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WO2018021362A1 - 脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制する方法、当該細胞の調製方法、及び物質の産生方法 - Google Patents

脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制する方法、当該細胞の調製方法、及び物質の産生方法 Download PDF

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Publication number
WO2018021362A1
WO2018021362A1 PCT/JP2017/026942 JP2017026942W WO2018021362A1 WO 2018021362 A1 WO2018021362 A1 WO 2018021362A1 JP 2017026942 W JP2017026942 W JP 2017026942W WO 2018021362 A1 WO2018021362 A1 WO 2018021362A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
porous membrane
surface layer
cell
polymer porous
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/026942
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
萩原　昌彦
哲男 川口
浩祐 馬場
Original Assignee
宇部興産株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 宇部興産株式会社 filed Critical 宇部興産株式会社
Priority to JP2018530322A priority Critical patent/JP6881454B2/ja
Priority to US16/319,997 priority patent/US20190270969A1/en
Priority to CN201780045716.5A priority patent/CN109477069B/zh
Publication of WO2018021362A1 publication Critical patent/WO2018021362A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography

Definitions

  • the present invention relates to a method for suppressing dedifferentiation of a cell that is easily dedifferentiated, a method for preparing the cell, and a method for producing a substance.
  • Chondrocytes are an example of cells that have received attention in this transplantation therapy.
  • a cartilage regeneration technique in which healthy chondrocytes that can be removed from a patient are cultured in vitro and transplanted, embedded, or replaced in an injured part of articular cartilage has already been promoted as a clinical application.
  • it is a methodology that utilizes the merit of autotransplantation.
  • a large amount of cells are required, such as when the affected area is large, it is indispensable to perform subculture in a plastic petri dish or the like.
  • chondrocytes are known to have a loss of cell characteristics called “dedifferentiation” when the number of passages increases, and the original function of chondrocytes producing extracellular matrix such as proteoglycan is lost and proliferated. It is known to be mutated into fibroblast-like cells that exhibit strong ability (Patent Document 1).
  • Patent Document 2 Attempts to coat human or animal-derived biological materials (glycoprotein, protein, etc.) on the surface of a culture vessel in order to suppress dedifferentiation of cells that are easily dedifferentiated, including chondrocytes (Patent Document 2), and polymers An attempt to culture in a gel (Patent Document 3) has been reported.
  • human or animal-derived biological materials glycoprotein, protein, etc.
  • Polyimide Porous Membrane The polyimide porous membrane has been used for applications such as filters, low dielectric constant films, electrolyte membranes for fuel cells, etc., especially for battery-related applications before the present application.
  • Patent Documents 5 to 7 particularly show excellent permeability to substances such as gas, high porosity, excellent smoothness of both surfaces, relatively high strength, and high film thickness direction in spite of high porosity.
  • a polyimide porous membrane having a large number of macrovoids having excellent proof stress against compressive stress is described. These are all polyimide porous membranes prepared via an amic acid.
  • a cell culturing method has been reported that includes culturing cells by applying them to a polyimide porous membrane (Patent Document 8).
  • An object of the present invention is to provide a method capable of suppressing the dedifferentiation of cells that are easily dedifferentiated using a completely different means from the conventional method and supplying the cells in large quantities.
  • the inventors of the present invention have a three-layer polymer porous structure having two surface layers having a plurality of pores and a macrovoid layer sandwiched between the two surface layers. Surprisingly, it has been found that by culturing on a membrane, spontaneous dedifferentiation of cells that are easily dedifferentiated can be suppressed, and the present invention has been achieved.
  • this invention has the following aspects.
  • a method for suppressing the dedifferentiation of cells that are easily dedifferentiated (1) applying the cells to a polymer porous membrane, and (2) culturing and growing the cells,
  • the polymer porous membrane has a three-layered polymer porous structure having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B
  • the average pore diameter of the pores present in the surface layer A is smaller than the average pore diameter of the pores present in the surface layer B
  • the macrovoid layer is bonded to the surface layers A and B.
  • the method comprising: a partition wall; and a plurality of macrovoids surrounded by the partition wall and the surface layers A and B, wherein holes in the surface layers A and B communicate with the macrovoid.
  • the cells are chondrocytes, osteoblasts, odontoblasts, enamel blasts, mammary epithelial cells, ciliated epithelial cells, intestinal epithelial cells, adipocytes, hepatocytes, mesangial cells, glomerular epithelial cells, sinusoidal endothelial cells, or The method according to [1], which is a myoblast. [3] The method according to [1] or [2], wherein the step (2) is performed for at least 30 days.
  • step (2) The method according to any one of [1] to [6], wherein in step (2), a part or the whole of the polyimide porous membrane is not in contact with the liquid phase of the cell culture medium.
  • step (2) the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture vessel is 10,000 times or less than the total volume of the polyimide porous membrane including the cell survival area, any one of [1] to [7] The method according to any one of the above.
  • [9] The method according to any one of [1] to [8], wherein the average pore diameter of the surface layer A is 0.01 to 50 ⁇ m.
  • the method according to any one of [1] to [9], wherein the average pore diameter of the surface layer B is 20 to 100 ⁇ m.
  • the polymer porous membrane has a thickness of 5 to 500 ⁇ m.
  • the polymer porous membrane is a polyimide porous membrane.
  • the polyimide porous film is a polyimide porous film containing polyimide obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine.
  • the polyimide porous membrane was colored by heat treatment at 250 ° C. or higher after molding a polyamic acid solution composition containing a polyamic acid solution obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine and a colored precursor.
  • the polymer porous membrane has a three-layered polymer porous structure having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B
  • the average pore diameter of the pores present in the surface layer A is smaller than the average pore diameter of the pores present in the surface layer B, and the macrovoid layer is bonded to the surface layers A and B.
  • a method of producing a substance using cells that are easily dedifferentiated (1) a step of applying the cells to a polymer porous membrane; (2) culturing and proliferating the cells, and (3) recovering a substance produced by the cells,
  • the polymer porous membrane has a three-layered polymer porous structure having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B
  • the average pore diameter of the pores present in the surface layer A is smaller than the average pore diameter of the pores present in the surface layer B, and the macrovoid layer is bonded to the surface layers A and B.
  • the cell is a chondrocyte, and the substance is at least one selected from proteoglycan, collagen, and hyaluronic acid.
  • the present invention it is possible to suppress dedifferentiation of cells that are easily dedifferentiated and supply the cells in large quantities. Moreover, it is possible to obtain a large amount of substances produced by the cells, which have been difficult to obtain in the past.
  • FIG. 1 shows a model diagram of cell culture using a polyimide porous membrane.
  • FIG. 2 shows an example of a cell culture device.
  • FIG. 3 shows changes over time in the number of cells when human chondrocytes are cultured in a polyimide porous membrane.
  • FIG. 4 shows the results of cell proliferation when a polyimide porous membrane in which human chondrocytes are cultured is sandwiched between upper and lower polyimide porous membranes and brought into contact with each other.
  • FIG. 5 shows changes over time in the number of cells when human chondrocytes are cultured in a polyimide porous membrane.
  • FIG. 6 shows an optical microscope image and a fluorescence microscope image of a sample obtained by live imaging of a polyimide porous membrane in human chondrocyte culture.
  • FIG. 7 shows changes over time in the number of cells when human chondrocytes are cultured in a polyimide porous membrane.
  • FIG. 8 shows changes over time in the number of cells when human osteoblasts are cultured in a polyimide porous membrane.
  • FIG. 9 shows changes over time in the number of cells when human osteoblasts are cultured in a polyimide porous membrane.
  • FIG. 10 shows an optical microscope image after calcification induction of human osteoblasts cultured for a long period of time.
  • FIG. 11 shows changes over time in the number of cells when human osteoblasts are cultured in a polyimide porous membrane.
  • FIG. 12 shows an electron microscope image of a sample in which a polyimide porous membrane in human osteoblast culture is fixed with formalin.
  • FIG. 13 shows a fluorescence microscope image of a sample in which a polyimide porous membrane in human osteoblast culture is fixed with formalin.
  • One aspect of the present invention is a method for suppressing the dedifferentiation of cells that are easily dedifferentiated, (1) applying the cells to a polymer porous membrane, and (2) culturing and growing the cells,
  • the polymer porous membrane has a three-layered polymer porous structure having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B
  • the average pore diameter of the pores present in the surface layer A is smaller than the average pore diameter of the pores present in the surface layer B
  • the macrovoid layer is bonded to the surface layers A and B.
  • the method includes a partition wall and a plurality of macrovoids surrounded by the partition wall and the surface layers A and B, and holes in the surface layers A and B communicate with the macrovoid.
  • dedifferentiation suppression method of the present invention it is also referred to as “dedifferentiation suppression method of the present invention”.
  • Another aspect of the present invention is a method for preparing cells that are easily dedifferentiated, (1) applying the cells to a polymer porous membrane, and (2) culturing and growing the cells,
  • the polymer porous membrane has a three-layered polymer porous structure having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B
  • the average pore diameter of the pores present in the surface layer A is smaller than the average pore diameter of the pores present in the surface layer B
  • the macrovoid layer is bonded to the surface layers A and B.
  • Another aspect of the present invention is a method for producing a substance using cells that are easily dedifferentiated, (1) a step of applying the cells to a polymer porous membrane; (2) culturing and proliferating the cells, and (3) recovering a substance produced by the cells,
  • the polymer porous membrane has a three-layered polymer porous structure having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B
  • the average pore diameter of the pores present in the surface layer A is smaller than the average pore diameter of the pores present in the surface layer B
  • the macrovoid layer is bonded to the surface layers A and B.
  • it is also referred to as “substance production method of the present invention”.
  • the “dedifferentiation suppression method of the present invention”, “the cell preparation method of the present invention”, and “the substance production method of the present invention” are also referred to as “the method of the present invention” below.
  • dedifferentiation means returning to a more undifferentiated state, in other words, a process opposite to differentiation.
  • the “cells that are easily dedifferentiated” used in the method of the present invention are not particularly limited.
  • cells that tend to dedifferentiate in conventional plate culture and preferably chondrocytes, osteoblasts, and odontoblasts.
  • “cells that are easily dedifferentiated” are also simply referred to as “cells used in the present invention” below.
  • the type of cells that can be easily dedifferentiated that can be used in the present invention is not particularly limited, but is preferably a mammalian cell, more preferably a primate (human, monkey, etc.), rodent (mouse, rat, guinea pig). Etc.), cats, dogs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, donkeys, goats or ferret cells, particularly preferably human cells.
  • A an embodiment comprising a step of seeding cells on the surface of the porous polymer membrane; (B) placing a cell suspension on the dry surface of the polymer porous membrane; Leave or move the polymer porous membrane to promote fluid outflow, or stimulate a portion of the surface to draw a cell suspension into the membrane; and The cells in the cell suspension remain in the membrane and the water is allowed to flow out, An embodiment comprising steps; and (C) Wetting one or both sides of the polymer porous membrane with a cell culture solution or a sterilized liquid, Loading the wet polymer porous membrane with a cell suspension; and The cells in the cell suspension remain in the membrane and the water is allowed to flow out, A mode comprising the steps.
  • the mode includes directly seeding cells and cell clusters on the surface of the porous polymer membrane.
  • a mode in which a polymer porous membrane is placed in a cell suspension and a cell culture solution is infiltrated from the surface of the membrane is also included.
  • the cells seeded on the surface of the polymer porous membrane adhere to the polymer porous membrane and enter the inside of the pore.
  • the cells spontaneously adhere to the polymer porous membrane without any physical or chemical force applied from the outside.
  • Cells seeded on the surface of the polymer porous membrane can stably grow and proliferate on the surface and / or inside of the membrane. Cells can take a variety of different forms depending on the location of the membrane in which they grow and multiply.
  • the cell suspension is placed on the dry surface of the polymer porous membrane.
  • the polymer porous membrane By leaving the polymer porous membrane, or moving the polymer porous membrane to promote the outflow of the liquid, or stimulating a part of the surface to suck the cell suspension into the membrane, The cell suspension penetrates into the membrane. Without being bound by theory, it is thought that this is due to the properties derived from the surface shape of the polymer porous membrane. According to this embodiment, the cells are sucked and seeded at the location where the cell suspension of the membrane is loaded.
  • one or both sides or the whole of the polymer porous membrane is wetted with a cell culture medium or a sterilized liquid, and then the cell suspension is suspended in the wet polymer porous membrane.
  • the liquid may be loaded. In this case, the passage speed of the cell suspension is greatly improved.
  • a method of wetting a part of the membrane electrode for the main purpose of preventing the scattering of the membrane (hereinafter referred to as “one-point wet method”) can be used.
  • the one-point wet method is substantially similar to the dry method (the embodiment (B)) that does not substantially wet the film.
  • a method in which a cell suspension is loaded into a polymer porous membrane that has been sufficiently wetted on one or both sides hereinafter referred to as “wet membrane”).
  • this Is described as “wet film method”.
  • the passage speed of the cell suspension is greatly improved in the entire polymer porous membrane.
  • the cells in the cell suspension are retained in the membrane, and the water is allowed to flow out.
  • processing such as concentrating the concentration of cells in the cell suspension and allowing unnecessary components other than cells to flow out together with moisture.
  • the mode of (A) may be referred to as “natural sowing” (B) and the mode of (C) as “suction sowing”.
  • the living cells selectively remain in the polymer porous membrane.
  • live cells remain in the polymer porous membrane and dead cells preferentially flow out with moisture.
  • the sterilized liquid used in the embodiment (C) is not particularly limited, but is a sterilized buffer or sterilized water.
