JPS63196855A - 特異的な免疫学的定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は主として臨床検査の分野での利用を目的とした
特異的な免疫学的定量方法に関する。

〔従来の技術〕

従来より、抗原または抗体を免疫学的反応を用いて定量
する場合、当該反応を干渉する物質の影響を除去するこ
とが重要な問題とされていた。特に臨床検査の分野のよ
うに生体試料中の抗原または抗体を定量する場合にはそ
の試料中に存在する非特異的干渉物質の影響を除去する
のが困難なことがたびたび指摘されていた。このような
例としてリウマチ因子の定量があげられる。一般に慢性
関節リウマチ患者の血清中には、リウマチ因子（Ｒｈｅ
ｕｍａｔｏｉｄ　ｆａｃｔｏｒ　）といわれる自己抗体
が存在することから、臨床検査においてリウマチ因子の
測定はりウマチ性疾患の診断や病勢判断に重要な役割を
果たしてきた。従来よりリウマチ因子の測定には赤血球
凝集反応（Ｗａａｌｅｒ−Ｒｏｓｅ反応他反応子テック
ス凝集反応などによるリウマチ因子の検出方法が用いら
れており、なかでもラテックス凝集反応は簡易迅速にリ
ウマチ因子が検出できるためスクリーニング試験として
広く利用されている。

しかし、このような凝集反応によるリウマチ因子の検出
は、定性反応であるため定量性に欠けるという問題があ
る。

これに対してリウマチ因子の定量を行う方法の例として
は免疫比濁法がある。しかしこの方法では非特異的な物
質、即ち干渉物質も反応に関与し、その影響のためリウ
マチ因子を特異的に測定することができず、リウマチ因
子が陰性の血清でもリウマチ因子が存在するように測定
されてしまうという難点があった。従って、この非特異
的な干渉物質の影響を除去することが必要である。

ところで、リウマチ因子の測定ではこのような非特異的
な干渉物質が補体成分Ｃｌｑであることが公知であり、
従ってこのＣｌｑの影響を除去することがリウマチ因子
を特異的に測定するための課題であった。従来よりこの
Ｃｌｑの影響を除去する方法としては、試料を加熱処理
して非動化することによりＣｌｑを不活性化する方法が
最も良く知られている。この他にＣｌｑの影響を除去す
るための添加剤を使用してＣｌｑを不活性化する方法も
ある。かかる添加剤の例としては、塩化ナトリウムや尿
素のほかＤＮＡやヒアルロン酸などのポリアニオン、プ
ロタミンなどのポリカチオン、Ｃ−反応性蛋７　（ＣＲ
Ｐ）や肺炎球菌などのＣ多糖類、ダラム陰性菌などの脂
質Ａ等が例示され、これらの単独または混合物を公知の
方法で試料に加えることによりＣｌｑの不活性化が行わ
れる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

このように抗原または抗体を使用する免疫学的定量法で
は、非特異的干渉物質の影響を除去することが課題であ
り、例えばリウマチ因子の定量においては前述のような
方法がとられていた。

しかし、従来の方法、即ち加熱処理、非特異的干渉物質
の影響を除去する添加剤による処理等の場合には次のよ
うな問題があった。すなわち、試料を加熱処理して非動
化する方法はその操作が煩雑で時間がかかるため（通常
５６℃、３０分間の加熱）、臨床検査の分野で近年注目
されている自動分析装置を用いて多数検体を迅速に測定
するには不適当である。また、添加剤を用いる方法では
非特異的干渉物質（たとえば、リウマチ因子の測定にお
ける非特異的干渉物質であるＣｌｑ）を完全に不活性化
できないという問題がしばしばあり、更に免疫比濁法で
は、前述のような添加剤を用いることにより光学的な測
定に影響するため、前述の添加剤を使用する方法は免疫
比濁法には適応できないという問題点がある。

本発明の目的は免疫学的定量法で問題となる非特異的な
干渉物質の影響を受けず、簡便、迅速、正確に抗原また
は抗体を定量することのできる測定方法を提供すること
にある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは上述の目的を達成するために鋭意研究を重
ねた結果、その干渉物質の抗体、とりわけその抗体のＦ
ａｂ又はＦａｂ”を用いることによって非特異的な干渉
物質が不活性化され、特異的な免疫学約定１が可能とな
ることを見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成した
。

即ち、本発明は抗原又は抗体を免疫学的反応を用いて定
量する方法において、当該反応に非特異的な干渉物質の
影響を除去するため、その干渉物質の抗体を用いること
を特徴とする特異的な免疫学的定量方法に関する。

本発明によれば、試料から干渉物質の影響が除去された
ため、免疫学的反応、とりわけ免疫比濁法のような定量
を正確に行うことが可能となり、また試料中の抗原又は
抗体を特異的、迅速簡便に定量することができる。

