CN108503708B

CN108503708B - 抗人cd47抗体及其用途

Info

Publication number: CN108503708B
Application number: CN201810375653.6A
Authority: CN
Inventors: 刘志刚; 刘玉兰; 郭晶晶; 郝小勃; 万姝南; 胡俊杰
Original assignee: Chongqing Genrix Biopharmaceutical Co ltd; Genrix Shanghai Biopharmaceutical Co ltd; Beijing Wisdomab Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Wisdomab Biotechnology Co ltd; Chongqing Zhixiang Jintai Biopharmaceutical Co ltd; Genrix Shanghai Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2017-09-01
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2038-04-20
Also published as: WO2019042119A1; CN108503708A

Abstract

本申请公开了特异性结合人CD47的抗体或其抗原结合部分，编码所述抗体或其抗原结合部分的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、制备和纯化该抗体的方法及所述抗体或其抗原结合部分的应用。

Description

抗人CD47抗体及其用途

技术领域

本申请大体涉及基因工程和抗体药物领域；具体而言，涉及抗人CD47抗体领域及其用途。本申请开发了新的抗人CD47抗体，并提供了该抗体在治疗CD47介导的疾病中的用途。

背景技术

CD47属于免疫球蛋白超家族成员，是I型跨膜糖蛋白，包括氨基端V型免疫球蛋白样细胞外结构域，由5个高度疏水的跨膜片段构成的跨膜结构域和亲水的羧基端细胞内结构域，分子量在47-55kD之间。最初，CD47因为与整合素α_vβ₃相互作用而为人们所认识，因此其又称为整合素相关蛋白(IAP)¹。CD47通过细胞外结构域与整合素α_vβ₃或α_IIbβ₃的β₃亚基相互作用，激活相应的整合素。

SIRPα(信号调节蛋白α(Signal regulatory proteinα))，又称SHPS-1(含Src同源2结构域蛋白酪氨酸激酶底物-1(Src homology 2domain-containing protein tyrosinephosphatase substrate-1))/BIT(具有酪氨酸的活化基序的脑免疫球蛋白样分子(brainimmunoglobulin-like molecule with tyrosine-based activation motifs))/CD172a，也是跨膜糖蛋白，胞外区具有3个免疫球蛋白样结构域，细胞内结构域具有典型的免疫受体酪氨酸抑制性序列(ITIM)，具有4个酪氨酸残基，是潜在的磷酸化位点。

CD47是SIRPα的配体，二者通过胞外结构域相互作用，形成细胞间的通讯复合物。CD47与SIRPα结合后，诱导SIRPα胞内ITIM磷酸化，磷酸化位点结合进而激活含有SH2(Src同源2(Src homology 2))结构域的酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2，引发信号传递的级联反应。SHP-1主要表达于造血细胞，负向调节这些细胞的功能²；而SHP-2表达非常广泛，调节小G蛋白Ras和Rho，正向控制细胞生长和增殖³。

SIRPα在神经元以及髓系造血细胞(如巨噬细胞和树突细胞)中表达丰富⁴，而CD47则表达于多数细胞中。CD47-SIRPα信号系统对调节巨噬细胞对成熟血细胞的吞噬具有重要作用。正常健康细胞(如红细胞⁵或血小板⁶)表面的CD47分子与巨噬细胞上的受体SIRPα相互作用产生抑制性信号，抑制其吞噬活性，达到调节血细胞的生命周期及其在血液中的数量的目的。单核细胞上的SIRPα与红细胞上的CD47作用，通过肌球蛋白-IIA去磷酸化抑制Fcγ受体依赖的吞噬作用⁷。CD47-SIRPα信号系统抑制树突细胞激活，参与神经系统发育、中性粒细胞趋化激活和基质细胞支持的造血细胞生成等多种生理活动，同时在诱导T细胞免疫耐受、活化、凋亡等方面也发挥着多种调节作用⁸。

近年来，CD47-SIRPα信号系统通过调节巨噬细胞的吞噬作用在肿瘤免疫监视中发挥的作用受到重视。CD47在许多恶性肿瘤，如卵巢癌⁹、急性骨髓性白血病(AML)¹⁰、B细胞淋巴瘤¹¹和实体瘤¹²中的表达水平显著上调，其平均表达水平是对应正常细胞的3.3倍左右，而且这种上调与恶性肿瘤患者的不良预后直接相关¹³。在人髓性白血病细胞(低水平表达内源CD47，不能移植于Rag2-Il2rg-小鼠)中表达小鼠CD47，可以抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，促进肿瘤细胞成功移植¹⁴。可以推断，肿瘤细胞上的CD47与巨噬细胞上的SIRPα作用，抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的清除，促进肿瘤在体内的生长和转移，高表达CD47是肿瘤细胞逃避免疫监视的普遍机制，阻断CD47-SIRPα作用，可能是新的肿瘤免疫治疗策略。

抗CD47抗体单独使用^10,12,13或者与其它肿瘤抗原抗体联合应用¹¹，在人急性骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)以及许多实体瘤的小鼠移植模型上都显示了很好的抑制肿瘤生长的作用。人源化抗CD47单克隆抗体诱导巨噬细胞对人原代AML细胞的吞噬作用，在体内彻底清除人AML细胞，使得移植小鼠长期无病生存；与利妥昔单抗联合作用，能清除NHL肿瘤，治愈异种移植小鼠¹⁵。而且，抗CD47抗体的安全性在猴体内得到证实。除了抗CD47抗体，高亲和力的SIRPα突变体(CD172a)也可以拮抗CD47进而阻断CD47-SIRPα信号通路，在AML模型上能显著增加巨噬细胞对AML细胞的吞噬作用，并抑制肿瘤的生长¹⁶。

新的抗CD47抗体的开发和应用是本领域所需要的。

发明概述

第一方面，本申请提供了一种特异性结合人CD47的抗体，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区和含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区，其中

