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WO2021197393A1 - 一种抗人cd47抗体及其抗原结合片段、制备方法和应用 - Google Patents

一种抗人cd47抗体及其抗原结合片段、制备方法和应用 Download PDF

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WO2021197393A1
WO2021197393A1 PCT/CN2021/084706 CN2021084706W WO2021197393A1 WO 2021197393 A1 WO2021197393 A1 WO 2021197393A1 CN 2021084706 W CN2021084706 W CN 2021084706W WO 2021197393 A1 WO2021197393 A1 WO 2021197393A1
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antibody
human
antigen
binding fragment
seq
Prior art date
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PCT/CN2021/084706
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顾莉蕴
赵勇
莫世甫
徐伟
杨洁
丁栋
王志超
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苏州泽璟生物制药股份有限公司
上海泽璟医药技术有限公司
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Publication date
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Priority to US17/995,190 priority patent/US20230167192A1/en
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    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Definitions

  • the condition is cancer
  • the condition is a lymphoma with high CD47 expression, such as acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome.
  • Figure 1 is a diagram showing the detection of the binding of the anti-human CD47 antibody of the present invention to the CD47 protein using the ELISA method.
  • Figure 4 shows the binding of the anti-human CD47 antibody of the present invention to human erythrocytes and its agglutinating effect on human erythrocytes.
  • Figure 4A shows that the anti-human CD47 antibodies UM03-L4, UM03-C4 of the present invention and the positive control antibody bind to human red blood cells
  • Figure 4B shows that the anti-human CD47 antibodies UM03-L4 and UM03-C4 of the present invention almost affect human red blood cells. There is no agglutination effect, and the positive control antibody has a strong agglutination effect on human red blood cells.
  • Figure 5 shows the binding of the anti-human CD47 chimeric antibody of the present invention to monkey red blood cells and its agglutinating effect on monkey red blood cells.
  • Figure 5A shows the binding of the anti-human CD47 antibody UM03-L4 of the present invention and the positive control antibody to monkey red blood cells
  • Figure 5B shows that the anti-human CD47 antibody UM03-L4 of the present invention has almost no agglutination effect on monkey red blood cells, and the positive control antibody pairs The agglutination of monkey red blood cells is strong.
  • Double-specific dsFv or “dsFv-dsFv” contains three polypeptide chains: VH1-VH2 groups, where the heavy chains of the two are connected by a polypeptide linker (such as a long elastic linker) and are respectively connected by a disulfide bond Combining with VL1 and VL2 groups, each pair of heavy and light chains paired by disulfide bonds has a different antigen specificity.
  • a polypeptide linker such as a long elastic linker
  • U03-C4 used in this application refers to a heavy chain as shown in SEQ ID NO: 15, a light chain as shown in SEQ ID NO: 16, and the heavy and light chain constant regions are human IgG4 and ⁇ chain respectively Humanized antibody.
  • Treatment or “therapy” of a certain condition includes preventing or alleviating a certain condition, reducing the rate of the rise or development of a certain condition, reducing the risk of developing a certain condition, and preventing or delaying the development of symptoms related to a certain condition , Reduce or terminate the symptoms associated with a certain condition, produce a complete or partial reversal of a certain condition, cure a certain condition, or a combination of the above.
  • treatment or “therapy” can refer to inhibiting or slowing the growth, reproduction, or metastasis of tumor or malignant cells, or some combination of the above.
  • treatment or “therapy” includes removing all or part of the tumor, inhibiting or slowing the growth and metastasis of the tumor, preventing or delaying the development of the tumor, or some combination of the above.
  • the antibodies described herein include immunoglobulin constant regions.
  • the immunoglobulin constant region includes a heavy chain and/or light chain constant region.
  • the heavy chain constant region includes CH1, CH1-CH2 or CH1-CH3 regions.
  • the immunoglobulin constant region may further include one or more modifications to obtain desired properties.
  • the constant region can be modified to reduce or eliminate one or more effector functions to enhance FcRn receptor binding or to introduce one or more cysteine residues.
  • the mixture containing the antibody of interest and impurities can be processed by low pH hydrophobic interaction chromatography, using an elution buffer with a pH of about 2.5-4.5, preferably at low salt concentrations (e.g., From about 0 to 0.25M salt concentration).
