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WO2022186220A1 - 植物酸性インベルターゼ活性化剤、その製造方法、及び、植物酸性インベルターゼ活性化方法 - Google Patents

植物酸性インベルターゼ活性化剤、その製造方法、及び、植物酸性インベルターゼ活性化方法 Download PDF

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Publication number
WO2022186220A1
WO2022186220A1 PCT/JP2022/008662 JP2022008662W WO2022186220A1 WO 2022186220 A1 WO2022186220 A1 WO 2022186220A1 JP 2022008662 W JP2022008662 W JP 2022008662W WO 2022186220 A1 WO2022186220 A1 WO 2022186220A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
outer membrane
cell wall
protein
invertase
cyanobacteria
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/008662
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
征司 児島
Original Assignee
パナソニックＩｐマネジメント株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by パナソニックＩｐマネジメント株式会社 filed Critical パナソニックＩｐマネジメント株式会社
Priority to BR112023017317A priority Critical patent/BR112023017317A2/pt
Priority to JP2023503876A priority patent/JPWO2022186220A1/ja
Priority to MX2023010084A priority patent/MX2023010084A/es
Publication of WO2022186220A1 publication Critical patent/WO2022186220A1/ja
Priority to US18/457,500 priority patent/US20240057613A1/en

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P21/00—Plant growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for producing a plant acid invertase activator, which is a natural metabolite having the effect of activating plant acid invertase, a plant acid invertase activator, and a method for activating plant acid invertase.
  • Invertase activity control by genetic recombination is known as one of the methods for controlling cell physiology (Non-Patent Document 1).
  • Invertase is an enzyme that decomposes sucrose (so-called sucrose) into glucose and fructose, and is deeply involved in the translocation, distribution and accumulation of sucrose produced by photosynthesis in leaves to various plant organs.
  • sucrose sucrose
  • Invertase is roughly divided into neutral invertase and acidic invertase according to its optimum pH.
  • acid invertase There are two types of acid invertase: cell wall invertase localized in the cell wall and vacuolar invertase localized in the vacuole.
  • Non-Patent Document 2 discloses that cotton fiber production of cotton is enhanced by activating vacuolar invertase using gene recombination technology.
  • Non-Patent Document 3 discloses that vacuolar invertase activity is essential for the growth of rice ears.
  • Non-Patent Documents 4 and 5 show that the yield of soybean and corn is increased by activating the cell wall invertase of corn and soybean by genetic recombination technology, and the sugar content of each grain is increased. is disclosed. For these reasons, the development of a technique for improving the productivity of crops by artificially activating acid invertase is expected.
  • the present disclosure provides a method for simply and efficiently producing a plant acid invertase activating substance that activates plant acid invertase.
  • the present disclosure provides a plant acid invertase activator capable of efficiently activating plant acid invertase, and a method for activating plant acid invertase.
  • the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria is 30% or more and 70% or less of the total amount of the proteins in the parent strain.
  • a plant acid invertase activator that activates plant acid invertase can be produced simply and efficiently.
  • the plant acid invertase activator of the present disclosure it is possible to effectively activate plant acid invertase.
  • the method for activating plant acid invertase of the present disclosure by using the plant acid invertase activator of the present disclosure in plants, it is possible to effectively activate acid invertase in plants.
  • FIG. 1 is a flow chart showing an example of a method for producing a plant acid invertase activator according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the cell surface layer of cyanobacteria.
  • 3 is a transmission electron microscope image of an ultra-thin section of the modified cyanobacteria of Example 1.
  • FIG. 4 is an enlarged image of the dashed line area A in FIG. 5 is a transmission electron microscope image of an ultra-thin section of the modified cyanobacteria of Example 2.
  • FIG. FIG. 6 is an enlarged image of the dashed line area B in FIG. 7 is a transmission electron microscope image of an ultra-thin section of the modified cyanobacteria of Comparative Example 1.
  • FIG. 10 is a graph showing average values of acid invertase activity of spinach cultivated in Example 3 and Comparative Example 2.
  • FIG. 11 is a graph showing the average dry weight of aboveground parts per spinach cultivated in Example 3 and Comparative Example 2; 12 is a graph showing average values of acid invertase activity of strawberries cultivated in Example 4 and Comparative Example 3.
  • FIG. 13 is a graph showing the average number of fruits per strawberry cultivated in Example 4 and Comparative Example 3.
  • FIG. 14 is a graph showing the average fruit weight per strawberry cultivated in Example 4 and Comparative Example 3.
  • FIG. 15 is a graph showing the average sugar content per strawberry cultivated in Example 4 and Comparative Example 3.
  • FIG. FIG. 16 is a diagram showing the state of representative fruits in Example 4 and Comparative Example 3, respectively.
  • FIG. 17 is an electropherogram showing the amounts of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall in the modified cyanobacteria of Examples 1, 2, Comparative Examples 1, 4 and 5; 18 is a transmission electron microscope image of an ultra-thin section of the modified cyanobacteria of Comparative Example 4.
  • FIG. 19 is an enlarged view of the dashed line area D in FIG. 18.
  • FIG. 20 is a transmission electron microscope image of an ultra-thin section of the modified cyanobacteria of Comparative Example 5.
  • FIG. 20 is a transmission electron microscope image of an ultra-thin section of the modified cyanobacteria of Comparative Example 5.
  • FIG. 21 is an enlarged view of the dashed line area E in FIG. 20.
  • FIG. 22 is a graph showing the amount of protein in the culture medium of the modified cyanobacteria of Examples 1, 2, Comparative Examples 1, 4 and 5.
  • FIG. 23 is a graph showing amounts of pyruvic acid covalently bound to cell wall-bound sugar chains of modified cyanobacteria of Example 2 and Comparative Example 1.
  • Non-Patent Document 2 reports that elongation of cotton fibers is promoted by highly expressing the cotton vacuole invertase gene using the 35S promoter.
  • Non-Patent Document 4 reports that cell wall invertase is activated by suppressing the expression of a gene that inhibits soybean cell wall invertase activity by RNA (ribonucleic acid) interference. Specifically, by applying this technology to soybeans, it was reported that the weight per soybean grain increased, the harvested weight per plant increased, and the sugar content per soybean grain increased. It is
  • Non-Patent Document 5 reports that the yield of maize is increased by highly expressing the maize cell wall invertase gene using the 35S promoter. It has also been reported that the sugar content per grain increases.
  • Cyanobacteria also called cyanobacteria or blue-green algae
  • Cyanobacteria are a group of eubacteria that split water through photosynthesis to produce oxygen and use the energy obtained to fix CO2 in the air.
  • Cyanobacteria can also fix atmospheric nitrogen (N 2 ), depending on the species. In this way, cyanobacteria can obtain most of the raw materials (that is, nutrients) and energy necessary for the growth of the cells from air, water, and light. Cyanobacteria can be cultured.
  • cyanobacteria are known to grow quickly and use light efficiently as a characteristic of cyanobacteria.
  • cyanobacteria are easy to genetically manipulate, so we used cyanobacteria among photosynthetic microorganisms.
  • Active research and development is being carried out on material production. For example, production of fuels such as ethanol, isobutanol, alkanes, and fatty acids (Patent Document 1: Japanese Patent No. 6341676) has been reported as an example of substance production using cyanobacteria.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 634167666
  • research and development is also being conducted on the production of substances that serve as nutrients for living organisms.
  • Non-Patent Document 8 Jie Zhou et al. ., “Discovery of a super-strong promoter enable efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria”, Scientific Reports, Nature Research, 2014, Vol.4, Article No.4500).
  • cyanobacterial cells cyanobacterial cells
  • desired compounds and proteins can be produced in cyanobacterial cells (hereinafter also referred to as cells).
  • the desired compounds and proteins produced in the cells of cyanobacteria are difficult to be secreted outside the cells, so it is necessary to disrupt the cells of the cyanobacteria and extract the desired compounds and proteins produced in the cells.
  • Cyanobacterial cell walls and cell membrane structures determine the permeability of proteins and intracellular metabolites, but it is easy to artificially modify cell membranes and cell wall structures to improve the ability to secrete and produce proteins and intracellular metabolites. is not.
  • Non-Patent Documents 6 and 7 deletion of the slr1841 gene or slr0688 gene, which is involved in the adhesion between the outer membrane of cyanobacteria and the cell wall and contributes to the structural stability of the cell surface, It has been described that the ability of cyanobacterial cells to proliferate is lost.
  • the present inventors diligently studied the optimal structural modification method of the cell membrane and cell wall to increase the secretory production ability of proteins and intracellular metabolites while maintaining the growth ability of cyanobacterial cells.
  • the present inventors diligently studied the optimal structural modification method of the cell membrane and cell wall to increase the secretory production ability of proteins and intracellular metabolites while maintaining the growth ability of cyanobacterial cells.
  • proteins produced in the cells of cyanobacteria by suppressing the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane of cyanobacteria and the cell wall to 30% to 70% of the total amount of the proteins in the parent strain, proteins produced in the cells of cyanobacteria and It was found that intracellular metabolites are more likely to be secreted extracellularly.
  • desired compounds and proteins produced within the cyanobacteria and intracellular metabolites are released outside the cells.
  • cyanobacterial secretions have the effect of activating acid invertase on multiple crop species.
  • the extracellularly secreted substance that activates the plant acid invertase that is, the plant acid invertase activator
  • the physiological activity of the plant acid invertase activator is less likely to be impaired. Invertase can be activated.
  • a plant acid invertase activator containing a substance having the effect of activating acid invertase can be easily and , can be efficiently manufactured.
  • the plant acid invertase activator of the present disclosure it is possible to effectively activate plant acid invertase.
  • the method for activating plant acid invertase of the present disclosure by using the plant acid invertase activator of the present disclosure in plants, it is possible to effectively activate acid invertase in plants.
  • the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria is suppressed to 30 to 70% of the total amount of the proteins in the parent strain. and causing said modified cyanobacteria to secrete a secretion involved in the activation of plant acid invertase.
  • the binding between the cell wall and the outer membrane (for example, the amount and strength of binding) is partially reduced, and the outer membrane partially detaches from the cell wall, without impairing the cell proliferation ability. easier to release.
  • proteins and metabolites produced within the cells (hereinafter also referred to as substances produced within the cells) are likely to leak out of the outer membrane, that is, out of the cells.
  • proteins and metabolites produced within the modified cyanobacteria are more likely to be secreted outside the cells, making it unnecessary to extract substances produced within the cells, such as by crushing the cells. Therefore, a plant acid invertase activator containing modified cyanobacterial secretions can be produced simply and efficiently.
  • the growth ability of the cells will be impaired, and if it exceeds 70%, it will be produced in the cells. protein cannot be leaked out of the cell.
  • the extraction process for the intracellularly produced substances is not required, it is less likely that the physiological activity and yield of the intracellularly produced substances will decrease. Therefore, among the intracellularly produced substances of the modified cyanobacteria, a decrease in physiological activity and a decrease in yield of substances involved in the activation of plant acid invertase (that is, plant acid invertase activating substances) are less likely to occur. As a result, the secretion of the modified cyanobacteria has an improved effect related to activation of plant acid invertase (hereinafter also referred to as plant acid invertase activation effect).
  • the modified cyanobacteria can be repeatedly used to produce the intracellularly produced substances. can be done. Therefore, it is not necessary to prepare new modified cyanobacteria each time the plant acid invertase activator is produced. Therefore, according to the method for producing a plant acid invertase activator according to one aspect of the present disclosure, a plant acid invertase activator can be produced simply and efficiently.
  • the protein involved in the binding between the outer membrane and the cell wall is an SLH (Surface Layer Homology) domain-retaining outer membrane protein and a cell wall - at least one pyruvate modifying enzyme.
  • SLH Surface Layer Homology
  • modified cyanobacteria for example, (i) an enzyme that catalyzes pyruvate modification of SLH domain-retaining outer membrane proteins that bind to the cell wall and sugar chains bound to the surface of the cell wall (that is, cell wall-pyruvate modification or (ii) expression of at least one of an SLH domain-retaining outer membrane protein and a cell wall-pyruvate modifying enzyme is inhibited. Therefore, the binding (that is, binding amount and binding strength) between the SLH domain of the SLH domain-retaining outer membrane protein in the outer membrane and the covalent sugar chain on the surface of the cell wall is reduced.
  • the modified cyanobacteria This makes it easier for the outer membrane to detach from the cell wall at the portion where the bond between the outer membrane and the cell wall is weakened.
  • the binding between the outer membrane and the cell wall is reduced, so that the outer membrane becomes easier to partially detach from the cell wall.
  • Substances produced in the cells are likely to leak out of the cells.
  • the modified cyanobacteria have improved secretion productivity for extracellularly secreting the plant acid invertase activating substance produced in the cells.
  • the modified cyanobacteria can be caused to efficiently secrete the plant acid invertase activator, so that the plant acid invertase activator can be produced.
  • the plant acid invertase activator containing can be efficiently produced.
  • the SLH domain-retaining outer membrane protein comprises Slr1841 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • NIES970_09470 consisting of NIES970_09470,
  • Anacy_3458 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, or any of these SLH domain-retaining outer membrane proteins with an amino acid sequence identical to 50% or more.
  • modified cyanobacteria for example, (i) any of the SLH domain-retaining outer membrane proteins shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 above, or any of these SLH domain-retaining outer membrane proteins and amino acid sequences 50% or more identical protein function is suppressed, or (ii) any SLH domain-retaining outer membrane protein shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 above or any of these SLH domain-retaining types The expression of proteins whose amino acid sequences are more than 50% identical to the outer membrane protein is suppressed.
  • the modified cyanobacterium (i) the function of the SLH domain-retaining outer membrane protein in the outer membrane or a protein having a function equivalent to the SLH domain-retaining outer membrane protein is suppressed, or (ii) the outer membrane The expression level of the SLH domain-retaining outer membrane protein or a protein having a function equivalent to the SLH domain-retaining outer membrane protein is decreased.
  • the binding domain for example, the SLH domain
  • the binding domain for binding the outer membrane to the cell wall has reduced binding amount and binding strength to the cell wall, so that the outer membrane partially detaches from the cell wall. easier.
  • the plant acid invertase activator produced in the modified cyanobacteria is easily secreted outside the cells, so that the plant An acid invertase activator can be efficiently produced.
  • the cell wall-pyruvate modifying enzyme comprises Slr0688 consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4, and the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 5.
  • Synpcc7942_1529, Anacy_1623 which consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, or a protein whose amino acid sequence is 50% or more identical to any of these cell wall-pyruvate modifying enzymes.
  • the modified cyanobacteria for example, (i) any of the cell wall-pyruvate modifying enzymes shown in SEQ ID NOS: 4 to 6 above, or any of these cell wall-pyruvate modifying enzymes and 50% of the amino acid sequence or (ii) any of the cell wall-pyruvate modifying enzymes shown in SEQ ID NOS: 4 to 6 above or any of these cell wall-pyruvate modifying enzymes
  • the expression of proteins with 50% or more amino acid sequence identity is suppressed.
  • the function of the cell wall-pyruvate modifying enzyme or a protein having a function equivalent to the enzyme is suppressed, or (ii) the function of the cell wall-pyruvate modifying enzyme or a protein equivalent to the enzyme is suppressed.
  • Expression levels of functional proteins are reduced.
  • the covalent sugar chains on the surface of the cell wall are less likely to be modified with pyruvic acid, so the binding amount and binding strength of the sugar chains on the cell wall to the SLH domain of the SLH domain-retaining outer membrane protein in the outer membrane is reduced.
  • the covalent sugar chains on the surface of the cell wall are less likely to be modified with pyruvate, which weakens the binding force between the cell wall and the outer membrane, making it easier for the outer membrane to partially detach from the cell wall.
  • pyruvate which weakens the binding force between the cell wall and the outer membrane, making it easier for the outer membrane to partially detach from the cell wall.
  • intracellularly-produced substances are more likely to leak out of the cells, and plant acid invertase-activating substances produced within the cells are also more likely to leak out of the cells.
  • the plant acid invertase activator produced in the modified cyanobacteria is easily secreted outside the cells, so that the plant An acid invertase activator can be efficiently produced.
  • a gene that expresses a protein involved in binding between the outer membrane and the cell wall may be deleted or inactivated.
  • the modified cyanobacteria As a result, in the modified cyanobacteria, the expression of a protein involved in the binding between the cell wall and the outer membrane is suppressed, or the function of the protein is suppressed. volume and binding strength) are partially reduced. As a result, in the modified cyanobacteria, the outer membrane tends to partially detach from the cell wall, so intracellularly produced substances such as proteins and metabolites produced in the cell are released outside the outer membrane, that is, outside the cell. Easier to leak. Therefore, the modified cyanobacterium has improved secretion productivity of the plant acid invertase activator produced in the cells.
  • the gene that expresses a protein involved in binding between the outer membrane and the cell wall is a gene encoding an SLH domain-retaining outer membrane protein, and at least one gene encoding a cell wall-pyruvate modifying enzyme.
  • the modified cyanobacteria at least one of the gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein and the gene encoding the cell wall-pyruvate modifying enzyme is deleted or inactivated. Therefore, in the modified cyanobacterium, for example, (i) expression of at least one of SLH domain-retaining outer membrane protein and cell wall-pyruvate modifying enzyme is suppressed, or (ii) SLH domain-retaining outer membrane protein and cell wall - at least one function of the pyruvate modifying enzyme is inhibited.
  • the binding that is, binding amount and binding strength
  • the binding between the outer membrane and the cell wall is reduced, making it easier for the outer membrane to partially detach from the cell wall. easier to do.
  • the modified cyanobacteria can be caused to efficiently secrete a plant acid invertase activator. It can be manufactured efficiently.
  • the gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein is slr1841 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 It may be nies970_09470 consisting of the nucleotide sequence shown, anacy_3458 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9, or a gene having a nucleotide sequence identical to any of these genes by 50% or more.
  • the modified cyanobacteria genes encoding any of the SLH domain-retaining outer membrane proteins shown in SEQ ID NOs: 7 to 9 above, or genes that are 50% or more identical to the nucleotide sequence of any of these genes is deleted or inactivated. Therefore, in the modified cyanobacteria, (i) the expression of any of the above SLH domain-retaining outer membrane proteins or proteins having functions equivalent to any of these proteins is suppressed, or (ii) the above The function of any SLH domain-retaining outer membrane protein or a protein having a function equivalent to any of these proteins is suppressed. As a result, in the modified cyanobacteria, the binding domain (e.g.
  • the plant acid invertase activator produced in the modified cyanobacteria is more likely to leak out of the cells. An acid invertase activator can be efficiently produced.
  • the gene encoding the cell wall-pyruvate modifying enzyme is represented by slr0688 and SEQ ID NO: 11 consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • synpcc7942_1529 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12, anacy_1623 consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12, or a gene having a nucleotide sequence identical to any of these genes by 50% or more.
  • the nucleotide sequence is 50% or more identical to the gene encoding any of the cell wall-pyruvate modifying enzymes shown in SEQ ID NOS: 10 to 12 above or the nucleotide sequence of the gene encoding any of these enzymes. is deleted or inactivated. Therefore, in the modified cyanobacterium, (i) the expression of any of the above cell wall-pyruvate modifying enzymes or proteins having functions equivalent to any of these enzymes is suppressed, or (ii) any of the above The function of any cell wall-pyruvate modifying enzyme or a protein having a function equivalent to any of these enzymes is inhibited.
  • the covalent sugar chains on the surface of the cell wall are less likely to be modified with pyruvic acid, so the binding amount and binding strength of the sugar chains on the cell wall to the SLH domain of the SLH domain-retaining outer membrane protein in the outer membrane is reduced.
  • the amount of pyruvic acid modification of the sugar chains that bind the cell wall to the outer membrane is reduced. becomes easier to leave.
  • the proteins and metabolites produced within the cells are likely to leak out of the cells, and the plant acid invertase activating substance produced within the cells is also likely to leak out of the cells.
  • the plant acid invertase activator produced in the modified cyanobacteria is more likely to leak out of the cells.
  • An acid invertase activator can be efficiently produced.
  • the plant acid invertase activator suppresses the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria to 30% or more and 70% or less of the total amount of the proteins in the parent strain. contains secretions of modified cyanobacteria that have been described.
  • the binding between the cell wall and the outer membrane (that is, the amount and strength of binding) is partially reduced, and the outer membrane partially detaches from the cell wall, without impairing the ability of the cells to proliferate. easier to release. Therefore, in modified cyanobacteria, proteins and metabolites produced within the cells (that is, substances produced within the cells) tend to leak out of the outer membrane (that is, out of the cells). This makes it easier for the modified cyanobacteria to extracellularly secrete the proteins and metabolites produced within the cells, thereby eliminating the need for extracting substances produced within the cells, such as by crushing the cells.
  • a plant acid invertase activator containing modified cyanobacterial secretions can be produced simply and efficiently.
  • the bioactivity and yield of the intracellularly produced substance are less likely to decrease. Therefore, among the intracellularly produced substances of the modified cyanobacteria, the substances involved in the activation of plant acid invertase (hereinafter also referred to as plant acid invertase activating substance) are less likely to have decreased physiological activity and decreased yield. This makes it possible to obtain a plant acid invertase activator with improved plant acid invertase activation effect. Therefore, the plant acid invertase activator according to one aspect of the present disclosure can effectively activate plant acid invertase.
  • the method for activating plant acid invertase uses the plant acid invertase activator for plants.
  • plant acid invertase is effectively activated by using a plant acid invertase activator with improved plant acid invertase activation effect in the plant.
  • each figure is not necessarily a strict illustration.
  • substantially the same configurations are denoted by the same reference numerals, and redundant description may be omitted or simplified.
  • the numerical range does not represent only a strict meaning, but includes a substantially equivalent range, such as measuring the amount of protein (eg, number or concentration, etc.) or its range.
  • both the fungal body and the cell represent a single cyanobacterial individual.
  • nucleotide sequences and amino acid sequences is calculated by the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) algorithm. Specifically, it is calculated by performing pairwise analysis with the BLAST program available on the website of NCBI (National Center for Biotechnology Information) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). be. Information on cyanobacterial genes and proteins encoded by the genes are published, for example, in the above-mentioned NCBI database and Cyanobase (http://genome.microbedb.jp/cyanobase/). From these databases, it is possible to obtain the amino acid sequences of the proteins of interest and the base sequences of the genes encoding those proteins.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the plant acid invertase activator contains secretions involved in the activation of plant acid invertase, and has the effect of activating plant acid invertase.