所述HCDR1序列为NYWMH，所述HCDR2序列为VIAPSDNYTNYNQKFQG，所述HCDR3序列为GGKYSMDY，所述LCDR1序列为RSSQSIVHSNGNTYLE，所述LCDR2序列为KVSNRFS，所述LCDR3序列为FQGSHVPFT；或者

所述HCDR1序列为SYWMH，所述HCDR2序列为TIDRSDSYISYNQKFKG，所述HCDR3序列为GGPYGSKMMDN，所述LCDR1序列为HASQNINVWLS，所述LCDR2序列为KASNLHT，所述LCDR3序列为QQGQSYPLT；或者

所述HCDR1序列为DYYMH，所述HCDR2序列为WIYPSSGNTKYAQKFKD，所述HCDR3序列为REEDYFDY，所述LCDR1序列为KSSQSLLYSSNKKNYLT，所述LCDR2序列为WASTRES，所述LCDR3序列为QQFYAYPIS；或者

所述HCDR1序列为DYYMH，所述HCDR2序列为WIYPSSGNTKYAQKFKD，所述HCDR3序列为REEDYFDY，所述LCDR1序列为KSSQSVLYSSNQKNYLT，所述LCDR2序列为WASTRES，所述LCDR3序列为GQYYAYPIT；或者

所述HCDR1序列为DYYMH，所述HCDR2序列为WIYPGSGNTRYSQKFKD，所述HCDR3序列为REEDYFDY，所述LCDR1序列为KSSQSLLYSSNKKNYLT，所述LCDR2序列为WASTRES，所述LCDR3序列为QQFYAYPIS；或者

所述HCDR1序列为DYYMH，所述HCDR2序列为WIYPGSGNTRYSQKFKD，所述HCDR3序列为REEDYFDY，所述LCDR1序列为KSSQSVLYSSNQKNYLT，所述LCDR2序列为WASTRES，所述LCDR3序列为GQYYAYPIT；

其中HCDR和LCDR序列根据Kabat定义。

在一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：23、28、30、32或者33所示。

在一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：24、29、31、34或者35所示。

在一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示；或者

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；或者

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示；或者

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示；或者

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示；或者

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示；或者

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示。

第二方面，本申请提供了一种特异性结合人CD47的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：23、28、30、32或者33中任何一项具有至少90％的一致性，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO：24、29、31、34或者35中任何一项具有至少90％的一致性。

第三方面，本申请提供了一种特异性结合人CD47的抗体，其中所述抗体与SEQ IDNO：1所示人CD47区段的结合表位为不连续表位，包括氨基酸Q1，E29，A30，Q31，N32，E35，E97，E100，L101，T102，R103，E104，G105和E106，上述残基编号参照SEQ ID NO：1。

在第一方面至第三方面的一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。

在第一方面至第三方面的一些实施方案中，所述抗体为非激活型抗体。

在第一方面至第三方面的一些实施方案中，所述抗体能结合并中和人CD47，进而阻断CD47-SIRPα信号通路。在一些实施方案中，所述抗体能促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。在一些实施方案中，所述抗体抑制肿瘤细胞的体内生长。在一些实施方案中，所述抗体不增加巨噬细胞对正常血细胞的吞噬。

在第一方面至第三方面的一些实施方案中，所述抗体具有至少一项以下性质：

以低于5nM的KD值的亲和力结合重组人CD47胞外区D1(SEQ ID NO：1)；

以低于5nM的IC₅₀值抑制CD172a高亲和力突变体(SEQ ID NO：4)与人CD47-Fc的结合；

在0-133nM浓度下施用不导致红细胞聚集。

在第一方面至第三方面的一些实施方案中，所述抗体为全抗体、Fab片段、F(ab’)₂片段或单链Fv片段(scFv)。

在第一方面至第三方面的一些实施方案中，所述抗体为全人源抗体。

在第一方面至第三方面的一些实施方案中，所述抗体还包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区和/或包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。

第四方面，本申请提供了核酸分子，其编码第一方面至第三方面所述的抗体或其抗原结合部分。

第五方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面至第三方面所述的抗体和药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

在一些实施方案中，所述药物组合物用于治疗CD47介导的疾病。

在一些实施方案中，所述疾病为肿瘤，例如恶性肿瘤。

在一些实施方案中，恶性肿瘤为伯基特淋巴瘤或多发性骨髓瘤。

第六方面，本申请提供了第一方面至第三方面所述的抗体在制备用于预防或治疗CD47介导的疾病的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述疾病为肿瘤，例如恶性肿瘤。

第七方面，本申请提供了预防或治疗CD47介导的疾病的方法，包括向有需要的个体给予第一方面至第三方面所述的抗体或第七方面的药物组合物。

在一些实施方案中，所述疾病为肿瘤，例如恶性肿瘤。

附图说明

图1显示本申请的抗CD47单抗与hCD172a竞争结合hCD47的结果。

图2显示基于血凝实验分析本申请的抗CD47单抗的致红细胞凝集效应。

图3显示通过流式细胞术，分析本申请的抗CD47单抗促巨噬细胞吞噬Daudi细胞的效果。

图4显示本申请的抗CD47单抗促进巨噬细胞对Daudi细胞的吞噬率。

图5显示本申请的人源化抗CD47单抗抑制hCD47与hCD172a结合的效果。

图6显示hS2C3及其变体抑制hCD47和hCD172a-D1M1结合的效果。

图7显示本申请的抗CD47单抗致红细胞凝集程度的效果。

图8显示本申请的抗CD47单抗促进巨噬细胞对Daudi细胞的吞噬率。

图9显示本申请的抗CD47单抗抑制小鼠体内肿瘤生长的效果。

图10显示本申请的抗CD47单抗抑制NOD-SCID小鼠体内异种移植人骨髓瘤RPMI8226肿瘤生长的效果。

图11显示了本申请测试得到的CD47-Fab复合物结构，其中A图显示CD47-Fab复合物整体结构；B图显示CD47-Fab复合物结合表面，参与蛋白相互作用的氨基酸残基用棍棒模型表示，两个主要的结合区域用虚线标注，C图显示B图中区域I相互作用的细节；D图显示B图中区域II相互作用的细节。