  • Suitable components may include, for example, antioxidants, fillers, binders, disintegrants, buffers, preservatives, lubricants, flavors, thickeners, colorants, emulsifiers or stabilizers such as Sugar and cyclodextrin.
  • Suitable antioxidants may include, for example, methionine, ascorbic acid, EDTA, sodium thiosulfate, platinum, catalase, citric acid, cysteine, mercaptoglycerol, thioglycolic acid, mercaptosorbitol, butyl methyl Anisole, butylated hydroxytoluene and/or propyl gallate.
  • the encoded heavy chain variable region amino acid sequence is as SEQ ID NO: 7
  • the amino acid sequence of the variable region of the light chain encoded by it is shown in SEQ ID NO: 8.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region of the mouse antibody were respectively connected to the constant region of the human IgG4 heavy chain and the constant region of the kappa chain to obtain the human-mouse chimeric antibody UM03-L4, whose heavy chain sequence is as SEQ ID NO: 9 is shown, and the light chain sequence is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the heavy chain sequence of the humanized antibody UM03-C4 is as follows:

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Abstract

本发明提供了一种抗人CD47抗体或其抗原结合片段、制备方法和应用。本发明还提供了编码所述抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸以及包含本发明的分离的多核苷酸的载体。本发明还提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防通过增强免疫应答而受益的病症，其中所述病症是癌症。

Description

一种抗人CD47抗体及其抗原结合片段、制备方法和应用 技术领域
本发明属于生物免疫技术领域，具体涉及能特异性结合人CD47蛋白并阻断其与SIRPα的结合，从而因此阻断CD47对表达SIRPα的巨噬细胞的抑制作用的抗人CD47抗体及其抗原结合片段，本发明还涉及所述抗体及其抗原结合片段的制备方法和用途。
背景技术
CD47是45～50kD的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。研究发现，肿瘤细胞上高表达的CD47与巨噬细胞上的配体SIRPα结合，使得SIRPα酪氨酸磷酸化，从而发出抑制性调节信号，抑制巨噬细胞的吞噬作用。对应的，阻断该通路可以解除巨噬细胞对肿瘤细胞吞噬的抑制作用，提高机体对肿瘤细胞的免疫反应，为肿瘤的免疫治疗提供一条新途径。
在以CD47-SIRPα轴为靶标的肿瘤治疗中，最主要的机制是巨噬细胞的激活，从而增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。其次，阻断CD47可能进一步将巨噬细胞募集到肿瘤组织中，以及向肿瘤组织募集额外的免疫细胞的细胞因子和趋化因子，如单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)，这些细胞因子的分泌有助于CD47阻断疗法的功效。再次，靶向CD47-SIRPα的疗法也可能改变肿瘤中巨噬细胞的极化状态。巨噬细胞按其表型和功能活性又可以分为M1(Ⅰ型)和M2(Ⅱ型)两种，M1巨噬细胞能产生大量的促炎细胞因子，并介导抵抗细胞内寄生虫和抑制肿瘤生长；M2巨噬细胞则产生较少的促炎分子，参与组织损伤修复、血管生成和促进肿瘤生长。研究发现，阻断CD47-SIRPα后可显著增加小鼠微环境中的M1巨噬细胞肿，而小鼠M2巨噬细胞则没有显著的增加。最后，其它免疫细胞也可以响应CD47阻断疗法。SIRPα在骨髓免疫细胞上高度表达，因此它可能是骨髓谱系的关键调节剂。在小鼠中，CD47通过SIRPα+树突状细胞来调节抗原摄取，使用同源免疫活性肿瘤模型发现，CD47阻断的治疗效果取决于树突状细胞。通过刺激巨噬细胞或树突细胞的抗原呈递，靶向CD47-SIRPα轴的疗法可以促进肿瘤的适应性免疫应答。
CD47广泛表达于多种细胞，特别是在新生红细胞上高表达。因此靶向CD47的治疗性抗体有可能会引起贫血。另一方面，体内游离抗人CD47抗体的浓度也会由于红细胞对抗人CD47抗体的吸附作用而大大降低。
因此，开发新的治疗性抗人CD47抗体，使得其与肿瘤细胞表面CD47蛋 白的结合选择性更强，与红细胞表面CD47蛋白结合更弱，成为新型治疗性抗人CD47抗体的目标之一。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种高效、安全的抗人CD47抗体。本发明还提供了所述抗体的制备方法和用途，本发明的抗人CD47抗体与肿瘤细胞表面CD47蛋白的结合选择性更强，与红细胞表面CD47蛋白结合更弱，通过调节人免疫功能治疗多种癌症。
一方面，本发明提供了一种抗人CD47抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个选自以下的重链互补决定区：
VH CDR1，其包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
VH CDR2，其包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；和
VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗人CD47抗体或其抗原结合片段还包含一个或多个选自以下的轻链互补决定区：
VL CDR1，其包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
VL CDR2，其包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；和
VL CDR3，其包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗人CD47抗体或其抗原结合片段是骆驼化单域抗体、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、dsFv2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds双功能抗体、纳米抗体、域抗体或双价域抗体；
优选地，所述抗人CD47抗体或其抗原结合片段还包含人源重链恒定区和/或人源轻链恒定区；更优选地，所述人源重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，所述人源轻链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的轻链恒定区；进一步优选地，所述人源重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，所述人源轻链恒定区为κ链。
在根据本发明的一个实施方案中，抗人CD47抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在根据本发明的一个实施方案中，抗人CD47抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在根据本发明的一个实施方案中，抗人CD47抗体或其抗原结合片段的重链包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在根据本发明的一个实施方案中，抗人CD47抗体或其抗原结合片段的轻链包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在根据本发明的一个实施方案中，抗人CD47抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在根据本发明的一个实施方案中，抗人CD47抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在根据本发明的一个实施方案中，抗人CD47抗体或其抗原结合片段的重链包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在根据本发明的一个实施方案中，抗人CD47抗体或其抗原结合片段的轻链包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
另一方面，本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其编码上述抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；
优选地，所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；
优选地，所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列；
优选地，所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。
再一方面，本发明还提供了包含本发明的分离的多核苷酸的载体。
又一方面，本发明还提供了包含本发明的载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，更优选为人、鼠、羊、马、狗或猫的细胞，进一步优选为中国仓鼠卵巢细胞。
