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WO2019168346A1 - 항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Publication number
WO2019168346A1
WO2019168346A1 PCT/KR2019/002376 KR2019002376W WO2019168346A1 WO 2019168346 A1 WO2019168346 A1 WO 2019168346A1 KR 2019002376 W KR2019002376 W KR 2019002376W WO 2019168346 A1 WO2019168346 A1 WO 2019168346A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
virus
anticancer
hydroxyurea
administered
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/002376
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
황태호
조몽
Original Assignee
주식회사 바이오녹스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to ES19761185T priority patent/ES2976989T3/es
Priority to CA3092441A priority patent/CA3092441A1/en
Priority to EP24155126.6A priority patent/EP4342985A3/en
Priority to EP19761185.8A priority patent/EP3760213B1/en
Priority to CN201980016179.0A priority patent/CN111818932A/zh
Priority to JP2020544934A priority patent/JP7167395B2/ja
Priority to AU2019226906A priority patent/AU2019226906B2/en
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • composition for cancer prevention or treatment comprising anticancer virus and hydroxyurea as active ingredients
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising an anticancer virus and hydroxyurea as an active ingredient.
  • the anticancer virus (Oncolyt i c vi rus) is excellent in tumor specific targeting ability, proliferation ability in cancer cells and cancer cell death ability, and various clinical studies based on anticancer virus have recently been conducted. In 2015, the era of anticancer viruses began in the United States and Europe with the herpes simplex virus-based anti-cancer virus tal imogene laherparepvec (T_Vec) successfully commercialized as a treatment for advanced colorioma.
  • T_Vec herpes simplex virus-based anti-cancer virus tal imogene laherparepvec
  • anticancer viruses In recent years, the usefulness of anticancer viruses has been shown to be able to activate tumor immunity as well as to be combined with other immunotherapeutic agents. Until 2000, early in the development of anti-cancer viruses, the direct killing effect of cancer-specific proliferation of viruses was more important. However, subsequent clinical studies found that activation of tumor immunity is a key mechanism rather than direct cancer cell death effects. Recently, anticancer virus was used in combination with immunotherapeutics such as immune checkpoint inhibi tor. Treatments are being developed. This is because the anticancer virus converts the tumor microenvironment in which immunity is suppressed to the tumor microenvironment suitable for immunotherapy.
  • immunotherapeutics such as immune checkpoint inhibi tor. Treatments are being developed. This is because the anticancer virus converts the tumor microenvironment in which immunity is suppressed to the tumor microenvironment suitable for immunotherapy.
  • the present inventors have studied to enhance the anticancer effect of the anticancer virus, and when the anticancer virus and hydroxyurea are used in combination with a cancer-infected individual, the anticancer effect is superior to that of the conventional anticancer virus alone. By completing the present invention. Challenge solution
  • an aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising an anticancer virus and hydroxyurea as an active ingredient.
  • Another aspect of the invention provides a method for treating cancer comprising administering an anticancer virus and hydroxyurea to a subject having cancer.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the anticancer virus and the hydroxyurea of the present invention as an active ingredient has better anticancer effect and safety than the conventional anticancer virus only, and the cancer cells resistant to the anticancer virus grow. It can inhibit cancer cells and kill cancer cells that can proliferate. Therefore, the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer of the present invention can be usefully used to treat cancer.
  • 1 is a cancer cell line after treatment with anticancer virus (01412) to 13 cancer cell lines 2019/168346 1 »(: 1 ⁇ 1 ⁇ 2019/002376) A diagram showing the cell survival rate.
  • Figure 3 shows anticancer virus ( ⁇ ⁇ ) in mouse-kidney cancer cell-forest mouse 0 1 «: 3 I). This is a diagram measuring the weight of the mouse.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating an experimental schedule for confirming the anticancer treatment effect by the combined administration of anticancer virus ( ⁇ ⁇ _ ) and in mouse-renal cancer cell-embedded mice (13 ⁇ 4 wave II).
  • Figure 5 shows anticancer virus in mouse-kidney cancer cell-forest mouse 03 ⁇ 4 US II) And ⁇ , after administration of the tumor size of the mouse is measured.
  • Figure 6 shows anti-cancer virus ( ⁇ After administration, the tumor size is measured.
  • Fig. 7 is a diagram illustrating the tumor size of mice after administration of anticancer virus (photo3-412) and e to mouse-breast cancer cell-embedded mice (4 mice).
  • FIG. 8 is a diagram showing the number of sintered nodes appearing on the tumor surface of mice sacrificed 18 days after administration of anticancer virus (0 -412) and mice to breast cancer cell-embedded mice (411).
  • FIG. 9 is a diagram measuring the weight change for 21 days after administration of anticancer virus (01412) and an example to the mouse-breast cancer cell-forest mouse (411).
  • Fig. 10 is a diagram measuring the size of tumors after administration of anticancer virus ( ⁇ 3_412) and a high dose of mouse-breast cancer cell-planted mice (411).
  • Fig. 11 is a diagram of survival rate after administration of anticancer virus (01412) and a high dose of mouse-breast cancer cell-plantation mouse (411).
  • Figure 12 is a diagram measuring the size of the tumor for 15 days after the administration of anti-cancer virus (01412) and ⁇ to human lung cancer cells (1 460) -embedded mice.
  • FIG. 13 shows the size of tumors for 28 days after administration of anti-cancer virus (01412) and mice to human-colon cancer cells (: # 1'-116) -embedded mice.
  • FIG. 14 is a comparison of tumor photographs of mice in each group on day 17 after administration of anti-cancer virus (0 -412) and -3 ⁇ 4 to human colon cancer cells (: # 1'-116) -grafted mice.
  • FIG. 15 is a comparison of tumor photographs of mice in each group on day 28 after administration of anti-cancer virus (0TS-412) and human- colorectal cancer cells (HCT-116) -established mice.
  • FIG. 16 shows H & E staining of tumors of mice after administration of anti-cancer virus (0TS-412) and mice to human-colon cancer cells (HT-29) -embedded mice.
  • Fig. 17 shows TUNEL staining of tumor tissues after administration of anti-cancer virus (0TS-412) and human colon cancer cell (HT-29) -embedded mice.
  • Figure 18 is a diagram measuring the size of tumors after administration of herpes simplex virus (HSV1) and shock to mouse-renal cancer cell-embedded mice.
  • HSV1 herpes simplex virus
  • FIG. 19 is a diagram measuring the size of tumors after administration of adenovirus and HU to mouse-renal cancer cell-embedded mice. Best Mode for Carrying Out the Invention
  • One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising an anticancer virus and hydroxyurea as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may be administered concurrently, sequentially, or in reverse order to the anticancer virus and hydroxyurea. Specifically, the pharmaceutical composition may be administered at the same time anti-cancer virus and hydroxyurea. In addition, the pharmaceutical composition may be administered hydroxyurea first, followed by anticancer virus. Furthermore, the pharmaceutical composition may be administered hydroxyurea after the first anticancer virus. In addition, the pharmaceutical composition may be administered hydroxyurea first, followed by administration of anti-cancer virus and hydroxyurea again.
  • anticancer virus used in the present invention refers to a recombinant virus that destroys cancer cells by manipulating the genes of the virus so as to specifically propagate only in cancer cells.
  • the anticancer virus is adenovirus (Adenovirus), Herpes simplex virus (Herpes simplex virus), measles virus (Measles virus), lentivirus (Lent ivirus), retrovirus (Cytomegalovirus), baculo Baculovirus, Adeno-associated virus, Myxoma virus, Vesicular stomatitis virus, Poliovirus (Pol iovi rus), Newcastle disease virus (Newcast le di sease vi rus), Parvovirus (Parvovi rus), Cossackie virus (Coxsacki e vi rus), Seneca virus, Vaccini a virus ) Or Orthopoxvirus (Orthopoxvi rus).
  • the anti-cancer virus may be derived from vaccinia virus (vaccinia virus (vac
  • the vaccinia virus is Western Reserve (WR)
  • New York Vaccini a Virus NYVAC
  • Wyeth The New York City Board of Heal th; NYCBOH
  • LC16m8 Lister
  • Copenhagen Tian Tan
  • USSR TashKent It may be, but is not limited to, Evans, IHD-J (Internat ional Heal th Division-J) or IHD_W (Inteniat ional Heal th Divi-sion-Whi te) vaccinia virus strain.
  • the anticancer virus may be a deletion of a thymidine kinase (TK) gene.
  • the anticancer virus may be one in which a thymidine kinase gene is deleted and a mutated herpes simplex thymidine kinase gene is inserted.
  • the anticancer virus may be a recombinant vaccinia virus that lacks the thymidine kinase gene.
  • the anticancer virus may be a recombinant vaccinia virus in which the thymidine kinase gene of vaccinia virus is deleted and the thymidine kinase (HSV1-TK) gene of herpes simpletex virus 1 is inserted.
