención se refiere al limbo esclerocorneal humano descelularizado según el primer aspecto de la invención, el limbo esclerocorneal recelularizado según el segundo aspecto de la invención, el tejido artificial según el tercer aspecto de la invención, o la composición según el cuarto aspecto de la invención, para el tratamiento de cualquier enfermedad de la superficie ocular, preferiblemente insuficiencia limbar, epiteliopatía corneal, y otras patologías del polo anterior en combinación con otros principios activos, como el glaucoma, uveítis, infecciones, así como otras patologías oculares, entre ellas las que producen neovascularización. Un noveno aspecto de la invención se refiere al uso limbo esclerocorneal humano descelularizado según el primer aspecto de la invención, el limbo esclerocorneal recelularizado según el segundo aspecto de la invención, el tejido artificial según el tercer aspecto de la invención, o la composición según el cuarto aspecto de la invención, como sistema de liberación de factores celulares y/o fármacos

Un décimo aspecto de la invención se refiere al limbo esclerocorneal humano descelularizado según el primer aspecto de la invención, el limbo esclerocorneal recelularizado según el segundo aspecto de la invención, el tejido artificial según el tercer aspecto de la invención, o la composición según el cuarto aspecto de la invención, para la liberación de células o fármacos.

Como se ha comentado anteriormente, el limbo de la invención puede emplearse para alojar células madre que pueden diferenciarse en células limbares o de otros linajes celulares. Además, puede contener células modificadas genéticamente para producir compuestos terapéuticos de utilidad, que puedan actuar como ingredientes activos. Puede también funcional como un“depot”, bien directamente, alojando compuestos terapéuticos de interés, o bien empleando nanopartículas u otros mecanismos para contenerlos y liberarlos.

A modo de ejemplo, no limitante, los agentes terapéuticos de utilidad de acuerdo a la invención incluyen las siguientes categorías terapéuticas: analgésicos, como los medicamentos anti-inflamatorios no esteroides, agonistas opiáceos y salicilatos; agentes anti-infecciosos, tales como antihelmínticos, antianaeróbicos, antibióticos, antibióticos aminoglucósidos, antibióticos antifúngicos , cefalosporinas, antibióticos macrólidos, diversos antibióticos beta-lactámicos, penicilinas, antibióticos quinolonas, antibióticos sulfonamidas, antibióticos de tetraciclina, antimicobacterianos, antimicobacterianos antituberculosos, antiprotozoarios, antiprotozoarios antimaláricos, agentes antivirales, agentes anti- retrovirales, escabicidas, agentes antiinflamatorios, corticosteroides antiinflamatorios, antipruriginosos/anestésicos tópicos locales, antiinfecciosos, antimicóticos tópicos antiinfecciosos, antivirales tópicos antiinfecciosos, agentes electrolíticos y renales, tales como agentes acidificantes, agentes alcalinizantes, diuréticos, inhibidores de la anhidrasa carbónica, diuréticos, diuréticos de asa, diuréticos osmóticos, diuréticos ahorradores de potasio, diuréticos de tiazida, suplementos de electrolitos, y agentes uricosúricos, enzimas, tales como enzimas pancreáticas y las enzimas trombolíticos, agentes gastrointestinales, tales como antidiarreicos, antieméticos, gastrointestinales agentes anti-inflamatorios gastrointestinales, el salicilato de agentes anti-inflamatorios, antiácidos antiúlceras gástricas, agentes inhibidores de la bomba de ácido antiulcerosos agentes, mucosa gástrica antiulcerosos agentes bloqueantes H2, antiulcerosos, agentes colelitolíticos digestants, eméticos, laxantes y ablandadores de heces y agentes procinéticos, anestésicos generales como los anestésicos inhalatorios halogenados anestésicos inhalatorios, anestésicos intravenosos, barbitúricos, benzodiazepinas anestésicos intravenosos, anestésicos por vía intravenosa de opiáceos y anestésicos intravenosos agonistas, hormonas y modificadores hormonales, como abortivos, agentes corticosteroides suprarrenales, agentes suprarrenales, los andrógenos, antiandrógenos, inmunobiológicos, agentes tales como inmunoglobulinas, inmunosupresores, toxoides, y vacunas; anestésicos locales, tales como amida de los anestésicos locales y de los anestésicos locales de tipo éster, agentes musculoesqueléticos, tales como anti-gota, agentes antiinflamatorios, corticosteroides anti-inflamatorios, agentes, compuestos de oro anti-inflamatoria, agentes inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE), agentes anti-inflamatorios salicilato, minerales y vitaminas, como la vitamina A, vitamina B, vitamina C, vitamina D, vitamina E y vitamina K.

