CN113423424A - 用于疫苗的佐剂组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于疫苗的佐剂组合物，其包含一种或多种基本上为异链烷烃的具有C17和/或C18异链烷烃的烃油和一种或多种表面活性剂。本发明还涉及包含所述佐剂组合物的疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于疫苗的新型佐剂组合物，其包含主要为异链烷烃的烃油和表面活性剂。
背景技术
目前存在各种不同的疫苗技术，包括所谓的“活病毒”疫苗(活抗原)、所谓的“减毒病毒”疫苗或所谓的“灭活病毒”(灭活抗原)疫苗。
在活病毒疫苗中，不需要添加佐剂，因为它们已具有足够水平的效力。然而，与此类疫苗相关的不良作用的风险很大。
相反，由于减毒或灭活病毒疫苗的效力有限，因此需要使用佐剂。当将溶解在水中的减毒或灭活病毒分散在油中时，其效力大幅增加。这种被称为乳液的分散体必须是稳定的并且尽可能具有流动性：稳定是为了确保疫苗的适当保存，流动性是为了能够快速且无痛地注射。因此，油充当佐剂。
用作疫苗佐剂的参照油是商品名为MarcolTM 52的白油，由链烷烃和环烷烃化合物组成。
文献FR 2922767公开了源自矿物、植物或动物来源的多种油以及合成油在疫苗用佐剂组合物中的应用。该文献公开了MarcolTM 52白油和对应于商品
IH CG的异十六烷及其他相关内容。这些油与表面活性剂一起配制在疫苗佐剂中。
这些油的缺点是对免疫细胞，例如从外周血分离出的单个核细胞(外周血单个核细胞或PBMC)、巨噬细胞和树突细胞，具有一定的细胞毒性。
文献RU 2072868提出了一种作为疫苗佐剂的油，其包含环烷烃、芳香族化合物和异链烷烃的混合物。该文献教导了最大量为20％(重量)的异链烷烃以降低反应原性。
佐剂油的特性也可能对接受治疗的受试者的免疫反应产生影响。因此，本发明旨在提供一种疫苗佐剂，其诱导强免疫反应以及尽可能最低的细胞毒性。
发明内容
这些目标通过一种新型佐剂组合物而实现。
本发明涉及一种用于疫苗的佐剂组合物，相对于该佐剂组合物的总重量，其包含：
-至少40重量％的烃油，其包含相对于所述烃油的总重量为90重量％至100重量％的异链烷烃，所述异链烷烃包含具有17个碳原子或18个碳原子的异链烷烃；和
-1重量％至15重量％的一种或多种表面活性剂。
根据一个实施方式，相对于异链烷烃的总重量，所述异链烷烃包含至少2重量％的具有17个碳原子的异链烷烃和/或具有18个碳原子的异链烷烃。
根据一个实施方式，所述烃油包含：
-具有15个碳原子的异链烷烃和具有16个碳原子的异链烷烃，其总量为烃油总重量的80重量％至95重量％；或
-具有15个碳原子的异链烷烃和具有16个碳原子的异链烷烃，其总量为烃油总重量的40重量％至80重量％；或
-具有16个碳原子的异链烷烃、具有17个碳原子的异链烷烃和具有18个碳原子的异链烷烃，其总量为烃油总重量的80重量％至98重量％；或
-具有17个碳原子的异链烷烃和具有18个碳原子的异链烷烃，其总量为烃油总重量的80重量％至98重量％。
根据一个实施方式，表面活性剂选自非离子表面活性剂，优选脱水山梨糖醇酯，优选脱水山梨糖醇脂肪酸酯，优选表面活性剂是脱水山梨糖醇单油酸酯。
根据一个实施方式，相对于组合物的总重量，本发明的组合物包含：
-60重量％至98重量％的烃油，其包含相对于烃油总重量为95重量％至100重量％的异链烷烃，所述异链烷烃包含具有17个和/或18个碳原子的异链烷烃；和
-2重量％至10重量％的一种或多种表面活性剂。
本发明还涉及包含本发明的佐剂组合物和至少一种抗原的疫苗。
根据一个实施方式，所述疫苗是油包水乳液的形式。
根据一个实施方式，所述油包水乳液的水相与脂肪相之间的质量比为50/50至10/90，优选40/60至20/80，更优选为30/70。
本发明还涉及本发明的佐剂组合物用于降低包含所述佐剂组合物的疫苗的细胞毒性的应用。
本发明还涉及本发明中定义的烃油在疫苗佐剂组合物中降低包含所述佐剂组合物的疫苗的细胞毒性的应用。
本发明还涉及本发明中定义的烃油在疫苗佐剂组合物中增强疫苗的稳定性、特别是乳液形式的疫苗的稳定性的应用。
本发明的佐剂组合物使得可以获得一种表现出非常低的细胞毒性同时还诱导免疫细胞产生强烈的抗感染响应的疫苗组合物。
本发明的佐剂组合物使得可以制备真正的既稳定又具有流动性的疫苗。
附图说明
[图1]在没有平行抗原刺激的情况下，油对PBMC的活力和活化的影响。
[图2]在没有平行抗原刺激的情况下，油对巨噬细胞的活力和活化的影响。
[图3]在没有平行抗原刺激的情况下，油对树突细胞的活力和活化的影响。