序列说明

SEQ ID NO：1显示人(homo sapiens)CD47胞外区D1(hCD47)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2显示小鼠(mus musculus)CD47胞外区D1(mCD47)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3显示猕猴(Macaca mulatta)CD47胞外区D1(mmCD47)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4显示人CD172a胞外区免疫球蛋白样结构域的高亲和力突变体(hCD172a-D1M1)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5显示His标签(His)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6显示人抗体IgG1的Fc段(Fc)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7显示鼠抗体IgG2a的Fc段(mFc)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8显示人IgG1亚型重链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9显示人IgG2亚型重链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:10显示人IgG4亚型重链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11显示鼠IgG1亚型重链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:12显示鼠IgG2a亚型重链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:13显示人κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:14显示人λ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:15显示鼠κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16显示鼠λ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18分别显示人源化抗CD47单抗Hu5F9-G4的VH序列和VK序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19显示鼠单链抗体S4D12的全长氨基酸序列，SEQ ID NO：20和21分别显示其VH和VK序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：22显示鼠单链抗体S2H2的全长氨基酸序列，SEQ ID NO：23和24分别显示其VH和VK序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：25显示鼠单链抗体S2C3的全长氨基酸序列，SEQ ID NO：26和27分别显示其VH和VK序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：28和29分别显示人源化S4D12(hS4D12)的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列。

SEQ ID NO：30和31分别显示人源化S2C3(hS2C3)的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列。

SEQ ID NO：32显示重链可变区突变体H10C7的氨基酸序列。

SEQ ID NO：33显示重链可变区突变体H11E5的氨基酸序列。

SEQ ID NO：34显示轻链可变区突变体L25B8的氨基酸序列。

SEQ ID NO：35显示轻链可变区突变体L26A6的氨基酸序列。

发明详细描述

本申请的发明人通过抗体工程技术得到了新的抗人CD47抗体。在本申请的多个方面，提供了新的抗人CD47抗体或其抗原结合片段，编码该抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、制备和纯化该抗体的方法及所述抗体或其抗原结合片段的医学和生物学应用。根据本申请提供的抗体的可变区的序列，可构建全长的抗体分子作为药物用于治疗临床上由CD47介导的疾病。

除非另外指明，本发明的实施采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。

除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。

定义

如本文所用术语“抗体”，是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到标靶的免疫球蛋白分子。标靶包括但不限于碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、多肽等。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体，而且还包括其抗原结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。

通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链变异区(VH)和第一、第二及第三恒定区(CH1、CH2及CH3)。每个轻链含有轻链变异区(VL)和恒定区(CL)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。

如本文所用术语“抗原结合片段或抗原结合部分”，是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区域。抗原结合域可以包含重链变异区(VH)、轻链变异区(VL)或上述两者。VH和VL中的每个通常含有三个互补决定区CDR1、CDR2及CDR3。

本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即kabat定义和Chothia定义。(参阅例如Kabat,“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”，National Institutes of Health,Bethesda，Md.(1991)；A1-Lazikani etal.，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；以及Martin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989))。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定VH和VL序列中CDR区序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR序列。

对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中CDR区序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http://www.abysis.org/)。

抗原结合片段的实例包括但不限于：(1)Fab片段，其可以是具有VL-CL链和VH-CH1链的单价片段；(2)F(ab')₂片段，其可以是具有两个Fab'片段的二价片段，该两个Fab'片段由铰链区的二硫桥(即Fab'的二聚物)连接；(3)具有抗体的单臂的VL和VH域的Fv片段；(4)单链Fv(scFv)，其可以是由VH域和VL域经由胜肽连接符组成的单一多胜肽链；以及(5)(scFv)₂，其可以包含两个由胜肽连接符连接的VH域和两个VL域，该两个VL域是经由二硫桥与该两个VH域组合。

如本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。

本文所用术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。

本文所用术语“肿瘤”指由异常细胞生长形成的赘生物或实体病变。肿瘤可以是良性的、恶变前的或恶性的。

“原发性肿瘤”是在个体中最初位点存在的肿瘤，可以与“转移性肿瘤”相区别，转移性肿瘤存在于个体中距原发性肿瘤的远距离部位。

本文所用术语“恶性肿瘤”是指或描述哺乳动物的生理条件，其典型的特征在于不受调控的细胞生长。示例性恶性肿瘤包括：癌、黑素瘤肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞瘤和胚细胞瘤。恶性肿瘤的更多具体实例包括：鳞状细胞癌(例如，鳞状上皮细胞癌)，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌的肺癌，腹膜癌，肝细胞癌，包括胃肠癌的胃癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，膀胱癌，尿路癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌(hepatic carcinoma)，肛门癌，阴茎癌，黑素瘤，多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤，脑癌及头颈癌以及相关转移灶。

本文所用术语“癌”指由变异的上皮细胞或具有未知的组织学发生、但具有与上皮细胞有关的特定分子学或组织学特征(如产生细胞角蛋白或细胞间桥)的变异细胞组成的侵袭性恶性肿瘤。本申请的示例性癌包括卵巢癌、阴道癌、子宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肛门癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、胰岛瘤、腺癌、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、口腔癌、脑癌、成神经管细胞瘤、神经外胚层瘤、胶质瘤、垂体癌和骨癌。

本文所用术语“淋巴瘤”指免疫系统的淋巴细胞的恶性肿瘤。淋巴瘤通常以实体瘤存在。示例性淋巴瘤包括：非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、原发性巨球蛋白血症(

macroglobulinemia)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、结内边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性淋巴瘤、经典霍奇金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤、结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞NK细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、赛谢综合征、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴增生病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、非特指型外周T细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。经典霍奇金淋巴瘤的示例性形式包括：结节性硬化型、混合细胞型、淋巴细胞富集型和淋巴细胞消减型或非消减型。