En una realización particular, los agentes terapéuticos útiles según las categorías anteriores incluyen: (1) analgésicos en general, tales como lidocaína o sus derivados, y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) analgésicos, incluyendo diclofenaco, ibuprofeno, ketoprofeno, naproxeno y, (2) analgésicos opiáceos agonistas, como la codeína, fentanilo, hidromorfona y la morfina, (3) analgésicos de salicilato, como la aspirina (ASA), (4) bloqueadores H1 antihistamínicos, tales como terfenadina, clemastina y (5) agentes antiinfecciosos, tales como mupirocina; (6) antianaeróbicos anti-infecciosos, tales como cloranfenicol y clindamicina; (7) antifúngicos antibióticos antiinfecciosos, tales como anfotericina B, clotrimazol, fluconazol y ketoconazol; (8) contra el antibiótico macrólido - infecciosos, tales como la azitromicina y eritromicina; (9) diversos beta-lactámico antiinfecciosos, tales como aztreonam y imipenem; (10) antibiótico de penicilina antiinfecciosos, tales como nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V y; (11) quinolona antibióticos anti infecciosos, tales como ciprofloxacina y norfloxacina; (12) antibiótico tetraciclina anti infecciosos, tales como doxiciclina, minociclina y tetraciclina; (13) antituberculosos antimicobacterianos antiinfecciosos, tales como isoniazida (INH), rifampicina y; (14) antiprotozoarios antiinfecciosos, como atovacuona y dapsona; (15) antipalúdico antiprotozoarios antiinfecciosos, tales como cloroquina y pirimetamina; (16) anti- retrovirales anti infecciosos, tales como ritonavir y zidovudina; (17) contra el antiviral - infeccioso agentes, tales como aciclovir, ganciclovir, interferón alfa, y rimantadina; (18) antifúngicos tópicos antiinfecciosos, tales como anfotericina B, clotrimazol, miconazol, nistatina y; (19) antivirales tópicos antiinfecciosos, tales como el aciclovir; (20) agentes electrolíticas y renales, como la lactulosa; (21) diuréticos de asa, como la furosemida; (22) diuréticos ahorradores de potasio, como triamtereno; (23) diuréticos tiazídicos, tales como hidroclorotiazida (HCTZ), (24) agentes uricosúricos, tales como probenecid; (25) enzimas, tales como RNasa y DNasa; (26) antieméticos, tales como proclorperazina; (27) salicilato gastrointestinales inflamatorias antiagentes, tales como sulfasalazina; (28) de la bomba gástrica de ácido anti-inhibidor agentes de úlceras, tales como el omeprazol; (29) bloqueantes H2, agentes anti-úlcera, tales como cimetidina, famotidina, nizatidina y ranitidina; (30) digestivos, tales como pancrelipase; (31) agentes procinéticos, tales como la eritromicina (32; éster) anestésicos locales, tales como benzocaína y procaína; (33) musculoesqueléticos corticosteroides anti-inflamatorios, agentes, tales como beclometasona, betametasona, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, y prednisona; (34) musculoesqueléticos antiinflamatorios inmunosupresores, tales como azatioprina, ciclofosfamida y metotrexato; (35) musculoesqueléticos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), tales como diclofenaco, ibuprofeno, ketoprofeno, ketorlac, y naproxeno; (36) minerales, tales como hierro, calcio y magnesio; (37) Los compuestos de vitamina B , tales como la cianocobalamina (vitamina B12) y la niacina (vitamina B3); (38) compuestos de vitamina C, tales como ácido ascórbico, y (39) compuestos de vitamina D, tales como calcitriol.

