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WO2021029409A1 - 小片多孔膜を適用した細胞培養法 - Google Patents

小片多孔膜を適用した細胞培養法 Download PDF

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Publication number
WO2021029409A1
WO2021029409A1 PCT/JP2020/030614 JP2020030614W WO2021029409A1 WO 2021029409 A1 WO2021029409 A1 WO 2021029409A1 JP 2020030614 W JP2020030614 W JP 2020030614W WO 2021029409 A1 WO2021029409 A1 WO 2021029409A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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cells
porous membrane
cell culture
small piece
polymer porous
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/030614
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
萩原　昌彦
泉展 日▲高▼
原田　崇司
隼人 此島
Original Assignee
宇部興産株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 宇部興産株式会社 filed Critical 宇部興産株式会社
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Priority to EP20853067.5A priority patent/EP4012016A4/en
Priority to KR1020227004265A priority patent/KR20220042371A/ko
Priority to JP2021539299A priority patent/JPWO2021029409A1/ja
Priority to US17/633,936 priority patent/US20220290083A1/en
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture and a substance production system, and more specifically, to a cell culture method using a small piece polymer porous membrane.
  • the present invention also relates to a cell culture device and a kit provided with a small piece polymer porous membrane.
  • Cell culture cells generally exist in a living body as a population having a three-dimensional structure.
  • the cells when culturing cells in an artificial environment, the cells are cultivated in a two-dimensional manner in a single-layered manner attached to the bottom of the culture vessel, or the cells are dispersed in a liquid culture medium.
  • a suspension culture method in which the cells are cultured in a state is generally used.
  • the cells used in the planar culture method cells having relatively high adhesiveness are suitable, but even when suitable cells are used, the properties of the cells may change significantly due to the difference in the culture environment.
  • the suspension culture method some cells are suitable and some are not.
  • Non-Patent Document 1 and Patent Document 1 As a method of culturing a large amount of cells in a three-dimensional environment, a method using a bioreactor or a cell culture carrier has been reported (Non-Patent Document 1 and Patent Document 1).
  • a method using a bioreactor there is a method in which a fibrous substance such as glass fiber is accumulated in a column and cells are continuously cultured in the space to produce the substance (Patent Document 2).
  • a typical cell culture carrier microcarriers, which are small particles capable of adhering and growing cells, have been widely studied (Patent Documents 3 and 4).
  • Patent Document 4 As shown in Patent Document 4 as an example of production, in order to increase the amount of product and increase efficiency by the cell culture method using a microcarrier, it is most important to achieve high-density cell culture. It will be an important issue. Another important issue is how efficiently and easily the cells can be proliferated and the cells can be transplanted and seeded on the microcarrier which is a carrier. In this regard, in a cell culture system using microcarriers, it is necessary to sufficiently stir and diffuse the microcarriers so as not to aggregate them with each other. Therefore, there is an upper limit to the density of cells that can be cultured because a volume sufficient to sufficiently stir and diffuse the culture solution in which microcarriers are dispersed is required.
  • exosomes The physiological activity of exosomes is supported by the composition of nucleic acids and proteins controlled by the cells from which the exosomes are derived, and the quality of exosomes produced at each stage of induction, logarithmic growth, quiescence, and death in cell culture. Is expected to change. Therefore, when considering the production of exosomes on an industrial scale, it is not preferable for quality control that the characteristics of exosomes change depending on the culture time, and it is possible to produce exosomes of uniform quality over a long period of time with a once established production system. Is required.
  • anaerobic bacteria are excluded in cell culture regardless of whether a cell culture carrier is used or not, and whether it is a floating cell or an adherent cell.
  • oxygen supply is an important issue for the healthy growth of cells.
  • adherent cells are cultured in a plane using a petri dish, a plate, or a chamber, the appropriate range of the amount of medium is limited with respect to the area of the culture vessel. Therefore, when an unnecessarily large amount of medium is used, sufficient oxygen may not be supplied to the cells, which may cause damage due to hypoxia or death of the cells.
  • Non-Patent Document 4 it is known that when a group of cells forms a spheroid and its size becomes too large, the cells inside become deficient in oxygen (Non-Patent Document 4).
  • Patent Document 5 In order to deal with such an oxygen supply problem, attempts have been made to improve the oxygen concentration by using microbubbles (Patent Document 5) and a uniform oxygen supply method in microcarrier culture (Patent Document 6).
  • Patent Document 5 a uniform oxygen supply method in microcarrier culture
  • the cells preferentially inhabit and proliferate in a low oxygen environment, so that it is complicated to adjust the oxygen supply during cell culture depending on the cell type. Requires operation. Therefore, there has been a demand for the development and construction of a cell culture method capable of easily adjusting the amount of oxygen provided and culturing a large number of cells by a simple and automated process.
  • the present inventors have provided cell culture methods and cell culture devices using a polymer porous membrane, but in order to prevent the continuous morphology of the membranous polymer porous membrane from being deformed, a polymer is used.
  • a cell culture module in which a porous membrane is housed in a casing is applied to a cell culture container, a cell culture device, or a cell culture system (Patent Document 7: "Cell Culture Module”).
  • Patent Document 7 "Cell Culture Module”
  • stress is prevented from being applied to the cells grown in the polymer porous membrane, apoptosis and the like are suppressed, and a stable and large amount of cells can be cultured.
  • a casing for accommodating the polymer porous membrane is required, and the size and strength of the cell culture container itself containing the casing are limited.
  • polyimide porous membranes Prior to this application, polyimide porous membranes have been used for applications such as filters, low dielectric constant films, and electrolyte membranes for fuel cells, especially for battery-related applications.
  • Patent Documents 8 to 10 particularly have excellent permeability to substances such as gas, high porosity, excellent smoothness on both surfaces, relatively high strength, and despite the high porosity, the film thickness direction.
  • a polyimide porous membrane having a large number of macrovoids having excellent resistance to compressive stress is described. All of these are polyimide porous membranes prepared via amic acid.
  • the inventors reviewed the cell culture technology using a polyimide porous membrane and reduced the size of the conventional porous membrane sheet for cell culture to a small size of about 1 mm on a side, so that a stationary type that does not require any peculiar equipment is required.
  • By making the porous membrane into small pieces it is possible to install a large number of sheets in a very small space, and by supplying nutrients, it is possible to culture a large number of cells in a stable and labor-saving manner. I found.
  • cell recovery from the polyimide porous membrane has tended to be difficult to proceed efficiently, it has been clarified that cell recovery also proceeds efficiently to some extent by this method.
  • the small piece culture method showed high efficiency in terms of cell growth, exosome production amount, and the like. Due to its small piece properties, it has excellent system visibility and can form an excellent system for the production of various substances such as antibodies, viruses or exosomes. Sampling is also easy, and even if an extremely small amount of sample is taken out as a representative, fixation, staining, identification, evaluation, etc. can be clearly performed. In addition, it can be used in combination with a continuous culture method such as an overflow reactor, and a large amount of cells can be statically cultured for a long period of time. In particular, in the production of exosomes, it has been found that the cell culture method using the small piece polymer porous membrane of the present invention enables the production of exosomes having a stable production amount and quality over a long period of time.
  • the present invention by making the polymer porous membrane into small pieces, a large amount of cells are not required, no specific cell culture equipment is required, no stirrer is applied to the cell culture container, and no spinner flask is used. It is possible to provide an optimum space that can be cultured. Further, the small piece polymer porous film is dispersed in the culture medium and / or the small piece polymer porous film is accumulated in multiple layers and sinks in a dispersed and / or laminated state at the bottom of the cell culture vessel, and maintains that state. Therefore, the present invention is completed by finding that the amount (depth) of the cell culture medium can be easily adjusted, and the amount of dissolved oxygen (oxygen supply state) in the culture medium can be easily adjusted. It came to. That is, the present invention includes, but is not limited to, the following aspects.
  • a cell culture method that does not require stirring, which comprises applying cells to a small piece polymer porous membrane and culturing the cells.
  • the small piece polymer porous film is a small piece having a three-layer structure having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B.
  • the average pore diameter of the pores existing in the surface layer A is smaller than the average pore diameter of the pores existing in the surface layer B
  • the macrovoid layer is the surface layers A and B.
  • a cell culture method in which the small piece polymer porous membranes are dispersed and / or the small piece polymer porous membranes are multiplely accumulated in a culture solution and dispersed and / or laminated on the bottom of a cell culture vessel.
  • the cells adhered to the small piece polymer porous membrane are proliferated, the cells are detached by enzymatic treatment, and the small piece polymer porous membrane to which the cells are not adhered is added to the cell culture vessel to obtain the cells.
  • the surface layer A has an average pore size of 0.01 to 50 ⁇ m.
  • the small piece polyimide porous film is heat-treated at 250 ° C. or higher after forming a polyamic acid solution composition containing a polyamic acid solution obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine and a coloring precursor.
  • the small piece polymer porous film was dispersed and / or the small piece polymer porous film was accumulated in multiple layers in the culture medium, and the small piece polymer porous film was dispersed and / or laminated on the bottom of the cell culture vessel. Since the cell culture can be performed in the state, the cell culture can be left without the need for stirring by a stirrer or the like, and therefore, unlike the use of the conventional modularized polymer porous membrane provided with a casing, the cell culture is performed. Since the size, material, strength, etc. of the container are not limited and it is not necessary to install a stirrer or the like, it is possible to use a very wide range of cell culture containers.
  • the cell culture method of the present invention does not simply require stirring and does not reject the stirring conditions. Therefore, according to the present invention, it is possible to impose weak vibration or flow conditions on such a cell culture method. It is also possible to increase the cell mass (internal expansion) by adding the small piece polymer porous membrane after seeding the cells on the small piece polymer porous membrane and culturing the cells without collecting the cells. Furthermore, by using the small piece polymer porous membrane, stable and long-term substance production becomes possible. Compared with the conventional polyimide porous membrane, in the culture using the small piece polymer porous membrane, the cell proliferation is significantly increased, the cell recovery efficiency is remarkably improved, and the internal expansion is possible as described above. Therefore, it became easy to continue the cell culture for a longer period of time. Further, it has an advantage that the small piece member can be frozen and stored while the cells are supported in the small piece polymer porous membrane.
  • Calcification It is a figure which shows the change in the number of cells with time of the cultured human skin fibroblast using the small piece polyimide porous membrane. It is a figure which shows an exemplary overflow type bioreactor. It is a figure and an image which shows an exemplary overflow type bioreactor. It is a figure which shows an exemplary overflow type bioreactor. It is a figure which shows the change of the cell behavior (cell density and cell behavior) with time of the cultured chondrocyte using the small piece polyimide porous membrane.
  • a small polymer porous membrane can be produced by molding a polymer porous membrane described later into a desired size. Molding can be performed using various processing units. For example, but not limited to, a polymer porous membrane (for example, a polyimide porous membrane, a polyether sulfone (PES) porous membrane) is punched out with a pinnacle die using a simple pinnacle punching machine to punch a small piece of polymer porous having a desired shape. A film can be obtained.
  • a polymer porous membrane for example, a polyimide porous membrane, a polyether sulfone (PES) porous membrane
  • PES polyether sulfone
  • the average pore diameter of the pores present in the surface layer A (hereinafter, also referred to as “A surface” or “mesh surface”) in the polymer porous film used in the present invention is not particularly limited, but is, for example. , 0.01 ⁇ m or more and less than 200 ⁇ m, 0.01 to 150 ⁇ m, 0.01 to 100 ⁇ m, 0.01 to 50 ⁇ m, 0.01 ⁇ m to 40 ⁇ m, 0.01 ⁇ m to 30 ⁇ m, 0.01 ⁇ m to 25 ⁇ m, 0.01 ⁇ m to 20 ⁇ m, Alternatively, it is 0.01 ⁇ m to 15 ⁇ m, preferably 0.01 ⁇ m to 25 ⁇ m.
  • the average pore diameter of the pores existing in the surface layer B (hereinafter, also referred to as “B surface” or “large hole surface”) in the polymer porous membrane used in the present invention is the average pore diameter of the pores existing in the surface layer A. It is not particularly limited as long as it is larger than, but is, for example, more than 5 ⁇ m and 200 ⁇ m or less, 20 ⁇ m to 100 ⁇ m, 25 ⁇ m to 100 ⁇ m, 30 ⁇ m to 100 ⁇ m, 35 ⁇ m to 100 ⁇ m, 40 ⁇ m to 100 ⁇ m, 50 ⁇ m to 100 ⁇ m, or 60 ⁇ m to 100 ⁇ m, preferably. It is 30 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the average pore size of the polymer porous membrane surface is the area average pore size.
  • the area average pore diameter can be determined according to the following (1) and (2).
  • the average pore size of the portion other than the surface of the polymer porous membrane can also be obtained in the same manner.
  • All the hole diameters obtained by the above formula I are applied to the following formula II, and the area average hole diameter da when the shape of the holes is a perfect circle is obtained.
  • the thicknesses of the surface layers A and B are not particularly limited, but are, for example, 0.01 to 50 ⁇ m, preferably 0.01 to 20 ⁇ m.
  • the average pore size of the macrovoids in the macrovoid layer in the polymer porous membrane in the film plane direction is not particularly limited, but is, for example, 10 to 500 ⁇ m, preferably 10 to 100 ⁇ m, and more preferably 10 to 80 ⁇ m.
  • the thickness of the partition wall in the macrovoid layer is not particularly limited, but is, for example, 0.01 to 50 ⁇ m, preferably 0.01 to 20 ⁇ m.
  • at least one partition wall in the macrovoid layer communicates with adjacent macrovoids and has an average pore size of 0.01 to 100 ⁇ m, preferably 0.01 to 50 ⁇ m, one or more. Has a hole.
  • the bulkhead in the macrovoid layer is non-perforated.
  • the total film thickness of the polymer porous membrane surface used in the present invention is not particularly limited, but may be 5 ⁇ m or more, 10 ⁇ m or more, 20 ⁇ m or more, or 25 ⁇ m or more, and may be 500 ⁇ m or less, 300 ⁇ m or less, 100 ⁇ m or less, 75 ⁇ m or less. Alternatively, it may be 50 ⁇ m or less. It is preferably 5 to 500 ⁇ m, and more preferably 25 to 75 ⁇ m.
  • the film thickness of the polymer porous membrane used in the present invention can be measured with a contact-type thickness gauge.
  • the porosity of the polymer porous membrane used in the present invention is not particularly limited, but is, for example, 40% or more and less than 95%.
  • the porosity of the polymer porous film used in the present invention can be determined from the texture mass according to the following formula III by measuring the film thickness and mass of the porous film cut to a predetermined size.
  • S means the area of the porous film
  • d means the total film thickness
  • w means the measured mass
  • D means the density of the polymer.
  • the density is 1.34 g / cm 3 (.)
  • the polymer porous membrane used in the present invention is preferably a three-layer having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B. It is a polymer porous film having a structure, wherein the average pore diameter of the pores existing in the surface layer A is 0.01 ⁇ m to 25 ⁇ m, and the average pore diameter of the pores existing in the surface layer B is 30 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the macrovoid layer has a partition wall bonded to the surface layers A and B, the partition wall, and a plurality of macrovoids surrounded by the surface layers A and B, and the partition wall of the macrovoid layer and the surface thereof.
  • the thickness of the layers A and B is 0.01 to 20 ⁇ m, the pores in the surface layers A and B communicate with the macrovoid, the total film thickness is 5 to 500 ⁇ m, and the pore ratio is 40% or more. It is a polymer porous membrane that is less than 95%.
  • at least one partition wall in the macrovoid layer communicates between adjacent macrovoids with one or more pores having an average pore diameter of 0.01-100 ⁇ m, preferably 0.01-50 ⁇ m. Have.
  • the bulkhead does not have such a hole.
  • the polymer porous membrane used in the present invention is preferably sterilized.
  • the sterilization treatment is not particularly limited, and examples thereof include dry heat sterilization, steam sterilization, sterilization with a disinfectant such as ethanol, and arbitrary sterilization treatment such as electromagnetic wave sterilization such as ultraviolet rays and gamma rays.
  • the small piece polymer porous membrane used in the present invention is not particularly limited as long as it has the above-mentioned structural characteristics, but is preferably a small piece polyimide porous membrane or a small piece polyether sulfone (PES) porous membrane.
  • PES polyether sulfone
  • Polyimide Porous film Polyimide is a general term for polymers containing an imide bond in a repeating unit, and usually means an aromatic polyimide in which an aromatic compound is directly linked by an imide bond.
  • Aromatic polyimide has a rigid and strong molecular structure because the aromatic and the aromatic have a conjugated structure via an imide bond, and the imide bond has a strong intermolecular force, so that a very high level of heat is generated. It has physical, mechanical and chemical properties.
  • the polyimide porous membrane that can be used in the present invention is preferably a polyimide porous membrane containing (as a main component) a polyimide obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine, and more preferably tetracarboxylic dianhydride. It is a polyimide porous film made of polyimide obtained from a substance and a diamine. "Containing as a main component" means that, as a component of the polyimide porous membrane, a component other than the polyimide obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine is essentially not contained or may be contained. , Means that it is an additional component that does not affect the properties of the polyimide obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine.
  • the polyimide porous film that can be used in the present invention has a polyamic acid solution composition containing a polyamic acid solution obtained from a tetracarboxylic acid component and a diamine component and a coloring precursor, and then has a temperature of 250 ° C.
  • the colored polyimide porous film obtained by the above heat treatment is also included.
  • the polyamic acid is obtained by polymerizing a tetracarboxylic acid component and a diamine component.
  • the polyamic acid is a polyimide precursor that can be ring-closed to form a polyimide by thermal imidization or chemical imidization.
  • the polyamic acid even if a part of the amic acid is imidized, it can be used as long as it does not affect the present invention. That is, the polyamic acid may be partially thermally imidized or chemically imidized.
  • an imidization catalyst an organic phosphorus-containing compound, inorganic fine particles, fine particles such as organic fine particles, and the like can be added to the polyamic acid solution, if necessary.
  • fine particles such as a chemical imidizing agent, a dehydrating agent, inorganic fine particles, and organic fine particles can be added to the polyamic acid solution, if necessary. Even if the above-mentioned components are mixed with the polyamic acid solution, it is preferable to carry out the process under the condition that the coloring precursor does not precipitate.