  • invertase is an enzyme that catabolizes sucrose into reducing sugars such as glucose and fructose in plants.
  • acid invertase contributes to the utilization of sucrose in plants and its catabolism to reducing sugar, a form of storage sugar. Therefore, the plant acid invertase activator according to the present embodiment can promote plant growth and accumulation of storage sugars in fruits and the like by activating plant acid invertase. becomes. Therefore, the plant acid invertase activator according to the present embodiment can efficiently promote the production of agricultural products, for example, by using them in agricultural products.
  • promoting the growth of plants means increasing the number of leaves, stems, buds, flowers, or fruits of plants, thickening the stems or trunks, and increasing the height.
  • promoting the growth of the plant the plant body and its fruit root increase, and the number of fruits increases.
  • plant acid invertase contributes to the control of plant diseases, the improvement of nutrient absorption, and the improvement of plant quality, such as increasing the sugar content of fruits. Therefore, plant acid invertase activators are effective for improving plant quality such as increased yield of crops, increased body weight of crops and fruits, high sugar content of fruits, reduction of physiological disorders, and reduction of diseases for multiple crop species. can be effectively improved.
  • plants include garden trees, flowering plants, lawns, roadside trees, etc., and forest trees that are rarely fertilized.
  • the plant acid invertase activator is such that the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria (hereinafter also referred to as binding-related proteins) is 30% of the total amount of the proteins in the parent strain.
  • binding-related proteins proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria
  • the total amount of the binding-related protein is suppressed to 30% of the total amount of the protein in the parent strain means that 70% of the total amount of the protein in the parent strain is lost and 30% remains.
  • the secretions include secretions involved in the activation of plant acid invertase.
  • the secretions contain proteins and metabolites produced within the cells of the modified cyanobacteria (that is, substances produced within the cells).
  • the intracellularly produced substance includes a substance involved in the activation of plant acid invertase (that is, a plant acid invertase activating substance).
  • Plant acid invertase activating substances include, for example, peptidases, nucleases, or organic matter-degrading enzymes such as phosphatase, DNA metabolism-related substances such as adenosine or guanosine, and nucleic acids such as p-aminobenzoic acid or spermidine (for example, DNA or RNA). They are intracellular molecules involved in promoting synthesis, ketone bodies such as 3-hydroxybutyric acid, or organic acids such as gluconic acid. The modified cyanobacterial secretion may be a mixture of these plant acid invertase activators.
  • FIG. 1 is a flow chart showing an example of a method for producing a plant acid invertase activator according to this embodiment.
  • the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria is suppressed to 30% or more and 70% or less of the total amount of the proteins in the parent strain. (step S01); and causing the modified cyanobacterium to secrete a secretion involved in the activation of plant acid invertase (step S02).
  • the modified cyanobacterial secretion contains proteins and metabolites produced within the modified cyanobacterium (that is, intracellular products). These intracellularly produced substances include substances involved in the activation of plant acid invertase (that is, plant acid invertase activating substances).
  • the modified cyanobacteria are prepared.
  • Preparing the modified cyanobacteria refers to adjusting the state of the modified cyanobacteria so that the modified cyanobacteria can secrete secretions.
  • Preparing a modified cyanobacterium may be, for example, genetically modifying a parent cyanobacterium (so-called parent strain) to produce a modified cyanobacterium, and microbial cells are prepared from a lyophilized modified cyanobacterium or a glycerol stock. It may be restoration, or recovery of the modified cyanobacteria that have finished secreting the plant acid invertase activating substance in step S02.
  • the modified cyanobacteria are made to secrete secretions that are involved in plant growth promotion.
  • the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria is suppressed to 30% or more and 70% or less of the total amount of the proteins in the parent strain.
  • the binding (eg, amount and strength of binding) between the cell wall and the outer membrane is partially reduced, and the outer membrane becomes easier to partially detach from the cell wall without impairing the proliferation ability. Therefore, proteins and metabolites produced within the cells are easily secreted outside the outer membrane (that is, outside the cells).
  • These intracellularly produced substances also include substances involved in the activation of plant acid invertase. Therefore, in step S02, by culturing the modified cyanobacteria under predetermined conditions, intracellularly produced substances involved in the activation of plant acid invertase are secreted outside the cells.
  • Cultivation of cyanobacteria can generally be carried out based on liquid culture using BG-11 medium (see Table 2) or a modified method thereof. Therefore, culture of modified cyanobacteria may be performed as well.
  • the cyanobacterial culture period for producing the plant acid invertase activator may be any period as long as it is possible to accumulate proteins and metabolites at high concentrations under conditions in which the cells are sufficiently grown. , 1 to 3 days, or 4 to 7 days.
  • the culture method may be, for example, aeration and stirring culture or shaking culture.
  • the modified cyanobacteria produce proteins and metabolites (i.e. intracellularly produced substances) within the cells and secrete the intracellularly produced substances into the culture medium.
  • the intracellularly produced substance includes an intracellularly produced substance (that is, a plant acid invertase activating substance) involved in the activation of plant acid invertase.
  • the culture solution is filtered or centrifuged to remove solids such as cells (i.e., bacterial cells) from the culture solution, and the culture supernatant is obtained. may be recovered.
  • a secretion containing an intracellularly produced substance (that is, a plant acid invertase activator) involved in the activation of plant acid invertase is modified cyano Since it is secreted extracellularly from bacteria, it is not necessary to disrupt the cells to recover the plant acid invertase activator. Therefore, the modified cyanobacteria remaining after recovery of the plant acid invertase activator can be repeatedly used to produce the plant acid invertase activator.
  • the method for collecting the plant acid invertase activating substance secreted into the culture medium is not limited to the above examples. good.
  • the plant acid invertase-activating substance that has permeated the permeable membrane may be recovered.
  • the plant acid invertase activating substance can be recovered from the culture solution while culturing the modified cyanobacteria, eliminating the need to remove the modified cyanobacteria from the culture solution. Therefore, the plant acid invertase activator can be produced more simply and efficiently.
  • the modified cyanobacteria it is possible to reduce the damage and stress received by the modified cyanobacteria by eliminating the need to collect the cells from the culture solution and crush the cells. Therefore, the secretion productivity of the plant acid invertase activator of the modified cyanobacterium is less likely to decrease, and the modified cyanobacterium can be used for a longer period of time.
  • a plant acid invertase activator can be obtained simply and efficiently by using the modified cyanobacteria of the present embodiment.
  • Cyanobacteria also called cyanobacteria or cyanobacteria, are a group of prokaryotic organisms that capture light energy with chlorophyll, electrolyze water with the energy obtained, and perform photosynthesis while generating oxygen. Cyanobacteria are rich in diversity, and in terms of cell shape, for example, there are unicellular species such as Synechocystis sp. PCC 6803 and filamentous species such as Anabaena sp. As for habitat, there are thermophilic species such as Thermosynechococcus elongatus, marine species such as Synechococcus elongatus, and freshwater species such as Synechocystis.
  • Microcystis aeruginosa which have gas vesicles and produce toxins
  • Gloeobacter violaceus which lacks thylakoids but have proteins called phycobilisomes, which are light-harvesting antennas in the plasma membrane, have unique characteristics. Many species are also included.
  • Fig. 2 is a diagram schematically showing the cell surface layer of cyanobacteria.
  • the cell surface layer of cyanobacteria is composed of, in order from the inside, a plasma membrane (also called inner membrane 1), peptidoglycan 2, and an outer membrane 5, which is a lipid membrane forming the outermost layer of the cell.
  • a plasma membrane also called inner membrane 1
  • peptidoglycan 2 and an outer membrane 5, which is a lipid membrane forming the outermost layer of the cell.
  • Sugar chains 3 composed of glucosamine, mannosamine, etc. are covalently bound to peptidoglycan 2, and pyruvic acid is bound to these covalently bound sugar chains 3 (Non-Patent Document 8: Jurgens and Weckesser, 1986, J. Bacteriol., 168:568-573).
  • the cell wall 4 including the peptidoglycan 2 and the covalent sugar chain 3 is referred to.
  • the gap between the plasma membrane (that is, the inner membrane 1) and the outer membrane 5 is called a periplasm, and the decomposition of proteins or the formation of three-dimensional structures, the decomposition of lipids or nucleic acids, or the uptake of extracellular nutrients, etc.
  • the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 (for example, Slr1841 in the figure) is composed of the C-terminal region embedded in the lipid membrane (also called outer membrane 5) and the N-terminal SLH domain 7 protruding from the lipid membrane. It is widely distributed in bacteria belonging to the Negativicutes class, which is a group of cyanobacteria and Gram-negative bacteria (Non-Patent Document 9: Kojima et al., 2016, Biosci.Biotech.Biochem., 10:1954-1959).
  • Non Patent Document 10 Kowata et al., 2017, J. Bacteriol., 199: e00371-17.
  • covalent sugar chain 3 in peptidoglycan 2 must be modified with pyruvate (Non-Patent Document 11: Kojima et al., 2016, J. Biol. Chem., 291:20198-20209).
  • Examples of genes encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 include slr1841 or slr1908 retained by Synechocystis sp. PCC 6803, and oprB retained by Anabaena sp.
  • cell wall-pyruvate modification enzyme 9 An enzyme that catalyzes the pyruvate modification reaction of the covalent sugar chain 3 in peptidoglycan 2 (hereinafter referred to as cell wall-pyruvate modification enzyme 9) was identified in the Gram-positive bacterium Bacillus anthracis and named CsaB.
  • Non-Patent Document 12 Mesnage et al., 2000, EMBO J., 19:4473-4484.
  • CsaB Non-Patent Document 12: Mesnage et al., 2000, EMBO J., 19:4473-4484.
  • cyanobacteria whose genome nucleotide sequences have been published, many species possess genes encoding homologous proteins having an amino acid sequence identity of 30% or more with CsaB. Examples include slr0688 held by Synechocystis sp. PCC 6803 and syn7502_03092 held by Synechococcus sp.
  • cyanobacteria photosynthetically fixed CO 2 is converted into precursors of various amino acids and intracellular molecules through multistep enzymatic reactions. Using them as raw materials, proteins and metabolites are synthesized in the cytoplasm of cyanobacteria. Some of these proteins and metabolites function within the cytoplasm, and others are transported from the cytoplasm to the periplasm and function within the periplasm. However, no cases of cyanobacteria that actively secrete proteins and metabolites outside the cell have been reported to date.
  • cyanobacteria Because cyanobacteria have high photosynthetic ability, they do not necessarily need to take in organic matter from the outside as nutrients. Therefore, cyanobacteria have very few channel proteins in the outer membrane 5 that allow permeation of organic matter, such as the organic matter channel protein 8 (eg, Slr1270) in FIG. For example, in Synechocystis sp. PCC 6803, organic matter channel protein 8, which allows organic matter to permeate, is present in only about 4% of the total protein content of outer membrane 5. On the other hand, cyanobacteria are permeable only to inorganic ions, such as SLH domain-retaining outer membrane protein 6 (e.g., Slr1841) in Fig.
  • inorganic ions such as SLH domain-retaining outer membrane protein 6 (e.g., Slr1841) in Fig.
  • the outer membrane 5 has many ion channel proteins that allow For example, in Synechocystis sp. PCC 6803, ion channel proteins permeable to inorganic ions account for approximately 80% of the total protein content of outer membrane 5 .
  • Non-Patent Document 6 and Non-Patent Document 7 disclose that deletion of the slr1841 gene or slr0688 gene, which is involved in the adhesion between the outer membrane and the cell wall and contributes to the structural stability of the cell surface layer, increases the cell proliferation ability. stated to be lost.
  • the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 in cyanobacteria is 30% or more and 70% or less of the total amount of the proteins in the parent strain.
  • binding-related proteins proteins involved in binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 in cyanobacteria
  • the total amount of the binding-related protein is suppressed to 30% of the total amount of the protein in the parent strain means that 70% of the total amount of the protein in the parent strain is lost and 30% remains.
  • the modified cyanobacteria has improved secretory productivity of intracellularly produced substances that secrete intracellularly produced proteins and metabolites extracellularly.
  • intracellularly produced substances include intracellularly produced substances involved in the activation of plant acid invertase (that is, plant acid invertase activating substances).
  • the modified cyanobacteria also improve the secretion productivity of the plant acid invertase activator, which secretes the plant acid invertase activator produced in the cell to the outside of the cell.
  • the modified cyanobacteria can be used repeatedly even after the plant acid invertase activator is recovered.
  • production means that the modified cyanobacteria produce proteins and metabolites inside the cells, and secretory production means that the produced proteins and metabolites are secreted outside the cells.
  • the protein involved in binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 may be at least one of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9, for example.
  • the function of at least one of SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 is suppressed.
  • SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be suppressed, and (ii) SLH domain-retaining protein that binds to cell wall 4
  • At least one of the expression of the outer membrane protein 6 and the expression of the enzyme that catalyzes the pyruvate modification reaction of the sugar chain bound on the surface of the cell wall 4 that is, the cell wall-pyruvate modification enzyme 9) may be suppressed.
  • the outer membrane 5 is easily detached from the cell wall 4 at the portion where these bonds are weakened.
  • intracellularly produced substances such as proteins and metabolites present in the cell of the modified cyanobacterium, particularly in the periplasm, are released outside the cell (outside the outer membrane 5). Easier to leak.
  • the modified cyanobacteria have improved secretion productivity for extracellularly secreting the plant acid invertase activating substance produced in the cells.
  • the outer membrane 5 is partially detached from the cell wall 4 by suppressing the function of at least one binding-related protein of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9.
  • cyanobacteria will be described more specifically.
  • a cyanobacterium before suppressing at least one of the expression of SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the expression of cell wall-pyruvate modifying enzyme 9, which is the parent microorganism of the modified cyanobacterium in this embodiment (herein , “parent strain” or “parent cyanobacteria”) is not particularly limited and may be any kind of cyanobacteria.
  • the parent cyanobacterium may be of the genera Synechocystis, Synechococcus, Anabaena, or Thermosynechococcus, among others Synechocystis sp. PCC 6803, Synechococcus sp.
  • Thermosynechococcus elongatus BP-1 good too.
  • the parent strain may be a wild cyanobacterium or a modified cyanobacterium that is equivalent to a wild cyanobacterium before suppressing the total amount of binding-related proteins to 30% or more and 70% or less. of binding-associated proteins.
  • the amino acid sequences of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the enzyme that catalyzes the cell wall-pyruvate modification reaction (that is, the cell wall-pyruvate modification enzyme 9) in these parent cyanobacteria, and the genes encoding these binding-related proteins The base sequence and the position of the gene on the chromosomal DNA or plasmid can be confirmed with the above-mentioned NCBI database and Cyanobase.
  • the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 whose functions are suppressed in the modified cyanobacterium according to the present embodiment can be used in any parent cyanobacterium as long as they are possessed by the parent cyanobacterium. and are not limited by the locations of the genes encoding them (for example, on chromosomal DNA or on plasmids).
  • the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be Slr1841, Slr1908, or Slr0042 when the parent cyanobacterium belongs to the genus Synechocystis, or may be NIES970_09470 when the parent cyanobacterium belongs to the genus Synechococcus. If the parent cyanobacteria belong to the genus Anabaena, it may be Anacy_5815 or Anacy_3458. If the parent cyanobacterium belongs to the genus Leptolyngbya, it may be A0A1Q8ZE23_9CYAN.
  • the parent cyanobacterium belongs to the genus Crocosphaera, it may be B1WRN6_CROS5 or the like, and if the parent cyanobacterium belongs to the genus Pleurocapsa, it may be K9TAE4_9CYAN or the like.
  • SLH domain-retaining outer membrane protein 6 is, for example, Synechocystis sp. PCC 6803 Slr1841 (SEQ ID NO: 1), Synechococcus sp. NIES-970 NIES970_09470 (SEQ ID NO: 2), or Anabaena cylindrica PCC 7122 Anacy_3458 (SEQ ID NO: 3) or the like. Also, proteins having 50% or more of the same amino acid sequence as these SLH domain-retaining outer membrane proteins 6 may be used.
  • modified cyanobacteria for example, (i) any SLH domain-retaining outer membrane protein 6 shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 above, or any of these SLH domain-retaining outer membrane proteins 6 and amino acids The function of the protein whose sequence is 50% or more identical may be suppressed, and (ii) any SLH domain-retaining outer membrane protein 6 shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 above or any of these SLHs The expression of a protein whose amino acid sequence is 50% or more identical to that of domain-retained outer membrane protein 6 may be suppressed.
  • the function of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 in the outer membrane 5 or a protein having a function equivalent to the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 is suppressed, or (ii) ) The expression level of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 in the outer membrane 5 or a protein having a function equivalent to that of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 is reduced.
  • the binding domain for example, SLH domain 7
  • the binding domain for binding the outer membrane 5 to the cell wall 4 reduces the amount and strength of binding to the cell wall 4. becomes easier to partially detach from
  • intracellularly produced substances easily leak out of the cells, so that plant acid invertase activating substances produced in the cells also easily leak out of the cells.
  • the amino acid sequences of a protein are 30% or more identical, there is a high degree of homology in the three-dimensional structure of the protein, and there is a high possibility that it will have the same function as the protein in question. Therefore, as the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 whose function is suppressed, for example, the amino acid sequence of any of the SLH domain-retaining outer membrane proteins 6 shown in the above SEQ ID NOs: 1 to 3, 40% or more, Consisting of an amino acid sequence having preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more identity, and sharing the cell wall 4 It may be a protein or polypeptide that has a function of binding to the conjugated sugar chain 3 .
  • the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be Slr0688 or the like when the parent cyanobacterium belongs to the genus Synechocystis, or may be Syn7502_03092 or Synpcc7942_1529 or the like when the parent cyanobacterium belongs to the genus Synechococcus. If the cyanobacteria belong to the genus Anabaena, it may be ANA_C20348 or Anacy_1623. If the parent cyanobacteria belongs to the genus Microcystis, it may be CsaB (NCBI access ID: TRU80220).
  • CsaB NCBI access ID: WP_107667006.1
  • parent cyanobacteria if the parent cyanobacteria is of the genus Spirulina, it may be CsaB (NCBI access ID: WP_026079530.1) or the like, and the parent cyanobacteria CsaB (NCBI access ID: WP_096658142.1), etc., if the parent cyanobacterium belongs to the genus Calothrix, and CsaB (NCBI access ID: WP_099068528.1), etc.
  • the parent cyanobacterium belongs to the genus Nostoc , If the parent cyanobacteria is the genus Crocosphaera, it may be CsaB (NCBI access ID: WP_012361697.1) or the like, and if the parent cyanobacteria is the genus Pleurocapsa, it may be CsaB (NCBI access ID: WP_036798735) or the like. good too.
  • the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 is, for example, Slr0688 (SEQ ID NO: 4) of Synechocystis sp. PCC 6803, Synpcc7942_1529 (SEQ ID NO: 5) of Synechococcus sp. Anacy_1623 (sequence number 6) etc. may be sufficient.
  • proteins having 50% or more of the same amino acid sequence as these cell wall-pyruvate modifying enzymes 9 may be used.
  • the function of proteins that are 50% or more identical may be suppressed
  • any cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 shown in SEQ ID NOS: 4-6 above or any of these cell wall-pyruvate The expression of a protein whose amino acid sequence is 50% or more identical to that of modifying enzyme 9 may be suppressed.
  • the function of the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 or a protein having a function equivalent to the enzyme is suppressed, or (ii) the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 or the enzyme Expression levels of proteins with equivalent functions are reduced.
  • the covalent sugar chains 3 on the surface of the cell wall 4 are less likely to be modified with pyruvic acid. 5 becomes easier to partially detach from the cell wall 4.
  • intracellularly produced substances easily leak out of the cells, so that plant acid invertase activating substances produced in the cells also easily leak out of the cells.
  • the amino acid sequences of proteins are 30% or more identical, they are likely to have functions equivalent to those of the protein. Therefore, as the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 whose function is suppressed, for example, the amino acid sequence of any of the cell wall-pyruvate modifying enzymes 9 shown in the above SEQ ID NOs: 4 to 6 and 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more of amino acid sequence identity, and peptidoglycan 2 of cell wall 4 It may be a protein or polypeptide having a function of catalyzing the reaction of modifying the covalent sugar chain 3 with pyruvate.
  • suppressing the function of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 means suppressing the ability of the protein to bind to the cell wall 4, suppressing the transport of the protein to the outer membrane 5, Alternatively, it is to suppress the ability of the protein to function embedded in the outer membrane 5 .
  • suppressing the function of the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 means suppressing the function of the protein to modify the covalently bound sugar chain 3 of the cell wall 4 with pyruvate.
  • Means for suppressing the functions of these proteins are not particularly limited as long as they are means commonly used for suppressing protein functions.
  • the means include, for example, deleting or inactivating the gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9, inhibiting transcription of these genes, Inhibition of translation of transcription products of these genes, or administration of inhibitors that specifically inhibit these proteins may be used.
  • the modified cyanobacteria are composed of the outer membrane 5 and the cell wall 4, and as a result, expression of proteins involved in binding between the cell wall 4 and the outer membrane 5 is suppressed in the modified cyanobacteria. Since the function of the protein is suppressed, the binding (that is, binding amount and binding strength) between the cell wall 4 and the outer membrane 5 is partially reduced. As a result, in the modified cyanobacteria, the outer membrane 5 is likely to partially detach from the cell wall 4, so that the outer membrane 5 of the modified cyanobacteria is free from intracellularly produced substances such as proteins and metabolites produced in the cells. It becomes easy to leak out to the outside, that is, to the outside of the bacterial body.
  • the modified cyanobacterium has improved secretory productivity of the plant acid invertase activator, which is produced in the cell and secretes the plant acid invertase activator outside the cell.
  • the modified cyanobacteria can be repeatedly used to produce the plant acid invertase activating substance even after the substance is recovered.
  • the gene that expresses the protein involved in binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 is, for example, at least one of the gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the gene encoding the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9. There may be. In the modified cyanobacterium, at least one of the gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 is deleted or inactivated.