  • the buffer include (+) and ( ⁇ ) Dulbecco ’s PBS, (+) and ( ⁇ ) Hank's Balanced Salt Solution. Examples of buffer solutions are shown in Table 1 below.
  • the cell is applied to the polymer porous membrane in such a manner that the cells adhere to the membrane by suspending adherent cells in suspension with the polymer porous membrane (entanglement).
  • a cell culture medium cells and one or more of the polymer porous membranes may be placed in a cell culture vessel.
  • the cell culture medium is liquid
  • the polymer porous membrane is in a suspended state in the cell culture medium. Due to the nature of the polymer porous membrane, cells can adhere to the polymer porous membrane.
  • the polymer porous membrane can be cultured in a suspended state in the cell culture medium.
  • the cells adhere spontaneously to the polymer porous membrane. “Spontaneously adheres” means that the cells remain on or inside the porous polymer membrane without any physical or chemical force applied from the outside.
  • the above-described application of the cell to the polymer porous membrane may be performed by combining two or more methods.
  • the cells may be applied to the polymer porous membrane by combining two or more of the embodiments (A) to (C).
  • Steps for culturing and proliferating cells used in the present invention Cell culture can be classified into adherent culture cells and suspension culture cells depending on the form of cell culture.
  • Adherent culture cells are cultured cells that adhere to a culture vessel and proliferate, and the medium is changed during passage.
  • Floating culture cells are cultured cells that proliferate in a floating state in a medium. In general, dilution culture is performed without replacing the medium during passage.
  • Suspension culture can be cultured in a floating state, that is, in a liquid state, so that it can be cultured in large quantities. Compared with adherent cells that grow only on the surface of the culture vessel, it is a three-dimensional culture. There is an advantage that the number of cells that can be cultured is large.
  • the polymer porous membrane when used in a suspended state in the cell culture medium, two or more pieces of the polymer porous membrane may be used. Since the polymer porous membrane is a three-dimensional and flexible thin film, the polymer porous membrane has a large surface area that can be cultured in a certain volume of cell culture medium by using, for example, small pieces suspended in the culture medium. Can be brought in. In the case of normal culture, the container bottom area is the upper limit of the cell culture area, but in the cell culture using the polymer porous membrane of the present invention, all of the large surface area of the previously introduced polymer porous membrane is the cell. It becomes the area that can be cultured.
  • the polymer porous membrane allows the cell culture medium to pass therethrough, for example, nutrition and oxygen can be supplied into the folded membrane.
  • the polymer porous membrane is completely different from the conventional flat culture and is a cell culture substrate having a three-dimensional and flexible structure. Culturing is possible even in a culture container of material and size (for example, petri dishes, flasks, tanks, bags, etc.).
  • the size and shape of the polymer porous membrane pieces are not particularly limited.
  • the shape can take any shape such as a circle, an ellipse, a square, a triangle, a polygon, and a string.
  • the polymer porous membrane of the present invention is flexible, it can be used by changing its shape.
  • the polymer porous membrane may be processed into a three-dimensional shape instead of a flat shape.
  • a polymer porous membrane is i) folded, ii) rolled into a roll, iii) a sheet or piece is connected with a thread-like structure, or iv) tied in a rope, in a cell culture vessel May be suspended or fixed in the cell culture medium.
  • a polymer porous membrane is i) folded, ii) rolled into a roll, iii) a sheet or piece is connected with a thread-like structure, or iv) tied in a rope, in a cell culture vessel May be suspended or fixed in the cell culture medium.
  • many polymer porous membranes can be placed in a fixed volume of cell culture medium, as in the case of using small pieces.
  • each piece can be handled as an aggregate, cell bodies can be aggregated and moved, and the overall applicability is high
  • two or more polymer porous membranes may be laminated in the cell culture medium vertically or horizontally.
  • Lamination also includes an embodiment in which polymer porous membranes partially overlap. Stacked culture enables cells to be cultured at high density in a narrow space. It is also possible to form a multilayer system with different types of cells by further stacking the membranes on the membrane where the cells are already grown.
  • the number of polymer porous membranes to be laminated is not particularly limited.
  • the cells preferably grow and proliferate on and inside the polymer porous membrane.
  • dedifferentiation can be performed over a long period of at least 30 days, at least 60 days, at least 120 days, at least 200 days, or at least 300 days without performing a conventional passaging operation such as trypsin treatment.
  • Cells can be cultured while being suppressed.
  • the cells can be cultured while suppressing dedifferentiation for a period of at least twice, at least four times, and at least 4.5 times.
  • the present invention it is possible to maintain a dynamic life, not a resting state, for a long period of time without causing detachment or death of cells generated by long-term cell culture in a petri dish or the like. Further, according to the present invention, even in cells cultured for a long period, cell viability or cell properties (for example, the expression level of cell surface markers, etc.) hardly change compared to cells before long-term culture. In addition, according to the present invention, since cells grow three-dimensionally in the porous polymer membrane, it is difficult to cause contact inhibition caused by the limitation of the culture area and the planar environment as seen in conventional planar culture. The culture can be grown for a long period of time.
  • the present invention it is possible to arbitrarily increase the space in which cell culture is possible by bringing another polymer porous membrane into contact with the polymer porous membrane to which the cells are adhered. Without performing a subculture operation with treatment, it is possible to perform culture that grows for a long period of time while avoiding a confluent state that causes contact inhibition.
  • a new storage method in which cells are stored for a long period of time without being frozen.
  • the average pore diameter of the pores existing in the surface layer A (hereinafter also referred to as “A surface” or “mesh surface”) in the porous polymer membrane used in the present invention is although not particularly limited, for example, 0.01 ⁇ m or more and less than 200 ⁇ m, 0.01 to 150 ⁇ m, 0.01 to 100 ⁇ m, 0.01 to 50 ⁇ m, 0.01 ⁇ m to 40 ⁇ m, 0.01 ⁇ m to 30 ⁇ m, 0.01 ⁇ m to 20 ⁇ m Or 0.01 ⁇ m to 15 ⁇ m, preferably 0.01 ⁇ m to 15 ⁇ m.
  • the average pore diameter of the pores existing in the surface layer B (hereinafter also referred to as “B surface” or “large hole surface”) in the polymer porous membrane used in the present invention is the average pore diameter of the pores existing in the surface layer A.
  • the thickness is not particularly limited as long as it is larger than 200 ⁇ m, for example, 20 ⁇ m to 100 ⁇ m, 30 ⁇ m to 100 ⁇ m, 40 ⁇ m to 100 ⁇ m, 50 ⁇ m to 100 ⁇ m, or 60 ⁇ m to 100 ⁇ m, and preferably 20 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the average pore diameter on the surface of the polymer porous membrane is determined by measuring the pore area for 200 or more apertures from the scanning electron micrograph on the surface of the porous membrane, and determining the pore size according to the following formula (1)
  • the average diameter when the shape is assumed to be a perfect circle can be obtained by calculation.
  • Sa means the average value of the pore area.
  • the thickness of the surface layers A and B is not particularly limited, but is, for example, 0.01 to 50 ⁇ m, preferably 0.01 to 20 ⁇ m.
  • the average pore diameter in the plane direction of the macrovoids in the macrovoid layer in the polymer porous membrane is not particularly limited, but is, for example, 10 to 500 ⁇ m, preferably 10 to 100 ⁇ m, and more preferably 10 to 80 ⁇ m.
  • the thickness of the partition wall in the macrovoid layer is not particularly limited, but is, for example, 0.01 to 50 ⁇ m, and preferably 0.01 to 20 ⁇ m.
  • at least one partition wall in the macrovoid layer has one or more average pore diameters of 0.01 to 100 ⁇ m, preferably 0.01 to 50 ⁇ m, communicating adjacent macrovoids. Has holes.
  • the partition in the macrovoid layer has no pores.
  • the film thickness of the polymer porous membrane used in the present invention is not particularly limited, but may be 5 ⁇ m or more, 10 ⁇ m or more, 20 ⁇ m or more, or 25 ⁇ m or more, 500 ⁇ m or less, 300 ⁇ m or less, 100 ⁇ m or less, 75 ⁇ m or less, or 50 ⁇ m. It may be the following.
  • the thickness is preferably 5 to 500 ⁇ m, more preferably 25 to 75 ⁇ m.
  • the measurement of the thickness of the polymer porous membrane used in the present invention can be performed with a contact-type thickness meter.
  • the porosity of the polymer porous membrane used in the present invention is not particularly limited, but is, for example, 40% or more and less than 95%.
  • the porosity of the polymer porous membrane used in the present invention can be determined according to the following formula (2) from the basis weight by measuring the thickness and mass of the porous film cut to a predetermined size.
  • S represents the area of the porous film
  • d represents the film thickness
  • w represents the measured mass
  • D represents the density of the polymer.
  • the density is 1.34 g / cm 3 . To do.
  • the polymer porous membrane used in the present invention is preferably a three-layer structure having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B.
  • the macrovoid layer includes a partition bonded to the surface layers A and B, and a plurality of macrovoids surrounded by the partition and the surface layers A and B.
  • the partition of the macrovoid layer and the surface The thicknesses of the layers A and B are 0.01 to 20 ⁇ m, the holes in the surface layers A and B communicate with the macrovoids, the total film thickness is 5 to 500 ⁇ m, and the porosity is 40% or more. Less than 95% Is mer porous membrane.
  • the at least one partition wall in the macrovoid layer has one or more pores having an average pore diameter of 0.01 to 100 ⁇ m, preferably 0.01 to 50 ⁇ m, communicating between adjacent macrovoids. Have In another embodiment, the septum does not have such holes.
  • the polymer porous membrane used in the present invention is preferably sterilized.
  • the sterilization treatment is not particularly limited, and includes any sterilization treatment such as dry heat sterilization, steam sterilization, sterilization with a disinfectant such as ethanol, and electromagnetic wave sterilization such as ultraviolet rays and gamma rays.
  • the polymer porous membrane used in the present invention is not particularly limited as long as it has the above structural characteristics, but is preferably a porous membrane of polyimide or polyethersulfone (PES).
  • PES polyethersulfone
  • Polyimide is a general term for polymers containing imide bonds in repeating units, and usually means an aromatic polyimide in which aromatic compounds are directly linked by imide bonds.
  • Aromatic polyimide has a conjugated structure through the imide bond between aromatic and aromatic, so it has a rigid and strong molecular structure, and the imide bond has a strong intermolecular force, so it has a very high level of heat. Has mechanical, mechanical and chemical properties.
  • the polyimide porous membrane that can be used in the present invention is preferably a polyimide porous membrane comprising polyimide (as a main component) obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine, more preferably It is a polyimide porous membrane made of polyimide obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine.
  • “Containing as a main component” means that a component other than polyimide obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine may be essentially not included or included as a component of the polyimide porous membrane. It means that it is an additional component that does not affect the properties of the polyimide obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine.
  • the polyimide porous membrane that can be used in the present invention is formed by molding a polyamic acid solution composition containing a polyamic acid solution obtained from a tetracarboxylic acid component and a diamine component and a colored precursor, and then heat-treating at 250 ° C. or higher.
  • the colored polyimide porous membrane obtained by (1) is also included.
  • Polyamic acid is obtained by polymerizing a tetracarboxylic acid component and a diamine component.
  • Polyamic acid is a polyimide precursor that can be ring-closed to form polyimide by thermal imidization or chemical imidization.
  • the polyamic acid even if a part of the amic acid is imidized, it can be used as long as it does not affect the present invention. That is, the polyamic acid may be partially thermally imidized or chemically imidized.
  • fine particles such as an imidization catalyst, an organic phosphorus-containing compound, inorganic fine particles, and organic fine particles can be added to the polyamic acid solution as necessary.
  • fine particles such as a chemical imidating agent, a dehydrating agent, inorganic fine particles, and organic fine particles, etc. can be added to a polyamic acid solution as needed. Even when the above components are added to the polyamic acid solution, it is preferable that the coloring precursor is not precipitated.
  • colored precursor means a precursor that is partially or wholly carbonized by heat treatment at 250 ° C. or higher to produce a colored product.
  • the colored precursor that can be used in the production of the polyimide porous membrane is uniformly dissolved or dispersed in a polyamic acid solution or a polyimide solution, 250 ° C. or higher, preferably 260 ° C. or higher, more preferably 280 ° C. or higher, more preferably Is thermally decomposed and carbonized by heat treatment at 300 ° C. or higher, preferably 250 ° C. or higher in the presence of oxygen such as air, preferably 260 ° C. or higher, more preferably 280 ° C. or higher, more preferably 300 ° C. or higher.
  • Those that produce colored products are preferred, those that produce black colored products are more preferred, and carbon-based colored precursors are more preferred.
  • the carbon-based coloring precursor is not particularly limited.
  • polymers such as petroleum tar, petroleum pitch, coal tar, coal pitch, or polymers obtained from monomers including pitch, coke, and acrylonitrile, ferrocene compounds (ferrocene and ferrocene derivatives). Etc.
  • the polymer and / or ferrocene compound obtained from the monomer containing acrylonitrile are preferable, and polyacrylonitrile is preferable as a polymer obtained from the monomer containing acrylonitrile.
  • the polyimide porous membrane that can be used in the present invention is obtained by molding a polyamic acid solution obtained from a tetracarboxylic acid component and a diamine component without using the above colored precursor, A polyimide porous membrane obtained by heat treatment is also included.
  • a polyimide porous membrane produced without using a colored precursor is composed of, for example, 3 to 60% by mass of a polyamic acid having an intrinsic viscosity of 1.0 to 3.0 and 40 to 97% by mass of an organic polar solvent.
  • the polyamic acid solution is cast into a film and immersed in or contacted with a coagulation solvent containing water as an essential component to produce a polyamic acid porous film, and then the polyamic acid porous film is heat-treated to form an imide. May be manufactured.