  • the "colored precursor” means a precursor that is partially or wholly carbonized by heat treatment at 250 ° C. or higher to produce a colored product.
  • the coloring precursor that can be used in the production of the polyimide porous film is uniformly dissolved or dispersed in a polyamic acid solution or a polyimide solution, and is 250 ° C. or higher, preferably 260 ° C. or higher, more preferably 280 ° C. or higher, more preferably.
  • Those that produce colored products are preferable, those that produce black-based colored products are more preferable, and carbon-based colored precursors are more preferable.
  • the coloring precursor looks like a carbonized product when heated, but structurally, it contains a foreign element other than carbon, and has a layered structure, an aromatic crosslinked structure, and a disordered structure containing tetrahedral carbon. Including.
  • the carbon-based coloring precursor is not particularly limited, and for example, a polymer obtained from a tar or pitch such as petroleum tar, petroleum pitch, coal tar, coal pitch, coke, and a monomer containing acrylonitrile, and a ferrocene compound (ferrocene and ferrocene derivative). And so on.
  • a polymer and / or a ferrocene compound obtained from a monomer containing acrylonitrile is preferable, and polyacrylonitrile is preferable as a polymer obtained from a monomer containing acrylonitrile.
  • the polyimide porous film that can be used in the present invention is obtained after molding a polyamic acid solution obtained from a tetracarboxylic acid component and a diamine component without using the above-mentioned coloring precursor.
  • a polyimide porous membrane obtained by heat treatment is also included.
  • the polyimide porous film produced without using a coloring precursor is composed of, for example, 3 to 60% by mass of a polyamic acid having an ultimate viscosity of 1.0 to 3.0 and 40 to 97% by mass of an organic polar solvent.
  • a polyamic acid solution is cast into a film and immersed or brought into contact with a coagulation solvent containing water as an essential component to prepare a porous film of the polyamic acid, and then the porous film of the polyamic acid is heat-treated to imide. It may be manufactured by converting.
  • the coagulation solvent containing water as an essential component is water, or a mixed solution of water of 5% by mass or more and less than 100% by mass and an organic polar solvent of more than 0% by mass and 95% by mass or less. May be. Further, after the imidization, at least one surface of the obtained porous polyimide film may be subjected to plasma treatment.
  • tetracarboxylic dianhydride can be used as the tetracarboxylic dianhydride that can be used in the production of the above-mentioned polyimide porous membrane, and can be appropriately selected according to desired properties and the like.
  • Specific examples of the tetracarboxylic dianhydride include pyromellitic dianhydride, 3,3', 4,4'-biphenyltetracarboxylic dianhydride (s-BPDA), 2,3,3', 4'.
  • -Biphenyltetracarboxylic dianhydride such as biphenyltetracarboxylic dianhydride (a-BPDA), oxydiphthalic acid dianhydride, diphenylsulfone-3,4,3', 4'-tetracarboxylic dianhydride, bis (3,4-dicarboxyphenyl) sulfide dianhydride, 2,2-bis (3,4-dicarboxyphenyl) -1,1,1,3,3,3-hexafluoropropanedianhydride, 2, 3,3', 4'-benzophenonetetracarboxylic dianhydride, 3,3', 4,4'-benzophenonetetracarboxylic dianhydride, bis (3,4-dicarboxyphenyl) methanedianhydride, 2 , 2-bis (3,4-dicarboxyphenyl) propanedianhydride, p-phenylenebis (trimellitic acid monoesteric acid anhydride),
  • At least one aromatic tetracarboxylic dianhydride selected from the group consisting of biphenyltetracarboxylic dianhydride and pyromellitic dianhydride is particularly preferable.
  • the biphenyltetracarboxylic dianhydride 3,3', 4,4'-biphenyltetracarboxylic dianhydride can be preferably used.
  • any diamine can be used as the diamine that can be used in the production of the polyimide porous membrane.
  • the diamine include the following. 1) Benzenediamine with one benzene nucleus such as 1,4-diaminobenzene (para-phenylenediamine), 1,3-diaminobenzene, 2,4-diaminotoluene, 2,6-diaminotoluene; 2) Diaminodiphenyl ethers such as 4,4'-diaminodiphenyl ether, 3,4'-diaminodiphenyl ether, 4,4'-diaminodiphenylmethane, 3,3'-dimethyl-4,4'-diaminobiphenyl, 2,2'- Dimethyl-4,4'-diaminobiphenyl, 2,2'-bis (trifluoromethyl) -4,4'-diaminobiphenyl, 3,3'-dimethyl-4,4'-d
  • the diamine to be used can be appropriately selected according to desired characteristics and the like.
  • aromatic diamine compounds are preferable, and 3,3'-diaminodiphenyl ether, 3,4'-diaminodiphenyl ether, 4,4'-diaminodiphenyl ether and paraphenylenediamine, 1,3-bis (3-aminophenyl) Benzene, 1,3-bis (4-aminophenyl) benzene, 1,4-bis (3-aminophenyl) benzene, 1,4-bis (4-aminophenyl) benzene, 1,3-bis (4-amino) Phenoxy) benzene and 1,4-bis (3-aminophenoxy) benzene can be preferably used.
  • at least one diamine selected from the group consisting of benzenediamine, diaminodiphenyl ether and bis (aminophenoxy) phenyl is preferable.
  • the polyimide porous membrane that can be used in the present invention has a glass transition temperature of 240 ° C. or higher or a tetracarboxylic dianoxide at 300 ° C. or higher without a clear transition point from the viewpoint of heat resistance and dimensional stability at high temperature. It is preferably formed from a polyimide obtained by combining an acid dianhydride and a diamine.
  • the polyimide porous film that can be used in the present invention is preferably a polyimide porous film made of the following aromatic polyimides from the viewpoint of heat resistance and dimensional stability at high temperatures.
  • An aromatic polyimide composed of at least one tetracarboxylic acid unit selected from the group consisting of a biphenyl tetracarboxylic acid unit and a pyromellitic acid unit, and an aromatic diamine unit.
  • Aromatic polyimide consisting of a tetracarboxylic acid unit and at least one aromatic diamine unit selected from the group consisting of a benzenediamine unit, a diaminodiphenyl ether unit and a bis (aminophenoxy) phenyl unit.
  • At least one tetracarboxylic acid unit selected from the group consisting of biphenyltetracarboxylic acid units and pyromellitic acid units, and at least one selected from the group consisting of benzenediamine units, diaminodiphenyl ether units and bis (aminophenoxy) phenyl units.
  • Aromatic polyimide consisting of a kind of aromatic diamine unit.
  • the polyimide porous film used in the present invention preferably has a three-layer structure having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B.
  • the macrovoid layer has a partition wall bonded to the surface layers A and B, the partition wall, and a plurality of macrovoids surrounded by the surface layers A and B, and the partition wall of the macrovoid layer and the surface thereof.
  • the thickness of the layers A and B is 0.01 to 20 ⁇ m, the pores in the surface layers A and B communicate with the macrovoid, the total film thickness is 5 to 500 ⁇ m, and the pore ratio is 40% or more.
  • at least one partition wall in the macrovoid layer has one or more pores having an average pore diameter of 0.01 to 100 ⁇ m, preferably 0.01 to 50 ⁇ m, communicating the adjacent macrovoids with each other.
  • polyimide porous membrane described in International Publication No. 2010/038873, JP-A-2011-219585, or JP-A-2011-219586 can also be used in the present invention.
  • the PES porous membrane that can be used in the present invention comprises a polyether sulfone and typically comprises substantially a polyether sulfone.
  • the polyether sulfone may be synthesized by a method known to those skilled in the art, and for example, a method of polycondensing a dihydric phenol, an alkali metal compound and a dihalogenodiphenyl compound in an organic polar solvent, a divalent phenol. It can be produced by a method in which an alkali metal dihydrate is synthesized in advance and polycondensed with a dihalogenodiphenyl compound in an organic polar solvent.
  • alkali metal compound examples include alkali metal carbonate, alkali metal hydroxide, alkali metal hydride, alkali metal alkoxide and the like.
  • sodium carbonate and potassium carbonate are preferable.
  • Divalent phenol compounds include hydroquinone, catechol, resorcin, 4,4'-biphenol, bis (hydroxyphenyl) alkanes (eg 2,2-bis (hydroxyphenyl) propane, and 2,2-bis (hydroxyphenyl)).
  • Methane), dihydroxydiphenylsulfones, dihydroxydiphenylethers, or at least one of the hydrogens on their benzene rings is a lower alkyl group such as a methyl group, an ethyl group or a propyl group, or a lower alkoxy group such as a methoxy group or an ethoxy group. Examples include those that have been replaced.
  • the divalent phenol compound two or more of the above compounds can be mixed and used.
  • the polyether sulfone may be a commercially available product.
  • Examples of commercially available products include Sumika Excel 7600P, Sumika Excel 5900P (all manufactured by Sumitomo Chemical Co., Ltd.) and the like.
  • the logarithmic viscosity of the polyether sulfone is preferably 0.5 or more, more preferably 0.55 or more, from the viewpoint of satisfactorily forming macrovoids of the porous polyether sulfone membrane, and the production of the porous polyether sulfone membrane From the viewpoint of ease, it is preferably 1.0 or less, more preferably 0.9 or less, still more preferably 0.8 or less, and particularly preferably 0.75 or less.
  • the PES porous film or the polyether sulfone as a raw material thereof has a glass transition temperature of 200 ° C. or higher or a clear glass transition temperature from the viewpoint of heat resistance and dimensional stability under high temperature. It is preferably not observed.
  • the method for producing the PES porous membrane that can be used in the present invention is not particularly limited, but for example, A polyether sulfone solution containing 0.3% by mass to 60% by mass of a polyether sulfone having a logarithmic viscosity of 0.5 to 1.0 and 40% by mass to 99.7% by mass of an organic polar solvent was cast into a film.
  • the heat treatment includes a step of coarsening the pores to obtain a PES porous film, and the heat treatment heats the solidified film having the pores up to the glass transition temperature or higher of the polyether solvent or 240 ° C. or higher. It may be manufactured by a method including raising the temperature.
  • the PES porous film that can be used in the present invention is preferably a PES porous film having a surface layer A, a surface layer B, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B.
  • the macrovoid layer includes a partition wall bonded to the surface layers A and B, and a plurality of macrovoids surrounded by the partition wall and the surface layers A and B and having an average pore diameter of 10 ⁇ m to 500 ⁇ m in the film plane direction.
  • Have and The partition wall of the macrovoid layer has a thickness of 0.1 ⁇ m to 50 ⁇ m.
  • the surface layers A and B have a thickness of 0.1 ⁇ m to 50 ⁇ m, respectively.
  • the surface layers A and B one has a plurality of pores having an average pore diameter of more than 5 ⁇ m and 200 ⁇ m or less, and the other has a plurality of pores having an average pore diameter of 0.01 ⁇ m or more and less than 200 ⁇ m.
  • One of the surface layer A and the surface layer B has a surface aperture ratio of 15% or more, and the other surface layer has a surface aperture ratio of 10% or more.
  • the pores of the surface layer A and the surface layer B communicate with the macrovoid.
  • the PES porous membrane has a total film thickness of 5 ⁇ m to 500 ⁇ m and a porosity of 50% to 95%. It is a PES porous membrane.
  • the above-mentioned polymer porous membrane as a cell culture carrier used in the cell culture apparatus of the present invention has a slightly hydrophilic porous property, stable liquid retention is achieved in the polymer porous membrane and it can be dried. A strong moist environment is maintained. Therefore, cell survival and proliferation can be achieved even with an extremely small amount of medium as compared with a cell culture apparatus using a conventional cell culture carrier.
  • cells seeded on the porous polymer membrane can be cultured without being killed by shearing force or foam, so oxygen and nutrients can be efficiently supplied to the cells. A large number of cells can be cultured.
  • the small polymer porous membrane used in the embodiment of the present invention is optional without accommodating the polymer porous membrane in a casing (mantle) as a prior art. It can be used by adding it to the cell culture solution of.
  • the small piece polymer porous membrane used in the cell culture method of the present invention has a surface layer A or surface layer B having an area of 4 mm 2 or less, preferably 3 mm 2 or less, more preferably 2 mm 2 or less. Most preferably, it is 1 mm 2 .
  • the lower limit of the area of the surface layer A or the surface layer B is, for example, may also be 0.01 mm 2 or more, it may also be 0.04 mm 2 or more, may also be 0.09 mm 2 or more, 0. It may be 16 mm 2 or more.
  • the shape of the small piece polymer porous film includes, for example, a polygon (for example, a triangle, a quadrangle (for example, a rectangle), a pentagon, a hexagon ... n-sided (n is an arbitrary integer)), a substantially circular shape, and a substantially elliptical shape.
  • the shape may include a curved line and a straight line.
  • the polymer porous membrane 200a applied in the cell culture apparatus 1a has, for example, a ratio of the longest diameter / the shortest diameter of the surface layer A or the surface layer B of 0.5 to 1, preferably 0.75. It is preferably ⁇ 1, more preferably 0.9 to 1.
  • the term "diameter” refers to the length between any two points on the outer circumference of the surface layer A or the surface layer B.
  • the "longest diameter” means the longest length between any two points on the outer circumference of the surface layer A or the surface layer B.
  • the "shortest diameter” means the shortest length between any two points on the outer circumference of the surface layer A or the surface layer B.
  • the longest diameter is 2 ⁇ 2 ⁇ (1/2) mm or less
  • the shortest diameter is 2 ⁇ . 2 ⁇ (1/2) mm or less
  • the longest diameter is 1.5 ⁇ 2 ⁇ (1/2) mm or less
  • the shortest diameter is 1.5 ⁇ 2 ⁇ (1/2) mm or less, more preferably.
  • the longest diameter is 1 ⁇ 2 ⁇ (1/2) mm or less
  • the shortest diameter is 1 ⁇ 2 ⁇ (1/2) mm or less.
  • the longest diameter is 2 mm or less and the shortest diameter is 2 mm or less, preferably the longest diameter is 1. It is 5 mm or less and the shortest diameter is 1.5 mm or less, more preferably the longest diameter is 1.2 mm or less and the shortest diameter is 1.2 mm or less.
  • it becomes possible to efficiently supply oxygen and nutrients to the cells supported on the small piece polymer porous membrane the cell proliferation becomes good, and the activity of producing exosome substances such as arbitrary proteins becomes remarkably high. Brings the effect.
  • the small piece polymer porous membrane is accumulated, and the cells supported on any small piece polymer porous membrane are transferred to another small piece polymer porous membrane. It is possible to provide a culture environment in which the cells grow while moving or adhering to each other. Therefore, when the small piece polymer porous membrane is applied to the cell culture vessel, it is preferable that the cell culture vessel is allowed to stand and cultured without shaking. Since the small piece polymer porous membrane settles in the medium when left to stand, in the case of culturing cells suitable for hypoxic conditions, simply increase the amount of medium and increase the depth without using a special device. Therefore, it is possible to carry out a hypoxic culture system.
  • the number of small piece polymer porous membranes added to the cell culture vessel is not limited, but it is preferable that the small piece polymer porous membranes are multiplely accumulated in the culture solution after the addition. It is preferable that one small piece polymer porous membrane partially or wholly overlaps another small piece polymer porous membrane, and specifically, the overlapping portion is 1% per small piece polymer porous membrane. 2, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80 It may be in the region of%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100%.
  • a well-formed multiple structure of a conventional polymer porous membrane obtained by stacking a plurality of small piece polymer porous membranes so that their sides are aligned in the vertical direction is obtained.
  • the small piece polymer porous membrane may form an amorphous or non-uniform laminated state.
  • the latter laminated state for example, to briefly explain with two small piece polymer porous membranes, one side of one membrane is in contact with one side or surface of the other membrane, resulting in a V-shaped structure and a T-shape.
  • the seeded cells are not limited to the plane of the membrane in the process of their migration and proliferation, but are microspace portions formed when the membranes overlap each other, for example, a V-shaped structure. If so, the cells gather at the bottom of the V or at the step (thickness or height of the membrane) formed by overlapping the surfaces, and while holding a foothold on the small piece polyimide porous membrane, the cells further gather and spheroids.
  • Adipocytes survive by accumulating membranes on the top of the inverted V-shaped structure (opposite the bottom of the V-shaped structure), while osteoblasts have membranes stacked more than the flat portion of the membrane. There is a tendency to form cell aggregates three-dimensionally in the formed stepped portion.
  • the small piece polymer porous membrane when used for cell culture, as described above, it may be in a dispersed state or a state in which it is integrated with each other, and is an assembly when the small piece polymer porous membrane is used. Body formation does not matter at all.
  • the small piece polymer porous membrane dispersed and multiplely accumulated at the bottom of the cell culture vessel, that is, the sedimentation has stopped has the apex, side or surface of one small piece because the small piece itself is lightweight.
  • the small piece polymer porous film fluctuates, it is sterically dispersed and accumulated in multiple layers, and further, since the polymer porous film has liquid permeability, the small piece polymer porous film is provided. Since the cells supported on the membrane are not depleted of nutrients and oxygen from the medium (having excellent circulation), the cells can be allowed to stand and cultured without shaking.
  • the thickness of the small piece polymer porous membrane is not different from the thickness of the above polymer porous membrane.
  • the small piece polymer porous membrane has higher rigidity and its self-deformation efficiency decreases. This applies not only to strip-shaped membranes, but also to various forms of small polymer porous membranes. For example, as demonstrated in Comparative Example 1 described later, when "1 cm square polyimide porous membrane” and “1 mm square small piece polyimide porous membrane” were used for culturing human mesenchymal stem cells, the small piece polymer porous film was used.
  • the cell culture method using the small piece polymer porous membrane of the present invention is from the viewpoint of cell proliferation, substance production, and long-term culture. It can be said that this is a method of providing an environment in which cells are more likely to live than the conventional cell culture method using a polymer porous membrane.
  • the cell culture method of the present invention is a method in which suspended cells are poured into a small piece polymer porous membrane and allowed to stand for cell culture. There is no need to apply a stirrer or use a spinner flask.