本発明で使用される干渉物質の抗体は、測定を意図する
抗原または抗体の種類に応じて適宜選択すればよい、た
とえば、リウマチ因子の定量にあたっては非特異的な干
渉物質は前述のように補体成分Ｃｌｑである。従って、
干渉物質の抗体としては、Ｃｌｑ抗体が使用され、とり
わけ抗ヒトＣｌｑ血清を処理して得られたＣｌｑ抗体が
使用される。

ところで、免疫比濁法は抗原抗体反応に起因する免疫沈
降反応を応用したもので、抗原抗体反応によって生じた
反応物の量を溶液中の濃度の変化としてとらえ、それを
光学的に測定するものである。このときの吸収度は抗原
抗体反応によって生じた反応物の量に比例するため・吸
収度を測定することにより試料中の抗原又は抗体の量を
測定することができる。

而して、本発明の方法、とりわけその干渉物質の抗体由
来のＦａｂ又はＦａｂ’　を用いることにより光学的な
測定に影響することがないので、免疫比濁法による免疫
学的定量をより正確に行うことが出来る。かかる干渉物
質の抗体由来のＦａｂ又はＦａｂ’　は自体既知の手段
によって調製することができる。たとえば、干渉物質の
抗体を蛋白分解酵素（ペプシン、パパインなど）によっ
て消化することによって調製することが出来る。たとえ
ば、Ｃｌｑ抗体のＦａｂ又はＦａｂ’の調製の好ましい
例としては、抗ヒトＣｌｑ血清（ＩｇＧ）をペプシン又
はパパインなどの蛋白質分解酵素により消化して、元の
抗体分子に存在していた２個の活性部位のうち１個を含
むそれぞれのフラグメントＦａｂ又はＦａｂ’を得るこ
とができる。

本発明の定量方法は、抗原または抗体の定量に使用され
るものであり、特異的な抗原−抗体反応を利用する定量
方法であれば、いずれにも応用可能である。たとえば、
変性ヒト免疫グロブリン（熱変成、尿素変成等によって
変成されたもの）を使用して特異的にリウマチ因子の定
量を行う方法等に応用することができる。また、その試
料としては、血液（特に、血清、血漿等）、髄液等が使
用される。

本発明の定量方法においては、少なくとも抗原−抗体反
応時に干渉物質が不活性化されているように干渉物質の
抗体が使用（反応系に添加）されるが、当該干渉物質の
抗体は、試料中に添加されることが好ましい。

本発明の定量方法は、上記干渉物質の抗体が使用される
以外は、自体既知の定量方法の手順に準じて実施される
。たとえば免疫比濁反応によるリウマチ因子の定量の場
合の好ましい実施態様としては、次の手順が例示される
。

即ち、干渉物質の抗体を添加した試料と変性免疫グロブ
リンとを抗原抗体反応させる。かくして得られた溶液中
の沈降物質の濃度を、分光光度計等にて、特定の波長で
測定してその濁度を測定し、これを標準血清を使用して
作成された標準検量と比較して検体中のリウマチ因子が
定量される。

〔発明の作用・効果〕

本発明では抗原または抗体の特異的な免疫学的定量方法
において、非特異的干渉物質の影響を除去するために、
その干渉物質の抗体を用いるものであり、かかる手段に
よって干渉物質を抗原抗体反応で不活性化させるという
方法であり、従来の方法に比べて干渉物質の影響を除去
する時に要する操作が簡便で、定量を短時間に行え、ま
た特異性の高い方法である。

従って、特に臨床検査の分野のように干渉物質の影響が
大きい検体を試料とするときには本発明の方法は非常に
有用である。

更に、最近臨床検査は省力化と多検体処理などの目的の
ため自動化がすすみ、自動分析装置も多数導入されてい
るが、自動分析装置に応用されるためには一連の操作の
所要時間が短く、かつ操作ステップの少ないことが条件
となる０本発明の方法を免疫比濁反応で行ったとき、反
応所要時間を１０分間という短時間にすることが可能で
あり、かつ操作ステッチは試料に干渉物質の抗体を加え
ることと、その後主反応を起こす反応液を加えるという
２つのステップで測定ができるため、自動分析装置への
応用が可能となった。

このように本発明は臨床検査の分野での用途に多大な効
果をもたらすものである。

〔実施例〕

以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらに限定
されるものではない。

実施例１ 抗ヒトＣｌｑ血清１０ｍ１に飽和硫安溶液５−１を加え
て遠心分離して得られた沈澱分画に生理食塩水を加えて
溶解し、更に透析して硫安を除く。これにパパイン７ｍ
ｇ／＋ｗｌ溶液及びメルカプトエタノール溶液を加えて
反応後、更にヨードアセトアミドを加えて反応させ、Ｄ
Ｆ、−５２クロマトグラフイーによりＣｌｑ抗体のＦａ
ｂを調製する。