  • the coagulation solvent containing water as an essential component is water or a mixed solution of 5% by mass or more and less than 100% by mass of water and more than 0% by mass and 95% by mass or less of an organic polar solvent. May be.
  • plasma treatment may be performed on at least one surface of the obtained porous polyimide film.
  • any tetracarboxylic dianhydride can be used, and can be appropriately selected according to desired characteristics.
  • Specific examples of tetracarboxylic dianhydride include pyromellitic dianhydride, 3,3 ′, 4,4′-biphenyltetracarboxylic dianhydride (s-BPDA), 2,3,3 ′, 4 ′.
  • -Biphenyltetracarboxylic dianhydride such as biphenyltetracarboxylic dianhydride (a-BPDA), oxydiphthalic dianhydride, diphenylsulfone-3,4,3 ', 4'-tetracarboxylic dianhydride, bis (3,4-dicarboxyphenyl) sulfide dianhydride, 2,2-bis (3,4-dicarboxyphenyl) -1,1,1,3,3,3-hexafluoropropane dianhydride, 2, 3,3 ′, 4′-benzophenone tetracarboxylic dianhydride, 3,3 ′, 4,4′-benzophenone tetracarboxylic dianhydride, bis (3,4-dicarboxyphenyl) methane dianhydride 2,2-bis (3,4-dicarboxyphenyl) propane dianhydride, p-phenylenebis (trimellitic acid monoester acid an
  • At least one aromatic tetracarboxylic dianhydride selected from the group consisting of biphenyltetracarboxylic dianhydride and pyromellitic dianhydride is particularly preferable.
  • the biphenyltetracarboxylic dianhydride 3,3 ′, 4,4′-biphenyltetracarboxylic dianhydride can be suitably used.
  • Arbitrary diamine can be used for the diamine which can be used in manufacture of the said polyimide porous membrane.
  • diamines include the following. 1) One benzene nucleus such as 1,4-diaminobenzene (paraphenylenediamine), 1,3-diaminobenzene, 2,4-diaminotoluene, 2,6-diaminotoluene, etc .; 2) 4,4'-diaminodiphenyl ether, diaminodiphenyl ether such as 3,4'-diaminodiphenyl ether, 4,4'-diaminodiphenylmethane, 3,3'-dimethyl-4,4'-diaminobiphenyl, 2,2'- Dimethyl-4,4′-diaminobiphenyl, 2,2′-bis (trifluoromethyl) -4,4′-diaminobiphenyl, 3,3′-dimethyl-4,4′-dia
  • diamine to be used can be appropriately selected according to desired characteristics.
  • aromatic diamine compounds are preferable, and 3,3′-diaminodiphenyl ether, 3,4′-diaminodiphenyl ether, 4,4′-diaminodiphenyl ether and paraphenylenediamine, 1,3-bis (3-aminophenyl) Benzene, 1,3-bis (4-aminophenyl) benzene, 1,4-bis (3-aminophenyl) benzene, 1,4-bis (4-aminophenyl) benzene, 1,3-bis (4-amino) Phenoxy) benzene and 1,4-bis (3-aminophenoxy) benzene can be preferably used.
  • at least one diamine selected from the group consisting of benzenediamine, diaminodiphenyl ether and bis (aminophenoxy) phenyl is preferred.
  • the polyimide porous membrane that can be used in the present invention has a glass transition temperature of 240 ° C. or higher or a clear transition point at 300 ° C. or higher from the viewpoint of heat resistance and dimensional stability at high temperatures. It is preferably formed from a polyimide obtained by combining acid dianhydride and diamine.
  • the polyimide porous membrane that can be used in the present invention is preferably a polyimide porous membrane made of the following aromatic polyimide from the viewpoints of heat resistance and dimensional stability at high temperatures.
  • an aromatic polyimide comprising at least one tetracarboxylic acid unit selected from the group consisting of a biphenyltetracarboxylic acid unit and a pyromellitic acid unit, and an aromatic diamine unit
  • an aromatic polyimide comprising a tetracarboxylic acid unit and at least one aromatic diamine unit selected from the group consisting of a benzenediamine unit, a diaminodiphenyl ether unit and a bis (aminophenoxy) phenyl unit;
  • the polyimide porous membrane used in the present invention is preferably a three-layer structure having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B.
  • the macrovoid layer includes a partition bonded to the surface layers A and B, and a plurality of macrovoids surrounded by the partition and the surface layers A and B.
  • the partition of the macrovoid layer and the surface The thicknesses of the layers A and B are 0.01 to 20 ⁇ m, the holes in the surface layers A and B communicate with the macrovoids, the total film thickness is 5 to 500 ⁇ m, and the porosity is 40% or more. Less than 95% A polyimide porous film.
  • at least one partition wall in the macrovoid layer has one or a plurality of holes having an average pore diameter of 0.01 to 100 ⁇ m, preferably 0.01 to 50 ⁇ m, which communicate adjacent macrovoids.
  • polyimide porous membrane described in International Publication WO2010 / 038873, JP2011-219585, or JP2011-219586 can also be used in the present invention.
  • the PES porous membrane that can be used in the present invention contains polyethersulfone, and is typically substantially composed of polyethersulfone.
  • Polyethersulfone may be synthesized by a method known to those skilled in the art, for example, a method of polycondensation reaction of a dihydric phenol, an alkali metal compound and a dihalogenodiphenyl compound in an organic polar solvent, An alkali metal disalt can be synthesized in advance and can be produced by a polycondensation reaction with a dihalogenodiphenyl compound in an organic polar solvent.
  • alkali metal compound examples include alkali metal carbonates, alkali metal hydroxides, alkali metal hydrides, alkali metal alkoxides, and the like.
  • sodium carbonate and potassium carbonate are preferable.
  • dihydric phenol compounds examples include hydroquinone, catechol, resorcin, 4,4′-biphenol, bis (hydroxyphenyl) alkanes (for example, 2,2-bis (hydroxyphenyl) propane, and 2,2-bis (hydroxyphenyl) Methane), dihydroxydiphenyl sulfones, dihydroxydiphenyl ethers, or at least one hydrogen of the benzene ring is a lower alkyl group such as a methyl group, an ethyl group or a propyl group, or a lower alkoxy group such as a methoxy group or an ethoxy group.
  • the substituted one is mentioned.
  • the dihydric phenol compound a mixture of two or more of the above compounds can be used.
  • the polyethersulfone may be a commercially available product.
  • a commercial item Sumika Excel 7600P, Sumika Excel 5900P (above, Sumitomo Chemical Co., Ltd. product) etc. are mentioned.
  • the logarithmic viscosity of the polyethersulfone is preferably 0.5 or more, more preferably 0.55 or more from the viewpoint of satisfactorily forming the macrovoids of the PES porous membrane, and the ease of production of the porous polyethersulfone membrane In view of the above, it is preferably 1.0 or less, more preferably 0.9 or less, still more preferably 0.8 or less, and particularly preferably 0.75 or less.
  • the PES porous membrane or polyethersulfone as a raw material thereof has a glass transition temperature of 200 ° C. or higher or a clear glass transition temperature from the viewpoint of heat resistance and dimensional stability at high temperatures. Preferably it is not observed.
  • the production method of the PES porous membrane that can be used in the present invention is not particularly limited.
  • a polyethersulfone solution containing 0.3% to 60% by weight of polyethersulfone having a logarithmic viscosity of 0.5 to 1.0 and 40% to 99.7% by weight of an organic polar solvent is cast into a film.
  • the PES porous membrane that can be used in the present invention preferably has a surface layer A, a surface layer B, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B. Because the macrovoid layer includes a partition bonded to the surface layers A and B, and a plurality of macrovoids surrounded by the partition and the surface layers A and B and having an average pore diameter of 10 ⁇ m to 500 ⁇ m in the film plane direction.
  • the partition wall of the macrovoid layer has a thickness of 0.1 ⁇ m to 50 ⁇ m
  • Each of the surface layers A and B has a thickness of 0.1 ⁇ m to 50 ⁇ m
  • one has a plurality of pores having an average pore diameter of more than 5 ⁇ m and not more than 200 ⁇ m, and the other has a plurality of pores having an average pore diameter of 0.01 ⁇ m or more and less than 200 ⁇ m
  • the surface opening ratio of one of the surface layer A and the surface layer B is 15% or more, and the surface opening ratio of the other surface layer is 10% or more
  • the pores of the surface layer A and the surface layer B communicate with the macrovoid;
  • the PES porous membrane has a total film thickness of 5 ⁇ m to 500 ⁇ m and a porosity of 50% to 95%. PES porous membrane.
  • FIG. 1 shows a model diagram of cell culture using a polymer porous membrane.
  • FIG. 1 is a diagram for assisting understanding, and each element is not an actual size.
  • a large amount of cells grow on the multifaceted connected porous portion and the surface of the polymer porous membrane. Can be cultured easily.
  • a large amount of cells can be cultured while the amount of the medium used for cell culture is greatly reduced as compared with the conventional method.
  • the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture container can be significantly reduced with respect to the total volume of the polymer porous membrane including the cell survival area.
  • the volume occupied by the porous polymer membrane not containing cells in the space including the volume of the internal gap is referred to as “apparent polymer porous membrane volume” (see FIG. 1). Then, when the cells are applied to the polymer porous membrane and the cells are supported on and inside the polymer porous membrane, the polymer porous membrane, the cells, and the medium infiltrated into the polymer porous membrane are entirely space.
  • the volume occupied therein is referred to as “polymer porous membrane volume including cell viability zone” (see FIG. 1).
  • the polymer porous membrane volume including the cell survival area is apparently about 50% larger than the polymer porous membrane volume at the maximum.
  • a plurality of polymer porous membranes can be accommodated and cultured in one cell culture vessel.
  • the cell survival area for each of the plurality of polymer porous membranes carrying cells is sometimes simply referred to as “the total volume of the polymer porous membrane including the cell viability zone”.
  • the method of the present invention even if the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture container is 10,000 times or less than the total volume of the polymer porous membrane including the cell viability area, It becomes possible to culture well. In addition, cells can be cultured well over a long period of time even under conditions where the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture vessel is 1000 times or less than the total volume of the polymer porous membrane including the cell survival area. . Furthermore, even when the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture vessel is 100 times or less than the total volume of the polymer porous membrane including the cell survival area, the cells can be cultured well over a long period of time. . And even if the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture container is 10 times or less than the total volume of the polymer porous membrane including the cell survival area, the cells can be cultured well over a long period of time. .
  • the space (container) for cell culture can be miniaturized to the limit as compared with the conventional cell culture apparatus for performing two-dimensional culture. Moreover, when it is desired to increase the number of cells to be cultured, it is possible to increase the volume of cell culture flexibly by a simple operation such as increasing the number of polymer porous membranes to be laminated. If it is a cell culture apparatus provided with the polymer porous membrane used for this invention, it becomes possible to isolate
  • the space (container) in which the cell culture medium is stored may be enlarged or reduced according to the purpose, or may be a replaceable container, and is not particularly limited.
  • the number of cells contained in the cell culture container after the culture using the polymer porous membrane is uniformly dispersed in the cell culture medium contained in the cell culture container.
  • a method for measuring the number of cells during or after the culture various known methods can be used.
  • a method of measuring the number of cells contained in a cell culture vessel after culturing using a polymer porous membrane as if all the cells are uniformly dispersed in the cell culture medium contained in the cell culture vessel Any known method can be used as appropriate.
  • a cell count method using CCK8 can be suitably used.
  • Cell Counting Kit 8; a solution reagent manufactured by Dojindo Laboratories (hereinafter referred to as “CCK8”) was used to measure the number of cells in a normal culture without using a polymer porous membrane, and the absorbance was measured. The correlation coefficient with the actual cell number is obtained.
  • the polymer porous membrane, to which the cells were applied and cultured was transferred to a medium containing CCK8, stored in an incubator for 1 to 3 hours, the supernatant was extracted, and the absorbance was measured at a wavelength of 480 nm. The number of cells is calculated from the obtained correlation coefficient.
  • the mass culture of cells means, for example, that the number of cells contained per square centimeter of the polymer porous membrane is 1.0 ⁇ 10 5 or more after the culture using the polymer porous membrane. 0 ⁇ 10 5 or more, 1.0 ⁇ 10 6 or more, 2.0 ⁇ 10 6 or more, 5.0 ⁇ 10 6 or more, 1.0 ⁇ 10 7 or more, 2.0 ⁇ 10 7 As mentioned above, it means culturing until it becomes 5.0 ⁇ 10 7 or more, 1.0 ⁇ 10 8 or more, 2.0 ⁇ 10 8 or more, or 5.0 ⁇ 10 8 or more.
  • the number of cells contained per square centimeter of the polymer porous membrane can be appropriately measured using a known method such as a cell counter.
  • the cell culture system and culture conditions can be appropriately determined according to the cell type and the like. Culture methods suitable for cells that are easily dedifferentiated are known, and those skilled in the art can culture cells applied to a polymer porous membrane using any known method. A cell culture medium can also be suitably prepared according to the kind of cell.
  • the cell culture medium used in the method of the present invention may be in any form such as a liquid medium, a semi-solid medium, a solid medium and the like.
  • the medium may be brought into contact with the polymer porous membrane supporting the cells by spraying a liquid medium in the form of droplets into the cell culture container.
  • cell culture using a polymer porous membrane it can coexist with other floating culture carriers such as microcarriers and cellulose sponges.
  • the shape and scale of the system used for culturing are not particularly limited, and it can be appropriately used from petri dishes for cell culture, flasks, plastic bags, test tubes to large tanks.