具体实施方式
本发明涉及用于疫苗的佐剂组合物，相对于所述佐剂组合物的总重量，其包含：
-至少40重量％的烃油，其包含相对于烃油总重量为90重量％至100重量％的异链烷烃，所述异链烷烃包含具有17个碳原子和/或18个碳原子的异链烷烃；和
-1重量％至15重量％的一种或多种表面活性剂。
作为事先说明，应该注意的是，在说明书和所附的权利要求中，术语“在……之间”应理解为包括所提及的上下限。
烃油
在本发明的上下文和范围内，烃油的异链烷烃含量为烃油总重量的90重量％至100重量％。仍在本发明的上下文和范围内，烃油的异链烷烃包含具有17个碳原子的异链烷烃和/或具有18个碳原子的异链烷烃。
根据本发明的一个实施方式，佐剂组合物中使用的烃油包含相对于烃油总重量为90重量％至100重量％的异链烷烃，所述异链烷烃包含相对于异链烷烃总重量为至少2％重量的具有17个碳原子的异链烷烃和/或具有18个碳原子的异链烷烃。
根据本发明的一个实施方式，佐剂组合物的烃油所含的异链烷烃含量相对于烃油总重量为大于或等于95重量％、有利地大于或等于98重量％，所述异链烷烃包含相对于异链烷烃总重量为至少2重量％的具有17个碳原子的异链烷烃和/或具有18个碳原子的异链烷烃。
根据本发明的一个实施方式，佐剂组合物的烃油所含的异链烷烃含量相对于烃油总重量为大于或等于95重量％、有利地大于或等于98重量％，所述异链烷烃包含相对于异链烷烃总重量为至少20重量％的具有17个碳原子的异链烷烃和/或具有18个碳原子的异链烷烃。
根据本发明的一个实施方式，烃油中所含的所述异链烷烃包含相对于异链烷烃总重量为至少20重量％、优选至少30重量％、优选至少35重量％、优选至少40重量％、优选至少60重量％、优选至少80重量％的具有17个碳原子的异链烷烃和/或具有18个碳原子的异链烷烃。
根据本发明的一个实施方式，佐剂组合物的烃油所含的异链烷烃含量相对于烃油总重量为大于或等于95重量％、有利地大于或等于98重量％；并且相对于烃油中存在的异链烷烃的总重量，至少90重量％、优选至少95重量％的所述异链烷烃含有12至30个碳原子、优选13至19个碳原子、甚至更多优选14至18个碳原子。
根据本发明的一个实施方式，所述烃油包含：
-具有15个碳原子的异链烷烃和具有16个碳原子的异链烷烃，其总量为烃油总重量的40重量％至80重量％、优选50重量％至70重量％；或
-具有15个碳原子的异链烷烃和具有16个碳原子的异链烷烃，其总量为烃油总重量的80重量％至95重量％；或
-具有16个碳原子的异链烷烃、具有17个碳原子的异链烷烃和具有18个碳原子的异链烷烃，其总量为烃油总重量的80重量％至98重量％；或
-具有17个碳原子的异链烷烃和具有18个碳原子的异链烷烃，其总量为烃油总重量的80重量％至98重量％。
根据本发明的一个实施方式，异链烷烃是非环状异链烷烃。
用于本发明的佐剂组合物中的烃油优选包含相对于烃油总重量小于或等于10重量％、优选小于或等于5重量％、有利地小于或等于2重量％的正链烷烃。
根据一个实施方式，相对于烃油的总重量，本发明的烃油优选包含90重量％至100重量％的异链烷烃和0至10重量％的正链烷烃，优选95重量％至100％重量的异链烷烃和0至5重量％的正链烷烃，更优选98重量％至100％重量的异链烷烃和0至2重量％的正链烷烃。在更有利的方式中，本发明的佐剂组合物的烃油不含正链烷烃。
本发明的佐剂组合物的烃油优选包含相对于烃油总重量小于或等于1重量％、优选小于或等于0.5重量％、更优选小于或等于100ppm(重量)的环烷烃化合物。
用于本发明的佐剂组合物中的烃油有利地不含芳香族化合物。例如，这意味着芳香族化合物的重量含量小于或等于500ppm、优选小于或等于300ppm、优选小于或等于100ppm、更优选小于或等于50ppm、有利地小于或等于20ppm，所述含量通过例如UV光谱法测量。
根据本发明的一个实施方式，所述烃油包含：
-异链烷烃，相对于烃油的总重量，所述异链烷烃的含量为90重量％至100重量％、优选95重量％至100重量％、优选98重量％至100重量％，所述异链烷烃包含相对于异链烷烃总重量为至少2重量％、优选至少20重量％的具有17个碳原子的异链烷烃和/或具有18个碳原子的异链烷烃，
-正链烷烃，相对于烃油的总重量，所述正链烷烃的含量小于或等于10重量％、优选小于或等于5重量％、优选小于或等于2重量％；和/或
-环烷烃化合物，相对于烃油的总重量，所述环烷烃化合物的含量小于或等于1重量％、优选小于或等于0.5重量％、优选小于或等于100ppm；和/或
