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WO2020169903A1 - Composition adjuvante pour vaccin - Google Patents

Composition adjuvante pour vaccin Download PDF

Info

Publication number
WO2020169903A1
WO2020169903A1 PCT/FR2020/050267 FR2020050267W WO2020169903A1 WO 2020169903 A1 WO2020169903 A1 WO 2020169903A1 FR 2020050267 W FR2020050267 W FR 2020050267W WO 2020169903 A1 WO2020169903 A1 WO 2020169903A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
isoparaffins
weight
carbon atoms
oil
vaccine
Prior art date
Application number
PCT/FR2020/050267
Other languages
English (en)
Inventor
Benjamin Swoboda
Original Assignee
Total Marketing Services
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Total Marketing Services filed Critical Total Marketing Services
Priority to BR112021015900-2A priority Critical patent/BR112021015900A2/pt
Priority to US17/430,554 priority patent/US20220125918A1/en
Priority to EP20710220.3A priority patent/EP3927373A1/fr
Priority to MX2021009718A priority patent/MX2021009718A/es
Priority to CN202080013930.4A priority patent/CN113423424A/zh
Publication of WO2020169903A1 publication Critical patent/WO2020169903A1/fr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59

Definitions

  • the present invention relates to a new adjuvant composition for a vaccine comprising a predominantly isoparaffinic hydrocarbon oil and a surfactant.
  • live antigens vaccines called “attenuated virus” or vaccines called “inactivated virus” (inactivated antigen).
  • Attenuated or inactivated virus vaccines have limited efficacy which requires the use of an adjuvant.
  • the attenuated or inactivated virus dissolved in water, is dispersed in an oil, its effectiveness is greatly increased.
  • This dispersion called emulsion, must be stable and as fluid as possible, stable to have good preservation of the vaccine and fluid to be able to be injected quickly and painlessly.
  • the oil thus acts as an adjuvant.
  • the reference oil used as a vaccine adjuvant is a white oil
  • Marcol TM 52 consisting of paraffins and naphthenic compounds.
  • Document FR 2 922 767 discloses the use, in an adjuvant composition for a vaccine, of various oils of mineral, plant or animal origin as well as of synthetic oils.
  • This document discloses, among other things, white oil Marcol TM 52 and an isohexadecane corresponding to the commercial product Creasil® IH CG. These oils are formulated with surfactants in vaccine adjuvants.
  • oils have the disadvantage of having a certain cytotoxicity towards immune cells such as isolated mononuclear cells from peripheral blood (PBMC), macrophages and dendritic cells.
  • PBMC peripheral blood
  • macrophages and dendritic cells.
  • Document RU2072868 proposes an oil as an adjuvant for a vaccine
  • the nature of the adjuvant oil can also have an effect on the immune response of the subject treated.
  • the present invention aims to provide a vaccine adjuvant inducing a strong immune response and the lowest possible cytotoxicity.
  • the invention relates to an adjuvant composition for a vaccine comprising, relative to the total weight of the adjuvant composition:
  • hydrocarbon oil comprising a content by weight of isoparaffins ranging from 90 to 100% relative to the total weight of the hydrocarbon oil, said isoparaffins including isoparaffins having 17 carbon atoms or 18 carbon atoms and
  • said isoparaffins comprise, relative to the total weight of isoparaffins, at least 2% by weight of isoparaffins having 17 carbon atoms and / or isoparaffins having 18 carbon atoms.
  • the hydrocarbon oil comprises:
  • the surfactant is chosen from nonionic surfactants, preferably sorbitan esters, preferably sorbitan fatty acid esters, preferably the surfactant is a sorbitan monooleate.
  • the composition of the invention comprises, relative to the total weight of the composition: - from 60 to 98% by weight of hydrocarbon oil comprising a content by weight of isoparaffins ranging from 95 to 100% relative to the total weight of the oil
  • isoparaffins including isoparaffins having 17 carbon atoms and / or 18 carbon atoms
  • the present invention also relates to a vaccine comprising the adjuvant composition according to the invention and at least one antigen.
  • the vaccine is in the form of a water-in-oil emulsion.
  • the mass ratio between the aqueous phase and the fatty phase of the water-in-oil emulsion ranges from 50/50 to 10/90, preferably from 40/60 to 20 / 80 and more preferably is 30/70.
  • the present invention also relates to the use of an adjuvant composition according to the invention for reducing the cytotoxicity of a vaccine comprising said adjuvant composition.
  • the present invention also relates to the use of hydrocarbon oil
  • an adjuvant composition for a vaccine for reducing the cytotoxicity of the vaccine comprising said adjuvant composition.
  • the present invention also relates to the use of hydrocarbon oil
  • an adjuvant composition for a vaccine in an adjuvant composition for a vaccine, to improve the stability of the vaccine, in particular for a vaccine in the form of an emulsion.
  • the adjuvant composition according to the invention makes it possible to have a composition for a vaccine that is not very cytotoxic while inducing a strong anti-infectious response of the immune cells.
  • the adjuvant composition according to the invention makes it possible to prepare vaccines which are both stable and fluid.
  • FIG. 1 Effects of oils on the viability and activation of PBMCs, in the absence of parallel antigenic stimulation.
  • FIG. 2 Effects of oils on the viability and activation of macrophages, in the absence of parallel antigen stimulation.
  • FIG. 3 Effects of oils on the viability and activation of dendritic cells, in the absence of parallel antigen stimulation.
  • the invention relates to an adjuvant composition for a vaccine comprising, relative to the total weight of the adjuvant composition:
  • hydrocarbon oil comprising a content by weight of isoparaffins ranging from 90 to 100% relative to the total weight of the hydrocarbon oil, said isoparaffins including isoparaffins having 17 carbon atoms and / or 18 carbon atoms and
  • the hydrocarbon oil comprises a content by weight of isoparaffins ranging from 90 to 100% relative to the total weight of the hydrocarbon oil.
  • isoparaffins of hydrocarbon oil include isoparaffins having 17 carbon atoms and / or isoparaffins having 18 carbon atoms.
  • the hydrocarbon oil used in the adjuvant composition comprises between 90 and 100% by weight of isoparaffins relative to the total weight of the hydrocarbon oil, said isoparaffins including, relative to the total weight of isoparaffins, at least 2% by weight of isoparaffins having 17 carbon atoms and / or isoparaffins having 18 carbon atoms.
  • the hydrocarbon oil of the adjuvant composition comprises a content by weight of isoparaffins greater than or equal to 95% and advantageously greater than or equal to 98% relative to the total weight of the 'hydrocarbon oil, said isoparaffins including, relative to the total weight of
  • isoparaffins at least 2% by weight of isoparaffins having 17 carbon atoms and / or isoparaffins having 18 carbon atoms.
  • the hydrocarbon oil of the adjuvant composition comprises a content by weight of isoparaffins greater than or equal to 95% and advantageously greater than or equal to 98% relative to the total weight of the 'hydrocarbon oil, said isoparaffins including, relative to the total weight of isoparaffins, at least 20% by weight of isoparaffins having 17 carbon atoms and / or isoparaffins having 18 carbon atoms.
  • the isoparaffins contained in the hydrocarbon oil include, relative to the total weight of the isoparaffins, at least 20% by weight, preferably at least 30% by weight, preferably at least 35% by weight, preferably at least 40% by weight, preferably at least 60% by weight, preferably at least 80% by weight of isoparaffins having 17 carbon atoms and / or isoparaffins having 18 atoms of carbon.
  • the hydrocarbon oil of the adjuvant composition comprises a content by weight of isoparaffins greater than or equal to 95% and advantageously greater than or equal to 98% relative to the total weight of the 'hydrocarbon oil and at least 90%, preferably at least 95%, by weight of said isoparaffins, relative to the total weight of isoparaffins present in the hydrocarbon oil, contain from 12 to 30 carbon atoms, preferably from 13 to 19 carbon atoms, more preferably 14 to 18 carbon atoms.
  • the hydrocarbon oil comprises:
  • isoparaffins are non-cyclic isoparaffins.
  • the hydrocarbon oil according to the invention preferably comprises a content of normal paraffins less than or equal to 10% by weight, preferably less than or equal to 5% by weight and advantageously less than or equal to 2% by weight, relative to the total weight of the hydrocarbon oil.
  • the hydrocarbon oil according to the invention preferably comprises, relative to the total weight of the hydrocarbon oil, an isoparaffin content ranging from 90 to 100% by weight and a normal paraffin content. ranging from 0 to 10% by weight, preferably from 95 to 100% by weight of isoparaffins and from 0 to 5% by weight of normal paraffins and more preferably from 98% to 100% by weight of isoparaffins and from 0 to 2 % by weight of normal paraffins. Even more advantageously, the hydrocarbon-based oil of the adjuvant composition according to the invention does not contain normal paraffins.
  • the hydrocarbon oil of the adjuvant composition according to the invention preferably comprises a content of naphthenic compounds less than or equal to 1% by weight, preferably less than or equal to 0.5% by weight and more preferably less than or equal to 100 ppm by weight, based on the total weight of the oil
  • the invention is advantageously free of aromatic compounds.
  • a content by weight of aromatic compounds less than or equal to 500 ppm, preferably less than or equal to 300 ppm, preferably less than or equal to 100 ppm, more preferably less than or equal to 50 ppm and advantageously less than or equal to 20 ppm measured for example by UV spectrometry.
  • the hydrocarbon oil comprises:
  • an isoparaffin content ranging from 90 to 100% by weight, preferably from 95 to 100% by weight and preferably from 98% to 100% by weight relative to the total weight of the hydrocarbon oil, said isoparaffins including, relative to the total weight of isoparaffins, at least 2% by weight and preferably at least 20% by weight, of isoparaffins having 17 carbon atoms and / or isoparaffins having 18 carbon atoms,
  • a normal paraffin content of less than or equal to 10% by weight, preferably less than or equal to 5% by weight and preferably less than or equal to 2% by weight relative to the total weight of the hydrocarbon oil;
  • a content of naphthenic compounds less than or equal to 1% by weight, preferably less than or equal to 0.5% by weight and preferably less than or equal to 100 ppm relative to the total weight of the hydrocarbon oil; and or
  • a content by weight of aromatic compounds less than or equal to 500 ppm, preferably less than or equal to 300 ppm, preferably less than or equal to 100 ppm, more preferably less than or equal to 50 ppm and advantageously less than or equal to 20 ppm, relative to the total weight of the hydrocarbon oil.
  • the contents by weight of isoparaffins, normal paraffins, naphthenes and aromatics of the hydrocarbon oil can be determined according to methods well known to those skilled in the art. Mention may be made, by way of nonlimiting example, of a gas chromatography method.
  • the invention also preferably has an extremely low content by weight of sulfur compounds, typically less than or equal to 5 ppm, preferably less than or equal to 3 ppm and more preferably less than or equal to 0.5 ppm, that is to say say at a level too low to be detected with conventional low-sulfur analyzers.
  • the hydrocarbon oil has a boiling point ranging from 230 to 340 ° C, preferably from 235 to 330 ° C and more
  • hydrocarbon is less than 80 ° C, preferably less than 60 ° C, and more
  • the invention also preferably has a flash point greater than or equal to 110 ° C, preferably greater than or equal to 120 ° C and more preferably greater than or equal to 140 ° C according to standard EN ISO 2719.
  • a high flash point, typically above 110 ° C allowing, among other things, to alleviate safety problems during storage and transport by avoiding excessive flammability of the oil
  • the hydrocarbon oil also preferably has a vapor pressure of 20 ° C.
  • the hydrocarbon oil used in the hydrocarbon oil used in the hydrocarbon oil used in the hydrocarbon oil used in the hydrocarbon oil used in the hydrocarbon oil used in the hydrocarbon oil used in the hydrocarbon oil used in the hydrocarbon oil used in the hydrocarbon oil used in the hydrocarbon oil used in the hydrocarbon oil used in the hydrocarbon oil used in the hydrocarbon oil used in the hydrocarbon oil used in the hydrocarbon oil used in the hydrocarbon oil used in the hydrocarbon oil used in the hydrocarbon oil used in the
  • the adjuvant composition according to the invention has a flash point greater than or equal to 110 ° C according to standard EN ISO 2719 and a vapor pressure at 20 ° C less than or equal to 0.01 kPa.