本文所用术语“肉瘤”为来自由胚胎中胚层发育的多种组织之一中的变异细胞的恶性肿瘤。因此，肉瘤包括骨、软骨、脂肪、肌肉、血管和造血组织的肿瘤。例如，来自骨的骨肉瘤、来自软骨的软骨肉瘤、来自脂肪的脂肪肉瘤和来自平滑肌的平滑肌肉瘤。示例性的肉瘤包括：Askin瘤、葡萄状肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤-PNET、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤。软组织肉瘤的亚类包括：软组织腺泡状肉瘤、血管肉瘤、叶状囊肉瘤、皮肤纤维肉瘤硬纤维瘤、促纤维化小圆细胞肿瘤、上皮样肉瘤骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波济氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。

本文所用术语“白血病”为血液或骨髓的恶性肿瘤，特征在于白细胞的异常增多。白血病是广义术语，其涵盖了一系列疾病。因此，白血病是更广泛的称为血液肿瘤的疾病种类的一部分。白血病细分为多个大类；第一种分类是白血病的急性和慢性形式。急性白血病的特征在于未成熟的血细胞数量的快速增长。由于这些细胞的积聚使得骨髓不能制造健康的血细胞。慢性白血病的特征在于相对成熟、但仍为异常的白细胞的过度产生。通常通过数月或数年的发展，所述细胞的产生速率大大高于正常细胞，导致血液中有很多的异常白细胞。白血病也可以通过受累的血细胞进行细分。这样的分界将白血病划分为成淋巴细胞或淋巴细胞白血病和骨髓性(myeloid)或骨髓性(myelogenous)白血病。在成淋巴细胞或淋巴细胞白血病中，癌变发生在通常继续形成淋巴细胞的骨髓细胞类型中。在骨髓性(myeloid)或骨髓性(myelogenous)白血病中，癌变发生在通常继续形成红细胞、一些其他类型的白细胞和血小板的骨髓细胞类型中。结合这两种分类提供了总共四种主要类别。在这四种主要分类的每一种中，通常有一些亚类别。还存在分类方案之外的罕见类型。示例性的白血病包括：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞性白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞性白血病、大颗粒淋巴细胞白血病、幼年型粒-单核细胞白血病、B细胞幼淋巴细胞性白血病、伯基特白血病和成人T细胞性白血病。

在本文给出的核酸序列中涉及兼并碱基(除了A、T、C、G常规碱基之外)的使用，其含义与本领域技术人员通常理解的相同。例如，R代表A或G；Y代表C或T，M代表A或C；K代表G或T；S代表C或G；W代表A或T；H代表A或C或T；B代表C或G或T；V代表A或C或G；D代表A或G或T；N代表A或C或G或T。

其中HCDR和LCDR序列根据Kabat定义。

在第一方面至第三方面的一些实施方案中，所述抗体能结合并中和人CD47，进而阻断CD47-SIRPα信号通路。在一些事实方案中，所述抗体能促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，抑制肿瘤细胞的体内生长，而不增加巨噬细胞对正常血细胞的吞噬。

在0-133nM浓度下施用不导致红细胞聚集。

在一些实施方案中，所述核酸分子可操作地连接到调控序列，调控序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。

在一些实施方案中，所述疾病为肿瘤，例如恶性肿瘤。

在一些实施方案中，药物组合物还可包含下述中的一种或多种：润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，如苯甲酸、山梨酸和丙酸钙；增甜剂和/或调味剂等。

在一些实施方案中，可将本申请中的药物组合物配制为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、酏剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆、栓剂或胶囊等形式。

在一些实施方案中，可以利用任何生理上可接受的给药方式递送本申请的药物组合物，这些给药方式包括但不限于：口服给药、肠胃外给药、经鼻给药、直肠给药、腹膜内给药、血管内注射、皮下给药、经皮给药、吸入给药等。

在一些实施方案中，可以通过混合具有所需纯度的试剂与视情况的药学上可接受的载体、赋形剂等，以冻干制剂或水溶液的形式配制用于治疗用途的药物组合物用于存储。

在一些实施方案中，所述疾病为肿瘤，例如恶性肿瘤。

第七方面，本申请提供了预防或治疗CD47介导的疾病的方法，包括向有需要的个体给予第一方面至第三方面所述的抗体或第五方面的药物组合物。

在一些实施方案中，所述疾病为肿瘤，例如恶性肿瘤。

在其他方面，本申请还提供包含编码本申请抗体或其抗原结合部分的分离的核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或载体的宿主细胞。

在其他方面，本申请还提供产生本申请抗体的方法。在一些实施方案中，产生抗体的方法包括培养宿主细胞以便于表达核酸。在一些实施方案中，产生抗体的方法还包括从宿主细胞培养基中回收抗体。

应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。

以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。

实施例

实施例1：重组蛋白的制备

制备抗CD47单抗的过程中需要用到多种不同的重组蛋白，包括人CD47胞外区D1(hCD47，SEQ ID NO：1)、小鼠CD47胞外区D1(mCD47，SEQ ID NO：2)、猕猴CD47胞外区D1(mmCD47，SEQ ID NO：3)和人CD172a胞外区免疫球蛋白样结构域的高亲和力突变体(hCD172a-D1M1，SEQ ID NO：4)。这些蛋白具有翻译后修饰(如糖基化或者二硫键等)，因而利用哺乳动物细胞表达系统更有利于保持重组蛋白的结构和功能。此外，为了有利于重组蛋白的纯化和单克隆抗体功能的鉴定，在这些重组蛋白的C端添加了His标签(His，SEQ IDNO：5)或者人抗体IgG1的Fc段(Fc，SEQ ID NO：6)或者鼠抗体IgG2a的Fc段(mFc，SEQ ID NO：7)。抗体重链恒定区可以是人IgG1亚型(SEQ ID NO:8)，人IgG2亚型(SEQ ID NO:9)、人IgG4亚型(SEQ ID NO:10)或者鼠IgG1亚型(SEQ ID NO：11)，鼠IgG2a亚型(SEQ ID NO:12)；轻链恒定区可以是人κ亚型(SEQ ID NO:13)、人λ亚型(SEQ ID NO:14)或者鼠κ亚型(SEQ ID NO:15)、鼠λ亚型(SEQ ID NO：16)。