-芳香族化合物，相对于烃油的总重量，所述芳香族化合物的重量含量小于或等于500ppm、优选小于或等于300ppm、优选小于或等于100ppm、更优选小于或等于50ppm、有利地小于或等于至20ppm，。
烃油中的异链烷烃、正链烷烃、环烷烃和芳香族化合物的重量含量可以根据本领域技术人员公知的方法确定。作为非限制性实例，可以提及气相色谱法。
用于本发明的佐剂组合物中的烃油还优选具有极低重量含量的硫化合物，通常小于或等于5ppm、优选小于或等于3ppm、更优选小于或等于0.5ppm，也就是说，水平过低以至于无法通过常规的低硫分析仪检测到。
根据本发明的一个实施方式，根据标准ASTM D86，烃油的沸点为230℃至340℃，优选235℃至330℃，更优选240℃至325℃。
根据本发明的一个实施方式，根据标准ASTM D86，烃油的终沸点和初沸点之差小于80℃、优选小于60℃、更优选小于40℃。
根据EN ISO 2719标准，用于本发明的佐剂组合物中的烃油还优选具有大于或等于110℃、优选大于或等于120℃、更优选大于或等于140℃的闪点。通常大于110℃的高闪点通过避免烃油的过度易燃性而可以克服储存和运输过程中的安全问题等。
烃油还优选具有小于或等于0.01kPa的20℃下的蒸气压。
根据一个实施方式，用于本发明的佐剂组合物中的烃油具有大于或等于110℃的根据标准EN ISO 2719的闪点和小于或等于0.01kPa的20℃下的蒸气压。优选地，所述烃油具有大于或等于120℃的闪点和小于或等于0.01kPa的20℃下的蒸气压。更优选地，其具有大于或等于140℃的闪点和小于或等于0.01kPa的20℃下的蒸气压。
根据本发明的一个实施方式，烃油是生物来源的并且通常具有相对于烃油总重量为至少90重量％的生物材料含量。该含量水平有利地更高，特别是大于或等于95重量％，优选大于或等于98重量％，且有利地等于100％。根据标准ASTM D 6866-12方法B(ASTM D6866-06)和ASTM D 7026(ASTM D 7026-04)确定生物材料或生物碳的含量水平。
根据标准EN ISO 3104，本发明的佐剂组合物的烃油还优选具有小于或等于5cSt、优选小于或等于4cSt、更优选小于或等于3cSt的40℃下的运动粘度。
术语“生物碳”表示碳来自天然来源并来自生物材料，如下文所述。生物碳含量和生物材料含量是表示相同值的术语。源自可再生资源或生物材料的材料是一种有机材料，其中碳来源于最近通过光合作用从大气中固定(在人类尺度上)的CO2。生物材料(100％天然来源的碳)的14C/12C同位素比值大于10-12，通常约为1.2x10-12，而化石材料的比值为零。事实上，同位素14C是在大气中形成，然后按照最多几十年的时间尺度通过光合作用整合。14C的半衰期为5730年。因此，光合作用产生的材料，即一般而言的植物，必然具有最大的同位素14C含量。
根据本发明的一个实施方式，烃油的28天生物降解性为至少60％、优选至少70％、优选至少75％、甚至更优选至少80％，这根据经济合作与发展组织标准OECD 306来测量。
根据一个特定的实施方式，所述烃油：
-根据标准ASTM D86的沸点为230℃至340℃、优选235℃至330℃、更优选240℃至325℃；和/或
-烃油根据标准ASTM D86的终沸点和初沸点之差小于80℃、优选小于60℃、更优选小于40℃，和/或
-根据OECD标准306测量的28天生物降解性为至少60％、优选至少70％、优选至少75％、甚至更优选至少80％；和/或
-根据EN ISO 2719标准的闪点大于或等于110℃。
根据本发明的一个具体实施方式，佐剂组合物的烃油的沸程(根据标准ASTM D86测量)为235℃至330℃、更优选240℃至325℃，并且异链烷烃含量相对于烃油总重量为大于或等于95％、有利地大于或等于98％，所述异链烷烃包含相对于异链烷烃总重量为至少2重量％、优选至少20重量％的具有17个碳原子的异链烷烃和/或具有18个碳原子的异链烷烃。
获得烃油的方法
本发明的烃油可以是例如源自生物质转化的烃馏分。术语“源自生物质转化”应理解为是指由源自生物来源的原料产生的烃馏分。
优选地，源自生物来源的烃馏分通过包括加氢脱氧(HDO)和异构化(ISO)步骤的方法获得。加氢脱氧(HDO)步骤导致：生物酯或甘油三酯成分的结构分解；含氧化合物、磷化合物和硫化合物的消除；以及烯键的氢化。由加氢脱氧反应产生的产物随后被异构化。分馏步骤可优选在加氢脱氧和异构化步骤之后。以有利的方式，感兴趣的馏分此后经历加氢处理和后续蒸馏步骤，以获得本发明所需的烃油的规格。