  • modified cyanobacteria for example, (i) expression of at least one of SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 is suppressed, or (ii) SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and at least one function of cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 are inhibited. Therefore, the binding (that is, binding amount and binding force) between the SLH domain 7 of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 in the outer membrane 5 and the covalently bound sugar chain 3 on the surface of the cell wall 4 is reduced. This makes it easier for the outer membrane 5 to detach from the cell wall 4 at the portion where the bond between the outer membrane 5 and the cell wall 4 is weakened.
  • the outer membrane 5 becomes easier to partially detach from the cell wall 4, so that proteins and metabolites produced in the bacterium are released into the bacterium. It easily leaks out of the body. As a result, the plant acid invertase activating substance produced inside the modified cyanobacteria is also likely to leak out of the cells.
  • a gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and at least one transcription of the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be repressed.
  • the gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 may be slr1841, slr1908, or slr0042 when the parent cyanobacterium belongs to the genus Synechocystis, or nies970_09470 when it belongs to the genus Synechococcus. If the parent cyanobacteria belong to the genus Anabaena, it may be anacy_5815 or anacy_3458.If the parent cyanobacteria belong to the genus Microcystis, it may be A0A0F6U6F8_MICAE.
  • the parent cyanobacterium belongs to the genus Leptolyngbya, it may be A0A1Q8ZE23_9CYAN, etc. If the parent cyanobacteria belongs to the genus Calothrix, it may be A0A1Z4R6U0_9CYAN, etc. If the parent cyanobacteria belongs to the genus Nostoc, it may be A0A1C0VG86_9NOSO, etc.
  • the parent cyanobacterium belongs to the genus Crocosphaera, it may be B1WRN6_CROS5 or the like, and if the parent cyanobacterium belongs to the genus Pleurocapsa, it may be K9TAE4_9CYAN or the like.
  • the nucleotide sequences of these genes can be obtained from the NCBI database or Cyanobase mentioned above.
  • the gene encoding SLH domain-retaining outer membrane protein 6 is Synechocystis sp. PCC 6803 slr1841 (SEQ ID NO: 7), Synechococcus sp. NIES-970 nies970_09470 (SEQ ID NO: 8), Anabaena cylindrica PCC 7122 anacy_3458 (SEQ ID NO: 9), or genes whose amino acid sequences are 50% or more identical to these genes.
  • the nucleotide sequence is 50% or more identical to the gene encoding any of the SLH domain-retaining outer membrane proteins 6 shown in SEQ ID NOs: 7 to 9 above, or any of these genes. Genes are deleted or inactivated. Therefore, in the modified cyanobacteria, (i) the expression of any of the above SLH domain-retaining outer membrane protein 6 or a protein having a function equivalent to any of these proteins is suppressed, or (ii) the above The function of any SLH domain-retaining outer membrane protein 6 or a protein having a function equivalent to any of these proteins is suppressed.
  • the binding domain for example, SLH domain 7
  • the binding domain for example, SLH domain 7
  • the proteins and metabolites produced within the cells are likely to leak out of the cells, and the plant acid invertase activating substance produced within the cells is also likely to leak out of the cells.
  • any of the genes encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 shown in the above SEQ ID NOs: 7 to 9 A base sequence having 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more identity with the base sequence It may be a gene that encodes a protein or polypeptide that has a function of binding to the covalently-linked sugar chain 3 on the cell wall 4 .
  • the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 may be slr0688 or the like when the parent cyanobacterium belongs to the genus Synechocystis, or syn7502_03092 or synpcc7942_1529 or the like when the parent cyanobacterium belongs to the genus Synechococcus. If the parent cyanobacteria is the genus Anabaena, it may be ana_C20348 or anacy_1623. If the parent cyanobacteria is the genus Microcystis, it may be csaB(NCBI access ID: TRU80220).
  • the parent cyanobacterium belongs to the genus Cynahothese, it may be csaB (NCBI access ID: WP_107667006.1).
  • the parent cyanobacteria is the genus Calothrix, it may be csaB (NCBI access ID: WP_096658142.1), etc.
  • the parent cyanobacteria is the genus Nostoc, csaB (NCBI access ID: WP_099068528.1), etc.
  • csaB NCBI access ID: WP_012361697.1
  • csaB NCBI access ID: WP_036798735
  • the parent cyanobacteria is the genus Pleurocapsa etc.
  • the nucleotide sequences of these genes can be obtained from the NCBI database or Cyanobase mentioned above.
  • the gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 is slr0688 (SEQ ID NO: 10) of Synechocystis sp. PCC 6803, synpcc7942_1529 (SEQ ID NO: 11) of Synechococcus sp. PCC 7942, or Anabaena cylindrica PCC 7122 anacy_1623 (SEQ ID NO: 12).
  • genes whose base sequences are 50% or more identical to these genes may also be used.
  • the modified cyanobacteria 50% or more of the base sequence of the gene encoding any of the cell wall-pyruvate modifying enzymes 9 shown in the above SEQ ID NOs: 10 to 12 or the genes encoding any of these enzymes Identical genes are deleted or inactivated. Therefore, in the modified cyanobacteria, (i) the expression of any of the above cell wall-pyruvate modifying enzymes 9 or proteins having functions equivalent to any of these enzymes is suppressed, or (ii) the above The function of any cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 or a protein having a function equivalent to any of these enzymes is inhibited.
  • the base sequences of genes encoding proteins are 30% or more identical, it is highly likely that a protein with a function equivalent to that of the protein will be expressed. Therefore, as a gene encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 whose function is suppressed, for example, the base sequence of any of the genes encoding cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 shown in SEQ ID NOs: 10 to 12 above and 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, consisting of a base sequence having an identity, Moreover, it may be a gene encoding a protein or polypeptide having a function of catalyzing a reaction in which the covalent sugar chain 3 of the peptidoglycan 2 on the cell wall 4 is modified with pyruvic acid.
  • the method for producing modified cyanobacteria includes a step of suppressing the total amount of proteins involved in binding between outer membrane 5 and cell wall 4 in cyanobacteria to 30% or more and 70% or less of the total amount of the proteins in the parent strain.
  • the protein involved in binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 may be at least one of the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9, for example.
  • the means for suppressing the function of the protein is not particularly limited, but for example, deletion or inactivation of the gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein 6 and the gene encoding the cell wall-pyruvate modifying enzyme 9 inhibiting transcription of these genes, inhibiting translation of transcription products of these genes, or administering inhibitors that specifically inhibit these proteins.
  • Means for deleting or inactivating the gene include, for example, introduction of mutations to one or more bases on the base sequence of the gene, substitution of the base sequence with other base sequences, or modification of other base sequences. It may be insertion or deletion of part or all of the nucleotide sequence of the gene.
  • Means for inhibiting the transcription of the gene include, for example, mutagenesis of the promoter region of the gene, inactivation of the promoter by substitution with another base sequence or insertion of another base sequence, or CRISPR interference method (non- Patent Document 13: Yao et al., ACS Synth. Biol., 2016, 5:207-212).
  • Specific techniques for the introduction of mutation or substitution or insertion of base sequences may be, for example, UV irradiation, site-directed mutagenesis, homologous recombination, or the like.
  • the means for inhibiting translation of the transcription product of the gene may be, for example, RNA interference method.
  • a modified cyanobacterium may be produced by suppressing the function of a protein involved in binding between the outer membrane 5 and the cell wall 4 in cyanobacteria by using any of the above means.
  • the binding that is, binding amount and binding force
  • the binding that is, binding amount and binding force
  • the outer membrane 5 is partially removed from the cell wall 4. easily detached.
  • intracellularly produced substances such as proteins and metabolites produced in the cells are likely to leak out of the outer membrane 5 (that is, out of the cells).
  • Substances involved in the activation of that is, plant acid invertase activating substances
  • the plant acid invertase activating substance produced in the cells leaks out of the cells, so the cells are crushed to recover the substance. you don't have to.
  • the modified cyanobacteria are cultured under appropriate conditions, and then the plant acid invertase activating substance secreted into the culture medium can be recovered. It is also possible to recover the material. Therefore, by using the modified cyanobacterium obtained by the present production method, it is possible to efficiently produce a microbiological plant acid invertase activating substance. Therefore, according to the method for producing a modified cyanobacterium according to the present embodiment, it is possible to provide a modified cyanobacterium with high utilization efficiency that can be repeatedly used even after the plant acid invertase activator is recovered.
  • the method for activating plant acid invertase according to the present embodiment uses the plant acid invertase activator described above for a plant.
  • the plant acid invertase activator according to the present embodiment is a plant acid invertase activator having a plant acid invertase activating effect.
  • plant acid invertase can be effectively activated.
  • the above plant acid invertase activator may be used as it is, or after being concentrated or diluted.
  • concentration of the plant acid invertase activator and the application method are appropriately adjusted according to the type of plant, the nature of the soil, the purpose, etc. may decide.
  • the plant acid invertase activator may be, for example, the culture medium of the modified cyanobacteria itself, or a solution obtained by removing the cells of the modified cyanobacteria from the culture medium. may be an extract obtained by extracting by membrane technology or the like.
  • the desired substance may be an enzyme that decomposes nutrients in the soil, or a substance that solubilizes insoluble substances in the soil (e.g., metals such as iron) (e.g., a substance that has a chelating effect).
  • a substance that has a chelating effect e.g., it may be a substance that improves the intracellular physiological activity of plants.
  • the method of applying the plant acid invertase activator to the plant may be, for example, spraying the plant, spraying the soil, watering or mixing, or mixing in hydroponic solution. For example, several milliliters of the plant acid invertase activator per individual plant may be added to the root of the plant about once a week.
  • the modified cyanobacteria the method for producing the modified cyanobacteria, and the method for producing the plant acid invertase activator of the present disclosure will be specifically described in Examples, but the present disclosure is in no way limited only to the following Examples. not a thing
  • cyanobacteria As a method for partially detaching the outer membrane of cyanobacteria from the cell wall, expression suppression of the slr1841 gene encoding an SLH domain-retaining outer membrane protein (Example 1) and cell wall-pyruvic acid modification Expression of the slr0688 gene encoding the enzyme was suppressed (Example 2) to produce two types of modified cyanobacteria. Then, the protein secretion productivity of these modified cyanobacteria was measured, and the secreted intracellular substances (here, proteins and intracellular metabolites) were identified.
  • the cyanobacterial species used in this example is Synechocystis sp. PCC 6803 (hereinafter simply referred to as "cyanobacteria").
  • Example 1 a modified cyanobacterium was produced in which the expression of the slr1841 gene, which encodes an SLH domain-retaining outer membrane protein, was suppressed.
  • the mechanism of gene expression suppression by this method is as follows.
  • a complex is formed between the nuclease-deficient Cas9 protein (dCas9) and the sgRNA (slr1841_sgRNA) that complementarily binds to the base sequence of the slr1841 gene.
  • dCas9 nuclease-deficient Cas9 protein
  • slr1841_sgRNA sgRNA
  • this complex recognizes the slr1841 gene on the cyanobacterial chromosomal DNA and binds specifically to the slr1841 gene.
  • the steric hindrance of this binding inhibits transcription of the slr1841 gene.
  • the expression of the cyanobacterial slr1841 gene is suppressed.
  • the degree of suppression of the slr1841 gene can be controlled by controlling the transcriptional activity of slr1841_sgRNA.
  • psbA1::dCas9 cassette The psbA1::dCas9 cassette was inserted into the pUC19 plasmid using the In-Fusion PCR Cloning Method®, resulting in the pUC19-dCas9 plasmid.
  • sgRNA specifically binds to the target gene by introducing a sequence of about 20 bases complementary to the target sequence into the region called protospacer on the sgRNA gene. do.
  • the protospacer sequences used in this example are shown in Table 3.
  • the sgRNA gene (excluding the protospacer region) and the kanamycin resistance marker gene are linked and inserted into the slr2030-slr2031 gene on the chromosomal DNA (non-patent document 13). Therefore, the sgRNA (slr1841_sgRNA ) can be easily obtained. In addition, the degree of suppression of the slr1841 gene can be controlled by controlling the transcriptional activity of slr1841_sgRNA.
  • the primers slr2030-Fw (SEQ ID NO: 15) and slr2031-Rv (SEQ ID NO: 18) listed in Table 1 were used for amplification by PCR, resulting in ( A DNA fragment (slr2030-2031::slr1841_sgRNA) was obtained in which i) the slr2030 gene fragment, (ii) slr1841_sgRNA, (iii) the kanamycin resistance marker gene, and (iv) the slr2031 gene fragment were linked in this order.
  • the slr2030-2031::slr1841_sgRNA was inserted into the pUC19 plasmid using the In-Fusion PCR Cloning Method® to obtain the pUC19-slr1841_sgRNA plasmid.
  • the pUC19-slr1841_sgRNA plasmid was introduced into the Synechocystis dCas9 strain in the same manner as in (1-1) above, and the transformed cells were selected on BG-11 agar medium containing 30 ⁇ g/mL kanamycin.
  • a transformant Synechocystis dCas9 slr1841_sgRNA strain (hereinafter also referred to as slr1841 suppressor strain) in which slr1841_sgRNA was inserted into the slr2030-slr2031 gene on the chromosomal DNA was obtained.
  • the promoter sequences of the dCas9 gene and slr1841_sgRNA gene are designed so that their expression is induced in the presence of anhydrotetracycline (aTc).
  • aTc anhydrotetracycline
  • the expression of the slr1841 gene was suppressed by adding a final concentration of 1 ⁇ g/mL aTc to the medium.
  • Example 1 the total amount of proteins involved in the binding between the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria was reduced from the parent strain (Synechocystis dCas9 strain, Comparative Example 1 described later) to ), a modified cyanobacterial Synechocystis dCas9 slr1841_sgRNA strain (so-called slr1841-suppressing strain) was obtained, which was suppressed by about 30% compared to the amount of the protein in ).
  • the proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall are slr1841, slr1908 and slr0042. The results of measuring the amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall will be described later in (8-1).
  • Example 2 a modified cyanobacterium in which the expression of the slr0688 gene encoding a cell wall-pyruvate modifying enzyme was suppressed was obtained by the following procedure.
  • the set of primers slr2030-Fw (SEQ ID NO: 15) and sgRNA_slr0688-Rv (SEQ ID NO: 19) and the set of sgRNA_slr0688-Fw (SEQ ID NO: 20) and slr2031-Rv (SEQ ID NO: 18) described in Table 1 were used.
  • In-Fusion PCR was performed on a DNA fragment (slr2030-2031::slr0688_sgRNA) in which (i) the slr2030 gene fragment, (ii) slr0688_sgRNA, (iii) the kanamycin resistance marker gene, and (iv) the slr2031 gene fragment were linked in order.
  • the procedure was performed under the same conditions as in (1-2) above, except that it was inserted into the pUC19 plasmid using the cloning method (registered trademark) to obtain the pUC19-slr0688_sgRNA plasmid.
  • the degree of suppression of the slr0688 gene can be controlled by controlling the transcriptional activity of slr0688_sgRNA.
  • Example 2 the amount of the protein involved in the binding of the outer membrane and the cell wall in cyanobacteria increased without impairing the growth ability of the parent strain (Synechocystis dCas9 strain, Comparative Example 1 described later). ), a modified cyanobacterial Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA strain (hereinafter also referred to as slr0688-suppressed strain) was obtained, which was suppressed to about 50%.
  • the protein involved in binding between the outer membrane and the cell wall is slr0688.
  • the results of measuring the amount of pyruvic acid which is related to the amount of protein involved in binding between the outer membrane and the cell wall, will be described later in (8-4).
  • Example 3 (3-1) Cultivation of strain
  • the slr1841-suppressed strain of Example 1 was inoculated into BG-11 medium containing 1 ⁇ g/mL aTc so that the initial cell concentration OD730 was 0.05, and the light intensity was 100 ⁇ mol/m 2 /s. , shaking culture for 5 days at 30°C.
  • the slr0688-suppressed strain of Example 2 and the control strain of Comparative Example 1 were also cultured under the same conditions as in Example 1.
  • FIG. 3 is a TEM (Transmission Electron Microscope) image of the slr1841-suppressed strain of Example 1.
  • FIG. 4 is an enlarged image of the dashed line area A in FIG.
  • FIG. 4(a) is an enlarged TEM image of the dashed line area A in FIG. 3
  • FIG. 4(b) depicts the enlarged TEM image of FIG. 4(a).
  • the outer membrane was partially detached from the cell wall (that is, the outer membrane was partially peeled off) and the outer membrane was partially flexed. board.
  • FIG. 5 is a TEM image of the slr0688-suppressed strain of Example 2.
  • FIG. 6 is an enlarged image of the dashed line area B in FIG.
  • FIG. 6(a) is an enlarged TEM image of the dashed line area B in FIG. 5
  • FIG. 6(b) is a drawing depicting the enlarged TEM image of FIG. 6(a).
  • FIG. 7 is a TEM image of the Control strain of Comparative Example 1.
  • FIG. 8 is an enlarged image of the dashed line area C in FIG.
  • FIG. 8(a) is an enlarged TEM image of the dashed line area C in FIG. 7
  • FIG. 8(b) is a drawing depicting the enlarged TEM image of FIG. 8(a).
  • the cell surface layer of the Control strain of Comparative Example 1 was well-ordered, and the inner membrane, cell wall, outer membrane, and S layer were stacked in order.
  • the portion where the outer membrane detached from the cell wall as in Examples 1 and 2 the portion where the outer membrane detached from the cell wall (that is, peeled off), and the portion where the outer membrane flexed was not seen.
  • the slr1841-suppressed strain of Example 1, the slr0688-suppressed strain of Example 2, and the Control strain of Comparative Example 1 were cultured, respectively, and the amount of extracellularly secreted protein (hereinafter referred to as secretion (also referred to as protein content) was measured.
  • secretion also referred to as protein content
  • the protein secretion productivity of each of the above strains was evaluated based on the amount of protein in the culture medium.
  • the protein secretion productivity refers to the ability to produce a protein by secreting the protein produced in the cell to the outside of the cell. A specific method will be described below.
  • Example 1 Culture of strain The slr1841-suppressed strain of Example 1 was cultured in the same manner as in (3-1) above. Culturing was performed three times independently. The strains of Example 2 and Comparative Example 1 were also cultured under the same conditions as the strain of Example 1.
  • both the slr1841-suppressed strain of Example 1 and the slr0688-suppressed strain of Example 2 compared the amount of protein secreted into the culture supernatant (mg/ L) was about 25 times better.
  • the absorbance (730 nm) of the culture solution was measured, and the amount of secreted protein per 1 g of bacterial cell dry weight (mg protein/g cell dry weight) was calculated. and the slr0688-suppressed strain of Example 2, the amount of secreted protein per 1 g of cell dry weight (mg protein/g cell dry weight) was improved by about 36 times compared to the Control strain of Comparative Example 1. rice field.
  • the gene encoding the cell wall-pyruvate modifying enzyme (slr1841) was more likely than the slr1841-suppressed strain of Example 1 in which the expression of the gene encoding the SLH domain-retaining outer membrane protein (slr1841) was suppressed.
  • slr0688 expression was suppressed, the slr0688-suppressed strain of Example 2 had a larger amount of protein secreted into the culture supernatant. This is thought to be related to the fact that the number of covalent sugar chains on the cell wall surface is greater than the number of SLH domain-retaining outer membrane protein (Slr1841) in the outer membrane.
  • the slr0688-suppressed strain of Example 2 had a lower binding amount and binding force between the outer membrane and the cell wall than the slr1841-suppressed strain of Example 1, so the amount of secreted protein was reduced to that of the slr1841-suppressed strain of Example 1. Presumably more than stocks.
  • IAA iodoacetamide
  • cysteine was added at a final concentration of 60 mM, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
  • 400 ng of trypsin was added and allowed to stand overnight at 37° C. to fragment the protein into peptides.
  • TFA Trifluoroacetic Acid
  • the sample was dried using a centrifugal evaporator. After that, 3% acetonitrile and 0.1% formic acid were added, and the sample was dissolved using a closed ultrasonic crusher. A peptide concentration of 200 ng/ ⁇ L was prepared.
  • Table 4 shows the 30 proteins with the highest relative quantification values among the identified proteins that are expected to have clear enzymatic activity.
  • Example 3 After aligning the individual size of each pot as described above, 5 mL of culture supernatant of modified cyanobacteria (hereinafter referred to as secretion of modified cyanobacteria) per strain is added to the roots of spinach once a week. added. After cultivating for 40 days, the dry weight of the aboveground part was measured after harvesting, and the average value and standard deviation (SD) were obtained. In addition, the acid invertase activity was measured by the method shown below, and the average value and standard deviation (SD) were determined.
  • the modified cyanobacteria are the slr1841-suppressed strain of Example 1 and the slr0688-suppressed strain of Example 2.
  • the extraction buffer consists of the following composition.
  • HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)-KOH pH7.4
  • MgCl2 1mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)
  • EGTA ethyleneglycol-bis( ⁇ -aminoehylether)-tetraacetic acid
  • PMSF phenmethylsulphonyl-fluoride
  • DTT dithiothreitol
  • Triton X-100 200 mL/L glycerol 5mM thiourea
  • Example 3 was repeated except that water was used instead of the secretion of the modified cyanobacteria.
  • FIGS. 10 and 11 The results of Example 3 and Comparative Example 2 are shown in FIGS. 10 and 11.
  • FIG. 10 is a graph showing average values of acid invertase activity of spinach cultivated in Example 3 and Comparative Example 2.
  • FIG. 11 is a graph showing the average dry weight of above-ground parts (referred to as average plant weight) per spinach plant cultivated in Example 3 and Comparative Example 2.
  • FIG. 10 is a graph showing average values of acid invertase activity of spinach cultivated in Example 3 and Comparative Example 2.
  • FIG. 11 is a graph showing the average dry weight of above-ground parts (referred to as average plant weight) per spinach plant cultivated in Example 3 and Comparative Example 2.
  • FIG. 10 is a graph showing average values of acid invertase activity of spinach cultivated in Example 3 and Comparative Example 2.
  • FIG. 11 is a graph showing the average dry weight of above-ground parts (referred to as average plant weight) per spinach plant cultivated in Example 3 and Comparative Example 2.
  • the acid invertase activity of the spinach cultivated in Example 3 was approximately 2.3 times higher than that of Comparative Example 2.