根据Uniprot数据库的各种目的重组蛋白的氨基酸序列，设计并合成上述各种重组蛋白的基因(包含His标签或者Fc、mFc编码基因)。利用常规的分子生物学技术将合成的各种重组蛋白基因克隆至合适的真核表达载体(如invitrogen公司的pcDNA3.1等)，然后利用脂质体(如invitrogen公司的293fectin等)或者其他阳离子转染试剂(如PEI等)将制备的重组蛋白表达质粒转染入HEK293细胞(如invitrogen公司的HEK293F)，在无血清悬浮培养条件下培养3-4天。然后通过离心等方式收获培养上清。

His标签融合表达的重组蛋白利用金属螯合亲和层析柱(如GE公司的HisTrap FF等)对培养上清中的重组蛋白进行一步纯化。Fc和mFc融合表达的重组蛋白用ProteinA/G亲和层析柱(如GE公司的Mabselect SURE等)进行一步纯化。然后利用脱盐柱(如GE公司的Hitrap desaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为PBS(pH7.0)或者其他合适的缓冲液。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃。

实施例2：鼠抗人CD47单抗的制备

1.小鼠免疫及免疫抗体库的制备

取6-8周龄BALB/c小鼠，免疫之前对小鼠进行尾静脉采血留本底血清。首次免疫取hCD47-mFc融合蛋白以费氏完全佐剂乳化，每只小鼠腹腔注射50μg融合蛋白。间隔两周加强免疫，取hCD47-mFc融合蛋白以费式不完全佐剂乳化，每只小鼠腹腔注射50μg融合蛋白，注射前断尾采血，共进行两次加强免疫。第四次免疫改用冲击免疫，以不加佐剂的hCD47-mFc重组抗原作为免疫原，每只小鼠腹腔注射50μg融合蛋白，冲击免疫后3天处死小鼠，收集脾细胞。

使用小鼠淋巴细胞分离液(达科为，#DKW33-R0100)对小鼠脾脏淋巴细胞进行分离，利用细胞总RNA提取试剂盒(天根，#DP430)，将分离的淋巴细胞进行总RNA的提取。以提取的总RNA为模板，利用第一链cDNA合成试剂盒(Thermo scientific，#K1621)分别合成重链可变区和轻链可变区，反转录引物采取基因特异性引物，引物配对区分别位于抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区，具体序列分别为PmCGR:TGCATTTGAACTCCTTGCC和PmCKR:CCATCAATCTTCCACTTGAC。将合成完成的cDNA立即存放于-70℃保存备用。然后，以反转录得到的cDNA为模板，参考文献(Journal of Immunological Methods，201(1997)，35–55)合成引物，并利用PCR分别扩增鼠抗体VH和VK，然后利用重叠延伸PCR技术，构建单链抗体(scFv)。最后将制备的小鼠单链抗体基因克隆至载体pADSCFV-S(实验技术流程可参见中国专利申请201510097117.0号)，构建scFv库。此抗体库的库容达到1.2×10E7，正确率约为85％。

3.小鼠免疫库的筛选和鉴定

按照与中国专利申请201510097117.0号相似的实验流程，以重组huCD47-D1-his为抗原，利用固相筛选策略筛选展示小鼠单链抗体库的噬菌体，共进行三轮筛选，最终获得多株序列不同、但能特异性结合hCD47的鼠抗体，包括克隆S1F9，S2H2，S4D12，S2C3，S2D10。噬菌体-ELISA表明hCD172a-D1M1可以与其中四株鼠单抗(S1F9/S2C3/S2H2/S4D12)竞争结合CD47，而鼠单抗S2D10与CD47的结合不被hCD172a-D1M1阻断。

实施例3：鼠单抗的鉴定

选取鼠单链抗体S4D12(SEQ ID NO：19，VH和VK序列分别为SEQ ID NO：20和21)、S2H2(SEQ ID NO：22，VH和VK序列分别为SEQ ID NO：23和24)和S2C3(SEQ ID NO：25，VH和VK序列分别为SEQ ID NO：26和27)，利用分子生物学方法制备重组人IgG4-κ形式鼠-人嵌合抗体，同时参照美国专利申请US 9017675B2的公开内容，制备人源化抗CD47单抗Hu5F9-G4(VH序列和VK序列分别为SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18)。

1.重组抗CD47单抗阻断hCD47结合hCD172a

包被抗原hCD47-mFc，用固定浓度的hCD172a-D1M1-His对S2C3/S2H2/S4D12嵌合抗体进行梯度稀释，用HRP-小鼠-抗his IgG(康为世纪，CW0285M)检测CD172a-D1M1-His和hCD47-mFc的结合。ELISA分析结果(图1)显示，单抗S2C3，S2H2和S4D12阻断CD47和CD172a-D1M1相互作用的能力差异不大，IC₅₀约在2-5nM的范围(表1)。

表1：三种不同抗CD47单抗抑制CD47与CD172a-D1M1结合的IC₅₀

	S2C3-IgG4	S2H2-IgG4	S4D12-IgG4	Hu5F9-IgG4
					IC<sub>50</sub>(nM)	5.193	2.077	3.889	9.605

2.重组抗CD47单抗的亲和力分析

利用Biacore X100测定IgG4嵌合抗体的亲和力。氨基偶联试剂盒，人抗体捕获试剂盒，CM5芯片和pH7.4的10×HBS-EP等相关试剂和耗材均购自GE healthcare。根据试剂盒中的说明书，将抗人Fc段的抗体偶联至CM5芯片表面，稀释抗体蛋白至合适浓度，保证300RU左右的抗体被抗人Fc的抗体捕获。将huCD47-D1-his设置一系列的浓度梯度(500nM，167nM，56nM，18.5nM，6.2nM)流经固定相表面，25℃下测定各单克隆抗体的亲和力。结果如表2所示。