进一步地，本发明还提供了本发明的抗体或其抗原结合片段的制备方法，其包括在能够表达本发明的多核苷酸的条件下培养所述的宿主细胞。
进一步地，本发明还提供了包含本发明的抗体或其抗原结合片段的试剂盒。
进一步地，本发明还提供了包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体的药物组合物。
进一步地，本发明还提供了包含本发明的抗体或其抗原结合片段在制备药物或用于细胞疗法的细胞中的用途，所述药物或细胞用于预防和/或治疗通过增强免疫应答而受益的病症。
在根据本发明的一个实施方案中，其中所述病症是癌症，优选地，所述病症是CD47高表达的淋巴瘤，例如急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征。
与现有技术相比，本发明的抗人CD47抗体与肿瘤细胞表面CD47蛋白的结合选择性更强，与红细胞表面CD47蛋白结合更弱，并且对红细胞没有凝集作用，是新型治疗性抗人CD47抗体的目标之一。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为使用ELISA法检测本发明的抗人CD47抗体与CD47蛋白的结合的图。
图2为本发明的抗人CD47抗体与高表达人/鼠CD47的人/鼠肿瘤细胞的结合。其中，图2A中MKN-45、A2780和SW620是CD47阳性细胞；图2B表明本发明的抗体UM03-L4和UM03-C4与MKN-45、A2780和SW620均有强结合；图2C表明本发明的抗人CD47抗体与高表达鼠CD47的小鼠肿瘤细胞MC-38的结合，发现UM03-L4与小鼠CD47仅有极弱的结合。
图3表明本发明的抗人CD47抗体能抑制CHO-CD47细胞与SIRPa蛋白的结合。
图4表明本发明的抗人CD47抗体与人红细胞的结合及对人红细胞的凝集作用。其中，图4A表明本发明的抗人CD47抗体UM03-L4、UM03-C4及阳性对照抗体与人红细胞的结合；图4B表明本发明的抗人CD47抗体UM03-L4和UM03-C4对人红细胞几乎没有凝集作用，阳性对照抗体对人红细胞的凝集作用较强。
图5表明本发明的抗人CD47嵌合抗体与猴红细胞的结合及对猴红细胞的凝集作用。其中，图5A表明本发明的抗人CD47抗体UM03-L4及阳性对照抗体与猴红细胞的结合；图5B表明本发明的抗人CD47抗体UM03-L4对猴红细胞几乎没有凝集作用，阳性对照抗体对猴红细胞的凝集作用较强。
图6为本发明的抗人CD47抗体的抗原抗体亲和力检测。
图7为本发明的抗人CD47抗体在小鼠体内的抗肿瘤效果。
图8为本发明的抗人CD47抗体在食蟹猴体内的药物代谢试验。
具体实施方式
本申请的以下描述只为说明本申请的多种实施方式。因此，此处讨论的具体修改方式不应理解为对申请范围的限制。本领域的技术人员在不偏离本申请范围的情况下即可很容易地得出多种等同方式、变化和修改，应理解这样的等同实施方式包括在本发明范围内。在本申请中引用的所有文献，包括公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入。
定义
本发明中的"抗体"一词包括任意可结合某特定抗原的免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或双特异性(双价)抗体。一个天然的完整抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链由一可变区和第一、第二、第三恒定区组成；每条轻链由一可变区和一恒定区组成。哺乳动物的重链可分为α、δ、ε、γ和μ，哺乳动物的轻链可分为λ或κ。抗体呈"Y"型，Y 型结构的颈部由两条重链的第二和第三恒定区组成，其通过二硫键结合。"Y"型结构的每条臂包括其中一条重链的可变区和第一恒定区，其与一条轻链的可变区和恒定区结合。轻链和重链的可变区决定抗原的结合。每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)。轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重链(H)的CDR包含HCDR1，HCDR2、HCDR3。本发明中公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat，Chothia或Al-Lazikani命名法命名或识别。(AI-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,273(4)：927(1997)；Chothia,C.等，J.Mol.Biol.,186(3)：651-63(1985)；Chothia,C.and Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,196：901(1987)；Chothia，C.等，Nature,342(6252)：877-83(1989)；Kabat,E.A.等，National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。其中，三个CDR由被称为框架区(FR)的侧面连续部分间隔开，框架区比CDR更加高度保守并形成一个支架支撑超变环。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类。根据是否含有α、δ、ε、γ和μ重链，抗体可分别分为五个主要的分类或异构体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。几个主要的抗体分类还可分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)等。
本申请中的"抗原结合片段"一词，指由含有一个或多个CDR的抗体部分或者任何其他结合抗原但不具有完整抗体结构的抗体片段所形成的一种抗体片段。抗原结合片段的例子包括，但不限于，如双功能抗体(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(dsdiabody)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(双价的双功能抗体)、双价单链抗体(BsFv)、多特异性抗体、骆驼化单域抗体(camelized single domain antibody)、纳米抗体、域抗体和双价域抗体。抗原结合片段可以与母体抗体结合相同的抗原。在某些实施方式中，抗原结合片段可以含有来自某特定人抗体的一个或多个CDR，移接至来自一个或多个不同人抗体的框架区。
抗体的"Fab"片段是指由一条轻链(包括可变区和恒定区)和一条重链的可变区和部分恒定区经二硫键结合起来的那部分抗体分子。
"Fab’"片段是指包含了部分绞链区的Fab片段。
"F(ab')2"指的是Fab的二聚体。
抗体的Fc段负责多种不同的效应功能如ADCC和CDC，但不参与抗原的结合。
抗体的"Fv"段指的是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段 由一条轻链的可变区和一条重链的可变区组成。
"单链Fv抗体"或"scFv"是指由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体(Huston JS等，Proc Natl Acad Sci USA,85：5879(1988))。
"单链抗体Fv-Fc"或"scFv-Fc"是指由连接到某抗体Fc段的scFv组成的工程抗体。
"骆驼化单域抗体(Camelized single domain antibody)"，"重链抗体"或"HCAb(Heavy-chain-only antibodies，HCAb)"都是指含有两个VH域而不含有轻链的抗体(Riechmann L.和Muyldermans S.,J Immunol Methods.231(1-2)：25-38(1999)；Muyldermans S.,J Biotechnol.74(4)：277-302(2001)；W094/04678；W094/25591；U.S.Patent No.6,005,079)。重链抗体最初从驼科(骆驼、单峰驼和美洲驼)衍生得到。虽然缺失轻链，骆驼化抗体(camelized antibodies)有确证的抗原结合全部功能(Hamers Casterman C.等，Nature 363(6428)：446-8(1993)；Nguyen VK.等，"Heavy-chain antibodies in Camelidae：a case of evolutionary innovation,Immunogenetics.54(1)：39-47(2002)；Nguyen VK.等，Immunology.109(1)：93-101(2003))。重链抗体的可变区(VH域)是己知的最小的获得性免疫产生的抗原结合单位(Koch-Nolte F.等，FASEB J.21(13)：3490-8.Epub(2007))。
"纳米抗体"是指一种抗体片段，其由一个来自重链抗体的VH域和两个恒定区CH2和CH3组成。
"双功能抗体(diabody)"包括带有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中该片段含有在同一条多肽链上相连的VH域和VL域(请参见，Holliger P.等，Proc Natl Acad Sci USA.90(14):6444-8(1993)；EP404097；W093/11161)。两个域之间衔接物很短，使同一条链上的两个域不能互相配对，从而迫使两个域与另一条链的互补域配对，形成两个抗体结合位点。这两个抗体结合位点可靶向结合相同或不同的抗原(或抗原表位)。
"域抗体"是指仅含有一条重链可变区或一条轻链可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或多个VH域由一个多肽衔接物共价结合并形成双价域抗体。双价域抗体的两个VH域可靶向作用于相同或不同的抗原。
在某些实施方式中，"(dsFv)2"含有三条肽链：两个VH基因间通过一条多肽衔接物相连，并通过二硫键与两个VL基团结合。
在某些实施方式中"双特异性ds双功能抗体"含有VL1-VH2(由一个多肽衔接物相连)和VH1-VL2(也是由一个多肽衔接物相连)，两者在VH1和VLl间通过二硫键结合。
"双特异性dsFv"或"dsFv-dsFv"含有三条多肽链：VH1-VH2基团，其中两者的重链通过多肽衔接物(如：长的弹性衔接物)相连，并通过二硫键分别与VL1和VL2基团结合，每对通过二硫键配对的重链轻链具有不同的抗原特异性。
在某些实施方式中，"scFv二聚体"是双价双功能抗体或双价单链抗体(BsFv)，含有二聚化的两个VH-VL(由多肽衔接物连接)基团，其中二个基团的VH与另一个基团的VL协作形成两个结合位点，这两个结合位点可靶向结合相同抗原(或抗原表位)或不同抗原(或抗原表位)。在另一些实施方式中，"scFv二聚体"是双特异性双功能抗体，含有相互连接的V L1-V H2(由多肽衔接物连接)和V H1-V L2(由多肽衔接物连接)，其中V H1和V L1协作，V H2和V L2协作，且每个协作的配对具有不同的抗原特异性。