  • the anticancer virus may be a recombinant vaccinia virus (W tk _) in which granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and VII-galactosidase gene are not inserted and the thymidine kinase gene is deleted. .
  • the anticancer virus may be a recombinant vaccinia virus in which a thymidine kinase (TK) gene is deleted and a human GM-CSF or human G-CSF gene is inserted.
  • TK thymidine kinase
  • gene deletion means that a gene is partially deleted, a total deletion, or a foreign gene is inserted into the gene so that the gene is not expressed.
  • thymidine kinase used in the present invention is called thymidine kinase and means an enzyme involved in the biosynthesis of nucleotides. Is an enzyme used for both biosynthesis of nucleotides in cells and viruses. In this case, normal cells do not divide anymore and do not exist, and even if cells divide rapidly, such as hair follicles, the amount of TK is not enough for the virus to use. This can be used to selectively kill only cancer cells by deleting the TK gene in the virus, allowing the virus to proliferate only in the presence of cancer cells.
  • GM-CSF used in the present invention is a granulocyte-macrophage colony-st imulating factor, which is a macrophage,
  • GM-CSF stimulates stem cells to produce granulocytes (neutrophils, basophils, eosinophils) and monocytes. GM-CSF also induces an immune response by rapidly increasing the number of macrophages.
  • the GM-CSF may be derived from human, GenBank :
  • G-CSF used in the present invention is a granulocyte colony-st imulating factor, which is stimulated by inflammation or endotoxin to produce macrophages, fibroblasts, endothelial cells, and the like. Means cytokine.
  • the G-CSF promotes the production of neutrophils.
  • the G-CSF may be of human origin (rhGCSF), GenBank: MA03056. It may be a protein having a sequence of 1.
  • hydroxyurea used in the present invention is a compound having the following formula.
  • the exact mechanism of the hydroxyurea is not known, but the synthesis It is known as an anticancer agent that inhibits.
  • the hydroxyurea may also be included in the pharmaceutical composition in the form of a commercialized medicament comprising the hydroxyurea.
  • the commercialized medicament comprising the hydroxyurea component may be, but is not limited to, Hydroxyurea®, Hydrea®, Droxi a TM, Mylocel TM, Siklos® hydrin capsules.
  • the dosage of the anticancer virus depends on the condition and weight of the individual, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the patient may be administered anti-cancer viruses of viral particles (vi rus part i cle), infectious viral units (TCID50) or plaque forming units (pfu) of lxlO 5 to lxlO 18 .
  • the anticancer virus may be administered at a dose of lxlO 5 to lxlO 10 pfu. More preferably, the anticancer virus may be administered at a dose of at least lxlO 5 and less than lxlO 9 pfu. In one embodiment of the present invention, the anticancer virus was administered with lxlO 5 or lxlO 7 pfu.
  • the hydroxyurea may be administered at a dose of 0.1 rag / kg / day to 90 rag / kg / day.
  • the dose of hydroxyurea is 0.1 rag / kg / day to 90 rag / kg / day, 1 mg / kg / day to 80 mg / kg / day, 5 mg / kg / day to 70 mg / kg / day, 10 rag / kg / day to 60 mg / kg / day or 20 mg / kg / day to 50 rag / kg ⁇ lay.
  • the hydroxyurea was administered at 20 rag / kg / day, 30 mg / kg / day, 60 mg / kg / day or 90 mg / kg / day.
  • the cancer may be solid cancer or hematologic cancer.
  • the solid cancer is lung cancer, colon cancer, prostate cancer, thyroid cancer, breast cancer, brain cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, skin cancer, thymic cancer, stomach cancer, colon cancer, liver cancer, ovarian cancer, uterine cancer, bladder cancer, rectal cancer, gallbladder cancer, biliary cancer and Pancreatic cancer may be any one selected from the group consisting of.
  • the hematologic cancer may be any one selected from the group consisting of lymphoma, acute leukemia and multiple myeloma. 0 2019/168346 1> (1 '/ 10-2019 / 002376
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a physiologically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may further comprise suitable excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions. It can also be used in the form of injections according to conventional methods.
  • the pharmaceutical composition may be a sterile aqueous solution, a non-aqueous solvent, a suspension, an emulsion, a lyophilized formulation, suppository, etc. as a preparation for parenteral administration.
  • a non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the route of administration, dosage and frequency of administration of the pharmaceutical composition may be administered to the subject in various ways and amounts depending on the condition of the patient and the presence or absence of side effects, and the optimal dosage method, dosage and frequency of administration are appropriate for those skilled in the art. You can choose from a range.
  • the pharmaceutical composition may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances whose therapeutic effects are known for the disease to be treated, or may be formulated in combination with other drugs.
  • the pharmaceutical compositions can be administered parenterally, including intratumoral, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, intra-nodal and intravenous can be administered by any suitable method. Preferably, it may be intratumoral administration, intraperitoneal administration or intravenous administration. On the other hand, the dosage of the pharmaceutical composition may be determined according to the dosing schedule, dosage and health of the patient.
  • kits for preventing or treating cancer comprising a first composition comprising an anticancer virus as an active ingredient and a second composition comprising hydroxyurea as an active ingredient.
  • the anticancer virus is as described above in the pharmaceutical composition.
  • the second composition comprising the hydroxyurea as an active ingredient may be a commercialized drug.
  • Commercialized drugs containing the hydroxyurea as an active ingredient may be Hydroxyurea ® , Hydrea ® , Droxiaä, Mylocelä, Siklos ® hydrin capsules.
  • the dose of anticancer virus may vary depending on the condition and weight of the subject, the extent of the disease, 0 2019/168346 1 »(: 1 ⁇ 1 ⁇ 2019/002376 Depends on drug form, route of administration and duration and may be appropriately selected by those skilled in the art. Patients with 1 to 5 1 to 10 (10 18 viral particles ( An anticancer virus of a viral unit (1 ⁇ 1050) or a plaque forming unit ⁇ ! Having infectivity may be administered.
  • the anticancer virus may be administered in urine 10 5 to ⁇ 10 10 or a dose. More preferably, the anticancer virus is 1 acid 0 5 to It may be administered at a lower dose. In one embodiment of the present invention, the first composition was administered in urine 10 5 or urine ratio.
  • the dosage of the second composition is 0.1. To 90 1 / 13 ⁇ 4 / (137 doses). Specifically, the dosage of the second composition is 0.1 13 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 4 / (to 90! 1 ⁇ / 1 3 ⁇ 4 ⁇ , 1 / uri ⁇ a / sun) To 80 13 ⁇ 4 / urinary ⁇ , 5 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇
  • the second composition can be administered by / yong / sun.
  • the second composition can be administered by / yong / sun.
  • the cancer may be solid cancer or hematologic cancer.
  • the solid cancer is lung cancer, colon cancer, prostate cancer, thyroid cancer, breast cancer, brain cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, skin cancer, thymic cancer, stomach cancer, colon cancer, liver cancer, ovarian cancer, uterine cancer, bladder cancer, rectal cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer and Pancreatic cancer may be any one selected from the group consisting of.
  • the hematological cancer may be any one selected from the group consisting of lymphoma, acute leukemia and multiple myeloma.
  • the first composition and the second composition may further comprise a physiologically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may further comprise suitable excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions. It can also be used in the form of injections according to conventional methods.
  • the first and second compositions are sterile as preparations for parenteral administration.
  • 2019/168346 1 »(: 1 ⁇ 1 ⁇ 2019/002376 may include aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories, and the like.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol (1) 1,71611 ⁇ 2 seed 10) 1), polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate and the like can be used.
  • ⁇ wi tepsol, macrogol, tween 0: ⁇ ⁇ 611 611, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the route of administration, dosage and frequency of administration of the first and second compositions may be administered to the subject in a variety of ways and amounts depending on the condition of the patient and the presence or absence of side effects, and the optimal method of administration, dosage and frequency of administration A person skilled in the art can select a suitable range.
  • the pharmaceutical composition may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances whose therapeutic effect is known for the disease to be treated, or may be formulated in combination with other drugs.
  • the first composition and the second composition can be administered parenterally, intratumorally (11: 1: 1: 11010), intraperitoneal (1 3? 61 1: 2,1631), subcutaneously (31 _ (1 81160113) ), Intradermal (large-sun beauty), lymph node (1; large-110 (131) and intravenous (1; large 16110113) and the like.
  • it may be intratumoral administration, intraperitoneal administration or intravenous administration.
  • the dosage of the first composition and the second composition may be determined according to the administration schedule, dosage and health of the patient.
  • the first composition may be administered twice, and may be administered to the subject at 7 to 30 day intervals. Specifically, the first composition may be administered every 7 days, 14 days, 21 days or 30 days.