En otra realización preferida, el agente terapéutico puede ser un factor de crecimiento u otra molécula que afecta a la diferenciación celular y/o proliferación, como por ejemplo, pero sin limitarnos, el derivado de las plaquetas (PDGF), transformante (TGF), insulínico (IGF), hepático (HGF), epidérmico (EGF), endotelio vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), o cualquier de sus combinaciones. Los factores de crecimiento que inducen la diferenciación de estados finales son bien conocidos en la técnica, y puede ser seleccionado de cualquiera de esos factores que se ha demostrado que induce un estado de diferenciación final. Los factores de crecimiento para uso en los métodos aquí descritos pueden, en ciertas realizaciones, ser variantes o fragmentos de un factor de crecimiento de origen natural. Por ejemplo, una variante puede ser generada al hacer cambios de aminoácidos conservadores y prueba de la variante resultante en uno de los ensayos funcionales descritos anteriormente u otro ensayo funcional conocido en la técnica. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen alifático-hidroxilo en sus cadenas laterales es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen que contiene amida en las cadenas laterales es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina, y un grupo de aminoácidos que tienen que contiene azufre en las cadenas laterales es cisteína y metionina. Grupos preferidos de sustitución de aminoácidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina- valina, y asparagina-glutamina. Como los expertos en la técnica apreciarán, las variantes o fragmentos de factores de crecimiento de polipéptidos se pueden generar usando técnicas convencionales, tales como mutagénesis, incluyendo la creación de mutación de punto discreto (s), o por truncamiento. Por ejemplo, la mutación puede dar lugar a variantes que conservan sustancialmente la misma, o simplemente un subconjunto, de la actividad biológica de un factor de crecimiento polipeptídico de la que se derivó.

En otra realización preferida, el agente terapéutico puede ser un agente antifactor de crecimiento. Más preferiblemente podría ser un anti-VEGF que puede emplearse para el tratamiento de varias patologías oculares, como por ejemplo, la degeneración ocular asociada a la edad (DEMAE), retinopatía diabética, y otras patologías oculares donde se ha demostrado la eficacia de los medicamentos anti-VEGF. Medicamentos anti-VEGF son conocidos en el estado del arte, como por ejemplo pero sin limitarnos, anticuerpos como bevacizumab, ranibizumab, lapatinib, sunitinib, sorafenib, axitinib, and pazopanib, o cualquiera de sus combinaciones.

Por último, otro aspecto de la invención se refiere al uso del tejido artificial de la invención para al limbo esclerocorneal humano descelularizado según el primer aspecto de la invención, el limbo esclerocorneal recelularizado según el segundo aspecto de la invención, el tejido artificial según el tercer aspecto de la invención, o la composición según el cuarto aspecto de la invención, para la evaluación de un producto farmacológico, biológico y/o químico.

Otro aspecto de la invención se refiere a un scaffold obtenible mediante un método que comprende: a) obtener el scaffold de la invención y b) obtener otro scaffold mediante una impresión 3D tomando como molde el scaffold de la invención.

La impresión 3D puede desarrollarse por cualquiera de los métodos conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo, aunque sin limitarnos, por impresión por inyección, modelado por deposición fundente, fotopolimerización, impresión con hielo, etc.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, se añade un componente para disminuir la fragilidad, por ejemplo un polisacárido. Ejemplos de polisacáridos que pueden emplearse son pero, sin limitarnos, agar-agar, agarosa, alginato, quitosano ocarragenatos, o cualquier combinación de los anteriores.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del elemento impreso según se describe en el anterior aspecto de la invención en la elaboración de un medicamento... El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, mejora, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales.

Los compuestos y composiciones de la presente invención pueden ser empleados junto con otros medicamentos en terapias combinadas. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o de otra composición diferente, para su administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLO DE LA INVENCIÓN

1_. Tallado de los fragmentos de casquete esclerocorneal

Se procede a cortar el casquete esclerocorneal en 4 fragmentos de similares longitudes y se recorta córnea clara hasta dejar sólo 1 mm y 2 mm de esclera. Si aún queda conjuntiva se retira para dejar la esclera desnuda. Se fija cada fragmento ya sea con agujas o con pegamento de cianoacrilato quirúrgico estéril sobre la base almohadillada en las que vienen las suturas de nylon 10-0. Una vez fijado, con un cuchíllete de 2,75 mm triangular de bordes cortantes se incide sobre el espesor del fragmento en su tercio medio y se delamina el 1/3 anterior del estroma corneo-escleral ayudándose para este corte con una pinza Adson apoyada a ambos lados del fragmento a modo de triángulo isósceles en la que dos de los lados superiores serían las pinzas y la base el fragmento de corneo-esclera. Se continúa la disección con cuchíllete tipo“crescent” o con los bordes laterales del mismo cuchíllete de 2,75 mm deslizando el cuchíllete hacia los lados, hasta terminar de diseccionar un segmento semicircular de esclera y córnea de 1/3 de espesor anterior aproximadamente.