这种HDO/ISO方法是对粗生物类原料实施的，也称为生物质或生物来源的原料，选自植物油、动物脂肪、鱼油及其混合物。合适的生物来源原料是例如：菜籽油、介花油、妥尔油、葵花油、大豆油、大麻油、橄榄油、亚麻籽油、芥末油、棕榈油、花生油、蓖麻油、椰子油；动物脂肪，例如牛脂；回收的膳食脂肪；源自基因工程的原料；以及从例如藻类和细菌等微生物生产的生物原料或原材料。从粗生物材料中获得的缩合产物、酯或其他衍生物也可用作原料。
优选地，生物来源的原料是酯或甘油三酯衍生物。该材料首先经历加氢脱氧(HDO)步骤，以分解甘油三酯或酯组分的结构，消除含氧化合物、磷化合物和硫化合物，并同时对烯键氢化。使生物来源的原料加氢脱氧的该加氢脱氧(HDO)步骤之后是使由此获得的产物异构化，这导致烃链的支化并增强链烷烃在低温下的性能。
在HDO步骤中，使氢气和生物来源的原料以同时或逆流的方式通过加氢脱氧催化床。在HDO步骤中，压力和温度分别在20巴和150巴之间以及200℃和500℃之间。在该步骤中使用常规和已知的加氢脱氧催化剂。可选地，可以在温和条件下对生物来源的原料进行预氢化过程，以避免在HDO步骤之前发生双键的副反应。在加氢脱氧步骤之后，对反应产生的产物进行异构化步骤(ISO)，其中使氢气和产物以及可选的正链烷烃混合物以同时或逆流的方式通过催化床以进行异构化。在ISO步骤中，压力和温度分别在20巴和150巴之间以及200℃和500℃之间。在该步骤中使用常规和已知的异构化催化剂。
文献中描述了各种不同的HDO/ISO方法。申请WO2014/033762描述了一种方法，该方法包括逆流运行的预加氢步骤、加氢脱氧(HDO)步骤和异构化步骤。专利申请EP1728844描述了一种从植物和动物来源的化合物混合物生产烃化合物的烃化合物生产方法。
也可以实施额外的次级过程(例如中间混合、捕集或其他此类过程)。
本发明的佐剂组合物优选包含相对于所述组合物总重量为40重量％至99重量％、优选60重量％至98重量％、更优选85重量％至96重量％的烃油。
表面活性剂：
本发明的佐剂组合物构成脂肪相，为了形成疫苗，该脂肪相可以与包含抗原的水相混合。存在于佐剂组合物中的表面活性剂使得可以混合不混溶的脂肪相和水相，以获得均匀且稳定的混合物。
根据本发明的一个实施方式，相对于所述佐剂组合物的总重量，所述佐剂组合物包含2重量％至10重量％、优选4重量％至8重量％、优选约6重量％的表面活性剂。
术语“表面活性剂”应理解为是指一种或多种表面活性剂。
可用于本发明中的表面活性剂是可商购且本领域技术人员可获得的表面活性剂。这些通常是药学上可接受的表面活性剂，特别是与在人和动物中的施用相容。
根据本发明的一个实施方式，包含在佐剂组合物中的表面活性剂是非离子表面活性剂。
根据本发明的一个实施方式，包含在佐剂组合物中的表面活性剂选自脱水山梨糖醇酯、聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯、甘露聚糖酯、聚乙氧基化甘露聚糖酯；优选选自脱水山梨糖醇酯。
根据本发明的一个实施方式，包含在佐剂组合物中的表面活性剂是选自脱水山梨糖醇油酸酯、脱水山梨糖醇硬脂酸酯、脱水山梨糖醇棕榈酸酯和脱水山梨糖醇月桂酸酯的脱水山梨糖醇脂肪酸酯。优选地，表面活性剂是脱水山梨糖醇单油酸酯。可用于本发明的佐剂组合物中的表面活性剂的非限制性实例是Croda销售的
80。
根据本发明的另一个实施方式，包含在佐剂组合物中的表面活性剂选自卵磷脂、聚乙氧基化链烷醇、聚乙二醇酯、聚二醇聚羟基硬脂酸酯或聚甘油聚羟基硬脂酸酯。
本发明的佐剂组合物
本发明的佐剂组合物包含至少一种如上定义的烃油和至少一种表面活性剂。
根据本发明的一个实施方式，佐剂组合物由一种或多种如上定义的烃油和一种或多种表面活性剂组成。
根据本发明的一个实施方式，佐剂组合物包含至少一种不同于本发明中定义的烃油的其他油。优选地，根据该实施方式，相对于佐剂组合物的总重量，佐剂组合物包含1重量％至40重量％、优选5重量％至30重量％或甚至10重量％至20重量％的另一种油。
在所述其他油中，可以提及矿物油、植物油或动物油。特别地，其他油可以是源自化石或可再生资源的烃油，或者氢化或非氢化的植物油。
根据一个实施方式，本发明的佐剂组合物包含选自正链烷烃，通常选自包含12至40个碳原子、优选14至30个碳原子或甚至16到24个碳原子的正链烷烃的其他油。所述正链烷烃可以选自生物来源的正链烷烃。这些正链烷烃可以是市售的。
根据本发明的一个实施方式，用于疫苗的佐剂组合物相对于佐剂组合物的总重量由以下组成：
-至少40％重量的一种或多种烃油，其包含相对于烃油总重量为90％至100％的异链烷烃，所述异链烷烃包含相对于异链烷烃总重量为至少20重量％的具有17个碳原子或18个碳原子的异链烷烃；