  • the hydrocarbon-based oil has a flash point greater than or equal to 120 ° C. and a vapor pressure at 20 ° C. less than or equal to 0.01 kPa. And more preferably, it has a flash point greater than or equal to 140 ° C and a vapor pressure at 20 ° C less than or equal to 0.01 kPa.
  • the hydrocarbon oil is of original
  • biomaterial content of at least 90% by weight relative to the total weight of the hydrocarbon oil. This content is advantageously higher, in particular greater than or equal to 95% by weight, preferably greater than or equal to 98% by weight and advantageously equal to 100%.
  • the hydrocarbon oil of the adjuvant composition according to the invention further preferably has a kinematic viscosity at 40 ° C less than or equal to 5 cSt,
  • bio-carbon indicates that the carbon is of natural origin and comes from a biomaterial, as indicated below.
  • Bio-carbon content and biomaterial content are expressions indicating the same value.
  • a material of renewable origin or biomaterial is an organic material in which the carbon is obtained from CO2 fixed recently (on a human scale) by photosynthesis from the atmosphere.
  • a biomaterial (100% carbon of natural origin) exhibits a 14 C / 12 C isotopic ratio greater than 10 -12 , typically around 1.2 x 10 -12 , while a fossil material has a zero ratio.
  • isotopic 14 C is formed in the atmosphere and is then integrated by photosynthesis, according to a time scale of a few decades at most. The half-life of 14 C is 5730 years.
  • the materials resulting from photosynthesis namely plants in general, necessarily have a maximum content of the isotope 14 C.
  • the hydrocarbon oil has a
  • OECD 306 preferably at least 75% and even more preferably at least 80% measured according to the OECD 306 standard.
  • the hydrocarbon oil has:
  • a boiling point ranging from 230 to 340 ° C, preferably from 235 to 330 ° C and more preferably from 240 to 325 ° C according to standard ASTM D86; and or - a difference between the final boiling point and the initial boiling point according to the ASTM D86 standard for hydrocarbon oil of less than 80 ° C, preferably less than 60 ° C, and more preferably less than 40 ° C, and or
  • the hydrocarbon oil of the adjuvant composition has a boiling range (measured according to the ASTM D86 standard) in the range ranging from 235 to 330 ° C and more preferably from 240 at 325 ° C, and contains an isoparaffin content by weight greater than or equal to 95% and
  • isoparaffins including, relative to the total weight of
  • isoparaffins at least 2% by weight, preferably at least 20% by weight
  • isoparaffins having 17 carbon atoms and / or isoparaffins having 18 carbon atoms are isoparaffins having 17 carbon atoms and / or isoparaffins having 18 carbon atoms.
  • the hydrocarbon oil according to the invention can be a hydrocarbon cut resulting, for example, from the conversion of biomass.
  • the term “result of the conversion of the biomass” is understood to mean a hydrocarbon cut produced from raw materials of biological origin.
  • the hydrocarbon cut of biological origin is obtained by a process comprising hydrodeoxygenation (HDO) and isomerization (ISO) stages.
  • the hydrodeoxygenation (HDO) step leads to the decomposition of the structures of the biological esters or of the triglyceride constituents, to the elimination of oxygenated, phosphorus and sulfur compounds and to the hydrogenation of the olefinic bonds.
  • the product resulting from the hydrodeoxygenation reaction is then isomerized.
  • a fractionation step can preferably follow the hydrodeoxygenation and isomerization steps.
  • the fractions of interest are then subjected to hydrotreatment and then distillation stages in order to obtain the specifications of the desired hydrocarbon oil according to the invention.
  • This HDO / ISO process is implemented on a gross biological load, also called biomass or raw material of biological origin, selected from the group consisting of vegetable oils, animal fats, fish oils and their mixed.
  • Suitable raw materials of biological origin are for example rapeseed oil, canola oil, tall oil, sunflower oil, soybean oil, hemp oil, olive oil , linseed oil, mustard oil, palm oil, peanut oil, castor oil, coconut oil, animal fats such as tallow, fats recycled food, raw materials from genetic engineering, and organic raw materials produced from microorganisms such as algae and bacteria. Condensation products, esters or other derivatives obtained from raw biological materials can also serve as raw materials.
  • the raw material of biological origin is an ester or a triglyceride derivative.
  • This material is first subjected to a hydrodeoxygenation (HDO) step to break down the structure of the constituent esters or triglycerides and to eliminate the oxygenated, phosphorus and sulfur compounds concomitantly with
  • HDO hydrodeoxygenation
  • the hydrogen and the raw material of biological origin are passed through a hydrodeoxygenation catalytic bed simultaneously or in countercurrent manner.
  • the pressure and the temperature are between 20 and 150 bars and between 200 and 500 ° C respectively.
  • Conventional and known hydrodeoxygenation catalysts are used during this step.
  • the raw material of biological origin can be subjected to prehydrogenation under mild conditions to avoid the side reactions of the double bonds before the HDO step.
  • the product resulting from the reaction is subjected to an isomerization step (ISO) where the hydrogen and the product, and optionally a mixture of n-paraffins, are passed through catalytic beds of simultaneous or countercurrent isomerization.
  • ISO isomerization step
  • the pressure and the temperature are between 20 and 150 bars and between 200 and 500 ° C respectively.
  • Conventional and known isomerization catalysts are used during this step.
  • WO 2014/033762 describes a process comprising a pre-hydrogenation step, a hydrodeoxygenation (HDO) step and an isomerization step operated against the current.
  • Patent application EP 1728844 describes a process for the production of hydrocarbon compounds from a mixture of compounds of plant and animal origin. Additional secondary processes can also be implemented (such as intermediate mixtures, traps or other such processes).
  • the adjuvant composition according to the invention preferably comprises a hydrocarbon oil content ranging from 40 to 99% by weight, preferentially from 60 to 98% by weight and more preferably from 85 to 96% by weight relative to the total weight. of the adjuvant composition.
  • the adjuvant composition according to the invention constitutes a fatty phase which, to form a vaccine, can be mixed with an aqueous phase comprising an antigen.
  • the surfactant present in the adjuvant composition makes it possible to mix the fatty phase and the aqueous phase which are immiscible in order to obtain a homogeneous and stable mixture.
  • the adjuvant composition comprises
  • surfactant is meant one or more surfactants.
  • the surfactants which can be used in the invention are surfactants which are commercially available and accessible to those skilled in the art. These are typically pharmaceutically acceptable surfactants, in particular
  • the surfactant contained in the surfactant contained in the surfactant
  • adjuvant composition is a nonionic surfactant.
  • the surfactant contained in the surfactant contained in the surfactant
  • adjuvant composition is chosen from sorbitan esters, polyethoxylated sorbitan esters, mannitan esters, polyethoxylated mannitan esters, preferably from sorbitan esters.
  • the surfactant contained in the surfactant contained in the surfactant
  • the adjuvant composition is a sorbitan fatty acid ester chosen from sorbitan oleate, sorbitan stearate, sorbitan palmitate and sorbitan laurate.
  • the surfactant is a sorbitan monooleate.
  • a non-limiting example of a surfactant which can be used in the adjuvant composition according to the invention is SPAN® 80 sold by Croda.
  • the surfactant contained in the adjuvant composition is chosen from lecithins, polyethoxylated alkanols, polyethylene glycol esters, polyglycol or polyglycerol polyhydroxystearates.
  • Adjuvant composition according to the invention
  • the adjuvant composition according to the invention comprises at least one oil
  • hydrocarbon as defined above and at least one surfactant are hydrocarbon as defined above and at least one surfactant.
  • the adjuvant composition consists of one or more hydrocarbon oils as defined above and of one or more surfactants.
  • the adjuvant composition comprises at least one other oil other than the hydrocarbon oil defined in the present invention.
  • the adjuvant composition comprises from 1 to 40% by weight, preferably from 5 to 30% by weight, or even from 10 to 20% by weight of another oil, relative to the total weight of the adjuvant composition.
  • the other oils can be a hydrocarbon oil of fossil or renewable origin or a hydrogenated or non-hydrogenated vegetable oil.
  • the adjuvant composition according to the invention comprises another oil chosen from n-paraffins, typically from n-paraffins comprising from 12 to 40 carbon atoms, preferably from 14 to 30 carbon atoms. carbon, or even from 16 to 24 carbon atoms.
  • n-paraffins can be chosen from bio-based n-paraffins. These n-paraffins may be available commercially.
  • the adjuvant composition for a vaccine consists of, relative to the total weight of the adjuvant composition:
  • hydrocarbon oil comprising a content by weight of isoparaffins ranging from 90 to 100% relative to the total weight of the hydrocarbon oil, said isoparaffins including, relative to the weight total isoparaffins, at least 20% by weight of isoparaffins having 17 carbon atoms or 18 carbon atoms,
  • the adjuvant composition for a vaccine preferably comprises, relative to the total weight of the adjuvant composition:
  • hydrocarbon oil comprising a content by weight of isoparaffins ranging from 90 to 100% relative to the total weight of the hydrocarbon oil, said isoparaffins including, relative to the weight total isoparaffins, at least 20% by weight of isoparaffins having 17 carbon atoms or 18 carbon atoms,
  • the adjuvant composition for the vaccine according to the invention comprises a mass ratio of hydrocarbon oil (s) defined in the invention / n-paraffin (s) ranging from 60/40 to 99/1, preferably from 70/30 to 98/2, or even from 80/20 to 95/5.
  • the adjuvant composition does not
  • the adjuvant composition for a vaccine consists of, relative to the total weight of the adjuvant composition:
  • hydrocarbon oil comprising a content by weight of isoparaffins ranging from 90 to 100% relative to the total weight of the hydrocarbon oil, said isoparaffins including, relative to the weight total isoparaffins, at least 2% by weight, preferably at least 20% by weight isoparaffins having 17 carbon atoms or 18 carbon atoms and
  • sorbitan esters preferably sorbitan monooleate.
  • the adjuvant composition can also comprise other agents such as for example metal salts, preferably aluminum salts, preferably in an amount ranging from 0.1 to 5% by weight relative to the total weight of the product. adjuvant composition. These metal salts make it possible to increase the viscosity of the adjuvant composition and to improve the stability of the emulsion.
  • the adjuvant composition for a vaccine comprises, or even consists of, relative to the total weight of the adjuvant composition:
  • hydrocarbon oil comprising a content by weight of isoparaffins ranging from 90 to 100% relative to the total weight of the hydrocarbon oil, said isoparaffins including isoparaffins having 17 carbon atoms or 18 carbon atoms
  • metal salts preferably of aluminum salts
  • the adjuvant composition for a vaccine comprises, or even consists of, relative to the total weight of the adjuvant composition:
  • hydrocarbon oil comprising a content by weight of isoparaffins ranging from 90 to 100% relative to the total weight of the hydrocarbon oil, said isoparaffins including isoparaffins having 17 atoms carbon or 18 carbon atoms
  • metal salts preferably of aluminum salts
  • oils chosen, for example, from n-paraffins.
  • the adjuvant composition further comprises a preservative, for example a paraben, preferably methylparaben, ethylparaben and / or propylparaben.
  • a preservative for example a paraben, preferably methylparaben, ethylparaben and / or propylparaben.
  • the adjuvant composition for vaccine does not
  • the adjuvant composition does not comprise a polymer.
  • Vaccine prepared from the adjuvant composition according to the invention
  • the adjuvant composition according to the invention is useful for preparing a vaccine.
  • the vaccine is in the form of an emulsion, in which the adjuvant composition of the invention constitutes the fatty phase.
  • the vaccine according to the invention does not comprise a fatty phase different from the adjuvant composition according to the invention.
  • the vaccine is in the form of an emulsion, in which the aqueous phase comprises water, an antigen and a surfactant.
  • the surfactant contained in the aqueous phase may be identical or different from the surfactant contained in the adjuvant composition constituting the fatty phase.
  • the surfactant contained in the aqueous phase is chosen from nonionic surfactants, preferably from sorbitan esters, polyethoxylated sorbitan esters, mannitan esters, polyethoxylated mannitane esters of preferably from sorbitan esters.