表2.不同抗CD47单抗亲和力常数

	K<sub>on</sub>(1/Ms)	K<sub>off</sub>(1/s)	KD(M)
				S2C3-IgG4	8.861E+5	2.221E-2	2.506E-8
S2H2-IgG4	7.169E+5	6.959E-3	9.707E-9
				S4D12-IgG4	1.414E+6	1.423E-2	1.006E-8
Hu5F9-IgG4	1.317E+6	2.646E-2	2.01E-8

3.重组抗CD47单抗的红细胞凝集能力分析

红细胞表面高表达CD47，因此抗CD47单抗可以和红细胞表面的CD47特异性结合。由于每个抗体有两个抗原结合位点，因而抗CD47单抗可能导致红细胞凝集。导致红细胞凝集的单抗在体内会引起贫血、红细胞数量减少等副反应。抗CD47单抗是否导致红细胞凝集主要取决于单抗在CD47分子上的识别表位。本实施例利用经典的血凝实验对抗CD47单抗导致红细胞凝聚的能力进行了分析。将之前实施例选用的抗CD47抗体(40μg/ml)用PBS稀释进行一系列的倍比稀释，然后在微量血凝反应板中与制备的1％红细胞悬液混合，置于微量振荡器上振荡1min混匀。将微量血凝反应板于25℃室温静置1h后用照相记录红细胞凝集程度，并将微量血凝反应板倾斜45°角持续数分钟，通过红细胞流动速率快慢来进一步确定红细胞凝集程度。红细胞凝集程度可分为4个等级：4凝成均匀薄层，倾斜不流动；3凝成均匀薄层，倾斜有轻微流动；2凝成少量薄层，倾斜流动较快；1未有薄层形成，倾斜后与对照孔流动速度一样。结果显示(图2)，人-鼠嵌合单抗S2C3和S2H2不引起红细胞凝集，而人-鼠嵌合单抗S4D12和人源化抗体Hu5F9有强烈的红细胞凝集作用。

4.重组抗CD47单抗能够促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞

利用Ficoll密度梯度离心法从健康人全血中分离PBMC，然后通过CD14磁珠(抗人CD14磁性颗粒–DM，BD)从PBMC中分选得到CD14⁺单核细胞。将CD14⁺单核细胞以8×10⁵/孔的密度接种于12孔板中，用10ng/ml MCSF诱导7天左右至分化成成熟的巨噬细胞。肿瘤细胞(Daudi淋巴瘤细胞系)预先用CFSE染色后计数重悬，以8×10⁵的细胞量和终浓度10μg/ml的不同抗CD47单抗或对照抗体(IgG)共孵育15-30min，随后转移至含巨噬细胞的孔中。共同孵育3h后收集巨噬细胞，利用抗人CD14-APC对巨噬细胞进行染色，30min后PBS洗涤两次，利用流式细胞术(BD Accuri^TM C6)检测APC(FL-4)和CFSE(FL-1)双通路，并以巨噬细胞本底的吞噬率作为起始，计算出各个样品的吞噬率。结果显示(图3和图4)，本申请的三种人-鼠嵌合抗CD47单抗和Hu5F9都能够促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞。

实施例4：鼠单抗的人源化及鉴定

1.鼠单抗的人源化改造

对鼠抗体S2C3和S4D12进行人源化研究以降低其免疫原性。将S2C3和S4D12的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)分别与IMGT数据库中的人抗体胚系基因序列相比较，选择合适的胚系基因序列以提供抗体的框架区1至3(FR1+FR2+FR3)，选择合适的J区基因序列以提供框架区4(FR4)。这个模板可以根据例如抗体的相对总长度、CDR的大小、位于抗体框架区(FR)和超变区(CDR)之间连接处的氨基酸残基、序列整体的同源性等等选出，所选的模板可以是多个序列的混合物或者可以是共有模板，目的是尽可能维持亲本互补决定区(CDR)的合适构象。最终确定人源化S4D12(hS4D12)轻、重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：29，SEQID NO：28)和人源化S2C3(hS2C3)的轻、重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：30)。根据人源化抗体的氨基酸序列设计并合成可变区基因，并制备IgG4版本的人源化抗体hS2C3和hS4D12。

2.人源化抗CD47单抗的活性分析

参照实施例3中的方法分析了人源化抗CD47单抗抑制hCD47与hCD172a结合的能力，结果显示(图5)人源化抗体hS2C3和hS4D12能够有效抑制hCD47与hCD172a的结合，IC₅₀低于5nM(表3)。利用BIAcore对人源化抗体的亲和力进行了分析，结果显示，人源化抗体基本保持了亲本鼠抗体的亲和力(表4)。

表3：人源化抗CD47单抗抑制CD47与CD172a结合的IC₅₀

	Hu5F9-IgG4	hS4D12-IgG4	hS2C3-IgG4
				IC<sub>50</sub>	4.161	2.68	3.364

表4：人源化抗D47单抗的亲和力常数

	K<sub>on</sub>	K<sub>off</sub>	KD
				S4D12	1.285E+6	1.1E-2	8.56E-9
hS4D12	1.225E+6	1.176E-2	9.6E-9
				S2C3	1.111E+6	2.055E-2	1.85E-8
hS2C3	1.088E+6	1.099E-2	1.01E-8
				Hu5F9-IgG4	2.095E+6	3.142E-2	1.499E-8

实施例5：人源化抗CD47单抗hS2C3的亲和力成熟

为进一步提高人源化抗体的亲和力，对hS2C3进行了体外亲和力成熟。体外亲和力成熟的主要策略是依次在重链CDR和轻链CDR中引入突变，构建轻链或者重链突变库，然后基于双载体的噬菌体展示系统(具体操作可参照申请人之前提交的中国专利申请第201510097117.0号中的

实施例5)分别筛选重链和轻链的高亲和力突变体。

1.hS2C3重链突变库的构建及筛选

利用常规分子生物学方法构建hS2C3重链可变区的突变库，库容为6.5×10E5，突变库的正确率约为95％，其中在HCDR1和HCDR2中引入突变所需引物见表5。以重组huCD47-his为抗原，利用固相筛选策略对hS2C3-HCDR12突变库进行了3轮筛选，最终得到亲和力进一步提高的两个突变体H10C7(SEQ ID NO：32)和H11E5(SEQ ID NO：33)。