本申请中使用的术语"全人源"当用于抗体或抗原结合片段时，是指所述抗体或抗原结合片段具有某氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列对应于由人或人免疫细胞生产的、或从例如利用人源抗体库的转基因非人动物等非人来源衍生的抗体的氨基酸序列，或者其他编码人源抗体的序列。在某些实施方式中，全人源抗体不包含来源于非人抗体的氨基酸残基(特别是抗原结合残基)。
本申请中使用的术语"人源化"当用于抗体或抗原结合片段时，是指包括来源于非人动物的CDR、来源于人的FR区，以及来源于人的恒定区(当适用时)的抗体或抗原结合片段。由于人源化的抗体或抗原结合片段具有降低的免疫原性，其在某些实施方式中可用作人的治疗剂。在一些实施方式中，所述非人动物是哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。在一些实施方式中，所述人源化抗体或抗原结合片段除了CDR序列是非人源的以外，基本上全部由人源序列组成。在一些实施方式中，所述来源于人的FR区可以包括与其来自的人源抗体相同的氨基酸序列，或其可以包括一些氨基酸改变，例如，不超过10，9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸改变。在一些实施方式中，该氨基酸改变可以仅存在于重链FR区、仅存在于轻链FR区或同时存在于两个链中。在一些优选实施方式中，所述人源化抗体包括人源FRl-3和人源JH和JK。
本申请中使用的术语"嵌合"是指具有来源于一种物种的重链和/或轻链的一部分，和所述重链和/或轻链其余部分来源于不同物种的抗体或抗原结合片段。在一个示例性的例子中，嵌合抗体可以包括来源于人的恒定区和来源于非人动物例如小鼠的可变区。
术语“CD47”是指与SIRPα结合的配体。其它的命名为IAP、MER6或OA3等。它具有35.2kDa的分子量，并且存储在SwissProt中，登记号为Q08722。
本申请中的"特异性结合"或"特异性的结合"是指两分子间的非随机结合反应，如抗体和抗原间的反应。在某些实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合片段与人和/或猴CD47特异性结合，并且其结合亲和力(K D)≤10 -6M。本申请中的K D是指解离速度与结合速度的比值(k off/k on)，可通过表面等离子共振的方法测定，例如使用如Biacore的仪器。
本申请中使用的"UM03-L4"是指具有如SEQ ID NO:9所示的重链、如SEQ ID NO:10所示的轻链，且重轻链恒定区分别为人IgG4和k链的人-鼠嵌合抗体。
本申请中使用的"UM03-C4"是指具有如SEQ ID NO:15所示的重链、如SEQ ID NO:16所示的轻链，且重轻链恒定区分别为人IgG4和κ链的人源化抗体。
在本申请中当"保守替代"用于氨基酸序列时，是指将一个氨基酸残基用另一个具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基替代。例如，可以在疏水侧链氨基酸残基间(例如Met、Ala、VaL、Leu和Ile)、中性亲水侧链残基间(例如Cys、Ser，Thr、Asn和Gln)、酸性侧链残基间(例如Asp、Glu)、碱性侧链氨基酸间(例如His、Lys和Arg)或芳香侧链残基间(例如Trp、Tyr和Phe)进行保守替代。本领域己知保守替代通常不会引起蛋白构象结构的显著变化，因此能够保留蛋白质的生物活性。
当"百分比序列同一性"用于氨基酸序列(或核酸序列)时，是指在进行序列比对，并且必要时引入间隔使相同氨基酸(或核酸)数目达到最多后，在候选序列中，与参比序列相同的氨基酸(或核酸)残基占所述候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。所述氨基酸残基的保守替代可以认为或可以不认为是相同残基。可以通过本领域公开的工具对序列进行比对以确定氨基酸(或核酸)序列的百分比序列同一性。本领域技术人员可以使用所述工具的默认参数或根据比对的需要适当调整参数，例如通过挑选合适的算法。
本申请中使用的“T细胞”包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、T辅助1型T细胞、T辅助2型T细胞、T辅助17型T细胞和抑制性T细胞。
本申请中使用的"效应功能"是指抗体的Fc区与其效应器例如C1复合物和Fc受体结合的生物活性。示例性的效应功能包括抗体与C1复合物上的C1q相互作用诱导的补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体的Fc区与效应细胞上的Fc受体结合诱导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及吞噬。
本申请中的“癌症”或“癌状况”是指任何由肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移所介导，并引发实体瘤和非实体瘤如白血病的医学状况。本发明中的"肿瘤"是指肿瘤和/或恶性细胞的实体物质。
对某种状况的"治疗"或"疗法"包括预防或减轻某种状况，降低某种状况 兴起或发展的速度，减少发展出某种状况的风险，预防或延迟与某种状况相关的症状发展，减少或终止与某种状况相关的症状，产生某种状况的完全或部分的逆转，治愈某种状况，或以上的组合。对于癌症来说"治疗"或"疗法"可以指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长，繁殖，或转移，或以上的某些组合。对于肿瘤来说"治疗"或"疗法"包括清除全部或部分的肿瘤，抑制或减缓肿瘤生长和转移，预防或延缓肿瘤的发展，或以上的某些组合。
"被分离"的物质已经经人工由自然状态改变。如果自然界中出现某种"被分离"的物质或成分，那么其已经被改变或脱离其原始状态，或二者均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在的多核苷酸或多肽是未被分离的，但如果这些多核苷酸或多肽与之在天然状态下共存的物质足够分离并以足够纯的状态存在，则可以认为是"被分离"。在某些实施方式中，抗体和抗原结合片段的纯度为至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％，其由电泳方法(如SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳)，或色谱法(如离子交换色谱法或反相HPLC)确定。
本发明中"载体"是指，可将编码某蛋白的多核苷酸操作性地插入其中并使该蛋白获得表达的一种运载工具。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、噬菌体如λ噬茵体或M13噬菌体，以及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40))。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。
本发明中"宿主细胞"是指导入外源多核苷酸和/或载体的细胞。
本发明中的"治疗有效量"或"有效剂量"是指，某种药物有效治疗疾病的剂量或浓度。例如，对于本发明中公开的抗体或其抗原结合片段的用途来说，治疗有效量是在该剂量或浓度下，该抗体或抗原结合物可以清除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长、抑制肿瘤细胞转移、减轻任何与肿瘤或癌状况相关的症状或标记，预防或延缓肿瘤或癌状况的发展，抑制或清除病毒或病毒感染的细胞，或以上的某些组合。
"药用可接受的"是指所指的载剂、溶媒、稀释剂、辅料和/或盐，总的来说在化学上和/或在物理上与制剂中的其他配料相兼容，并在生理上与接受者相兼容。
“细胞疗法”是指将具有生物活性的细胞材料移植入病人体内以产生预期治疗效果的治疗方法。在具体的实施方案中，所述细胞疗法通过对特定细胞进行改造，以使得该细胞表达抗体或其抗原结合片段，目的在于增加细胞的治疗效果或是增强其特异性作用于特定组织部位的能力。
关于本发明中的抗人CD47抗体
在某些实施方式中，本申请提供了示例性的抗人CD47抗体UM03-C4。
本领域技术人员应理解可以将前述CDR序列进行修饰以包含一个或更多氨基酸的取代，由此得到提高的生物学活性例如提高的与人CD47的结合亲和性。例如，可以利用噬菌体展示技术生产并表达抗体变体库(例如Fab或FcFv变体)，随后筛选与人CD47有亲和性的抗体。另一个例子中，可以用计算机软件模拟所述抗体与人CD47的结合并鉴别抗体上形成结合界面的氨基酸残基。可以避免这些残基的替代以防止结合亲和性降低，或可以靶向这些残基进行替代以形成更强的结合。在某些实施方式中，CDR序列中的至少一个(或全部)取代是保守替代。
在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包括一个或多个CDR序列，这些序列具有与SEQ ID NO：1-6的序列至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性，并且同时保留了与其亲本抗体相似或甚至高于其的与人CD47的结合亲和性。所述亲本抗体具有基本相同的序列，但其相应的CDR序列与SEQ ID NO.:1-6所列的序列具有100％序列同一性。
在一些实施方式中，本申请所述的抗体或抗原结合片段能够以≤10 -7M的结合亲和性(K D)与人CD47特异性结合，其通过表面等离子共振法测量。结合亲和性值可以用K D值表示，其通过当抗原和抗原结合分子的结合达到平衡时的解离速率与结合速率的比值(k off/k on)计算得到。所述抗原结合亲和性(例如K D)可以通过本领域己知的适宜方法适宜地确定，例如包括使用仪器如Biacore的等离子共振结合法。
在某些实施方式中，本申请所述抗体或抗原结合片段与人CD47以10ng/mL-10μg/mL的EC50(即半数结合浓度)结合。抗体或抗原结合片段与人CD47的结合可以通过本领域己知的方法如夹心法如ELISA，Western印迹，FACS或其他结合试验测定。在示例性的例子中，将待测抗体(即一抗)与固定化的人CD47或表达人CD47的细胞结合，随后洗掉未结合抗体，引入标记的二抗，其能够与一抗结合因此能够检测出结合的二抗。当使用固定化的CD47时可在酶标仪板上进行所述检测，或当使用表达人CD47的细胞时可使用FACS分析进行所述检测。
所述抗体是人CD47特异性的。在某些实施方式中，所述抗体不与鼠CD47结合，但具有与猴CD47以及与人CD47相似的结合亲和性结合。
在一些实施方式中，所述的抗体具有IgG4同种型的恒定区，其具有降低的或消除的效应功能。例如ADCC和CDC等效应功能能够导致对表达CD47的细胞的细胞毒性。一些正常的细胞能够表达CD47。为了避免对这些正常的细胞产生潜在的不希望的毒性，本发明所述的抗体的某些实施方式具有降低的或甚至消除的效应功能。己知有许多测试用来估测ADCC或CDC活性，例如Fc受体结合试验、补体Clq结合实验和细胞裂解法，本领域技术人员能够容易选择。不希望受到理论的束缚，但据信具有降低的或消除的效应功能如ADCC和CDC的抗体不会引起对表达CD47的细胞(例如那些正常的细胞)的细胞毒性或将之降低到最小程度，因此避免了不希望的副作用。