  • the second composition may be administered within 24 hours after administration of the first composition. Specifically, the second composition may be administered continuously once a day from 3 days to 5 days before administration of the first composition, 24 hours after administration of the first composition, 1 day continuously for 9 days to 28 days May be administered once. In one embodiment of the present invention, the administration of the first composition from 1 day to 3 days before the first composition was administered continuously once a day, and the second composition 1 for 13 days, 17 days, 18 days or 28 days after the first composition Administration was once daily.
  • the anticancer virus is adenovirus (chosen sea), Heungsung Virus (Measles virus), Herpes simplex virus, Lentivirus, Retrovirus, Cytomegalovirus, baculovirus, Reovirus, Adeno Adeno-associated virus, Myxoma virus, Vesicular stomatitis virus, Pol iovirus, Newcast le disease virus, P arvovirus , Nose It may be derived from Coxsackie virus, Senecavirus, Vaccinia virus or Orthopoxvirus.
  • the anticancer virus may be derived from vaccinia virus, herpes simplex virus, or adenovirus.
  • the vaccinia virus is Western Reserve (WR), NYVAC (New York Vaccinia Virus), Wyeth (The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, Lister, Copenhagen, Tiantan ( Tian Tan),
  • IHD-W Inte at ional Health Division-White
  • the dosage of the anticancer virus depends on the condition and weight of the individual, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the patient may be administered an anticancer virus of virus particles, infectious virus units (TCID50) or plaque forming units (pfu) of lxlO 5 to lxlO 18 .
  • TCID50 infectious virus units
  • pfu plaque forming units
  • the anticancer virus may be administered at a dose of ixl0 5 to ixio 10 pfu. More preferably, the anticancer virus may be administered at a dose of at least lxlO 5 and less than lxlO 9 pfu. In one embodiment of the present invention, the anticancer virus 2019/168346 1 »(: 1 ⁇ 1 ⁇ 2019/002376 90 113 ⁇ 4 / 13 ⁇ 4 / (13 doses may be administered.
  • the dose of the hydroxyurea is 0.01 / dragon / sunk to 90 / urine / sunk, 1 blood / urine / sunk to 80 1 / 13 ⁇ 4 / (7, 5 13 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ to 70] / Urine can be administered as / (5, 10 / urine / sank to 60 13 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 4 / (or 20 1! 3 ⁇ 4 / urine 8 / (to 50 / ⁇ 3 ⁇ 4 / (137).
  • the anticancer virus may be administered twice, and may be administered to the subject at 7 to 30 day intervals. Specifically, the anticancer virus may be administered every 7 days, 14 days, 21 days or 30 days.
  • the hydroxyurea may be administered within 24 hours after anticancer virus administration. Specifically, the hydroxyurea may be administered continuously once a day from 3 to 5 days before the anticancer virus administration, and may be administered once a day continuously for 9 to 28 days from 24 hours after the anticancer virus administration. Can be. In one embodiment of the present invention, hydroxyurea was administered continuously once a day from 1 day to 3 days before the anticancer virus, 1 day for 13 days, 17 days, 18 days or 28 days after the anticancer virus administration It was administered twice.
  • the cancer may be solid cancer or hematologic cancer.
  • the solid cancer is lung cancer, colon cancer, prostate cancer, thyroid cancer, breast cancer, brain cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, skin cancer, thymic cancer, stomach cancer, colon cancer, liver cancer, ovarian cancer, uterine cancer, bladder cancer, rectal cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, And it may be any one selected from the group consisting of pancreatic cancer.
  • the hematologic cancer may be any one selected from the group consisting of lymphoma, acute leukemia and multiple myeloma.
  • the anticancer virus and hydroxyurea can be administered parenterally.
  • it may be intratumoral administration, intraperitoneal administration or intravenous administration.
  • the dose of the anticancer virus and hydroxyurea may be determined according to the dosing schedule, dose, and health status of the patient.
  • ⁇ individual '' as used in the present invention refers to administering the pharmaceutical composition of the present invention
  • ⁇ ⁇ 0 2019/168346 1 »(: 1 '/ 1 trillion 2019/002376 means a person whose condition is capable of alleviating, suppressing or treating a disease or suffering from cancer
  • the term "administration" means introducing an effective amount of a substance into a subject in an appropriate manner, and the route of administration of the anticancer virus and hydroxyurea may be administered through a general route to reach a target tissue. have.
  • the anticancer virus and hydroxyurea may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances whose therapeutic effects are known for the disease to be treated, or may be formulated in combination with other drugs.
  • Another aspect of the present invention provides a use of a pharmaceutical composition comprising an anticancer virus and hydroxyurea as active ingredients for preventing or treating cancer.
  • Another aspect of the present invention provides a use of a pharmaceutical composition comprising an anticancer virus and hydroxyurea as an active ingredient for the manufacture of a medicament for preventing or treating cancer.
  • TK thymidine kinase
  • Wild type vaccinia virus NYC Department of Heal th strain (Wyeth strain) and Western Reserve species were purchased from Amer ican Type Culture Collect ion (ATCC).
  • ATCC Amer ican Type Culture Collect ion
  • the TK region of the wild-type virus was identified by a shuttle plasmid with fi ref ly luci ferase reporter (p7.5 promoter) gene, fi ref ly luci ferase reporter and thymidine kinase (HSV1-TK) gene of herpes simplex virus.
  • Shuttle plasmids with shuttle plasmids and GFP genes were substituted using vectors.
  • Hela cells were cultured in EMEM medium containing 4xl0 5 cells / well conditions and 10% fetal calf serum in 6-well plates. That After treatment with wild-type vaccinia virus 0.05 M () I, after 2 hours, replaced with EMEM medium containing 2% fetal calf serum, linearized shuttle plasmid vector 4 // prepared in Preparation Example 1. g was transfected using Xfect TM polymer (Cl onetech 631317, USA). After 4 hours of incubation, the cells were replaced with EMEM medium containing 2% fetal bovine serum and further cultured for 72 hours.
  • infected cells were recovered, frozen and thawed three times, and the cells were lysed by sonication , and the recombinant vaccinia virus isolated by the sucrose cushion method was obtained, and then W tk_ , WR tk_ were obtained . Named it.
  • a recombinant vaccinia virus comprising a mutated HSV1-TK gene
  • cells without TK function in the presence of BrdU (Thymidine analogue, 15 m / ⁇ i) in TK- osteosarcoma (osteosarcoma 143 TK-) cell line.
  • Mutation of HSV1-TK was induced through 10 consecutive passages in the presence of a biochemical environment (TK-select ion pressure). Amino acid sequencing of the mutated vaccinia virus was submitted to Macrogen.
  • Toxicity was evaluated in 4T1, Renca and B16F10 cancer cell lines.
  • HeLa, A549, 4T1, B16F10 cells were obtained from ATCC (USA), and the remaining nine cancer cell lines were obtained from Korea Cell Line Bank (KCLB).
  • each cancer cell line was infected with an anti-cancer virus of 0.5 MOK0.5 pfu ⁇ : el l) and cultured for 72 hours. After that, CCK8 (Cel l Counting Ki t8) Cytotoxicity was analyzed.
  • the mouse cancer cell lines 4T1, Renca, B16F10 cancer cell lines showed a survival rate of more than 80%, and showed a relatively high resistance.
  • most of the remaining cancer cell lines showed a survival rate of 30% or less after 72 hours, and showed high cytotoxicity (FIG. 1).
  • FOG. 1 cytotoxicity
  • cancer cell lines derived from humans or mice having different proliferative capacity of anticancer viruses were implanted into mice, respectively, and human cancer cell-embedded mice (xenogrft model) and mouse cancer cell-embedded mice (al lograft) were made to perform animal experiments.
  • experiments were planned to determine whether the anticancer effect is increased in combination with hydroxyurea in a state where anticancer virus proliferation is limited in mouse cancer cell transplanted mice.
  • mice Females, 7 weeks from Orient Bio (Busan) were adjuvanted with Renca cancer cell line (Korea Cell Line Bank) with 5x10 ® cell count after 7 weeks of adaptation. was performed. Antitumor virus administration was started after observation until tumor size reached 100 mm 3 to 150 mm 3 . On the other hand, vaccinia virus-derived anticancer virus ( tk_ ) hardly proliferates in mouse kidney cancer cell- forest mouse models.
  • the group receiving the saline intratumor was the negative control group, and the group receiving the anticancer virus (W tk- , lxlO 7 pfu) was set as the positive control group.
  • a group receiving anticancer virus (W tk_ , lxlO 7 pfu) and hydroxyurea (30 rag / kg) was set as an experimental group.
  • Anticancer virus was administered intratumorally and secondly 15 days after the first administration. rh-G-CSF or hydroxyurea is sacrificed 4 days prior to anticancer virus administration: until intraperitoneally 2019/168346 1 »(: 1 ⁇ 1 ⁇ 2019/002376).
  • Example 2 16 days after the drug was administered to the mice of each group to measure the size of the tumor, the anticancer virus and In the group receiving the tumor, the tumor size was similar to that of the negative control group and the positive control group, and the tumor size was increased by more than 10 times.