  • the strain weight of the spinach cultivated in Example 3 increased by about 1.4 times compared to Comparative Example 1.
  • the acid invertase of the spinach is activated, and the activation of the acid invertase promotes the growth of spinach and increases the body weight. confirmed.
  • Example 4 During the cultivation period, 5 mL of modified cyanobacterial secretion per strain was added to the roots once a week. Strawberry fruits were harvested in order from red and mature ones, and the number of harvested fruits was recorded. Also, the weight and sugar content (Brix value) of the harvested fruit were measured, and their average value and standard deviation (SD) were determined. In addition, acid invertase activity was measured in the same manner as in Example 3, except that several fruits were used. Here, the amount of glucose produced by 1 g of fruit in 1 hour is defined as acid invertase activity.
  • the modified cyanobacteria are the slr1841-suppressed strain of Example 1 and the slr0688-suppressed strain of Example 2.
  • Example 4 Example 4 was repeated except that water was used instead of the secretion of the modified cyanobacteria.
  • FIGS. 12 to 16 The results of Example 4 and Comparative Example 3 are shown in FIGS. 12 to 16.
  • FIG. 12 is a graph showing average values of acid invertase activity of strawberries cultivated in Example 4 and Comparative Example 3.
  • FIG. 13 is a graph showing the average number of fruits per strawberry cultivated in Example 4 and Comparative Example 3.
  • FIG. 14 is a graph showing the average fruit weight per strawberry cultivated in Example 4 and Comparative Example 3.
  • FIG. 15 is a graph showing the average sugar content per strawberry cultivated in Example 4 and Comparative Example 3.
  • FIG. 12 is a graph showing average values of acid invertase activity of strawberries cultivated in Example 4 and Comparative Example 3.
  • FIG. 13 is a graph showing the average number of fruits per strawberry cultivated in Example 4 and Comparative Example 3.
  • FIG. 14 is a graph showing the average fruit weight per strawberry cultivated in Example 4 and Comparative Example 3.
  • FIG. 15 is a graph showing the average sugar content per strawberry cultivated in Example 4 and Comparative Example 3.
  • FIG. 12 is
  • FIG. 16 shows photographs of representative fruits in order to visually show the state of the fruits in Example 4 and Comparative Example 3.
  • the phytoacid invertase activity of strawberries cultivated in Example 3 was approximately 2.3 times higher than in Comparative Example 1.
  • Example 4 the average number of fruits per plant harvested in Example 4 increased by about 1.4 times compared to Comparative Example 3.
  • Example 4 there was no significant difference in the average fruit weight of the strawberries harvested in Example 4.
  • the strawberries cultivated in Example 4 had an average fruit weight equivalent to that of Comparative Example 3, although the number of fruits harvested per strain was large.
  • the average sugar content (Brix sugar content) of the strawberries harvested in Example 4 was about 1.1 times higher than in Comparative Example 3.
  • the strawberries cultivated in Example 4 had a high average sugar content, although the number of harvested fruits was large.
  • the strawberry fruits harvested in Example 4 and Comparative Example 3 did not differ in appearance such as size, shape, and color.
  • the strawberries cultivated in Example 4 were similar in fruit size and the like to those in Comparative Example 3, although the number of fruits harvested was large.
  • the plant acid invertase activator promotes growth, increases yield, increases body weight, and improves the sugar content of fruits for a plurality of crop species. It was confirmed that there was an effect such as an increase.
  • Comparative Example 4 a modified cyanobacterium lacking slr1908 (hereinafter also referred to as slr1908-deficient strain) was obtained based on the description in Non-Patent Document 6.
  • Comparative Example 5 a modified cyanobacterium lacking slr0042 (hereinafter also referred to as slr0042-deficient strain) was obtained based on the description in Non-Patent Document 7.
  • FIG. 17 shows the results of electrophoresis showing the respective amounts of proteins (slr1841, slr1908, and slr0042) involved in binding to the cell wall.
  • FIG. 17(a) is an electropherogram showing the amounts of proteins involved in the binding between the outer membrane and the cell wall in the modified cyanobacteria of Example 1, Example 2, Comparative Example 1, Comparative Example 4, and Comparative Example 5. be.
  • FIG. 17(b) is an enlarged view of the dashed line area Z.
  • FIG. The band intensity (darkness and thickness) in the electrophoretic photographs shown in FIGS. 17(a) and 17(b) represents the amount of each protein.
  • A is a molecular weight marker
  • B is an electrophoretic image of Comparative Example 1
  • C is Comparative Example 10
  • D is Example 1
  • E is an electrophoretic image of Comparative Example 9.
  • Band intensities were quantified using ImageJ software.
  • the slr1841-suppressed strain of Example 1 showed that the total amount of proteins involved in binding between the outer membrane and the cell wall (slr1841, slr1908, and slr0042) was lower than that of the parent strain due to suppression of slr1841 protein expression. It is reduced to about 30% compared to the Control strain of Comparative Example 1.
  • the amount of slr1841 protein is increased.
  • the total amount is increased by about 10% compared to the Control strain of Comparative Example 1, which is the parent strain.
  • the phenomenon that loss of any one outer membrane protein results in an increase in another similar outer membrane protein is a common phenomenon in other bacteria.
  • FIG. 18 is a transmission electron microscope image of an ultra-thin section of the modified cyanobacteria of Comparative Example 4.
  • FIG. 19 is an enlarged view of the dashed line area D in FIG. 18.
  • FIG. 18 and 19 the cell surface layer of the slr1908-deficient strain of Comparative Example 4 was well-ordered, and the inner membrane, cell wall, outer membrane, and S layer were laminated in order. That is, the outer membrane structure of the slr1908-deficient strain of Comparative Example 4 was almost the same as that of the Control strain of Comparative Example 1, which is the parent strain.
  • FIG. 20 is a transmission electron microscope image of an ultra-thin section of the modified cyanobacteria of Comparative Example 5.
  • FIG. 21 is an enlarged view of the dashed line area E in FIG. 20.
  • the cell surface layer of the slr0042-deficient strain of Comparative Example 5 was well-ordered, and the inner membrane, cell wall, outer membrane, and S layer were laminated in order. That is, the outer membrane structure of the slr0042-deficient strain of Comparative Example 5 was almost the same as that of the Control strain of Comparative Example 1, which is the parent strain.
  • FIG. 22 is a graph showing the amount of protein in the culture medium of the modified cyanobacteria of Examples 1, 2, Comparative Examples 1, 4 and 5.
  • FIG. 22 As shown in FIG. 22, the slr1841-suppressed strain of Example 1 and the slr0688-suppressed strain of Example 2 secrete and produce a large amount of protein in the culture medium. and the slr0042-deficient strain of Comparative Example 5 did not secrete and produce proteins in the culture medium.
  • FIG. 18 shows the results of quantification of the amount of pyruvic acid.
  • 23 is a graph showing amounts of pyruvic acid covalently bound to cell wall-bound sugar chains of modified cyanobacteria of Example 2 and Comparative Example 1.
  • the slr0688-suppressed strain of Example 2 had a reduced amount of pyruvic acid of about 50% compared to the Control strain of Comparative Example 1, which is the parent strain. From this, it is considered that the amount of the cell wall-pyruvate modifying enzyme, which is a protein involved in binding between the outer membrane and the cell wall, is also suppressed to about 50% of that in the parent strain.
  • the present disclosure it is possible to provide a modified cyanobacterium with improved secretion productivity of a plant acid invertase activator substance.
  • the modified cyanobacteria of the present disclosure by culturing the modified cyanobacteria of the present disclosure, the above substances can be produced efficiently. For example, by adding the substance to the soil, acid invertase in plants can be activated, thereby improving crop production. can be improved.

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Abstract

植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法は、シアノバクテリアにおいて外膜（５）と細胞壁（４）との結合に関与するタンパク質の総量が、親株における当該タンパク質の総量の３０～７０％に抑制されている改変シアノバクテリアを準備するステップ（ステップＳ０１）と、改変シアノバクテリアに植物の酸性インベルターゼの活性化に関与する分泌物を分泌させるステップ（ステップＳ０２）と、を含む。

Description

植物酸性インベルターゼ活性化剤、その製造方法、及び、植物酸性インベルターゼ活性化方法
　本開示は、植物の酸性インベルターゼを活性化させる効果を有する天然代謝産物である植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法、植物酸性インベルターゼ活性化剤及び植物酸性インベルターゼ活性化方法に関する。
　世界人口の増加に伴う食糧増産への要求に伴い、限られた耕作地の中で効率よく作物を生産するための技術開発が求められている。作物の増収を目指すためのアプローチは、光、温湿度、及び、土壌成分などの環境要因を作物の成長に適した条件にコントロールする方法（つまり、環境制御を行う方法）と、遺伝子組み換え技術の利用、又は、生理活性物質などの添加により植物の細胞生理を人為的に制御し成長を促進させる方法（つまり、細胞生理の制御を行う方法）とに大別される。
　細胞生理の制御を行う方法の一つとして、遺伝子組み換えによるインベルターゼの活性制御が知られている（非特許文献１）。インベルターゼは、スクロース（いわゆる、ショ糖）をグルコースとフルクトースとに分解する酵素であり、葉で行われる光合成によって生成するスクロースの植物体各器官への転流、分配及び蓄積に深く関与する。インベルターゼは、その至適pHによって中性インベルターゼと酸性インベルターゼとに大別される。酸性インベルターゼには、細胞壁に局在する細胞壁インベルターゼ、及び、液胞内に局在する液胞インベルターゼの２種類がある。インベルターゼの中で、特に、酸性インベルターゼ活性が作物収量と密接に関連することが知られている。例えば、非特許文献２には、遺伝子組み換え技術により液胞インベルターゼを活性化することにより、綿花の綿繊維生産が増進されることが開示されている。また、非特許文献３には、稲穂の成長に液胞インベルターゼ活性が必須であることが開示されている。また、例えば、非特許文献４及び５には、遺伝子組み換え技術によりトウモロコシ及びダイズの細胞壁インベルターゼを活性化することでダイズの収量及びトウモロコシの収量が増加し、それぞれの子実の含有糖分が増加することが開示されている。これらのことから、酸性インベルターゼを人為的に活性化することにより農作物の生産性を向上させる技術の開発が期待されている。
Roitsch, T. and M. C. Gonzalez (2004). "Function and regulation of plant invertases: sweet sensations." Trends in Plant Science 9(12): 606-613. Wang, L., et al. (2010). "Evidence that high activity of vacuolar invertase is required for cotton fiber and Arabidopsis root elongation through osmotic dependent and independent pathways, respectively." Plant Physiology, 154(2):744-756. Morey, S. R., et al. (2018). "Genetic Evidence for the Role of a Rice Vacuolar Invertase as a Molecular Sink Strength Determinant." Rice 11. Tang, X., et al. (2017). "Suppression of extracellular invertase inhibitor gene expression improves seed weight in soybean (Glycine max)." Journal of Experimental Botany 68(3): 469-482. Li, B., et al. (2013). "Constitutive expression of cell wallinvertase genes increases grain yield and starch content in maize." Plant Biotechnology Journal 11(9): 1080-1091. 木幡光, Studies on molecular basis of cyanobacterial outer membrane function and its evolutionary relationship with primitive chloroplasts, 博士論文,[オンライン], 2018.03.27,インターネット:<URL: http://hdl.handle.net/10097/00122689> 児島征司, 葉緑体表層膜で機能する細菌由来の膜安定化機構と物質透過機構の解明と応用, 科研費, [オンライン], 2018.04.23, インターネット:<URL: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18H02117>
　しかしながら、酸性インベルターゼを活性化する手法は、現時点で遺伝子組み換え技術による手法に限られているため、実用化が難しいという問題がある。遺伝子組み換え技術に対する世界各国の法規制、並びに、遺伝子組み換え技術を植物に施用する（以下、適用する、又は、使用するともいう）ことに対する生産者及び消費者の心理的な拒否感が上記技術の社会実装の大きな妨げとなっているからである。そのため、遺伝子組み換え技術を用いずに、外部からの刺激（例えば、何らかの物質を外部から植物に添加すること）により、作物の酸性インベルターゼを活性化する手法が求められている。
　そこで、本開示は、植物の酸性インベルターゼを活性化させる植物酸性インベルターゼ活性化物質を、簡便に、かつ、効率良く製造する方法を提供する。また、本開示は、効率的に植物の酸性インベルターゼを活性化することができる植物酸性インベルターゼ活性化剤、及び、植物酸性インベルターゼ活性化方法を提供する。
　本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法は、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が、親株における当該タンパク質の総量の３０％以上７０％以下に抑制されている改変シアノバクテリアを準備するステップと、前記改変シアノバクテリアに植物の酸性インベルターゼの活性化に関与する分泌物を分泌させるステップと、を含む。
　本開示の植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法によれば、植物の酸性インベルターゼを活性化させる植物酸性インベルターゼ活性化剤を、簡便に、かつ、効率良く製造することができる。また、本開示の植物酸性インベルターゼ活性化剤によれば、効果的に植物の酸性インベルターゼを活性化させることができる。また、本開示の植物酸性インベルターゼ活性化方法によれば、本開示の植物酸性インベルターゼ活性化剤を植物に使用することにより、効果的に植物の酸性インベルターゼを活性化させることができる。
図１は、実施の形態に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法の一例を示すフローチャートである。 図２は、シアノバクテリアの細胞表層を模式的に示した図である。 図３は、実施例１の改変シアノバクテリアの超薄切片の透過型電子顕微鏡像である。 図４は、図３の破線領域Ａの拡大像である。 図５は、実施例２の改変シアノバクテリアの超薄切片の透過型電子顕微鏡像である。 図６は、図５の破線領域Ｂの拡大像である。 図７は、比較例１の改変シアノバクテリアの超薄切片の透過型電子顕微鏡像である。 図８は、図７の破線領域Ｃの拡大像である。 図９は、実施例１、実施例２及び比較例１の改変シアノバクテリアの培養液中のタンパク質量（ｎ＝３、エラーバー＝ＳＤ）を示すグラフである。 図１０は、実施例３及び比較例２で栽培されたホウレン草の酸性インベルターゼ活性の平均値を示すグラフである。 図１１は、実施例３及び比較例２で栽培されたホウレン草１株あたりの地上部乾燥重量の平均値を示すグラフである。 図１２は、実施例４及び比較例３で栽培されたイチゴの酸性インベルターゼ活性の平均値を示すグラフである。 図１３は、実施例４及び比較例３で栽培されたイチゴ１株あたりの平均果実数を示すグラフである。 図１４は、実施例４及び比較例３で栽培されたイチゴ１株あたりの平均果実重量を示すグラフである。 図１５は、実施例４及び比較例３で栽培されたイチゴ１株あたりの平均糖度を示すグラフである。 図１６は、実施例４及び比較例３それぞれの代表的な果実の状態を示す図である。 図１７は、実施例１、実施例２、比較例１、比較例４及び比較例５の改変シアノバクテリアにおける外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の量を示す電気泳動像である。 図１８は、比較例４の改変シアノバクテリアの超薄切片の透過型電子顕微鏡像である。 図１９は、図１８の破線領域Ｄの拡大図である。 図２０は、比較例５の改変シアノバクテリアの超薄切片の透過型電子顕微鏡像である。 図２１は、図２０の破線領域Ｅの拡大図である。 図２２は、実施例１、実施例２、比較例１、比較例４及び比較例５の改変シアノバクテリアの培養液中のタンパク質の量を示すグラフである。 図２３は、実施例２及び比較例１の改変シアノバクテリアの細胞壁結合型糖鎖に共有結合しているピルビン酸の量を示すグラフである。
　（本開示の基礎となった知見）
　背景技術で述べたように、限られた耕作地の中で効率よく農作物を生産するための技術が求められている。そのための手法として、植物の酸性インベルターゼを活性化させる技術が期待されている。
　植物の酸性インベルターゼを活性化させる技術として、以下の従来技術が開示されている。
　例えば、非特許文献２には、３５Ｓプロモーターを用いて綿花の液胞インベルターゼ遺伝子を高発現させることにより、綿繊維の伸長が促進されることが報告されている。
　また、例えば、非特許文献４には、ダイズの細胞壁インベルターゼ活性を阻害する遺伝子の発現をＲＮＡ（ribonucleic acid）干渉法により抑制することで、細胞壁インベルターゼが活性化されることが報告されている。具体的には、この技術をダイズに適用することにより、ダイズの1粒あたり重量が増加し、1株当たりの収穫重量が増加し、さらに、ダイズ1粒あたりの含有糖分が増加することが報告されている。
　また、例えば、非特許文献５には、３５Ｓプロモーターを用いてトウモロコシの細胞壁インベルターゼ遺伝子を高発現させることにより、トウモロコシの収量が増加することが報告されている。また、子実1粒あたりの含有糖分が増加することも報告されている。
　しかしながら、植物の酸性インベルターゼを活性化させる手法は、現時点で遺伝子組み換え技術による手法に限られているため、実用化が難しいという問題がある。遺伝子組み換え技術に対する世界各国の法規制、並びに、遺伝子組み換え技術を植物に適用することに対する生産者及び消費者の心理的な拒否感が上記技術の社会実装の大きな妨げとなっているからである。そのため、遺伝子組み換え技術を用いずに、何らかの物質を外部から植物に添加することにより、作物の酸性インベルターゼを活性化する手法が強く求められている。さらに、近年、地球温暖化の防止及び環境負荷の低減などの環境への配慮の意識が拡大していることから、施用において環境負荷の少ない天然由来の物質の活用が望まれている。中でも、当該物質の製造時に化石エネルギーの消費量が少なく、より環境負荷の少ない天然由来の物質を施用することが特に望まれている。
　本発明者らは、農作物の生産性向上に資する天然由来物質の製造に使用する微生物として、シアノバクテリアに着目していた。シアノバクテリア（藍色細菌又は藍藻とも呼ばれる）は、真正細菌の一群であり、光合成により水を分解して酸素を産生し、得たエネルギーにより空気中のＣＯ２を固定する。シアノバクテリアは、種によっては、空気中の窒素（Ｎ２）も固定できる。このように、シアノバクテリアは、菌体の生育に必要な原料（つまり、栄養分）及びエネルギーの大部分を、空気、水、及び、光から得ることができるため、安価な原料で簡便なプロセスでシアノバクテリアを培養することができる。
　また、シアノバクテリアの特性として、生育が早く光利用効率が高いことが知られており、加えてその他の藻類種と比較して遺伝子操作が容易であるため、光合成微生物の中でもシアノバクテリアを利用した物質生産に関して活発な研究開発が行われている。例えば、シアノバクテリアを用いた物質生産の例として、エタノール、イソブタノール、アルカン類、及び、脂肪酸（特許文献１：特許第６３４１６７６号公報）等の燃料の生産が報告されている。また、生物の栄養源となる物質の生産に関する研究開発も行われている。例えば、タンパク質は生物にしか合成できないため、簡便に、かつ、効率良くタンパク質を生産する技術の開発が求められている。当該技術に用いる生物種の１つとして、光エネルギーと大気中のＣＯ２とを利用できるシアノバクテリアの活用が期待され、活発な研究開発が行われている（非特許文献８：Jie Zhou et al., “Discovery of a super-strong promoter enable efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria”,Scientific Reports, Nature Research, 2014, Vol.4, Article No.4500）。