在一些实施方式中，本申请所述的抗体或抗原结合片段具有降低的副作用。例如所述的抗人CD47抗体和其抗原结合片段可以具有全人源IgG序列，因此其免疫原性低于人源化的抗体。再例如，所述的抗体和其抗原结合片段可以具有IgG2或IgG4形式以消除ADCC和CDC。
在一些实施方式中，本申请所述的抗体的优势在于其能与具有免疫原性的物质联用，如肿瘤细胞、纯化的肿瘤抗原和用编码免疫刺激因子转染的细胞、肿瘤疫苗。此外，所述抗人CD47抗体和其抗原结合片段可以包括在联用治疗中，包括标准化学疗法和放射疗法、基于靶点的小分子疗法、其他新兴免疫检查点调节剂疗法。在一些实施方式中，所述抗体和其抗原结合片段可以用作抗体一药物缀合物、双特异性或多价抗体的基础分子。
在一些实施方式中，本申请所述的抗体和其抗原结合片段是骆驼化单域抗体(camelized single chain domain antibody)、双功能抗体(diabody)、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds双功能抗体(ds diabody)、纳米抗体、域抗体或双价域抗体。
在一些实施方式中，本申请所述的抗体包括免疫球蛋白恒定区。在一些实施方式中，免疫球蛋白恒定区包括重链和/或轻链恒定区。所述重链恒定区包括CH1、CH1-CH2或CH1-CH3区。在一些实施方式中，免疫球蛋白恒定区可以进一步包括一个或多个修饰以获得所需的性质。例如，可以将所述恒定区修饰以降低的或消除一种或多种效应功能以增强FcRn受体结合或引入一个或多个半胱氨酸残基。
在某些实施方式中，所述抗体及其抗原结合片段进一步包含缀合物。可以设想，本发明中的抗体或其抗原结合片段可与多种缀合物连接(见例如"Conjμgate Vaccines"、Contributions to Microbiology and Immunology、 J.M.Cruse and R.E.Lewis、Jr.(eds.)、Carger Press、New York(1989))。这些缀合物可以通过共价结合、亲和结合、嵌入、同等结合(coordinate binding)、络合、结合、混合或加入等其他方式与所述抗体或抗原结合物连接。在某些实施方式中，本发明公开的抗体和抗原结合片段可以通过工程的方法使其含有表位结合部分以外的特定位点，这些位点可用来结合一种或多种缀合物。例如，这样的位点可包含一种或多种反应性氨基酸残基，例如半胱氨酸残基和组氨酸残基，用于协助与结合物的共价连接。在某些实施方式中，抗体可间接连于缀合物，或通过另一个缀合物相连。例如，所述抗体或其抗原结合片段可结合生物素，然后间接结合第二个缀合物，其与亲和素相连。所述缀合物可以是可检测的标记、药代动力学修饰部分、纯化部分或细胞毒性部分。可检测的标记的例子可以包括荧光标记(例如荧光素、罗丹明、丹酰、藻红蛋白或德克萨斯红)、酶底物标记物(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D半乳糖昔酶)、稳定同位素或者放射性同位素、发色团部分、地高辛、生物素/亲和素、DNA分子或金以进行检测。在某些实施方式中，所述缀合物可以是药代动力学修饰部分如PEG，其帮助延长抗体的半衰期。其他适宜的聚合物包括例如竣甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇共聚物等。在某些实施方式中，所述缀合物可以是纯化部分例如磁珠。"细胞毒性部分"可以是对细胞有害的或可能损坏或杀死细胞的任何试剂。细胞毒性部分的示例包括，但不限于，紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙绽、吐根碱、丝裂霉素、依托泊昔、替尼泊甘、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、l-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普茶洛尔、嘌呤霉素及其类似物、抗代谢物(例如，甲氨喋呤、6-巯基嘌呤、6-巯鸟嘌呤、阿糖胞苷、5氟尿嘧啶达卡巴)、烷化剂(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茵霉素(AMC))以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
多核苷酸和重组方法
使用本领域公知的遗传工程学技术，可以将本申请所述抗体及其抗原结合片段的氨基酸序列转换成相应的DNA编码序列。由于遗传密码的简并性，转换所得的DNA序列可以完全一致，而编码的蛋白序列保持不变。
使用本领域公知的重组技术，可以将包括编码所述抗体及其抗原结合片段的多核苷酸的载体引入宿主细胞用于克隆(扩增DNA)或基因表达。在另一实施方式中，所述抗体及其抗原结合片段可通过本领域公知的同源重组的方法制得。多种载体可供选择。载体组分通常包括，但不限于，以下的二种或多种：信号序列、复制起始点、一种或多种标记基因、增强序列、启动子(例如：SV40，CMV，EF-1a)和转录终止序列。
在一些实施方式中，所述载体系统包括哺乳动物、细菌、酵母系统等，并将包括质粒例如但不限于pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pELpGEMEX、pGEX、pCLpCMV、pEGFP、pEGFT，pSV2、pFUSE、pVITRO，pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS420、pLexA、pACT2等其他可从实验室获得或市售的载体。适宜的载体可以包括质粒或病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
可以将包括编码所述抗体及其抗原结合片段的多核苷酸的载体引入宿主细胞用于克隆或基因表达。本发明中适用于克隆或表达所述载体中的DNA的宿主细胞为原核细胞、酵母或上述高级真核细胞。适用于本发明用途的原核细胞包括真细菌如，革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，例如，肠杆菌科，如，大肠杆菌，肠杆菌属，欧文氏菌属，克雷白氏杆菌属，变形杆菌属，沙门氏菌属，如，鼠伤寒沙门(氏)杆菌，沙雷氏菌属，如，粘质沙雷氏菌，以及志贺氏菌属，及杆菌属如，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，假单胞菌如，绿肽杆菌和链霉菌。
除了原核细胞以外，真核微生物如丝状真菌或酵母也可作宿主细胞克隆或表达编码抗体或其抗原结合片段的载体。酿酒酵母，或面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。但是，许多其他属、种和株都比较常用且在本发明中适用，如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母属宿主如，乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(ATCC12424)、保加利亚克鲁维酵母(ATCC16045)、魏氏克鲁维酵母(ATCC24178)、克鲁雄酵母(ATCC56500)、果蝇克鲁维酵母(ATCC36906)、耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母：解脂耶氏酵母(EP402226)；巳斯德毕赤酵母(EP183,070)；假丝酵母：里氏木霉(EP244234)；链孢霉；西方许旺酵母，如：西方许旺酵母；和丝状真菌，如：脉孢菌、青霉菌、弯颈霉和曲霉菌，如：钩巢曲霉和黑曲霉。
本发明中提供的适用于表达糖基化抗体或其抗原结合片段的宿主细胞由多细胞生物衍生得到。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。己发现多种杆状病毒株(baculoviral strains)及其变体以及对应的许可性昆虫宿主细胞(permissive insect host cells)，来自于诸如以下的宿主：草 地夜蛾(毛虫)、埃及斑蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)及家蚕。多种用于转染的病毒株为公众可得，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒的Bm-5变种，这些病毒都可在本发明中使用，特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛花、西红柿和烟草的植物细胞培养也可用作宿主。
但是，最感兴趣的是脊椎细胞，且脊椎细胞的培养(组织培养)己经成为常规操作。可用的哺乳动物宿主细胞实例有，SV40转化的猴肾细胞CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(293或悬浮培养的293细胞亚克隆，Graham等,J.Gen Virol.36：59(1977))；幼地鼠肾细胞(B血，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Ma ther,Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；及人肝癌细胞系(HepG2)。在某些优选的实施方式中，所述宿主细胞是293F细胞。
用上述的可产生所述抗体及其抗原结合片段的表达或克隆载体转化宿主细胞，并将其在常规的营养培养基中培养，所述营养培养基经修饰后适宜于诱导启动子、选择转化细胞或扩增编码目的序列的基因。
本发明中用于产生所述抗体及其抗原结合片段的宿主细胞可在多种本领域公知的培养基中培养。所述培养基还可含有本领域公知的适当浓度的任何其他必要的添加剂。所述培养基的条件，如温度、pH值等类似条件，为选择用于表达的宿主细胞此前所使用的条件，为普通技术人员所熟知。
在使用重组技术时，所述抗体可在胞内、壁膜空间生成，或直接分泌到培养基中。如果所述抗体在胞内生成，首先除去宿主细胞或裂解片断的颗粒残骸，例如，可通过离心或超声的方法。Carter等,Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了将分泌到大肠杆菌壁膜空间的抗体分离的方法。简要地说，在醋酸铀(pH 3.5)、EDTA和苯甲磺酣氟(PMSF)存在的条件下化开细胞糊(cell paste)约30分钟以上。离心除去细胞碎片。如所述抗体分泌到培养基中，则通常首先使用市售的蛋白浓度过滤器，如lAmicon或Millipore Pellicon ultrafiltration unit，浓缩该表达系统的上清液。在任何前述的步骤中都可加入蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白降解，以及抗生素以防止偶然污染物的生长。