  • the group treated with anticancer virus and hydroxyurea had a smaller tumor size than the negative control group, the positive control group, and other experimental groups, and observed a 7-fold increase in the initial tumor size (FIG. 2).
  • the combination of hydroxyurea and anticancer virus was confirmed to increase the anticancer effect through the smaller tumor size than the positive control group.
  • Example 2 The body weights of mice were measured on the day, 4th, 10th and 15th day of administration, before administration of each drug to the control and experimental groups of 1. The body weight of the mouse was calculated by subtracting the weight of the tumor from the weight of day 18, and the weight of the tumor (was calculated as H 2 when X is the shortest diameter and the longest diameter.
  • mice in the group receiving 7 were reduced by about 20% or more, while the weight of the mice in the experiment was confirmed to be stably maintained at 85% or more before the administration of the drug (FIG. 3).
  • mice females, sold by Orient Bio 810, 8113311
  • the group receiving intravenous saline was treated as a negative control group.
  • the group receiving hydroxyurea (30 1 / 13 ⁇ 4) was used as a positive control group.
  • a group administered with a combination of anticancer virus and hydroxyurea was set as an experimental group.
  • Anticancer virus was administered once intratumorally and secondly 17 days after the first administration.
  • the hydroxyurea was administered intraperitoneally once a day except for the day when the anticancer virus was administered from 3 days before the anticancer virus administration to 1 day before the sacrifice (FIG. 4).
  • Example 3 As a result of measuring the tumor size at 17 days after the drug was administered to each group of mice, the tumor size of the negative control group and the positive control group increased rapidly by 10 to 15 times, whereas the mice of the experimental group Tumor size was confirmed to be three times smaller than the negative control and positive control group (Fig. 5).
  • the anticancer virus and hydroxyurea are administered in combination, it was confirmed that the anticancer effect is significantly increased even in tumor models in which the anticancer virus rarely proliferates.
  • anticancer virus administration was started after observation until reaching 3 to 150 3 .
  • anticancer virus ( ⁇ —) derived from Western reserve species vaccinia virus can be proliferated in mouse kidney cancer cell-embedded mouse model.
  • the group receiving intravenous saline was negative control group, and anticancer virus ( ⁇ ⁇ ⁇ _ , Or hydroxy analogy (60! / 13 ⁇ 4) was the positive control group.
  • a group administered with a combination of anticancer virus and hydroxyurea was set as an experimental group.
  • the anticancer virus was administered once intraperitoneally.
  • Hydroxyurea was administered intraperitoneally once a day except for the day of anticancer virus from 1 day before the anticancer virus administration to 6 days after the administration.
  • Example 4.2 Confirmation of tumor size change 2019/168346 1 »(the 1 ⁇ 112019/002376 Example 4.
  • Tumor size was measured for 14 days after the drug was administered to the mice of each group 1, and the size of the mouse tumors of the negative control group and the positive control group was On the other hand, the tumor size of the mice in the anti-experimental group increased to about three-fold, while the anti-cancer virus and hydroxyurea co-administered the tumor growth significantly. 6).
  • Pre-Order from Orient Bio Mice were performed with allograft (female, 7 weeks) in 411 cancer cell lines (Korea Cell Line Bank) for a number 2x10 ® cells after undergoing an adaptation period of a week. The tumor was observed until the size reached 100 minus 3 to 150 3 and then the anticancer virus was started. On the other hand, vaccinia-derived anticancer virus (AZ_412) hardly proliferates in breast cancer cell-forest mouse models.
  • the prepared mouse breast cancer cell transplanted mice were classified into four groups (4).
  • the group receiving the saline intratumor was the negative control group, and the group receiving the anticancer virus (0 _412, urine 10 7 p ⁇ u) or the hydroxyurea (30 1 / 13 ⁇ 4) was the positive control group.
  • a group administered with a combination of anticancer virus and hydroxyurea was set as an experimental group.
  • the anticancer virus was administered once in the tumor. Hydroxyurea was administered intraperitoneally once a day except for the day when the anticancer virus was administered 3 days before the anticancer virus administration and 1 day before the sacrifice.
  • Example 5 As a result of measuring the change in tumor size for 10 days after administering the drug to the mice of each group, the tumor size of the negative control group and the positive control group increased nearly five times, whereas the mouse of the experimental group It was observed that the tumor size increased almost three times (FIG. 7). As a result, when the anticancer virus and hydroxyurea were administered in combination, it was confirmed that the anticancer effect was superior to that of the single drug administration alone.
  • mice male, sold by Orient Bio
  • 411 cancer cell lines Korea Cell Line Bank
  • the tumor was observed until the size reached 100 to 3 to 150, and then the anticancer virus was started.
  • vaccinia virus-derived anticancer virus (0 -412) hardly proliferates in breast cancer cell line-forest mouse models.
  • Anticancer Virus In addition, 411 cell line-forest mice are animal models in which metastasis progresses systemically, including lung tissue, and metastasis is generally assessed by the number of sintered nodes (Aena) on the tumor surface.
  • the group receiving the saline intratumor was the negative control group, and the group receiving the anticancer virus (0 _412, 1 nan 0 7 ? Ratio) or the hydroxyurea (30 1 / 13 ⁇ 4) was the positive control group.
  • a group administered with a combination of anticancer virus and hydroxyurea was set as an experimental group.
  • the anticancer virus was given a second dose 7 days after the first dose in the tumor.
  • the hydroxyurea was administered intraperitoneally once a day except for three days before the anticancer virus administration and three days before the sacrifice.
  • Example 6 As a result of calculating the number of tumor nodules at 21 days after the drug was administered to the mice of each group, the number of nodules was 1.5 times higher than that of the negative control group. A lot has been created. On the other hand, it was confirmed that the number of nodules was significantly reduced by 0.5 times in the mice of the experimental group (Fig. 8). Through this, the combination of anticancer virus and hydroxyurea was confirmed to inhibit metastasis to other organs.
  • the vaccinia virus-derived anti-cancer virus (01-412) is a breast cancer cell lines-hardly proliferation in a mouse model reforestation.
  • the prepared mouse breast cancer cell transplanted mice were classified into four groups.
  • the group receiving intravenous saline was negative control group and anticancer virus (0-412,
  • the group receiving high dose of hydroxyurea (90 0 / 13 ⁇ 4) was used as a positive control group.
  • the group which received anticancer virus and high dose of hydroxyurea in combination was set as an experimental group.
  • the anticancer virus was administered once in the tumor.
  • the hydroxyurea was administered intraperitoneally once a day except for the day when the anticancer virus was administered 3 days before the anticancer virus administration and 1 day before the sacrifice.
  • Example 7 The tumor size was measured for 17 days after the drug was administered to each group of mice, and the tumor size of the negative control group and the positive control group and the mouse increased nearly 3.5 times, whereas the tumor size of the mice in the experimental group increased 2.5 times. It was confirmed that. As a result, when the anticancer virus and the hydroxyurea were administered in combination, it was confirmed that the anticancer effect of tumor growth was inhibited compared with the case of the anticancer virus or the hydroxyurea alone (FIG. 10).
  • the human lung cancer cell implanted mouse was classified into four groups.
  • the group receiving intravenous saline was negative control group, and hydroxyurea or anticancer virus (01 412, IX 10 5 ?
  • the group receiving the rule was the positive control group.
  • a group receiving anticancer virus and hydroxyurea (20 1 / 13 ⁇ 4) intraperitoneally was set as an experimental group.
  • the anticancer virus was administered twice, and the second drug was administered 5 days after the first dose. Hydroxyurea was administered once daily except the day of anticancer virus from the day before the first anticancer virus administration to the day of sacrifice.
  • Example 8 As a result of measuring the tumor size at 15 days after the drug was administered to the mice in each group, the tumor size of the negative control group and the positive control group was 11, 9, and 7 times, respectively. An increase was observed. On the other hand, the tumor size of the mice in the experimental group increased about 2.5 times, and showed a tendency to decrease from day 12 (FIG. 12). As a result, when the anticancer virus and the hydroxyurea were administered in combination, it was confirmed that the tumor growth rate was more effectively suppressed than the cervix of the anticancer virus alone.
  • xenografts were performed with the human colon cancer cell line ⁇ 1 ' -116 cancer cell line (Korea Cell Line Bank) with a 2.5x10 ® cell number.
  • a xenograft was performed with the cancer cell line ⁇ 1'-116 (Korea Cell Line Bank).
  • Antitumor virus administration was started after observation until tumor size reached 20 3 to 250.
  • Human colon cancer cell-embedded mice prepared above were classified into four groups (5).
  • the group receiving intravenous saline was treated as a negative control group, and the group receiving hydroxyurea or anticancer virus (0 _412, 1 acid 0 7 ? Ratio) rule was used as a positive control group.
  • a group receiving intraperitoneal administration of anticancer virus and hydroxy analogues (30 1 / 13 ⁇ 4) was set as an experimental group.