  • the small piece polymer porous membrane has the property of being dispersed and / or accumulating in multiple layers with each other and sinking to the bottom of the cell culture vessel in that state, and such a state can be achieved in the medium.
  • the cell culture vessel and the cell culture device are not particularly limited. Therefore, it is usually not limited to dishes, petri dishes, plates, wells, bottles, bags, etc. used for cell culture, and is not limited to materials such as plastic, glass, etc., and any container can be used. Can be done.
  • the cell culture container may be in the form of a culture tank equipped in the device.
  • the small piece polymer porous membrane has the property of being dispersed and / or accumulating in multiple layers with each other and sinking to the bottom of the cell culture vessel, and does not require stirring or the like, so that it is intermittent or continuous.
  • Long-term cell culture is possible by using a cell culture device having a means for exchanging the medium. Examples of such a cell culture device include, but are not limited to, an overflow type bioreactor, an intermittent type bioreactor (WO2018 / 021359), and the like.
  • the overflow type bioreactor is the cell culture device 1a in FIG. 6, and the following: With a small polymer porous membrane 200a to which cells are applied; With the culture tank 10 containing the small piece polymer porous membrane 200a; With the medium supply port 113 provided in the culture tank 10 and supplying the medium; With a medium discharge port 101 provided on the side of the culture tank 10 and discharging the medium; With the medium supply tank 40 provided outside the culture tank 10 in communication with the medium supply port 113; A medium recovery tank 60 that communicates with the medium discharge port 101 and collects the medium discharged from the medium discharge port 101 is provided.
  • the medium discharge port 101 is characterized in that the medium is overflowed and discharged.
  • a cell culture device By using such a cell culture device, it is possible to continuously supply fresh medium, but after cell culture, depending on the amount of the supplied medium, from the medium outlet provided in the culture tank.
  • the medium can be continuously recovered, and long-term cell culture can be realized.
  • the concentration of proteins required for cell proliferation and the like produced by cells is prevented from suddenly changing, and nutrients (for example, glucose, etc.) in the medium consumed by the culture are continuously produced. It is possible to maintain a favorable cell culture environment.
  • the above-exemplified overflow-type bioreactor (FIG. 6) is characterized in that the medium is overflowed and discharged from the medium discharge port 101, and the medium discharged from the discharge port connector 104 is transferred to the medium recovery tank 60.
  • the pump 32 in the medium discharge pipe 50 connected for recovery it is also possible to forcibly recover the medium after cell culture (see FIG. 8).
  • the medium discharge tube 51 (for example, the inner diameter) is placed on the upper surface of the cell culture solution without providing the medium discharge port 101 on the side portion 102 constituting the culture tank main body 100 as shown in FIGS. 6 and 8.
  • An overflow bioreactor (FIG. 7) is provided that is provided with a guide 52 that penetrates (a tube having a 1 mm outer diameter of 2 mm) and can hold it. In this bioreactor, the height of the medium can be adjusted by draining the medium after cell culture from above.
  • the cell culture method of the present invention is a method of applying cells to a small piece polymer porous membrane and culturing the cells, and is characterized by not requiring shaking by stirring or the like. .. Furthermore, it is possible to supply a fresh medium and easily collect the medium after culturing without collecting the cells themselves or the small polymer porous membrane on which the cells are supported, and it is possible to easily collect the medium after culturing for a long period of time in a static state. , Can be cultured.
  • the term "medium” refers to a cell culture medium for culturing cells, particularly animal cells. Medium is used as a synonym for cell culture medium. Therefore, the medium used in the present invention refers to a liquid medium.
  • the type of medium can be a commonly used medium and is appropriately determined depending on the type of cells to be cultured.
  • the specific steps of application of cells to a small polymer porous membrane are not particularly limited. It is possible to employ the steps described herein, or any method suitable for applying the cells to the small polymer porous membrane.
  • application of cells to a small polymer porous membrane includes, for example, aspects such as: (A) A mode in which a cell suspension is injected onto a small polymer porous membrane added to a cell culture vessel; (B) An embodiment in which a small piece polymer porous membrane is added to a cell suspension injected into a cell culture vessel.
  • the cells seeded on the surface of the polymer porous membrane adhere to the small piece polymer porous membrane and enter the inside of the porous membrane.
  • the cells adhere to the small polymer porous membrane without any external physical or chemical force.
  • the cells seeded on the surface of the small polymer porous membrane can grow and proliferate stably on the surface and / or inside of the membrane. Cells can take various different morphologies depending on the position of the growing and proliferating membrane.
  • the small piece polymer porous membrane to be used may be pre-wet with a cell culture solution or a sterilized liquid.
  • living cells selectively stay in the small polymer porous membrane.
  • live cells remain in the small polymer porous membrane and dead cells remain in the cell suspension and die by flowing the medium or by replacing the medium. Cells can be removed.
  • the above sterilized liquid is not particularly limited, but is a sterilized buffer solution or sterilized water.
  • the buffer solution is, for example, (+) and (-) Dulbecco's PBS, (+) and (-) Hank's Balanced Salt Solution and the like. Examples of buffer solutions are shown in Table 1 below.
  • the application of cells to a small polymer porous membrane is an embodiment in which floating adhesive cells are suspendedly coexist with the small polymer porous membrane to attach the cells to the membrane (entanglement). )including.
  • the cell culture medium is liquid
  • the polymer porous membrane can be suspended in the cell culture medium, but the small pieces of polymer porous membrane to which the cells are attached rapidly descend in the medium and accumulate multiple times with each other. Then, it can sink to the bottom of the cell culture vessel and maintain its state.
  • the height (medium level) of the medium in the cell culture container for example, the culture tank of the cell culture device
  • the medium level is increased.
  • the cell culture method of the present invention does not require the medium to be actively shaken with a stirrer or the like, and the small polymer porous membranes can sink to the bottom of the cell culture vessel in a dispersed and / or multiple-accumulated state.
  • fresh medium can be continuously supplied, and depending on the amount of the supplied medium, a medium discharge port provided in the culture tank can be used.
  • the medium after cell culture can be continuously collected, and long-term cell culture can be realized. This also applies when an intermittent bioreactor is used, and fresh medium can be supplied at predetermined time intervals, and the medium after cell culture can be collected regularly, enabling long-term cell culture. Is.
  • the flowability of the medium is improved and a large amount of cells can be cultured.
  • desired substances proteins, exosomes, etc.
  • Example 1 described later human mesenchymal stem cells seeded on the small piece polymer porous membrane proliferated smoothly, and as shown in Example 2, when the cells were cultured for a long period of time, the cells were used. It was found that exosomes are stably produced over a long period of time.
  • kits for use in cell culture methods including small piece polymer porous membranes.
  • the kit of the present invention may appropriately contain components necessary for cell culture in addition to the small piece polymer porous membrane.
  • cells applied to a small piece polymer porous membrane, a cell culture medium, a cell culture device, an instruction manual for a kit, and the like are included.
  • a package containing a sterilized piece polymer porous membrane stored in a clear pouch that can be used as is for cell culture, or a piece in the same pouch. Includes a membrane-liquid integrated kit in which a sterile liquid is enclosed with a porous polymer membrane to enable efficient suction and seeding.
  • the term "suspended cells” refers to cells obtained by forcibly suspending adherent cells by a proteolytic enzyme such as trypsin and suspending them in a medium, or known acclimatization. It contains adherent cells and the like that can be suspended and cultured in the medium by the process.
  • the type of cell that can be used in the present invention is selected from the group consisting of, for example, animal cells, insect cells, plant cells, yeasts and bacteria.
  • Animal cells are roughly classified into cells derived from animals belonging to the phylum Vertebrate and cells derived from invertebrates (animals other than animals belonging to the phylum Vertebrate).
  • the origin of animal cells in the present specification is not particularly limited. Preferably, it means a cell derived from an animal belonging to the phylum Vertebrate.
  • the vertebrate phylum includes jawless and gnathostomata, and gnathostomata includes mammals, birds, amphibians, reptiles and the like.
  • Mammal is a cell derived from an animal belonging to the class Mammalia, generally referred to as a mammal.
  • Mammals are not particularly limited, but preferably include mice, rats, humans, monkeys, pigs, dogs, sheep, goats and the like.
  • the types of animal cells that can be used in the present invention are not limited, but are preferably selected from the group consisting of pluripotent stem cells, tissue stem cells, somatic cells, and germ cells.
  • pluripotent stem cell is intended to be a general term for stem cells having the ability to differentiate into cells of any tissue (pluripotency).
  • Pluripotent stem cells include, but are not limited to, embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic germ stem cells (EG cells), germ stem cells (GS cells), and the like. ..
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • EG cells embryonic germ stem cells
  • GS cells germ stem cells
  • any known pluripotent stem cell can be used, and for example, the pluripotent stem cell described in International Publication No. 2009/1233349 (PCT / JP2009 / 057441) can be used.
  • tissue stem cell means a stem cell having the ability to differentiate into various cell types (pluripotency), although the cell lineage capable of differentiating is limited to a specific tissue.
  • hematopoietic stem cells in bone marrow are the source of blood cells, and neural stem cells differentiate into nerve cells.
  • hepatic stem cells that make the liver and skin stem cells that become the skin tissue.
  • the tissue stem cells are selected from mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells, neural stem cells, skin stem cells, or hematopoietic stem cells.
  • somatic cells refers to cells other than germ cells among the cells that make up multicellular organisms. In sexual reproduction, it is not passed on to the next generation.
  • the somatic cells are hepatocytes, pancreatic cells, muscle cells, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, cartilage cells, fat cells, skin cells, fibroblasts, pancreatic cells, renal cells, lung cells, or , Lymphocytes, erythrocytes, leukocytes, monospheres, macrophages or macronuclear cells.
  • “Germ cell” means a cell that plays a role in transmitting genetic information to the next generation in reproduction. For example, it includes gametes for sexual reproduction, that is, eggs, egg cells, sperms, sperms, spores for asexual reproduction, and the like.
  • the cells may be selected from the group consisting of sarcoma cells, established cells and transformed cells.
  • Sparcoma is a cancer that develops in connective tissue cells derived from non-epithelial cells such as bone, cartilage, fat, muscle, and blood, and includes soft tissue sarcoma, malignant bone tumor, and the like.
  • Sarcoma cells are cells derived from sarcoma.
  • the “strained cell” means a cultured cell that has been maintained in vitro for a long period of time, has a certain stable property, and is capable of semi-permanent subculture.
  • PC12 cells derived from rat adrenal medulla
  • CHO cells derived from Chinese hamster ovary
  • HEK293 cells derived from human fetal kidney
  • HL-60 cells derived from human leukocyte cells
  • HeLa cells derived from human cervical cancer
  • Vero cells Derived from African green monkey kidney epithelial cells
  • MDCK cells derived from canine renal tubule epithelial cells
  • HepG2 cells cell line derived from human hepatoma
  • BHK cells neonatal hamster kidney cells
  • NIH3T3 cells derived from mouse fetal fibroblasts
  • Transformed cell means a cell in which nucleic acid (DNA or the like) is introduced from the outside of the cell to change its genetic properties.
  • the "adherent cell” is generally a cell that needs to adhere itself to an appropriate surface for proliferation, and is also called an adherent cell or a scaffold-dependent cell.
  • the cells used are adherent cells.
  • the cells used in the present invention are adherent cells, more preferably cells that can be cultured even when suspended in a medium.
  • Suspension-culturable adherent cells can be obtained by acclimatizing the adherent cells to a state suitable for suspension culture by a known method, for example, CHO cells, HEK293 cells, Vero cells, NIH3T3 cells. And so on, cell lines derived from these cells can be mentioned.
  • the cell culture method of the present invention by applying cells to the small piece polymer porous membrane and culturing the cells, a large amount of cells grow on the internal multifaceted connected porous portion and the surface of the small piece polymer porous membrane. , It becomes possible to easily culture a large amount of cells.
  • the cells seeded on the small piece polymer porous membrane used in the present invention provide an environment in which they can grow even under stirring conditions that conventionally kill them, and a large amount of cells can be cultured.
  • the volume occupied by the cell-free small piece polymer porous membrane in the space including the volume of the internal gap thereof is referred to as "apparently small piece polymer porous membrane volume".
  • the cells are applied to the small piece polymer porous membrane, and the medium infiltrated into the small piece polymer porous membrane, the cells, and the small piece polymer porous membrane in a state where the cells are supported on the surface and inside of the small piece polymer porous membrane.
  • the volume occupied in space as a whole is referred to as "small piece polymer porous membrane volume including cell survival area”.
  • the volume of the small piece polymer porous membrane including the cell survival area is apparently larger than that of the polymer small piece polymer porous membrane by about 50% at the maximum.
  • a plurality of cells (at least two cells, for example, 3 , 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 500, 1 ⁇ 10 3 , 2 ⁇ 10 3 ) are contained in one cell culture vessel.
  • the small polymer porous membranes include cell viability for each of the multiple small polymer porous membranes carrying cells.
  • the total volume of the membrane may be simply referred to as "the total volume of the small polymer porous membrane including the cell culture area”.
  • the cells can be extended for a long period of time. It becomes possible to cultivate well over. Further, even if the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture vessel is 1000 times or less than the total volume of the small piece polymer porous membrane including the cell survival area, the cells can be cultivated well for a long period of time. it can. Furthermore, even if the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture vessel is 100 times or less than the total volume of the small piece polymer porous membrane including the cell survival area, the cells can be cultivated well for a long period of time.
  • the cells can be cultivated well for a long period of time. it can.
  • the space (container) for cell culture can be made as small as possible as compared with the conventional cell culture device for two-dimensional culture. Further, when it is desired to increase the number of cells to be cultured, it is possible to flexibly increase the volume of cell culture by a simple operation such as increasing the number of small polymer porous membranes to be laminated.
  • the space (container) for culturing cells and the space (container) for storing the cell culture medium can be separated and cultured. It is possible to prepare a required amount of cell culture medium according to the number of cells.
  • the space (container) for storing the cell culture medium may be enlarged or miniaturized according to the purpose, or may be a replaceable container, and is not particularly limited.
  • mass culture of cells means, for example, the number of cells contained in a cell culture vessel after culturing using a small piece polymer porous membrane, and cell culture in which all cells are contained in the cell culture vessel. Assuming that they are uniformly dispersed in the medium, 1.0 ⁇ 10 5 or more, 1.0 ⁇ 10 6 or more, 2.0 ⁇ 10 6 or more, 5.0 ⁇ 10 6 or more per 1 ml of medium , 1.0 ⁇ 10 7 or more, 2.0 ⁇ 10 7 or more, 5.0 ⁇ 10 7 or more, 1.0 ⁇ 10 8 or more, 2.0 ⁇ 10 8 or more, 5.0 ⁇ It means culturing until the number is 10 8 or more, 1.0 ⁇ 10 9 or more, 2.0 ⁇ 10 9 or more, or 5.0 ⁇ 10 9 or more.
  • Various known methods can be used as a method for measuring the number of cells during or after culturing. For example, as a method of measuring the number of cells contained in a cell culture vessel after culturing using a small piece polymer porous membrane, assuming that all the cells are uniformly dispersed in the cell culture medium contained in the cell culture vessel. Can appropriately use a known method.
  • a cell number counting method using CCK8 can be preferably used. Specifically, using Cell Counting Kit8; a solution reagent manufactured by Dojin Chemical Laboratory (hereinafter referred to as "CCK8”), the number of cells in a normal culture without a small piece polymer porous membrane was measured, and the absorbance was measured.
  • the correlation coefficient between and the actual number of cells Then, the cells were applied, the cultured small piece polymer porous membrane was transferred to a medium containing CCK8, stored in an incubator for 1 to 3 hours, the supernatant was extracted, and the absorbance was measured at a wavelength of 460 nm. The number of cells is calculated from the correlation coefficient obtained in.
  • mass culture of cells means, for example, that the number of cells contained per square millimeter of a small piece polymer porous membrane after culturing using a small piece polymer porous membrane is 1.0 ⁇ 10 3. 2. or more, 2.0 x 10 3 or more, 1.0 x 10 4 or more, 2.0 x 10 4 or more, 5.0 x 10 4 or more, 1.0 x 10 5 or more, 2. Incubate until 0 ⁇ 10 5 or more, 5.0 ⁇ 10 5 or more, 1.0 ⁇ 10 6 or more, 2.0 ⁇ 10 6 or more, or 5.0 ⁇ 10 6 or more.
  • the number of cells contained in one square centimeter of the small polymer porous membrane can be appropriately measured by using a known method such as CCK8 described above.
  • the polyimide porous film used to prepare the small piece polymer porous film was composed of 3,3', 4,4'-biphenyltetracarboxylic dianhydride (s-BPDA), which is a tetracarboxylic acid component.
  • s-BPDA 4,4'-biphenyltetracarboxylic dianhydride
  • the obtained polyimide porous film has a three-layer structure of a polyimide porous film having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B. It is a film, and the average pore diameter of the pores existing in the surface layer A is 19 ⁇ m, the average pore diameter of the pores existing in the surface layer B is 42 ⁇ m, the film thickness is 25 ⁇ m, and the porosity is 74%. ..
  • Example 1 Culture method and exosome production of human mesenchymal stem cells using a small piece polymer porous film (1) Preparation of a small piece polyimide porous film Made by Tsukaya Knife Mfg. Co., Ltd. Flexible pinnacle die AP type for flat punching; 1 mm ⁇ 1 mm (1 mm ⁇ 1 mm) Prepare the blade specifications (see below), fix it on the magnet plate with magnetic force, and cut the polyimide porous film (25 ⁇ m thickness) manufactured by Ube Kosan using a simple punching machine (RDC FB type). A 1 mm ⁇ 1 mm small piece of polyimide porous film was prepared. Blade specifications Blade height 0.8mm Blade depth 0.4mm Etching depth 0.6mm Base thickness 0.2mm Blade angle 40 °
  • Ronza's human mesenchymal stem cells were passaged twice with an IWAKI collagen type 1 coat dish and treated with trypsin. the cells were suspended (4.0 ⁇ 10 6 cells) at; a to the medium (ADSC-4 4ml Kohjin Bio Co. Zenofuri medium).