  • the surfactant contained in the aqueous phase is a sorbitan fatty acid ester chosen from sorbitan oleate, sorbitan stearate, sorbitan palmitate, sorbitan laurate. sorbitan.
  • the surfactant is a polyethoxylated sorbitan ester.
  • Tween® 80 sold by Croda.
  • the surfactant contained in the aqueous phase is chosen from lecithins, polyethoxylated alkanols, polyethylene glycol esters, polyglycol or polyglycerol polyhydroxystearates.
  • the vaccine is in the form of a water-in-oil emulsion.
  • the vaccine is in the form of an emulsion in
  • the mass ratio between the aqueous phase and the fatty phase ranges from 50/50 to 10/90, preferably from 40/60 to 20/80 and more preferably is from 30/70.
  • the vaccine according to the invention has a dynamic viscosity at 25 ° C of between 10 and 150 mPa.s, preferably between 15 and 120 mPa.s, preferably between 20 and 100 mPa.s measured according to the ASTM D445 standard.
  • the vaccine is prepared by contacting the
  • antigen any substance which the immunological system of an individual recognizes as foreign, and which provokes a response by the production of antibodies.
  • Antigens are generally polysaccharides, polysaccharide derivatives, proteins or protein derivatives.
  • the antigen present in the vaccine is chosen from an anti-Foot and Mouth Disease virus, an anti-bacteria Pasteurella, a Newcastle antigen, an Avian Influenza antigen.
  • the vaccine is prepared by bringing the adjuvant composition according to the invention into contact with an aqueous phase comprising an antigen and a surfactant.
  • hydrocarbon oil according to the invention improves the anti-infective effect of an antigen.
  • the present invention thus relates to the use of the hydrocarbon oil defined in the present invention, in an adjuvant composition, to improve the anti-infectious effect of said adjuvant vaccine composition.
  • the adjuvant composition in the context of use, will preferably exhibit one or more of the characteristics defined above for the adjuvant composition according to the invention.
  • the present invention also relates to the use of the hydrocarbon oil according to the invention, in an adjuvant composition for a vaccine, for reducing the cytotoxicity of the vaccine.
  • the present invention also relates to the use of hydrocarbon oil
  • an adjuvant composition for a vaccine in an adjuvant composition for a vaccine, to improve the stability of the vaccine, in particular for a vaccine in the form of an emulsion.
  • Table 1 below groups together the physicochemical properties of two hydrocarbon oils which can be used in adjuvant compositions according to the invention.
  • refractive index at 20 ° C ASTM D 1218 vapor pressure: calculated according to methods well known to those skilled in the art.
  • Example 2 evaluation of the immunological effect of the oils of Example 1
  • Oils A and B described in Example 1 were tested in vitro to determine their immunological effects on human immune cells.
  • oils according to the invention were compared with those of reference adjuvants, in particular hydrocarbon oils, Marcol TM 52 and Creasil IH CG, the latter being an isoparaffinic oil.
  • hydrocarbon oils Marcol TM 52 and Creasil IH CG
  • Creasil IH CG an isoparaffinic oil.
  • the effects of the oils have also been compared to those of aluminum hydroxide, a benchmark adjuvant used in many commercial vaccines.
  • PBMC peripheral blood
  • IL interleukin
  • PBMCs, macrophages and dendritic cells were brought into contact for 24 hours with the oils according to the invention as well as with reference adjuvants.
  • the ability of cells to multiply, die and differentiate was measured by assaying cell activation, cell viability, cytokine profile and membrane expression of other biomarkers.
  • the cells are seeded in 96-well microplates (Corning). The microplates are then placed in the incubator at 37 ° C.
  • the microplates are emptied and the cells are rinsed.
  • Measurement of cell activation and viability 3 days after the treatment with the oils, the cells are observed under a microscope to assess cell activation and then subjected to a colorimetric test with methyl tetrazolium salt (MTT) to assess cell viability.
  • Cytokine assay 5 days after the treatment with the oils, multiplexed immunoenzymatic assays are carried out and immunophenotypings are analyzed by flow cytometry in order to determine the cytokine profile and the membrane expression of the cells.
  • Marcol TM 52 and Creasil® IH CG exhibit the same profile since they reduce the viability of PBMCs, macrophages and dendritic cells originating from different cell donors.
  • Marcol TM 52 and Creasil® IH CG exhibit cytotoxicity at low dilutions (dilutions expressed in% by volume), ie at high concentrations.
  • Oils A and B just like aluminum hydroxide, do not cause a decrease in cell viability.
  • Oils A and B show no cytotoxicity at the concentrations tested.
  • cytokine profile of PBMCs is observed after antigenic stimulation or not, either using tetanus toxin (TT) or tuberculin (PPD).
  • TT tetanus toxin
  • PPD tuberculin
  • Table 2 collates the results of the cytokine assays after 5 days in the supernatants of PBMC cultures not exposed in parallel to an antigen. The results are expressed in pg / mL.
  • Oil A is distinguished from other adjuvants by a more pronounced decrease in the level of IL-5, a decrease in that of TNF-a and an absence of increase in IFN-g.
  • the cytokine profile of macrophages and dendritic cells was evaluated during mixed lymphocyte reactions (MLR).
  • lymphocyte in response to interactions with macrophages, under antigen (PPD) or not.
  • PPD antigen
  • the results are expressed as a percentage relative to the untreated cells (Control).
  • Table 4 details the effects of the adjuvants on the cytokine levels in the culture supernatants of macrophages cocultured with the autologous lymphocytes and without prior antigen presentation (PPD).
  • IL-2 results in increased production of IL-2, IL-10, IL-12 and TNF-a. These results suggest a Th1, cellular response that is favored over a Th2 profile.
  • the presence of IL-12 directs the differentiation of naive T lymphocytes to lymphocytes with a Th1 profile.
  • detection of cytokines such as IL-4 and L-13 indicates a mixed Th1 and Th2 profile or regulation between the two profiles.
  • the high production of GM-CSF by Oils A and B is also an element that can accelerate a microbial response. Indeed, GM-CSF, at the central and peripheral levels, increases the number or the functionality of cells of the monocyto / macrophage lineage, thus potentiating the anti-infectious responses.
  • Table 7 details the effects of the adjuvants on the cytokine levels in the culture supernatants of dendritic cells cocultured with autologous lymphocytes and without prior antigen presentation (PPD).
  • Table 8 details the effects of the adjuvants on the cytokine levels in the culture supernatants of the dendritic cells cocultured with the autologous lymphocytes and after antigen presentation (PPD).
  • Oils A and B direct the response towards a Th1 profile with an increase in the levels of TNF-a, of IFN-g and IL-2.
  • an increase in the level of GM-CSF is observed.
  • Oils A and B are distinguished from other adjuvants tested at the cytokine level. Indeed, the other three adjuvants generate little or no modulations of the cytokines tested.
  • Oils A and B promote the proliferation / activation of lymphocytes brought into contact with cells presenting antigens, whether they are macrophages or dendritic cells, in the presence or absence of an antigen such as PPD.
  • Oils A and B exhibit a specific profile. On the one hand, they do not modulate the expression of CD1a, specific for dendritic cells.On the other hand, Oils A and B, and in particular Oil A, increase the expression of CD83, a marker of maturation of dendritic cells.
  • Oils A and B exhibit a specific profile, oriented towards Th1 type responses for lymphocytes and M1 for macrophages. They also lead to maturation of dendritic cells. These profiles, like the increased macrophage synthesis of GM-CSF, are believed to promote an anti-infectious response, a role expected of an adjuvant.
  • Example 3 preparation of an emulsion comprising the adjuvant composition of the invention - evaluation of the stability of the emulsion
  • the oil and the surfactant of the fatty phase are introduced into a test tube in the proportions indicated in Table 11.
  • the test tube is stirred and heated at 80 ° C until obtaining d 'a homogeneous phase.
  • the water and the surfactant of the aqueous phase are introduced into a second test tube in the proportions indicated in Table 1 1.
  • the test tube is stirred and heated at 80 ° C until the obtaining a homogeneous phase.
  • the aqueous phase is poured slowly into the fatty phase with vigorous stirring. Then the emulsion is mixed using a Turrax® type mixer at 9500 revolutions / minute for 30 seconds.
  • the stability of the composition described in Table 11 is observed visually after centrifugation at T0, after centrifugation after 24 hours (T24h) and after 90 days (T2160h).
  • the test tube contains 6.6 cm of emulsion, including 4.2 cm of fatty phase.
  • a manual measurement of the phase shift is made, that is to say a measurement of the fatty phase released above the emulsion.
  • the emulsion comprising the Marcol TM 52 oil has released more than the emulsion comprising Oil A.
  • Example 4 preparation of a vaccine comprising the adjuvant composition of
  • the vaccine is prepared according to the following protocol:
  • Turrax® type mixer set at 10,000 rpm for 3 minutes at 25 ° C.

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Abstract

La présente invention concerne une composition adjuvante pour vaccin comprenant une ou plusieurs huiles hydrocarbonées essentiellement isoparaffiniques comprenant des isoparaffines en C17 et/ou en C18, et un ou plusieurs tensioactifs. La présente invention concerne également un vaccin comprenant ladite composition adjuvante.

Description

Description
Titre de l'invention : Composition adjuvante pour vaccin
[0001] DOMAINE DE L’INVENTION
[0002] La présente invention concerne une nouvelle composition adjuvante pour vaccin comprenant une huile hydrocarbonée majoritairement isoparaffinique et un tensioactif.
[0003] CONTEXTE TECHNIQUE DE L’INVENTION
[0004] Il existe différentes technologies de vaccins, les vaccins dit à « virus vivant »
(antigènes vivants) les vaccins dit à « virus atténué » ou les vaccins dit à « virus inactivé » (antigène inactivé).
[0005] Dans les vaccins à virus vivant, il n’est pas nécessaire d’ajouter un adjuvant car ils ont déjà une efficacité suffisante. En revanche, le risque d’effets secondaires lié à ce type de vaccins est important.
[0006] A l’inverse, les vaccins à virus atténué ou inactivé ont une efficacité limitée qui requiert d’utiliser un adjuvant. Lorsque le virus atténué ou inactivé, dissous dans l’eau, est dispersé dans une huile, son efficacité est fortement augmentée. Cette dispersion, appelée émulsion, doit être stable et la plus fluide possible, stable pour avoir une bonne conservation du vaccin et fluide pour pouvoir être injectée rapidement et sans douleur. L’huile joue ainsi le rôle d’adjuvant.
[0007] L’huile de référence utilisée comme adjuvant de vaccin est une huile blanche
commercialisée sous la marque Marcol™ 52, constitué de paraffines et de composés naphténiques.
[0008] Le document FR 2 922 767 divulgue l’utilisation, dans une composition adjuvante pour vaccin, de différentes huiles d’origine minérale, végétale ou animale ainsi que d’huiles synthétiques. Ce document divulgue entre autre l’huile blanche Marcol™ 52 et un isohexadécane correspondant au produit commercial Creasil® IH CG. Ces huiles sont formulées avec des tensioactifs dans des adjuvants de vaccins.
[0009] Ces huiles présentent l’inconvénient d’avoir une certaine cytotoxicité vis-à-vis des cellules immunitaires telles que les cellules mononucléées isolées du sang périphérique (CMSP), les macrophages et les cellules dendritiques.
[0010] Le document RU2072868 propose une huile comme adjuvant pour vaccin
comprenant un mélange de naphtènes, de composés aromatiques et d’isoparaffines. Ce document enseigne une quantité maximale de 20% en poids d’isoparaffines pour abaisser la réactogénicité. [0011] La nature de l’huile adjuvante peut également avoir un effet sur la réponse immunitaire du sujet traité. La présente invention vise à proposer un adjuvant de vaccin induisant une réponse immunitaire forte et une cytotoxicité la plus faible possible.
[0012] RESUME DE L’INVENTION
[0013] Ces objectifs sont atteints grâce à une nouvelle composition adjuvante.