  • Anticancer virus was administered once, and hydroxyurea was administered once daily except on the day of anticancer virus administration from 3 days before the anticancer virus administration to the day of sacrifice.
  • Vaccinia virus-derived anticancer virus (/ -412) is able to proliferate in colorectal cancer cell line-forest mouse models.
  • Example 9 As a result of measuring the tumor size at 28 days after the drug was administered to the mice in each group, the tumor size of the mice in the negative control group and the hydroxyurea-only group rapidly increased by 11 times. Was observed. The group receiving anticancer virus alone confirmed that the tumor size gradually decreased from 3 days after the anticancer virus administration to maintain the initial tumor size. On the other hand, in the experimental group, the tumor size gradually decreased from the day of administration of the anticancer virus, and began to decrease from the size of the initial tumor at 14 days after the administration of the anticancer virus, and almost disappeared at 28 days (FIG. 13). In particular, complete remission was confirmed in 2 mice on day 28 in the experimental group (FIGS. 14 and 15).
  • Pre-Order from Orient Bio (Oh 810, Tomb) 1111/1111 mouse xenografts were performed as (female, 7 weeks) in a 5x10 ® cell number of human colon cancer cell line ⁇ -29 cancer cell line (Korea Cell Line Bank) After a period of adaptation of the week. The tumor was observed until the size reached 150 3 to 200 minus 3 and then the anticancer virus was started.
  • the prepared human colon cancer cell transplanted mice were classified into two groups, 2019/168346 1 »(: 1 ⁇ 1 ⁇ 2019/002376 anti-cancer virus (A _412, 1 10 7 ? Ratio) and hydroxyurea (25 It was performed for 8 weeks divided into groups receiving intraperitoneal administration. From week 1 to week 4, anticancer virus was administered to each group twice a week. The anticancer virus was administered once a week at 5 and 7 weeks, and the anticancer virus was not administered at both the 6 and 8 weeks. Hydroxy babies were administered once daily from week 6 to week 8. Meanwhile, vaccinia virus-derived anticancer virus Proliferation is possible in colon cancer cell line-embedded mouse model.
  • Tumor size was measured at the end of week 8 by sacrifice of each group of mice. As a result, it was confirmed that the tumor size was reduced and the condition of the tumor tissue was improved in the group administered with the anticancer virus and the hydroxy analogous baby than the group administered with the anticancer virus alone (FIG. 16).
  • the collected tumor tissues were stained with H ⁇ using hematoxylin and eosin.
  • the portion where the seedling staining is darkened means living cells.
  • the tumor size was smaller and the darkly stained part was smaller than the group to which only the anticancer virus was administered (FIG. 16). That is, it was confirmed that the apoptosis effect was superior in the experimental group in combination with the anticancer virus and hydroxyurea than the control group administered with only the anticancer virus.
  • the collected tumor tissues were analyzed by performing II ′ staining and Pienne staining. At this time, The darker part means live cells. In fluorescence staining, the anticancer virus is red fluorescent and dead cells are green fluorescent.
  • Pre-Order from Orient Bio Mice were performed with allograft (female, 7 weeks) in a cancer cell line (Korea Cell Line Bank) mouse kidney cell line 5x10 ® cells after undergoing an adaptation period of a week. The drug administration was started after observation until the tumor size reached 50 3 to 200 ⁇ 11 3 .
  • the prepared mouse kidney cancer cell implantation mice were classified into four groups.
  • the saline was administered to the group receiving the tumor as a control, and the hydroxy-urea, or herpes simplex virus group receiving administration of (, 1x10 ® 0 ⁇ 1) control group.
  • the group receiving ⁇ and hydroxy analogs (30 1 / 13 ⁇ 4) was set as the experimental group.
  • Three days after hydroxyurea administration it was administered once intratumorally, and hydroxyurea was administered intraperitoneally six times a week for 20 days after anticancer virus administration.
  • Example 11 As a result of measuring the change in tumor size on day 1, day 3, day 7, day 10, day 14, day 17 after the drug was administered to the mice of each group, it was confirmed that the tumor size of the experimental group was the smallest. Through this, it was confirmed that when combined with and hydroxyurea, tumor growth was more effectively inhibited than when only anticancer virus was administered (FIG. 18).
  • mice Female, 7 weeks from Orient Bio (Ami 0, 8113811) were transferred to 13 ⁇ 41 «cancer cell line (Korea Cell Line Bank), a 5x10 ® mouse kidney cancer cell line. Allografts were performed. The tumor was observed until the size reached 50 minus 3 to 200 1111 3 and drug administration was started.
  • the prepared mouse kidney cancer cell implantation mice were classified into three groups.
  • the group receiving intravenous saline was treated as a negative control group and the anticancer virus (show (160110 1'113, 1) (10 7 ? ) Only group receiving positive control group 2019/168346 1 »(the 1 ⁇ 112019/002376 group was set as the experimental group.
  • Adenovirus was administered once intratumorally 3 days after hydroxyurea administration, and hydroxyurea was administered intraperitoneally 6 times a week for 16 days after anticancer virus administration.
  • Example 12.1 the tumor size change was measured on the day, 3, 7, 10, 14, and 17 of the mice administered with the drug in the group. It was confirmed that the tumor size was the smallest. As a result, when adenovirus and hydroxyurea were administered in combination, it was confirmed that tumor growth was more effectively inhibited than when only anticancer virus was administered (FIG. 19).

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Abstract

본 발명은 항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 것이다. 본 발명의 항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 기존의 항암바이러스만을 투여하는 경우보다 종양 억제 효과가 우수하고, 항암바이러스에 저항성이 있는 암세포도 사멸시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

명세서 항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물 기술분야
본 발명은 항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다. 배경기술
항암바이러스 (Oncolyt i c vi rus)는 종양 특이적인 표적 능력, 암세포에서 의 증식능력 및 암세포 사멸능력이 우수하여, 최근 항암바이러스를 기반으로 하 는 다양한 임상연구가 진행되고 있다. 2015년에는 미국과 유럽에서 헤르페스 심 플렉스 바이러스를 기반으로 하는 항암바이러스인 티벡 (tal imogene laherparepvec , T_Vec)이 진행성 폭색종 치료제로 상업화에 성공하면서 항암바이 러스 분야의 시대가시작되었다.
최근 항암바이러스의 유용성은 그 자체로서의 효능을 넘어 종양 면역을 활성화시켜 다른 면역치료제와의 병용 치료제로써의 가능성도 보여주고 있다. 항 암바이러스 개발 초기인 2000년도 까지는 바이러스의 암세포 특이적 증식을 통한 직접 사멸 효과가 상대적으로 더 중요하였다. 하지만， 이후의 임상연구에서는 직 접적인 암세포 사멸 효과보다 종양면역의 활성화가 핵심적 기전임을 알게 되었 고， 이를 이용하여 최근에는 항암바이러스를 면역관문억제제 ( immune checkpoint inhibi tor) 등과 같은 면역치료제와 병용 투여하는 치료제가 개발되고 있다. 이 는 항암바이러스가 면역이 억제되어 있는 종양미세환경을 면역치료가 적합한 종 양미세환경으로 전환시켜주기 때문인 것으로 알려져 있다.
그러나, 지금까지 다수의 항암바이러스 임상연구에서는 종양미세환경이 간과되어 왔다. 임상연구에서 항암바이러스 치료 후， 급속한 종양 괴사 (acute tumor necrosi s) , 지속적 종양반응 (durable response) 또는 완치 (complete response)가 나타나기도 하지만, 때로는 종양의 진행 (progress ive di sease) 또는 조기사망 (ear ly death)과 같은 예측하기 어려운 결과 (pharmacodynamics var i abi l i ty）로 이어지기도 한다. 실예로, 백시니아 바이러스를 기반으로 하는 펙사벡（Pexa-vec）의 경우 1상 임상시험에서 항암바이러스 치료 후 한 달 이내에 조기 사망환자가발생한 바 있다.
따라서, 항암바이러스의 치료효과를 증진시키기 위해서는 암세포， 환자의 면역 상태 및 항암바이러스 사이의 상호작용에 대한 이해가 필요하며， 이를 바탕 으로 임상적 효능을높일 수 있는 기술에 대한 연구가 필요한실정이다. 기술적 과제
이에 본 발명자들은 항암바이러스의 항암효과를 증진시키기 위해 연구한 결과， 항암바이러스 및 히드록시유레아를 암이 발병된 개체에 병용 투여하는 경 우 기존의 항암바이러스만을 투여하는 경우보다 항암효과가 우수한 것을 확인함 으로써 본 발명을 완성하였다. 과제 해결 수단
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은， 항암바이러스 및 히드 록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한 다.