  • the cell culture was poured into a polyimide porous membrane piece (200 cm 2 ) that had been sterilized in advance in a 150 ml sterilized bottle manufactured by Corning and previously sterilized with 50 ml of the same medium and suspended by shaking in an incubator for 30 minutes. After the addition, the cells were shaken several times and then allowed to stand in a CO 2 incubator to start culturing.
  • the small piece polyimide was used by the color reaction by Cell Counting Kit-8 manufactured by Dojin Chemical Laboratory.
  • the total number of cells grown was 4.6 ⁇ 10 6 cells.
  • 25 ml of Thermo Fisher Scientific's TrypLE TM was added to the sheet on which the cells grow, left in the incubator for 50 minutes, the suspension was collected, and the small pieces were washed with 10 ml of TrypLE TM. And cell recovery was performed. Number of recovered cells was 2.3 ⁇ 10 6 cells (cell recovery rate of 50%). The recovered cells could be cultured in a collagen-coated dish.
  • Example 2 Long-term culture using a small piece polyimide porous membrane A long-term culture of human mesenchymal stem cells was carried out using the same method as in Example 1, and the medium was recovered over time to obtain exosomes. Stable exosome acquisition was possible throughout the culture period (Fig. 2). The total number of cells 76 days after the start of the culture, was 4.82 ⁇ 10 6 cells. The change in the number of cells during the experiment is shown in FIG.
  • Comparative Example 1 Culturing method using a polymer porous membrane of human mesenchymal stem cells (1) Culturing when using a 1 cm square polyimide porous membrane The 1 mm square small piece polyimide porous membrane described in Example 1 Instead, 200 1 cm square polyimide porous membranes were prepared, and the same cells as in the experiment of Example 1 were seeded at the same cell density to carry out a comparative experiment. Culture the total number of cells after 18 days, was 3.0 ⁇ 10 6 cells.
  • Example 3 Culture method using a small piece polyimide porous membrane of human skin fibroblasts (1) Preparation and cell seeding of skin fibroblasts Human adult skin fibroblasts cultured in a 60 cm 2 petri dish are used with trypsin. peeling and recovered Te was prepared cell suspension (3.0 ⁇ 10 6 cells) was added to LIFELINE Co. Zenofuri medium FibroLife 3 ml. The cell culture was poured into a polyimide porous membrane small piece (300 cm 2 ) that had been sterilized in advance and sterilized with 25 ml of the same medium and suspended in an incubator with shaking for 30 minutes. After the addition, the cells were shaken several times and then allowed to stand in a CO 2 incubator to start culturing.
  • Example 4 Intermittent culture method using a small piece polyimide porous membrane of a hybridoma (1) Preparation of a hybridoma and seeding on a small piece porous membrane A hybridoma (SC78.H81.C81.A9) manufactured by JCRB Cell Bank is used as a cell manufactured by Corning.
  • a ⁇ -ray sterilized product of 1 ⁇ 1 mm small perforated membrane 120 cm 2 moistened with purified water was sterilized and transferred to a 125 mL Ellenmeier (model number: 4115-0125) manufactured by Thermo Fisher Scientific, and the above medium (8 mM GlutaMax TM).
  • 10 mL of added CD Hybridoma was added and shaken in a CO 2 incubator for 30 minutes to complete the wetting of the membrane. Then, the medium was discharged and removed to complete the preparation of the wet film in the Erlenmeyer flask tank.
  • the cells After pouring 20 mL of the above cell suspension into the tank and shaking it several times, the cells were allowed to stand in a CO 2 incubator for 1 day to complete the process of adsorbing small pieces of cells. The entire residual liquid portion was discharged and removed from the layer, 20 mL of the above medium (8 mM GlutaMax TM -added CD Hybridoma) was added, and the mixture was allowed to stand in a CO 2 incubator to start culturing.
  • the above medium 8 mM GlutaMax TM -added CD Hybridoma
  • Example 5 Intermittent culture method using a small piece polyimide porous membrane of a hybridoma (1) Preparation of a hybridoma and seeding on a small piece porous membrane A cell and a small piece porous membrane are prepared and cultured by the same method as in Example New 1. After pouring into the tank, the cells were shaken in a CO 2 incubator on a Thermo Fisher Scientific shaker (MaxQ 200 CO2 Plus) at 50 rpm for 24 hours, and then the culture was transferred to static culture. After the migration, the culture was carried out in the same manner as in Example 4.
  • Thermo Fisher Scientific shaker MaxQ 200 CO2 Plus
  • Example 6 Small Polyimide Porous Membrane Continuous Culture Method_Hybridoma (1) Preparation of Hybridoma and Seeding into Small Porous Membrane A hybridoma (SC78.H81.C81.A9) manufactured by JCRB Cell Bank is used as a cell culture dish (Falcon) manufactured by Corning. (F)) and 10 passages in 125 mL Ellenmeier manufactured by Thermo Fisher Scientific (6 passages in 8 mM GlutaMax TM -added CD Hybridoma medium after 4 passages in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FBS). After culturing, a floating cell fluid having a viable cell density of 1.11 ⁇ 10 6 cells / mL (live cell ratio: 78%) was prepared.
  • Example 7 Cell culture and protein production by skin fibroblasts on a small piece polyimide porous membrane
  • Small piece porous membrane preparation and cell culture Human skin fibroblasts (manufactured by LONZA; Lot. No. 18TL215675) are corned. and five passages in company manufactured cell culture FALCON dish, the cells were suspended (1.2 ⁇ 10 6 cells) were trypsinized in a medium (produced by Lonza FGM-2 BulletKit 1.2ml).
  • Example 8 Culture of Chondrocyte Small Piece Porous Membrane A 125 ml square PET storage bottle (with a 45 mm cap) manufactured by Corning Inc. containing 120 cm 2 of sterilized polyimide porous membrane small pieces (1 mm ⁇ 1 mm) is prepared.
  • the amount of exosomes produced in the recovery medium on the 19th day of culture was measured with a human-derived exosome quantification CD9 / CD63ELISA kit (manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd .; product number _EXH0102EL), and the amount of exosomes produced was measured as the amount of protein of CD63.
  • Exosome production of 117 pg / ml was confirmed by accumulating for 3 days. Efficient and stable exosome production was confirmed in the intermittent culture system as well as in the above-mentioned continuous culture system.
  • Example 9 Small piece porous membrane culture and cell recovery of human skin fibroblasts
  • a polyimide small piece porous membrane sterilized in a 50 ml centrifuge tube (screw cap conical tube) manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. ( 300 cm 2 ) is transferred sterilized and 12 ml of PBS is added to moisten the membrane. After 1 hour, PBS is aspirated off to complete membrane preparation.
  • Human skin fibroblasts (LONZA Co., Ltd .; Lot. No. 18TL215675) were subcultured in a cell culture FALCON dish manufactured by Corning Co., Ltd., and treated with trypsin to prepare a medium (Fibroblast Serum Free manufactured by Lifeline Co., Ltd.). at medium Complete Kit) medium was adjusted to 2000 mg / L was added glucose solution 3.0ml were suspended cells (3.0 ⁇ 10 6 cells).

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Abstract

本発明は、小片ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養法を提供することを目的とする。本発明は、表面層Ａ又はＢの面積が４ｍｍ2以下である小片ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、培養することを含む、攪拌を必要としない細胞培養法を提供する。前記小片ポリマー多孔質膜は、特徴的な三次元構造を有するものであり、細胞培養液中で小片ポリマー多孔質膜が分散し及び／又は小片ポリマー多孔質膜同士が互いに多重に集積して、細胞培養容器の底部に分散及び／又は積層する性質を利用して、より簡便に培地を供給及び回収するものである。これにより、長期培養及び大量培養を実現させることによりエクソソームの安定した長期産生を可能にする。

Description

小片多孔膜を適用した細胞培養法
　本発明は、細胞培養及び物質産生システムに関し、より具体的には、小片ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養法に関する。また、小片ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置及びキットに関する。
　細胞培養
　細胞は生体内では一般に三次元的な構造をとった集団として存在する。一方で、細胞を人工環境において培養する場合は、細胞が培養容器底部に単層状に張り付く形で二次元的に培養される古典的な平面培養法や、液体培養液中に細胞を分散させた状態で培養する浮遊培養法が一般的に用いられる。平面培養法に用いられる細胞については、比較的接着性の高い細胞が適しているが、適した細胞を用いた場合でも、培養環境の違いにより、細胞の性質が大きく変化することがある。浮遊培養法についても、適した細胞と適さない細胞が存在する。
　ワクチン、酵素、ホルモン、抗体、サイトカイン等、医療用途に用いられる生体内タンパク質等への需要が高まるにつれ、細胞培養を用いた生体内タンパク質等の大量産生が重要度を増している。また、再生医療における細胞移植等が実用段階に移行する傾向に伴い、大量の細胞を効率的かつ簡便に培養する方法論が注目を集めている。さらに、最近では、診断マーカー、薬物送達担体、及び生物医薬としての利用が図られ、生理活性物質として機能し得るエクソソームを効率的に産生させるための細胞培養系の例も見られる。
　大腸菌等の浮遊細胞については、大型培養槽で大量培養する技術が研究されてきた。大型培養槽を用いた浮遊細胞の大量培養では、多量の培養液と攪拌装置が必要になる。一方、接着細胞を用いて物質産生を行なう研究も、使用する細胞の研究の進展と相まって、多くの注目を集めた。接着細胞を大量培養しようとする場合、古典的な平面培養法では、細胞は二次元的にしか展開しないため、多くの培養面積が必要になる。
　立体的な環境で大量の細胞を培養する方法としては、バイオリアクターや細胞培養担体を用いた方法が報告されている（非特許文献１、特許文献１）。バイオリアクターを用いた方法としては、ガラス繊維などの繊維状物質をカラム内に集積させ、その空間で継続的に細胞を培養して物質を産生する方法がある（特許文献２）。また、代表的な細胞培養用担体としては、細胞が付着育成出来る小粒子であるマイクロキャリアが広く研究対象となっている（特許文献３、４）。
　特許文献４において産生を例として示されたように、マイクロキャリアを用いた細胞培養法によって産生物の量を増加して効率を上げるためには、高密度での細胞培養を達成することが最も重要な課題となる。また、いかに効率的かつ簡便に細胞を増殖させ、担体であるマイクロキャリア上に細胞を移植・播種し得るかも重要な課題となる。この点に関し、マイクロキャリアを用いた細胞培養系では、マイクロキャリアを互いに凝集させないために、十分に攪拌・拡散される必要がある。したがって、マイクロキャリアを分散させた培養液を十分に攪拌・拡散することができるだけの容積が必要となるため、培養できる細胞の密度には上限がある。一方で、撹拌により十分な栄養供給を実現するためには、細胞が容易に剥離しないことが重要となるため、せん断力に対する耐性が必要不可欠な特性となる。さらに、マイクロキャリアと培養液とを分離するためには、細かな粒子を分別できるフィルタで分離させる必要があるなど、量及び効率においてまだまだ課題を抱えている。また、多くの三次元培養技術が創生されているが、その多くがハイドロゲルやスフェロイド法など、一時的培養技術又は評価向け技術であり、実際に長期物質産生を可能にして培養方法は報告されていない。バイオ医薬品や生理活性希少物質又はエクソソームといった物質の安定性生産のためには、安定的な長期培養技術が必要となる。これに関連して、間葉系幹細胞を含む初代細胞の長期培養は多く報告されているが（非特許文献２；非特許文献３）、細胞培養系の製造法として耐えうるものではない。
　エクソソームが有する生理活性は、エクソソームの由来する細胞によってコントロールされた核酸やタンパク質の構成によって支持され、細胞培養における誘導期、対数増殖期、静止期及び死滅期の各段階で産生されるエクソソームの品質は変化すると考えられる。そのため、エクソソームの工業的スケールでの生産を考える場合、エクソソームの特性が培養時間によって変化するのは品質管理上好ましくなく、一度確立した生産系で長期間に渡って均一な品質のエクソソームを産生できることが求められる。従来の培養細胞を用いたエクソソーム産生技術において、こうした細胞培養系の時間経過によるエクソソームの品質の変化の問題は十分に対処されておらず、品質の安定したエクソソームの供給や工業的スケールでのエクソソーム産生系の確立を阻害する技術的障壁となっている。
　また、細胞培養における酸素供給の観点から、細胞培養においては、細胞培養用担体を用いる、用いないに関わらず、また、浮遊細胞であるか接着細胞であるかに関わらず、嫌気性細菌を除けば、酸素供給は細胞の健全な育成のために重要な課題である。たとえば、接着細胞をシャーレやプレートあるいはチャンバーを用いて平面培養する場合、培養容器の面積に対して培地量の適正範囲に制限がある。そのため、不必要に多量の培地を使用した場合には、細胞に十分な酸素が供給されず、低酸素による障害が起こるケースや細胞が死に至るケースも生じうる。また、細胞群がスフェロイドを形成する場合、そのサイズが大きくなりすぎると、内部の細胞は酸素不足に陥ることが知られている（非特許文献４）。このような酸素供給課題に対して、マイクロバブルの利用による酸素濃度の向上（特許文献５）やマイクロキャリア培養における均一な酸素供給方法（特許文献６）などの試みがなされている。一方で、間葉系幹細胞の培養では、該細胞は低酸素環境に好んで生息し、増殖することが知られているため、細胞の種類に応じて、細胞培養時に酸素供給を加減する煩雑な操作を必要とする。そこで、簡便かつ自動化に向くプロセスで、提供される酸素量を容易に調節することができ、さらには大量の数の細胞を培養することができる細胞培養法の開拓と構築が希求されていた。
　本発明者らは、これまでポリマー多孔質膜を用いる細胞培養法及び細胞培養装置を提供してきたが、膜状のポリマー多孔質膜の継続的な形態が変形することを防止するために、ポリマー多孔質膜をケーシング（外套）に収容させた細胞培養モジュールを細胞培養容器、細胞培養装置、又は細胞培養システムに適用している（特許文献７：「細胞培養モジュール」）。これによって、ポリマー多孔質膜内で生育される細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等が抑制されて安定的かつ大量の細胞を培養することが可能となる。しかしながら、細胞培養モジュールを用いた細胞培養法では、ポリマー多孔質膜を収容させるためのケーシングを必要とすること、及び該ケーシングを入れる細胞培養容器自体の大きさや強度が制限される。