从所述细胞中制得的抗体可采用纯化方法进行纯化，例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE一纤维素离子交换色谱柱、硫酸铵沉淀、盐析以及亲和色谱，其中亲和色谱为优选的纯化技术。所述抗体的种类以及所述抗体中存在任何免疫球蛋白的Fc结构域决定了蛋白A作为亲和配体是否适合。蛋白A可用于纯化基于人γ1，γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.lmmunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G适用于所有鼠源异构体和人γ3(Guss等,EMBO J.5：1567-1575(1986))。琼脂糖是最常用的亲和配体附着基质，但也可选用其他基质。机械力稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯与用琼脂糖相比可实现更快的流速和更短的处理时间。如该抗体含有CH3结构域，则可用Bakerbond ABX.TM树脂进行纯化(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)。也可根据需要获得的抗体确定其他蛋白纯化的技术，如离子交换柱中的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、基于阴离子或阳离子交换树脂的肝素琼脂糖凝胶色谱(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀。
在任意初步纯化步骤之后，可用低pH疏水相互作用色谱的方法处理含有感兴趣的抗体和杂质的混合物，用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选地在低盐浓度下进行(例如，从约0到0.25M盐浓度)。
试剂盒
本申请提供了包括所述抗体或其抗原结合片段的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒用于检测在生物样品中的CD47的存在情况或水平。所述生物样品可以包括细胞或组织。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括与可检测标记缀合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述试剂盒包括未标记的抗体，并进一步包括能够与未标记的抗体结合标记的二抗。所述试剂盒可以进一步包括使用说明和在试剂盒中将每个组件分隔开的包装。
在一些实施方式中，所述抗人CD47抗体或其抗原结合片段与底物或仪器连接用于夹心测定如ELISA或免疫色谱测定。适用的底物或仪器可以是例如微孔板和试纸。
药物组合物和治疗方法
本申请进一步提供了包括所述抗体或其抗原结合片段的药物组合物和一个或多个药学上可接受的载体。
用在本申请公开的药物组合物中的药用可接受载剂可包括，例如，药用可接受的液体、凝胶或固体载剂、水相介质、非水相介质、抗微生物物质、 等渗物质、缓冲液、抗氧剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、整合剂、稀释剂、佐剂、辅料或无毒辅助物质，其他本领域公知的组分或以上的多种组合。
适用的组分可包括，例如，抗氧剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、矫味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂例如糖和环糊精。适用的抗氧剂可包括，例如，甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸纳、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘油、巯基乙酸、巯基山梨醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。在一种含有本发明公开的抗体或其抗原结合片段的组合物中包括一种或多种抗氧剂如甲硫氨酸，可将降低所述抗体或其抗原结合片段的氧化。对氧化作用的减少可防止或减少结合亲和力的降低，从而提高抗体稳定性并延长保质期。
进一步的说，药用可接受的载剂可包括，例如，水相介质如氯化钠注射液、林格氏液注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、或葡萄糖和乳酸林格注射液、非水介质例如：植物来源的不挥发性油、棉花子油、玉米油、芝麻油、或者花生油、细菌抑制或真菌抑制浓度下的抗菌物质、等渗剂如：氯化钠或葡萄糖、缓冲液如：磷酸盐或枸橼酸盐缓冲液，抗氧化剂如：硫酸氢钠，局部麻醉剂如：盐酸普鲁卡因，助悬剂和分散剂如：羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如：聚山梨醇酯80(吐温-80)、整合试剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇双(2一氨基乙基醚)四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。作为载剂的抗菌剂可加入多次剂量容器中的药物组合物中，其包括酚类或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯代丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷铵和氯苯乙铵。适用的辅料可包括，例如，水、盐、葡萄糖、甘油或乙醇。适用的无毒辅助物质可包括，例如，乳化剂、pH值缓冲剂、稳定剂、增溶剂，或者醋酸钠、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或者环糊精之类的物质。
所述药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、丸剂、胶囊、片剂、持续释放制剂或粉末。口服制剂可以包括标准载体如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯皖酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
在某些实施方式中，所述药物组合物被制剂成可注射的组合物。可注射的药物组合物可以任何常规的形式制备，例如，液体溶剂、悬浮剂、乳化剂或适用于产生液体溶剂、悬浮剂或乳化剂的固体形式。注射制剂可包括现用的无菌和/或无热原溶液、使用前现与溶剂结合的无菌干燥的可溶物，如冻干粉，包括皮下片、注射即用的无菌悬浮剂、使用前现与介质结合的无菌干燥不溶产品，和无菌和/或无热原的乳剂。溶剂可以为水相或非水相。
在某些实施方式中，单位剂量的注射制剂包装在一个安瓿、一支管或一 支带有针的针筒中。本领域悉知，所有注射给药的制剂应为无菌无热原。
在某些实施方式中，通过将本申请公开的抗体或其抗原结合片段溶解于某适当的溶剂中可制备无菌冻干的粉末。所述溶剂可含有一种可提高粉或由粉末制得的重组溶液的稳定性，或改善粉末或重组溶液的其他药理组分。适用的辅料包括，但不限于，水、葡萄糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、黑糖或其他适用的物质。溶剂可含有缓冲液，如枸橼酸缓冲液、磷酸钠或磷酸钾缓冲液或其他本技术熟练人员公知的缓冲液，在一种实施方式中，缓冲液的pH为中性。在本领域公知的标准条件下进行对所述溶液进行随后的过滤除菌，然后冻干制得理想的制剂。在一种实施方式中，将所得的溶剂分装至小管中冻干。每支小管可容纳单次剂量或多次剂量的所述抗人CD47抗体或其抗原结合片段或其组合物。每支小管中的装入量可略微高于每次剂量所需或多次剂量所需(例如10％过量)，从而保证取样精确和给药精确。冻干粉可在适当的条件下储存，如在约4℃到室温范围。
用注射用水将冻干粉重溶得到用于注射给药的制剂。在一种实施方式中，可将冻干粉加至无菌无热原水或其他适用的液体载剂中重溶。精确的量由选择的疗法决定，可根据经验值决定。
还提供了治疗方法，包括将治疗有效量的本申请所述的抗体施用给需要其的受试者。
本申请中提供的抗体的治疗有效剂量依赖于本领域公知的多种因素，例如体重、年龄、过往病史、现用治疗、对象的健康状况和交叉感染的潜力、过敏、超敏和副作用，以及给药途径和肿瘤发展的程度。本领域熟练人员(例如医生或兽医)可根据这些或其它条件或要求按比例降低或升高剂量。
在某些实施方式中，本发明提供的抗体可在治疗有效剂量约0.0lmg/kg到约100mg/kg之间给药。在某些实施方式中，所述抗体以约50mg/kg或更少的剂量给药，在某些实施方式中，给药剂量为10mg/kg或更少、5mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少或0.1mg/kg或更少。某特定剂量可在多个间隔给药，例如每天一次、每天两次或更多、每月两次或更多、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次或每两月或更多月一次。在某些实施方式中，给药剂量可随治疗进程变化。例如，在某些实施方式中，初始给药剂量可比后续给药剂量高。在某些实施方式中，给药剂量在治疗进程中根据给药对象的反应进行调整。
给药方案可通过调整达到最优反应(如治疗反应)。例如，可进行单剂量给药或在一段时间分多个分隔的剂量给药。
本发明中公开的抗体可通过本领域公知的给药方式给药，例如注射给药(如，皮下注射、腹腔注射、静脉注射，包括静脉滴注，肌肉注射或皮内注 射)或非注射给药(如，口服给药、鼻腔给药、舌下给药、直肠给药或外用给药)。
在某些实施方式中，所述抗体可用于治疗与其分子机制相关的病症，包括肿瘤和癌症，例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳癌、胰脏癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈部癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、草样肉芽肿(mycoses fungoids)、默克尔细胞癌和其它恶性血液病、如经典型霍奇金淋巴瘤(CHL)、原发性纵膈大B细胞淋巴瘤、T细胞/组织细胞的富B细胞淋巴瘤、EBV阳性和阴性PTLD和EBV相关弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、浆母细胞性淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、鼻咽癌和HHV8相关原发性渗出性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤，中枢神经系统(CNS)肿瘤，例如原发性CNS淋巴瘤，脊轴肿瘤，脑干神经胶质瘤。
使用方法
本申请进一步提供了使用所述抗体的方法。
在一些实施方式中，本申请提供了在个体中治疗与所述抗体机制相关的状况或病症的方法，包括施用治疗有效量的本申请所述的抗体。