実施例２ 実施例１のパパインの代わりにペプシンを用いて同様に
操作し、Ｃｌｑ抗体のＦａｂ’を調製する。

実施例３ 試料としてリウマチ因子が陰性のヒト血清４０Ｐ１に実
施例１で調製したＣｌｑ抗体のＦａｂ（蛋白濃度０．４
鶴１）／鴇ｌに希釈）８００−を加え、３７℃で５分間
加温する。これに熱変性したＴ−グロブリン（４００■
ｇ／Ｌ）溶液２００−を加え、更に３７℃で５分間加温
し、盲検を対照に波長３４０ｎ−における吸光度を測定
した（これをＡとする）。

このとき、比較のためＣｌｑ抗体のＦａｂの代わりに精
製水を用いて同様に操作した（これをＢとする）、更に
Ｃｌｑ抗体のＦａｂの代わりに精製水に同一の試料をあ
らかじめ５６℃で３０分間加熱処理して非動化したもの
を加えて同様に操作し吸光度を測定した（これをＣとす
る）、なお盲検は試料の代わりに精製水を用いた。その
結果、次表のような測定値が得られた。

この結果からＡとＣは已に比べてほとんど吸光度の上昇
がなく、これはこの試料に含まれている非特異的干渉物
質であるｃｔｑの影響がＡとＣにはあられれていないこ
とが分かった。すなわち本発明の方法が従来の試料を非
動化する方法と同様に非特異的干渉物質であるＣｌｑの
影響を除去できることが示された。

実施例４ 実施例３に準じてＣｌｑ抗体のＦ、ａｂの代わりにＦａ
ｂ”を用いた場合、前述のＡと同様の結果が得られ、Ｃ
ｌｑ抗体のＦａｂ’でも同様の効果があることが明らか
となった。

実施例５ 臨床検査における自動分析装置の１つである日立７０５
型の自動分析装置を用いて、リウマチ因子を含む血清を
希釈し検量線を作成した。

まず試料としてリウマチ因子９０１０／ｍｌを含むヒト
血清を希釈して系列を作り、それぞれ２０μに実施例１
で調製したＣｌｑ抗体のＦａｂ（蛋白濃度０．４ｍｇ／
ｍｌに１％ポリエチレングリコール溶液で希釈）４００
ＰＪを加える。５分後に変性Ｔ−グロプリン（４ＱＯ１
ｌＲ／Ｌ）溶液１００μを加え、更に５分後に波長３４
０ｎｍおよび７００ｎｍの２波長で吸光度を測定した。

このとき、対照としてＣｌｑ抗体のＦａｂの代わりに１
％ポリエチレングリコール溶液を用いて同様に操作した
。

その結果、第１図のような検量線が得られ、本発明の方
法は非特異的な干渉物質であるＣｌｑの影響を除去した
分だけ吸光度が低いことが示された。

実施例６ 本発明の方法が非特異的な干渉物質であるＣｌｑの影響
を受けずにリウマチ因子が定量できることは、次のよう
に非動化して非特異的な干渉物質の影響を除去した方法
との相関でも証明される。

即ち、本発明の方法であるＣｌｑ抗体のＦａｂを用いて
試料どしてヒト血清合計１２例について実施例５と同様
の操作で吸光度を測定し、これらをこの検量線からリウ
マチ因子の濃度として求めた（これをＹとする）、これ
らの試料については、別にこれらをあらかじめ非動化し
た後、同様にリウマチ因子の濃度を求めた（これらをＸ
とする）。

このＸ群とＹ群を比較したところ、相関係数ｒｍＯ１９
９４２回帰式Ｙ−１，０９Ｘ−１９，５となり、両群に
は良好な相関があることが示された。

また本発明はこのように臨床検査において自動分析装置
にも適用できる免疫学的定量法であることもわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は縦軸に吸光度、横軸にリウマチ因子９０１Ｕ／
ｍｌを含むヒト血清の希釈率をあられし、・印のプロッ
トが本発明の方法であるＣｌｑ抗体のＦａｂを用いた場
合、Ｏ印のプロットが対照の方法であるＣｌｑ抗体のＦ
ａｂを含まない場合である。 第１図

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗原又は抗体を免疫学的反応を用いて定量する方
   法において、当該反応に非特異的な干渉物質の影響を除
   去するため、その干渉物質の抗体を用いることを特徴と
   する特異的な免疫学的定量方法。
2. （２）干渉物質の抗体が当該抗体のＦａｂまたはＦａｂ
   ′である特許請求の範囲第（１）項記載の免疫学的定量
   方法。
3. （３）免疫学的反応を用いて定量する方法が免疫比濁法
   である特許請求の範囲第（１）項または第（２）項に記
   載の免疫学的定量方法。
4. （４）抗原又は抗体がリウマチ因子であり、干渉物質の
   抗体が抗Ｃｌｑまたは抗ＣｌｑのＦａｂあるいはＦａｂ
   ′である特許請求の範囲第（１）〜（３）項のいずれか
   １項に記載の免疫学的定量方法。