　＜ポリイミド多孔質膜＞
　ポリイミド多孔質膜は、本出願前よりフィルタ、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献８～１０は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。
特開昭６２-０６５６８１号公報 国際公開第２００８／０８４８５７号 特開平７-３１３１５１号公報 国際公開第２００３／０５４１７４号 特許第５５４９２０９号公報 特許第５４６０２４１号公報 国際公開第２０１８／０２１３６８号 国際公開第２０１０／０３８８７３号 特開２０１１－２１９５８５号公報 特開２０１１－２１９５８６号公報
Ogata et al., Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.77, No.1, p.46-51 1994 Dosh, R. H., et al., Science Reports, volume 9, Article number:1812 (2019) M. Mirbagheri, et al., Mater. Horiz., 6, 45-71 (2019) 黒澤 尋, 生物工学 第91巻、第11号、646-653頁、2013年
　接着性の動物細胞を大量に培養するには、シャーレやディッシュの様な平面形態のままだと大きな面積が必須不可欠となるため、積層形態の培養装置が創出されている。一方で、浮遊可能な担体を培地に浮かせて培養するマイクロキャリア等の方法も多く開発され、浮遊細胞の様な形態で大量の接着細胞を培養する方法も構築され活用されて来た。これらの方法は、ある程度の期間細胞を増殖させたり、ウイルスやタンパク質等の物質を産生させることに活用されてきたが、細胞の特性を損なうことなく長期に安定的に細胞を培養する方法論は見出されていない。
　また、大量の動物細胞を培養するためには、培地に大量の酸素を継続的に溶存させる必要がある。培地に酸素を溶存させる方法として、培地を攪拌する方法や、バブリングする方法がある。しかしながら、動物細胞の多くは、剪断力に弱く、攪拌培養方法では細胞を死滅させてしまう問題を抱えていた。また、通常のマグネチックスターラーと攪拌子の組み合わせた攪拌培養方法では、培養容器と攪拌子の接触部分において、細胞をすり潰してしまい、細胞を大量に培養することが困難であった。また、バブリングを行う培養方法では、バブリング時に生じる泡沫によって細胞を死滅させてしまう問題があった。一方で、低酸素環境に好んで生息する間葉系幹細胞などの細胞では、培地に大量の酸素を継続的に溶存させることは好ましくない。こうした細胞の培養には、インキュベータ内の酸素濃度を低減させるための装置を付加的に必要とすることとなる。
　発明者らは、ポリイミド多孔質膜を用いる細胞培養技術を見直し、従来の細胞培養向け多孔膜シートのサイズを１辺１ｍｍ程度の小サイズとすることで、特異な機器を全く必要としない静置型長期大量細胞培養システムを創出することができた。多孔膜を小片にしたことで、大量のシートを極めて小さな空間内に大量に設置することが可能となり、栄養を供給することで、安定的かつ省作業的に大量の細胞を培養可能であることを見出した。また、これまでポリイミド多孔質膜からの細胞回収は効率的に進みにくい傾向を示していたが、本方法では、細胞回収もある程度効率的に進むことが明確化した。また、小片としたことで分散状態や積層状態での培地等の流通性が良好なため、細胞の成長、エクソソームの産生量等々、小片培養法が高い効率を示した。小片特性のため、系の視認性にも優れており、抗体、ウイルスあるいはエクソソーム等の各種物質産生のための優れたシステムを形成し得る。サンプリングも容易であり、極めて少ない量のサンプルを代表として取り出しても、固定・染色・同定・評価等々が明確に実行出来る。また、オーバーフローリアクター等の連続培養法とも組み合わせて使用可能で、大量の細胞を静的に長期間、培養可能である。特に、エクソソーム産生では、本発明の小片ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養法により、長期間に亘り、安定した産生量と品質を有するエクソソームの産生が可能となることを見出した。
　本発明は、ポリマー多孔質膜を小片とすることにより、特異な細胞培養機器を必要とせず、細胞培養容器に攪拌機を適用したり、スピナーフラスコを使用したりすることもなく、細胞を大量に培養可能な最適な空間を提供することができる。さらに、培養液中で小片ポリマー多孔質膜が分散し及び／又は小片ポリマー多孔質膜同士が多重に集積しあって細胞培養容器の底部に分散及び／又は積層した状態で沈み、その状態を維持し得るため、細胞培養液の液量（深さ）を容易に調節可能であり、しいては培養液中の溶存酸素量（酸素供給状態）を簡便に調節できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
　［１］　小片ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、培養することを含む、攪拌を必要としない細胞培養法であって、
　ここで、前記小片ポリマー多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造の小片ポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通するものであり、
　前記表面層Ａ又は表面層Ｂの面積が４ｍｍ2以下であり、
　培養液中で前記小片ポリマー多孔質膜が分散し及び／又は小片ポリマー多孔質膜同士が多重に集積し、細胞培養容器の底部に分散及び／又は積層される、細胞培養法。
　［２］　間歇的に又は連続的に培地を交換することにより長期培養を行う、［１］に記載の細胞培養法。
　［３］　前記小片ポリマー多孔質膜に接着させた細胞を増殖された後、酵素処理により細胞を剥離し、細胞を接着させていない小片ポリマー多孔質膜を細胞培養容器に添加することにより、細胞を継代させて大量培養を行う、［１］又は［２］に記載の細胞培養法。
　［４］　前記小片ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１～１００μｍの複数の細孔を有する、［１］～［３］のいずれか１つに記載の細胞培養法。
　［５］　前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１～５０μｍである、［１］～［４］のいずれか１つに記載の細胞培養法。
　［６］　前記表面層Ｂの平均孔径が、２０～１００μｍである、［１］～［５］のいずれか１つに記載の細胞培養法。
　［７］　前記小片ポリマー多孔質膜の総膜厚が、５～５００μｍである、［１］～［６］のいずれか１つに記載の細胞培養法。
　［８］　前記小片ポリマー多孔質膜が、小片ポリイミド多孔質膜である、［１］～［７］のいずれか１つに記載の細胞培養法。
　［９］　前記小片ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、小片ポリイミド多孔質膜である、［８］に記載の細胞培養法。
　［１０］　前記小片ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色した小片ポリイミド多孔質膜である、［８］又は［９］に記載の細胞培養法。
　［１１］細胞によりエクソソームを産生させることを含む、［１］～［１０］のいずれか１つに記載の細胞培養法。
　［１２］　小片ポリマー多孔質膜を含む、［１］～［１１］のいずれか１つに記載の細胞培養法に使用するための細胞培養装置。
　［１３］　小片ポリマー多孔質膜を含む、［１］～［１１］のいずれか１つに記載の細胞培養法に使用するためのキット。
　［１４］　［１］～［１１］のいずれか１つに記載の方法によって取得したエクソソーム。
　本発明は、培養液中で小片ポリマー多孔質膜が分散し及び／又は小片ポリマー多孔質膜同士が多重に集積し、細胞培養容器の底部に小片ポリマー多孔質膜が分散及び／又は積層された状態で細胞培養を行うことができるため、攪拌機等による攪拌を必要とせずに放置することが可能であり、したがって、従来のケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜の使用とは異なり、細胞培養容器のサイズ、素材、強度等は限定されず、また、攪拌機等の設置が不要であることから、非常に広範囲の細胞培養容器を利用することが可能である。但し、本発明の細胞培養法は、撹拌を必要としないだけであり、撹拌条件を拒むものではない。したがって、本発明によれば、このような細胞培養法に、微弱な振動又は流動条件を課すことは可能である。また、細胞を小片ポリマー多孔質膜に播種して培養した後、細胞を回収せずに小片ポリマー多孔質膜を追加することにより細胞量を増加（内部拡大）させることも可能である。さらには、小片ポリマー多孔質膜を用いることで、安定的かつ長期的に物質産生が可能となる。従来のポリイミド多孔質膜と比較して、小片ポリマー多孔質膜を用いた培養では、細胞の増殖が有意に高くなり、また、細胞回収効率が顕著に改善され、上記のように内部拡大も可能であることから、より長期間、細胞培養を継続することが容易になった。さらに、細胞が小片ポリマー多孔質膜内に担持されたまま小片部材を凍結し、保存することができるという利点を有する。
小片ポリイミド多孔質膜（１ｍｍ角）及び非小片ポリイミド多孔質膜（１ｃｍ角）を用いて培養した場合のヒト間葉系幹細胞のグルコース消費の経時的変化を示す図である。 小片ポリイミド多孔質膜を用いて培養したヒト間葉系幹細胞からのエクソソームの長期産生を示す図である。 ヒト間葉系幹細胞の経時的な細胞数変化を示す図である。 小片ポリイミド多孔質膜を用いた培養したヒト間葉系幹細胞の幹性検証の結果を示す図である（左：脂肪細胞の分化誘導（左パネル）；右：骨芽細胞への分化誘導及び石灰化）。 小片ポリイミド多孔質膜を用いた培養したヒト皮膚線維芽細胞の経時的な細胞数変化を示す図である。 例示的なオーバーフロー型バイオリアクターを示す図である。 例示的なオーバーフロー型バイオリアクターを示す図及び画像である。 例示的なオーバーフロー型バイオリアクターを示す図である。 小片ポリイミド多孔質膜を用いた培養した軟骨細胞の経時的な細胞挙動（細胞密度及び細胞挙動）の変化を示す図である。
　以下、本発明の実施形態について、必要に応じて図面を参照しながら説明する。実施形態の構成は例示であり、本発明の構成は、実施形態の具体的構成に限定されない。
Ａ．小片ポリマー多孔質膜
１．小片ポリマー多孔質膜の作製
　小片ポリマー多孔質膜は、後述するポリマー多孔質膜を所望の大きさに成形することによって作製することができる。成形は、様々な加工用ユニットを用いて行うことができる。例えば、限定されないが、ピナクル簡易式抜き機を用いたピナクルダイにてポリマー多孔質膜（例えば、ポリイミド多孔質膜、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜）を打ち抜いて所望の形状の小片ポリマー多孔質膜を得ることができる。
２．ポリマー多孔質膜
　本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ａ（以下で、「Ａ面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、０．０１μｍ以上２００μｍ未満、０．０１～１５０μｍ、０．０１～１００μｍ、０．０１～５０μｍ、０．０１μｍ～４０μｍ、０．０１μｍ～３０μｍ、０．０１μｍ～２５μｍ、０．０１μｍ～２０μｍ、又は０．０１μｍ～１５μｍであり、好ましくは、０．０１μｍ～２５μｍである。
　本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ｂ（以下で、「Ｂ面」又は「大穴面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、表面層Ａに存在する孔の平均孔径よりも大きい限り特に限定されないが、例えば、５μｍ超２００μｍ以下、２０μｍ～１００μｍ、２５μｍ～１００μｍ、３０μｍ～１００μｍ、３５μｍ～１００μｍ、４０μｍ～１００μｍ、５０μｍ～１００μｍ、又は６０μｍ～１００μｍであり、好ましくは、３０μｍ～１００μｍである。
　本明細書において、ポリマー多孔質膜表面の平均孔径は面積平均孔径である。面積平均孔径は、以下の（１）及び（２）に従って求めることができる。なお、ポリマー多孔質膜表面以外の部位の平均孔径も同様にして求めることができる。
（１）多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真から、２００点以上の開孔部について孔面積Ｓを測定し、該孔面積を真円と仮定して式Ｉからそれぞれの孔径ｄを求める。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 （２）上記式Ｉによって求められた全ての孔径を以下の式ＩＩに適用し、孔の形状が真円であるとした際の面積平均孔径ｄａを求める。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　表面層Ａ及びＢの厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１～５０μｍであり、好ましくは０．０１～２０μｍである。
　ポリマー多孔質膜におけるマクロボイド層中のマクロボイドの膜平面方向の平均孔径は、特に限定されないが、例えば１０～５００μｍであり、好ましくは１０～１００μｍであり、より好ましくは１０～８０μｍである。また、当該マクロボイド層中の隔壁の厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１～５０μｍであり、好ましくは、０．０１～２０μｍである。一の実施形態において、当該マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１～１００μｍの、好ましくは０．０１～５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、当該マクロボイド層中の隔壁は孔を有さない。
　本発明で使用されるポリマー多孔質膜表面の総膜厚は、特に限定されないが、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上又は２５μｍ以上であってもよく、５００μｍ以下、３００μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下又は５０μｍ以下であってもよい。好ましくは、５～５００μｍであり、より好ましくは２５～７５μｍである。
　本発明で使用されるポリマー多孔質膜の膜厚の測定は、接触式の厚み計で行うことができる。
　本発明で使用されるポリマー多孔質膜の空孔率は特に限定されないが、例えば、４０％以上９５％未満である。
　本発明において用いられるポリマー多孔質膜の空孔率は、所定の大きさに切り取った多孔質フィルムの膜厚及び質量を測定し、目付質量から下式ＩＩＩに従って求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 （式中、Ｓは多孔質フィルムの面積、ｄは総膜厚、ｗは測定した質量、Ｄはポリマーの密度をそれぞれ意味する。ポリマーがポリイミドである場合は、密度は１．３４ｇ／ｃｍ3とする。）
　本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ～２５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は３０μｍ～１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１～２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５～５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリマー多孔質膜である。一の実施形態において、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１～１００μｍの、好ましくは０．０１～５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、隔壁は、そのような孔を有さない。
　本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、滅菌されていることが好ましい。滅菌処理としては、特に限定されないが、乾熱滅菌、蒸気滅菌、エタノール等消毒剤による滅菌、紫外線やガンマ線等の電磁波滅菌等任意の滅菌処理などが挙げられる。
　本発明で使用される小片ポリマー多孔質膜は、上記した構造的特徴を備える限り、特に限定されないが、好ましくは小片ポリイミド多孔質膜、又は小片ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である。以下に、小片ポリマー多孔質の作製に使用されるポリイミド多孔質膜及びポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜について説明する。
　２－１．ポリイミド多孔質膜
　ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。
　本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、好ましくは、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを（主たる成分として）含むポリイミド多孔質膜であり、より好ましくはテトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドからなるポリイミド多孔質膜である。「主たる成分として含む」とは、ポリイミド多孔質膜の構成成分として、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミド以外の成分は、本質的に含まない、あるいは含まれていてもよいが、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドの性質に影響を与えない付加的な成分であることを意味する。
　一実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜も含まれる。
　ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。
　ポリアミック酸は、アミック酸の一部がイミド化していても、本発明に影響を及ぼさない範囲であればそれを用いることができる。すなわち、ポリアミック酸は、部分的に熱イミド化又は化学イミド化されていてもよい。
　ポリアミック酸を熱イミド化する場合は、必要に応じて、イミド化触媒、有機リン含有化合物、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。また、ポリアミック酸を化学イミド化する場合は、必要に応じて、化学イミド化剤、脱水剤、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。ポリアミック酸溶液に前記成分を配合しても、着色前駆体が析出しない条件で行うことが好ましい。
　本明細書において、「着色前駆体」とは、２５０℃以上の熱処理により一部又は全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。
　上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得る着色前駆体としては、ポリアミック酸溶液又はポリイミド溶液に均一に溶解又は分散し、２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理、好ましくは空気等の酸素存在下での２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理により熱分解し、炭化して着色化物を生成するものが好ましく、黒色系の着色化物を生成するものがより好ましく、炭素系着色前駆体がより好ましい。
　着色前駆体は、加熱していくと一見炭素化物に見えるものになるが、組織的には炭素以外の異元素を含み、層構造、芳香族架橋構造、四面体炭素を含む無秩序構造のものを含む。
　炭素系着色前駆体は特に制限されず、例えば、石油タール、石油ピッチ、石炭タール、石炭ピッチ等のタール又はピッチ、コークス、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体、フェロセン化合物（フェロセン及びフェロセン誘導体）等が挙げられる。これらの中では、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体及び／又はフェロセン化合物が好ましく、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体としてはポリアクリロニトリルが好ましい。
　また、別の実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、上記の着色前駆体を使用せずに、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液を成形した後、熱処理することにより得られる、ポリイミド多孔質膜も含まれる。
　着色前駆体を使用せずに製造されるポリイミド多孔質膜は、例えば、極限粘度数が１．０～３．０であるポリアミック酸３～６０質量％と有機極性溶媒４０～９７質量％とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製し、その後当該ポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化することにより製造されてもよい。この方法において、水を必須成分とする凝固溶媒が、水であるか、又は５質量％以上１００質量％未満の水と０質量％を超え９５質量％以下の有機極性溶媒との混合液であってもよい。また、上記イミド化の後、得られた多孔質ポリイミド膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施してもよい。
　上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るテトラカルボン酸二無水物は、任意のテトラカルボン酸二無水物を用いることができ、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。テトラカルボン酸二無水物の具体例として、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ－ＢＰＤＡ）、２，３，３’，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ａ－ＢＰＤＡ）などのビフェニルテトラカルボン酸二無水物、オキシジフタル酸二無水物、ジフェニルスルホン－３，４，３’，４’－テトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）スルフィド二無水物、２，２－ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン二無水物、２，３，３’，４’－ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’－ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）メタン二無水物、２，２－ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）プロパン二無水物、ｐ－フェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｐ－ビフェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｍ－ターフェニル－３，４，３’，４’－テトラカルボン酸二無水物、ｐ－ターフェニル－３，４，３’，４’－テトラカルボン酸二無水物、１，３－ビス（３，４－ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４－ビス（３，４－ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４－ビス（３，４－ジカルボキシフェノキシ）ビフェニル二無水物、２，２－ビス〔（３，４－ジカルボキシフェノキシ）フェニル〕プロパン二無水物、２，３，６，７－ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，４，５，８－ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、４，４’－（２，２－ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸二無水物等を挙げることができる。また、２，３，３’，４’－ジフェニルスルホンテトラカルボン酸等の芳香族テトラカルボン酸を用いることも好ましい。これらは単独でも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