본 발명의 다른 측면은, 암이 발병된 개체에 항암바이러스 및 히드록시유 레아를투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다. 발명의 효과
본 발명의 항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 기존의 항암바이러스만을 투여하는 경우보다 항 암효과 및 안전성이 우수하고， 항암바이러스에 저항성이 있는 암세포는 성장을 억제시킬 수 있으며， 항암바이러스가 증식 가능한 암세포의 경우 사멸시킬 수 있 다 . 따라서， 본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 암을 치료하는데 유 용하게 사용될 수 있다. 도면의 간단한설명
도 1은 13종의 암세포주에 항암바이러스（01 412）를 처리한 후, 암세포주 2019/168346 1»（：1^1{2019/002376 의 세포생존율을 나타낸 도면이다.
도 2는 마우스-신장암세포-식림 마우스 0 1 3 I）에 항암바이러스（7\ 一）, 유전자재조합 인간 과립구 집락촉진인자（此 !7） 및 히드록시유레아（抑）를 투여 한후 마우스의 종양크기를 측정한도면이다.
도 3은 마우스-신장암세포-식림 마우스 0 1«：3 I）에 항암바이러스（ \ 一），
Figure imgf000005_0001
마우스의 체중을 측정한도면이다.
도 4는 마우스-신장암세포-식립 마우스（1¾파 I I）에서의 항암바이러스 （\^ _） 및 의 병용 투여에 의한 항암치료 효과를 확인하기 위한 실험 스케줄을 도식화한도면이다.
도 5는 마우스-신장암세포-식림 마우스 0¾미 I I）에 항암바이러스
Figure imgf000005_0002
및 ^를 투여한후, 마우스의 종양크기를 측정한도면이다.
도 6은 마우스-신장암세포-식림 마우스어61 3 I I I）에 항암바이러스（■
Figure imgf000005_0003
투여한후, 종양크기를 측정한도면이다.
도 7은 마우스-유방암세포-식립 마우스（4끄）에 항암바이러스（（光3-412） 및 에를 투여한후， 마우스의 종양크기를측정한도면이다.
도 8은 마우스-유방암세포-식립 마우스（411）에 항암바이러스（0 -412） 및 를 투여한 후， 18일 뒤 희생시킨 마우스의 종양표면에 나타난 소결절의 수를 계산한도면이다.
도 9는 마우스-유방암세포-식림 마우스（411）에 항암바이러스（01 412） 및 예를 투여한후， 21일 동안의 몸무게 변화를 측정한 도면이다.
도 10은 마우스-유방암세포-식림 마우스（411）에 항암바이러스（（江3_412） 및 고용량의 를 투여한후, 종양의 크기를 측정한도면이다.
도 11은 마우스-유방암세포-식림 마우스（411）에 항암바이러스（01 412） 및 고용량의 를 투여한후, 생존율을측정한도면이다.
도 12는 인간-폐암세포（ 1내460） -식립 마우스에 항암바이러스（01 412） 및 抑를 투여한후， 15일 동안종양의 크기를 측정한도면이다.
도 13은 인간-대장암세포（:敗1'-116） -식립 마우스에 항암바이러스（01 412） 및 抑를 투여한후, 28일 동안종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 14는 인간-대장암세포（:敗1'-116） -식립 마우스에 항암바이러스（0 -412） 및 ?¾를 투여한후, 17일째 각그룹의 마우스의 종양사진을 비교한도면이다. 도 15는 인간-대장암세포 (HCT-116) -식립 마우스에 항암바이러스 (0TS-412) 및 를 투여한후， 28일째 각그룹의 마우스의 종양사진을 비교한 도면이다. 도 16은 인간-대장암세포 (HT-29) -식립 마우스에 항암바이러스 (0TS-412) 및 抑를 투여한후， 마우스의 종양 전체를 H&E염색한사진이다.
도 17은 인간-대장암세포 (HT-29) -식립 마우스에 항암바이러스 (0TS-412) 및 를 투여한후, 종양조직을 TUNEL염색한사진이다.
도 18은 마우스-신장암세포-식립 마우스에 헤르페스 심플텍스 바이러스 (HSV1) 및 抑를 투여한후， 종양의 크기를 측정한도면이다.
도 19는 마우스-신장암세포-식립 마우스에 아데노바이러스(Adeno virus) 및 HU를 투여한후, 종양의 크기를 측정한도면이다. 발명의 실시를 위한최선의 형태
이하， 본 발명을구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면은 항암바이러스 및 히드록시유레아(hydroxyurea)를 유효성분으로 포함하는 암 예방또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 항암바이러스 및 히드록시유레아를 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은 항암바이러스 및 히드록시유레아를 동시에 투여할 수 있다. 또한， 상기 약학 조성물은 히드록시유레아를 먼저 투여한 후 항암바이러스를 투여할 수 있다. 나아가， 상기 약학 조성물은 항암바이러스를 먼저 투여한 후 히드록시유레아를 투여할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 히드록시유레아를 먼저 투여한 후 항암바이러스를 투여하고 다시 히드록시유레아를 투여할수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “항암바이러스” 란， 암세포에서만 특이적으로 증식하도록 바이러스의 유전자를 조작하여 암세포를 파괴하는 재조합 바이러스를 의미한다. 상기 항암바이러스는 아데노바이러스(Adenovirus), 허피스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) , 홍역 바이러스(Measles virus) , 렌티바이러스(Lent ivirus ) , 레트로바이러스(Retrovirus ) , 싸이토메갈로 바이러스 (Cytomegalovirus) , 배큘로바이러스(baculovirus), 아데노연관바이러스(Adeno-associated virus) , 점액종 바이러스(Myxoma virus) , 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus) , 폴리오바이러스 (Pol iovi rus) , 뉴캐슬병 바이러스 (Newcast le di sease vi rus) , 파보바이러스 (Parvovi rus)， 코사키 바이러스 (Coxsacki e vi rus) , 세네카바이러스 (Senecavi rus) , 백시니아 바이러스 (Vaccini a virus) 또는 오소폭스바이러스 (Orthopoxvi rus)로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직하게는， 상기 항암바이러스는 백시니아 바이러스 (vaccini a vi rus) , 헤르페스 심들렉스 바이러스 (Herpes simplex virus) 또는 아데노바이러스 (Adenovi rus)로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브 (Western Reserve , WR) ,
NYVAC(New York Vaccini a Virus) , Wyeth (The New York Ci ty Board of Heal th； NYCBOH) , LC16m8 , 리스터 (Li ster) , 코펜하겐 (Copenhagen) , 티안탄 (Tian Tan) , USSR, 타쉬켄트 (TashKent )， 에반스 (Evans) , IHD-J( Internat ional Heal th Divi sion-J) 또는 IHD_W( Inteniat ional Heal th Divi sion-Whi te) 백시니아 바이러스 주 (strain)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항암바이러스는 티미딘 키나아제 (Thymidine kinase , TK) 유전자를 결손시킨 것일 수 있다. 상기 항암바이러스는 티미딘 키나아제 (Thymidine Kinase) 유전자가 결실되고, 변이된 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나아제 (Herpes s implex vi rus type 1 Thymidine Kinase) 유전자가 삽입된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 항암바이러스는 티미딘 키나아제 유전자를 결손시킨 재조합 백시니아 바이러스일 수 있다. 구체적으로， 상기 항암바이러스는 백시니아 바이러스의 티미딘 키나아제 유전자가 결손되고， 헤르페스 심플텍스 바이러스 1의 티미딘 키나아제 (HSV1-TK) 유전자가 삽입된 재조합 백시니아 바이러스일 수 있다. 구체적으로， 상기 항암바이러스는 과립구-대식세포 콜로니 자극인자 (GM-CSF) 및 兵-갈락토시다아제 유전자가 삽입되지 않고 티미딘 키나아제 유전자가 결손된 재조합 백시니아 바이러스 (Wtk_)일 수 있다.