-1重量％至15重量％的一种或多种表面活性剂；和
-1重量％至40重量％的一种或多种其他油。
根据本发明的一个实施方式，用于疫苗的佐剂组合物相对于佐剂组合物的总重量包含以下或优选由以下组成：
-至少40％重量的一种或多种烃油，其包含相对于烃油总重量为90％至100％的异链烷烃，所述异链烷烃包含相对于异链烷烃总重量为至少20重量％的具有17个碳原子或18个碳原子的异链烷烃；
-1重量％至15重量％的一种或多种表面活性剂；和
-1重量％至40重量％的选自正链烷烃的一种或多种其他油。
根据一个实施方式，本发明的用于疫苗的佐剂组合物中所含的本发明中定义的烃油/正链烷烃的质量比为60/40至99/1、优选70/30至98/2或者甚至80/20至95/5。
根据本发明的另一个实施方式，佐剂组合物不包含除本发明中定义的烃油之外的任何油。
根据本发明的一个实施方式，用于疫苗的佐剂组合物相对于佐剂组合物的总重量由以下组成：
-至少40％重量的一种或多种烃油，其包含相对于烃油总重量为90％至100％的异链烷烃，所述异链烷烃包含相对于异链烷烃总重量为至少2重量％、优选至少20重量％的具有17个碳原子或18个碳原子的异链烷烃；和
-1重量％至15重量％的脱水山梨糖醇酯，优选脱水山梨糖醇单油酸酯。
佐剂组合物还可以包含其他试剂，例如金属盐，优选铝盐，其量优选为佐剂组合物总重量的0.1重量％至5重量％。这些金属盐可以增加佐剂组合物的粘度并增强乳液的稳定性。
根据本发明的一个实施方式，用于疫苗的佐剂组合物相对于佐剂组合物的总重量包含以下或甚至由以下组成：
-至少40％重量的一种或多种烃油，其包含相对于烃油总重量为90％至100％的异链烷烃，所述异链烷烃包含具有17个碳原子或18个碳原子的异链烷烃；
-1重量％至15重量％的一种或多种表面活性剂；和
-可选的0.1重量％至5重量％的金属盐，优选铝盐；
-可选的1重量％至40重量％的一种或多种其他油。
根据本发明的一个实施方式，用于疫苗的佐剂组合物相对于佐剂组合物的总重量包含以下或甚至由以下组成：
-至少40％重量的一种或多种烃油，其包含相对于烃油总重量为90％至100％的异链烷烃，所述异链烷烃包含具有17个碳原子或18个碳原子的异链烷烃；
-1重量％至15重量％的一种或多种表面活性剂；和
-可选的0.1重量％至5重量％的金属盐，优选铝盐；
-可选的1重量％至40重量％的一种或多种其他油，其选自例如正链烷烃。
根据另一个实施方式，佐剂组合物进一步包含防腐剂，例如对羟基苯甲酸酯，优选对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。
根据另一个实施方式，用于疫苗的佐剂组合物不包含金属盐。
根据本发明的一个实施方式，佐剂组合物不包含聚合物。
由本发明的佐剂组合物制备的疫苗
本发明的佐剂组合物可用于制备疫苗。
根据一个实施方式，疫苗为乳液形式，其中本发明的佐剂组合物构成脂肪相。
根据一个特定实施方式，本发明的疫苗不包含除本发明的佐剂组合物之外的脂肪相。
根据一个实施方式，疫苗为乳液形式，其中水相包含水、抗原和表面活性剂。
包含在水相中的表面活性剂可以与包含在构成脂肪相的佐剂组合物中的表面活性剂相同或不同。根据本发明的一个实施方式，包含在水相中的表面活性剂选自非离子表面活性剂，优选选自脱水山梨糖醇酯、聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯、甘露聚糖酯、聚乙氧基化甘露聚糖酯；优选选自脱水山梨糖醇酯。
根据本发明的一个实施方式，包含在水相中的表面活性剂是选自脱水山梨糖醇油酸酯、脱水山梨糖醇硬脂酸酯、脱水山梨糖醇棕榈酸酯和脱水山梨糖醇月桂酸酯的脱水山梨糖醇脂肪酸酯。优选地，表面活性剂是聚乙氧基化脱水山梨糖醇酯。可用于本发明的疫苗的水相中的表面活性剂的非限制性实例是Croda销售的
80。
根据本发明的另一个实施方式，包含在水相中的表面活性剂选自卵磷脂、聚乙氧基化链烷醇、聚乙二醇酯、聚二醇聚羟基硬脂酸酯或聚甘油聚羟基硬脂酸酯。
根据一个实施方式，疫苗是油包水乳液的形式。
根据一个实施方式，疫苗为乳液形式，其中水相和脂肪相之间的质量比为50/50至10/90、优选40/60至20/80、更优选30/70。
通常，本发明的疫苗的25℃下的动态粘度为10至150mPa.s、优选15至120mPa.s、优选20至100mPa.s，其根据标准ASTM D445测量。
根据一个实施方式，通过使本发明的佐剂组合物与包含抗原的水溶液接触来制备疫苗。术语“抗原”应理解为指被个体的免疫系统识别为外来物并通过产生抗体来引发响应的任何物质。抗原通常是多糖、多糖衍生物、蛋白或蛋白衍生物。