表5：hS2C3重链可变区突变库扩增所需引物

2.hS2C3轻链突变库的构建及筛选

类似地，利用表6中的兼并引物，通过重叠延伸PCR技术在hS2C3轻链可变区的LCDR1和LCDR3中引入突变并构建突变库。构建库容量约3.1×10E6，正确率约为90％。以重组huCD47-his为抗原，利用固相筛选策略对hS2C3-LCDR13突变库进行了3轮筛选，最终得到亲和力进一步提高的两个突变体L25B8(SEQ ID NO：34)和L26A6(SEQ ID NO：35)

表6：hS2C3轻链可变区突变库构建所需引物

3.hS2C3突变体的鉴定

利用筛选到的两种高亲和力轻链突变体和两种高亲和力重链突变体进行组合，制备了四种人源化抗体hS2C3的突变体：利用筛选到的两种高亲和力轻链突变体和两种高亲和力重链突变体进行组合，制备了四种人源化抗体hS2C3的突变体：H10C7+L25B8、H10C7+L26A6、H11E5+L25B8和H11E5+L26A6，并参照实施例3中的方法对四种hS2C3的突变体进行了亲和力和功能分析。

利用BIAcore对四种突变体的亲和力分析显示(表7)：四种突变体较人源化抗体hS2C3的亲和力有5-10倍的提高，而且四种突变体都能有效抑制hCD47结合hCD72a-D1M1(图6)，而且IC₅₀都低于5nM(表8)。

表7：hS2C3突变体的亲和力常数

抗体	K<sub>on</sub>	K<sub>off</sub>	KD
				H10C7+L25B8	1.031E+6	1.151E-3	1.115E-9
H10C7+L26A6	8.33E+5	1.932E-3	2.32E-9
				H11E5+L25B8	1.189E+6	9.597E-4	8.072E-10
H11E5+L26A6	9.297E+5	1.7E-3	1.829E-9
				hS2C3	1.078E+6	1.029E-2	0.955E-8

表8：hS2C3突变体抑制hCD47和hCD172a-D1M1结合的IC₅₀

	H10C7+L26A6	H11E5+L26A6	H10C7+L25B8	H11E5+L25B8	hS2C3
						IC<sub>50</sub>	4.25	3.521	4.511	4.129	4.13

红细胞凝集实验显示(图7)四种亲和力提高的人源化抗CD47单抗在0-133nM浓度范围内都不会导致红细胞凝集，而且四种人源化突变体都能够促进巨噬细胞对CD47⁺肿瘤细胞(Daudi)的吞噬(图8)。

4.人源化抗CD47单抗体内抑制肿瘤生长

利用人伯基特淋巴瘤raji细胞，以1×10⁴细胞/小鼠的量，皮下接种于雄性NSG小鼠，在肿瘤体积长至100cm³时随机分为5组，每组8只小鼠：(1)介质对照组；(2)20mg/kgH10C7+L26A6组；(3)10mg/kgH10C7+L26A6组；(4)3mg/kg H10C7+L26A6组；(5)10mg/kghu5F9-IgG4组。每周腹腔给药两次，一共3周。给药过程中，一周3次测量肿瘤大小及动物体重以评价抗CD47抗体的抑瘤作用。实验结果如图9所示，图9中横坐标为raji肿瘤的荷瘤小鼠接受药物处理的时间，纵坐标为肿瘤体积。结果表明：与介质对照组相比，人源化抗CD47单抗H10C7+L26A6能够抑制肿瘤的生长，其抑制能力与对照抗体hu5F9-IgG4相当。

5.人源化抗CD47单抗在人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞皮下异种移植NOD/SCID小鼠动物模型中的抑制肿瘤生长作用

在细胞接种前一天，将小鼠进行60Co照射处理(150rad)。雄性NOD/SCID小鼠于右侧背部皮下接种1×10⁷RPMI8226细胞，细胞重悬在PBS与基质胶(matrigel)的1:1混悬液中(0.1ml/只)。待肿瘤平均体积达到80-100mm³时，称量所有小鼠的体重，测量肿瘤体积后随机分组给药。肿瘤细胞接种当天定义为第0天。共分为5组，每组8只小鼠：(1)介质对照组(i.p.BIW*4，p.o.QD*4)；(2)10mg/kg达雷木单抗(daratumumab)(i.p.BIW*4)组；(3)10mg/kg H10C7+L26A6(i.p.BIW*4)组；(4)50mg/kg来那度胺(lenolidomide)(p.o.QD*4)组；⑤10mg/kg达雷木单抗(i.p.BIW*4)+50mg/kg来那度胺(p.o.QD*4)组。给药过程中，一周3次测量肿瘤大小及动物体重。达雷木单抗为已上市的针对多发性骨髓瘤的单抗药物，来那度胺为临床多发性骨髓瘤常规用药。实验结果如图10所示，图10中横坐标为皮下异种移植RMPI8226肿瘤的NOD-SCID荷瘤小鼠接受药物处理的时间，纵坐标为肿瘤体积，和介质对照组相比，人源化抗CD47单抗H10C7+L26A6能够显著抑制肿瘤的生长，其抑瘤能力要显著高于达雷木单抗、来那度胺和达雷木单抗+来那度胺的联合用药。

6.人源化抗CD47单抗H10C7+L26A6的CD47结合表位分析

为了研究人源化单抗H10C7+L26A6与人CD47的结合表位，利用HEK293细胞制备重组的H10C7+L26A6Fab片段以及重组的人CD47胞外区D1(hCD47，SEQ ID NO：1)形成Fab-hCD47复合物，在2.0M硫酸铵+5％异丙醇条件下形成复合物晶体，对复合物晶体进行X射线衍射实验，收集到分辨率