또한, 상기 항암바이러스는 티미딘 키나아제 (Thymidine kinase , TK) 유전자가 결손되고， 인간 GM-CSF 또는 인간 G-CSF 유전자가 삽입된 재조합 백시니아 바이러스일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “유전자 결손” 이란， 유전자 일부 결실， 전부 결실 , 또는 유전자 내부에 외래 유전자가 삽입되어 유전자가 발현되지 않는 것을 의미한다. 상기 유전자의 일부가 결실될 경우， 발현되는 폴레펩타이드의 N- 2019/168346 1»（：1/10公019/002376 말단 또는 c-말단의 일부 아미노산이 결실될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “TK(thymidine kinase)” 란， 티미딘 키나아제로 불리며, 뉴클레오티드의 생합성에 관여하는 효소를 의미한다. 상기 는 세포 및 바이러스의 뉴클레오티드의 생합성에 모두 쓰이는 효소이다. 이때， 세포의 경우 정상세포는 더 이상 분열하지 않아 가 존재하지 않으며， 모근세포처럼 빠르게 분열하는 세포라 하더라도 TK의 양이 바이러스가 이용할 만큼 충분하지 않다. 이러한 점을 이용해 바이러스에서 TK 유전자를 결손 시킴으로써 바이러스가 암세포의 가 존재하는 경우에만 증식할 수 있게 함으로써, 암세포만을 선택적으로사멸시킬 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “GM-CSF” 란, 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 (Granulocyte-macrophage colony-st imulat ing factor)로 대식세포，
T세포, 비만 세포， 자연살해세포， 내피세포 및 섬유아세포에 의해 분비되는 단백질을 의미한다. GM-CSF는 줄기세포가 과립구 (호중구， 호염기구， 호산구)과 단핵구를 생산하도록 자극한다. 또한， GM-CSF는 대식세포의 수를 급격히 늘려 면역반응을 유도한다. 상기 GM-CSF는 인간 유래일 수 있으며， GenBank：
AM52578.1의 서열을 가지는 단백질일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “G-CSF” 란， 과립구 집락 자극인자 (Granulocyte colony-st imulat ing factor)로 염증이나 내독소 (endotoxin)에 자극을 받아서 대식세포， 섬유모세포， 내피세포 등이 생산하는 사이토카인을 의미한다. 상기 G-CSF는 호중구의 생산을 촉진시킨다. 상기 G-CSF는 인간 유래일 수 있으며 (rhGCSF) , GenBank： MA03056. 1의 서열을 가지는 단백질일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “히드록시유레아” 란， 하기 화학식을 갖는 화합물이다.
[화학식 1]
Figure imgf000008_0001
상기 히드록시유레아의 정확한 기전은 밝혀져 있지 않으나， 합성을 저해하는 항암제로 알려져 있다. 또한, 상기 히드록시유레아는 히드록시유레아를 포함하는 상업화된 약제의 형태로 약학 조성물에 포함될 수 있다. 상기 히드록시유레아 성분을 포함하는 상업화된 약제는 Hydroxyurea® , Hydrea® , Droxi a TM, Mylocel TM, Siklos® 하이드린캡슐일 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항암바이러스의 투여량은 개체의 상태 및 체중， 질병의 정도， 약물형태， 투여경로 및 기간에 따라 다르며， 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 lxlO5 내지 lxlO18의 바이러스 입자 (vi rus part i cle) , 감염능을 가지는 바이러스 단위 (TCID50) 또는 플라크 형성 단위 (pfu)의 항암바이러스를 투여할 수 있다. 구체적으로는， lxlO5, 2xl05， 5x10s, lxlO6, 2xl06, 5xl06, lxlO7, 2xl07, 5xl07, lxlO8, 2xl08, 5xl08, lxlO9, 2xl09, 5xl09, lxlO10, 5xl010, lxlO11, 5xlOn , lxlO12, lxlO13, lxlO14, lxlO15, lxlO16, lxlO17 또는 그 이상의 바이러스 입자， 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위의 항암바이러스를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항암바이러스는 lxlO5 내지 lxlO10 pfu 용량으로 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 항암바이러스는 lxlO5 이상, lxlO9 pfu 미만의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는， 상기 항암바이러스를 lxlO5또는 lxlO7 pfu로투여하였다.
또한, 상기 히드록시유레아는 0.1 rag/kg/day 내지 90 rag/kg/day 용량으로 투여될 수 있다. 구체적으로， 상기 히드록시유레아의 투여량은 0.1 rag/kg/day 내지 90 rag/kg/day, 1 mg/kg/day 내지 80 mg/kg/ day , 5 mg/kg/day 내지 70 mg/kg/day, 10 rag/kg/day 내지 60 mg/kg/day 또는 20 mg/kg/day 내지 50 rag/kg八 lay로 투여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 히드록시유레아를 20 rag/kg/day, 30 mg/kg/day, 60 mg/kg/ day또는 90 mg/kg/day로 투여하였다. 상기 암은 고형암또는 혈액암일 수 있다. 구체적으로， 상기 고형암은 폐암, 대장암， 전립선암， 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암， 피부암， 흉선암， 위암, 결장암， 간암， 난소암, 자궁암， 방광암, 직장암， 담낭암, 담도암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, 상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 0 2019/168346 1＞（그1'/10?2019/002376 본 발명의 약학 조성물은 생리적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다 . 또한 , 본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한， 통상의 방법에 따라주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 제제로서 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제 , 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol) , 폴리에틸렌 글리콜， 올리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol) , 마크로골, 트윈 (tween) 61 , 카카오지， 라우린지， 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여경로， 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고， 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나， 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 약학 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양 내 (intratumoral ) , 복강내 (intraperitoneal) , 피하 (sub-cutaneous) , 피내 (intra- dermal ) , 림프절내 (intra-nodal) 및 정맥 내 (intra-venous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는， 종양 내 투여， 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편， 상기 약학 조성물의 투여량은 투여 스케줄， 투여량 및 환자의 건강상태 등에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 항암바이러스를 유효성분으로 포함하는 제 1 조성물 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 제 2 조성물을 포함하는 암 예방또는 치료용 키트를 제공한다.
상기 항암바이러스는 약학조성물에서 상술한 바와 같다.
상기 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 제 2 조성물은 상업화된 약제일 수 있다. 상기 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 상업화된 약제는 Hydroxyurea® , Hydrea® , Droxiaä, Mylocelä, Siklos® 하이드린캡슐일 수 있다. 상기 항암바이러스의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 0 2019/168346 1»（：1^1{2019/002376 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며， 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 1난05 내지 1)(1018의 바이러스 입자 (
Figure imgf000011_0001
감염능을 가지는 바이러스 단위 (1刀1050) 또는 플라크 형성 단위 ^打!)의 항암바이러스를 투여할 수 있다. 구체적으로는, 1산05 , 2 105 , 5x10 1x10® , 2x10® , 5x10® , 1산07 , 2x10' 5x10' 뇨108， 2산08 , 5x10® , 1산09 , 2산09， 5x10® , 1x10' 5산01()， ^1011 , 크인少1， 1x10^ , IX 1013, lxl014, 1산015, 1산016， 1 1017 또는 그 이상의 바이러스 입자， 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위의 항암바이러스를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는， 상기 항암바이러스는 뇨10 5 내지 ^1010 나 용량으로 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 항암바이러스는 1산05 내지
Figure imgf000011_0002
미만의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는， 상기 제 1 조성물을 뇨105 또는뇨 比로 투여하였다.
또한， 상기 제 2 조성물의 투여량은 0. 1
Figure imgf000011_0003
내지 90 1 /1¾/(137 용량으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 제 2 조성물의 투여량은 0. 1 1¾八¾/( 내지 90 !1退/1¾八 , 1 /뇨名/선크 내지 80 1¾/뇨名八 ， 5 八¾八
Figure imgf000011_0004
/용/선크 로 투여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는， 상기 제 2 조성물을
Figure imgf000011_0005
투여하였다.
상기 암은 고형암또는 혈액암일 수 있다. 구체적으로, 상기 고형암은 폐암， 대장암， 전립선암， 갑상선암， 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암， 흉선암, 위암， 결장암, 간암， 난소암， 자궁암, 방광암， 직장암， 담낭암， 담도암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한， 상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 제 1 조성물 및 제 2 조성물은 생리적으로 허용되는 담체를 .추가로 포함할 수 있다. 또한， 본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 제 1 조성물 및 제 2 조성물은 비경구 투여를 위한 제제로서 멸균된 2019/168346 1»（：1^1{2019/002376 수용액， 비수성용제， 현탁제, 유제, 동결건조 제제， 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제， 현탁제로는 프로필렌글리콜（1）1애7161½ 묘1 0）1）, 폴리에틸렌 글리콜， 올리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔（\vi tepsol）, 마크로골， 트윈 0:\¥근611） 61， 카카오지， 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 제 1 조성물 및 제 2 조성물의 투여경로， 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한， 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나， 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 제 1 조성물 및 제 2 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데， 종양 내（ 11:대1: 11010데）， 복강내（ 1 3?61 1:이1631） , 피하（31 _（:1 81160113） , 피내（ 대-선 미 ） , 림프절내（ 1；대-110（131） 및 정맥 내（ 1；대16110113） 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는， 종양 내 투여， 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편, 상기 제 1 조성물 및 제 2 조성물의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강상태 등에 따라 결정될 수 있다.
또한, 상기 제 1 조성물은 2회 투여할 수 있으며， 7일 내지 30일 간격으로 개체에 투여할 수 있다. 구체적으로, 상기 제 1 조성물은 7일， 14일， 21일 또는 30일 간격으로 투여할수 있다.
상기 제 2 조성물은 제 1 조성물 투여 후 24시간 이내에 투여할 수 있다. 구체적으로， 상기 제 2조성물은 제 1 조성물 투여 3일 내지 5일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여할 수 있으며， 제 1 조성물 투여한 후 24시간 후부터, 9일 내지 28일 동안 연속적으로 1일 1회 투여할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 제 1 조성물 투여 전 1일 내지 3일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여하였으며, 제 1 조성물 투여 후 13일， 17일， 18일 또는 28일 동안 제 2 조성물을 1일 1회 투여하였다.