根据一个实施方式，疫苗中存在的抗原选自抗口蹄疫病毒、抗巴斯德菌属细菌、纽卡斯尔抗原、禽流感抗原。
根据一个特定实施方式，通过使本发明的佐剂组合物与包含抗原和表面活性剂的水相接触来制备疫苗。
发明人已经发现，本发明的烃油可以增强抗原的抗感染作用。
因此，本发明涉及本发明中定义的烃油在佐剂组合物中增强用于疫苗的所述佐剂组合物的抗感染效果的应用。在应用的上下文中，所述佐剂组合物将优选表现出上文针对本发明的佐剂组合物定义的一种或多种特征。
本发明还涉及本发明的烃油在疫苗佐剂组合物中降低疫苗的细胞毒性的应用。
本发明还涉及本发明中定义的烃油在疫苗佐剂组合物中增强疫苗的稳定性、特别是乳液形式的疫苗的稳定性的应用。
实施例
在本说明书的剩余部分中，通过说明本发明的方式提供实施例，且实施例不旨在限制本发明的范围。
实施例1：免疫学效应的评估
下表1汇总了可用于本发明的佐剂组合物中的两种烃油的物理化学性质。
以下标准和方法用于测量上文所述的特性：
-闪点：EN ISO 2719
-15℃下的密度：EN ISO 1185
-40℃下的粘度：EN ISO 3104
-苯胺点：EN ISO 2977
-沸点：ASTM D86
-生物降解性：方法OECD 306
-20℃下的折射率：ASTM D 1218
-蒸气压：根据本领域技术人员熟知的方法计算。
实施例2：评价实施例1的油的免疫学效果
在体外测试实施例1中描述的油A和B以确定其对人免疫细胞的免疫学效果。
将本发明的油的免疫学效果与参照佐剂进行比较，特别是烃油MarcolTM 52和Creasil IH CG，后者是异链烷烃油。还将所述油的效果与氢氧化铝进行了比较，氢氧化铝是许多商业疫苗中使用的参照佐剂。
对人类免疫细胞进行了各种测试。第一项测试对从健康供体的外周血分离出的单个核细胞(外周血单个核细胞或PBMC)进行。然后通过分离PBMC的淋巴细胞和单核细胞群并在体外使单核细胞在细胞因子(GM-CSF和M-CSF或白细胞介素(IL)-4)的作用下分化为巨噬细胞或树突细胞来获得巨噬细胞和树突细胞，并对其进行其余测试。这些细胞模型在科学文献中已充分描述，特别是用于表征候选疫苗及其组分(例如其佐剂)的免疫学效应。
使PBMC、巨噬细胞和树突细胞与本发明的油以及参照佐剂接触24小时。通过测定细胞活化、细胞活力、细胞因子谱和其他生物标志物的膜表达来测量细胞增殖、死亡和分化的能力。
培养微孔板的制备：在与油温育前24小时，将细胞接种在96孔微孔板(Corning)中。然后将微孔板置于37℃的培养箱中。
细胞与油的温育：温育持续时间为15分钟。在这些温育时间之后，清空微孔板并冲洗细胞。
细胞活化和细胞活力的测量：用油处理后3天，在显微镜下观察细胞以评估细胞活化，然后用甲基四氮唑鎓盐(MTT)进行比色测试以评估细胞活力。
细胞因子测定：在用油处理后5天，进行多重酶免疫测定并通过流式细胞术进行免疫表型分型分析，以确定细胞的细胞因子谱和细胞膜表达。
测量了2或3个供体的效果，以一式三份培养物进行。测试结果示于下表2-10中。
与各种不同的稀释度(稀释度以体积百分比表示)下的细胞活力和活化相关的观察结果显示在图1至图3中。对于油A和B观察到显著的细胞活化，且油A比油B增加得多。
在这些实验条件下，MarcolTM 52和
IH CG表现出相同的特征，因为它们降低了来自不同细胞供体的PBMC、巨噬细胞和树突细胞的活力。MarcolTM 52和
IH CG在低稀释度(稀释度以体积百分比表示)，即高浓度下表现出细胞毒性。另一方面，油A和B与氢氧化铝一样不会导致细胞活力降低。与MarcolTM 52和
IH CG不同，油A和B在测试浓度下没有显示出细胞毒性。
在借助于破伤风毒素(TT)或结核菌素(PPD)进行抗原刺激后或在不进行抗原刺激的情况下，观察了PBMC的细胞因子谱。
下表2示出了5天后在未平行暴露于抗原的PBMC培养物的上清液中细胞因子测定的汇编结果。结果以pg/mL表示。
表2
PBMC的细胞因子谱
在没有对PBMC进行抗原刺激的情况下，在各种测试佐剂存在下观察了细胞因子产生水平的调节。在这些实验条件下，油A与其他佐剂的区别在于更明显的IL-5水平降低、TNF-α水平降低、并且IFN-γ没有增加。
在混合淋巴细胞反应(MLR)期间评估了巨噬细胞和树突细胞的细胞因子谱。
巨噬细胞
下表3比较了在响应于与巨噬细胞的相互作用时在抗原(纯化的蛋白衍生PPD)的存在或不存在下佐剂对淋巴细胞增殖的影响。结果表示为相对于未处理细胞(对照)的百分比。
表3
有和没有在先抗原(PPD)呈递时的巨噬细胞的细胞因子谱