　例えば、非特許文献８に記載の技術を用いてシアノバクテリアの遺伝子を任意に改変すれば、シアノバクテリアの細胞内（以下、菌体内ともいう）で所望の化合物及びタンパク質を産生させることができる。しかしながら、シアノバクテリアの細胞内で産生された所望の化合物及びタンパク質は、細胞外に分泌されにくいため、シアノバクテリアの細胞を破砕して、細胞内で産生された所望の化合物及びタンパク質を抽出する必要がある。
　シアノバクテリアの細胞壁および細胞膜の構造はタンパク質及び菌体内代謝産物の透過性を左右するが、細胞膜および細胞壁構造を人為的に改変してタンパク質及び菌体内代謝産物の分泌生産能力を向上させることは容易ではない。例えば、非特許文献６及び非特許文献７には、シアノバクテリアの外膜と細胞壁との接着に関与し、かつ、細胞表層の構造的安定性に寄与するslr1841遺伝子またはslr0688遺伝子を欠損させると、シアノバクテリア細胞の増殖能力が失われることが記載されている。
　そこで、本発明者らは、シアノバクテリア細胞の増殖能力を維持したまま、タンパク質及び菌体内代謝産物の分泌生産能力を高める細胞膜および細胞壁の最適な構造改変方法を鋭意検討した。その結果、シアノバクテリアの外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が、親株における当該タンパク質の総量の３０％～７０％に抑制させることにより、シアノバクテリアの菌体内で産生されたタンパク質及び菌体内代謝産物が菌体外に分泌されやすくなることを見出した。より具体的には、シアノバクテリアの細胞壁を被覆する外膜を部分的に細胞壁から脱離させることにより、シアノバクテリアの菌体内で産生された所望の化合物及びタンパク質及び菌体内代謝産物が菌体外に分泌されやすくなることを見出した。この過程において、本発明者らは、シアノバクテリアの分泌物が複数の作物種に対して、酸性インベルターゼを活性化させる効果を有することも発見した。これにより、シアノバクテリアの菌体を破砕することなく、菌体外に分泌された植物の酸性インベルターゼを活性化させる物質（つまり、植物酸性インベルターゼ活性化物質）を効率よく回収することができる。また、抽出などの操作が不要となることにより、植物酸性インベルターゼ活性化物質の生理活性が損なわれにくくなるため、当該分泌物を含む植物酸性インベルターゼ活性化剤によれば、効果的に植物の酸性インベルターゼを活性化させることができる。
　したがって、本開示の植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法によれば、複数の作物種に対して、酸性インベルターゼを活性化させる効果を有する物質を含む植物酸性インベルターゼ活性化剤を、簡便に、かつ、効率良く製造することができる。また、本開示の植物酸性インベルターゼ活性化剤によれば、効果的に植物の酸性インベルターゼを活性化させることができる。また、本開示の植物酸性インベルターゼ活性化方法によれば、本開示の植物酸性インベルターゼ活性化剤を植物に使用することにより、効果的に植物の酸性インベルターゼを活性化させることができる。
　（本開示の概要）
　本開示の一態様の概要は、以下の通りである。
　本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法は、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が、親株における当該タンパク質の総量の３０～７０％に抑制されている改変シアノバクテリアを準備するステップと、前記改変シアノバクテリアに植物の酸性インベルターゼの活性化に関与する分泌物を分泌させるステップと、を含む。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、細胞の増殖能力が損なわれることなく、細胞壁と外膜との結合（例えば、結合量及び結合力）が部分的に低減し、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなる。そのため、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物（以下、菌体内産生物質ともいう）が外膜の外、つまり、菌体外に漏出しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリアの菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物が菌体外に分泌されやすくなるため、例えば菌体を破砕するなどの、菌体内産生物質の抽出処理が不要となる。そのため、簡便に、かつ、効率良く、改変シアノバクテリアの分泌物を含む植物酸性インベルターゼ活性化剤を製造することができる。外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が、親株における当該タンパク質の総量の３０％未満に抑制されると細胞の増殖能力が損なわれてしまい、７０％を超えると菌体内で産生されたタンパク質を菌体外に漏出させることができない。
　また、上記の菌体内産生物質の抽出処理が不要となるため、菌体内産生物質の生理活性の低下及び収率の低下が起こりにくくなる。そのため、改変シアノバクテリアの菌体内産生物質のうち、植物の酸性インベルターゼの活性化に関与する物質（つまり、植物酸性インベルターゼ活性化物質）の生理活性の低下及び収率の低下も起こりにくくなる。これにより、改変シアノバクテリアの分泌物は、植物の酸性インベルターゼの活性化に関与する効果（以下、植物酸性インベルターゼ活性化効果ともいう）が向上する。
　また、上記の菌体内産生物質の抽出処理が不要となるため、菌体外に分泌された菌体内産生物質を回収した後も、改変シアノバクテリアを繰り返し使用して菌体内産生物質を産生させることができる。そのため、植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造の度に新たな改変シアノバクテリアを準備する必要がない。したがって、本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法によれば、植物酸性インベルターゼ活性化剤を、簡便に、かつ、効率良く製造することができる。
　例えば、本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法では、前記外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質は、ＳＬＨ（Surface Layer Homology）ドメイン保持型外膜タンパク質、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つであってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、例えば、（ｉ）細胞壁と結合するＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質及び細胞壁の表面の結合糖鎖をピルビン酸修飾する反応を触媒する酵素（つまり、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素）の少なくとも１つの機能が抑制されている、又は、（ｉｉ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つの発現が抑制されている。そのため、外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質のＳＬＨドメインと、細胞壁の表面の共有結合型の糖鎖との結合（つまり、結合量及び結合力）が低減する。これにより、外膜と細胞壁との結合が弱まった部分において外膜が細胞壁から脱離しやすくなる。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜と細胞壁との結合が低減することにより外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなるため、上記のように菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物などの菌体内産生物質が菌体外に漏出しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリアは、菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質を菌体外に分泌する分泌生産性が向上する。したがって、本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法によれば、当該改変シアノバクテリアに植物酸性インベルターゼ活性化物質を効率良く分泌させることができるため、植物酸性インベルターゼ活性化物質を含む植物酸性インベルターゼ活性化剤を効率良く製造することができる。
　例えば、本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法では、前記ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるSlr1841、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるNIES970_09470、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるAnacy_3458、又は、これらのいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、例えば、（ｉ）上記の配列番号１～３で示されるいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質又はこれらのいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の機能が抑制されている、又は、（ｉｉ）上記の配列番号１～３で示されるいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質又はこれらのいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の発現が抑制されている。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ｉ）外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質若しくはＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制される、又は、（ｉｉ）外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質若しくはＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質と同等の機能を有するタンパク質の発現量が低減する。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜が細胞壁と結合するための結合ドメイン（例えばＳＬＨドメイン）が、細胞壁と結合する結合量及び結合力が低減するため、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなる。これにより、菌体内産生物質が菌体外に漏出されやすくなるため、菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質も菌体外に漏出されやすくなる。したがって、本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法によれば、改変シアノバクテリアの菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質が菌体外に分泌されやすくなるため、植物酸性インベルターゼ活性化剤を効率良く製造することができる。
　例えば、本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法では、前記細胞壁－ピルビン酸修飾酵素は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるSlr0688、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるSynpcc7942_1529、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるAnacy_1623、又は、これらのいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、例えば、（ｉ）上記の配列番号４～６で示されるいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素若しくはこれらのいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の機能が抑制されている、又は、（ｉｉ）上記の配列番号４～６で示されるいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素若しくはこれらのいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の発現が抑制されている。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ｉ）細胞壁－ピルビン酸修飾酵素又は当該酵素と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制される、又は、（ｉｉ）細胞壁－ピルビン酸修飾酵素又は当該酵素と同等の機能を有するタンパク質の発現量が低減する。これにより、細胞壁の表面の共有結合型の糖鎖がピルビン酸で修飾されにくくなるため、細胞壁の糖鎖が外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質のＳＬＨドメインと結合する結合量及び結合力が低減する。その結果、改変シアノバクテリアでは、細胞壁の表面の共有結合型の糖鎖がピルビン酸で修飾されにくくなるため、細胞壁と外膜との結合力が弱まり、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなる。これにより、菌体内産生物質が菌体外に漏出されやすくなるため、菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質も菌体外に漏出されやすくなる。したがって、本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法によれば、改変シアノバクテリアの菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質が菌体外に分泌されやすくなるため、植物酸性インベルターゼ活性化剤を効率良く製造することができる。
　例えば、本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法では、前記外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子が欠失又は不活性化されていてもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、細胞壁と外膜との結合に関与するタンパク質の発現が抑制されるため、又は、当該タンパク質の機能が抑制されるため、細胞壁と外膜との結合（つまり、結合量及び結合力）が部分的に低減する。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなるため、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物などの菌体内産生物質が外膜の外、つまり、菌体外に漏出しやすくなる。そのため、改変シアノバクテリアは、菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質の分泌生産性が向上する。これにより、菌体を破砕するなどの、菌体内産生物質の抽出処理が不要となるため、菌体内産生物質の生理活性の低下及び収率の低下が起こりにくくなる。そのため、菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質の生理活性の低下及び収率の低下も起こりにくくなるため、植物酸性インベルターゼ活性化効果が向上した植物酸性インベルターゼ活性化剤を製造することができる。また、上記の菌体内産生物質の抽出処理が不要となるため、当該物質を回収した後も、改変シアノバクテリアを繰り返し使用して植物酸性インベルターゼ活性化物質を産生させることができる。そのため、植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造の度に新たな改変シアノバクテリアを準備する必要がない。したがって、本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法によれば、植物酸性インベルターゼ活性化剤を、簡便に、かつ、効率良く製造することができる。
　例えば、本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法では、前記外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子は、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つであってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている。そのため、改変シアノバクテリアでは、例えば、（ｉ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つの発現が抑制される、又は、（ｉｉ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つの機能が抑制される。そのため、外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質のＳＬＨドメインと、細胞壁の表面の共有結合型の糖鎖との結合（つまり、結合量及び結合力）が低減する。これにより、外膜と細胞壁との結合が弱まった部分において外膜が細胞壁から脱離しやすくなる。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜と細胞壁との結合が低減することにより外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなるため、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物が菌体外に漏出しやすくなる。これにより、菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質も菌体外に漏出しやすくなる。したがって、本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法によれば、当該改変シアノバクテリアに植物酸性インベルターゼ活性化物質を効率良く分泌させることができるため、植物酸性インベルターゼ活性化剤を効率良く製造することができる。
　例えば、本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法では、前記ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号７で示される塩基配列からなるslr1841、配列番号８で示される塩基配列からなるnies970_09470、配列番号９で示される塩基配列からなるanacy_3458、又は、これらのいずれかの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、上記の配列番号７～９で示されるいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子又はこれらのいずれかの遺伝子の塩基配列と５０％以上同一である遺伝子が欠失又は不活性化される。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ｉ）上記のいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質若しくはこれらのいずれかのタンパク質と同等の機能を有するタンパク質の発現が抑制される、又は、（ｉｉ）上記のいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質若しくはこれらのいずれかのタンパク質と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制される。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜が細胞壁と結合するための結合ドメイン（例えばＳＬＨドメイン）が細胞壁と結合する結合量及び結合力が低減するため、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなる。これにより、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物が菌体外に漏出しやすくなるため、菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質も菌体外に漏出しやすくなる。したがって、本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法によれば、改変シアノバクテリアの菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質が菌体外に漏出されやすくなるため、植物酸性インベルターゼ活性化剤を効率良く製造することができる。
　例えば、本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法では、前記細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子は、配列番号１０で示される塩基配列からなるslr0688、配列番号１１で示される塩基配列からなるsynpcc7942_1529、配列番号１２で示される塩基配列からなるanacy_1623、又は、これらのいずれかの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、上記の配列番号１０～１２で示されるいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子又はこれらのいずれかの酵素をコードする遺伝子の塩基配列と５０％以上同一である遺伝子が欠失又は不活性化される。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ｉ）上記のいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素若しくはこれらのいずれかの酵素と同等の機能を有するタンパク質の発現が抑制される、又は、（ｉｉ）上記のいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素若しくはこれらのいずれかの酵素と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制される。これにより、細胞壁の表面の共有結合型の糖鎖がピルビン酸で修飾されにくくなるため、細胞壁の糖鎖が外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質のＳＬＨドメインと結合する結合量及び結合力が低減する。その結果、改変シアノバクテリアでは、細胞壁が外膜と結合するための糖鎖がピルビン酸で修飾される量が低減するため、細胞壁と外膜との結合力が弱まり、外膜が細胞壁から部分的に離脱しやすくなる。これにより、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物が菌体外に漏出しやすくなるため、菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質も菌体外に漏出しやすくなる。したがって、本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法によれば、改変シアノバクテリアの菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質が菌体外に漏出されやすくなるため、植物酸性インベルターゼ活性化剤を効率良く製造することができる。
　また、本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤は、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が、親株における当該タンパク質の総量の３０％以上７０％以下に抑制されている改変シアノバクテリアの分泌物を含む。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、細胞の増殖能力が損なわれることなく、細胞壁と外膜との結合（つまり、結合量及び結合力）が部分的に低減し、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなる。そのため、改変シアノバクテリアでは、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物（つまり、菌体内産生物質）が外膜の外に（つまり、菌体の外に）漏出しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリアに菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物が菌体外に分泌されやすくなるため、例えば菌体を破砕するなどの、菌体内産生物質の抽出処理が不要となる。そのため、簡便に、かつ、効率良く、改変シアノバクテリアの分泌物を含む植物酸性インベルターゼ活性化剤を製造することができる。また、上記の菌体内産生物質の抽出処理が不要となるため、菌体内産生物質の生理活性の低下及び収率の低下が起こりにくくなる。そのため、改変シアノバクテリアの菌体内産生物質のうち、植物酸性インベルターゼ活性化に関与する物質（以下、植物酸性インベルターゼ活性化物質ともいう）の生理活性の低下及び収率の低下も起こりにくくなる。これにより、植物酸性インベルターゼ活性化効果が向上した植物酸性インベルターゼ活性化剤を得ることができる。したがって、本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤は、効果的に植物の酸性インベルターゼを活性化させることができる。
　また、本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化方法は、上記の植物酸性インベルターゼ活性化剤を植物に使用する。
　本開示の一態様に係る植物酸性インベルターゼ活性化方法によれば、植物酸性インベルターゼ活性化効果が向上した植物酸性インベルターゼ活性化剤を植物に使用することにより、効果的に植物の酸性インベルターゼを活性化させることができる。
　以下、実施の形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。
　なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的又は具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、材料、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、本開示を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
　また、各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化される場合がある。
　また、以下において、数値範囲は、厳密な意味のみを表すのではなく、実質的に同等な範囲、例えば、タンパク質の量（例えば、数又は濃度等）又はその範囲を計測することなどを含む。
　また、本明細書では、菌体と細胞とは、いずれも１つのシアノバクテリアの個体を表している。
　（実施の形態）
　本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）アルゴリズムによって計算される。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）のウェブサイトで利用できるBLASTプログラムにてペアワイズ解析を行うことにより算出される。シアノバクテリアの遺伝子及び当該遺伝子がコードするタンパク質に関する情報は、例えば上述のNCBIデータベース及びCyanobase（http://genome.microbedb.jp/cyanobase/）において公開されている。これらのデータベースから、目的のタンパク質のアミノ酸配列及びそれらのタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を取得することができる。
　［１．植物酸性インベルターゼ活性化剤］
　まず、本実施の形態に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤について説明する。植物酸性インベルターゼ活性化剤は、植物の酸性インベルターゼの活性化に関与する分泌物を含み、植物の酸性インベルターゼを活性化させる効果を有する。上述したように、インベルターゼは、植物体においてショ糖をブドウ糖及び果糖などの還元糖に異化する酵素である。特に、酸性インベルターゼは、植物体におけるショ糖の利用、及び、貯蔵糖の一形態である還元糖への異化に寄与する。したがって、本実施の形態に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤は、植物の酸性インベルターゼを活性化させることにより、植物の成長を促進させ、かつ、果実などへの貯蔵糖の蓄積を促進させることが可能となる。したがって、本実施の形態に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤は、例えば農作物に使用されることにより、効率良く農作物の生産を増進させることができる。
　例えば、植物の成長を促進させるとは、植物の葉、茎、蕾、花、又は実の数を増加させ、茎又は幹を太くし、背丈を伸長させることを言う。植物の成長が促進されることにより、植物体及びその果根部が増体され、果実数が増加される。
　また、酸性インベルターゼは、植物の病害の防除、養分の吸収率の向上、果実の高糖度化などの植物の品質向上に寄与する。したがって、植物酸性インベルターゼ活性化剤は、複数の作物種に対して、作物の増収、作物及び果実の増体、果実の高糖度化、生理障害の低減、並びに、病害の低減など、植物の品質を効果的に向上させることができる。
　なお、植物には、田畑で栽培される作物（いわゆる、農作物）の他、庭園樹、花卉、芝生、街路樹等も含み、また肥培の殆ど行われない山林樹木も含まれる。
　本実施の形態では、植物酸性インベルターゼ活性化剤は、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質（以下、結合関連タンパク質ともいう）の総量が、親株における当該たんぱく質の総量の３０％以上７０％以下に抑制されている改変シアノバクテリアの分泌物を含む。ここで、例えば、「結合関連タンパク質の総量が、親株における当該タンパク質の総量の３０％に抑制されている」とは、親株における当該タンパク質の総量の７０％が喪失し、３０％が残存している状態のことを意味する。これにより、改変シアノバクテリアでは、外膜５と細胞壁４との結合（例えば、結合量及び結合力）が部分的に低減するため、外膜５が細胞壁４から部分的に脱離しやすくなる。なお、シアノバクテリア（つまり、親株）及び改変シアノバクテリアについては後述する。
　上述したように、当該分泌物は、植物の酸性インベルターゼの活性化に関与する分泌物を含む。当該分泌物は、改変シアノバクテリアの菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物（つまり、菌体内産生物質）を含む。当該菌体内産生物質には、植物の酸性インベルターゼの活性化に関与する物質（つまり、植物酸性インベルターゼ活性化物質）が含まれている。
　植物酸性インベルターゼ活性化物質は、例えば、ペプチダーゼ、ヌクレアーゼ、若しくは、フォスファターゼ等の有機物分解酵素、アデノシン若しくはグアノシン等のDNA代謝関連物質、p－アミノ安息香酸若しくはスペルミジンなどの核酸（例えば、DNA又はRNA）合成促進に関与する細胞内分子、3－ヒドロキシ酪酸などのケトン体、又は、グルコン酸などの有機酸である。改変シアノバクテリアの分泌物は、これらの植物酸性インベルターゼ活性化物質の混合物であってもよい。
　［２．植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法］