　これらの中でも、特に、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族テトラカルボン酸二無水物が好ましい。ビフェニルテトラカルボン酸二無水物としては、３，３’，４，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物を好適に用いることができる。
　上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るジアミンは、任意のジアミンを用いることができる。ジアミンの具体例として、以下のものを挙げることができる。
　１）１，４－ジアミノベンゼン（パラフェニレンジアミン）、１，３－ジアミノベンゼン、２，４－ジアミノトルエン、２，６－ジアミノトルエンなどのベンゼン核１つのべンゼンジアミン；
　２）４，４’－ジアミノジフェニルエーテル、３，４’－ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、４，４’－ジアミノジフェニルメタン、３，３’－ジメチル－４，４’－ジアミノビフェニル、２，２’－ジメチル－４，４’－ジアミノビフェニル、２，２’－ビス（トリフルオロメチル）－４，４’－ジアミノビフェニル、３，３’－ジメチル－４，４’－ジアミノジフェニルメタン、３，３’－ジカルボキシ－４，４’－ジアミノジフェニルメタン、３，３’，５，５’－テトラメチル－４，４’－ジアミノジフェニルメタン、ビス（４－アミノフェニル）スルフィド、４，４’－ジアミノベンズアニリド、３，３’－ジクロロベンジジン、３，３’－ジメチルベンジジン、２，２’－ジメチルベンジジン、３，３’－ジメトキシベンジジン、２，２’－ジメトキシベンジジン、３，３’－ジアミノジフェニルエーテル、３，４’－ジアミノジフェニルエーテル、４，４’－ジアミノジフェニルエーテル、３，３’－ジアミノジフェニルスルフィド、３，４’－ジアミノジフェニルスルフィド、４，４’－ジアミノジフェニルスルフィド、３，３’－ジアミノジフェニルスルホン、３，４’－ジアミノジフェニルスルホン、４，４’－ジアミノジフェニルスルホン、３，３’－ジアミノベンゾフェノン、３，３’－ジアミノ－４，４’－ジクロロベンゾフェノン、３，３’－ジアミノ－４，４’－ジメトキシベンゾフェノン、３，３’－ジアミノジフェニルメタン、３，４’－ジアミノジフェニルメタン、４，４’－ジアミノジフェニルメタン、２，２－ビス（３－アミノフェニル）プロパン、２，２－ビス（４－アミノフェニル）プロパン、２，２－ビス（３－アミノフェニル）－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス（４－アミノフェニル）－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、３，３’－ジアミノジフェニルスルホキシド、３，４’－ジアミノジフェニルスルホキシド、４，４’－ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核２つのジアミン；
　３）１，３－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，３－ビス（３－アミノフェノキシ）－４－トリフルオロメチルベンゼン、３，３’－ジアミノ－４－（４－フェニル）フェノキシベンゾフェノン、３，３’－ジアミノ－４，４’－ジ（４－フェニルフェノキシ）ベンゾフェノン、１，３－ビス（３－アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３－ビス（３－アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３－ビス〔２－（４－アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４－ビス〔２－（３－アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４－ビス〔２－（４－アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核３つのジアミン；
　４）３，３’－ビス（３－アミノフェノキシ）ビフェニル、３，３’－ビス（４－アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’－ビス（３－アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’－ビス（４－アミノフェノキシ）ビフェニル、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、２，２－ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核４つのジアミン。
　これらは単独でも、２種以上を混合して用いることもできる。用いるジアミンは、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。
　これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、３，３’－ジアミノジフェニルエーテル、３，４’－ジアミノジフェニルエーテル、４，４’－ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、１，３－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェノキシ）ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。
　本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が２４０℃以上であるか、又は３００℃以上で明確な転移点がないテトラカルボン酸二無水物とジアミンとを組み合わせて得られるポリイミドから形成されていることが好ましい。
　本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、以下の芳香族ポリイミドからなるポリイミド多孔質膜であることが好ましい。
　（ｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
　（ｉｉ）テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び／又は、
　（ｉｉｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
　本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ～２５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は３０μｍ～１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１～２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５～５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。ここで、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１～１００μｍの、好ましくは０．０１～５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。
　例えば、国際公開第２０１０／０３８８７３号、特開２０１１－２１９５８５号公報、又は特開２０１１－２１９５８６号公報に記載されているポリイミド多孔質膜も、本発明に使用可能である。
　２－２．ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜
　本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、ポリエーテルスルホンを含み、典型的には実質的にポリエーテルスルホンからなる。ポリエーテルスルホンは当業者に公知の方法で合成されたものであってよく、例えば、二価フェノール、アルカリ金属化合物及びジハロゲノジフェニル化合物を有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法、二価フェノールのアルカリ金属二塩を予め合成しジハロゲノジフェニル化合物と有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法等によって製造できる。
　アルカリ金属化合物としては、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属水素化物、アルカリ金属アルコキシド等が挙げられる。特に、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムが好ましい。
　二価フェノール化合物としては、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシン、４，４’－ビフェノール、ビス（ヒドロキシフェニル）アルカン類（例えば２，２－ビス（ヒドロキシフェニル）プロパン、及び２，２－ビス（ヒドロキシフェニル）メタン）、ジヒドロキシジフェニルスルホン類、ジヒドロキシジフェニルエーテル類、又はそれらのベンゼン環の水素の少なくとも１つが、メチル基、エチル基、プロピル基等の低級アルキル基、又はメトキシ基、エトキシ基等の低級アルコキシ基で置換されたものが挙げられる。二価フェノール化合物としては、上記の化合物を二種類以上混合して用いることができる。
　ポリエーテルスルホンは市販品であってもよい。市販品の例としては、スミカエクセル７６００Ｐ、スミカエクセル５９００Ｐ（以上、住友化学(株)製）等が挙げられる。
　ポリエーテルスルホンの対数粘度は、多孔質ポリエーテルスルホン膜のマクロボイドを良好に形成する観点で、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．５５以上であり、多孔質ポリエーテルスルホン膜の製造容易性の観点から、好ましくは１．０以下、より好ましくは０．９以下、更に好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．７５以下である。
　また、ＰＥＳ多孔質膜、又はその原料としてのポリエーテルスルホンは、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が、２００℃以上であるか、又は明確なガラス転移温度が観察されないことが好ましい。
　本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜の製造方法は特に限定されないが、例えば、
　対数粘度０．５～１．０のポリエーテルスルホンの０．３質量％～６０質量％と有機極性溶媒４０質量％～９９．７質量％とを含むポリエーテルスルホン溶液を、フィルム状に流延し、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、空孔を有する凝固膜を作製する工程、及び
　前記工程で得られた空孔を有する凝固膜を熱処理して前記空孔を粗大化させて、ＰＥＳ多孔質膜を得る工程
を含み、前記熱処理は、前記空孔を有する凝固膜を、前記ポリエーテルスルホンのガラス転移温度以上、若しくは２４０℃以上まで昇温させることを含む、方法で製造されてもよい。
　本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、好ましくは、表面層Ａ、表面層Ｂ、及び前記表面層Ａと前記表面層Ｂとの間に挟まれたマクロボイド層、を有するＰＥＳ多孔質膜であって、
　前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた、膜平面方向の平均孔径が１０μｍ～５００μｍである複数のマクロボイドとを有し、
　前記マクロボイド層の隔壁は、厚さが０．１μｍ～５０μｍであり、
　前記表面層Ａ及びＢはそれぞれ、厚さが０．１μｍ～５０μｍであり、
　前記表面層Ａ及びＢのうち、一方が平均孔径５μｍ超２００μｍ以下の複数の細孔を有し、かつ他方が平均孔径０．０１μｍ以上２００μｍ未満の複数の細孔を有し、
　表面層Ａ及び表面層Ｂの、一方の表面開口率が１５％以上であり、他方の表面層の表面開口率が１０％以上であり、
　前記表面層Ａ及び前記表面層Ｂの前記細孔が前記マクロボイドに連通しており、
　前記ＰＥＳ多孔質膜は、総膜厚が５μｍ～５００μｍであり、かつ空孔率が５０％～９５％である、
ＰＥＳ多孔質膜である。
　本発明の細胞培養装置に用いられる、細胞培養担体としての上述のポリマー多孔質膜は、微親水性の多孔質特性を有するため、ポリマー多孔質膜内に安定した液保持がなされ、乾燥にも強い湿潤環境が保たれる。そのため、従来の細胞培養担体を用いる細胞培養装置と比較して、極めて少量の培地でも細胞の生存及び増殖を達成することができる。また、ポリマー多孔質膜に播種された細胞は、剪断力や、泡沫によっても細胞が死滅することなく培養が可能であるため、細胞に対して効率的に酸素や栄養を供給することができ、大量の細胞を培養することができる。
　本発明によれば、細胞への酸素供給を十分に行うことが可能となる。
　２－３．細胞培養法に用いられる小片ポリマー多孔質膜の実施形態
　本発明の実施態様で使用される小片ポリマー多孔質膜は、従来技術としてポリマー多孔質膜をケーシング（外套）内に収容させることなく、任意の細胞培養溶液に添加して使用することができる。一実施態様において、本発明の細胞培養法に使用される小片ポリマー多孔質膜は、表面層Ａ又は表面層Ｂの面積が、４ｍｍ2以下、好ましくは３ｍｍ2以下、より好ましくは２ｍｍ2以下、最も好ましくは１ｍｍ2であることを特徴としている。表面層Ａ又は表面層Ｂの面積の下限は、例えば、０．０１ｍｍ2以上であってもよく、０．０４ｍｍ2以上であってもよく、０．０９ｍｍ2以上であってもよく、０．１６ｍｍ2以上であってもよい。小片ポリマー多孔質膜の形状としては、例えば、多角形（例えば、三角形、四角形（例えば矩形）、五角形、六角形・・・ｎ角形（ｎは任意の整数））、略円形、略楕円形、曲線と直線とを含む形状であってもよい。一実施態様において、細胞培養装置１ａで適用されるポリマー多孔質膜２００ａは、例えば、表面層Ａ又は表面層Ｂの最長径／最短径の比が、０．５～１、好ましくは０．７５～１、より好ましくは０．９～１であることが好ましい。本明細書において、「径」とは、表面層Ａ又は表面層Ｂの外周の任意の二点の間の長さをいう。本明細書において、「最長径」とは、表面層Ａ又は表面層Ｂの外周の任意の二点の間の長さのうち、最長となる長さをいう。本明細書において、「最短径」とは、表面層Ａ又は表面層Ｂの外周の任意の二点の間の長さのうち、最短となる長さをいう。一実施態様において、本発明の細胞培養方法に適用される小片ポリマー多孔質膜が四角形、例えば矩形である場合、最長径が２×２＾（１／２）ｍｍ以下、及び最短径が２×２＾（１／２）ｍｍ以下、好ましくは、最長径が１．５×２＾（１／２）ｍｍ以下、及び最短径が１．５×２＾（１／２）ｍｍ以下、より好ましくは最長径が１×２＾（１／２）ｍｍ以下、及び最短径が１×２＾（１／２）ｍｍ以下である。他の態様において、本発明の細胞培養方法に適用されるポリマー多孔質膜が、略円形又は略楕円形である場合、最長径が２ｍｍ以下及び最短径が２ｍｍ以下、好ましくは最長径が１．５ｍｍ以下及び最短径が１．５ｍｍ以下、より好ましくは最長径が１．２ｍｍ以下及び最短径が１．２ｍｍ以下である。また、小片ポリマー多孔質膜に担持された細胞に、効率的に酸素や栄養を供給することが可能となり、細胞増殖も良好となり、任意のタンパク質等、エクソソームの物質を産生する活性も著しく高くなるという効果をもたらす。また、小片ポリマー多孔質膜が大量に培地中に適応されることにより、小片ポリマー多孔質膜が集積し、任意の小片ポリマー多孔質膜に担持された細胞が、別の小片ポリマー多孔質膜に移動したり、両者にまたがって接着しながら生育させる培養環境を提供することが可能となる。したがって、小片ポリマー多孔質膜を細胞培養容器に適用する場合は、細胞培養容器は振盪させることなく、静置して培養することが好ましい。小片ポリマー多孔質膜は、静置すると培地に沈降するため、低酸素条件に適した細胞の培養の場合には、特別な装置を使用する事なく、培地量を増加して深さを増すだけで、低酸素培養系を実行する事も可能となる。
　また、細胞培養容器に添加される小片ポリマー多孔質膜の数は限定されないが、添加後に培養液中で小片ポリマー多孔質膜同士が多重に集積した状態になることが好ましい。１つの小片ポリマー多孔質膜が、別の小片ポリマー多孔質膜と部分的又は全体的に重なっていることが好ましく、具体的には、重複している部分は、小片ポリマー多孔質膜あたり１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％の領域であってもよい。
　本発明によれば、小片ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養では、複数の小片ポリマー多孔質膜の各辺が垂直方向に揃うように積み重ねた従来のポリマー多孔質膜の整形な多重構造をとる場合もあるが、小片ポリマー多孔質膜は、不定形な又は不均一な積層状態を形成する場合もある。後者のような積層状態としては、例えば、２枚の小片ポリマー多孔質膜で簡単に説明すると、一方の膜の一辺が、他方の膜の一辺又は面に接触して、Ｖ字構造、Ｔ字構造、ｙ字（小文字）構造など微小な空間が形成される状況でもよく、膜同士の面と面が部分的に又は全体的に重なった構造でなくてもよい。このような構造に対して、播種された細胞はその移動や増殖の過程に於いて、膜の平面に限らず、膜同士が重なりあった際に形成される微小空間部分、例えば、Ｖ字構造であればＶ底の部分、又は面同士が重なり合ってできた段差（膜厚又は膜の高さ）に集まり、小片ポリイミド多孔質膜に足場を持ちながら、さらに、細胞同士が集合して、スフェロイドではない立体的空間を細胞自らが作ることにより、長期間生存することができる。エクソソーム産生という観点で考えた場合、増殖や死滅といった劇的変化の状況ではなく、安定な一定数の細胞集合状態を長期に維持している環境に依存して、安定にかつ均一な品質のエクソソームの産生を実現することができる。小片多孔膜及びそこに生育する細胞が形成する集合構造に関しては、後述する実施例２にてヒト間葉系幹細胞の幹性検証の結果を示した際の図４の写真で見てとれるように、脂肪細胞は、膜同士が逆Ｖ字構造の頂上部（Ｖ字構造の底部の反対）に集積して生存し、一方、骨芽細胞は、膜の平面部よりも膜同士が積層してできた段差部分において立体的に細胞集合体を形成する傾向にある。
　従来技術としてのマイクロキャリアを用いた細胞培養法では、高密度培養及び細胞増殖を達成させるという課題の他に、いかにしてマイクロキャリア上に細胞を移植及び播種させ得るかという課題がある。マイクロキャリアを互いに凝集させないため、すなわち、集合体を形成させないための攪拌及び拡散手段が必要であることは周知の事実であり、これはまた細胞培養において負の要素と言える。一方で、本発明では、小片ポリマー多孔質膜を細胞培養に使用する上で、上述したように、分散状態や互いに集積した状態であってもよく、小片ポリマー多孔質膜を使用した場合の集合体形成は何ら問題にはならない。
　また、培養液中、細胞培養容器の底部に分散及び多重に集積した、すなわち、沈降が停止した小片ポリマー多孔質膜は、小片自体が軽量であることから、一小片の頂点、辺若しくは面が、細胞培養容器の底面若しくは側面、又は他の小片の頂点、辺若しくは面に接触しながら、例えば、培地のフローによって揺らぐ状態であり得る。本発明によれば、上記の通り、小片ポリマー多孔質膜が揺らぎなら立体的に分散及び多重に集積していること、さらにポリマー多孔質膜が液通過性を備えていることから、小片ポリマー多孔質膜に担持された細胞に対して、培地からの栄養及び酸素を枯渇させることがない（優れた流通性を有する）ため、振盪させることなく、静置して細胞を培養することができる。
　これまでに、小片化していないポリマー多孔質膜を継続的に形態変化する状態で細胞を培養すると、ポリマー多孔質膜内で生育される細胞にストレスが加わり、アポトーシス等により死滅することが知られている（ＷＯ２０１８／０２１３６７）。そこでは、ポリマー多孔質膜として縦０．５ｃｍ×横５ｃｍ（縦横比１：１０）の自己変形し易い短冊型の膜を用いることにより、細胞死が顕著に誘導されることが記載されている。仮に、本発明の小片ポリマー多孔質膜を上記ポリマー多孔質膜と同じ縦横比で作製した場合であっても、小片ポリマー多孔質膜の厚さは、上記ポリマー多孔質膜の厚さと変わらないため、両者の立体形状を比較した場合、小片ポリマー多孔質膜の方が剛性が高くなり、その自己変形効率が下がることは容易に想像し得る。このことは、短冊型の膜に限らず、各種形態の小片ポリマー多孔質膜にもあてはまる。例えば、後述する比較例１において実証されるように、「１ｃｍ角のポリイミド多孔質膜」と「１ｍｍ角の小片ポリイミド多孔質膜」をヒト間葉系幹細胞の培養に使用したところ、小片ポリマー多孔質膜を用いた方が、培養期間を通じて高いグルコース消費が行われていることから、本発明の小片ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養法は、細胞増殖、物質産生、及び長期培養の観点から、従来のポリマー多孔質膜における細胞培養法よりも、細胞に対して生息しやすい環境を提供する方法であると言える。
Ｂ．細胞培養容器
　本発明によれば、本発明の細胞培養法は、小片ポリマー多孔質膜に、懸濁された細胞を注加し、静置させて細胞培養を行う方法であって、細胞培養容器に攪拌機を適用したり、スピナーフラスコを使用する必要がない。上記の通り、小片ポリマー多孔質膜は、分散及び／又は互いに多重に集積して、その状態で細胞培養容器の底部に沈むという性質を有するものであり、培地中でこのような状態を達成できる細胞培養容器及び細胞培養装置であれば、特に限定されない。したがって、通常、細胞培養に使用されるディッシュ、シャーレ、プレート、ウェル、ボトル、バッグ等に限定されず、また素材、例えば、プラスチック製、ガラス製等に限定されず、任意の容器を利用することができる。また、細胞培養装置を用いる場合、細胞培養容器は、装置内に装備された培養槽の形態であってもよい。
　さらに、小片ポリマー多孔質膜は、分散及び／又は互いに多重に集積して、細胞培養容器の底部に沈むという性質を有し、また、攪拌等を必要としないため、間歇的に又は連続的に培地を交換する手段を有する細胞培養装置を使用すれば、長期的な細胞培養が可能になる。このような細胞培養装置の例としては、限定されないが、オーバーフロー型バイオリアクター、間歇型バイオリアクター（WO2018/021359）等が挙げられる。