下表4详述了在与自体淋巴细胞共培养且没有在先抗原(PPD)呈递的巨噬细胞的培养物上清液中佐剂对细胞因子水平的影响。
表4
下表5详述了在与自体淋巴细胞共培养且在抗原(PPD)呈递后的巨噬细胞的培养物上清液中佐剂对细胞因子水平的影响。
表5
细胞因子的分析结果表明，油A的存在会诱导IL-2、IL-10、IL-12和TNF-α的产生增加。这些结果表明细胞Th1响应，其与Th2谱相比更有优势。IL-12的存在指导初始T淋巴细胞分化为具有Th1谱的淋巴细胞。然而，检测到例如IL-4和L-13等细胞因子表明混合的Th1和Th2谱或这两种谱之间的调控。油A和油B导致的高GM-CSF产量也是加速微生物响应的一个因素。事实上，GM-CSF在中枢和外周水平上增加单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞的数量或功能，从而增强抗感染响应。
树突细胞
下表6比较了在响应于与树突细胞的相互作用时在抗原(纯化的蛋白衍生PPD)的存在或不存在下佐剂对淋巴细胞增殖的影响。结果表示为相对于未处理细胞(对照)的百分比。
表6
表7详述了在与自体淋巴细胞共培养且没有在先抗原(PPD)呈递的树突细胞的培养物上清液中佐剂对细胞因子水平的影响。
表7
表8详述了在与自体淋巴细胞共培养且在抗原(PPD)呈递后的树突细胞的培养物上清液中佐剂对细胞因子水平的影响。
表8
培养物上清液中的细胞因子分析表明，油A和B，尤其是油A，会将响应引导至具有增加水平的TNF-α、IFN-γ和IL-2的Th1谱。对于巨噬细胞，观察到GM-CSF水平的增加。油A和B与在细胞因子水平上与所测试的其他佐剂不同。事实上，其他三种佐剂对所测试的细胞因子没有或几乎没有产生调节作用。
油A和B促进与呈递抗原的细胞接触的淋巴细胞的增殖/活化，无论它们是巨噬细胞还是树突细胞，无论是否存在抗原(例如PPD)。
膜表达
巨噬细胞
表9
佐剂对巨噬细胞分化的影响(处理后3天的免疫表型分型和分析)。
油A和B对巨噬细胞膜表达的影响与
IH CG的接近，其中蛋白CD163和CD32(分化簇)(免疫球蛋白的Fc(可结晶片段)受体之一)显著减少。这种双重调节作用似乎表明巨噬细胞偏向于M1型促炎特征，这有利于宿主对抗微生物感染的有益炎症反应。这种偏向性与细胞因子产生水平一致，例如被描述为激活M1偏向型巨噬细胞的TNF-α的产生水平，以及由相同的M1巨噬细胞分泌的IL-12的产生水平。同时需要注意的是，氢氧化铝的效果(CD14表达减少，CD86表达增加)与实验室之前描述的相同(Rimaniol&al.,In vitrointeractions between macrophages and aluminum-containing adjuvants.Vaccine,2007,25,6784–6792)。这些结果可以确定使用油A和B观察到的调节作用。
树突细胞
表10
佐剂对树突细胞分化的影响(处理后3天的免疫表型分型和分析)。
关于树突细胞的膜标志物，油A和B具有特定谱。一方面，它们不调节树突细胞特异性的CD1a表达。另一方面，油A和B，尤其是油A，会增加CD83(一种树突细胞成熟标志物)的表达。
总之，油A和B表现出特定谱，偏向于淋巴细胞的Th1型反应和巨噬细胞的M1型反应。它们还导致树突细胞的成熟。这些特征，例如GM-CSF的巨噬细胞合成增加，被认为促进了抗感染反应，这是佐剂的预期作用。
实施例3：制备包含本发明的佐剂组合物的乳液-评价乳液稳定性
包含本发明的佐剂组合物的乳液的实例在下表11中给出。百分比是相对于佐剂组合物总重量的重量百分比。
表11
制备乳液的操作程序如下：
将来自脂肪相的油和表面活性剂按表11中所示的比例引入试管中。搅拌试管并加热至80℃直到获得均相。
将水相的水和表面活性剂按表11中所示的比例引入第二试管中。搅拌该试管并加热至80℃直到获得均相。
在80℃下，在剧烈搅拌下将水相缓慢倒入脂肪相中。随后，利用
型混合器以9500转/分钟将乳液混合30秒。
在适度搅拌下使混合物冷却至25℃。
当产生乳液时，观察到单一均相。然后，用离心机Fisher Bioblock ScientificSigma1-6以3500转/分钟在时间T0和随后在24小时后将乳液离心20分钟。
在T0时离心后、在24小时后离心后(T24h)和在90天后(T2160h)目视观察表11中描述的组合物的稳定性。
试管含有6.6cm的乳液，其包含4.2cm的脂肪相。对失相(dephasing)进行手动测量，即测量乳液上方释放的脂肪相。
[表12]
| T0 | T24h | T2160h | |
| 组合物1 | 0.1cm | 0.3cm | 4.2cm |