　続いて、本実施の形態に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法について図１を参照しながら説明する。図１は、本実施の形態に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法の一例を示すフローチャートである。
　本実施の形態に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法は、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が、親株における当該タンパク質の総量の３０％以上７０％以下に抑制されている改変シアノバクテリアを準備するステップ（ステップＳ０１）と、当該改変シアノバクテリアに植物の酸性インベルターゼの活性化に関与する分泌物を分泌させるステップ（ステップＳ０２）と、を含む。上述したように、改変シアノバクテリアの分泌物は、改変シアノバクテリアの菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物（つまり、菌体内産生物質）を含む。これらの菌体内産生物質には、植物の酸性インベルターゼの活性化に関与する物質（つまり、植物酸性インベルターゼ活性化物質）が含まれる。
　ステップＳ０１では、上記の改変シアノバクテリアを準備する。改変シアノバクテリアを準備するとは、改変シアノバクテリアが分泌物を分泌できる状態に改変シアノバクテリアの状態を調整することをいう。改変シアノバクテリアを準備するとは、例えば、親シアノバクテリア（いわゆる、親株）を遺伝子改変して改変シアノバクテリアを作製することであってもよく、改変シアノバクテリアの凍結乾燥体又はグリセロールストックから菌体を復元することであってもよく、ステップＳ０２で植物酸性インベルターゼ活性化物質を分泌させ終えた改変シアノバクテリアを回収することであってもよい。
　ステップＳ０２では、改変シアノバクテリアに植物の成長促進に関与する分泌物を分泌させる。本実施の形態における改変シアノバクテリアは、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が、親株における当該タンパク質の総量の３０％以上７０％以下に抑制されているため、細胞の増殖能力が損なわれることなく、細胞壁と外膜との結合（例えば、結合量及び結合力）が部分的に低減し、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなる。そのため、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物が外膜の外（つまり、菌体外）に分泌されやすくなる。これらの菌体内産生物質には、植物の酸性インベルターゼの活性化に関与する物質も含まれる。そのため、ステップＳ０２では、改変シアノバクテリアを所定の条件で培養することにより、植物の酸性インベルターゼの活性化に関与する菌体内産生物質が菌体外に分泌される。
　シアノバクテリアの培養は、一般に、BG-11培地（表２参照）を用いた液体培養又はその変法に基づいて実施することができる。そのため、改変シアノバクテリアの培養も同様に実施してもよい。また、植物酸性インベルターゼ活性化剤を製造するためのシアノバクテリアの培養期間としては、十分に菌体が増殖した条件でタンパク質及び代謝産物が高濃度に蓄積するように行える期間であればよく、例えば、１～３日間であってもよく、４～７日間であってもよい。また、培養方法は、例えば、通気攪拌培養又は振とう培養であってもよい。
　上記の条件で培養することにより、改変シアノバクテリアは、菌体内でタンパク質及び代謝産物（つまり、菌体内産生物質）を産生し、当該菌体内産生物質を培養液中に分泌する。当該菌体内産生物質は、植物の酸性インベルターゼの活性化に関与する菌体内産生物質（つまり、植物酸性インベルターゼ活性化物質）を含む。培養液中に分泌された菌体内産生物質を回収する場合、培養液をろ過、又は遠心分離等することにより、培養液から細胞（つまり、菌体）等の固形分を除去し、培養上清を回収してもよい。本実施の形態に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法によれば、植物の酸性インベルターゼの活性化に関与する菌体内産生物質（つまり、植物酸性インベルターゼ活性化物質）を含む分泌物が改変シアノバクテリアの細胞外に分泌されるので、植物酸性インベルターゼ活性化物質の回収のために細胞を破砕する必要がない。そのため、植物酸性インベルターゼ活性化物質の回収後に残った改変シアノバクテリアを繰り返し使用して、植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造を行うことができる。
　なお、培養液中に分泌された植物酸性インベルターゼ活性化物質の回収方法は、上記の例に限られず、改変シアノバクテリアを培養しながら、培養液中の植物酸性インベルターゼ活性化物質を回収してもよい。例えば、タンパク質を透過させる透過膜を用いることにより、透過膜を透過した植物酸性インベルターゼ活性化物質を回収してもよい。このように、改変シアノバクテリアを培養しながら培養液中の植物酸性インベルターゼ活性化物質を回収することができるため、培養液から改変シアノバクテリアの菌体を除去する処理が不要となる。そのため、より簡便に、かつ、効率良く植物酸性インベルターゼ活性化剤を製造することができる。
　また、培養液からの菌体の回収処理及び菌体の破砕処理が不要となることにより、改変シアノバクテリアが受けるダメージ及びストレスを低減することができる。そのため、改変シアノバクテリアの植物酸性インベルターゼ活性化物質の分泌生産性が低減しにくくなり、より長く改変シアノバクテリアを使用することができる。
　以上のように、本実施の形態における改変シアノバクテリアを用いることで、植物酸性インベルターゼ活性化剤を簡便に、かつ、効率よく得ることができる。
　以下、シアノバクテリア及び改変シアノバクテリアについて説明する。
　［３．シアノバクテリア］
　シアノバクテリアは、藍藻又は藍色細菌とも呼ばれ、クロロフィルで光エネルギーを捕集し、得たエネルギーで水を電解して酸素を発生しながら光合成をおこなう原核生物の一群である。シアノバクテリアは、多様性に富んでおり、例えば、細胞形状ではSynechocystis sp. PCC 6803のような単細胞性の種及びAnabaena sp. PCC 7120のような多細胞が連なった糸状性の種がある。生育環境についても、Thermosynechococcus elongatusのような好熱性の種、Synechococcus elongatusのような海洋性の種、Synechocystisのような淡水性の種がある。また、Microcystis aeruginosaのようにガス小胞を持ち毒素を産生する種、及び、チラコイドを持たずに原形質膜に集光アンテナであるフィコビリソームと呼ばれるタンパク質を有するGloeobacter violaceusのように、独自の特徴をもつ種も多数挙げられる。
　図２は、シアノバクテリアの細胞表層を模式的に示した図である。図２に示されるように、シアノバクテリアの細胞表層は、内側から順に、原形質膜（内膜１ともいう）、ペプチドグリカン２、及び細胞最外層を形成する脂質膜である外膜５で構成される。ペプチドグリカン２にはグルコサミン及びマンノサミンなどで構成される糖鎖３が共有結合しており、また、これらの共有結合型の糖鎖３にはピルビン酸が結合している（非特許文献８：Jurgens and Weckesser, 1986, J. Bacteriol., 168:568-573）。本明細書では、ペプチドグリカン２と共有結合型の糖鎖３とを含めて細胞壁４と呼ぶ。また、原形質膜（つまり、内膜１）と外膜５との間隙は、ペリプラズムと呼ばれ、タンパク質の分解又は立体構造の形成、脂質又は核酸の分解、若しくは、細胞外の栄養素の取り込み等に関与する様々な酵素が存在する。
　ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６（例えば、図中のSlr1841）は、脂質膜（外膜５ともいう）に埋め込まれたＣ末端側領域と、脂質膜から突き出したＮ末端側のＳＬＨドメイン７から成り、シアノバクテリア及びグラム陰性細菌の一群であるNegativicutes綱に属する細菌において広く分布している（非特許文献９：Kojima et al., 2016, Biosci.Biotech. Biochem., 10:1954-1959）。脂質膜（つまり、外膜５）に埋め込まれた領域は、親水性物質の外膜透過を可能にするためのチャネルを形成し、一方でＳＬＨドメイン７は細胞壁４に結合する機能をもつ（非特許文献１０：Kowata et al., 2017, J. Bacteriol., 199:e00371-17）。ＳＬＨドメイン７が細胞壁４に結合するためには、ペプチドグリカン２における共有結合型の糖鎖３がピルビン酸で修飾されている必要がある（非特許文献１１：Kojima et al., 2016, J. Biol. Chem., 291:20198-20209）。ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子の例としては、Synechocystis sp. PCC 6803が保持するslr1841若しくはslr1908、又はAnabaena sp. 90が保持するoprBなどが挙げられる。
　ペプチドグリカン２における共有結合型の糖鎖３のピルビン酸修飾反応を触媒する酵素（以下、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９という）は、グラム陽性菌であるBacillus anthracisにおいて同定され、CsaBと命名されている（非特許文献１２：Mesnage et al., 2000, EMBO J., 19:4473-4484）。ゲノム塩基配列が公開されているシアノバクテリアにおいて、多くの種がCsaBとアミノ酸配列の同一性が３０％以上となる相同タンパク質をコードする遺伝子を保持している。例としては、Synechocystis sp. PCC 6803が保持するslr0688又はSynechococcus sp. 7502が保持するsyn7502_03092などが挙げられる。
　シアノバクテリアでは、光合成により固定されたＣＯ２は多段階の酵素反応を経て各種アミノ酸及び細胞内分子の前駆体に変換される。それらを原料として、シアノバクテリアの細胞質内でタンパク質及び代謝産物が合成される。それらのタンパク質及び代謝産物の中には、細胞質内で機能するものもあるし、細胞質からペリプラズムに輸送されてペリプラズム内で機能するものもある。しかしながら、細胞外にタンパク質及び代謝産物を積極的に分泌するケースは、現在までシアノバクテリアにおいては報告されていない。
　シアノバクテリアは、高い光合成能力を有するため、必ずしも有機物を栄養分として外から取り込む必要がない。そのため、シアノバクテリアは、図２の有機物チャネルタンパク質８（例えば、Slr1270）のように、有機物を透過させるチャネルタンパク質を外膜５に非常にわずかにしか有していない。例えば、Synechocystis sp. PCC 6803では、有機物を透過させる有機物チャネルタンパク質８は、外膜５の総タンパク質量の約４％しか存在しない。一方、シアノバクテリアは、生育に必要な無機イオン類を高効率で細胞内に取り込むために、図２のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６（例えば、Slr1841）のように、無機イオン類のみを透過させるイオンチャネルタンパク質を外膜５に多く有する。例えば、Synechocystis sp. PCC 6803では、無機イオンを透過させるイオンチャネルタンパク質は、外膜５の総タンパク質量の約８０％を占める。
　このように、シアノバクテリアでは、外膜５におけるタンパク質などの有機物を透過させるチャネルが非常に少ないため、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物を菌体外に積極的に分泌することが難しいと考えられている。また、シアノバクテリアの細胞壁及び細胞膜の構造はタンパク質透過性を左右するが、細胞膜および細胞壁構造を人為的に改変してタンパク質分泌生産能力を向上させることは容易ではない。例えば、非特許文献６および非特許文献７には、外膜と細胞壁との接着に関与し、細胞表層の構造的安定性に寄与するslr1841遺伝子あるいはslr0688遺伝子を欠損させると、細胞の増殖能力が失われることが記載されている。
　［４．改変シアノバクテリア］
　続いて、本実施の形態における改変シアノバクテリアについて図２を参照しながら説明する。
　本実施の形態における改変シアノバクテリアは、シアノバクテリアにおいて外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質（いわゆる、結合関連タンパク質）の総量が、親株における当該タンパク質の総量の３０％以上７０％以下に抑制されている。ここで、例えば、「結合関連タンパク質の総量が、親株における当該タンパク質の総量の３０％に抑制されている」とは、親株における当該タンパク質の総量の７０％が喪失し、３０％が残存している状態のことを意味する。これにより、改変シアノバクテリアでは、外膜５と細胞壁４との結合（例えば、結合量及び結合力）が部分的に低減するため、外膜５が細胞壁４から部分的に脱離しやすくなる。そのため、改変シアノバクテリアは、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物を菌体外に分泌する菌体内産生物質の分泌生産性が向上する。上述したように、菌体内産生物質には、植物の酸性インベルターゼの活性化に関与する菌体内産生物質（つまり、植物酸性インベルターゼ活性化物質）が含まれる。そのため、改変シアノバクテリアは、菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質を菌体外に分泌する植物酸性インベルターゼ活性化物質の分泌生産性も向上する。また、菌体を破砕して植物酸性インベルターゼ活性化物質を回収する必要がないため、植物酸性インベルターゼ活性化物質を回収した後も、改変シアノバクテリアを繰り返し使用することができる。なお、本明細書では、改変シアノバクテリアが菌体内でタンパク質及び代謝物を作り出すことを産生と言い、産生されたタンパク質及び代謝物を菌体外に分泌することを分泌生産と言う。
　外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質は、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つであってもよい。本実施の形態では、改変シアノバクテリアは、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つのタンパク質の機能が抑制されている。例えば、改変シアノバクテリアでは、（ｉ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つの機能が抑制されてもよく、（ｉｉ）細胞壁４と結合するＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６の発現、及び、細胞壁４の表面の結合糖鎖のピルビン酸修飾反応を触媒する酵素（つまり、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９）の発現の少なくとも１つが抑制されてもよい。これにより、外膜５中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６のＳＬＨドメイン７と細胞壁４の表面の共有結合型の糖鎖３との結合（つまり、結合量及び結合力）が低減する。そのため、これらの結合が弱まった部分において外膜５が細胞壁４から脱離しやすくなる。外膜５が細胞壁４から部分的に脱離することにより、改変シアノバクテリアの細胞内、特にペリプラズムに存在するタンパク質及び代謝産物などの菌体内産生物質が細胞の外（外膜５の外）へ漏出しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリアは、菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質を菌体外に分泌する分泌生産性が向上する。
　以下、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つの結合関連タンパク質の機能が抑制されることにより外膜５が部分的に細胞壁４から脱離するように改変されたシアノバクテリアについてより具体的に説明する。
　本実施の形態における改変シアノバクテリアの親微生物となる、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６の発現及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の発現の少なくとも１つを抑制する前のシアノバクテリア（本明細書において、「親株」又は「親シアノバクテリア」という）の種類は、特に制限はなく、あらゆる種類のシアノバクテリアであってもよい。例えば、親シアノバクテリアは、Syenechocystis属、Synechococcus属、Anabaena属、又は、Thermosynechococcus属であってもよく、中でも、Synechocystis sp. PCC 6803、Synechococcus sp. PCC 7942、又は、Thermosynechococcus elongatus BP-1であってもよい。なお、親株は、結合関連タンパク質の総量を３０％以上７０％以下に抑制する前のシアノバクテリアであれば、野生のものであってもよいし、改変したものであって、野生のものと同等の結合関連タンパク質を有するものであってもよい。
　これらの親シアノバクテリアにおけるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾反応を触媒する酵素（つまり、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９）のアミノ酸配列、それらの結合関連タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列、及び、当該遺伝子の染色体DNA又はプラスミド上での位置は、上述のNCBIデータベース及びCyanobaseで確認することができる。
　なお、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアにおいて機能が抑制されるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９は、親シアノバクテリアが保有している限り、いずれの親シアノバクテリアのものであってもよく、それらをコードする遺伝子の存在場所（例えば、染色体DNA上又はプラスミド上）により制限されるものではない。
　例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６は、親シアノバクテリアがSyenchocystis属の場合、Slr1841、Slr1908、又は、Slr0042等であってもよく、親シアノバクテリアがSynechococcus属の場合、NIES970_09470等であってもよく、親シアノバクテリアがAnabaena属の場合、Anacy_5815又はAnacy_3458等であってもよく、親シアノバクテリアがMicrocystis属の場合、A0A0F6U6F8_MICAE等であってもよく、親シアノバクテリアがCyanothese属の場合、A0A3B8XX12_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがLeptolyngbya属の場合、A0A1Q8ZE23_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがCalothrix属の場合、A0A1Z4R6U0_9CYANが挙げられ、親シアノバクテリアがNostoc属の場合、A0A1C0VG86_9NOSO等であってもよく、親シアノバクテリアがCrocosphaera属の場合、B1WRN6_CROS5等であってもよく、親シアノバクテリアがPleurocapsa属の場合、K9TAE4_9CYAN等であってもよい。
　より具体的には、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６は、例えば、Synechocystis sp. PCC 6803のSlr1841（配列番号１）、Synechococcus sp. NIES-970のNIES970_09470（配列番号２）、又は、Anabaena cylindrica PCC 7122 のAnacy_3458（配列番号３）等であってもよい。また、これらのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、例えば、（ｉ）上記の配列番号１～３で示されるいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６又はこれらのいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の機能が抑制されていてもよく、（ｉｉ）上記の配列番号１～３で示されるいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６又はこれらのいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の発現が抑制されていてもよい。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ｉ）外膜５中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６若しくはＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制される、又は、（ｉｉ）外膜５中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６若しくはＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６と同等の機能を有するタンパク質の発現量が低減する。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜５が細胞壁４と結合するための結合ドメイン（例えば、ＳＬＨドメイン７）が細胞壁４と結合する結合量及び結合力が低減するため、外膜５が細胞壁４から部分的に脱離しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリアでは、菌体内産生物質が菌体外に漏出しやすくなるため、菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質も菌体外に漏出しやすくなる。
　一般に、タンパク質のアミノ酸配列が３０％以上同一であれば、タンパク質の立体構造の相同性が高いため、当該タンパク質と同等の機能を有する可能性が高いと言われている。そのため、機能が抑制されるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６としては、例えば、上記の配列番号１～３で示されるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６のいずれかのアミノ酸配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、細胞壁４の共有結合型の糖鎖３と結合する機能を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。
　また、例えば、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９は、親シアノバクテリアがSyenchocystis属の場合、Slr0688等であってもよく、親シアノバクテリアがSynechococcus属の場合、Syn7502_03092又はSynpcc7942_1529等であってもよく、親シアノバクテリアがAnabaena属の場合、ANA_C20348又はAnacy_1623等であってもよく、親シアノバクテリアがMicrocystis属の場合、CsaB (NCBIのアクセスID：TRU80220)等であってもよく、親シアノバクテリアがCyanothese属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_107667006.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがSpirulina属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_026079530.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがCalothrix属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_096658142.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがNostoc属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_099068528.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがCrocosphaera属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_012361697.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがPleurocapsa属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_036798735）等であってもよい。
　より具体的には、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９は、例えば、Synechocystis sp. PCC 6803のSlr0688（配列番号４）、Synechococcus sp. PCC 7942のSynpcc7942_1529（配列番号５）、又は、Anabaena cylindrica PCC 7122のAnacy_1623（配列番号６）等であってもよい。また、これらの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、例えば、（ｉ）上記の配列番号４～６で示されるいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９又はこれらのいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の機能が抑制されていてもよく、（ｉｉ）上記の配列番号４～６で示されるいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９又はこれらのいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の発現が抑制されていてもよい。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ｉ）細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９又は当該酵素と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制される、又は、（ｉｉ）細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９又は当該酵素と同等の機能を有するタンパク質の発現量が低減する。これにより、細胞壁４の表面の共有結合型の糖鎖３がピルビン酸で修飾されにくくなるため、細胞壁４の糖鎖３が外膜５中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６のＳＬＨドメイン７と結合する結合量及び結合力が低減する。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアでは、細胞壁４の表面の共有結合型の糖鎖３がピルビン酸で修飾されにくくなるため、細胞壁４と外膜５との結合力が弱まり、外膜５が細胞壁４から部分的に脱離しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリアでは、菌体内産生物質が菌体外に漏出しやすくなるため、菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質も菌体外に漏出しやすくなる。
　また、上述したとおり、タンパク質のアミノ酸配列が３０％以上同一であれば、当該タンパク質と同等の機能を有する可能性が高いと言われている。そのため、機能が抑制される細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９としては、例えば、上記の配列番号４～６で示される細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９のいずれかのアミノ酸配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、細胞壁４のペプチドグリカン２の共有結合型の糖鎖３をピルビン酸で修飾する反応を触媒する機能を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。
　なお、本明細書において、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６の機能を抑制するとは、当該タンパク質の細胞壁４との結合能力を抑制すること、当該タンパク質の外膜５への輸送を抑制すること、又は、当該タンパク質が外膜５に埋め込まれて機能する能力を抑制することである。
　なお、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の機能を抑制するとは、当該タンパク質が細胞壁４の共有結合型の糖鎖３をピルビン酸で修飾する機能を抑制することである。
　これらのタンパク質の機能を抑制する手段としては、タンパク質の機能の抑制に通常使用される手段であれば特に限定されない。当該手段は、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子を欠失若しくは不活性化させること、これらの遺伝子の転写を阻害すること、これらの遺伝子の転写産物の翻訳を阻害すること、又は、これらのタンパク質を特異的に阻害する阻害剤を投与することなどであってもよい。
　本実施の形態では、改変シアノバクテリアは、外膜５と細胞壁４とこれにより、改変シアノバクテリアでは、細胞壁４と外膜５との結合に関与するタンパク質の発現が抑制されるため、又は、当該タンパク質の機能が抑制されるため、細胞壁４と外膜５との結合（つまり、結合量及び結合力）が部分的に低減する。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜５が細胞壁４から部分的に脱離しやすくなるため、改変シアノバクテリアは、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物などの菌体内産生物質が外膜５の外、つまり、菌体外に漏出しやすくなる。そのため、改変シアノバクテリアは、菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質を菌体外に分泌する植物酸性インベルターゼ活性化物質の分泌生産性が向上する。これにより、菌体を破砕するなどの、菌体内産生物質の抽出処理が不要となるため、菌体内産生物質の生理活性の低下及び収率の低下が起こりにくくなる。そのため、菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質の生理活性の低下及び収率の低下も起こりにくくなるため、植物酸性インベルターゼ活性化効果が向上した植物酸性インベルターゼ活性化剤を製造することができる。また、上記の菌体内産生物質の抽出処理が不要となるため、当該物質を回収した後も、改変シアノバクテリアを繰り返し使用して植物酸性インベルターゼ活性化物質を産生させることができる。