的数据(表9)，并通过分子置换法解析了CD47抗原抗体复合物的晶体结构。最终得到的结构模型包括CD47胞外区1-116aa(SEQ ID NO：1)、抗体重链1-219aa、轻链1-219aa。抗体H链和L链最后一个氨基酸残基在电子密度中均不可见，提示其在晶体中没有固定结构。在复合物晶体结构中，CD47以单体形式存在，而且在N16、N32、N55和N93位点存在可见的糖基化。

CD47与Fab的相互作用面积约为

其中CD47与重链的相互作用面积约为

与轻链的相互作用面积约为

相互作用主要涉及CD47的N端、BC环、β-链F、FG环和β-链G，而抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链可变区的LCDR1、LCDR3参与了对CD47的识别(图11)。相互作用方式包括氢键、盐键、范德华力以及疏水相互作用(表10)。其中，人源化抗CD47单抗H10C7+L26A6识别人CD47的一个不连续(空间)表位，主要包括氨基酸Q1，E29，A30，Q31，N32，E35，E97，E100，L101，T102，R103，E104，G105和E106。

据文献报道，抗人CD47单抗hu5F9单抗的抗原结合表位包括氨基酸Q1，E29，K39，K41，E97，T99，R103和E104；而抗人CD47单抗2A1的抗原表位包括氨基酸Y37，K39，K41，K43，G44，R45，D46，D51，H90，N93，E97，T99，E104和E106。抗人CD47单抗H10C7+L26A6、hu5F9和2A1的表位都有部分重叠，但又都不完全相同。

为了进一步对抗人CD47单抗H10C7+L26A6的表位进行验证，挑选表位中的部分氨基酸位点，利用常规分子生物学方法制备了三种hCD47的突变体，包括Q1A，E35A和L101A，并利用BIAcore测定了人源化抗CD47单抗H10C7+L26A6与这些hCD47突变体的亲和力，并与天然的hCD47进行了比较(表11)。结果显示：L101A点突变导致完全不结合，Q1A的突变导致亲和力下降约100倍，而E35A突变导致亲和力提高约4倍。表明这些构成单抗H10C7+L26A6表位的关键氨基酸的突变将直接导致抗体-抗原亲和力的变化(降低或者提高)。同时分析抗人CD47单抗hu5F9与这些突变体的亲和力发现(表11)，只有hCD47中的Q1A突变影响hu5F9与人CD47的亲和力，而hCD47中的E35A和L101A突变对hu5F9的亲和力没有明显的改变。此结果与hu5F9的抗原表位中包括Q1，而不包括E35和L101一致。

表9.复合物晶体的X射线衍射收据收集及统计

*括号中的数值是对于最高分辨率壳

表10：参与Fab-hCD47结合的氨基酸残基

表11：基于BIAcore分析不同hCD47突变体与人源化抗CD47单抗的亲和力

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18.Patent reference,US2014/0140989 A1,P38

序列表

<110> 北京智仁美博生物科技有限公司

智翔（上海）医药科技有限公司

重庆智翔金泰生物制药有限公司

<120> 抗人CD47抗体及其用途

<130> 18C10410CN

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Ala Pro Ser Asp Asn Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Lys Gly Gly Lys Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro

130 135 140

Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser

145 150 155 160

Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys

165 170 175

Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe

180 185 190

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr

210 215 220

Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys

225 230 235 240

Leu Glu Ile Lys

<210> 20

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Ala Pro Ser Asp Asn Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Lys Gly Gly Lys Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 21

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 22

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Asp Arg Ser Asp Ser Tyr Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Gly Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Gly Pro Tyr Gly Ser Lys Met Met Asp Asn Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser

130 135 140

Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala

145 150 155 160

Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly

180 185 190

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu

195 200 205

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

210 215 220

Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Leu Lys

<210> 23

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

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35 40 45

Gly Thr Ile Asp Arg Ser Asp Ser Tyr Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Gly Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

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Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

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<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Ser Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Ala Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala

130 135 140

Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

145 150 155 160

Leu Leu Tyr Pro Ser Asn Lys Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln

165 170 175

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

180 185 190

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

195 200 205

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr

210 215 220

Tyr Cys Gln Glu Tyr Tyr Ala Tyr Pro Leu Ser Phe Gly Ala Gly Thr

225 230 235 240

Lys Leu Glu Ile Lys

245

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<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

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<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

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65 70 75 80

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100 105 110

Lys

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<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Ala Pro Ser Asp Asn Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Lys Gly Gly Lys Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 29

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

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65 70 75 80

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100 105 110

<210> 30

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Ser Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

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85 90 95

Ala Arg Arg Glu Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 31

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Pro

20 25 30

Ser Asn Lys Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

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65 70 75 80

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100 105 110

Lys

<210> 32

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

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50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 33

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

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50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 34

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Lys Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Phe Tyr Ala Tyr Pro Ile Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 35

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ala Tyr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

Claims

1.一种特异性结合人CD47的抗体，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区和含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区，其中

其中HCDR和LCDR序列根据Kabat定义。

2.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：23、28、32或者33所示。

3.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：24、29、34或者35所示。

4.根据权利要求1所述的抗体，其中

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示；或者

5.一种特异性结合人CD47的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：30所示，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中

所述抗体能以低于5nM的KD值的亲和力结合如SEQ ID NO：1所示的重组人CD47胞外区D1；和/或

所述抗体能以低于5nM的IC₅₀值抑制如SEQ ID NO：4所示的CD172a高亲和力突变体与人CD47-Fc的结合；和/或

所述抗体在0-133nM浓度下施用不导致红细胞聚集；和/或

所述抗体为全抗体、Fab片段、F(ab’)₂片段或单链Fv片段(scFv)；和/或

所述抗体还包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区和/或包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。

7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述抗体为全人源抗体。

8.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。

9.核酸分子，其编码权利要求1-8中任一项所述的抗体。

10.药物组合物，其包含权利要求1-8中任一项所述的抗体和药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

11.权利要求1-8中任一项所述的抗体在制备用于治疗CD47介导的肿瘤的药物中的用途。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述肿瘤为恶性肿瘤。