　オーバーフロー型バイオリアクターの細胞培養装置に関して、例示的な該細胞培養装置を図６に示す。具体的には、オーバーフロー型バイオリアクターは、図６中の細胞培養装置１ａであって、以下：
　細胞を適用する小片ポリマー多孔質膜２００ａと；
　前記小片ポリマー多孔質膜２００ａを収容する培養槽１０と；
　前記培養槽１０に設けられ、培地を供給する培地供給口１１３と；
　前記培養槽１０の側部に設けられ、前記培地を排出する培地排出口１０１と；
　前記培地供給口１１３と連通し、前記培養槽１０の外部に設けられた培地供給槽４０と；
　前記培地排出口１０１と連通し、前記培地排出口１０１から排出される前記培地を回収する培地回収槽６０、を備え、
　前記培地排出口１０１は、前記培地をオーバーフローさせて排出することを特徴とする。このような細胞培養装置を用いれば、新鮮な培地を継続的に供給することが可能である一方、供給された培地の量に応じて、培養槽に設けられた培地排出口から、細胞培養後の培地を連続的に回収することが可能となり、長期間の細胞培養が実現可能となる。また、従来の培地交換のように細胞が産生した細胞増殖等に必要なタンパク質の濃度が急激に変化することが防止され、培養によって消費された培地中の栄養分（例えば、グルコース等）は継続的に供給され、好ましい細胞培養環境を維持することができる。
　上記例示的なオーバーフロー型バイオリアクター（図６）では、培地排出口１０１から、培地をオーバーフローさせて排出することを特徴とするが、排出口コネクタ１０４からの排出される培地を培地回収槽６０に回収するために接続された培地排出管５０にポンプ３２を備えることにより、細胞培養後の培地を強制的に回収することも可能である（図８参照）。
　別の実施形態では、図６及び図８に示されるような培養槽本体１００を構成する側部１０２に培地排出口１０１を設けることなく、細胞培養液の上面に培地排出管５１（例えば、内径１ｍｍ外径２ｍｍのチューブ）を内部に貫通し、保持可能なガイド５２を備えたオーバーフロー型バイオリアクター（図７）が提供される。このバイオリアクターでは、細胞培養後の培地を上側から液抜きをすることにより、培地の高さを調整することができる。
Ｃ．小片ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養法
　本発明の細胞培養法は、細胞を小片ポリマー多孔質膜に適用し、培養する方法であって、攪拌等による振盪を必要としないことを特徴とする。さらに、細胞自体又は細胞を担持させた小片ポリマー多孔質膜を回収することなく、新鮮な培地の供給、及び培養後の培地を簡便に回収することが可能であり、静的な状態で長期間、培養を行うことができる。本明細書において、「培地」とは、細胞、特に動物細胞を培養するための細胞培養培地のことを指す。培地は、細胞培養液と同義の意味として用いられる。そのため、本発明において用いられる培地とは、液体培地のことを指す。培地の種類は、通常使用される培地を使用することが可能であり、培養する細胞の種類によって適宜決定される。
　本発明によれば、細胞の小片ポリマー多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、細胞を小片ポリマー多孔質膜に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法において、細胞の小片ポリマー多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。
　（Ａ）細胞培養容器に添加した小片ポリマー多孔質膜上に、細胞懸濁液を注入する態様；
　（Ｂ）細胞培養容器に注入された細胞懸濁液に小片ポリマー多孔質膜を添加する態様。
　ポリマー多孔質膜の表面に播種された細胞は、小片ポリマー多孔質膜に接着し、多孔の内部に入り込んでいく。好ましくは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞は小片ポリマー多孔質膜に接着する。小片ポリマー多孔質膜の表面に播種された細胞は、膜の表面及び／又は内部において安定して生育・増殖することが可能である。細胞は生育・増殖する膜の位置に応じて、種々の異なる形態をとり得る。また、使用される小片ポリマー多孔質膜を予め細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤されておいてもよい。
　限定されるわけではないが、好ましくは、小片ポリマー多孔質膜には生細胞が選択的に留まる。よって、本発明の方法の好ましい実施形態において、生細胞が前記小片ポリマー多孔質膜内に留まり、死細胞は細胞懸濁液中に残存し、培地をフローさせることにより、又は培地を入れ替えるによって死細胞を除去することができる。
　上記の滅菌された液体は特に限定されないが、滅菌された緩衝液若しくは滅菌水である。緩衝液は、例えば、(+)及び(-)Dulbecco’s PBS 、(+)及び(-)Hank's Balanced Salt Solution等である。緩衝液の例を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明の方法において、細胞の小片ポリマー多孔質膜への適用は、浮遊状態にある接着性細胞を小片ポリマー多孔質膜と懸濁的に共存させることにより細胞を膜に付着させる態様（絡め取り）を含む。細胞培養培地が液体の場合、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態になり得るが、細胞を付着させた小片ポリマー多孔質膜は、培地中で速やかに下降し、互いに多重に集積して、細胞培養容器の底部に沈み、その状態を維持し得る。
　また、小片ポリマー多孔質膜を収容した細胞培養容器（例えば、上記細胞培養装置の培養槽）中の培地の高さ（培地レベル）を容易に調節することができるため、例えば、培地レベルを高くすることにより低酸素環境を好む間葉系幹細胞の培養効率を上昇させることが可能である。
　本発明の細胞培養法は、培地を攪拌機等で積極的に振盪させる必要がないこと、及び小片ポリマー多孔質膜が分散及び／又は多重に集積した状態で細胞培養容器の底部に沈み得ることから、例えば、オーバーフロー型バイオリアクターを用いる培養系では、新鮮な培地を継続的に供給することが可能である一方、供給された培地の量に応じて、培養槽に設けられた培地排出口から、細胞培養後の培地を連続的に回収することが可能となり、長期間の細胞培養が実現可能となる。これは、間歇型バイオリアクターを用いた場合も同様であり、所定の時間間隔で新鮮な培地を供給し、細胞培養後の培地を定期的に回収することができ、長期間の細胞培養が可能である。
　また、細胞培養を継続しながら、細胞を担持していない新鮮な小片ポリマー多孔質膜を細胞培養容器に注加することにより、細胞は、新たに注加された小片ポリマー多孔質膜に移動及び接着して、さらに増殖することができる（拡大培養）。
　このように、本発明の細胞培養法では、小片ポリマー多孔質膜を用いることによって、培地の流通性が良好となり、大量の細胞を培養可能となる。それに伴って、所望の物質（タンパク質、エクソソーム等）の産生を増大させることができる。後述する実施例１に示されるように、小片ポリマー多孔質膜に播種したヒト間葉系幹細胞は順調に増殖し、実施例２に示されるように、同細胞を長期培養したところ、該細胞からのエクソソームが長期に亘り、安定して産生することがわかった。
Ｄ．細胞培養法に使用するためのキット
　本発明はさらに、小片ポリマー多孔質膜を含む、細胞培養法に使用するためのキットを提供する。本発明のキットは、小片ポリマー多孔質膜の他に、細胞培養に必要な構成要素を適宜含みうる。例えば、小片ポリマー多孔質膜に適用する細胞、細胞培養培地、細胞培養装置、キットの取り扱い説明書などが含まれる。限定されるわけではないが、一態様として、透明なパウチ内に滅菌された小片ポリマー多孔質膜が保存され、そのままで細胞培養に使用可能な形態を含むパッケージや、あるいは、同パウチ内に小片ポリマー多孔質膜とともに滅菌液体が封入されており、効率的吸込み播種が可能になっている膜・液体の一体型形態のキットを含む。
定義
　本明細書において、「懸濁された細胞」とは、例えば、トリプシン等のタンパク質分解酵素によって、接着細胞を強制的に浮遊させて培地中に懸濁して得られた細胞や、公知の馴化工程によって、培地中に浮遊培養可能となった接着細胞などを含んでいる。
　本発明に利用し得る細胞の種類は、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される。動物細胞は、脊椎動物門に属する動物由来の細胞と無脊椎動物（脊椎動物門に属する動物以外の動物）由来の細胞とに大別される。本明細書における、動物細胞の由来は特に限定されない。好ましくは、脊椎動物門に属する動物由来の細胞を意味する。脊椎動物門は、無顎上綱と顎口上綱を含み、顎口上綱は、哺乳綱、鳥綱、両生綱、爬虫綱などを含む。好ましくは、一般に、哺乳動物と言われる哺乳綱に属する動物由来の細胞である。哺乳動物は、特に限定されないが、好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどを含む。
　本発明に利用しうる動物細胞の種類は、限定されるわけではないが、好ましくは、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、及び生殖細胞からなる群から選択される。
　本明細書において「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称することを意図する。限定されるわけではないが、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等を含む。好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は倫理的な問題もない等の理由により特に好ましい。多能性幹細胞としては公知の任意のものを使用可能であるが、例えば、国際公開第２００９／１２３３４９号（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５７０４１）に記載の多能性幹細胞を使用可能である。
　「組織幹細胞」とは、分化可能な細胞系列が特定の組織に限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力（分化多能性）を有する幹細胞を意味する。例えば骨髄中の造血幹細胞は血球のもととなり、神経幹細胞は神経細胞へと分化する。このほかにも肝臓をつくる肝幹細胞、皮膚組織になる皮膚幹細胞などさまざまな種類がある。好ましくは、組織幹細胞は、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択される。
　「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞のことを言う。有性生殖においては次世代へは受け継がれない。好ましくは、体細胞は、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される。
　「生殖細胞」は、生殖において遺伝情報を次世代へ伝える役割を持つ細胞を意味する。例えば、有性生殖のための配偶子、即ち卵子、卵細胞、精子、精細胞、無性生殖のための胞子などを含む。
　細胞は、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択してもよい。「肉腫」とは、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血液等の非上皮性細胞由来の結合組織細胞に発生する癌で、軟部肉腫、悪性骨腫瘍などを含む。肉腫細胞は、肉腫に由来する細胞である。「株化細胞」とは、長期間にわたって体外で維持され、一定の安定した性質をもつに至り、半永久的な継代培養が可能になった培養細胞を意味する。ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＬ－６０細胞（ヒト白血球細胞由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞由来）、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞株）、ＢＨＫ細胞（新生児ハムスター腎臓細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス胎児線維芽細胞由来）などヒトを含む様々な生物種の様々な組織に由来する細胞株が存在する。「形質転換細胞」は、細胞外部から核酸（ＤＮＡ等）を導入し、遺伝的性質を変化させた細胞を意味する。
　本明細書において、「接着細胞」とは、一般に、増殖のために適切な表面に自身を接着させる必要がある細胞であって、付着細胞又は足場依存性細胞ともいわれる。本発明のいくつかの実施形態では、使用する細胞は接着細胞である。本発明に用いられる細胞は、接着細胞であって、より好ましくは、培地中に懸濁した状態でも培養可能な細胞である。懸濁培養可能な接着細胞とは、公知の方法によって、接着細胞を懸濁培養に適した状態へ馴化させることによって得ることが可能であり、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などや、これらの細胞から派生して得られた細胞株が挙げられる。
　本発明の細胞培養法では、小片ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、培養することにより、小片ポリマー多孔質膜の有する内部の多面的な連結多孔部分や表面に、大量の細胞が生育するため、大量の細胞を簡便に培養することが可能となる。また、本発明に用いられる、小片ポリマー多孔質膜に播種された細胞は、従来は死滅するような攪拌条件でも生育可能な環境を提供し、細胞を大量に培養することが可能となる。
　本明細書において、細胞を含まない小片ポリマー多孔質膜がその内部間隙の体積も含めて空間中に占める体積を「見かけ上小片ポリマー多孔質膜体積」と呼称する。そして、小片ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、小片ポリマー多孔質膜の表面及び内部に細胞が担持された状態において、小片ポリマー多孔質膜、細胞、及び小片ポリマー多孔質膜内部に浸潤した培地が全体として空間中に占める体積を「細胞生存域を含む小片ポリマー多孔質膜体積」と呼称する。膜厚２５μｍの小片ポリマー多孔質膜の場合、細胞生存域を含む小片ポリマー多孔質膜体積は、見かけ上ポリマー小片ポリマー多孔質膜より、最大で５０％程度大きな値となる。本発明の方法では、１つの細胞培養容器中に複数（少なくとも２個、例えば、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１×１０3、２×１０3、３×１０3、４×１０3、５×１０3、７×１０3、１×１０4、２×１０4、３×１０4、５×１０4、７×１０4、１×１０5、２×１０5、３×１０5、５×１０5、７×１０5、１×１０6、２×１０6、３×１０6、５×１０6、７×１０6、１×１０7個、又はそれらを超える）の小片ポリマー多孔質膜を収容して培養することができるが、その場合、細胞を担持した複数の小片ポリマー多孔質膜のそれぞれについての細胞生存域を含む小片ポリマー多孔質膜体積の総和を、単に「細胞生存域を含む小片ポリマー多孔質膜体積の総和」と記載することがある。
　本発明の方法を用いることにより、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含む小片ポリマー多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することが可能となる。また、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含む小片ポリマー多孔質膜体積の総和の１０００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。さらに、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含む小片ポリマー多孔質膜体積の総和の１００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。そして、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含む小片ポリマー多孔質膜体積の総和の１０倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。
　つまり、本発明によれば、細胞培養する空間（容器）を従来の二次元培養を行う細胞培養装置に比べて極限まで小型化可能となる。また、培養する細胞の数を増やしたい場合は、積層する小片ポリマー多孔質膜の枚数を増やす等の簡便な操作により、柔軟に細胞培養する体積を増やすことが可能となる。本発明に用いられる小片ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置であれば、細胞を培養する空間（容器）と細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）とを分離することが可能となり、培養する細胞数に応じて、必要となる量の細胞培養培地を準備することが可能となる。細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）は、目的に応じて大型化又は小型化してもよく、あるいは取り替え可能な容器であってもよく、特に限定されない。
　本明細書において、細胞の「大量培養」とは、例えば、小片ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数が、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして、培地１ミリリットルあたり１．０×１０5個以上、１．０×１０6個以上、２．０×１０6個以上、５．０×１０6個以上、１．０×１０7個以上、２．０×１０7個以上、５．０×１０7個以上、１．０×１０8個以上、２．０×１０8個以上、５．０×１０8個以上、１．０×１０9個以上、２．０×１０9個以上、又は５．０×１０9個以上となるまで培養することをいう。
　なお、培養中又は培養後の細胞数を計測する方法としては、種々の公知の方法を用いることができる。例えば、小片ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数を、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして計測する方法としては、公知の方法を適宜用いることができる。例えば、ＣＣＫ８（次文参照）を用いた細胞数計測法を好適に用いることができる。具体的には、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｉｇ　Ｋｉｔ８；同仁化学研究所製溶液試薬（以下、「ＣＣＫ８」と記載する。）を用いて、小片ポリマー多孔質膜を用いない通常の培養における細胞数を計測し、吸光度と実際の細胞数との相関係数を求める。その後、細胞を適用し、培養した小片ポリマー多孔質膜を、ＣＣＫ８を含む培地に移し、１～３時間インキュベータ内で保存し、上清を抜き出して４６０ｎｍの波長にて吸光度を測定して、先に求めた相関係数から細胞数を計算する。
　また、別の観点からは、細胞の「大量培養」とは、例えば、小片ポリマー多孔質膜を用いた培養後に小片ポリマー多孔質膜１平方ミリメートルあたりに含まれる細胞数が１．０×１０3個以上、２．０×１０3個以上、１．０×１０4個以上、２．０×１０4個以上、５．０×１０4個以上、１．０×１０5個以上、２．０×１０5個以上、５．０×１０5個以上、１．０×１０6個以上、２．０×１０6個以上、又は５．０×１０6個以上となるまで培養することをいう。小片ポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数は、上述のＣＣＫ８等の公知の方法を用いて適宜計測することが可能である。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
　以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。なお本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
　以下の実施例において小片ポリマー多孔質膜の作製に使用したポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分である３，３’，４，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ－ＢＰＤＡ）とジアミン成分である４，４’－ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）とから得られるポリアミック酸溶液と、着色前駆体であるポリアクリルアミドとを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより、調製された。得られたポリイミド多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、当該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、表面層Ａに存在する孔の平均孔径は１９μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は４２μｍであり、膜厚が２５μｍであり、空孔率が７４％であった。
実施例１：ヒト間葉系幹細胞の小片ポリマー多孔質膜を用いた培養法及びエクソソーム産生
（１）小片ポリイミド多孔質膜の作製
　塚谷刃物製作所製フレキシブルピナクルダイＡＰタイプ平抜用；１ｍｍ×１ｍｍ（刃のスペックは以下参照）を用意し、マグネットプレート上に磁力で固定して、簡易式抜き機（ＲＤＣ　ＦＢタイプ）を使用して宇部興産製ポリイミド多孔質膜（２５μｍ厚）を切断加工することがで、１ｍｍ×１ｍｍの小片ポリイミド多孔質膜を準備した。
刃スペック
　刃高　０．８ｍｍ
　刃深度　０．４ｍｍ
　エッチング深度　０．６ｍｍ
　ベース厚　０．２ｍｍ
　刃角度　４０°
（２）間葉系幹細胞の準備と小片ポリイミド多孔質膜への播種
　ロンザ社製ヒト間葉系幹細胞（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ（商標））を、ＩＷＡＫＩ製コラーゲンタイプ１コートディッシュにて２継代し、トリプシン処理をして培地（コージンバイオ社製ゼノフリー培地；ＡＤＳＣ－４　４ｍｌ）にて細胞（４．０×１０6細胞）を懸濁した。コーニング製１５０ｍｌ滅菌ボトル内で、事前に滅菌的に同培地５０ｍｌにて湿潤し、インキュベータ内で３０分間振盪懸濁したポリイミド多孔質膜小片（２００ｃｍ2）に上記細胞培養を注加した。注加後、数回振り交ぜた後、ＣＯ2インキュベータ内で静置して培養を開始した。
（３）培養の継続
　２日若しくは３日の１度のペースで上記培地（ＡＤＳＣ－４）に１０００ｍｇ／Ｌのグルコースを加えた培地５０ｍｌを交換し、培養を１８日間継続した。培養過程で、グルコース消費量と乳酸産生量を継続的に測定し、順調な細胞増殖を確認した（図１）。
（４）小片ポリイミド多孔質膜上の細胞数確認と小片多孔質膜からの細胞回収
　培養開始から１８日後に、同仁化学研究所製Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８による呈色反応を利用して、小片ポリイミド多孔質膜上に生育する細胞数を検証したところ、生育する総細胞数は、４．６×１０6細胞であった。この細胞が生育するシートに、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製ＴｒｙｐＬＥ（商標）を２５ｍｌ注加し、５０分間インキュベータ内で放置した後に懸濁液を回収し、更にＴｒｙｐＬＥ（商標）１０ｍｌで小片を洗浄して細胞回収を実行した。回収した細胞数は、２．３×１０6細胞（細胞回収率５０％）であった。回収した細胞は、コラーゲンコートディッシュにて培養が可能であった。