  • a cell culture dish manufactured by BD Falcon, a Nunc cell factory manufactured by Thermo Scientific, and the like are included.
  • a polymer porous membrane in the present invention it was possible to perform culture in a suspension culture-like state using cells for suspension culture even for cells that were not inherently capable of suspension culture.
  • a spinner flask manufactured by Corning, rotary culture, or the like can be used.
  • a hollow fiber culture system such as FiberCell (registered trademark) System manufactured by VERITAS can be used as an environment in which similar functions can be realized.
  • the culture in the method of the present invention is a type in which the polymer porous membrane sheet is exposed to the air using a continuous circulation or open type device that continuously adds and recovers the medium on the polymer porous membrane. It is also possible to execute with.
  • cells may be cultured in a system in which the cell culture medium is supplied into the cell culture container continuously or intermittently from a cell culture medium supply means installed outside the cell culture container.
  • the cell culture medium can be a system in which the cell culture medium is circulated between the cell culture medium supply means and the cell culture container.
  • the system When cell culture is performed in a system in which the cell culture medium is continuously or intermittently supplied from the cell culture medium supply means installed outside the cell culture container, the system is a cell culture container. It may be a cell culture device including a culture unit and a culture medium supply unit as a cell culture medium supply means, wherein the culture unit is a culture unit containing one or more polymer porous membranes for supporting cells.
  • the culture medium supply unit includes a culture medium storage container, a culture medium supply line, and a liquid feed pump that continuously or intermittently feeds the culture medium via the culture medium supply line, where the first end of the culture medium supply line is
  • the cell culture device may be a culture medium supply unit, which is in contact with the culture medium in the culture medium storage container and the second end of the culture medium supply line communicates with the culture unit via the culture medium supply port of the culture unit.
  • the culture unit may be a culture unit that does not include an air supply port, an air discharge port, and an oxygen exchange membrane, and further includes an air supply port and an air discharge port, or an oxygen exchange membrane. It may be a culture unit. Even if the culture unit does not include an air supply port, an air discharge port, and an oxygen exchange membrane, oxygen and the like necessary for cell culture are sufficiently supplied to the cells through the medium. Furthermore, in the cell culture apparatus, the culture unit further includes a medium discharge line, wherein the first end of the medium discharge line is connected to the medium storage container, and the second end of the medium discharge line is the culture unit. The culture medium may be circulated between the culture medium supply unit and the culture unit by communicating with the culture unit via the culture medium outlet.
  • FIG. 2 shows an example of a cell culture apparatus which is an example of the cell culture system, but the cell culture system that can be used for the purpose of the present invention is not limited to this.
  • a desired substance is produced from a cell by culturing the cell as described above.
  • the produced substance may be a substance remaining in the cell or a substance secreted from the cell.
  • the produced substance can be recovered by a known method according to the kind and nature of the substance. In the case of substances secreted from cells, the substances can be recovered from the cell culture medium. If the produced substance remains in the cell, the cell is destroyed by a known method such as chemical treatment using a cell lysing agent, ultrasonic treatment, homogenizer, physical treatment using a disposable disposable tube, etc. By doing so, it is possible to take the substance out of the cell and collect it.
  • a method for destroying cells can be appropriately applied by those skilled in the art depending on the type of cell, the type of substance, and the like.
  • the cell used is a chondrocyte
  • the substance is at least one selected from proteoglycan, collagen and hyaluronic acid.
  • the polyimide porous membrane used in the following examples is composed of 3,3 ′, 4,4′-biphenyltetracarboxylic dianhydride (s-BPDA) which is a tetracarboxylic acid component and 4,4 which is a diamine component. It was prepared by molding a polyamic acid solution composition containing a polyamic acid solution obtained from '-diaminodiphenyl ether (ODA) and a polyacrylamide as a coloring precursor, and then heat-treating it at 250 ° C. or higher.
  • s-BPDA 4,4′-biphenyltetracarboxylic dianhydride
  • the obtained polyimide porous film is a three-layer polyimide porous film having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B.
  • the average pore size of the pores existing in the surface layer A was 6 ⁇ m
  • the average pore size of the pores existing in the surface layer B was 46 ⁇ m
  • the film thickness was 25 ⁇ m
  • the porosity was 73%.
  • Example 1 Culture of human chondrocytes on a polyimide porous membrane Add 1 ml of chondrocyte growth medium (PromoCell) to a 2 cm x 2 cm sterilized square container (Thermo Fisher Scientific cat.103) and sterilize it. The square polyimide porous membrane was immersed in the medium with the A side of the mesh structure facing upward. 4 ⁇ 10 4 human chondrocytes were seeded per sheet, and the culture was continuously performed in a CO 2 incubator while changing the medium (1 ml) twice a week.
  • the culture using the polyimide porous membrane is hereinafter referred to as “member culture”, and the obtained cell sample is hereinafter referred to as “member culture cell sample”.
  • CCK8 Cell Counting Kit-8 (manufactured by Dojindo Laboratories, hereinafter referred to as “CCK8”), and the cell growth behavior was observed. The results are shown in FIG. Stable growth and growth of human chondrocytes over time was observed.
  • Example 2 Migration of human chondrocytes from polyimide porous membrane to empty polyimide porous membrane (gas phase passage method)
  • human chondrocytes were cultured for 59 days in a CO 2 incubator.
  • One set of three layers of polyimide porous membrane laminates were prepared by sandwiching the upper and lower sides of each new polyimide porous membrane of the same size with respect to the polyimide porous membrane sheet on which cells were grown in culture. This three-layer stack was placed on a mesh placed in a medium so as to be in contact with the gas phase, and the culture was continued in a CO 2 incubator. After 7 days, each laminate was made independent for each sheet, and the number of cells of each polyimide porous membrane was measured using CCK8. The results are shown in FIG.
  • Example 3 Long-term culture of human chondrocytes The culture of human chondrocytes of Example 1 was further continued under the same conditions as in Example 1. The number of cells was counted using CCK8, and the cell growth behavior was observed. The results are shown in FIG.
  • the polyimide porous membrane in the member culture on day 170 after the start of culture was sterilized and transferred to a dish (mouth inner diameter: 35 mm). 1 ml of medium was added, and further CellMask Orange Plasma Membrane Stain (1 ⁇ L) and Hoechst33342 (PromoKine) (0.5 ⁇ L) were added and left in the incubator for 5 minutes. Thereafter, the medium containing the staining reagent was removed and new medium was added to complete the staining. For each medium, the polyimide porous membrane was moved to a 2-hole plastic chamber (manufactured by Sarstedt), and a fluorescence microscope image was obtained with the cells kept alive by a confocal laser microscope. In addition, he obtained an optical microscope image of the same field of view. An image is shown in FIG. Chondrocytes were observed in a shape compatible with the mesh structure of the polyimide porous membrane A surface.
  • Example 4 Substance production from human chondrocytes
  • the member cultured cell samples on day 120 and 365 after the start of culture, and the medium after culturing the cell samples were collected, and type II collagen and proteoglycan were obtained by ELISA. The production amount of was measured.
  • the cell wall was destroyed by the ultrasonic crushing from the outside, and intracellular type II collagen and proteoglycan were collected.
  • human chondrocytes were cultured for 5 days after one passage in a cell culture petri dish (manufactured by Sumitomo Bakelite) under the same conditions as in Example 3 except that no polyimide porous membrane was used.
  • the culture without using the polyimide porous membrane is hereinafter referred to as “normal culture”, and the obtained cell sample is referred to as “normal culture cell sample”.
  • the normal cultured cell sample and the medium after culturing the cell sample were collected, and the production amounts of type II collagen and proteoglycan were measured by ELISA.
  • type II collagen and proteoglycan recovered are shown below. It was confirmed that high production of type II collagen and proteoglycan was maintained.
  • Type II collagen and proteoglycan are substances specific to human chondrocytes. Since the characteristics of human chondrocytes that are easily dedifferentiated even after long-term culture are maintained, the method of the present invention can suppress dedifferentiation of cells that are easily dedifferentiated. It was proved to be.
  • Example 5 Long-term culture and substance production of human chondrocytes (effect of differences in the initial seeding number of cells)
  • Each sheet was seeded with 4 ⁇ 10 4 or 2 ⁇ 10 4 chondrocytes, and was continuously cultured in a CO 2 incubator while changing the medium (1 ml) twice a week. The number of cells was counted using CCK8, and the cell growth behavior was observed.
  • the results are shown in FIG. Human chondrocytes could be stably cultured for a long period of time without greatly depending on the initial seeding number of cells.
  • type II collagen and proteoglycan recovered are shown below. Even after long-term member culture, high production of type II collagen and proteoglycan was confirmed in human chondrocytes. In addition, the reproducibility of the substance production amount was confirmed even when compared with the results of Example 4.
  • Example 6 Culture of human osteoblasts on polyimide porous membrane Add 1 ml of osteoblast growth medium (PromoCell, C-27001) to a 2 cm x 2 cm sterilized square container (Thermo Fisher Scientific, cat. 103) Then, a sterilized 1.4 cm square square polyimide porous membrane was immersed in the medium with the A side of the mesh structure facing upward. 4 ⁇ 10 4 human osteoblasts (manufactured by PromoCell) per seed were seeded and cultured continuously in a CO 2 incubator. The medium (1 ml) was changed twice a week. After the start of culture, the number of cells was counted using CCK8, and the cell growth behavior was observed. The results are shown in FIG. Stable cell growth and growth over time was observed.
  • Example 7 Cultivation of human osteoblasts on a porous polyimide membrane and induction of calcification Osteoblast growth medium (PromoCell, C-27001) in a 2 cm x 2 cm sterilized square container (Thermo Fisher Scientific, cat.103) 1) 1 ml was added, and a sterilized 1.4 cm square square polyimide porous membrane was immersed in the medium with the A side of the mesh structure facing up. 4 ⁇ 10 4 or 2 ⁇ 10 4 human osteoblasts (PromoCell) are seeded per sheet, and the culture is continuously continued in a CO 2 incubator while changing the medium (1 ml) twice a week. went.
  • the polyimide porous membrane (referred to as “Sample 1” and “Sample 2”, respectively) during the member culture on the 83rd day and the 224th day after the start of the culture was used as a mineralization induction medium (PromoCell, osteoblast calcification medium). ) was added to each sterilized square container of 2 cm ⁇ 2 cm, and calcification induction was performed. After the induction period, staining was performed with a calcification staining kit (manufactured by Cosmo Bio), and redness of the calcification portion was observed with an optical microscope. The results are shown in the following table and FIG. The number of grown cells before calcification induction in the table was measured using CCK8.
  • a characteristic red discoloration part was observed in the microscopic image of FIG. 10, and it was found that osteoblast characteristics were continuously maintained during long-term culture. Even after culturing for a long time, the characteristics (calcification ability) of osteoblasts, which are easily dedifferentiated cells, are maintained. It was demonstrated that the dedifferentiation of can be suppressed.
  • Example 8 Cultivation and microscopy of human osteoblasts on polyimide porous membrane Osteoblast growth medium (Promo Cell, C-27001) in a 2 cm x 2 cm sterilized square container (Thermo Fisher Scientific, cat. 103) ) 1 ml was added, and a sterilized 1.4 cm square square square polyimide porous membrane was immersed in the medium of the container with the A side of the mesh structure facing up. 4 ⁇ 10 4 or 2 ⁇ 10 4 human osteoblasts (manufactured by PromoCell) are inoculated per polyimide porous membrane, and cultured in a CO 2 incubator while changing the medium (1 ml) twice a week. Continuously.
  • the polyimide porous membrane in the member culture on the 160th day was fixed in formalin and observed with an electron microscope. Specifically, the polyimide porous membrane was fixed with 2.5% glutaraldehyde and 2% formaldehyde mixed fixative, then fixed after osmium tetroxide, and after dehydration by sequential ethanol replacement method, at liquid nitrogen temperature Freeze cleaving was performed. After freeze-drying using t-butyl alcohol, antistatic treatment was performed by osmium plasma deposition, and observation with a scanning electron microscope (SEM) was performed. A field emission SEM was used for observation, and observation was performed with a secondary electron image under an acceleration voltage of 5 kV and high vacuum. The results are shown in FIG. Many interesting member culturing behaviors were observed, including cell alignment, formation of a multi-layered structure of cells, and differences in cell alignment between the membrane surface and near (inner) layers.
  • SEM scanning electron microscope
  • the polyimide porous membrane in the member culture on day 171 was fixed with formalin and observed with a fluorescence microscope. Specifically, after immobilizing the polyimide porous membrane with formalin, it was stained with Alexa Fluor (registered trademark) 488 phalloidin, CellMask Orange Plasma Membrane Stain, and DAPI, and a fluorescence microscopic image was obtained with a confocal laser microscope. The results are shown in FIG. Two different surface layer portions of the A surface surface layer and the B surface surface layer were measured to verify the state of cell assembly. It was clear that strong orientation was seen in both surface layers, and the results were in good agreement with the SEM analysis.
  • the method of the present invention can be used to suppress dedifferentiation of cells that are easily dedifferentiated and supply the cells in large quantities. Moreover, it can utilize in order to obtain the substance which the said cell produces that was difficult to obtain conventionally.