[0014] L’invention concerne une composition adjuvante pour vaccin comprenant, par rapport au poids total de la composition adjuvante :
au moins 40% en poids d’huile hydrocarbonée comprenant une teneur en poids d’isoparaffines allant de 90 à 100% par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée, lesdites isoparaffines incluant des isoparaffines ayant 17 atomes de carbone ou 18 atomes de carbone et
de 1 à 15% en poids de tensioactif(s).
[0015] Selon un mode de réalisation, lesdites isoparaffines comprennent, par rapport au poids total des isoparaffines, au moins 2% en poids d’isoparaffines ayant 17 atomes de carbone et/ou d’iso paraffines ayant 18 atomes de carbone.
[0016] Selon un mode de réalisation, l’huile hydrocarbonée comprend :
- des isoparaffines ayant 15 atomes de carbone et des isoparaffines ayant 16 atomes de carbone en une quantité combinée allant de 80 à 95% en poids, par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée; ou
- des isoparaffines ayant 15 atomes de carbone et des isoparaffines ayant 16 atomes de carbone en une quantité combinée allant de 40 à 80% en poids, par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée ; ou
- des isoparaffines ayant 16 atomes de carbone, des isoparaffines ayant 17 atomes de carbone et des isoparaffines ayant 18 atomes de carbone en une quantité combinée allant de 80 à 98% en poids, par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée ; ou
- des isoparaffines ayant 17 atomes de carbone et des isoparaffines ayant 18 atomes de carbone en une quantité combinée allant de 80 à 98% en poids, par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée.
[0017] Selon un mode de réalisation, le tensioactif est choisi parmi les tensioactifs non- ioniques, de préférence les esters de sorbitane, de préférence les esters d’acide gras de sorbitane, de préférence le tensioactif est un monooléate de sorbitane.
[0018] Selon un mode de réalisation, la composition de l’invention comprend, par rapport au poids total de la composition : - de 60 à 98% en poids d’huile hydrocarbonée comprenant une teneur en poids d’isoparaffines allant de 95 à 100% par rapport au poids total de l’huile
hydrocarbonée, lesdites isoparaffines incluant des isoparaffines ayant 17 atomes de carbone et/ou 18 atomes de carbone, et
- de 2 à 10% en poids de tensioactif(s).
[0019] La présente invention concerne également un vaccin comprenant la composition adjuvante selon l’invention et au moins un antigène.
[0020] Selon un mode de réalisation, le vaccin est sous forme d’une émulsion eau dans l’huile.
[0021] Selon un mode de réalisation, le ratio massique entre la phase aqueuse et la phase grasse de l’émulsion eau-dans-l’huile va de 50/50 à 10/90, de préférence de 40/60 à 20/80 et plus préférentiellement est de 30/70.
[0022] La présente invention concerne également l’utilisation d’une composition adjuvante selon l’invention pour diminuer la cytotoxicité d’un vaccin comprenant ladite composition adjuvante.
[0023] La présente invention concerne également l’utilisation de l’huile hydrocarbonée
définie selon l’invention, dans une composition adjuvante pour vaccin, pour diminuer la cytotoxicité du vaccin comprenant ladite composition adjuvante.
[0024] La présente invention concerne également l’utilisation de l’huile hydrocarbonée
définie selon l’invention, dans une composition adjuvante pour vaccin, pour améliorer la stabilité du vaccin, en particulier pour un vaccin sous la forme d’une émulsion.
[0025] La composition adjuvante selon l’invention permet de disposer d’une composition pour vaccin peu cytotoxique tout en induisant une forte réponse anti-infectieuse des cellules immunitaires.
[0026] La composition adjuvante selon l’invention permet de préparer des vaccins à la fois stables et fluides.
[0027] FIGURES
[0028] [Fig. 1] Effets des huiles sur la viabilité et l’activation des CMSP, en l’absence d’une stimulation antigénique parallèle.
[0029] [Fig. 2] Effets des huiles sur la viabilité et l’activation des macrophages, en l’absence d’une stimulation antigénique parallèle. [0030] [Fig. 3] Effets des huiles sur la viabilité et l’activation des cellules dendritiques, en l’absence d’une stimulation antigénique parallèle.
[0031] DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
[0032] L’invention concerne une composition adjuvante pour vaccin comprenant, par rapport au poids total de la composition adjuvante :
- au moins 40% en poids d’huile hydrocarbonée comprenant une teneur en poids d’isoparaffines allant de 90 à 100% par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée, lesdites isoparaffines incluant des isoparaffines ayant 17 atomes de carbone et/ou 18 atomes de carbone et
- de 1 à 15% en poids de tensioactif(s).
[0033] A titre préliminaire on notera que, dans la description et les revendications suivantes, l’expression « compris entre » doit s’entendre comme incluant les bornes citées.
[0034] Huile hvdrocarbonée
[0035] Dans le cadre de la présente invention, l’huile hydrocarbonée comprend une teneur en poids d’isoparaffines allant de 90 à 100% par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée. Toujours dans le cadre de la présente invention, les isoparaffines de l’huile hydrocarbonée incluent des isoparaffines ayant 17 atomes de carbone et/ou des isoparaffines ayant 18 atomes de carbone.
[0036] Selon un mode de réalisation de l'invention, l’huile hydrocarbonée utilisée dans la composition adjuvante comprend entre 90 et 100% en poids d’isoparaffines par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée, lesdites isoparaffines incluant, par rapport au poids total des isoparaffines, au moins 2% en poids d’isoparaffines ayant 17 atomes de carbone et/ou d’iso paraffines ayant 18 atomes de carbone.
[0037] Selon un mode de réalisation de l'invention, l’huile hydrocarbonée de la composition adjuvante comprend une teneur en poids d’isoparaffines supérieure ou égale à 95 % et avantageusement supérieure ou égale à 98% par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée, lesdites isoparaffines incluant, par rapport au poids total des
isoparaffines, au moins 2% en poids d’isoparaffines ayant 17 atomes de carbone et/ou d’isoparaffines ayant 18 atomes de carbone.
[0038] Selon un mode de réalisation de l’invention, l’huile hydrocarbonée de la composition adjuvante comprend une teneur en poids d’isoparaffines supérieure ou égale à 95 % et avantageusement supérieure ou égale à 98% par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée, lesdites isoparaffines incluant, par rapport au poids total des isoparaffines, au moins 20% en poids d’iso paraffines ayant 17 atomes de carbone et/ou d’isoparaffines ayant 18 atomes de carbone.
[0039] Selon un mode de réalisation de l'invention, les isoparaffines contenues dans l’huile hydrocarbonée incluent, par rapport au poids total des iso paraffines, au moins 20% en poids, de préférence au moins 30% en poids, de préférence au moins 35% en poids, de préférence au moins 40% en poids, de préférence au moins 60% en poids, de préférence au moins 80% en poids d’isoparaffines ayant 17 atomes de carbone et/ou d’isoparaffines ayant 18 atomes de carbone.
[0040] Selon un mode de réalisation de l'invention, l’huile hydrocarbonée de la composition adjuvante comprend une teneur en poids d’isoparaffines supérieure ou égale à 95 % et avantageusement supérieure ou égale à 98% par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée et au moins 90%, de préférence au moins 95%, en poids desdites isoparaffines, par rapport au poids total des isoparaffines présentes dans l’huile hydrocarbonée, comportent de 12 à 30 atomes de carbone, de préférence de 13 à 19 atomes de carbone, de préférence encore de 14 à 18 atomes de carbone.
[0041] Selon un mode de réalisation de l’invention, l’huile hydrocarbonée comprend :
- des isoparaffines ayant 15 atomes de carbone et des isoparaffines ayant 16 atomes de carbone en une quantité combinée allant de 40 à 80% en poids, de préférence de 50 à 70% en poids, par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée; ou
- des isoparaffines ayant 15 atomes de carbone et des isoparaffines ayant 16 atomes de carbone en une quantité combinée allant de 80 à 95% en poids, par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée ; ou
- des isoparaffines ayant 16 atomes de carbone, des isoparaffines ayant 17 atomes de carbone et des isoparaffines ayant 18 atomes de carbone en une quantité combinée allant de 80 à 98% en poids, par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée; ou
- des isoparaffines ayant 17 atomes de carbone et des isoparaffines ayant 18 atomes de carbone en une quantité combinée allant de 80 à 98% en poids, par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée.
[0042] Selon un mode de réalisation de l’invention, les isoparaffines sont des isoparaffines non-cycliques.
[0043] L’huile hydrocarbonée utilisée dans la composition adjuvante selon l’invention
comprend de préférence une teneur en paraffines normales inférieure ou égale à 10% en poids, préférentiellement inférieure ou égale à 5 % en poids et avantageusement inférieure ou égale à 2% en poids, par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée. [0044] Selon un mode de réalisation, l’huile hydrocarbonée selon l’invention comprend de préférence, par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée, une teneur en isoparaffines allant de 90 à 100% en poids et une teneur en paraffines normales allant de 0 à 10% en poids, préférentiellement de 95 à 100% en poids d’isoparaffines et de 0 à 5% en poids de paraffines normales et plus préférentiellement de 98% à 100% en poids d’isoparaffines et de 0 à 2 % en poids de paraffines normales. De manière encore plus avantageuse l’huile hydrocarbonée de la composition adjuvante selon l’invention ne contient pas de paraffines normales.
[0045] L’huile hydrocarbonée de la composition adjuvante selon l’invention comprend de préférence une teneur en composés naphténiques inférieure ou égale à 1 % en poids, préférentiellement inférieure ou égale à 0,5% en poids et plus préférentiellement inférieure ou égale à 100 ppm en poids, par rapport au poids total de l’huile
hydrocarbonée.
[0046] L’huile hydrocarbonée mise en oeuvre dans la composition adjuvante selon
l’invention est avantageusement exempte de composés aromatiques. Par exempte, on entend une teneur en poids de composés aromatiques inférieure ou égale à 500 ppm, de préférence inférieure ou égale à 300 ppm, préférentiellement inférieure ou égale à 100 ppm, plus préférentiellement inférieure ou égale à 50 ppm et avantageusement inférieure ou égale à 20 ppm mesurée par exemple par spectrométrie UV.
[0047] Selon un mode de réalisation de l'invention, l'huile hydrocarbonée comprend :
une teneur en isoparaffines allant de 90 à 100% en poids, de préférence de 95 à 100% en poids et préférentiellement de 98% à 100% en poids par rapport au poids total de l'huile hydrocarbonée, lesdites isoparaffines incluant, par rapport au poids total des isoparaffines, au moins 2% en poids et préférentiellement au moins 20% en poids, d’isoparaffines ayant 17 atomes de carbone et/ou d’isoparaffines ayant 18 atomes de carbone,
une teneur en paraffines normales inférieure ou égale à 10% en poids, de préférence inférieure ou égale à 5% en poids et préférentiellement inférieure ou égale à 2% en poids par rapport au poids total de l'huile hydrocarbonée ; et/ou
une teneur en composés naphténiques inférieure ou égale à 1 % en poids, de préférence inférieure ou égale à 0,5% en poids et préférentiellement inférieure ou égale à 100 ppm par rapport au poids total de l'huile hydrocarbonée ; et/ou
une teneur en poids de composés aromatiques inférieure ou égale à 500 ppm, de préférence inférieure ou égale à 300 ppm, préférentiellement inférieure ou égale à 100 ppm, plus préférentiellement inférieure ou égale à 50 ppm et avantageusement inférieure ou égale à 20 ppm, par rapport au poids total de l'huile hydrocarbonée.
[0048] Les teneurs en poids en isoparaffines, en paraffines normales, en naphtènes et en aromatiques de l’huile hydrocarbonée peuvent être déterminées selon des méthodes bien connues de l’homme du métier. On peut citer à titre d’exemple non limitatif, une méthode par chromatographie en phase gazeuse.
[0049] L’huile hydrocarbonée mise en oeuvre dans la composition adjuvante selon
l’invention a également de préférence une teneur en poids de composés soufrés extrêmement basse, typiquement inférieure ou égale à 5 ppm, préférentiellement inférieure ou égale à 3 ppm et plus préférentiellement inférieure ou égale à 0,5 ppm, c’est-à-dire à un niveau trop bas pour être détectée grâce à des analyseurs de basse- teneur en soufre conventionnels.