Posteriormente, se procede a suturar con nylon la esquina anterior corneal para que el manejo en laboratorio sea el correcto. El transporte se realiza en el mismo medio que vienen los casquetes esclerocorneales, tipo Optisol®. 2. Descelularización de limbos esclero-corneales humanos.

En primer lugar, se procede a eliminar todas las células y restos celulares de los limbos esclero-corneales humanos procedentes de donantes multiorgánicos o de biopsias limbares utilizando un método previamente descrito para la córnea por González-Andrades et al. 2015 y por Oliveira et al. 2013 (Píos ONE 8(6); e66538) para intestino delgado basado en el agente aniónico tensoactivo dodecilsulfato sódico (SDS). Para ello, los limbos esclero- corneales previamente tallados se lavan en suero fisiológico o tampón fosfato (PBS) y se sumergen en una solución de SDS al 0,1% en agua o en PBS, incubándose en esta solución a tempera ambiente durante 12 a 48 horas con agitación (de 100 a 300 rpm), renovando esta solución cada 12 horas. Tras ello, se lavan abundantemente con PBS durante 24-48 horas a temperatura ambiente en agitación, renovando el PBS cada 12 horas. Una muestra de los limbos esclero-corneales así descelularizados se fija con formalina neutra y se procesa para análisis histológico y confirmación de la eficacia del proceso de descelularización.

3. Recelularización con células humanas.

Una vez descelularizadas, las muestras se colocan en una placa de Petri estéril con la superficie anterior (cara corneal) hacia arriba y se procede a su recelularización. Para ello, se parte de un cultivo primario de células estromales de la córnea (queratocitos) o de tejido conectivo (fibroblastos) o de células madre mesenquimales humanas -MSC- (células madre del tejido adiposo, de la pulpa dentaria, de la médula ósea o del cordón umbilical) previamente establecido. Este cultivo se tripsiniza para despegar las células, se lava en medio de cultivo, y las células son depositadas sobre la superficie corneal de los fragmentos de limbo esclero-corneal o se inyectan en el interior del estroma utilizando una microaguja quirúrgica. Tras ello, se analizó la presencia de células mediante tinción de cada una de las muestras con DAPI (colorante fluorescente que se une específicamente al ADN y marca los núcleos celulares en color azul).

Los resultados muestran la presencia de abundantes células en la muestra de limbo esclero- corneal original no sometida a descelularización, y una completa desaparición de todas las células tras el proceso de descelularización. Las muestras recelularizadas con células madre mesenquimales de la gelatina de Wharton del cordón umbilical humano (WH) o con fibroblastos de la mucosa oral humana (FOM) mostraron una capa de células en la superficie y, en algunos casos, algunas células en el interior del tejido descelularizado, tal como se muestra en las figuras.

5

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Limbo esclerocorneal humano descelularizado.

2.- El limbo esclerocorneal descelularizado humano según la reivindicación anterior, obtenible por un método in vitro de descelularización que comprende el uso de solución de agente descelularizante, preferentemente SDS, preferiblemente SDS a aproximadamente el

0,1 %.