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Abstract

本発明は、脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制する方法であって、（１）前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び（２）前記細胞を培養し、増殖させる工程を含み、ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法に関する。

Description

脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制する方法、当該細胞の調製方法、及び物質の産生方法
　本発明は、脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制する方法、当該細胞の調製方法、及び物質の産生方法に関する。
　細胞の脱分化
　再生医療の重要度が加速的に増す中、特異な機能を有する末梢細胞を用いた移植療法は、広く実施されるようになり、高い治療効果が注目を集めている。軟骨細胞はこの移植療法で注目される細胞の例である。患者から摘出可能で健常な軟骨細胞を生体外で培養し、関節軟骨の損傷部に移植・包埋・置換する軟骨再生術が，すでに臨床応用として進められている。自家移植のメリットを活用した方法論である一方で、患部が大きな場合等は大量の細胞が必要とする場合には、プラスチックシャーレ等での継代増殖を行なう事が不可欠となる。
　しかしながら、軟骨細胞は、継代回数が増えると「脱分化」と呼ばれる細胞特性の喪失現象が知られており、プロテオグリカンなどの細胞外マトリクスを産生する軟骨細胞本来の機能が失われ，かつ、増殖能を強く示す線維芽細胞様細胞に変異することが知られている（特許文献１）。
　軟骨細胞を含む、脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制するために、ヒト或いは動物由来の生体物質（糖タンパク質、タンパク質等）を培養容器表面へコーティングする試み（特許文献２）や、高分子ゲル中で培養する試み（特許文献３）が報告されている。
　また、脱分化しやすい乳腺上皮細胞を、複数のマイクロ容器を有する細胞培養容器のマイクロ容器内において細胞を重層化した状態で培養することで、脱分化を抑制する方法が報告されている（特許文献４）。
　ポリイミド多孔質膜
　ポリイミド多孔質膜は、本出願前よりフィルター、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献５～７は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。
　細胞をポリイミド多孔質膜に適用して培養することを含む、細胞の培養方法が報告されている（特許文献８）。
ＷＯ２００６／０８２８５４ 特開平８－３１７７８６号公報 ＷＯ０３／００６６３５ ＷＯ２００９／０９９１５３ ＷＯ２０１０／０３８８７３ 特開２０１１－２１９５８５号公報 特開２０１１－２１９５８６号公報 ＷＯ２０１５／０１２４１５
　本発明は、従来とは全く異なる手段を用いて脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制し、当該細胞を大量に供給可能な方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、複数の孔を有する２つの表面層と、当該２つの表面層との間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜上で培養することで、驚くべきことに、脱分化しやすい細胞の自発的脱分化を抑制できることを見出し、本発明に至った。
　すなわち本発明は、以下の態様を有する。
［１］
　脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制する方法であって、
（１）前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
（２）前記細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法。
［２］
　前記細胞が軟骨細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞、エナメル芽細胞、乳腺上皮細胞、繊毛上皮細胞、腸上皮細胞、脂肪細胞、肝細胞、メサンギウム細胞、糸球体上皮細胞、類洞内皮細胞、又は筋芽細胞である、［１］に記載の方法。
［３］
　前記工程（２）が少なくとも３０日間実施される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
　前記工程（２）において、細胞を、ポリマー多孔質膜１平方センチメートル当たりに１．０ｘ１０5個以上となるまで増殖させる、［１］～［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］
　２以上のポリマー多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いる、［１］～［４］のいずれか１つに記載の方法。
［６］
　前記ポリマー多孔質膜を
　ｉ）折り畳んで、
　ｉｉ)ロール状に巻き込んで、
　ｉｉｉ)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
　ｉｖ）縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させて用いる、［１］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］
　工程（２）において、ポリイミド多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］
　工程（２）において、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない、［１］～［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］
　前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１～５０μｍである、［１］～［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１０］
　前記表面層Ｂの平均孔径が、２０～１００μｍである、［１］～［９］のいずれか１つに記載の方法。
［１１］
　前記ポリマー多孔質膜の膜厚が、５～５００μｍである、［１］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］
　前記ポリマー多孔質膜がポリイミド多孔質膜である、［１］～［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１３］
　ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、［１２］に記載の方法。
［１４］
　ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、［１２］又は［１３］に記載の方法。
［１５］
　前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン多孔質膜である、［１］～［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１６］
　脱分化しやすい細胞を調製する方法であって、
（１）前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
（２）前記細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程（２）において前記細胞の脱分化は抑制される、前記方法。
［１７］
　脱分化しやすい細胞を用いて物質を産生する方法であって、
（１）前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、
（２）前記細胞を培養し、増殖させる工程、及び
（３）前記細胞が産生する物質を回収する工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程（２）において前記細胞の脱分化は抑制される、前記方法。
［１８］
　前記細胞が軟骨細胞であって、前記物質がプロテオグリカン、コラーゲン及びヒアルロン酸から選択される少なくとも１つである、［１７］に記載の方法。
　本発明によれば、脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制し、当該細胞を大量に供給することができる。また、従来入手することが困難であった、当該細胞が産生する物質を大量に得ることができる。
図１は、ポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を示す。 図２は、細胞培養装置の一例を示す。 図３は、ヒト軟骨細胞をポリイミド多孔質膜で培養した際の細胞数の経時変化を示す。 図４は、ヒト軟骨細胞を培養しているポリイミド多孔質膜を、上下１枚ずつ空のポリイミド多孔質膜で挟んで接触させた場合の細胞の増殖結果について示す。 図５は、ヒト軟骨細胞をポリイミド多孔質膜で培養した際の細胞数の経時変化を示す。 図６は、ヒト軟骨細胞培養中のポリイミド多孔質膜をライブイメージングした試料の光学顕微鏡画像及び蛍光顕微鏡画像を示す。 図７は、ヒト軟骨細胞をポリイミド多孔質膜で培養した際の細胞数の経時変化を示す。 図８は、ヒト骨芽細胞をポリイミド多孔質膜で培養した際の細胞数の経時変化を示す。 図９は、ヒト骨芽細胞をポリイミド多孔質膜で培養した際の細胞数の経時変化を示す。 図１０は、長期間部材培養されたヒト骨芽細胞を石灰化誘導した後の光学顕微鏡画像を示す。 図１１は、ヒト骨芽細胞をポリイミド多孔質膜で培養した際の細胞数の経時変化を示す。 図１２は、ヒト骨芽細胞培養中のポリイミド多孔質膜をホルマリン固定した試料の電子顕微鏡画像を示す。 図１３は、ヒト骨芽細胞培養中のポリイミド多孔質膜をホルマリン固定した試料の蛍光顕微鏡画像を示す。
　本発明の一態様は、脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制する方法であって、
（１）前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
（２）前記細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法に関する。以下で「本発明の脱分化抑制方法」とも呼ぶ。
　また、本発明の別の態様は、脱分化しやすい細胞を調製する方法であって、
（１）前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
（２）前記細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程（２）において前記細胞の脱分化は抑制される、前記方法に関する。以下で「本発明の細胞調製方法」とも呼ぶ。
　また、本発明の別の態様は、脱分化しやすい細胞を用いて物質を産生する方法であって、
（１）前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、
（２）前記細胞を培養し、増殖させる工程、及び
（３）前記細胞が産生する物質を回収する工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程（２）において前記細胞の脱分化は抑制される、前記方法に関する。以下で「本発明の物質産生方法」とも呼ぶ。
　「本発明の脱分化抑制方法」、「本発明の細胞調製方法」及び「本発明の物質産生方法」を、以下で「本発明の方法」とも呼ぶ。
　本明細書中、「脱分化」とは、より未分化性の高い状態に戻ることを意味し、言い換えれば、分化とは逆のプロセスをいう。
　本発明の方法で使用される「脱分化しやすい細胞」としては、特に限定されないが、例えば従来の平板培養では脱分化する傾向にある細胞であり、好ましくは軟骨細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞、エナメル芽細胞、乳腺上皮細胞、繊毛上皮細胞、腸上皮細胞、脂肪細胞、肝細胞、メサンギウム細胞、糸球体上皮細胞、類洞内皮細胞、又は筋芽細胞である。より好ましくは、軟骨細胞又は骨芽細胞である。本明細書において、「脱分化しやすい細胞」を、以下で単に「本発明で使用される細胞」とも呼ぶ。
　本発明に利用し得る脱分化しやすい細胞の種類は、特に限定されないが、好ましくは哺乳動物の細胞であり、より好ましくは霊長類（ヒト、サルなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ又はフェレットの細胞であり、特に好ましくはヒトの細胞である。
　１．本発明で使用される細胞をポリマー多孔質膜へする適用する工程について
　本発明で使用される細胞のポリマー多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、細胞を膜状の担体に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法において、細胞のポリマー多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。
　（Ａ）細胞を前記ポリマー多孔質膜の表面に播種する工程を含む、態様；
　（Ｂ）前記ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に細胞懸濁液を載せ、
　放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞懸濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
　細胞懸濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様；並びに、
　（Ｃ）前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
　前記湿潤したポリマー多孔質膜に細胞懸濁液を装填し、そして、
　細胞懸濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。
　（Ａ）の態様は、ポリマー多孔質膜の表面に細胞、細胞塊を直接播種することを含む。あるいは、ポリマー多孔質膜を細胞懸濁液中に入れて、膜の表面から細胞培養液を浸潤させる態様も含む。
　ポリマー多孔質膜の表面に播種された細胞は、ポリマー多孔質膜に接着し、多孔の内部に入り込んでいく。好ましくは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞はポリマー多孔質膜に自発的に接着する。ポリマー多孔質膜の表面に播種された細胞は、膜の表面及び／又は内部において安定して生育・増殖することが可能である。細胞は生育・増殖する膜の位置に応じて、種々の異なる形態をとりうる。
　（Ｂ）の態様において、ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に細胞懸濁液を載せる。ポリマー多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞懸濁液を前記膜に吸い込ませることにより、細胞懸濁液が膜中に浸透する。理論に縛られるわけではないが、これはポリマー多孔質膜の各表面形状等に由来する性質によるものであると考えられる。本態様により、膜の細胞懸濁液が装填された箇所に細胞が吸い込まれて播種される。
　あるいは、（Ｃ）の態様のように、前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面の部分又は全体を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤してから、湿潤したポリマー多孔質膜に細胞懸濁液を装填してもよい。この場合、細胞懸濁液の通過速度は大きく向上する。
　例えば、膜の飛散防止を主目的として膜極一部を湿潤させる方法（以後、これを「一点ウェット法」と記載する）を用いることができる。一点ウェット法は、実質上は膜を湿潤させないドライ法（（Ｂ）の態様）にほぼ近いものである。ただし、湿潤させた小部分については、細胞液の膜透過が迅速になると考えられる。また、ポリマー多孔質膜の片面又は両面の全体を十分に湿潤させたもの（以後、これを「ウェット膜」と記載する）に細胞懸濁液を装填する方法も用いることができる（以後、これを「ウェット膜法」と記載する）。この場合、ポリマー多孔質膜の全体において、細胞懸濁液の通過速度が大きく向上する。
　（Ｂ）及び（Ｃ）の態様において、細胞懸濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる。これにより細胞懸濁液中の細胞の濃度を濃縮する、細胞以外の不要な成分を水分とともに流出させる、などの処理も可能になる。
　（Ａ）の態様を「自然播種」（Ｂ）及び（Ｃ）の態様を「吸込み播種」と呼称する場合がある。
　限定されるわけではないが、好ましくは、ポリマー多孔質膜には生細胞が選択的に留まる。よって、本発明の方法の好ましい実施形態において、生細胞が前記ポリマー多孔質膜内に留まり、死細胞は優先的に水分とともに流出する。
　態様（Ｃ）において用いる滅菌された液体は特に限定されないが、滅菌された緩衝液若しくは滅菌水である。緩衝液は、例えば、(+)及び(-)Dulbecco’s PBS 、(+)及び(-)Hank's Balanced Salt Solution等である。緩衝液の例を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　さらに、本発明の方法において、細胞のポリマー多孔質膜への適用は、浮遊状態にある接着性細胞をポリマー多孔質膜と懸濁的に共存させることにより細胞を膜に付着させる態様（絡め取り）も含む。例えば、本発明の方法において、細胞をポリマー多孔質膜に適用するために、細胞培養容器中に、細胞培養培地、細胞及び１又はそれ以上の前記ポリマー多孔質膜を入れてもよい。細胞培養培地が液体の場合、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である。ポリマー多孔質膜の性質から、細胞はポリマー多孔質膜に接着しうる。よって、生来浮遊培養に適さない細胞であっても、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態で培養することが可能である。好ましくは、細胞は、ポリマー多孔質膜に自発的に接着する。「自発的に接着する」とは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞がポリマー多孔質膜の表面又は内部に留まることを意味する。
　上述した細胞のポリマー多孔質膜への適用は、２種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いてもよい。例えば、態様（Ａ）～（Ｃ）のうち、２つ以上の方法を組み合わせてポリマー多孔質膜に細胞を適用してもよい。
　２．本発明で使用される細胞を培養し、増殖させる工程について
　細胞培養は、細胞培養における存在形態により培養細胞は接着培養系細胞と浮遊培養系細胞に分類することができる。接着培養系細胞は培養容器に付着し増殖する培養細胞であり、継代には培地交換を行う。浮遊培養系細胞は培地中において浮遊状態で増殖する培養細胞であり、一般的には継代の際には培地交換は行わず、希釈培養を行う。浮遊培養は、浮遊状態、即ち液体中での培養が可能なため、大量培養が可能であり、培養容器表面にのみ生育する付着細胞と比較すると、立体的な培養である為に、単位空間当りの培養可能細胞数は多いという利点がある。