[0050] Selon un mode de réalisation de l'invention, l'huile hydrocarbonée a une température d'ébullition allant de 230 à 340°C, de préférence de 235 à 330°C et plus
préférentiellement de 240 à 325°C selon la norme ASTM D86.
[0051] Selon un mode de réalisation de l’invention, la différence entre le point final
d’ébullition et le point initial d’ébullition selon la norme ASTM D86 de l’huile
hydrocarbonée est inférieure à 80°C, de préférence inférieure à 60°C, et plus
préférentiellement inférieure à 40°C.
[0052] L’huile hydrocarbonée mise en oeuvre dans la composition adjuvante selon
l’invention a également de préférence un point éclair supérieur ou égal à 1 10°C, préférentiellement supérieur ou égal à 120°C et plus préférentiellement supérieur ou égal à 140°C selon la norme EN ISO 2719. Un point éclair élevé, typiquement supérieure à 1 10°C permettant entre autre de pallier les problèmes de sécurité lors du stockage et du transport en évitant une inflammabilité trop sensible de l’huile
hydrocarbonée.
[0053] L’huile hydrocarbonée a aussi de préférence une pression de vapeur à 20°C
inférieure ou égale à 0,01 kPa.
[0054] Selon un mode de réalisation, l’huile hydrocarbonée mise en oeuvre dans la
composition adjuvante selon l’invention a un point éclair supérieur ou égal à 110°C selon la norme EN ISO 2719 et une pression de vapeur à 20°C inférieure ou égale à 0,01 kPa. Préférentiellement l’huile hydrocarbonée a un point éclair supérieur ou égal à 120°C et une pression de vapeur à 20°C inférieure ou égale à 0,01 kPa. Et plus préférentiellement, elle a un point éclair supérieur ou égal à 140°C et une pression de vapeur à 20°C inférieure ou égale à 0,01 kPa.
[0055] Selon un mode de réalisation de l’invention, l’huile hydrocarbonée est d’origine
biologique et présente typiquement une teneur en biomatériau d'au moins 90% en poids par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée. Cette teneur est avantageusement plus élevée, en particulier supérieure ou égale à 95% en poids, de préférence supérieure ou égale à 98 % en poids et avantageusement égale à 100%. La détermination de la teneur en biomatériau ou en bio-carbone est donnée conformément aux normes ASTM D 6866-12, la méthode B (ASTM D 6866-06) et ASTM D 7026 (ASTM D 7026-04).
[0056] L’huile hydrocarbonée de la composition adjuvante selon l’invention a en outre de préférence une viscosité cinématique à 40°C inférieure ou égale à 5 cSt,
préférentiellement inférieure ou égale à 4 cSt et plus préférentiellement inférieure ou égale à 3 cSt selon la norme EN ISO 3104.
[0057] Le terme de « bio-carbone » indique que le carbone est d'origine naturelle et vient d'un biomatériau, comme indiqué ci-après. La teneur en bio-carbone et la teneur en biomatériau sont des expressions indiquant la même valeur. Un matériau d'origine renouvelable ou biomatériau est un matériau organique dans lequel le carbone est issu du CO2 fixé récemment (sur une échelle humaine) par photosynthèse à partir de l’atmosphère. Un biomatériau (Carbone 100% d’origine naturelle) présente un rapport isotopique 14C/12C supérieur à 10-12, typiquement environ 1 ,2 x 10-12, tandis qu'un matériau fossile a un rapport nul. En effet, le 14C isotopique est formé dans l'atmosphère et est alors intégré par photosynthèse, selon une échelle de temps de quelques dizaines d'années au maximum. La demi-vie du 14C est 5730 années. Ainsi, les matériaux issus de la photosynthèse, à savoir les plantes d'une manière générale, ont nécessairement un contenu maximum en isotope 14C.
[0058] Selon un mode de réalisation de l'invention, l'huile hydrocarbonée a une
biodégradabilité à 28 jours d'au moins 60%, de préférence d'au moins 70%,
préférentiellement d'au moins 75% et encore plus préférentiellement d'au moins 80% mesurée selon la norme OECD 306.
[0059] Selon un mode particulier de réalisation, l'huile hydrocarbonée a :
une température d’ébullition allant de 230 à 340°C, de préférence de 235 à 330°C et plus préférentiellement de 240 à 325°C selon la norme ASTM D86 ; et/ou - une différence entre le point final d’ébullition et le point initial d’ébullition selon la norme ASTM D86 de l’huile hydrocarbonée inférieure à 80°C, de préférence inférieure à 60°C, et plus préférentiellement inférieure à 40°C, et/ou
une biodégradabilité à 28 jours d’au moins 60%, de préférence d’au moins 70%, préférentiellement d’au moins 75% et encore plus préférentiellement d’au moins 80% mesurée selon la norme OCDE 306 ; et/ou
un point éclair supérieur ou égal à 110°C selon la norme EN ISO 2719.
[0060] Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, l’huile hydrocarbonée_de la composition adjuvante présente un intervalle d’ébullition (mesuré selon la norme ASTM D86) dans la gamme allant de 235 à 330°C et plus préférentiellement de 240 à 325°C, et comprend une teneur en poids d’isoparaffines supérieure ou égale à 95 % et
avantageusement supérieure ou égale à 98% par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée, lesdites isoparaffines incluant, par rapport au poids total des
isoparaffines, au moins 2% en poids, de préférence au moins 20% en poids,
d’isoparaffines ayant 17 atomes de carbone et/ou d’isoparaffines ayant 18 atomes de carbone.
[0061] Procédé d'obtention de l'huile hvdrocarbonée
[0062] L'huile hydrocarbonée selon l'invention peut être une coupe hydrocarbonée issue par exemple de la conversion de la biomasse. Par issue de la conversion de la biomasse, on entend une coupe hydrocarbonée produite à partir de matières premières d'origine biologique.
[0063] De préférence, la coupe hydrocarbonée d'origine biologique est obtenue par un procédé comprenant des étapes d'hydrodésoxygénation (HDO) et d'isomérisation (ISO). L'étape d'hydrodésoxygénation (HDO) conduit à la décomposition des structures des esters biologiques ou des constituants triglycérides, à l'élimination des composés oxygénés, phosphorés et soufrés et à l'hydrogénation des liaisons oléfiniques. Le produit issu de la réaction d'hydrodésoxygénation est ensuite isomérisé. Une étape de fractionnement peut de préférence suivre les étapes d'hydrodésoxygénation et d'isomérisation. De manière avantageuse, les fractions d'intérêt sont ensuite soumises à des étapes d'hydrotraitement puis de distillation afin obtenir les spécifications de l'huile hydrocarbonée souhaitée selon l'invention.
[0064] Ce procédé HDO/ISO est mis en oeuvre sur une charge biologique brute, encore appelée biomasse ou matière première d'origine biologique, sélectionnée dans le groupe consistant en des huiles végétales, des graisses animales, des huiles de poisson et leur mélange. Les matières premières d'origine biologique appropriées sont par exemple l'huile de colza, l'huile de canola, le talloil, l'huile de tournesol, l'huile de soja, l'huile de chanvre, l'huile d'olive, l'huile de lin, l'huile de moutarde, l'huile de palme, l'huile d'arachide, l'huile de ricin, l'huile de noix de coco, les graisses animales telles que le suif, les graisses alimentaires recyclées, les matières premières issues du génie génétique, et les matières premières biologiques produites à partir de microorganismes tels que les algues et les bactéries. Des produits de condensation, esters ou autres dérivés obtenus à partir de matériaux biologiques bruts peuvent également servir de matières premières.
[0065] De préférence, la matière première d'origine biologique est un ester ou un dérivé triglycéride. Ce matériau est soumis tout d'abord à une étape d'hydrodésoxygénation (HDO) pour décomposer la structure des esters ou triglycérides constitutifs et éliminer les composés oxygénés, phosphorés et soufrés de manière concomitante à
l'hydrogénation des liaisons oléfiniques. Cette étape d'hydrodésoxygénation (HDO) de la matière première d'origine biologique est suivie par une isomérisation du produit ainsi obtenu conduisant à la ramification de la chaîne hydrocarbonée et à une amélioration des propriétés de la paraffine à basses températures.
[0066] Durant l'étape HDO, l'hydrogène et la matière première d'origine biologique sont passés sur un lit catalytique d'hydrodésoxygénation de manière simultanée ou à contre- courant. Durant l'étape HDO, la pression et la température sont comprises entre 20 et 150 bars et entre 200 et 500°C respectivement. Des catalyseurs classiques et connus d'hydrodésoxygénation sont utilisés durant cette étape. Éventuellement, la matière première d'origine biologique peut être soumise à une préhydrogénation sous conditions douces pour éviter les réactions secondaires des doubles liaisons avant l'étape HDO. Après l'étape d'hydrodésoxygénation, le produit issu de la réaction est soumis à une étape d'isomérisation (ISO) où l'hydrogène et le produit, et éventuellement un mélange de n- paraffines, sont passés sur des lits catalytiques d'isomérisation de manière simultanée ou à contre- courant. Lors de l'étape ISO, la pression et la température sont comprises entre 20 et 150 bars et entre 200 et 500°C respectivement. Des catalyseurs classiques et connus d'isomérisation sont utilisés durant cette étape.
[0067] Divers procédés HDO/ISO sont décrits dans la littérature. La demande
WO 2014/033762 décrit un procédé comprenant une étape de pré-hydrogénation, une étape d’hydrodésoxygénation (HDO) et une étape d’isomérisation opérées à contre- courant. La demande de brevet EP 1728844 décrit un procédé de production de composés hydrocarbonés à partir d’un mélange de composés d’origine végétale et animale. [0068] Des procédés secondaires additionnels peuvent également être mis en oeuvre (comme des mélanges intermédiaires, des piégeages ou autres procédés de la sorte).
[0069] La composition adjuvante selon l’invention comprend de préférence une teneur en huile hydrocarbonée allant de 40 à 99% en poids, préférentiellement de 60 à 98% en poids et plus préférentiellement de 85 à 96% en poids par rapport au poids total de la composition adjuvante.
[0070] Tensioactif :
[0071] La composition adjuvante selon l’invention constitue une phase grasse qui, pour former un vaccin, peut être mélangée avec une phase aqueuse comprenant un antigène. Le tensioactif présent dans la composition adjuvante permet de mélanger la phase grasse et la phase aqueuse qui sont non-miscibles afin d’obtenir un mélange homogène et stable.
[0072] Selon un mode de réalisation de l'invention, la composition adjuvante comprend
entre 2 et 10% en poids de tensioactif, de préférence entre 4 et 8% en poids, de préférence environ 6% en poids de tensioactif, par rapport au poids total de la
composition adjuvante.
[0073] Par tensioactif, on entend un ou plusieurs tensioactifs.
[0074] Les tensioactifs qui peuvent être utilisés dans l’invention sont des tensioactifs qui sont disponibles commercialement et accessibles à l’homme du métier. Ce sont typiquement des tensioactifs pharmaceutiquement acceptables, en particulier
compatibles pour une administration chez les êtres humains et les animaux.
[0075] Selon un mode de réalisation de l'invention, le tensioactif contenu dans la
composition adjuvante est un tensioactif non-ionique.
[0076] Selon un mode de réalisation de l'invention, le tensioactif contenu dans la
composition adjuvante est choisi parmi les esters de sorbitane, les esters de sorbitane polyéthoxylés, les esters de mannitane, les esters de mannitane polyéthoxylés de préférence parmi les esters de sorbitane.
[0077] Selon un mode de réalisation de l'invention, le tensioactif contenu dans la
composition adjuvante est un ester d’acide gras de sorbitane choisi parmi l'oléate de sorbitane, le stéarate de sorbitane, le palmitate de sorbitane, le laurate de sorbitane. De préférence, le tensioactif est un monooléate de sorbitane. Un exemple non limitatif de tensioactif pouvant être utilisé dans la composition adjuvante selon l’invention est le SPAN® 80 commercialisé par Croda. [0078] Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le tensioactif contenu dans la composition adjuvante est choisi parmi les lécithines, les alcanols polyéthoxylés, les esters de polyéthylèneglycol, les polyhydroxystéarates de polyglycol ou de polyglycérol.