| 组合物2 | 0.1cm | 0.4cm | 4.2cm |
测量脂肪相的释放
在T0时，对于包含油MarcolTM 52的乳液观察到与包含油A的乳液相同的释放。
24小时后，包含油MarcolTM 52的乳液比包含油A的乳液释放更多。据观察，对于包含油A的组合物，相对于包含在乳液中的总脂肪相的量，脂肪相的释放为7.1％(＝0.3/4.2)；而包含油MarcolTM 52的组合物为9.5％(＝0.4/4.2)。
实施例4：包含本发明佐剂组合物的疫苗的制备
包含本发明的佐剂组合物的疫苗的实例提供在下表13中。
表13
根据以下方案制备疫苗：
-脂肪相的制备：
利用设定为10,000转/分钟的
型混合器，在25℃下将132克烃油与8克
80混合3分钟。
-水相的制备：
利用设定为10,000转/分钟的
型混合器，在25℃下将2.5g
80与57.5g抗原溶液混合3分钟。
-乳液的制备：
将脂肪相引入
型混合器，以10,000转/分钟搅拌30秒，然后用时3分钟缓慢加入水相，同时保持10,000-12,000转/分钟的搅拌。
由此获得油包水乳液形式的200g疫苗。
Claims (14)
1.一种用于疫苗的佐剂组合物，相对于所述佐剂组合物的总重量，其包含：
-至少40重量％的烃油，其包含含量相对于所述烃油的总重量为90重量％至100重量％的异链烷烃，所述异链烷烃包含具有17个碳原子或18个碳原子的异链烷烃；和
-1重量％至15重量％的一种或多种表面活性剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，相对于异链烷烃的总重量，所述异链烷烃包含至少2重量％的具有17个碳原子的异链烷烃和/或具有18个碳原子的异链烷烃。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述烃油包含：
-具有15个碳原子的异链烷烃和具有16个碳原子的异链烷烃，其总量为所述烃油总重量的80重量％至95重量％；或
-具有15个碳原子的异链烷烃和具有16个碳原子的异链烷烃，其总量为所述烃油总重量的40重量％至80重量％；或
-具有16个碳原子的异链烷烃、具有17个碳原子的异链烷烃和具有18个碳原子的异链烷烃，其总量为所述烃油总重量的80重量％至98重量％；或
-具有17个碳原子的异链烷烃和具有18个碳原子的异链烷烃，其总量为所述烃油总重量的80重量％至98重量％。
4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂选自非离子表面活性剂，优选脱水山梨糖醇酯。
5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂是脱水山梨糖醇脂肪酸酯，优选脱水山梨糖醇单油酸酯。
6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，相对于所述组合物的总重量，所述组合物包含：
-60重量％至98重量％的烃油，其包含含量相对于所述烃油总重量为95重量％至100重量％的异链烷烃，所述异链烷烃包含具有17个碳原子和/或18个碳原子的异链烷烃；和
-2重量％至10重量％的一种或多种表面活性剂。
7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其还包含除权利要求1至6中任一项中定义的所述烃油之外的其他油，所述其他油优选选自正链烷烃，所述正链烷烃优选包含14至30个碳原子。
8.如权利要求7所述的组合物，其中，烃油/正链烷烃的质量比为60/40至99/1、优选70/30至98/2或者甚至更优选80/20至95/5。
9.一种疫苗，其包含权利要求1至8中任一项所述的佐剂组合物和至少一种抗原。
10.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于，其是油包水乳液的形式。
11.如权利要求10所述的疫苗，其特征在于，所述油包水乳液的水相与脂肪相的质量比为50/50至10/90，优选40/60至20/80，更优选为30/70。
12.权利要求1至8中任一项所述的佐剂组合物用于降低包含所述佐剂组合物的疫苗的细胞毒性的应用。
13.权利要求1至8中任一项中定义的所述烃油在用于疫苗的佐剂组合物中降低包含所述佐剂组合物的疫苗的细胞毒性的应用。
14.权利要求1至8中任一项中定义的所述烃油在用于疫苗的佐剂组合物中增强疫苗的稳定性、特别是增强乳液形式的疫苗的稳定性的应用。
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