　本発明の方法において、ポリマー多孔質膜を細胞培養培地中に浮遊した状態で用いる場合、２以上の前記ポリマー多孔質膜の小片を用いてもよい。ポリマー多孔質膜は立体的でフレキシブルな薄膜であるため、例えばその小片を培養液中に浮遊させて用いることにより、一定容量の細胞培養培地中に多くの培養可能な表面積を有するポリマー多孔質膜を持ち込むことが可能となる。通常培養の場合、容器底面積が細胞培養可能な面積の上限となるが、本発明のポリマー多孔質膜を用いた細胞培養では、先の持ち込まれたポリマー多孔質膜の大表面積の全てが細胞培養可能な面積となる。ポリマー多孔質膜は細胞培養液を通過させるので、例えば折りたたまれた膜内にも栄養や酸素等の供給が可能となる。また、ポリマー多孔質膜は従来の平面培養とは全く異なり、立体的かつフレキシブルな構造を有する細胞培養基材であるため、接着性を有する細胞を培養容器の形状を選ばず、様々な形状、材質、大きさの培養容器内でも培養可能である（例えば、シャーレ、フラスコ、タンク、バッグ等）。
　ポリマー多孔質膜の小片の大きさ、形状は、特に限定されない。形状は、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など任意の形をとりうる。
　本発明のポリマー多孔質膜は柔軟性があるため形状を変化させて用いることができる。ポリマー多孔質膜を平面状ではなく、立体状に形状を加工して用いてもよい。例えば、ポリマー多孔質膜を、ｉ）折り畳んで、ｉｉ)ロール状に巻き込んで、ｉｉｉ)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、ｉｖ）縄状に結んで、細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させてもよい。ｉ）～ｉｖ）のように形状を加工することにより、小片を用いる場合と同様に、一定容量の細胞培養培地中に多くのポリマー多孔質膜を入れることができる。さらに、各小片を集合体として取り扱うことができるため、細胞体を集合化して移動させることが可能となり、総合的な応用性が高い。
　小片集合体と同様の考え方として、２以上のポリマー多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いてもよい。積層とは、ポリマー多孔質膜が一部重なる態様も含む。積層培養により、狭いスペースで高密度に細胞を培養することが可能になる。既に細胞が育成している膜上にさらに膜を積層させて設置して別種細胞との多層系を形成することも可能である。積層するポリマー多孔質膜の数は特に限定されない。
　本発明の方法において、好ましくは、細胞はポリマー多孔質膜の表面及び内部に生育し増殖する。
　本発明の方法において、従来のようにトリプシン処理等を行う継代操作を行う事なく、少なくとも３０日間、少なくとも６０日間、少なくとも１２０日間、少なくとも２００日間、または少なくとも３００日間の長期にわたって、脱分化を抑制しながら細胞を培養することができる。また、本発明の方法により、従来の平面培養で培養することができる期間以上、例えば、平面培養期間の１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上の期間、脱分化を抑制しながら細胞を培養することができる。本発明によれば、シャーレ等の平面培養での長期間の細胞培養で発生する細胞の剥離や死滅等を生じる事なく、休止状態ではなく動的な生命を長期間維持する事ができる。また、本発明によれば、長期培養した細胞であってもセルバイアビリティ又は細胞の性質（例えば、細胞表面マーカーの発現量等）が、長期培養前の細胞と比較してほとんど変化しない。また、本発明によれば、細胞がポリマー多孔質膜内において三次元的に増殖するため、従来の平面培養で見られるような培養領域の制限及び平面環境によりおこるコンタクトインヒビションが起こりにくいため、長期間、生育させる培養が可能となる。また、本発明によれば、細胞が接着したポリマー多孔質膜に別のポリマー多孔質膜を接触させることによって、細胞培養可能な空間を任意に増加することが可能であり、従来のようなトリプシン処理を伴った継代操作を行うことなく、コンタクトインヒビションが引き起こされるコンフルエント状態を回避しながら長期間、増殖させる培養が可能となる。また、本発明によれば、細胞を凍結等行うことなく、生きたまま長期間保存するという新たな保存方法までも提供するものである。
　３．本発明で使用されるポリマー多孔質膜について
　本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ａ（以下で、「Ａ面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、０．０１μｍ以上２００μｍ未満、０．０１～１５０μｍ、０．０１～１００μｍ、０．０１～５０μｍ、０．０１μｍ～４０μｍ、０．０１μｍ～３０μｍ、０．０１μｍ～２０μｍ、又は０．０１μｍ～１５μｍであり、好ましくは、０．０１μｍ～１５μｍである。
　本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ｂ（以下で、「Ｂ面」又は「大穴面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、表面層Ａに存在する孔の平均孔径よりも大きい限り特に限定されないが、例えば、５μｍ超２００μｍ以下、２０μｍ～１００μｍ、３０μｍ～１００μｍ、４０μｍ～１００μｍ、５０μｍ～１００μｍ、又は６０μｍ～１００μｍであり、好ましくは、２０μｍ～１００μｍである。
　ポリマー多孔質膜表面の平均孔径は、多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真より、２００点以上の開孔部について孔面積を測定し、該孔面積の平均値から下式（１）に従って孔の形状が真円であるとした際の平均直径を計算より求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 （式中、Ｓａは孔面積の平均値を意味する。）
　表面層Ａ及びＢの厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１～５０μｍであり、好ましくは０．０１～２０μｍである。
　ポリマー多孔質膜におけるマクロボイド層中のマクロボイドの膜平面方向の平均孔径は、特に限定されないが、例えば１０～５００μｍであり、好ましくは１０～１００μｍであり、より好ましくは１０～８０μｍである。また、当該マクロボイド層中の隔壁の厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１～５０μｍであり、好ましくは、０．０１～２０μｍである。一の実施形態において、当該マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１～１００μｍの、好ましくは０．０１～５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、当該マクロボイド層中の隔壁は孔を有さない。
　本発明で使用されるポリマー多孔質膜の膜厚は、特に限定されないが、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上又は２５μｍ以上であってもよく、５００μｍ以下、３００μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下又は５０μｍ以下であってもよい。好ましくは、５～５００μｍであり、より好ましくは２５～７５μｍである。
　本発明で使用されるポリマー多孔質膜の膜厚の測定は、接触式の厚み計で行うことができる。
　本発明で使用されるポリマー多孔質膜の空孔率は特に限定されないが、例えば、４０％以上９５％未満である。
　本発明において用いられるポリマー多孔質膜の空孔率は、所定の大きさに切り取った多孔質フィルムの膜厚及び質量を測定し、目付質量から下式（２）に従って求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 （式中、Ｓは多孔質フィルムの面積、ｄは膜厚、ｗは測定した質量、Ｄはポリマーの密度をそれぞれ意味する。ポリマーがポリイミドである場合は、密度は１．３４ｇ／ｃｍ3とする。）
　本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ～１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ～１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１～２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５～５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリマー多孔質膜である。一の実施形態において、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１～１００μｍの、好ましくは０．０１～５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、隔壁は、そのような孔を有さない。
　本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、滅菌されていることが好ましい。滅菌処理としては、特に限定されないが、乾熱滅菌、蒸気滅菌、エタノール等消毒剤による滅菌、紫外線やガンマ線等の電磁波滅菌等任意の滅菌処理などが挙げられる。
　本発明で使用されるポリマー多孔質膜は、上記した構造的特徴を備える限り、特に限定されないが、好ましくはポリイミド、又はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）の多孔質膜である。
　ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。
　一実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、好ましくは、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを（主たる成分として）含むポリイミド多孔質膜であり、より好ましくはテトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドからなるポリイミド多孔質膜である。「主たる成分として含む」とは、ポリイミド多孔質膜の構成成分として、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミド以外の成分は、本質的に含まない、あるいは含まれていてもよいが、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドの性質に影響を与えない付加的な成分であることを意味する。
　本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜も含まれる。
　ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。
　ポリアミック酸は、アミック酸の一部がイミド化していても、本発明に影響を及ぼさない範囲であればそれを用いることができる。すなわち、ポリアミック酸は、部分的に熱イミド化又は化学イミド化されていてもよい。
　ポリアミック酸を熱イミド化する場合は、必要に応じて、イミド化触媒、有機リン含有化合物、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。また、ポリアミック酸を化学イミド化する場合は、必要に応じて、化学イミド化剤、脱水剤、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。ポリアミック酸溶液に前記成分を配合しても、着色前駆体が析出しない条件で行うことが好ましい。
　本明細書において、「着色前駆体」とは、２５０℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。
　上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得る着色前駆体としては、ポリアミック酸溶液又はポリイミド溶液に均一に溶解または分散し、２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理、好ましくは空気等の酸素存在下での２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理により熱分解し、炭化して着色化物を生成するものが好ましく、黒色系の着色化物を生成するものがより好ましく、炭素系着色前駆体がより好ましい。
　着色前駆体は、加熱していくと一見炭素化物に見えるものになるが、組織的には炭素以外の異元素を含み、層構造、芳香族架橋構造、四面体炭素を含む無秩序構造のものを含む。
　炭素系着色前駆体は特に制限されず、例えば、石油タール、石油ピッチ、石炭タール、石炭ピッチ等のタール又はピッチ、コークス、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体、フェロセン化合物（フェロセン及びフェロセン誘導体）等が挙げられる。これらの中では、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体及び／又はフェロセン化合物が好ましく、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体としてはポリアクリルニトリルが好ましい。
　また、別の実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、上記の着色前駆体を使用せずに、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液を成形した後、熱処理することにより得られる、ポリイミド多孔質膜も含まれる。
　着色前駆体を使用せずに製造されるポリイミド多孔質膜は、例えば、極限粘度数が１．０～３．０であるポリアミック酸３～６０質量％と有機極性溶媒４０～９７質量％とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製し、その後当該ポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化することにより製造されてもよい。この方法において、水を必須成分とする凝固溶媒が、水であるか、又は５質量％以上１００質量％未満の水と０質量％を超え９５質量％以下の有機極性溶媒との混合液であってもよい。また、上記イミド化の後、得られた多孔質ポリイミド膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施してもよい。
　上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るテトラカルボン酸二無水物は、任意のテトラカルボン酸二無水物を用いることができ、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。テトラカルボン酸二無水物の具体例として、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ－ＢＰＤＡ）、２，３，３’，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ａ－ＢＰＤＡ）などのビフェニルテトラカルボン酸二無水物、オキシジフタル酸二無水物、ジフェニルスルホン－３，４，３’，４’－テトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）スルフィド二無水物、２，２－ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン二無水物、２，３，３’，４’－ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’－ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）メタン二無水物、２，２－ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）プロパン二無水物、ｐ－フェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｐ－ビフェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｍ－ターフェニル－３，４，３’，４’－テトラカルボン酸二無水物、ｐ－ターフェニル－３，４，３’，４’－テトラカルボン酸二無水物、１，３－ビス（３，４－ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４－ビス（３，４－ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４－ビス（３，４－ジカルボキシフェノキシ）ビフェニル二無水物、２，２－ビス〔（３，４－ジカルボキシフェノキシ）フェニル〕プロパン二無水物、２，３，６，７－ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，４，５，８－ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、４，４’－（２，２－ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸二無水物等を挙げることができる。また、２，３，３’，４’－ジフェニルスルホンテトラカルボン酸等の芳香族テトラカルボン酸を用いることも好ましい。これらは単独でも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
　これらの中でも、特に、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族テトラカルボン酸二無水物が好ましい。ビフェニルテトラカルボン酸二無水物としては、３，３’，４，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物を好適に用いることができる。
　上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るジアミンは、任意のジアミンを用いることができる。ジアミンの具体例として、以下のものを挙げることができる。
　１）１，４－ジアミノベンゼン（パラフェニレンジアミン）、１，３－ジアミノベンゼン、２，４－ジアミノトルエン、２，６－ジアミノトルエンなどのベンゼン核１つのべンゼンジアミン；
　２）４，４’－ジアミノジフェニルエーテル、３，４’－ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、４，４’－ジアミノジフェニルメタン、３，３’－ジメチル－４，４’－ジアミノビフェニル、２，２’－ジメチル－４，４’－ジアミノビフェニル、２，２’－ビス（トリフルオロメチル）－４，４’－ジアミノビフェニル、３，３’－ジメチル－４，４’－ジアミノジフェニルメタン、３，３’－ジカルボキシ－４，４’－ジアミノジフェニルメタン、３，３’，５，５’－テトラメチル－４，４’－ジアミノジフェニルメタン、ビス（４－アミノフェニル）スルフィド、４，４’－ジアミノベンズアニリド、３，３’－ジクロロベンジジン、３，３’－ジメチルベンジジン、２，２’－ジメチルベンジジン、３，３’－ジメトキシベンジジン、２，２’－ジメトキシベンジジン、３，３’－ジアミノジフェニルエーテル、３，４’－ジアミノジフェニルエーテル、４，４’－ジアミノジフェニルエーテル、３，３’－ジアミノジフェニルスルフィド、３，４’－ジアミノジフェニルスルフィド、４，４’－ジアミノジフェニルスルフィド、３，３’－ジアミノジフェニルスルホン、３，４’－ジアミノジフェニルスルホン、４，４’－ジアミノジフェニルスルホン、３，３’－ジアミノベンゾフェノン、３，３’－ジアミノ－４，４’－ジクロロベンゾフェノン、３，３’－ジアミノ－４，４’－ジメトキシベンゾフェノン、３，３’－ジアミノジフェニルメタン、３，４’－ジアミノジフェニルメタン、４，４’－ジアミノジフェニルメタン、２，２－ビス（３－アミノフェニル）プロパン、２，２－ビス（４－アミノフェニル）プロパン、２，２－ビス（３－アミノフェニル）－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス（４－アミノフェニル）－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、３，３’－ジアミノジフェニルスルホキシド、３，４’－ジアミノジフェニルスルホキシド、４，４’－ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核２つのジアミン；