[0079] Composition adjuvante selon l’invention
[0080] La composition adjuvante selon l’invention comprend au moins une huile
hydrocarbonée telle que définie ci-dessus et au moins un tensioactif.
[0081] Selon un mode de réalisation de l’invention, la composition adjuvante est constituée d’une ou plusieurs huiles hydrocarbonées telles que définies ci-dessus et d’un ou plusieurs tensioactifs.
[0082] Selon un mode de réalisation de l’invention, la composition adjuvante comprend au moins une autre huile différente de l’huile hydrocarbonée définie dans la présente invention. De préférence, selon ce mode de réalisation, la composition adjuvante comprend de 1 à 40% en poids, de préférence de 5 à 30% en poids, voire de 10 à 20% en poids d’une autre huile, par rapport au poids total de la composition adjuvante.
[0083] Parmi les autres huiles, on peut citer les huiles minérales, végétales ou animales. En particulier, l’autre huile peut être une huile hydrocarbonée d’origine fossile ou renouvelable ou une huile végétale hydrogénée ou non.
[0084] Selon un mode de réalisation, la composition adjuvante selon l’invention comprend une autre huile choisie parmi les n-paraffines, typiquement parmi les n-paraffines comprenant de 12 à 40 atomes de carbone, de préférence de 14 à 30 atomes de carbone, voire de 16 à 24 atomes de carbone. Les n-paraffines peuvent être choisies parmi les n-paraffines biosourcées. Ces n-paraffines peuvent être disponibles commercialement.
[0085] Selon un mode de réalisation de l’invention, la composition adjuvante pour vaccin consiste en, par rapport au poids total de la composition adjuvante :
- au moins 40% en poids d’huile(s) hydrocarbonée(s) comprenant une teneur en poids d’isoparaffines allant de 90 à 100% par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée, lesdites isoparaffines incluant, par rapport au poids total des isoparaffines, au moins 20% en poids d’isoparaffines ayant 17 atomes de carbone ou 18 atomes de carbone,
- de 1 à 15% en poids de tensioactif(s) et
- de 1 à 40% en poids d'une ou plusieurs autres huiles. [0086] Selon un mode de réalisation de l’invention, la composition adjuvante pour vaccin comprend, de préférence consiste en, par rapport au poids total de la composition adjuvante :
- au moins 40% en poids d’huile(s) hydrocarbonée(s) comprenant une teneur en poids d’isoparaffines allant de 90 à 100% par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée, lesdites isoparaffines incluant, par rapport au poids total des isoparaffines, au moins 20% en poids d’isoparaffines ayant 17 atomes de carbone ou 18 atomes de carbone,
- de 1 à 15% en poids de tensioactif(s) et
- de 1 à 40% en poids d'une ou plusieurs autres huiles choisies parmi les n-paraffines.
[0087] Selon un mode de réalisation, la composition adjuvante pour vaccin selon l’invention comprend un ratio massique huile(s) hydrocarbonée(s) définie(s) dans l’invention / n- paraffine(s) allant de 60/40 à 99/1 , de préférence de 70/30 à 98/2, voire de 80/20 à 95/5.
[0088] Selon un autre mode de réalisation de l’invention, la composition adjuvante ne
comprend pas d’huile différente de l’huile hydrocarbonée définie dans la présente invention.
[0089] Selon un mode de réalisation de l’invention, la composition adjuvante pour vaccin consiste en, par rapport au poids total de la composition adjuvante :
- au moins 40% en poids d’huile(s) hydrocarbonée(s) comprenant une teneur en poids d’isoparaffines allant de 90 à 100% par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée, lesdites isoparaffines incluant, par rapport au poids total des isoparaffines, au moins 2% en poids, de préférence au moins 20% en poids d’isoparaffines ayant 17 atomes de carbone ou 18 atomes de carbone et
- de 1 à 15% en poids d’esters de sorbitane, de préférence de monooléate de sorbitane.
[0090] La composition adjuvante peut également comprendre d’autres agents comme par exemple des sels métalliques, de préférence des sels d’aluminium, de préférence en une quantité allant de 0,1 à 5% en poids par rapport au poids total de la composition adjuvante. Ces sels métalliques permettent d’augmenter la viscosité de la composition adjuvante et d’améliorer la stabilité de l’émulsion.
[0091] Selon un mode de réalisation de l’invention, la composition adjuvante pour vaccin comprend, voire consiste en, par rapport au poids total de la composition adjuvante :
- au moins 40% en poids d’huile(s) hydrocarbonée(s) comprenant une teneur en poids d’isoparaffines allant de 90 à 100% par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée, lesdites isoparaffines incluant des isoparaffines ayant 17 atomes de carbone ou 18 atomes de carbone
- de 1 à 15% en poids de tensioactif(s) et
- éventuellement de 0,1 à 5% en poids de sels métalliques, de préférence de sels d’aluminium,
- éventuellement de 1 à 40% en poids d’une ou plusieurs autres huiles.
[0092] Selon un mode de réalisation de l’invention, la composition adjuvante pour vaccin comprend, voire consiste en, par rapport au poids total de la composition adjuvante :
- au moins 40% en poids d’huile(s) hydrocarbonée(s) comprenant une teneur en poids d’isoparaffines allant de 90 à 100% par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée, lesdites isoparaffines incluant des isoparaffines ayant 17 atomes de carbone ou 18 atomes de carbone
- de 1 à 15% en poids de tensioactif(s) et
- éventuellement de 0,1 à 5% en poids de sels métalliques, de préférence de sels d’aluminium,
- éventuellement de 1 à 40% en poids d’une ou plusieurs autres huiles choisies par exemple parmi les n-paraffines.
[0093] Selon un autre mode de réalisation, la composition adjuvante comprend en outre un conservateur, par exemple un parabène, de préférence méthylparabène, éthylparabène et/ou propylparabène.
[0094] Selon un autre mode de réalisation, la composition adjuvante pour vaccin ne
comprend pas de sels métalliques.
[0095] Selon un mode de réalisation de l'invention, la composition adjuvante ne comprend pas de polymère.
[0096] Vaccin préparé à partir de la composition adjuvante selon l’invention
[0097] La composition adjuvante selon l’invention est utile pour préparer un vaccin.
[0098] Selon un mode de réalisation, le vaccin est sous la forme d’une émulsion, dans laquelle la composition adjuvante de l’invention constitue la phase grasse.
[0099] Selon un mode de réalisation particulier, le vaccin selon l’invention ne comprend pas de phase grasse différente de la composition adjuvante selon l’invention. [0100] Selon un mode de réalisation, le vaccin est sous la forme d’une émulsion, dans laquelle la phase aqueuse comprend de l’eau, un antigène et un tensioactif.
[0101] Le tensioactif contenu dans la phase aqueuse peut être identique ou différent du tensioactif contenu dans la composition adjuvante constituant la phase grasse. Selon un mode de réalisation de l'invention, le tensioactif contenu dans la phase aqueuse est choisi parmi les tensioactifs non-ioniques, de préférence parmi les esters de sorbitane, les esters de sorbitane polyéthoxylés, les esters mannitane, les esters de mannitane polyéthoxylés de préférence parmi les esters de sorbitane.
[0102] Selon un mode de réalisation de l'invention, le tensioactif contenu dans la phase aqueuse est un ester d’acide gras de sorbitane choisi parmi l'oléate de sorbitane, le stéarate de sorbitane, le palmitate de sorbitane, le laurate de sorbitane. De préférence, le tensioactif est un ester de sorbitan polyéthoxylé. Un exemple non limitatif de tensioactif pouvant être utilisé dans la phase aqueuse du vaccin selon l’invention est le Tween® 80 commercialisé par Croda.
[0103] Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le tensioactif contenu dans la phase aqueuse est choisi parmi les lécithines, les alcanols polyéthoxylés, les esters de polyéthylèneglycol, les polyhydroxystéarates de polyglycol ou de polyglycérol.
[0104] Selon un mode de réalisation, le vaccin est sous la forme d’une émulsion eau-dans- l’huile.
[0105] Selon un mode de réalisation, le vaccin est sous la forme d’une émulsion dans
laquelle le ratio massique entre la phase aqueuse et la phase grasse va de 50/50 à 10/90, de préférence de 40/60 à 20/80 et plus préférentiellement est de 30/70.
[0106] Typiquement, le vaccin selon l’invention a une viscosité dynamique à 25°C comprise entre 10 et 150 mPa.s, de préférence entre 15 et 120 mPa.s, de préférence entre 20 et 100 mPa.s mesurée selon la norme ASTM D445.
[0107] Selon un mode de réalisation, le vaccin est préparé par mise en contact de la
composition adjuvante selon l’invention avec une solution aqueuse comprenant un antigène. On entend par antigène toute substance que le système immunologique d'un individu reconnaît comme étrangère, et qui provoque une réponse par la production d'anticorps. Les antigènes sont généralement des polysaccharides, des dérivés de polysaccharide, des protéines ou des dérivés de protéine.
[0108] Selon un mode de réalisation, l’antigène présent dans le vaccin est choisi parmi un anti-virus Foot and Mouth Disease, un anti-bacteria Pasteurella, un antigène Newcastle, un antigène Avian Influenza. [0109] Selon un mode de réalisation particulier, le vaccin est préparé par mise en contact de la composition adjuvante selon l’invention avec une phase aqueuse comprenant un antigène et un tensioactif.
[01 10] Les inventeurs ont découvert que l’huile hydrocarbonée selon l’invention permet d’améliorer l’effet anti-infectieux d’un antigène.
[01 11] La présente invention concerne ainsi l’utilisation de l’huile hydrocarbonée définie dans la présente invention, dans une composition adjuvante, pour améliorer l’effet anti infectieux de ladite composition adjuvante pour vaccin. La composition adjuvante, dans le cadre de l’utilisation, présentera de préférence une ou plusieurs des caractéristiques définies ci-dessus pour la composition adjuvante selon l’invention.
[01 12] La présente invention concerne également l’utilisation de l’huile hydrocarbonée selon l’invention, dans une composition adjuvante pour vaccin, pour diminuer la cytotoxicité du vaccin.
[01 13] La présente invention concerne également l’utilisation de l’huile hydrocarbonée
définie dans la présente l’invention, dans une composition adjuvante pour vaccin, pour améliorer la stabilité du vaccin, en particulier pour un vaccin sous la forme d’une émulsion.
[01 14] EXEMPLES
[01 15] Dans la suite de la présente description, des exemples sont donnés à titre illustratif de la présente invention et ne visent en aucun cas à en limiter la portée.
[01 16] Exemple 1 : évaluation des effets immunologiques
[01 17] Le tableau 1 ci-dessous regroupe les propriétés physico chimiques de deux huiles hydrocarbonées utilisables dans des compositions adjuvantes selon l’invention.
[01 18] [Tableau 1]
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
[01 19] Les normes et méthodes suivantes ont été utilisées pour mesurer les propriétés ci- dessus :
- point éclair : EN ISO 2719
- densité à 15°C : EN ISO 1 185
- viscosité à 40°C : EN ISO 3104
- point d’aniline : EN ISO 2977
- Point d’ébullition : ASTM D86
biodégradabilité : méthode OCDE 306
indice de réfraction à 20°C : ASTM D 1218 pression de vapeur : calculée selon des méthodes bien connues de l’homme du métier.
[0120] Exemple 2 : évaluation de l’effet immunologique des Huiles de l’Exemple 1
[0121] Les Huiles A et B décrites dans l’Exemple 1 ont été testées in vitro pour déterminer leurs effets immunologiques sur des cellules immunitaires humaines.
[0122] Les effets immunologiques des huiles selon l’invention ont été comparés à ceux d’adjuvants de référence, en particulier des huiles hydrocarbonées, Marcol™ 52 et Creasil IH CG, cette dernière étant une huile isoparaffinique. Les effets des huiles ont également été comparés à ceux de l’hydroxyde d’aluminium, un adjuvant de référence utilisée dans de nombreux vaccins commerciaux.