本发明公开的抗体可单独给药或与一种或多种其他治疗手段或物质联合给药。例如，本发明公开的抗体或其抗原结合片段可与化疗、放疗、癌症治疗手术(如肿瘤切除术)、抗病毒药物、一种或多种抗呕吐药或其他化疗导致的并发症的疗法、或任何其他用于癌症或病毒的治疗物质进行联用。在某些这样的实施方式中，本发明公开的抗体与一种或多种治疗物质联用时，可与所述的一种或多种治疗物质同时给药，在某些这样的实施方式中，所述的抗体可作为同一个药物组合物的一部分同时给药。但是，与其他治疗物质"联用"的抗体不需要同时给药或与该治疗物质在同一组合物中给药。本发明中"联用"的含义还包括在另一个治疗物质之前或之后给药的抗体也被认为是与该治疗物质"联用"，即使所述抗体与第二种物质通过不同给药方式给药。在可能的情况下，与本发明公开的抗体联用的其他治疗物质可参照该其他治疗物质的产品说明书的方法用药，或参照、外科医生的案头参考书2003(Physicians'Desk Reference,57th Ed；Medical Economics Company；ISBN：1563634457；第57版(2002年11月))，或参照其他本领域公知的方法。
在某些实施方式中，所述治疗物质能够诱导或增强针对癌症的免疫反应。例如，肿瘤疫苗可以用于诱导对某些肿瘤或癌症的免疫应答。细胞因子治疗可以用于提高将肿瘤抗原向免疫系统的递呈。细胞因子治疗的示例包括但不 限于干扰素如干扰素α、β和γ，集落剌激因子如巨噬细胞CSF、粒细胞巨噬细胞CSF和粒细胞CSF，白介素如1L-L、1L-1a、1L-2、1L 3、1L-4、1L-5、1L-6、1L-7，1L-8、1L-9、1L-10、1L-ll和1L-12，肿瘤坏死因子如TNF-α和TNF-β。还可以使用灭活免疫抑制目标的试剂，如PD-1抗体、TGF-β抑制剂、IL-10抑制剂和Fas配体抑制剂。另一组试剂包括激活针对肿瘤或癌细胞的免疫响应的那些试剂，例如，提高T细胞激活(如T细胞共剌激信号通路如CTLA-4、ICOS、OX40、4-1BB等通路)的那些，以及提高树突细胞功能和抗原递呈的那些。
以下实施例旨在更好地说明本发明，且不应理解为限制本发明的范围。所有下述的特定组合物、材料和方法，其整体或部分，都在本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不是为了限制本发明，而只是为说明特定的实施方式在本发明的范围内。本领域熟练技术人员可不添加创造性及不偏离本发明范围而开发出等同的组合物、材料和方法。应理解，在对本发明的方法作出的多种改动可以仍然包括在本发明范围内。发明人意在将这样的变动包括在本发明的范围内。
实施例1：小鼠抗人CD47单克隆抗体的获得
本申请发明人构建了过表达人CD47蛋白的CHO细胞株，以之免疫小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0-AG14细胞进行杂交瘤细胞融合，并取适量融合后的细胞铺至96孔板。融合后第10天取各孔上清，以ELISA法检测杂交瘤细胞分泌的小鼠抗体与人CD47的结合活性(方法参见实施例4)及其对SIRPα/CD47结合的抑制活性(方法参见实施例6)，得到了一系列具有较高活性的杂交瘤细胞。选择其中活性最好的杂交瘤细胞，经测序获得其分泌抗体对应的重链可变区cDNA序列和轻链可变区cDNA序列，其编码的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；其编码的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。将小鼠抗体的重链可变区和轻链可变区分别连接至人IgG4重链的恒定区和κ链的恒定区，得到人-鼠嵌合抗体UM03-L4，其重链序列如SEQ ID NO：9所示，轻链序列如SEQ ID NO：10所示。
杂交瘤细胞的重链可变区(即人-鼠嵌合抗体UM03-L4的重链可变区)氨基酸序列如下所示；
Figure PCTCN2021084706-appb-000001
杂交瘤细胞的轻链可变区(即人-鼠嵌合抗体UM03-L4的轻链可变区)氨基酸序列如下所示；
Figure PCTCN2021084706-appb-000002
人-鼠嵌合抗体UM03-L4的重链氨基酸序列如下所示；
Figure PCTCN2021084706-appb-000003
人-鼠嵌合抗体UM03-L4的轻链氨基酸序列如下所示；
Figure PCTCN2021084706-appb-000004
实施例2：抗体的人源化
对实施例1中得到的小鼠抗体重链可变区和轻链可变区的序列进行分析，得到其重链互补决定区CDR为以下序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；其轻链互补决定区为以下序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
Figure PCTCN2021084706-appb-000005
搜索人germline抗体序列数据库(IGMT)，分别获得与小鼠抗体重/轻链可变区同源性较高的人germline抗体序列，并将其框架区与上述小鼠抗体的CDR进行组合，即所谓CDR grafting，同时对框架区的部分氨基酸进行了回复突变，最终获得了人源化抗体UM03-C4，其重链序列如SEQ ID NO：15所示，轻链序列如SEQ ID NO：16所示。
人源化抗体UM03-C4的重链可变区序列如下：
Figure PCTCN2021084706-appb-000006
人源化抗体UM03-C4的轻链可变区序列如下：
Figure PCTCN2021084706-appb-000007
人源化抗体UM03-C4的重链序列如下：
Figure PCTCN2021084706-appb-000008
人源化抗体UM03-C4的轻链序列如下：
Figure PCTCN2021084706-appb-000009
实施例3：抗体的制备
编码UM03-L4重链和轻链的cDNA序列分别如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示；编码UM03-C4重链和轻链的cDNA序列分别如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示。
编码UM03-L4重链的cDNA序列(SEQ ID NO：11)：
Figure PCTCN2021084706-appb-000010
Figure PCTCN2021084706-appb-000011
编码UM03-L4轻链的cDNA序列(SEQ ID NO：12)：
Figure PCTCN2021084706-appb-000012
编码UM03-C4重链的cDNA序列(SEQ ID NO：17)：
Figure PCTCN2021084706-appb-000013
Figure PCTCN2021084706-appb-000014
编码UM03-C4轻链的cDNA序列(SEQ ID NO：18)：
Figure PCTCN2021084706-appb-000015
将cDNA序列连接在编码信号肽的序列之后，分别克隆到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.4上。将重链表达质粒和轻链表达质粒按2：1的摩尔比用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)转染入HEK293细胞，并在37℃、5％二氧化碳条件下培养7天。收集培养液上清，并用Protein A亲和层析法提纯上清中的抗体。纯化后的抗体经PBS溶液透析和冷冻干燥浓缩后，保存于-20℃。
实施例4：抗体与CD47蛋白的结合
将浓度为1μg/mL的人CD47蛋白溶液以100μL/孔包被96孔高亲和力板，4℃，振荡过夜。第二天先以300μL PBST(Tween20：0.5‰)洗涤3次，之后用100μL/孔的5％BSA/PBS封闭2小时，室温振荡。300μL PBST 洗涤3次。用PBS配制抗体样品的梯度稀释溶液。以100μL/孔加入96孔板，室温振荡1小时。300μL PBST洗涤3次。配制二抗羊抗鼠(goat anti-mouse)IgG HRP或羊抗人(goat anti-human)IgG HRP溶液，以100μL/孔加入96孔板，室温振荡1小时。300μLPBST洗涤4次。加入100μL/孔TMB，显色20min。加入100μL/孔0.6N H 2SO 4，终止显色，检测OD 450nm。
经检测，结果如图1所示，嵌合抗体UM03-L4与人CD47结合的EC50为0.2499μg/mL,人源化抗体UM03-C4与人CD47结合的EC50为0.1687μg/mL。
实施例5：抗体与高表达人CD47的人肿瘤细胞的结合
胃癌细胞株MKN-45、卵巢癌细胞株A2780和结肠癌细胞株SW620(ATCC)是高表达CD47的人源肿瘤细胞。首先，本申请发明人使用流式细胞术验证了上述3株细胞上的CD47表达。用PBS配制抗人CD47检测抗体(eBioscience，17-0479-42)和APC isotype(eBioscience，17-4714-41)，anti-huIgG 633(life technologies，A21091)的浓度梯度溶液，配制成终浓度的2×工作液。分别收集上述三种肿瘤细胞，PBS洗涤一遍后分别计数，稀释成4*10 6/ml细胞悬液；分别取50μL抗体工作液加入50μL细胞悬液中，4℃避光孵育30min；PBS洗两遍后加入对应的荧光标记二抗(anti-huIgG 633)，4℃避光孵育30min，PBS洗涤两次后，以400μL FACS buffer悬起，以流式细胞仪检测抗体与细胞的结合情况。结果显示三株细胞均为CD47阳性的细胞(图2A)
本申请发明人检测了嵌合抗体UM03-L4和人源化抗体UM03-C4与上述3个肿瘤细胞株结合的情况。方法同上。如图2B所示，结果显示嵌合抗体UM03-L4及人源化抗体UM03-C4与高表达人CD47的三株人肿瘤细胞均有结合。检测结果总结如表1所示。
类似的，本申请发明人检测了抗体UM03-L4与高表达鼠CD47的小鼠肿瘤细胞MC-38的结合，发现UM03-L4与小鼠CD47没有结合，如图2C所示，其中同型抗体对照为APC isotype(Biolegend，400511)，CD47检测抗体为抗鼠CD47检测抗体(Biolegend，127513)。
表1人源化抗体UM03-C4与人肿瘤细胞的结合EC50(μg/ml)
  UM03-L4 UM03-C4
MKN-45 0.3811 0.3544
A2780 0.142 0.1191
SW620 0.2163 0.1262
实施例6：抗体抑制CHO-CD47细胞与SIRPα蛋白的结合
首先构建过表达人CD47的CHO稳转细胞株。用PBS配制抗体的浓度梯度溶液，配制成终浓度的2×工作液。收集CHO-CD47细胞，离心后重悬于培养基中，调整密度至4*10 6/ml，取50μL抗体工作液加入50μL细胞悬液中，4℃避光孵育30min；PBS洗两遍后加入100μL 4μg/ml SIRPa-mFc(AcroBiosystems)或PBS，4℃孵育30min；PBS洗两遍后加入对应的荧光标记二抗，4℃避光孵育30min，PBS洗涤两次后，以400μL FACS buffer悬起，以流式细胞仪检测抗体与细胞的结合情况。