　３）１，３－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，３－ビス（３－アミノフェノキシ）－４－トリフルオロメチルベンゼン、３，３’－ジアミノ－４－（４－フェニル）フェノキシベンゾフェノン、３，３’－ジアミノ－４，４’－ジ（４－フェニルフェノキシ）ベンゾフェノン、１，３－ビス（３－アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３－ビス（３－アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３－ビス〔２－（４－アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４－ビス〔２－（３－アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４－ビス〔２－（４－アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核３つのジアミン；
　４）３，３’－ビス（３－アミノフェノキシ）ビフェニル、３，３’－ビス（４－アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’－ビス（３－アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’－ビス（４－アミノフェノキシ）ビフェニル、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、２，２－ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核４つのジアミン。
　これらは単独でも、２種以上を混合して用いることもできる。用いるジアミンは、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。
　これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、３，３’－ジアミノジフェニルエーテル、３，４’－ジアミノジフェニルエーテル、４，４’－ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、１，３－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェノキシ）ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。
　本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が２４０℃以上であるか、又は３００℃以上で明確な転移点がないテトラカルボン酸二無水物とジアミンとを組み合わせて得られるポリイミドから形成されていることが好ましい。
　本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、以下の芳香族ポリイミドからなるポリイミド多孔質膜であることが好ましい。
　（ｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
　（ｉｉ）テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び／又は、
　（ｉｉｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
　本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ～１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ～１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１～２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５～５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。ここで、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１～１００μｍの、好ましくは０．０１～５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。
　例えば、国際公開ＷＯ２０１０／０３８８７３、特開２０１１－２１９５８５、又は特開２０１１－２１９５８６に記載されているポリイミド多孔質膜も、本発明に使用可能である。
　本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、ポリエーテルスルホンを含み、典型的には実質的にポリエーテルスルホンからなる。ポリエーテルスルホンは当業者に公知の方法で合成されたものであってよく、例えば、二価フェノール、アルカリ金属化合物及びジハロゲノジフェニル化合物を有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法、二価フェノールのアルカリ金属二塩を予め合成しジハロゲノジフェニル化合物と有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法等によって製造できる。
　アルカリ金属化合物としては、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属水素化物、アルカリ金属アルコキシド等が挙げられる。特に、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムが好ましい。
　二価フェノール化合物としては、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシン、４，４’－ビフェノール、ビス（ヒドロキシフェニル）アルカン類（例えば２，２－ビス（ヒドロキシフェニル）プロパン、及び２，２－ビス（ヒドロキシフェニル）メタン）、ジヒドロキシジフェニルスルホン類、ジヒドロキシジフェニルエーテル類、又はそれらのベンゼン環の水素の少なくとも１つが、メチル基、エチル基、プロピル基等の低級アルキル基、又はメトキシ基、エトキシ基等の低級アルコキシ基で置換されたものが挙げられる。二価フェノール化合物としては、上記の化合物を二種類以上混合して用いることができる。
　ポリエーテルスルホンは市販品であってもよい。市販品の例としては、スミカエクセル７６００Ｐ、スミカエクセル５９００Ｐ（以上、住友化学(株)製）等が挙げられる。
　ポリエーテルスルホンの対数粘度は、ＰＥＳ多孔質膜のマクロボイドを良好に形成する観点で、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．５５以上であり、多孔質ポリエーテルスルホン膜の製造容易性の観点から、好ましくは１．０以下、より好ましくは０．９以下、更に好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．７５以下である。
　また、ＰＥＳ多孔質膜、又はその原料としてのポリエーテルスルホンは、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が、２００℃以上であるか、又は明確なガラス転移温度が観察されないことが好ましい。
　本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜の製造方法は特に限定されないが、例えば、
　対数粘度０．５～１．０のポリエーテルスルホンの０．３質量％～６０質量％と有機極性溶媒４０質量％～９９．７質量％とを含むポリエーテルスルホン溶液を、フィルム状に流延し、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、空孔を有する凝固膜を作製する工程、及び
　前記工程で得られた空孔を有する凝固膜を熱処理して前記空孔を粗大化させて、ＰＥＳ多孔質膜を得る工程
を含み、前記熱処理は、前記空孔を有する凝固膜を、前記ポリエーテルスルホンのガラス転移温度以上、若しくは２４０℃以上まで昇温させることを含む、方法で製造されてもよい。
　本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、好ましくは、表面層Ａ、表面層Ｂ、及び前記表面層Ａと前記表面層Ｂとの間に挟まれたマクロボイド層、を有するＰＥＳ多孔質膜であって、
　前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた、膜平面方向の平均孔径が１０μｍ～５００μｍである複数のマクロボイドとを有し、
　前記マクロボイド層の隔壁は、厚さが０．１μｍ～５０μｍであり、
　前記表面層Ａ及びＢはそれぞれ、厚さが０．１μｍ～５０μｍであり、
　前記表面層Ａ及びＢのうち、一方が平均孔径５μｍ超２００μｍ以下の複数の細孔を有し、かつ他方が平均孔径０．０１μｍ以上２００μｍ未満の複数の細孔を有し、
　表面層Ａ及び表面層Ｂの、一方の表面開口率が１５％以上であり、他方の表面層の表面開口率が１０％以上であり、
　前記表面層Ａ及び前記表面層Ｂの前記細孔が前記マクロボイドに連通しており、
　前記ＰＥＳ多孔質膜は、総膜厚が５μｍ～５００μｍであり、かつ空孔率が５０％～９５％である、
ＰＥＳ多孔質膜である。
　４．細胞培養と培養体積
　ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を図１に示す。図１は理解を助けるための図であり、各要素は実寸ではない。本発明の方法では、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、培養することにより、ポリマー多孔質膜の有する内部の多面的な連結多孔部分や表面に、大量の細胞が生育するため、大量の細胞を簡便に培養することが可能となる。また、本発明の方法では、細胞培養に用いる培地の量を従来の方法よりも大幅に減らしつつ、大量の細胞を培養することが可能となる。たとえば、ポリマー多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない状態であっても、大量の細胞を長期にわたって培養することができる。また、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和に対して、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積を著しく減らすことも可能となる。
　本明細書において、細胞を含まないポリマー多孔質膜がその内部間隙の体積も含めて空間中に占める体積を「見かけ上ポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図１参照）。そして、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、ポリマー多孔質膜の表面及び内部に細胞が担持された状態において、ポリマー多孔質膜、細胞、及びポリマー多孔質膜内部に浸潤した培地が全体として空間中に占める体積を「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図１参照）。膜厚２５μｍのポリマー多孔質膜の場合、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積は、見かけ上ポリマー多孔質膜体積より、最大で５０％程度大きな値となる。本発明の方法では、１つの細胞培養容器中に複数のポリマー多孔質膜を収容して培養することができるが、その場合、細胞を担持した複数のポリマー多孔質膜のそれぞれについての細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和を、単に「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和」と記載することがある。
　本発明の方法を用いることにより、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することが可能となる。また、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。さらに、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。そして、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。
　つまり、本発明によれば、細胞培養する空間（容器）を従来の二次元培養を行う細胞培養装置に比べて極限まで小型化可能となる。また、培養する細胞の数を増やしたい場合は、積層するポリマー多孔質膜の枚数を増やす等の簡便な操作により、柔軟に細胞培養する体積を増やすことが可能となる。本発明に用いられるポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置であれば、細胞を培養する空間（容器）と細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）とを分離することが可能となり、培養する細胞数に応じて、必要となる量の細胞培養培地を準備することが可能となる。細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）は、目的に応じて大型化又は小型化してもよく、あるいは取り替え可能な容器であってもよく、特に限定されない。
　本発明の方法において、たとえば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数が、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして、培地１ミリリットルあたり１．０×１０5個以上、１．０×１０6個以上、２．０×１０6個以上、５．０×１０6個以上、１．０×１０7個以上、２．０×１０7個以上、５．０×１０7個以上、１．０×１０8個以上、２．０×１０8個以上、５．０×１０8個以上、１．０×１０9個以上、２．０×１０9個以上、または５．０×１０9個以上となるまで培養することをいう。
　なお、培養中または培養後の細胞数を計測する方法としては、種々の公知の方法を用いることができる。たとえば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数を、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして計測する方法としては、公知の方法を適宜用いることができる。たとえば、ＣＣＫ８を用いた細胞数計測法を好適に用いることができる。具体的には、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｉｇ　Ｋｉｔ８；同仁化学研究所製溶液試薬（以下、「ＣＣＫ８」と記載する。）を用いて、ポリマー多孔質膜を用いない通常の培養における細胞数を計測し、吸光度と実際の細胞数との相関係数を求める。その後、細胞を適用し、培養したポリマー多孔質膜を、ＣＣＫ８を含む培地に移し、１～３時間インキュベータ内で保存し、上清を抜き出して４８０ｎｍの波長にて吸光度を測定して、先に求めた相関係数から細胞数を計算する。
　また、別の観点からは、細胞の大量培養とは、たとえば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後にポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数が１．０×１０5個以上、２．０×１０5個以上、１．０×１０6個以上、２．０×１０6個以上、５．０×１０6個以上、１．０×１０7個以上、２．０×１０7個以上、５．０×１０7個以上、１．０×１０8個以上、２．０×１０8個以上、または５．０×１０8個以上となるまで培養することをいう。ポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数は、セルカウンター等の公知の方法を用いて適宜計測することが可能である。
　５．細胞の培養システム及び培養条件
　本発明の方法において、細胞の培養システム及び培養条件は、細胞の種類等に応じて適宜決定することができる。脱分化しやすい細胞に適した培養方法が公知であり、当業者は任意の公知の方法を用いてポリマー多孔質膜に適用した細胞を培養することができる。細胞培養培地も細胞の種類に応じて適宜調製することができる。
　脱分化しやすい細胞の細胞培養培地は、例えば、ロンザ社やタカラバイオ社の細胞培養培地カタログに記載されている。本発明の方法に用いることの細胞培養培地は、液体培地、半固形培地、固形培地等のいずれの形態であってもよい。また、液滴状とした液体培地を細胞培養容器中に噴霧することにより、細胞を担持したポリマー多孔質膜に培地が接触するようにしてもよい。
　ポリマー多孔質膜を用いる細胞の培養に関して、マイクロキャリアやセルローススポンジ等、他の浮遊型培養担体と共存させることもできる。
　本発明の方法において、培養に用いるシステムの形状、規模などは特に限定されず、細胞培養用のシャーレ、フラスコ、プラスチックバッグ、試験管から大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のＮｕｎｃ　セルファクトリー等が含まれる。なお、本発明においてポリマー多孔質膜を用いることにより、生来浮遊培養が可能でなかった細胞についても浮遊培養向け装置にて、浮遊培養類似状態での培養を行うことが可能になった。浮遊培養用の装置としては、例えば、コーニング社製のスピナーフラスコや回転培養等が使用可能である。また、同様の機能を実現出来る環境として、ＶＥＲＩＴＡＳ社のＦｉｂｅｒＣｅｌｌ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍの様な中空糸培養システムも使用することが可能である。
　本発明の方法における培養は、ポリマー多孔質膜上に連続的に培地を添加し回収するような連続循環もしくは開放型の装置を用いて、空気中にポリマー多孔質膜シートを露出させるような型式で実行することも可能である。
　本発明において、細胞の培養は、細胞培養容器外に設置された細胞培養培地供給手段から連続的又は間歇的に細胞培養培地が細胞培養容器中に供給される系で行ってもよい。その際、細胞培養培地が細胞培養培地供給手段と細胞培養容器との間を循環する系であることができる。
　細胞の培養を、細胞培養容器外に設置された細胞培養培地供給手段から連続的又は間歇的に細胞培養培地が細胞培養容器中に供給される系で行う場合、その系は、細胞培養容器である培養ユニットと細胞培養培地供給手段である培地供給ユニットとを含む細胞培養装置であってよく、ここで
　　培養ユニットは細胞を担持するための１又は複数のポリマー多孔質膜を収容する培養ユニットであって、培地供給口および培地排出口を備えた培養ユニットであり、
　　培地供給ユニットは培地収納容器と、培地供給ラインと、培地供給ラインを介して連続的又は間歇的に培地を送液する送液ポンプとを備え、ここで培地供給ラインの第一の端部は培地収納容器内の培地に接触し、培地供給ラインの第二の端部は培養ユニットの培地供給口を介して培養ユニット内に連通している、培地供給ユニットである
細胞培養装置であってよい。