[0123] Différents tests ont été effectués sur des cellules immunitaires humaines. Le premier test a été fait sur les cellules mononucléées isolées du sang périphérique (CMSP) de donneurs sains. D’autres tests ont ensuite été faits sur des macrophages et des cellules dendritiques obtenus en séparant les populations lymphocytaire et monocytaire des CMSP et en différenciant les monocytes in vitro en macrophages ou en cellules dendritiques sous l’effet de cytokines (GM-CSF & M-CSF ou interleukine(IL)-4). Ces modèles cellulaires sont bien décrits dans la littérature scientifique, en particulier pour caractériser les effets immunologiques de candidats vaccins et de leurs constituants tels que leurs adjuvants.
[0124] Les CMSP, les macrophages et les cellules dendritiques ont été mis en contact pendant 24 heures avec les huiles selon l’invention ainsi qu’avec des adjuvants de référence. La capacité des cellules à se multiplier, à mourir et à se différencier a été mesurée en dosant l’activation cellulaire, la viabilité cellulaire, le profil de cytokines et l’expression membranaire d’autres biomarqueurs.
[0125] Préparation de microplaques de culture : 24 heures avant l'incubation avec les
huiles, les cellules sont ensemencées dans des microplaques 96 puits (Corning). Les microplaques sont ensuite placées à l'incubateur à 37°C.
[0126] Incubation des cellules avec les huiles : la durée d'incubation était de 15 minutes.
Après ces temps d'incubation, les microplaques sont vidées et les cellules sont rincées.
[0127] Mesure de l’activation et de la viabilité cellulaire : 3 jours après le traitement par les huiles, les cellules sont observées au microscope pour évaluer l’activation cellulaire puis soumises à un test colorimétrique au sel de méthyl de tétrazolium (MTT) pour évaluer la viabilité cellulaire. [0128] Dosage des cytokines : 5 jours après le traitement par les huiles, des dosages immunoenzymatiques multiplexés sont réalisés et des immunophénotypages sont analysés par cytométrie en flux afin de déterminer le profil des cytokines et l’expression membranaire des cellules.
[0129] Les effets ont été mesurés vis-à-vis de 2 ou 3 donneurs, en triplicat de culture. Les résultats des tests sont présentés dans les Tableaux 2 à 10 ci-dessous.
[0130] Les résultats des observations relatives à l’activation et la viabilité cellulaire à
différentes dilutions (les dilutions sont exprimées en % volumique) sont présentés aux Figures 1 à 3. On observe une activation cellulaire significative pour les Huiles A et B avec une augmentation plus forte pour l’Huile A que pour l’Huile B.
[0131] Dans ces conditions expérimentales, le Marcol™ 52 et le Creasil® IH CG présentent le même profil puisqu’ils diminuent la viabilité des CMSP, des macrophages et des cellules dendritiques provenant des différents donneurs de cellules. Le Marcol™ 52 et le Creasil® IH CG présentent une cytotoxicité aux faibles dilutions (dilutions exprimées en % volumique), c’est-à-dire aux fortes concentrations. En revanche, les Huiles A et B, tout comme l’hydroxyde d’aluminium, n’engendrent pas de diminution de la viabilité cellulaire. Contrairement au Marcol™ 52 et au Creasil® IH CG, les Huiles A et B ne montrent aucune cytotoxicité aux concentrations testées.
[0132] Le profil de cytokines des CMSP est observé après stimulation antigènique ou non soit à l’aide de la Toxine Tétanique (TT), soit de la tuberculine (PPD).
[0133] Le Tableau 2, ci-dessous, rassemble les résultats des dosages des cytokines après 5 jours dans les surnageants de cultures de CMSP non exposées en parallèle à un antigène. Les résultats sont exprimés en pg/mL.
[0134] [Tableau 2]
Dilution IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 IL-12 IL-13 GM-CSF IFN-g TNF-a
Témoin 4 978 14 185 48
Figure imgf000020_0001
2 003 227 750 71 445
Hydroxyde
4 104 6 33 53 645 121 538 9 262 d’aluminium
4 3 842 12 65 71 3 2 052 188 992 41 643
Huile A 20 4 043 9 35 24 2 1 175 130 515 25 561
100 3 991 11 72 28 2 1 698 155 382 35 206
20 3 852 6 14 348 16 72 15 851
Marcol™ 52
100 4 886 14 181 1 896 227 1 445 69 664 500 5 067 14 294 68 2 2 773 283 1 192 71 217
50 4 662 1 2 3 0 7 3 13 1 987
Creasil® IH
250 4 807 12 155 41 3 2 312 266 1 091 40 023 CG
1250 4 535 14 21 1 55 3 2 200 286 1 107 70 288
4 3 708 13 63 43 2 1 089 140 789 64 724
Huile B 20 4 761 13 99 36 3 1 673 202 1 242 75 070
100 5 240 14 133 50 2 1 734 190 1 323 75 138
Profil de cytokines des CMSP
[0135] Sans stimulation antigénique des CMSP, des modulations sont observées au niveau de la production cytokinique en présence des différents adjuvants testés. Dans ces conditions expérimentales, l’Huile A se distingue des autres adjuvants par une diminution plus prononcée du taux d’IL-5, une diminution de celui du TNF-a et une absence d’augmentation d’IFN-g.
[0136] Le profil des cytokines des macrophages et des cellules dendritiques a été évalué lors de réactions lymphocytaires mixtes (MLR).
[0137] Macrophages
[0138] Le Tableau 3, ci-dessous, compare les effets des adjuvants sur la prolifération
lymphocytaire en réponse aux interactions avec les macrophages, sous antigène (PPD) ou non. Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport aux cellules non-traitées (Témoin).
[0139] [Tableau 3]
Sans PPD Avec PPD
Ecart-
% ou Dilution Moyenne Moyenne Ecart-Type.
Type.
Témoin 100 12 100 12
Hydroxyde 10% 74 7 63 7
d’aluminium 2% 68 6 61 12
4 109 14 121 1 1
Huile A 20 145 7 1 10 13
100 131 5 1 19 5
20 108 9 78 8
Marcol™ 52
100 102 7 48 7 500 103 6 88 8
50 107 7 98 6
Creasil® IH
250 1 16 6 98 5
CG
1250 107 6 103 4
4 100 2 98 1 1
Huile B
20 171 7 136 17
100 135 4 123 6
Profil de cytokines des macrophages avec et sans présentation antigènique (PPD) préalable
[0140] Le Tableau 4, ci-dessous, détaille les effets des adjuvants sur les taux cytokiniques dans les surnageants de culture des macrophages cocultivés avec les lymphocytes autologues et sans présentation antigénique (PPD) préalable.
[0141] [Tableau 4]
% ou
IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 IL-12 IL-13 GM-CSF IFN-y TNF-a Dilution
Figure imgf000022_0001
4 37 0 0,04 7 0 1 2 1 1 331
Huile A 20 37 1 0,56 5 0,26 0 3 1 2 222
100 25 0 0,56 4 0,01 0 1 1 1 091
20 10 0 0,04 2 0 0,14 0 0,68 295
Marcol™ 52 100 7 0 0,31 1 0 0 0,21 0,31 227
500 15 0 0,04 4 0,26 0,14 1 0,31 416
50 22,5 0,1 1 0,04 4 0 0 1 0,68 802
Creasil® IH
250 18 0,1 1 0 3 0 0 1 0,31 612 CG
1250 15 0,1 1 0,56 4 0 0,14 0,38 1 564
4 16 0,1 1 0,81 6 0 0,14 1 0,68 659
Huile B 20 21 0 0,04 4 0,14 0 1 0,68 1 121
100 20 0 0 4 0 0 1 0,68 579
[0142] Le Tableau 5, ci-dessous, détaille les effets des adjuvants sur les taux cytokiniques dans les surnageants de culture des macrophages cocultivés avec les lymphocytes autologues et après présentation antigènique (PPD). [0143] [Tableau 5]
% ou
IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 IL-12 IL-13 GM-CSF IFN-y
Dilution TNF-a
NT 18 0 2 4 0 1 1 1 235
PPD 297 6 12 16 0 41 144 20 15 356
Figure imgf000023_0001
4 690 19 59 36 3 132 999 62 66 323
Huile A 20 539 15 37 39 2 15 522 12 43 879
100 613 16 40 39 3 56 604 21 49 185
20 328 7 1 1 1 1 15 128 15 13 816
Marcol™ 52 100 357 8 18 13 1 38 219 31 19 957
500 41 1 10 2 17 1 59 236 28 20 938
50 505 12 30 26 1 ,5 79 435 31 32 987
Creasil® IH
250 544 14 31 24 1 ,5 69 385 31 32 601
CG
1250 512 13 27 22 2 70 373 31 32 061
4 566 14 40 36 2 326 492 87 36 840
Huile B 20 454 1 1 21 16 1 ,5 37 252 28 23 104
100 492 1 1 22 20 1 96 273 21 25 019
[0144] Les résultats des dosages cytokiniques indiquent que la présence de l’Huile A
engendre une production accrue d’IL-2, d’IL-10, d’IL-12 et de TNF-a. Ces résultats suggèrent une réponse Th1 , cellulaire, favorisée par rapport à un profil Th2. La présence d’IL-12 oriente la différenciation des lymphocytes T naïfs vers des lymphocytes de profil Th1. Toutefois, la détection de cytokines comme l’IL-4 et l’L-13 témoigne d’un profil mixte Th1 et Th2 ou d’une régulation entre les deux profils. La forte production de GM- CSF par les Huiles A et B est aussi un élément pouvant accélérer une réponse microbienne. En effet, le GM-CSF, aux niveaux central et périphérique, augmente le nombre ou la fonctionnalité des cellules de la lignée monocyto/macrophagique, potentialisant ainsi les réponses anti-infectieuses.
[0145] Cellules dendritiques
[0146] Le Tableau 6, ci-dessous, compare les effets des adjuvants sur la prolifération
lymphocytaire en réponse aux interactions avec les cellules dendritiques, sous antigène (PPD) ou non. Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport aux cellules non- traitées (Témoin). [0147] [Tableau 6]
Sans PPD Avec PPD
% ou Dilution Moy. ET. Moy. ET.
Témoin 100 4 100 9
Hydroxyde 10% 57 28 69 1 d’aluminium 2% 96 12 106 5
4 128 5 131 1 1
Huile A 20 135 2 147 8
100 138 6 138 7
20 1 14 4 137 5
Marcol™ 52 100 1 14 2 124 5
500 1 18 13 1 14 4
50 96 41 107 2
Creasil® IH
250 128 3 141 14
CG
1250 108 1 1 16 5
4 79 3 87 4
Huile B 20 161 0 177 2
100 124 2 134 2
[0148] Le Tableau 7 détaille les effets des adjuvants sur les taux cytokiniques dans les surnageants de culture des cellules dendritiques cocultivées avec les lymphocytes autologues et sans présentation antigénique (PPD) préalable.
[0149] [Tableau 7]
% ou
IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 IL-12 IL-13 GM-CSF IFN-g TNF-a Dilution
NT 37 0, 1 0,6 5,5 0 7,5 2,5 477
Hydroxyde
10
Figure imgf000024_0001
8 0 10 3 649 d’aluminium 0,1
4 51 0,5 1 7 0, 1 12 8 5 1 354
Huile A 20 31 0,1 0,6 5 0 2,5 9 4 1 417
100 37 0, 1 1 6 0 6 7 3 1 059
20 31 0 1 5 0 6 2 1 ,5 504
Marcol™ 52 100 37 0 0,6 6 0 9,5 3 2 626
500 24,5 0, 1 0,6 2 0 3 10 4,5 1 214
Figure imgf000024_0002
1250 47 0 0,6 11 4 2 722
4 47 0,3 0 8 0 11 4 3 742
Huile B 20 23.5 0 0,04 8 0 3 3,5 3 925
100 45.5 0, 1 1 ,5 8,5 0 11 4,5 2 629
[0150] Le Tableau 8 détaille les effets des adjuvants sur les taux cytokiniques dans les surnageants de culture des cellules dendritiques cocultivées avec les lymphocytes autologues et après présentation antigénique (PPD).