　外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子は、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子の少なくとも１つであってもよい。改変シアノバクテリアでは、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子の少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている。そのため、改変シアノバクテリアでは、例えば、（ｉ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つの発現が抑制される、又は、（ｉｉ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つの機能が抑制される。そのため、外膜５中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６のＳＬＨドメイン７と、細胞壁４の表面の共有結合型の糖鎖３との結合（つまり、結合量及び結合力）が低減する。これにより、外膜５と細胞壁４との結合が弱まった部分において外膜５が細胞壁４から脱離しやすくなる。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜５と細胞壁４との結合が低減することにより外膜５が細胞壁４から部分的に脱離しやすくなるため、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物が菌体外に漏出しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリアの菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質も菌体外に漏出しやすくなる。
　本実施の形態では、シアノバクテリアにおけるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つの機能を抑制するために、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子の少なくとも１つの転写を抑制してもよい。
　例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子は、親シアノバクテリアがSyenchocystis属の場合、slr1841、slr1908、又は、slr0042等であってもよく、Synechococcus属の場合、nies970_09470等であってもよく、親シアノバクテリアがAnabaena属の場合、anacy_5815又はanacy_3458等であってもよく、親シアノバクテリアがMicrocystis属の場合、A0A0F6U6F8_MICAE等であってもよく、親シアノバクテリアがCyanothese属の場合、A0A3B8XX12_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがLeptolyngbya属の場合、A0A1Q8ZE23_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがCalothrix属の場合、A0A1Z4R6U0_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがNostoc属の場合、A0A1C0VG86_9NOSO等であってもよく、親シアノバクテリアがCrocosphaera属の場合、B1WRN6_CROS5等であってもよく、親シアノバクテリアがPleurocapsa属の場合、K9TAE4_9CYAN等であってもよい。これらの遺伝子の塩基配列は、上述したNCBIデータベース又はCyanobaseから入手できる。
　より具体的には、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子は、Synechocystis sp. PCC 6803のslr1841（配列番号７）、Synechococcus sp. NIES-970のnies970_09470（配列番号８）、Anabaena cylindrica PCC 7122 のanacy_3458（配列番号９）、又は、これらの遺伝子とアミノ酸配列が５０％以上同一である遺伝子であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、上記の配列番号７～９で示されるいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子又はこれらのいずれかの遺伝子の塩基配列と５０％以上同一である遺伝子が欠失又は不活性化される。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ｉ）上記のいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６若しくはこれらのいずれかのタンパク質と同等の機能を有するタンパク質の発現が抑制される、又は、（ｉｉ）上記のいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６若しくはこれらのいずれかのタンパク質と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制される。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜５が細胞壁４と結合するための結合ドメイン（例えばＳＬＨドメイン７）が細胞壁４と結合する結合量及び結合力が低減するため、外膜５が細胞壁４から部分的に離脱しやすくなる。これにより、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物が菌体外に漏出しやすくなるため、菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質も菌体外に漏出しやすくなる。
　上述したように、タンパク質のアミノ酸配列が３０％以上同一であれば、当該タンパク質と同等の機能を有する可能性が高いと言われている。そのため、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列が３０％以上同一であれば、当該タンパク質と同等の機能を有するタンパク質が発現される可能性が高いと考えられる。そのため、機能が抑制されるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子としては、例えば、上記の配列番号７～９で示されるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子のいずれかの塩基配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつ、細胞壁４の共有結合型の糖鎖３と結合する機能を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
　また、例えば、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子は、親シアノバクテリアがSyenchocystis属の場合、slr0688等であってもよく、親シアノバクテリアがSynechococcus属の場合、syn7502_03092又はsynpcc7942_1529等であってもよく、親シアノバクテリアがAnabaena属の場合、ana_C20348又はanacy_1623等であってもよく、親シアノバクテリアがMicrocystis属の場合、csaB (NCBIのアクセスID：TRU80220)等であってもよく、親シアノバクテリアがCynahothese属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_107667006.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがSpirulina属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_026079530.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがCalothrix属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_096658142.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがNostoc属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_099068528.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがCrocosphaera属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_012361697.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがPleurocapsa属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_036798735）等であってもよい。これらの遺伝子の塩基配列は、上述したNCBIデータベース又はCyanobaseから入手できる。
　より具体的には、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子は、Synechocystis sp. PCC 6803のslr0688（配列番号１０）、Synechococcus sp. PCC 7942のsynpcc7942_1529（配列番号１１）、又は、Anabaena cylindrica PCC 7122 のanacy_1623（配列番号１２）であってもよい。また、これらの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、上記の配列番号１０～１２で示されるいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子又はこれらのいずれかの酵素をコードする遺伝子の塩基配列と５０％以上同一である遺伝子が欠失又は不活性化される。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ｉ）上記のいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９若しくはこれらのいずれかの酵素と同等の機能を有するタンパク質の発現が抑制される、又は、（ｉｉ）上記のいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９若しくはこれらのいずれかの酵素と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制される。これにより、細胞壁４の表面の共有結合型の糖鎖３がピルビン酸で修飾されにくくなるため、細胞壁４の糖鎖３が外膜５中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６のＳＬＨドメイン７と結合する結合量及び結合力が低減する。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアでは、細胞壁４が外膜５と結合するための糖鎖３がピルビン酸で修飾される量が低減するため、細胞壁４と外膜５との結合力が弱まり、外膜５が細胞壁４から部分的に離脱しやすくなる。これにより、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物が菌体外に漏出しやすくなるため、菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質も菌体外に漏出しやすくなる。
　上述したように、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列が３０％以上同一であれば、当該タンパク質と同等の機能を有するタンパク質が発現される可能性が高いと考えられる。そのため、機能が抑制される細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子としては、例えば、上記の配列番号１０～１２で示される細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子のいずれかの塩基配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、細胞壁４のペプチドグリカン２の共有結合型の糖鎖３をピルビン酸で修飾する反応を触媒する機能を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
　[５．改変シアノバクテリアの製造方法]
　続いて、本実施の形態における改変シアノバクテリアの製造方法について説明する。改変シアノバクテリアの製造方法は、シアノバクテリアにおいて外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質の総量が、親株における当該タンパク質の総量の３０％以上７０％以下に抑制させるステップを含む。
　本実施の形態では、外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質は、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つであってもよい。
　なお、タンパク質の機能を抑制する手段としては、特に限定されないが、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子を欠失若しくは不活性化させること、これらの遺伝子の転写を阻害すること、これらの遺伝子の転写産物の翻訳を阻害すること、又はこれらのタンパク質を特異的に阻害する阻害剤を投与することなどであってもよい。
　上記遺伝子を欠失又は不活性化させる手段は、例えば、該当遺伝子の塩基配列上の１つ以上の塩基に対する突然変異の導入、該当塩基配列に対する他の塩基配列への置換若しくは他の塩基配列の挿入、又は、該当遺伝子の塩基配列の一部若しくは全部の削除などであってもよい。
　上記遺伝子の転写を阻害する手段は、例えば、該当遺伝子のプロモーター領域に対する変異導入、他の塩基配列への置換若しくは他の塩基配列の挿入による当該プロモーターの不活性化、又は、CRISPR干渉法（非特許文献１３：Yao et al., ACS Synth. Biol., 2016, 5:207-212）等であってもよい。上記の変異導入、又は塩基配列の置換若しくは挿入の具体的な手法は、例えば、紫外線照射、部位特異的変異導入、又は、相同組換え法などであってもよい。
　また、上記遺伝子の転写産物の翻訳を阻害する手段は、例えば、RNA干渉法などであってもよい。
　以上のいずれかの手段を用いることにより、シアノバクテリアにおける外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質の機能を抑制させて、改変シアノバクテリアを製造してもよい。
　これにより、上記の製造方法で製造された改変シアノバクテリアは、細胞壁４と外膜５との結合（つまり、結合量及び結合力）が部分的に低減するため、外膜５が細胞壁４から部分的に脱離しやすくなる。その結果、改変シアノバクテリアでは、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物などの菌体内産生物質が外膜５の外に（つまり、菌体の外に）漏出しやすくなるため、植物の酸性インベルターゼの活性化に関与する物質（つまり、植物酸性インベルターゼ活性化物質）も菌体外に漏出しやすくなる。したがって、本実施の形態における改変シアノバクテリアの製造方法によれば、植物酸性インベルターゼ活性化物質の分泌生産性が向上した改変シアノバクテリアを提供することができる。
　また、本実施の形態における製造方法で製造された改変シアノバクテリアでは、菌体内で産生された植物酸性インベルターゼ活性化物質が菌体外に漏出するため、当該物質の回収のために菌体を破砕する必要がない。例えば、改変シアノバクテリアを適切な条件で培養し、次いで培養液中に分泌された植物酸性インベルターゼ活性化物質を回収すればよいため、改変シアノバクテリアを培養しながら培養液中の植物酸性インベルターゼ活性化物質を回収することも可能である。そのため、本製造方法により得られる改変シアノバクテリアを使用すれば、効率のよい微生物学的植物酸性インベルターゼ活性化物質の生産を実施することができる。したがって、本実施の形態における改変シアノバクテリアの製造方法によれば、植物酸性インベルターゼ活性化物質を回収した後も繰り返し使用することができる利用効率の高い改変シアノバクテリアを提供することができる。
　［６．植物酸性インベルターゼ活性化方法］
　本実施の形態に係る植物酸性インベルターゼ活性化方法は、上記の植物酸性インベルターゼ活性化剤を植物に使用する。上述したように、本実施の形態に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤は、植物酸性インベルターゼ活性化効果を有する植物酸性インベルターゼ活性化剤であるため、上記の植物酸性インベルターゼ活性化剤を植物に使用することにより、効果的に植物の酸性インベルターゼを活性化させることができる。
　上記の植物酸性インベルターゼ活性化剤は、そのままは勿論、濃縮又は希釈して使用されてもよい。当該植物成長促進剤の植物への適用（つまり、施用）にあたっては、植物の種類、土壌の性質、及び、目的などに応じて、適宜、植物酸性インベルターゼ活性化剤の濃度、及び、適用方法を決定してもよい。植物酸性インベルターゼ活性化剤は、例えば、改変シアノバクテリアの培養液そのものであってもよく、当該培養液から改変シアノバクテリアの菌体を除去した溶液であってもよく、当該培養液から所望の物質を膜技術等により抽出した抽出物であってもよい。所望の物質は、土壌中の養分を分解する酵素であってもよく、土壌中の不溶物質（例えば、鉄などの金属）を可溶化する物質（例えば、キレート効果を有する物質）であってもよく、植物の細胞内生理活性を向上させる物質であってもよい。また、植物酸性インベルターゼ活性化剤の植物への適用方法は、例えば、植物への噴霧、土壌への噴霧、潅水、若しくは、混合、又は、水耕液への混合などであってもよい。例えば、植物体1個体あたり数ミリリットルの植物酸性インベルターゼ活性化剤を週１回程度、植物体の根元に添加してもよい。
　以下、実施例にて本開示の改変シアノバクテリア、改変シアノバクテリアの製造方法及び植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法について具体的に説明するが、本開示は以下の実施例のみに何ら限定されるものではない。
　以下の実施例では、シアノバクテリアの外膜を細胞壁から部分的に脱離させる方法として、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードするslr1841遺伝子の発現抑制（実施例１）、及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードするslr0688遺伝子の発現抑制（実施例２）を行い、２種類の改変シアノバクテリアを製造した。そして、これらの改変シアノバクテリアのタンパク質の分泌生産性の測定と、分泌された菌体内産生物質（ここでは、タンパク質及び細胞内代謝産物）の同定とを行った。なお、本実施例で使用したシアノバクテリア種は、Synechocystis sp. PCC 6803（以下、単に、「シアノバクテリア」と呼ぶ）である。
　（実施例１）
　実施例１では、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードするslr1841遺伝子の発現が抑制された改変シアノバクテリアを製造した。
　（１）slr1841遺伝子の発現が抑制されたシアノバクテリア改変株の構築
　遺伝子発現抑制法として、CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）干渉法を用いた。本方法では、dCas9タンパク質をコードする遺伝子（以下、dCas9遺伝子という）と、slr1841_sgRNA（single-guide Ribonucleic Acid）遺伝子とを、シアノバクテリアの染色体DNAに導入することにより、slr1841遺伝子の発現を抑制することができる。また、slr1841_sgRNAの転写活性を制御することにより、slr1841遺伝子の抑制の程度をコントロールすることができる。
　本方法による遺伝子発現抑制の仕組みは次の通りである。
　まず、ヌクレアーゼ活性を欠損したCas9タンパク質（dCas9）と、slr1841遺伝子の塩基配列に相補的に結合するsgRNA（slr1841_sgRNA）とが、複合体を形成する。
　次に、この複合体がシアノバクテリアの染色体DNA上のslr1841遺伝子を認識し、slr1841遺伝子と特異的に結合する。この結合が立体障害となることにより、slr1841遺伝子の転写が阻害される。その結果、シアノバクテリアのslr1841遺伝子の発現が抑制される。また、slr1841_sgRNAの転写活性を制御することにより、slr1841遺伝子の抑制の程度をコントロールすることができる。
　以下、上記の２つの遺伝子の各々をシアノバクテリアの染色体DNAに導入する方法を具体的に説明する。
　（１－１）dCas9遺伝子の導入
　Synechocystis LY07株（以下、LY07株ともいう）（非特許文献１３参照）の染色体DNAを鋳型として、dCas9遺伝子及びdCas9遺伝子の発現制御のためのオペレーター遺伝子、並びに、遺伝子導入の目印となるスペクチノマイシン耐性マーカー遺伝子を、表１に記載のプライマーpsbA1-Fw（配列番号１３）及びpsbA1-Rv（配列番号１４）を用いてPCR（Polymerase chain reaction）法により増幅した。なお、LY07株では、上記の３つの遺伝子が連結した状態で染色体DNA上のpsbA1遺伝子に挿入されているため、１つのDNA断片としてPCR法により増幅することができる。ここでは、得られたDNA断片を「psbA1::dCas9カセット」と表記する。In-Fusion PCRクローニング法（登録商標）を用いて、psbA1::dCas9カセットをpUC19プラスミドに挿入し、pUC19-dCas9プラスミドを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　得られたpUC19-dCas9プラスミド1μgとシアノバクテリア培養液（菌体濃度OD730=0.5程度）を混合し、自然形質転換によりpUC19-dCas9プラスミドをシアノバクテリアの細胞内に導入した。形質転換された細胞を20μg/mLのスペクチノマイシンを含むBG-11寒天培地上で生育させることにより、選抜した。選抜された細胞では、染色体DNA上のpsbA1遺伝子と、pUC19-dCas9プラスミド上のpsbA1上流断片領域及びpsbA1下流断片領域との間で相同組み換えが起こっている。これにより、psbA1遺伝子領域にdCas9カセットが挿入されたSynechocystis dCas9株を得た。なお、用いたBG-11培地の組成は表２の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（１－２）slr1841_sgRNA遺伝子の導入
　CRISPR干渉法では、sgRNA遺伝子上のprotospacerと呼ばれる領域に、標的配列と相補的な約20塩基の配列を導入することにより、sgRNAが標的遺伝子に特異的に結合する。本実施例で用いたprotospacer配列は表３に示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　Synechocystis LY04株、LY05株、または、LY07株では、sgRNA遺伝子（protospacer領域を除く）とカナマイシン耐性マーカー遺伝子とが連結した形で、染色体DNA上のslr2030-slr2031遺伝子に挿入されている（非特許文献１３参照）。したがって、当該sgRNA遺伝子をPCR法により増幅する際に用いるプライマーにslr1841遺伝子（配列番号７）と相補的なprotospacer配列（配列番号２１）を付与することにより、slr1841を特異的に認識するsgRNA (slr1841_sgRNA)を容易に得ることができる。また、slr1841_sgRNAの転写活性を制御することにより、slr1841遺伝子の抑制の程度をコントロールすることができる。
　まず、LY07株の染色体DNAを鋳型とし、表１に記載のプライマーslr2030-Fw（配列番号１５）及びsgRNA_slr1841-Rv（配列番号１６）のセット、並びに、sgRNA_slr1841-Fw（配列番号１７）及びslr2031-Rv（配列番号１８）のセットを用いて２つのDNA断片をPCR法により増幅した。
　続いて、上記のDNA断片の混合溶液を鋳型として、表１に記載のプライマーslr2030-Fw（配列番号１５）とslr2031-Rv（配列番号１８）とを用いてPCR法により増幅することにより、（i）slr2030遺伝子断片、（ii）slr1841_sgRNA、（iii）カナマイシン耐性マーカー遺伝子、（iv）slr2031遺伝子断片が順に連結したDNA断片（slr2030-2031::slr1841_sgRNA）を得た。In-Fusion PCRクローニング法（登録商標）を用いて、slr2030-2031::slr1841_sgRNAをpUC19プラスミドに挿入し、pUC19-slr1841_sgRNAプラスミドを得た。
　上記（１－１）と同様の方法でpUC19-slr1841_sgRNAプラスミドをSynechocystis dCas9株に導入し、形質転換された細胞を30μg/mLカナマイシンを含むBG-11寒天培地上で選抜した。これにより、染色体DNA上のslr2030-slr2031遺伝子にslr1841_sgRNAが挿入された形質転換体Synechocystis dCas9 slr1841_sgRNA株（以下、slr1841抑制株ともいう）を得た。
　（１－３）slr1841遺伝子の抑制
　上記dCas9遺伝子及びslr1841_sgRNA遺伝子は、アンヒドロテトラサイクリン（aTc）の存在下で発現誘導されるようにプロモーター配列が設計されている。本実施例では、培地中に終濃度1μg/mL aTcを添加することによりslr1841遺伝子の発現を抑制した。
　以上のようにして、実施例１では、細胞の増殖能力を損なわせることなく、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が、親株（Synechocystis dCas9株、後述の比較例１）における当該タンパク質の量と比較して、３０％程度に抑制された改変シアノバクテリアSynechocystis dCas9 slr1841_sgRNA株（いわゆる、slr1841抑制株）を得た。ここで、外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質は、slr1841、slr1908およびslr0042である。なお、外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の量の測定結果については、後述の（８－１）で説明する。
　（実施例２）
　実施例２では、下記の手順により、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードするslr0688遺伝子の発現が抑制された改変シアノバクテリアを得た。
　（２）slr0688遺伝子の発現が抑制されたシアノバクテリア改変株の構築
　上記（１－２）と同様の手順により、slr0688遺伝子（配列番号４）と相補的なprotospacer配列（配列番号２２）を含むsgRNA遺伝子をSynechocystis dCas9株に導入し、Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株を得た。なお、表１に記載のプライマーslr2030-Fw（配列番号１５）及びsgRNA_slr0688-Rv（配列番号１９）のセット、並びに、sgRNA_slr0688-Fw（配列番号２０）及びslr2031-Rv（配列番号１８）のセットを用いたことと、（i）slr2030遺伝子断片、（ii）slr0688_sgRNA、（iii）カナマイシン耐性マーカー遺伝子、（iv）slr2031遺伝子断片が順に連結したDNA断片（slr2030-2031::slr0688_sgRNA）をIn-Fusion PCRクローニング法（登録商標）を用いて、pUC19プラスミドに挿入し、pUC19-slr0688_sgRNAプラスミドを得たこと以外は、上記（１－２）と同様の条件で行った。また、slr0688_sgRNAの転写活性を制御することにより、slr0688遺伝子の抑制の程度をコントロールすることができる。
　さらに、上記（１－３）と同様の手順により、slr0688遺伝子の発現を抑制した。
　以上のようにして、実施例２では、細胞の増殖能力を損なわせることなく、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の量が、親株（Synechocystis dCas9株、後述の比較例１）における当該タンパク質の量と比較して、５０％程度に抑制された改変シアノバクテリアSynechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株（以下、slr0688抑制株ともいう）を得た。ここで、外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質は、slr0688である。なお、外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の量に関係するピルビン酸量の測定結果については、後述の（８－４）で説明する。
　（比較例１）
　比較例１では、実施例１の（１－１）と同様の手順により、Synechocystis dCas9株を得た。
　続いて、実施例１、実施例２及び比較例１で得られた菌株について、それぞれ、細胞表層の状態の観察及びタンパク質の分泌生産性試験を行った。以下、詳細について説明する。
　（３）菌株の細胞表層の状態の観察
　実施例１で得られた改変シアノバクテリアSynechocystis dCas9 slr1841_sgRNA株（つまり、slr1841抑制株）、実施例２で得られた改変シアノバクテリアSynechocystis dCas9slr0688_sgRNA株（いわゆる、slr0688抑制株）、及び、比較例１で得られた改変シアノバクテリアSynechocystis dCas9株（以下、Control株という）のそれぞれの超薄切片を作製し、電子顕微鏡を用いて細胞表層の状態（言い換えると、外膜構造）を観察した。
　（３－１）菌株の培養
　初発菌体濃度OD730=0.05となるように、実施例１のslr1841抑制株を、1μg/mL aTcを含むBG-11培地に接種し、光量100μmol/m2/s、30℃の条件下で5日間振盪培養した。なお、実施例２のslr0688抑制株及び比較例１のControl株も実施例１と同様の条件で培養した。
　（３－２）菌株の超薄切片の作製
　上記（３－１）で得られた培養液を、室温にて2,500gで10分間遠心分離し、実施例１のslr1841抑制株の細胞を回収した。次いで、細胞を-175℃の液体プロパンで急速凍結した後、2%グルタルアルデヒド及び1%タンニン酸を含むエタノール溶液を用いて-80℃で2日間固定した。固定後の細胞をエタノールにより脱水処理し、脱水した細胞を酸化プロピレンに浸透させたあと、樹脂（Quetol-651）溶液中に沈めた。その後60℃で48時間静置し、樹脂を硬化させて、細胞を樹脂で包埋した。樹脂中の細胞を、ウルトラミクロトーム（Ultracut）を用いて70nmの厚さに薄切し、超薄切片を作製した。この超薄切片を、2%酢酸ウラン及び1%クエン酸鉛溶液を用いて染色して、実施例１のslr1841抑制株の透過型電子顕微鏡の試料を準備した。なお、実施例２のslr0688抑制株及び比較例１のControl株についてもそれぞれ同様の操作を行い、透過型電子顕微鏡の試料を準備した。
　（３－３）電子顕微鏡による観察
　透過型電子顕微鏡（JEOL　JEM-1400Plus）を用いて、加速電圧100kV下で、上記（３－２）で得られた超薄切片の観察を行った。観察結果を図３～図８に示す。
　まず、実施例１のslr1841抑制株について説明する。図３は、実施例１のslr1841抑制株のＴＥＭ（Transmission Electron Microscope）像である。図４は、図３の破線領域Ａの拡大像である。図４の（ａ）は、図３の破線領域Ａの拡大ＴＥＭ像であり、図４の（ｂ）は、図４の（ａ）の拡大ＴＥＭ像を描写した図である。
　図３に示されるように、実施例１のslr1841抑制株では、外膜が細胞壁から部分的に剥離し（つまり、外膜が部分的に剥がれ落ち）、かつ、外膜が部分的に撓んでいた。
　細胞表層の状態をより詳細に確認するために、破線領域Ａを拡大観察したところ、図４の（ａ）及び図４の（ｂ）に示されるように、外膜が部分的に剥がれ落ちた部分（図中の一点破線領域ａ１及びａ２）を確認できた。また、一点破線領域ａ１の傍に外膜が大きく撓んだ部分を確認できた。この部分は、外膜と細胞壁との結合が弱められた部分であり、培養液が外膜からペリプラズム内に浸透したため、外膜が外側に膨張されて、撓んだと考えられる。
　続いて、実施例２のslr0688抑制株について説明する。図５は、実施例２のslr0688抑制株のＴＥＭ像である。図６は、図５の破線領域Ｂの拡大像である。図６の(ａ)は、図５の破線領域Ｂの拡大ＴＥＭ像であり、図６の（ｂ）は、図６の（ａ）の拡大ＴＥＭ像を描写した図である。
　図５に示されるように、実施例２のslr0688抑制株では、外膜が細胞壁から部分的に剥離し、かつ、外膜が部分的に撓んでいた。また、slr0688抑制株では、外膜が部分的に細胞壁から脱離していることが確認できた。