（５）エクソソーム数の測定
　回収した細胞培養液を高速冷却遠心機（久保田商事株式会社製、Ｍｏｄｅｌ　６０００）を用いて４℃で３０分間、１０，０００ｇで遠心分離を行い、デブリスを除去した（調製液１）。０．０２５μｍのフィルタ（メルク社製、製品名：ＭＦ－ミリポアメンブレンフィルタ、型番：ＶＳＷＰ０４７００）を用いた吸引濾過により微粒子を除去したＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬株式会社製、販売元コード：１６６－２３５５５）を用いて、「調製液１」を所定の濃度に希釈した（調製液２）。次いで「調製液２」を０．２μｍのシリンジフィルタ（ザルトリウス社製、製品名：ミニザルト、型番：１６５３４Ｋ）を用いて２００ｎｍ以上の粒子を除去した（調製液３）。ゼータ電位・粒径分布測定装置（株式会社マイクロテックニチオン製、ＺＥＥＣＯＭ　ＺＣ－３０００）を用いて、ブラウン運動軌跡解析から、「調製液３」に含まれる粒子の粒径分布及びエクソソーム画分の粒子数を測定した。１日当たりのエクソソーム産生量は、以下に示す「式１」にて算出した。
　式１：粒子数×サンプル希釈倍率×１５０ｎｍ以下の粒子の割合／培地溜め込み日数
実施例２
（１）小片ポリイミド多孔質膜を用いる長期培養
　実施例１と同様の方法を用いて、ヒト間葉系幹細胞の長期培養を行い、経時的に培地を回収してエクソソームを取得した。培養期間を通じて安定したエクソソーム取得が可能であった（図２）。培養開始後７６日の総細胞数は、４．８２×１０6細胞であった。実験期間中の細胞数変化を図３に示す。
（２）小片ポリイミド多孔質膜上の細胞の幹性検証
　小片ポリイミド多孔質膜で培養したヒト間葉系幹細胞の幹性検証の為、期間の異なる培養サンプルを一部回収し、脂肪細胞及び骨芽細胞への分化誘導を実施した。結果を図４に示す。培養期間を通じた幹性の維持が確認された。
比較例１：ヒト間葉系幹細胞のポリマー多孔質膜を用いた培養法
（１）１ｃｍ角のポリイミド多孔質膜を用いた場合の培養
　実施例１に記載の１ｍｍ角の小片ポリイミド多孔質膜の代わりに１ｃｍ角のポリイミド多孔質膜を２００枚用意し、実施例１の実験と同じ細胞を同細胞密度で播種して比較実験を実施した。１８日後の培養総細胞数は、３．０×１０6細胞であった。
（２）１ｃｍ角のポリイミド多孔質膜からの間葉系幹細胞の回収
　実施例１と同様にＴｒｙｐＬＥ（商標）を用いる細胞回収実験を行ったところ、遊離回収された細胞数は、１．０×１０6細胞（細胞回収率３３％）であった。
（３）代謝面での比較
　実施例１及び比較例１のグルコース消費の比較データを図１に示す。培養期間を通じて、小片ポリイミド多孔質膜での培養に於いて高いグルコース消費が行われていることが確認された。
実施例３：ヒト皮膚線維芽細胞の小片ポリイミド多孔質膜を用いた培養法
（１）皮膚線維芽細胞の準備と細胞播種
　６０ｃｍ2シャーレにて培養したヒト成人皮膚線維芽細胞を、トリプシンを用いて剥離・回収し、ＬＩＦＥＬＩＮＥ社製ゼノフリー培地ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ　３ｍｌを加えて細胞懸濁液（３．０×１０6細胞）を準備した。事前に滅菌的に同培地２５ｍｌにて湿潤し、インキュベータ内で３０分間振盪懸濁したポリイミド多孔質膜小片（３００ｃｍ2）に上記細胞培養を注加した。注加後、数回振り混ぜた後、ＣＯ2インキュベータ内で静置して培養を開始した。
（２）皮膚線維芽細胞の小片ポリイミド多孔質膜培養
　２日若しくは３日毎に培地交換を行い、１５日以降は毎日培地交換を実施した。ＣＣＫ８を用いた呈色による総細胞数の変化を図５に示す。安定的な細胞成長が観測された。
実施例４：ハイブリドーマの小片ポリイミド多孔質膜を用いた間歇式培養法
（１）ハイブリドーマの準備と小片多孔膜への播種
　ＪＣＲＢ細胞バンク製ハイブリドーマ（ＳＣ７８．Ｈ８１.Ｃ８１.Ａ９）をＣｏｒｎｉｎｇ社製細胞培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ（商標））およびＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ社製１２５ｍＬエルレンマイヤーで８継代（富士フイルム和光純薬社製ＲＰＭＩ－１６４０にＧｉｂｃｏ（商標）製ＥＳ Ｃｅｌｌ ＦＢＳ １０％添加した培地で４継代した後、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ社製無血清培地ＣＤ　ＨｙｂｒｉｄｏｍａにＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ社製ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）を８ｍＭ添加した培地で更に４継代）し、生細胞密度１．１７×１０6細胞／ｍＬ（生細胞率：８７％）の浮遊細胞液を準備した。Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ社製１２５ｍＬエルレンマイヤー（型番；４１１５－０１２５）へ、精製水で湿潤した１×１ｍｍ小片多孔膜１２０ｃｍ２のγ線滅菌体を滅菌的に移送し、上記培地（８ｍＭ　ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）添加ＣＤ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）を１０ｍＬ注加してＣＯ2インキュベータ内で３０分間振盪して膜の湿潤を完了した。その後、上記培地を排出除去し、エルレンマイヤーフラスコ槽内での湿潤膜準備を完了した。槽内に上記細胞懸濁液２０ｍＬを注加し数回振り交ぜた後、ＣＯ2インキュベータ内で１日間静置して細胞の小片多孔膜吸着工程を完了した。層内に残留液部を全量排出除去し、上記培地（８ｍＭ　ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）添加ＣＤ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）を２０ｍＬ注加後、ＣＯ2インキュベータ内で静置して培養を開始した。
（２）代謝物及び抗体産生量の測定
　培養開始後、２日目と６日目に細胞培養液を少量サンプリングして、ロッシュ社製ＣｅｄｅｘＢｉｏを用いて培養液中のグルコース濃度、乳酸濃度および抗体産生量を測定し、代謝状況を検証した。良好な細胞の生着と増殖が確認され（表２）、また、効率的に抗体産生が進行する事を確認した。ハイブリドーマが小片多孔膜で培養可能であり連続的な抗体産生に適用可能である事が示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（３）小片多孔膜の細胞数測定
　培養日数６日目の小片多孔膜を富士フイルム和光純薬社製Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２培地（グルタミン・フェノールレッド含有）１０ｍＬで２回洗浄して浮遊細胞を除去した後、株式会社同仁化学研究所製のＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８を用いた呈色反応により小片多孔膜に接着している生細胞密度を測定し１．６４×１０３細胞／ｃｍ２の細胞密度で、総数は１．９７×１０５細胞の生細胞が観察された。洗浄によって容易に剥離されない細胞が小片多孔膜に接着・生着していることが確認された。
実施例５：ハイブリドーマの小片ポリイミド多孔質膜を用いた間歇式培養法
（１）ハイブリドーマの準備と小片多孔膜への播種
　実施例新１と同様の方法で細胞及び小片多孔膜を準備し、培養槽への注加後に、ＣＯ２インキュベータ内でＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ社製シェーカー（ＭａｘＱ ２００　ＣＯ２Ｐｌｕｓ）上にて５０ｒｐｍで２４時間振盪し、その後静置培養に移行した。移行後は実施例４と同様の操作で培養を実行した。
（２）代謝物及び抗体産生量の測定
　実施例４と同様の方法でサンプルを取得し、代謝物及び産生された抗体量の測定を行い、細胞の生着と良好な増殖を確認した。優れた抗体産生力が確認された（表３）。運動条件を用いる細胞吸着過程を経ることで、より効率的に小片多孔膜培養が実施され、効率的な抗体産生等に適用可能であることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（３）小片多孔膜の細胞数測定
　実施例４と同様の方法で小片多孔膜に接着した生細胞密度を測定したところ、１．４１×１０３細胞／ｃｍ２の細胞密度で、総数は１．７０×１０５細胞の生細胞が観察された。複数回の洗浄によっても容易に剥離されない状態でハイブリドーマが小片多孔膜に接着・生着していることが確認された。
実施例６：小片ポリイミド多孔質膜連続培養法＿ハイブリドーマ
（１）ハイブリドーマの準備と小片多孔膜への播種
　ＪＣＲＢ細胞バンク製ハイブリドーマ（ＳＣ７８．Ｈ８１.Ｃ８１.Ａ９）をＣｏｒｎｉｎｇ社製細胞培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ（商標））およびＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ社製１２５ｍＬエルレンマイヤーで１０継代（ＦＢＳ　１０％添加ＲＰＭＩ－１６４０培地で４継代した後、８ｍＭ　ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）添加ＣＤ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地で６継代）浮遊細胞培養して、生細胞密度１．１１×１０6細胞／ｍＬ（生細胞率：７８％）の浮遊細胞液を準備した。精製水で湿潤した１×１ｍｍ小片多孔膜１２０ｃｍ２の滅菌体を充填した図７に示すオーバーフローリアクターに上記細胞懸濁液２０ｍＬを注加した。注加後、培養槽部分を数回振り交ぜた後、ＣＯ2インキュベータ内で３０分間静置して培養を開始した。また、図８に示す装置も同様に使用可能であった。
（２）連続培養の実施
　１日あたり約２０ｍＬのペースで上記培地（８ｍＭ　ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）添加ＣＤ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）をリアクター内へ連続的に供給し、抜出ポンプ（アズワン製チューブポンプ）を利用して液面高を制御することで、培養槽内の培地量を一定に保ちながら連続的に培地回収を行った。
　同様に、図８の装置を用いた場合には、図面右サイドのポンプがある場合には、排出ポンプとして、無い場合（図６）には自然流出として、同様の液面制御にて一定量の槽内培地にて安定した培養環境を保つことが可能となる。
（３）代謝物の測定
　抜き出した培養液は１日に１度のペースで回収し、ロッシュ社製ＣｅｄｅｘＢｉｏを用いて回収液中のグルコース濃度、乳酸濃度および抗体産生量を測定した。結果を表４に示す。培養期間を通じて、安定的かつ効率的にグルコース消費・乳酸産生が進行し、同時に、良好な抗体産生が安定的かつ連続的に実施されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（４）小片多孔膜の細胞数測定
　培養日数５日目にリアクター内の培地を除去し、残留した小片多孔膜を富士フイルム和光純薬社製Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２培地（グルタミン・フェノールレッド含有）１０ｍＬで２回洗浄して表面から離脱可能な浮遊細胞を除去した後、株式会社同仁化学研究所製のＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８を用いた呈色反応により細胞数測定を実施した。この方法で細胞密度を測定すると１．４６×１０３細胞／ｃｍ２、総数は１．７５×１０５細胞の生細胞が、洗浄によっても容易に剥離されない状態で小片多孔膜に接着・生着していることが確認された。
実施例７：小片ポリイミド多孔質膜での皮膚線維芽細胞による細胞培養とタンパク産生
（１）小片多孔膜準備と細胞培養
ヒト皮膚線維芽細胞（ＬＯＮＺＡ社製；Ｌｏｔ．Ｎｏ．１８ＴＬ２１５６７５）を、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製細胞培養ＦＡＬＣＯＮディッシュにて５継代し、トリプシン処理をして培地（ロンザ社製ＦＧＭ－２　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ　１．２ｍｌ）にて細胞（１．２×１０６細胞）を懸濁した。コーニング製１２５ｍｌ滅菌ボトル内で、事前にＤ－ＰＢＳ（富士フイルム和光純薬株式会社）５０ｍｌにて滅菌的にポリイミド小片多孔質膜（１２０ｃｍ２）をＣＯ２インキュベータ内で湿潤し、Ｄ－ＰＢＳを除去した後、上記の培地（ロンザ社製ＦＧＭ－２　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）を１０ｍｌ注加した。この多孔膜を含む培地を同インキュベータ内で更に３０分間放置した後、上記の細胞懸濁液１．２ｍｌを注加した。注加後、数回振り交ぜた後、同インキュベータ内で一晩静置し、翌日、上記の培地（ロンザ社製ＦＧＭ－２　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）を２０ｍｌ注加して、長期培養を開始した。
（２）培養の継続
　週に１度のペースで上記の培地（ＦＧＭ－２　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）３０ｍｌを交換し、培養を１８日間継続した。培養過程で、グルコース消費量と乳酸産生量を測定し、順調な細胞増殖を確認した。
（３）フィブロネクチン産生量の測定
　回収した細胞培養液を用いて、５日目、１３日目、１８日目のフィブロネクチン産生量をＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ製　Ｃａｔ：ＭＫ１１５）を使用して測定した。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
実施例８：軟骨細胞の小片多孔膜培養
　滅菌済みポリイミド多孔質膜小片（１ｍｍ×１ｍｍ）１２０ｃｍ２を入れたＣｏｒｎｉｎｇ社製１２５ｍｌ角型ＰＥＴ製ストレージボトル（４５ｍｍキャップ付き）を準備する。この小片多孔膜の入った角型滅菌ボトルに培地（コージンバイオ社製ゼノフリー培地；ＫＢＭ　ＡＤＳＣ－４Ｒ）にグルコース液（富士フイルム和光純薬株式会社製；４５ｗ／ｖ％　Ｄ（＋）－グルコース溶液）を注加し、総グルコース濃度が３０００ｍｇ／Ｌに調整した調整培地３０ｍｌを注加して、小片を十分に培地となじませる。
　ＩＷＡＫＩ コラーゲンＩコート ディッシュで培養した４継代目のＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製ヒト軟骨細胞（Ｙ３０　ｆｅｍａｌｅ　４３９Ｚ０３７．３）をＧｉｂｃｏ社製Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（０．０５％）、フェノールレッドを使用して剥がし、遠心・細胞回収後、前記調整培地（グルコース注加ＫＢＭ　ＡＤＳＣ－４Ｒ）で懸濁した。ポリイミド多孔質膜小片の面積１ｃｍ２あたり１．０×１０４細胞（Ｔｏｔａｌ；１．２×１０６細胞）の細胞懸濁液を１ｍｌあたり１．０×１０６細胞の懸濁細胞密度で注加した。注加後、小片多孔膜を含む培養槽角型ボトルをＣＯ２インキュベータ内に移送し、静置培養を開始する。
　週２回のペースで３０ｍｌの培地交換を行い、培養を継続した。８日、１５日、２０日、３５日に、同仁化学研究所製Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８による呈色反応を利用して、多孔膜小片に生育している総細胞数を測定した。増殖状況を図９に示す。ヒト軟骨細胞が良好な細胞生育状況を確認した。小さな培養容器の静置培養で、安定的かつ長期間、大量の細胞を簡便かつ容易に長期に亘って培養可能である事が示された。
　また、培養１９日目に於ける回収培地内のエクソソーム産生量をヒト由来エクソソーム定量用ＣＤ９／ＣＤ６３ＥＬＩＳＡ キット（コスモバイオ社製；品番＿ＥＸＨ０１０２ＥＬ）にてエクソソーム産生量をＣＤ６３のタンパク量として測定したところ、３日間溜め込みで、１１７ｐｇ／ｍｌのエクソソーム産生が確認された。前述の連続培養系と同様に間歇培養系に於いても、効率的かつ安定的なエクソソーム産生が確認された。
実施例９：ヒト皮膚線維芽細胞の小片多孔膜培養と細胞回収
（１）小片多孔膜準備と細胞準備
　住友ベークライト社製５０ｍｌ遠沈管（スクリューキャップコニカルチューブ）内に滅菌したポリイミド小片多孔質膜（３００ｃｍ２）を滅菌的に移送し、ＰＢＳ１２ｍｌを注加して膜を湿潤させる。１時間後、ＰＢＳを吸引除去し、膜準備を完了する。
　ヒト皮膚線維芽細胞（ＬＯＮＺＡ社製；Ｌｏｔ．Ｎｏ．１８ＴＬ２１５６７５）を、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製細胞培養ＦＡＬＣＯＮディッシュにて２継代し、トリプシン処理をして培地（Ｌｉｆｅｌｉｎｅ社製ＦｉｂｒｏＬｉｆｅ（登録商標） Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｋｉｔ）にグルコース液を加え２０００ｍｇ／Ｌに調整した培地３．０ｍｌにて細胞（３．０×１０６細胞）を懸濁した。
（２）細胞播種及び細胞培養
　先にコニカルチューブ内に準備した小片多孔膜に前記培地１０ｍｌ及び上記懸濁細胞を加え数回緩やかに振り交ぜた後、ＣＯ２インキュベータ内で終夜放置する。翌日、細胞が吸着した小片ポリイミド多孔質膜をコーニング製１５０ｍｌ滅菌ボトル内に移送し、更に２０ｍｌの培地を加えて培養を開始する。週２回のペースで培地交換（容量３０ｍｌ）を行い、２日、６日、９日、１４日に、同仁化学研究所製Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８による呈色反応を利用して、多孔膜小片に生育している総細胞数を測定した。各測定日のボトル内小片ポリイミド多孔質膜に生育しているヒト皮膚線維芽細胞の１ｃｍ２当たりの細胞密度及びボトル内の総細胞数を測定し、細胞の生育状況を確認した。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（３）小片多孔膜からの細胞回収と継代
　培養開始後１５日目に、ボトル内の培地を排除し、ＰＢＳ２０ｍｌでボトル内の小片多孔膜を洗浄した後、同ＰＢＳを吸引排除する。引き続き、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製ＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）を１５ｍｌ注加し、ＣＯ２インキュベータ内で４０分放置する。細胞が遊離して白濁した上清を回収し、更に前記培地２５ｍｌで小片多孔膜を洗浄して、遊離細胞を回収した。遠心分離後前記培地３ｍｌで懸濁して細胞数測定を実施した所、３．６ｘ１０６個の生細胞を確認した。回収した本細胞を培養プレート及び小片ポリイミド多孔質膜に播種し、細胞の生育を確認した。
　１ａ　　細胞培養装置
　１０　　培養槽
　１００　　培養槽本体
　１０１　　培地排出口
　１０２　　側部
　１０３　　底部
　１０４　　排出口コネクタ
　１１０　　培養槽蓋体
　１１１　　第１蓋体コネクタ
　１１２　　第１培地供給管
　１１３　　培地供給口
　１１４　　第１通気管
　１１５　　第１通気フィルタ
　１２０　　培養後の培地
　１２１　　培地レベル
　２００ａ　　小片ポリマー多孔質膜
　３０　　第２培地供給管
　３１　　第３培地供給管
　３２　　ポンプ
　４０　　培地供給槽
　４００　　新鮮培地
　４１　　培地供給槽蓋体
　４１０　　第２蓋体コネクタ
　４１１　　第２通気管
　４１２　　第２通気フィルタ
　５０、５１　　培地排出管
　５２　　ガイド
　６０　　培地回収槽
　６１　　培地回収槽蓋体
　６１０　　第３蓋体コネクタ
　６１１　　第３通気管
　６１２　　第３通気フィルタ
　７０　　培養槽設置台

Claims (14)

  1. 　小片ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、培養することを含む、攪拌を必要としない細胞培養法であって、
    　ここで、前記小片ポリマー多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造の小片ポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通するものであり、
    　前記表面層Ａ又は表面層Ｂの面積が４ｍｍ2以下であり、
    　培養液中で前記小片ポリマー多孔質膜が分散し及び／又は小片ポリマー多孔膜同士が多重に集積し、細胞培養容器の底部に分散及び／又は積層される、細胞培養法。
  2. 　間歇的に又は連続的に培地を交換することにより長期培養を行う、請求項１に記載の細胞培養法。
  3. 　前記小片ポリマー多孔質膜に接着させた細胞を増殖された後、酵素処理により細胞を剥離し、細胞を接着させていない小片ポリマー多孔質膜を細胞培養容器に添加することにより、細胞を継代させて大量培養を行う、請求項１又は２に記載の細胞培養法。
  4. 　前記小片ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１～１００μｍの複数の細孔を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞培養法。
  5. 　前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１～５０μｍである、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞培養法。
  6. 　前記表面層Ｂの平均孔径が、２０～１００μｍである、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞培養法。
  7. 　前記小片ポリマー多孔質膜の総膜厚が、５～５００μｍである、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞培養法。
  8. 　前記小片ポリマー多孔質膜が、小片ポリイミド多孔質膜である、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞培養法。
  9. 　前記小片ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、小片ポリイミド多孔質膜である、請求項８に記載の細胞培養法。
  10. 　前記小片ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色した小片ポリイミド多孔質膜である、請求項８又は９に記載の細胞培養法。
  11. 　細胞によりエクソソームを産生させることを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞培養法。
  12. 　小片ポリマー多孔質膜を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の細胞培養法に使用するための細胞培養装置。
  13. 　小片ポリマー多孔質膜を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の細胞培養法に使用するためのキット。
  14. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法によって取得したエクソソーム。
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