[0151] [Tableau 8]
% ou
IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 IL-12 IL-13 GM-CSF IFN-g
Dilution TNF-a
NT 40 0 0,5
Figure imgf000025_0001
0 10 4 2 322
PPD 771 7 31 47 3 770 205 779 12 854
Hydroxyde
686 9 38 69 3 1 016 263 961 14 338 d’aluminium
4 1 189 14 43 86 5 617 465 1 689 22 704
Huile A 20 617 7 21 46 3 96 237 218 14 527
100 913 9 21 56 3 257 260 438 15487
20 855 8 29 52 4 737 226 854 14 731
Marcol™ 52 100 770 9 35 67 3 917 241 851 15 248
500 778 9 33 75 4 875 240 974 14 630
50 1 003 10 33 78 4 657 304 1 032 17 861
Creasil® IH
250 1 031 10 47 72 4 1 809 429 1 026 17 150 CG
1250 951 9 33 63 4 769 265 893 17 289
4 987 12 50 106 5 1 467 361 2 019 22 056
Huile B 20 843 9 28 57 4 526 266 1 490 16 369
100 860 8 34 53 3 795 248 1 134 15 296
[0152] Les dosages de cytokines dans les surnageants de culture indiquent que les Huiles A et B, et en particulier l’Huile A, orientent la réponse vers un profil Th1 avec une augmentation des niveaux de TNF-a, d’IFN-g et d’IL-2. Comme pour les macrophages, une augmentation du taux de GM-CSF est observée. Les Huiles A et B se distinguent des autres adjuvants testés au niveau des cytokines. En effet, les trois autres adjuvants engendrent peu ou pas de modulations des cytokines testées. [0153] Les Huiles A et B favorisent la prolifération/activation des lymphocytes mis au contact des cellules présentatrice d’antigènes, que ce soient des macrophages ou des cellules dendritiques, en présence ou non d’un antigène comme la PPD.
[0154] Expression membranaire
[0155] Macrophages
[0156] [Tableau 9]
Figure imgf000026_0001
Effets des adjuvants sur la différenciation des macrophages (Immunophénotypage et
analyse 3 jours après le traitement).
[0157] L’effet des Huiles A et B sur l’expression membranaire des macrophages est proche de celui du Creasil® IH CG avec une forte diminution des protéines CD163 et de CD32 (Cluster Différentiation), un des récepteurs Fc (Fragment cristallisable) des
immunoglobulines. Cette double modulation semble témoigner d’une orientation des macrophages vers un profil pro-inflammatoire de type M1 , favorable à une réponse inflammatoire bénéfique de l’hôte contre une infection microbienne. Cette orientation est cohérente avec les productions cytokiniques, comme celle du TNF-a, décrit pour activer les macrophages orientés M1 et, celle de l’IL-12, secrétée par les mêmes macrophages M1. On notera parallèlement que les effets de l’hydroxyde d’aluminium (diminution de l’expression des CD14 et augmentation de l’expression des CD86) sont identiques à ceux préalablement décrits par le laboratoire ( Rimaniol & al., In vitro interactions between macrophages and aluminum-containing adjuvants. Vaccine, 2007, 25, 6784- 6792). Ces résultats permettent d’asseoir les modulations observées avec les Huiles A et B.
[0158] Cellule dendritiques
[0159] [Tableau 10]
Hydroxyde MarcolTM Creasil® IH
Huile A Huile B d’aluminium 52 CG
CD1a —
HLA-DR = = . .. +
CD83 ++ ++ = - +
CD40 =
Effets des adjuvants sur la différenciation des cellules dendritiques. (Immunophénotypage et analyse 3 jours après le traitement).
[0160] S’agissant des marqueurs membranaires des cellules dendritiques, les Huiles A et B présentent un profil spécifique. D’une part, ils ne modulent pas l’expression de CD1 a, spécifique des cellules dendritiques Et d’autre part, les Huiles A et B, et en particulier l’Huile A, augmente l’expression de CD83, un marqueur de la maturation des cellules dendritiques.
[0161] En conclusion, les Huiles A et B présentent un profil spécifique, orienté vers les réponses de type Th1 pour les lymphocytes et M1 pour les macrophages. Ils conduisent également à une maturation des cellules dendritiques. Ces profils, tout comme la synthèse macrophagique accrue de GM-CSF, sont supposés favoriser une réponse anti infectieuse, rôle attendu d’un adjuvant.
[0162] Exemple 3 : préparation d’une émulsion comprenant la composition adjuvante de l’invention - évaluation de la stabilité de l’émulsion
[0163] Un exemple d’émulsion comprenant la composition adjuvante selon l’invention est donné dans le Tableau 11 ci-dessous. Les pourcentages sont des pourcentages en poids par rapport au poids total de la composition adjuvante.
[0164] [Tableau 1 1]
Figure imgf000028_0001
[0165] Le mode opératoire de préparation de l’émulsion est le suivant :
[0166] L’huile et le tensioactif de la phase grasse sont introduits dans un tube à essai dans les proportions indiquées dans le Tableau 11. Le tube à essai est mis sous agitation et chauffé à 80°C jusqu’à l’obtention d’une phase homogène.
[0167] L’eau et le tensioactif de la phase aqueuse sont introduits dans un second tube à essai dans les proportions indiquées dans le Tableau 1 1. Le tube à essai est mis sous agitation et chauffé à 80°C jusqu’à l’obtention d’une phase homogène.
[0168] A 80°C, la phase aqueuse est versée lentement dans la phase grasse sous vive agitation. Puis l’émulsion est mélangée au moyen d’un mélangeur de type Turrax® à 9 500 tours/minute pendant 30 secondes.
[0169] Le mélange est laissé à refroidir jusqu’à 25°C sous agitation modérée.
[0170] Lorsque l’émulsion est réalisée, on observe une seule phase homogène. L’émulsion est alors centrifugée à T0 puis à après 24 heures pendant 20 minutes à
3 500 tours/minute avec une centrifugeuse Fisher Bioblock Scientific Sigma 1-6.
[0171] La stabilité de la composition décrite dans le Tableau 11 est observée visuellement après centrifugation à T0, après centrifugation après 24 heures (T24h) et après 90 jours (T2160h).
[0172] Le tube à essai comprend 6,6 cm d’émulsion, dont 4,2 cm de phase grasse. Une mesure manuelle du déphasage est faite, c’est-à-dire une mesure de la phase grasse relarguée au-dessus de l’émulsion.
[0173] [Tableau 12]
Figure imgf000028_0002
Mesure du relargage de la phase grasse
[0174] A T0, on observe le même relargage pour l’émulsion comprenant l’huile Marcol™ 52 que pour l’émulsion comprenant l’Huile A.
[0175] Après 24 heures, l’émulsion comprenant l’huile Marcol™ 52 a davantage relargué que l’émulsion comprenant l’Huile A. On observe pour la composition comprenant l’Huile A, un relargage de 7,1 % (= 0,3 / 4,2) de phase grasse par rapport à la quantité de phase grasse totale comprise dans l’émulsion, contre 9,5% (= 0,4 / 4,2) pour la composition comprenant l’huile Marcol™ 52.
[0176] Exemple 4 : préparation d’un vaccin comprenant la composition adjuvante de
l’invention
[0177] Un exemple de vaccin comprenant la composition adjuvante selon l’invention est donné dans le Tableau 13 ci-dessous.
[0178] [Tableau 13]
Figure imgf000029_0001
[0179] Le vaccin est préparé selon le protocole suivant :
[0180] - Préparation de la phase grasse :
[0181] Mélanger 132 g d’huile hydrocarbonée avec 8 g de Span® 80 au moyen d’un
mélangeur de type Turrax® réglé à 10 000 tours/minute pendant 3 minutes à 25°C.
[0182] - Préparation de la phase aqueuse :
[0183] Mélanger 2,5 g de Tween® 80 avec 57,5 g d’une solution d’antigène au moyen d’un mélangeur de type Turrax® réglé à 10 000 tours/minute pendant 3 minutes à 25°C.
[0184] - Préparation de l’émulsion : [0185] Introduire la phase grasse dans le mélangeur de type Turrax®, agiter 30 secondes à 10 000 tours/minute, puis ajouter doucement pendant 3 minutes la phase aqueuse en agitant à 10 000 - 12 000 tours/minute.
[0186] On obtient ainsi 200 g de vaccin sous forme d’émulsion eau-dans-l’huile.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Composition adjuvante pour vaccin comprenant, par rapport au poids total de la composition adjuvante :
au moins 40% en poids d’huile hydrocarbonée comprenant une teneur en poids d’isoparaffines allant de 90 à 100% par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée, lesdites isoparaffines incluant des isoparaffines ayant 17 atomes de carbone ou 18 atomes de carbone et
de 1 à 15% en poids de tensioactif(s).
[Revendication 2] Composition selon la revendication 1 , caractérisée en ce que lesdites isoparaffines comprennent, par rapport au poids total des isoparaffines, au moins 2% en poids d’isoparaffines ayant 17 atomes de carbone et/ou d’isoparaffines ayant 18 atomes de carbone.
[Revendication 3] Composition selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l’huile hydrocarbonée comprend :
- des isoparaffines ayant 15 atomes de carbone et des isoparaffines ayant 16 atomes de carbone en une quantité combinée allant de 80 à 95% en poids, par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée; ou
- des isoparaffines ayant 15 atomes de carbone et des isoparaffines ayant 16 atomes de carbone en une quantité combinée allant de 40 à 80% en poids, par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée ; ou
- des isoparaffines ayant 16 atomes de carbone, des isoparaffines ayant 17 atomes de carbone et des isoparaffines ayant 18 atomes de carbone en une quantité combinée allant de 80 à 98% en poids, par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée ; ou
- des isoparaffines ayant 17 atomes de carbone et des isoparaffines ayant 18 atomes de carbone en une quantité combinée allant de 80 à 98% en poids, par rapport au poids total de l’huile hydrocarbonée.
[Revendication 4] Composition selon l’une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le tensioactif est choisi parmi les tensioactifs non-ioniques, de préférence les esters de sorbitane.
[Revendication 5] Composition selon l’une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le tensioactif est un ester d’acide gras de sorbitane, de préférence un monooléate de sorbitane.
[Revendication 6] Composition selon l’une des revendications 1 à 5, comprenant, par rapport au poids total de la composition : - de 60 à 98% en poids d’huile hydrocarbonée comprenant une teneur en poids d’isoparaffines allant de 95 à 100% par rapport au poids total de l’huile
hydrocarbonée, lesdites isoparaffines incluant des isoparaffines ayant 17 atomes de carbone ou 18 atomes de carbone, et
- de 2 à 10% en poids de tensioactif(s).
[Revendication 7] Composition selon l’une des revendications 1 à 6, comprenant en outre une huile différente de ladite huile hydrocarbonée définie dans l’une des revendications 1 à 6, de préférence choisie parmi les n-paraffines comprenant de préférence de 14 à 30 atomes de carbone.
[Revendication 8] Composition selon la revendication 7, présentant un ratio massique huile hydrocarbonée/n-paraffines allant de 60/40 à 99/1 , de préférence de 70/30 à 98/2, de préférence encore de 80/20 à 95/5.
[Revendication 9] Vaccin comprenant la composition adjuvante telle que définie dans l’une des revendications 1 à 8 et au moins un antigène.
[Revendication 10] Vaccin selon la revendication 9, caractérisé en ce qu’il est sous forme d’une émulsion eau-dans-l’huile.
[Revendication 1 1] Vaccin selon la revendication 10, caractérisé en ce que le ratio massique entre la phase aqueuse et la phase grasse de l’émulsion eau-dans-l’huile va de 50/50 à 10/90, de préférence de 40/60 à 20/80 et plus préférentiellement est de 30/70.
[Revendication 12] Utilisation d’une composition adjuvante selon l’une des
revendications 1 à 8, pour diminuer la cytotoxicité d’un vaccin comprenant ladite composition adjuvante.
[Revendication 13] Utilisation de l’huile hydrocarbonée définie dans l’une des revendications 1 à 8, dans une composition adjuvante pour vaccin, pour diminuer la cytotoxicité du vaccin comprenant ladite composition adjuvante.
[Revendication 14] Utilisation de l’huile hydrocarbonée définie dans l’une des revendications 1 à 8, dans une composition adjuvante pour vaccin, pour améliorer la stabilité du vaccin, en particulier pour un vaccin sous la forme d’une émulsion |
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