　細胞表層の状態をより詳細に確認するために、破線領域Ｂを拡大観察したところ、図６の（ａ）及び図６の（ｂ）に示されるように、外膜が大きく撓んだ部分（図中の一点破線領域ｂ１）、及び、外膜が部分的に剥がれ落ちた部分（図中の一点破線領域ｂ２及びｂ３）を確認できた。また、一点破線領域ｂ１、ｂ２及びｂ３それぞれの近傍に外膜が細胞壁から脱離している部分を確認できた。
　続いて、比較例１のControl株について説明する。図７は、比較例１のControl株のＴＥＭ像である。図８は、図７の破線領域Ｃの拡大像である。図８の（ａ）は、図７の破線領域Ｃの拡大ＴＥＭ像であり、図８の（ｂ）は、図８の（ａ）の拡大ＴＥＭ像を描写した図である。
　図７及び図８に示されるように、比較例１のControl株の細胞表層は整っており、内膜、細胞壁、外膜、及びＳ層が順に積層された状態を保っていた。つまり、Control株では、実施例１及び２のように外膜が細胞壁から脱離した部分、外膜が細胞壁から剥離した（つまり、剥がれ落ちた）部分、及び、外膜が撓んだ部分は見られなかった。
　（４）タンパク質の分泌生産性試験
　実施例１のslr1841抑制株、実施例２のslr0688抑制株、及び、比較例１のControl株をそれぞれ培養し、細胞外に分泌されたタンパク質量（以下、分泌タンパク質量ともいう）を測定した。培養液中のタンパク質量により、上記の菌株それぞれのタンパク質の分泌生産性を評価した。なお、タンパク質の分泌生産性とは、細胞内で産生されたタンパク質を細胞外に分泌することにより、タンパク質を生産する能力をいう。以下、具体的な方法について説明する。
　（４－１）菌株の培養
　実施例１のslr1841抑制株を上記（３－１）と同様の方法で培養した。培養は、独立して３回行った。なお、実施例２及び比較例１の菌株についても実施例１の菌株と同様の条件で培養した。
　（４－２）細胞外に分泌されたタンパク質の定量
　上記（４－１）で得られた培養液を、室温にて2,500gで10分間遠心分離し、培養上清を得た。得られた培養上清を、ポアサイズ0.22μmのメンブレンフィルターを用いてろ過し、実施例１のslr1841抑制株の細胞を完全に除去した。ろ過後の培養上清に含まれる総タンパク質量をBCA（Bicinchoninic Acid）法により定量した。この一連の操作を、独立して培養した3つの培養液のそれぞれについて行い、実施例１のslr1841抑制株の細胞外に分泌されたタンパク質量の平均値及び標準偏差を求めた。なお、実施例２及び比較例１の菌株についても、それぞれ、同様の条件で3つの培養液のタンパク質の定量を行い、3つの培養液中のタンパク質量の平均値及び標準偏差を求めた。
　結果を図９に示す。図９は、実施例１、実施例２及び比較例１の改変シアノバクテリアの培養液中のタンパク質量（n=3、エラーバー=SD）を示すグラフである。
　図９に示されるように、実施例１のslr1841抑制株及び実施例２のslr0688抑制株のいずれも、比較例１のControl株と比較して培養上清中に分泌されたタンパク質量(mg/L)が約25倍向上していた。
　データの記載を省略するが、培養液の吸光度（730nm）を測定し、菌体乾燥重量1gあたりの分泌タンパク質量（mg protein/g cell dry weight）を算出したところ、実施例１のslr1841抑制株及び実施例２のslr0688抑制株のいずれも、菌体乾燥重量1gあたりの分泌タンパク質量（mg protein/g cell dry weight）は、比較例１のControl株と比較して、約36倍向上していた。
　また、図９に示されるように、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子（slr1841）の発現を抑制した実施例１のslr1841抑制株よりも、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子（slr0688）の発現を抑制した実施例２のslr0688抑制株の方が、培養上清中に分泌されたタンパク質量が多かった。これは、外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質（Slr1841）の数よりも細胞壁表面の共有結合型の糖鎖の数の方が多いことが関係していると考えられる。つまり、実施例２のslr0688抑制株の方が、実施例１のslr1841抑制株よりも外膜と細胞壁との結合量及び結合力がより低下したため、分泌されたタンパク質量が実施例１のslr1841抑制株よりも多くなったと考えられる。
　以上の結果より、外膜と細胞壁との結合に関連するタンパク質の機能を抑制することにより、シアノバクテリアの外膜と細胞壁との結合が部分的に弱められ、外膜が細胞壁から部分的に脱離することが確認できた。外膜と細胞壁との結合が弱まることにより、シアノバクテリアの細胞内で産生されたタンパク質が細胞外に漏出しやすくなることも確認できた。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリア及びその製造方法によれば、タンパク質の分泌生産性が大きく向上することが示された。
　（５）分泌されたタンパク質の同定
　続いて、上記（４－２）で得られた培養上清中に含まれる分泌タンパク質を、LC-MS/MSにより同定した。方法を以下に説明する。
　（５－１）試料調製
　培養上清の液量に対して8倍量の冷アセトンを加え、20℃で2時間静置後、20,000gで15分間遠心分離し、タンパク質の沈殿物を得た。この沈殿物に100mM Tris pH8.5、0.5%ドデカン酸ナトリウム（SDoD）を加え、密閉式超音波破砕機によってタンパク質を溶解した。タンパク質濃度1μg/mLに調整後、終濃度10mMのジチオスレイトール（DTT）を添加して50℃で30分間静置した。続いて、終濃度30mMのヨードアセトアミド（IAA）を添加し、室温（遮光）で30分間静置した。IAAの反応を止めるために、終濃度60mMのシステインを添加して室温で 10分間静置した。トリプシン400 ngを添加して37℃で一晩静置し、タンパク質をペプチド断片化した。5%TFA（Trifluoroacetic Acid）を加えた後、室温にて15,000gで10分間遠心分離し、上清を得た。この作業によりSDoDが除去された。C18スピンカラムを用いて脱塩後、遠心エバポレーターにより試料を乾固した。その後、3%アセトニトリル、0.1%ギ酸を加え、密閉式超音波破砕機を用いて試料を溶解した。ペプチド濃度200ng/μLになるように調製した。
　（５－２）LC-MS/MS分析
　上記（５－１）で得られた試料をLC-MS/MS装置（UltiMate 3000 RSLCnano LC System) を用いて以下の条件で解析を実施した。
　試料注入量：200ng
　カラム：CAPCELL CORE MP 75μm×250mm
　溶媒：A溶媒は0.1%ギ酸水溶液、B溶媒は0.1%ギ酸+80%アセトニトリル
　グラジエントプログラム：試料注入4分後にB溶媒8%、27分後にB溶媒44%、28分後にB溶媒80%、34分後に測定終了
　（５－３）データ解析
　得られたデータは以下の条件で解析し、タンパク質及びペプチドの同定ならびに定量値の算出を行った。
　ソフトウェア：Scaffold DIA
　データベース：UniProtKB/Swiss Prot database ( Synechocystis sp. PCC 6803)
　Fragmentation：HCD
　Precursor Tolerance：8ppm
　Fragment Tolerance：10ppm
　Data Acquisition Type：Overlapping DIA
　Peptide Length：8-70
　Peptide Charge：2-8
　Max Missed Cleavages：1
　Fixed Modification：Carbamidomethylation
　Peptide FDR： 1%以下
　同定されたタンパク質のうち相対定量値が最も大きかった30種類のタンパク質のうち、明らかな酵素活性を持つと予想されるものを表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　これら6種類のタンパク質は、全て、実施例１のslr1841抑制株及び実施例２のslr0688抑制株の培養上清のそれぞれに含まれていた。これらのタンパク質の全てにおいて、ペリプラズム（外膜と内膜との間隙を指す）移行シグナルが保持されていた。この結果により、実施例１及び実施例２の改変株では、外膜が細胞壁から部分的に脱離することによってペリプラズム内のタンパク質が外膜の外（つまり、菌体外）に漏出しやすくなることが確認できた。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアは、タンパク質の分泌生産性が大幅に向上していることが示された。
　（６）分泌された細胞内代謝産物の同定
　（６－１）試料調製
　改変シアノバクテリアの培養上清80μlに対し内部標準物質の濃度を1,000μMとなるよう調整した20μlの水溶液を加えて攪拌し、限外ろ過後、測定に供した。
　（６－２）CE（Capillary electrophoresis）-TOFMS（Time-Of-Flight Mass Spectrometry）分析
　本試験ではカチオンモード、及び、アニオンモードの測定を以下に示す条件で行った。
　［カチオンモード］
　装置：Agilent CE-TOFMS system
　Capillary: Fused silica capillary i.d. 50μm×80cm
　測定条件：
　　Run buffer: Cation buffer solution (p/n: H3301-1001)
　　CE voltage: Positive, 30kV
　　MS ionization: ESI positive
　　MS scan range: m/z 50-1,000
　［アニオンモード］
　装置：Agilent CE-TOFMS system
　Capillary: Fused silica capillary i.d. 50μm×80cm
　測定条件：
　　Run buffer: Anion buffer solution (p/n: H3301-1001)
　　CE voltage: Positive, 30kV
　　MS ionization: ESI negative
　　MS scan range: m/z 50-1,000
　（６－３）データ処理
　CE-TOFMSで検出されたピークは、自動積分ソフトウェアMasterHands（登録商標） ver.2.17.1.11を用いて、シグナル/ノイズ比3以上のピークを自動検出した。検出されたピークに対して、各代謝産物固有の質量電荷比（m/z）と泳動時間の値を元に、HMT（ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ（株））の代謝物質ライブラリに登録された全物質の値と照合して、改変シアノバクテリアの培養上清に含まれる代謝産物を検索した。検索のための許容誤差は、泳動時間で+/-0.5min、m/zで+/-10ppmとした。同定された各代謝産物について100μMの一点検量として濃度を算出した。同定された主要な代謝産物を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　これら12種類の細胞内代謝産物は、全て、実施例１のslr1841抑制株及び実施例２のslr0688抑制株の培養上清のそれぞれに含まれていた。データは載せていないが、比較例１のControl株の培養上清には、これらの代謝産物は含まれていなかった。この結果により、実施例１及び実施例２の改変株では、外膜が細胞壁から部分的に脱離することによって細胞内代謝産物が外膜の外（つまり、菌体外）に漏出しやすくなることが確認できた。
　（７）栽培試験及び酸性インベルターゼ活性測定試験
　続いて、改変シアノバクテリアの分泌物（ここでは、改変シアノバクテリアの培養上清）の植物酸性インベルターゼ活性化効果を評価するために、以下の植物栽培試験を実施した。具体的には、葉菜類生産に対する効果を評価するために、ホウレン草の栽培試験を実施した。また、果実生産に対する効果を評価するために、イチゴの栽培試験を実施した。以下、これらの栽培試験についてそれぞれ説明する。
　（７－１）ホウレン草栽培試験
　まず、栽培用ポット（12cm×10cm）に、市販の培養土入れ、ポットあたり3粒のホウレン草の種子を播種した。栽培は、室内温度が23℃、白色光源の光量子束密度が200μmol/m2/sで、明条件10時間及び暗条件14時間の条件で40日間行った。その間、各ポットに、50mLの蒸留水を2日おきに給水した。栽培開始からおよそ１週間後、子葉が展開した段階で間引きし、各ポットにおける個体サイズを揃えた。
　（実施例３）
　上記のように、各ポットの個体サイズを揃えた後、改変シアノバクテリアの培養上清（以下、改変シアノバクテリアの分泌物と呼ぶ）を1株あたり5mL、1週間に1回、ホウレン草の根元に添加した。40日間栽培し、収穫後に地上部乾重量を測定し、その平均値及び標準偏差（SD）を求めた。また、下記に示す方法で酸性インベルターゼ活性を測定し、その平均値及び標準偏差（SD）を求めた。なお、改変シアノバクテリアは、実施例１のslr1841抑制株及び実施例２のslr0688抑制株である。
　（酸性インベルターゼ活性測定）
　葉長10cm程度の葉を各株から数枚切り取り、重量を測定した。葉を液体窒素で凍結したあと、乳鉢ですりつぶした。ここに、下記の抽出バッファーを3mL加え、ガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズし、抽出液を調製した。この抽出液20μLを、180μLの酸性インベルターゼ反応用溶液（50mM sodium acetate pH4.3、0.1M sucroseから成る）に加え、30℃で1時間静置し、抽出液と酸性インベルターゼ反応溶液とを反応させた。その後、85℃で3分間インキュベートすることにより反応停止させた。この反応の間に生成されたグルコース量を市販のグルコース定量キットを用いて定量した。この値から、葉重量1gが1時間に生成するグルコース量を酸性インベルターゼ活性として算出し、その平均値及び標準偏差（SD）を求めた。
　＜抽出バッファー＞
　抽出バッファーは、下記組成から成る。
　100 mM HEPES（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid ）-KOH pH7.4
　5mM MgCl２
　1mM EDTA（ethylenediaminetetraacetic acid）
　1mM EGTA(ethyleneglycol-bis(β-aminoehylether)-tetraacetic acid)
　1mM PMSF（phenmethylsulphonyl-fluoride）
　5mM DTT（dithiothreitol）
　1mL/L Triton X-100
　200mL/L glycerol
　5mM thiourea
　（比較例２）
　改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、水を使用したこと以外、実施例３と同様に行った。
　（結果）
　実施例３及び比較例２の結果を図１０及び図１１に示す。図１０は、実施例３及び比較例２で栽培されたホウレン草の酸性インベルターゼ活性の平均値を示すグラフである。図１１は、実施例３及び比較例２で栽培されたホウレン草1株あたりの地上部乾燥重量の平均値（平均株重量という）を示すグラフである。
　図１０に示されるように、実施例３で栽培されたホウレン草の酸性インベルターゼ活性は、比較例２と比較して、約2.3倍に上昇していた。
　また、図１１に示されるように、実施例３で栽培されたホウレン草の株重量は、比較例１と比べて約1.4倍に増加していた。
　したがって、改変シアノバクテリアの分泌物をホウレン草に施用すると、ホウレン草の酸性インベルターゼが活性化されること、及び、酸性インベルターゼの活性化によりホウレン草の成長促進、及び、増体などの効果が見られることが確認された。
　（７－２）イチゴ栽培試験
　葉数約9枚、株長約7cmのイチゴ苗を市販の培養土を入れた栽培用ポット（12cm×10cm）に定植した。栽培は、明期温度が20℃、暗期温度が15℃、白色光源の光量子束密度が200μmol/m2/sで、明条件14時間及び暗条件10時間の条件で150日間行った。その間、各ポットに、50mLの蒸留水を1日おきに給水した。また、50日に1回、市販の化学肥料（窒素全量6%、水溶性リン酸10%、水溶性カリウム5%、水溶性苦土0.05%、水溶性マンガン0.001%、及び、水溶性ホウ素0.005%を含む原液の500倍希釈液）を各ポットあたり100mL施用した。
　（実施例４）
　上記の栽培期間中、改変シアノバクテリアの分泌物を1株あたり5mL、1週間に1回、根元に添加した。イチゴ果実が赤く成熟したものから順に収穫し、収穫した果実数を記録した。また、収穫した果実の重量及び糖度（Brix値）を測定し、それらの平均値及び標準偏差（SD）を求めた。また、果実を数個使用する点以外、実施例３と同様の方法で、酸性インベルターゼ活性を測定した。ここでは、果実1gが1時間に生成するグルコース量を酸性インベルターゼ活性とする。なお、改変シアノバクテリアは、実施例１のslr1841抑制株及び実施例２のslr0688抑制株である。
　（比較例３）
　改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、水を使用したこと以外、実施例４と同様に行った。
　（結果）
　実施例４及び比較例３の結果を図１２～図１６に示す。図１２は、実施例４及び比較例３で栽培されたイチゴの酸性インベルターゼ活性の平均値を示すグラフである。図１３は、実施例４及び比較例３で栽培されたイチゴ1株あたりの平均果実数を示すグラフである。図１４は、実施例４及び比較例３で栽培されたイチゴ1株あたりの平均果実重量を示すグラフである。図１５は、実施例４及び比較例３で栽培されたイチゴ1株あたりの平均糖度を示すグラフである。
　また、図１６には、実施例４及び比較例３それぞれの果実の状態を視覚的に示すために、代表的な果実の写真を掲載している。
　図１２に示されるように、実施例３で栽培されたイチゴの植物酸性インベルターゼ活性は、比較例１と比較して約2.3倍に上昇していた。
　また、図１３に示されるように、実施例４で収穫された1株あたりの平均果実数は、比較例３と比較して約1.4倍に増加していた。
　また、図１４に示されるように、実施例４で収穫されたイチゴの平均果実重量は、有意な差はなかった。つまり、実施例４で栽培されたイチゴは、1株あたり収穫される果実数が多くなっているにもかかわらず、平均果実重量が比較例３と同等であった。
　また、図１５に示されるように、実施例４で収穫されたイチゴの果実の平均糖度（Brix糖度）は、比較例３よりも約1.1倍向上していた。つまり、実施例４で栽培されたイチゴは、収穫される果実数が多くなっているにもかかわらず、果実の平均糖度が高くなっていた。
　また、図１６に示されるように、実施例４及び比較例３のそれぞれで収穫されたイチゴの果実は、大きさ、形状、及び、色味などの外見に差異はなかった。つまり、実施例４で栽培されたイチゴは、収穫される果実数が多くなっているにもかかわらず、果実のサイズなども比較例３と同等であった。
　したがって、改変シアノバクテリアの分泌物をイチゴに施用すると、イチゴの酸性インベルターゼが活性化されること、及び、酸性インベルターゼの活性化によりイチゴの成長促進、果実数の増加、果実サイズの維持、及び、果実糖度の上昇など効果が見られることが確認された。
　（まとめ）
　ホウレン草及びイチゴの栽培試験並びに酸性インベルターゼ活性測定の結果から、本実施の形態に係る植物酸性インベルターゼ活性化剤は、複数の作物種に対して、生育促進、増収、増体、及び、果実の糖度上昇などの効果を有することが確認できた。
　（８）非特許文献６および７に記載された従来例との比較
　以下に、非特許文献６および７に記載された従来例である比較例４および比較例５と、本実施の形態である実施例１および実施例２との比較結果について説明する。
　（比較例４）
　比較例４では、非特許文献６の記載に基づいてslr1908を欠損させた改変シアノバクテリア（以下、slr1908欠損株ともいう）を得た。
　（比較例５）
　比較例５では、非特許文献７の記載に基づいてslr0042を欠損させた改変シアノバクテリア（以下、slr0042欠損株ともいう）を得た。
　（８－１）外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量の比較
　実施例１のslr1841抑制株、実施例２のslr0688抑制株、比較例４のslr1908欠損株、および、比較例５のslr0042欠損株を上記（３－１）と同様の手順で培養したあと、培養液を5,000×gで10分間遠心し、菌体ペレットを得た。超音波破砕機にて菌体を破砕し、5,000×gで10分間遠心することにより未破砕の菌体を沈殿させ除去したあと、遠心上清をさらに20,000×gで30分間遠心して菌体由来膜画分ペレットを得た。この膜画分ペレットを2％SDS中で37℃、15分間インキュベートすることにより外膜以外の成分を可溶化させ、次に20,000×gで30分間遠心することにより、外膜画分ペレットを得た。上記（４－２）に記載のBCA法により外膜画分ペレットに含有されるタンパク質量を定量したあと、5μgタンパク質当量を電気泳動（SDS-PAGE）に供し、外膜ペレット画分に含まれるタンパク質成分を分析した。
　実施例１の改変シアノバクテリア（つまり、slr1841抑制株）、比較例１、比較例４および比較例５の改変シアノバクテリア（つまり、Control株、slr1908欠損株、および、slr0042欠損株）における、外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質（slr1841、slr1908、およびslr0042）それぞれの量を示す電気泳動結果を図１７に示す。図１７の（ａ）は、実施例１、実施例２比較例１、比較例４及び比較例５の改変シアノバクテリアにおける外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の量を示す電気泳動像である。図１７の（ｂ）は、破線領域Ｚの拡大図である。図１７の（ａ）および図１７の（ｂ）に示される電気泳動写真におけるバンドの強度（濃さおよび太さ）は、それぞれのタンパク質の量を表す。図１７の（ａ）において、Ａは分子量マーカー、Ｂは比較例１、Ｃは比較例１０、Ｄは実施例１、Ｅは比較例９の電気泳動像である。バンド強度は、ImageJソフトウェアを用いて定量した。
　バンド強度の比較から、実施例１のslr1841抑制株は、slr1841タンパク質の発現が抑制されることにより、外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質（slr1841、slr1908、およびslr0042）の合計量が親株である比較例１のControl株に比べて約30％程度まで低下している。
　一方で、比較例５のslr0042欠損株は、図１７の（ｂ）に示されるように、もともと親株（つまり、比較例１のControl株）に含まれるslr0042タンパク質量が非常に少ないことから、親株のslr0042遺伝子を欠損させても外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質（slr1841、slr1908、およびslr0042）の合計量は、親株である比較例１のControl株に比べて数％程度しか低下していない。
　他方、比較例４のslr1908欠損株は、slr1908タンパク質が欠損する代わりに、slr1841タンパク質の量が増加しているため、外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質（slr1841、slr1908、およびslr0042）の合計量は親株である比較例１のControl株に比べて、10％程度増加している。ある任意の外膜タンパク質の欠損により、別の類似の外膜タンパク質の増加が起こる現象は、他の細菌においてよく見られる現象である。
　（８－２）電子顕微鏡写真
　比較例４および比較例５の改変シアノバクテリアの外膜の状態を上記（３）と同様の条件で透過電子顕微鏡を用いて観察した。観察結果を図１８～図２１に示す。
　まず、比較例４のslr1908欠損株について説明する。図１８は、比較例４の改変シアノバクテリアの超薄切片の透過型電子顕微鏡像である。図１９は、図１８の破線領域Ｄの拡大図である。図１８および図１９に示されるように、比較例４のslr1908欠損株の細胞表層は整っており、内膜、細胞壁、外膜、及びＳ層が順に積層された状態を保っていた。つまり、比較例４のslr1908欠損株の外膜構造は、親株である比較例１のControl株と差異がほとんど無かった。
　続いて、比較例５のslr0042欠損株について説明する。図２０は、比較例５の改変シアノバクテリアの超薄切片の透過型電子顕微鏡像である。図２１は、図２０の破線領域Ｅの拡大図である。図２０および図２１に示されるように、比較例５のslr0042欠損株の細胞表層は整っており、内膜、細胞壁、外膜、及びＳ層が順に積層された状態を保っていた。つまり、比較例５のslr0042欠損株の外膜構造は、親株である比較例１のControl株と差異がほとんど無かった。
　（８－３）分泌生産されるタンパク質の量
　実施例１、実施例２、比較例１、比較例４及び比較例５の改変シアノバクテリアを培養した際の、培養上清中に分泌生産されるタンパク質量を上記（４－２）と同様に測定した。その結果を図２２に示す。図２２は、実施例１、実施例２、比較例１、比較例４及び比較例５の改変シアノバクテリアの培養液中のタンパク質の量を示すグラフである。図２２に示されるように、実施例１のslr1841抑制株および実施例２のslr0688抑制株は、培養液中に多量のタンパク質を分泌生産しているが、比較例１のControl株、比較例４のslr0042欠損株、および、比較例５のslr0042欠損株は、培養液中に殆どタンパク質を分泌生産していないことが確認された。
　（８－４）ピルビン酸量の比較
　実施例２の改変シアノバクテリア（つまり、slr0688抑制株）および比較例１の改変シアノバクテリア（つまり、Control株）の菌体由来膜画分ペレットを上記（８－１）と同様の方法で得た。これを2％SDS中で1時間煮沸したあと40,000×gで60分間遠心することにより、細胞壁画分を沈殿させた。細胞壁画分を0.5 M HClに懸濁し、100℃で30分間加水分解を行った。NaOHを添加しpHを7.0に調整したあと、この加水分解産物中に含まれるピルビン酸量を市販のピルビン酸定量キットを用いて定量した。ピルビン酸量の定量結果を図１８に示す。図２３は、実施例２及び比較例１の改変シアノバクテリアの細胞壁結合型糖鎖に共有結合しているピルビン酸の量を示すグラフである。図２３に示されるように、実施例２のslr0688抑制株では、親株である比較例１のControl株に比べて、ピルビン酸量が約50％程度まで低下していることが確認された。このことから、外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質である細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の量についても、親株における当該タンパク質の約50％程度に抑制されていると考えられる。
　本開示によれば、植物酸性インベルターゼ活性化剤物質の分泌生産性が向上した改変シアノバクテリアを提供することができる。また、本開示の改変シアノバクテリアを培養すれば、効率良く上記物質を製造することができ、例えば当該物質を土に添加することにより植物の酸性インベルターゼを活性化させることができるため、作物生産を増進することができる。
　１　内膜
　２　ペプチドグリカン
　３　糖鎖
　４　細胞壁
　５　外膜
　６　ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質
　７　ＳＬＨドメイン
　８　有機物チャネルタンパク質
　９　細胞壁－ピルビン酸修飾酵素

Claims (10)

  1. 　シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が、親株における当該タンパク質の総量の３０～７０％に抑制されている改変シアノバクテリアを準備するステップと、
    　前記改変シアノバクテリアに植物の酸性インベルターゼの活性化に関与する分泌物を分泌させるステップと、
    　を含む、
    　植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法。
  2. 　前記外膜と前記細胞壁との結合に関与するタンパク質は、ＳＬＨ（Surface Layer Homology）ドメイン保持型外膜タンパク質、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つである、
    　請求項１に記載の植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法。
  3. 　前記ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質は、
    　配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるSlr1841、
    　配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるNIES970_09470、
    　配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるAnacy_3458、又は、
    　これらのいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質である、
    　請求項２に記載の植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法。
  4. 　前記細胞壁－ピルビン酸修飾酵素は、
    　配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるSlr0688、
    　配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるSynpcc7942_1529、
    　配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるAnacy_1623、又は、
    　これらのいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質である、
    　請求項２に記載の植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法。
  5. 　前記外膜と前記細胞壁との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子が欠失又は不活性化されている、
    　請求項１に記載の植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法。
  6. 　前記外膜と前記細胞壁との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子は、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つである、
    　請求項５に記載の植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法。
  7. 　前記ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子は、
    　配列番号７で示される塩基配列からなるslr1841、
    　配列番号８で示される塩基配列からなるnies970_09470、
    　配列番号９で示される塩基配列からなるanacy_3458、又は、
    　これらのいずれかの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子である、
    　請求項６に記載の植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法。
  8. 　前記細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子は、
    　配列番号１０で示される塩基配列からなるslr0688、
    　配列番号１１で示される塩基配列からなるsynpcc7942_1529、
    　配列番号１２で示される塩基配列からなるanacy_1623、又は、
    　これらのいずれかの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子である、
    　請求項６に記載の植物酸性インベルターゼ活性化剤の製造方法。
  9. 　シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の総量が、親株における当該タンパク質の総量の３０～７０％に抑制されている改変シアノバクテリアの分泌物を含む、
    　植物酸性インベルターゼ活性化剤。
  10. 　請求項９に記載の植物酸性インベルターゼ活性化剤を植物に使用する、
    　植物酸性インベルターゼ活性化方法。
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