3.- El limbo esclerocorneal descelularizado humano según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, obtenible por un método in vitro de descelularización que comprende: a) cortar el casquete esclerocorneal en 4 fragmentos de similares longitudes, b) recortar la córnea clara hasta dejar sólo 1 mm y 2 mm de esclera, c) fija cada fragmento sobre un soporte, preferiblemente una almohadilla, d) delaminar el 1/3 anterior del estroma corneo-escleral e) diseccionar un segmento semicircular de esclera y córnea de 1/3 de espesor anterior aproximadamente. f) lavar el limbo esclero-corneal resultante del paso (e) en suero fisiológico o tampón fosfato (PBS), g) sumergir en una solución de agente descelularizante, preferiblemente SDS, y más preferiblemente SDSal 0,1% en agua o en PBS, e) incubar a temperatura ambiente durante 12 a 48 horas con agitación (entre 100 y 300 rpm), renovando esta solución cada 12 horas. f) lavar con PBS durante 24-48 horas a temperatura ambiente en agitación, renovando el PBS cada 12 horas

4 - Limbo esclerocorneal recelularizado que comprende el limbo esclerocorneal humano descelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5.- Limbo esclerocorneal recelularizado según la reivindicación anterior, donde las células que se emplean para recelularizar son células humanas.

6.- Limbo esclerocorneal recelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 4-5, donde las células que se emplean para recelularizar son células autólogas.

7.- Limbo esclerocorneal recelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, donde las células que se emplean para recelularizar son células madre. donde las células madre se seleccionan de la lista que consiste en células madre mesenquimales, células limbares del ojo, células madre hemotopoyéticas, células madre embrionarias no humanas, células madre pluripotentes inducidas, células madre adultas, células mesoteliales, células madre de sangre de cordón umbilical, o cualquier combinación de las mismas, preferiblemente las células madres son células mesenquimales de cordón umbilical y/o células limbares.

8.- Limbo esclerocorneal recelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 4-7, donde las células que se emplean para recelularizar se seleccionan de la lista que consiste en: estromales de la córnea (queratocitos), células de tejido conectivo (fibroblastos), células madre mesenquimales, o cualquiera de sus combinaciones.

9.- Limbo esclerocorneal recelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 4-8, donde las células que se emplean para recelularizar son células mesenquimales, y más preferiblemente obtenidas de cordón umbilical.

10.- Limbo esclerocorneal recelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 4-9, depositadas sobre la superficie corneal de los fragmentos de limbo esclero-corneal o se inyectan en el interior del estroma, preferiblemente utilizando una microaguja quirúrgica

11.- Limbo esclerocorneal recelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 4-10, donde el limbo esclerocorneal se obtiene a partir de un donante cadáver

12.- Limbo esclerocorneal recelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 4-11 , que tiene un espesor de entre 50-300 pm, más preferiblemente de entre 100-250 pm, y aún más preferiblemente aproximadamente de 200.

13.- Un tejido artificial que comprende el limbo esclerocorneal humano descelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o el limbo esclerocorneal recelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 4-12.

14.- Una composición que comprende el limbo esclerocorneal humano descelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o el limbo esclerocorneal recelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 4-12, o el tejido artificial según la reivindicación 13.

15.- La composición según la reivindicación anterior, donde la composición es una composición farmacéutica.

16.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, que comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-11 , que comprende, además, otro principio activo.

18.- El limbo esclerocorneal humano descelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o el limbo esclerocorneal recelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 4-12, o el tejido artificial según la reivindicación 13, o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 14-17, para su uso como medicamento.

19.- El limbo esclerocorneal humano descelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o el limbo esclerocorneal recelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 4-12, o el tejido artificial según la reivindicación 13, o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 14-17, para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un órgano enfermo o dañado

20.- El limbo esclerocorneal humano descelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o el limbo esclerocorneal recelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 4-12, o el tejido artificial según la reivindicación 13, o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 14-17, para el tratamiento de la insuficiencia limbar unilateral o bilateral, parcial o total.

21.- El limbo esclerocorneal humano descelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o el limbo esclerocorneal recelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 4-12, o el tejido artificial según la reivindicación 13, o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 14-17, para el tratamiento de cualquier epiteliopatía, de una enfermedad ocular corneal que implique o no neovascularización corneal.

22.- Uso del limbo esclerocorneal humano descelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o el limbo esclerocorneal recelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 4-12, o el tejido artificial según la reivindicación 13, o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 14-17, como sistema de liberación de factores celulares y/o fármacos.

23.- Un kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para obtener limbo esclerocorneal humano descelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o el limbo esclerocorneal recelularizado según cualquiera de las reivindicaciones 4-12, o el tejido artificial según la reivindicación 13, o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 14-17.

24.- Uso del kit o dispositivo según la reivindicación anterior en un método según se describe en las reivindciaciones 2-3.