如图3所示，SIRPα蛋白可以与CHO-CD47细胞结合，该结合可以被嵌合抗体UM03-L4或人源化抗体UM03-C4抑制，两者的IC50分别为3.383μg/mL和2.398μg/mL。
实施例7：抗体与人红细胞的结合及对人红细胞的凝集作用
本申请发明人检测了嵌合抗体UM03-L4和人源化抗体UM03-C4以及阳性对照抗体Hu5F9(美国专利US 9017675B2及文献PLoS ONE 2015,10(9):e0137345)与人红细胞的结合以及对人红细胞的凝集作用。首先从志愿者外周血中分离红细胞，用生理盐水悬成2％浓度红细胞悬液。用PBS配制抗体的浓度梯度溶液，配制成终浓度的2×工作液。取50μL抗体工作液加入50μL红细胞悬液中，4℃避光孵育60min；PBS洗两遍后加入对应的荧光标记二抗，4℃避光孵育30min，PBS洗涤两次后，以400μL FACS buffer悬起，以流式细胞仪检测抗体与红细胞的结合情况。对于红细胞凝集检测，同样取50μL抗体工作液加入50μL红细胞悬液中，置于96孔圆底板，室温静置2h后观察拍照。
如图4A所示，嵌合抗体UM03-L4和人源化抗体UM03-C4与人红细胞的结合EC50分别为1.21μg/ml和0.93μg/ml，结合上平台分别为586和473，阳性对照抗体Hu5F9与人红细胞结合的EC50和上平台分别为1.954μg/ml和892；如图4B所示，嵌合抗体UM03-L4和人源化抗体UM03-C4对人红细胞几乎没有凝集作用，阳性对照抗体对人红细胞的凝集作用较强。
实施例8：抗体与猴红细胞的结合及对猴红细胞的凝集作用
类似的，本申请发明人检测了嵌合抗体UM03-L4及阳性对照抗体Hu5F9与猴红细胞的结合以及对猴红细胞的凝集作用，检测方法与人红细胞相同。如图5A所示，嵌合抗体UM03-L4和阳性对照抗体与猴红细胞的结合EC50分别为0.9070μg/ml和0.5860μg/ml，结合上平台分别为186和392；同样 的，图5B显示嵌合抗体UM03-L4对猴红细胞几乎没有凝集作用，阳性对照抗体对猴红细胞的凝集作用较强。
实施例9：抗原抗体亲和力检测
抗原抗体结合的亲和力用SPR技术(Surface Plasmon Resonance)进行检测。简单来说，将4μg/mL浓度的UM03-C4与protein A sensor chip(GE,Cat#29127556)孵育30s进行抗体捕获。在抗原结合阶段，以梯度稀释的CD47蛋白为流动相与sensor chip上捕获的UM03-C4抗体进行120s的结合。在解离阶段，以HBS-EP缓冲液持续洗脱360s。CD47在sensor chip上与抗体结合的情况以Biacore T200(GE Healthcare)进行定量检测。检测结果如表2和图6所示，UM03-C4的亲和力为0.4nM。
表2 UM03-C4与CD47的亲和力和动力学数据
受体 配体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
CD47 UM03-C4 1.02E+06 1.933E-04 1.90E-10
实施例10：小鼠肿瘤药效模型
Daudi细胞(ATCC，人淋巴瘤细胞)为CD47高表达的肿瘤细胞，按6×10 6细胞/只的量将Daudi细胞接种于雌性NCG小鼠皮下。待肿瘤长至约150mm 3后，静脉给予UM03-C4抗体2.5mg/kg、UM03-C4抗体5mg/kg、UM03-C4抗体10mg/kg、阳性抗体Hu5F9(5mg/kg)和IgG1同型对照抗体(5mg/kg),每组6只小鼠。每3天给药一次，共给药4次。
如图7结果显示，由于该模型是晚期肿瘤模型，阳性抗体Hu5F9组小鼠与对照组小鼠相比，未能显示出更长的生存时间，而UM03-C4抗体治疗组，在各个剂量下，都显示出了明确的药效。
实施例11：食蟹猴的药物代谢
对食蟹猴(n＝2)静脉注射UM03-C4，剂量为15mg/kg。在给药前后0、0.25、4、8、24、48、72、96、144、192、240和336小时采血，ELISA法检测血药浓度，并做药时曲线图。结果如图8所示。同时计算药代动力学参数，结果如表1所示。在本实验中，同时观察到食蟹猴出现中轻度贫血，未观察到明显的血小板减少现象。
表3 UM03-C4在食蟹猴上的药代动力学参数(15mg/kg，n＝2)
Figure PCTCN2021084706-appb-000016
上述仅为本发明的优选实施例而已，并不对本发明起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的技术方案的范围内，对本发明揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动，均属未脱离本发明的技术方案的内容，仍属于本发明的保护范围之内。

Claims (12)

  1. 一种抗人CD47抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个选自以下的重链互补决定区：
    VH CDR1，其包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
    VH CDR2，其包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；和
    VH CDR3，其包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
  2. 根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗人CD47抗体或其抗原结合片段还包含一个或多个选自以下的轻链互补决定区：
    VL CDR1，其包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
    VL CDR2，其包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；和
    VL CDR3，其包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
  3. 根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗人CD47抗体或其抗原结合片段是骆驼化单域抗体、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、dsFv2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds双功能抗体、纳米抗体、域抗体或双价域抗体；
    优选地，所述抗人CD47抗体或其抗原结合片段还包含人源重链恒定区和/或人源轻链恒定区；更优选地，所述人源重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，所述人源轻链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的轻链恒定区；进一步优选地，所述人源重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，所述人源轻链恒定区为κ链。
  4. 根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗人CD47抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；和/或所述抗人CD47抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；或者
    所述抗人CD47抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；和/或所述抗人CD47抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
  5. 根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗人CD47抗体或其抗原结合片段的重链包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；和/或所述抗人CD47抗体或其抗原结合片段的轻链包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；或者
    所述抗人CD47抗体或其抗原结合片段的重链包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；和/或所述抗人CD47抗体或其抗原结合片段的轻链包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
  6. 一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至5中任一项所述的 抗体或其抗原结合片段；
    其中，所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；和/或所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；或者
    所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列；和/或所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。
  7. 一种载体，其包括根据权利要求6所述的分离的多核苷酸。
  8. 一种宿主细胞，其包括根据权利要求7所述的载体；
    优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，更优选为人、鼠、羊、马、狗或猫的细胞，进一步优选为中国仓鼠卵巢细胞。
  9. 一种根据权利要求1至5任一项所述的抗人CD47抗体或其抗原结合片段的制备方法，其包括在能够表达根据权利要求6所述的分离的多核苷酸的条件下培养根据权利要求8所述的宿主细胞。
  10. 一种试剂盒，其包括根据权利要求1至5中任一项所述的抗人CD47抗体或其抗原结合片段。
  11. 一种药物组合物，其包括根据权利要求1至5中任一项所述的抗人CD47抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
  12. 根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备药物或用于细胞疗法的细胞中的用途，所述药物或细胞用于预防和/或治疗通过增强免疫应答而受益的病症；
    优选地，所述病症是癌症；更优选地，所述病症是CD47高表达的淋巴瘤，例如急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征。
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