　また、上記細胞培養装置において、培養ユニットは空気供給口、空気排出口、及び酸素交換膜を備えない培養ユニットであってよく、また、空気供給口及び空気排出口、又は酸素交換膜を備えた培養ユニットであってよい。培養ユニットは空気供給口及び空気排出口、並びに酸素交換膜を備えないものであっても、細胞の培養に必要な酸素等が培地を通じて十分に細胞に供給される。さらに、上記細胞培養装置において、培養ユニットが培地排出ラインをさらに備え、ここで培地排出ラインの第一の端部は培地収納容器に接続し、培地排出ラインの第二の端部は培養ユニットの培地排出口を介して培養ユニット内に連通し、培地が培地供給ユニットと培養ユニットとを循環可能であってよい。
　上記細胞の培養システムの一例である細胞培養装置の例を図２に示すが、本発明の目的のために用いることができる細胞の培養システムはこれに限定されるものではない。
　６．本発明の物質産生方法について
　本発明の物質産生方法において、上述したように細胞を培養することにより、細胞から所望の物質を産生させる。産生された物質が、細胞内に留まる物質であっても、細胞から分泌される物質であってもよい。産生された物質は、物質の種類、性質に応じて公知の方法により回収することが可能である。細胞から分泌される物質の場合、細胞培養培地から物質を回収することができる。産生された物質が細胞内に留まる物質の場合、細胞溶解剤等を用いた化学的処理、超音波処理、ホモジナイザー、破砕用ディスポチューブ等を用いた物理的処理などの公知の方法により細胞を破壊することにより、物質を細胞外に出して回収することが可能である。細胞を破壊する方法は、細胞の種類、物質の種類等に応じて適宜当業者が適用可能である。
　本発明の物質産生方法の一実施形態において、使用される細胞は軟骨細胞であって、前記物質がプロテオグリカン、コラーゲン及びヒアルロン酸から選択される少なくとも１つである。
　以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。なお本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
　以下の実施例で使用されたポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分である３，３’，４，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ－ＢＰＤＡ）とジアミン成分である４，４’－ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）とから得られるポリアミック酸溶液と、着色前駆体であるポリアクリルアミドとを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより、調製された。得られたポリイミド多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、当該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、表面層Ａに存在する孔の平均孔径は６μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は４６μｍであり、膜厚が２５μｍであり、空孔率が７３％であった。
　実施例１
　ポリイミド多孔質膜上でのヒト軟骨細胞の培養
　２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Thermo Fisher Scientific社 cat.103）に軟骨細胞増殖培地（PromoCell社製）１ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にして培地に浸漬させた。１枚のシートあたり４×１０4個のヒト軟骨細胞を播種し、週２回培地（１ｍｌ）を交換しながらＣＯ2インキュベータ内で培養を継続的に行った。ポリイミド多孔質膜を使用した上記培養を以下で「部材培養」と呼び、得られた細胞サンプルを以下で「部材培養細胞サンプル」と呼ぶ。培養開始後、Cell Counting Kit-8（同仁化学研究所製、以下で「ＣＣＫ８」と呼ぶ）を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図３に示す。長期間に亘る、安定したヒト軟骨細胞の増殖及び生育が観察された。
　実施例２
　ポリイミド多孔質膜から空のポリイミド多孔質膜へのヒト軟骨細胞の移動（気相継代法）
　実施例１に記載の方法に従って、ヒト軟骨細胞を５９日間ＣＯ2インキュベータ内で培養した。培養中の細胞の生育したポリイミド多孔質膜シートに対し、新規な同サイズのポリイミド多孔質膜各１枚で上下を挟み、３段重ねのポリイミド多孔質膜積層体を１セット用意した。この３段重ねの積層体を、培地中に置いたメッシュの上に気相に接する様に置き、ＣＯ2インキュベータ内で培養を継続した。７日間後、それぞれの積層体を１枚毎に独立させ、各ポリイミド多孔質膜の細胞数についてＣＣＫ８を用いて測定した。結果を図４に示す。
　上部・下部のシート共に、接触により十分量の細胞が生着し、独立後も順調に細胞数の上昇が確認された。約４週間で、生育細胞数上限近傍に達した。
　実施例３
　ヒト軟骨細胞の長期培養
　実施例１のヒト軟骨細胞の培養を、実施例１と同一の条件下でさらに継続した。ＣＣＫ８を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図５に示す。
　培養開始後１７０日目の部材培養中のポリイミド多孔質膜をディッシュ（口内径３５ｍｍ）に滅菌的に移送した。培地１ｍｌを加え、更に、CellMask Orange Plasma Membrane Stain（１μＬ）及びHoechst33342（PromoKine社製）（０．５μＬ）を加えてインキュベータ内に５分静置した。その後、染色試薬の入った培地を除去し、新しい培地を加えて、染色を完了した。培地ごと、ポリイミド多孔質膜を２穴プラスチックチャンバ（ザルスタット社製）に移動し、共焦点レーザー顕微鏡により細胞を生かしたままで蛍光顕微鏡画像を取得した。また、同視野の光学顕微鏡画像を所得した。画像を図６に示す。ポリイミド多孔質膜Ａ面のメッシュ構造に適合する形状で、軟骨細胞が観察された。
　実施例４
　ヒト軟骨細胞からの物質産生
　実施例３における、培養開始後１２０日目及び３６５日目の部材培養細胞サンプル、及び当該細胞サンプルを培養した後の培地を回収し、ＥＬＩＳＡ法によってタイプＩＩコラーゲン及びプロテオグリカンの産生量を測定した。なお、部材培養細胞サンプルについては、外部からの超音波破砕によって細胞壁を破壊し、細胞内のタイプＩＩコラーゲン及びプロテオグリカンを回収した。
　また、ポリイミド多孔質膜を使用しないこと以外は実施例３と同様の条件で、細胞培養用シャーレ（住友ベークライト製）中でヒト軟骨細胞を１回継代後に５日間培養した。ポリイミド多孔質膜を使用しない培養を以下で「通常培養」と呼び、得られた細胞サンプルを「通常培養細胞サンプル」と呼ぶ。当該通常培養細胞サンプル、及び当該細胞サンプルを培養した後の培地を回収して、ＥＬＩＳＡ法によってタイプＩＩコラーゲン及びプロテオグリカンの産生量を測定した。
　回収されたタイプＩＩコラーゲン及びプロテオグリカンの量を以下に示す。タイプＩＩコラーゲン及びプロテオグリカンの高い産生量維持が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　タイプＩＩコラーゲン及びプロテオグリカンは、ヒト軟骨細胞に特有の物質である。長期培養した後であっても脱分化しやすい細胞であるヒト軟骨細胞の特性が維持されていることから、本発明の方法を使用することによって、脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制可能であることが実証された。
　実施例５
　ヒト軟骨細胞の長期培養及び物質産生（細胞の初期播種数の違いが及ぼす影響）
　２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Thermo Fisher Scientific社、cat.103）に軟骨細胞増殖培地（PromoCell社製）１ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にして培地に浸漬させた。１枚のシートあたり４×１０4又は２×１０4個の軟骨細胞をそれぞれ播種し、週２回培地（１ｍｌ）を交換しながらＣＯ2インキュベータ内で培養を継続的に行った。ＣＣＫ８を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図７に示す。細胞の初期播種数には大きく依存せずに、ヒト軟骨細胞を安定して長期に培養することができた。
　ヒト軟骨細胞の培養開始後３９日目及び２７７日目の部材培養細胞サンプル（初期播種細胞数４．０×１０4個）、及び当該細胞サンプルを培養した後の培地を回収し、ＥＬＩＳＡ法によってタイプＩＩコラーゲン及びプロテオグリカンの産生量を測定した。なお、部材培養細胞サンプルについては、外部からの超音波破砕によって細胞壁を破壊し、細胞内のタイプＩＩコラーゲン及びプロテオグリカンを回収した。
　回収されたタイプＩＩコラーゲン及びプロテオグリカンの量を以下に示す。長期間の部材培養後であっても、ヒト軟骨細胞においてタイプＩＩコラーゲン及びプロテオグリカンの高い産生量維持が確認された。また、実施例４の結果と比較しても、物質産生量の再現性が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　実施例６
　ポリイミド多孔質膜上でのヒト骨芽細胞の培養
　２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Thermo Fisher Scientific社、cat.103）に骨芽細胞増殖培地 （PromoCell社製、C-27001）１ｍｌを加え、滅菌した１．４cm角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にして培地に浸漬させた。1枚のシートあたり４×１０４個のヒト骨芽細胞（PromoCell社製）を播種し、ＣＯ２インキュベータ内で培養を継続的に行った。週２回培地（１ｍｌ）を交換した。培養開始後、ＣＣＫ８を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図８に示す。長期間に亘る、安定した細胞の増殖及び生育が観察された。
　実施例７
　ポリイミド多孔質膜上でのヒト骨芽細胞の培養と石灰化誘導
　２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Thermo Fisher Scientific社、cat.103）に骨芽細胞増殖培地 （PromoCell社製、C-27001）１ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にして培地に浸漬させた。１枚のシートあたり４×１０4又は２×１０4個のヒト骨芽細胞（PromoCell社製）を播種し、週２回培地（１ｍｌ）を交換しながらＣＯ2インキュベータ内で培養を継続的に行った。培養開始後、ＣＣＫ８を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図９に示す。細胞の初期播種数には大きく依存せずに、長期間に亘る、安定したヒト骨芽細胞の増殖及び生育が観察された。
　培養開始後８３日目及び２２４日目の部材培養中のポリイミド多孔質膜（それぞれ「サンプル１」及び「サンプル２」と呼ぶ）を、石灰化誘導培地（PromoCell社製、骨芽細胞石灰化培地）を加えた、２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器にそれぞれ移送し、石灰化誘導を実施した。誘導期間経過後、石灰化染色キット（コスモバイオ製）にて染色し、石灰化部分の赤変を光学顕微鏡にて観察した。結果を以下の表及び図１０に示す。表中の石灰化誘導前の生育細胞数はＣＣＫ８を用いて計測した。図１０の顕微鏡画像において特長ある赤変部が観察され、骨芽細胞特性が長期培養の中で継続的に維持されることが分かった。長期間培養した後であっても、脱分化しやすい細胞である骨芽細胞の特性（石灰化能）が維持されていることから、本発明の方法を使用することによって、脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制可能であることが実証された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　実施例８
　ポリイミド多孔質膜上でのヒト骨芽細胞の培養と顕微鏡観察
　２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Thermo Fisher Scientific社、cat.103）に骨芽細胞増殖培地 （Promo Cell社製、C-27001）１ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にして容器の培地に浸漬させた。１枚のポリイミド多孔質膜あたり４×１０4又は２×１０4個のヒト骨芽細胞（PromoCell社製）をそれぞれ播種し、週２回培地（１ｍｌ）を交換しながらＣＯ2インキュベータ内で培養を継続的に行った。培養開始後、ＣＣＫ８を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図１１に示す。細胞の初期播種数には大きく依存せずに、長期間に亘る、安定したヒト骨芽細胞の増殖及び生育が観察された。
　培養開始後、１６０日目の部材培養中のポリイミド多孔質膜をホルマリン固定し、電子顕微鏡観察を行った。具体的には、２.５％グルタールアルデヒド、２％ホルムアルデヒド混合固定液でポリイミド多孔質膜を固定後、四酸化オスミウム後固定を行い、逐次的エタノール置換法で脱水後に、液体窒素温度にて凍結割断を行った。ｔ－ブチルアルコールを用いた凍結真空乾燥後、オスミウムプラズマ蒸着により帯電防止処理を行い、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察を実施した。観察には電界放出型ＳＥＭを用い、加速電圧５ｋＶ、高真空下で二次電子像とし、観察を行った。結果を図１２に示す。細胞の整列、細胞の多重積層構造の形成、及び膜表層部と膜近傍（内部）層における細胞の整列の相違性など、多くの興味深い部材培養挙動が観察された。
　培養開始後、１７１日目の部材培養中のポリイミド多孔質膜をホルマリン固定し、蛍光顕微鏡観察を行った。具体的には、ポリイミド多孔質膜をホルマリン固定後、Alexa Fluor（登録商標）488ファロイジン、CellMask Orange Plasma Membrane Stain、及びDAPIで染色し、共焦点レーザー顕微鏡により蛍光顕微画像を取得した。結果を図１３に示す。Ａ面表層とＢ面表層の２つの異なる表層部を測定し、細胞の集合状況を検証した。どちらの表層部においても、強い配向性が見られる事が明らかであり、ＳＥＭ解析と良く一致した結果となった。また、配向の形状に関しては、Ａ面側では、幅広い細胞が多く観察される事実に対し、Ｂ面側では細長い細胞群の整列が観察された。この事実も、ＳＥＭ解析と良く一致した結果であった。ポリイミド多孔質膜の２つの異なる表面が、長期培養後に細胞の集合状態にも大きく影響を与えうるという事実が複数の分析手段で一致した見解として観察されており、非常に興味深い結果と言える。
　本発明の方法は、脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制し、当該細胞を大量に供給するために利用することができる。また、従来入手することが困難であった、当該細胞が産生する物質を大量に得るために利用することができる。

Claims (18)

  1. 　脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制する方法であって、
    （１）前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
    （２）前記細胞を培養し、増殖させる工程
    を含み、
    ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法。
  2. 　前記細胞が軟骨細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞、エナメル芽細胞、乳腺上皮細胞、繊毛上皮細胞、腸上皮細胞、脂肪細胞、肝細胞、メサンギウム細胞、糸球体上皮細胞、類洞内皮細胞、又は筋芽細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記工程（２）が少なくとも３０日間実施される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記工程（２）において、細胞を、ポリマー多孔質膜１平方センチメートル当たりに１．０ｘ１０5個以上となるまで増殖させる、請求項１～３のいずれか1項に記載の方法。
  5. 　２以上のポリマー多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記ポリマー多孔質膜を
    　ｉ）折り畳んで、
    　ｉｉ)ロール状に巻き込んで、
    　ｉｉｉ)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
    　ｉｖ）縄状に結んで
    細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させて用いる、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　工程（２）において、ポリイミド多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　工程（２）において、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１～５０μｍである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記表面層Ｂの平均孔径が、２０～１００μｍである、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記ポリマー多孔質膜の膜厚が、５～５００μｍである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　前記ポリマー多孔質膜がポリイミド多孔質膜である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 　前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン多孔質膜である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　脱分化しやすい細胞を調製する方法であって、
    （１）前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
    （２）前記細胞を培養し、増殖させる工程
    を含み、
    ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
    前記工程（２）において前記細胞の脱分化は抑制される、前記方法。
  17. 　脱分化しやすい細胞を用いて物質を産生する方法であって、
    （１）前記細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、
    （２）前記細胞を培養し、増殖させる工程、及び
    （３）前記細胞が産生する物質を回収する工程
    を含み、
    ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
    前記工程（２）において前記細胞の脱分化は抑制される、前記方法。
  18. 　前記細胞が軟骨細胞であって、前記物質がプロテオグリカン、コラーゲン及びヒアルロン酸から選択される少なくとも１つである、請求項１７に記載の方法。
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