본 발명의 또 다른 측면은 암이 발병된 개체에게 항암바이러스 및 히드록시유레아를 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 항암바이러스는 아데노바이러스（쇼선해 ）， 흥역 바이러스 (Measles virus) , 허피스 심플렉스 바이러스 (Herpes simplex virus) , 렌티바이러스 (Lentivirus) , 레트로바이러스 (Retrovirus) , 싸이토메갈로 바이러스 (Cytomegalovirus) , 배큘로바이러스 (baculovirus) , 리오바이러스 (Reovirus) , 아데노연관바이러스 (Adeno-associated virus) , 점액종 바이러스 (Myxoma virus) , 수포성 구내염 바이러스 (Vesicular stomatitis virus) , 폴리오바이러스 (Pol iovirus) , 뉴캐슬병 바이러스 (Newcast le disease virus) , 파보바이러스 (parvovirus)， 코사키 바이러스 (Coxsackie virus) , 세네카바이러스 (Senecavirus) , 백시니아 바이러스 (Vaccinia virus) 또는 오소폭스바이러스 (Orthopoxvirus)로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직하게는， 상기 항암바이러스는 백시니아 바이러스 (vaccinia virus) , 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Herpes simplex virus) 또는 아데노바이러스 (Adenovirus)로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브 (Western Reserve, WR) , NYVAC(New York Vaccinia Virus) , Wyeth(The New York City Board of Health； NYCBOH), LC16m8, 리스터 (Lister), 코펜하겐 (Copenhagen) , 티안탄 (Tian Tan),
USSR, 타쉬켄트 (TashKent) , 에반스 (Evans), IHD-J ( International Health
Division-J) 또는 IHD-W(Inte at ional Health Division-White) 백시니아 바이러스주 (strain)일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항암바이러스의 투여량은 개체의 상태 및 체중， 질병의 정도， 약물형태， 투여경로 및 기간에 따라 다르며， 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 lxlO5 내지 lxlO18의 바이러스 입자 (virus particle) , 감염능을 가지는 바이러스 단위 (TCID50) 또는 플라크 형성 단위 (pfu)의 항암바이러스를 투여할 수 있다. 구체적으로는， lxlO5, 2xl05, 5xl05， lxlO6, 2xl06, 5xl06, lxlO7, 2xl07, 5xl07, lxlO8, 2xl08, 5xl08, lxlO9, 2xl09, 5xl09, lxlO10, 5xl010, lxlO11, 5xlOn, lxlO12, lxlO13, lxlO14, lxlO15, lxlO16, lxlO17 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위의 항암바이러스를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항암바이러스는 ixl0 5 내지 ixio10 pfu 용량으로 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는， 상기 항암바이러스는 lxlO5 이상， lxlO9 pfu 미만의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는， 상기 항암바이러스를 2019/168346 1»（：1^1{2019/002376
Figure imgf000014_0001
90 11¾/1¾/（13 용량으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 히드록시유레아의 투여량은 0. 1 / 용/선크 내지 90 /뇨용/선크 ， 1 피용/뇨名/산크 내지 80 1 /1¾/（ 7， 5 1¾八¾八 내지 70 ］ /뇨은/（ 5 , 10 /뇨용/산크 내지 60 1¾八¾/（ 또는 20 1!¾/뇨8/（ 내지 50 /}¾/（137로 투여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는， 상기 히드록시유레아를 20 / 格/선크:!/ , 30 1 /뇨용八 ,
Figure imgf000014_0002
투여하였다. 또한, 상기 항암바이러스는 2회 투여할 수 있으며， 7일 내지 30일 간격으로 개체에 투여할 수 있다. 구체적으로, 상기 항암바이러스는 7일， 14일, 21일 또는 30일 간격으로 투여할 수 있다.
상기 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 후 24시간 이내에 투여할 수 있다. 구체적으로， 상기 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 3일 내지 5일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여할 수 있으며， 항암바이러스 투여 후 24시간 후부터， 9일 내지 28일 동안 연속적으로 1일 1회 투여할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는， 히드록시유레아를 항암바이러스 투여 전 1일 내지 3일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여하였으며， 항암바이러스 투여 후 13일， 17일， 18일 또는 28일 동안 1일 1회 투여하였다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 구체적으로， 상기 고형암은 폐암， 대장암， 전립선암， 갑상선암， 유방암, 뇌암， 두경부암, 식도암， 피부암， 흉선암, 위암， 결장암, 간암， 난소암， 자궁암， 방광암, 직장암, 담낭암， 담도암 、 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한， 상기 혈액암은 림프종， 급성 백혈병 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
ᅭ 상기 항암바이러스 및 히드록시유레아는 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양 내（ 1:대1:1페0대1）， 복강내（ 1:대?61 1:이1631）， 피하（ !） -以 배） , 피내（ 技대 -（ ä^）， 림프절내（ 1：대-110（131） 및 정맥 내（ 메해에크） 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는， 종양 내 투여， 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편, 상기 항암바이러스 및 히드록시유레아의 투여량은 투여 스케줄， 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에서 사용하는 용어 ''개체"란, 본 발명의 약학 조성물을 투여하여 \¥0 2019/168346 1»（：1'/1 조2019/002376 질환이 경감， 억제 또는 치료될 수 있는 상태이거나 암을 앓고 있는 사람을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "투여"란， 적절한 방법으로 개체에 유효량의 물질을 도입하는 것을 의미하며， 상기 항암바이러스 및 히드록시유레아의 투여 경로는 목표조직에 도달할수 있는 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 또한， 상기 항암바이러스 및 히드록시유레아는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나， 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은， 암을 예방 또는 치료하기 위한 항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 약학조성물의 용도를 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은， 암 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다. 발명의 실시를 위한형태
이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐， 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 항암바이러스 제조
제조예 1.1. 셔틀플라스미드 벡터 제작
티미딘 키나아제 (TK) 유전자가 결실된 항암바이러스를 제조하기 위해,
ATCC(Amer ican Type Cul ture Col lect ion)에서 야생형 백시니아 바이러스 NYC Department of Heal th 종 (Wyeth strain) 및 Western Reserve 종을 구입하였다. 재조합을 위해 야생형 바이러스의 TK 부위를 f i ref ly luci ferase reporter (p7.5 promoter ) 유전자를 가진 셔틀 플라스미드, f i ref ly luci ferase reporter와 헤르페스 심플텍스 바이러스의 티미딘 키나아제 (HSV1-TK) 유전자를 가진 셔틀 플라스미드 및 GFP 유전자를 가진 셔틀 플라스미드를 벡터를 사용하여 치환하였다.
제조예 1.2. 재조합백시니아바이러스 제조
재조합 바이러스를 확보하기 위하여， Hela 세포 (ATCC)를 6 -웰 플레이트에 4xl05 세포/웰 조건 및 10% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지에 배양하였다. 그 후， 야생형 백시니아 바이러스 0.05 M()I를 처리하고， 2시간 후， 2% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지로 교체한 후， 상기 제조예 1.1.에서 제작한 선형화시킨 셔틀 플라스미드 벡터 4 //g을 XfectTM polymer (Cl onetech 631317, USA)를 이용하여 형질주입하였다. 4시간 배양 후, 세포를 2%우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지로 교체한 후 72시간 추가 배양하였다. 최종적으로， 감염된 세포를 회수한 다음 동결 및 해동을 3회 반복 후 초음파분쇄로 세포를 용해시키고, 수크로오스 쿠션 방법 (sucrose cushion method)으로 분리된 재조합 백시니아 바이러스를 확보하였고 이를 Wtk_, WR tk_로 명명하였다.
변이된 HSV1-TK 유전자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스를 확보하기 위해 그 후， TK- 골육종 (osteosarcoma 143 TK-)세포주에서 BrdU(Thymidine analogue , 15 m/^i) 존재 하, TK 기능이 없는 세포를 선택할 수 있는 생화학적 환경 (TK- select ion pressure)이 가해진 상태에서 10회의 연속 계대 배양을 통해 HSV1-TK의 돌연변이를 유도하였다. 변이된 백시니아 바이러스의 아미노산 서열 분석 (amino acid sequencing)을마크로젠에 의뢰하였다.
그 결과， 변이된 백시나아 바이러스의 HSV1-TK의 C-말단의 46번째 아미노산인 글루타민 (Gin)을 코딩하는 코돈 (caa)이 스탑 코돈 (stop codon)으로 점 돌연변이 (point mutat ion)된 것을 확인하였다. 또한, 변이된 백시나아 바이러스의 HSV1-TK의 46번째 이후의 C-말단의 아미노산 잔기들이 결실된 것을 확인하였다. 최종적으로， 유전적 안정성이 확보된 HSV1-TK 단편을 발현하는 변이된 백시니아바이러스 (0TS-412)를 획득하였다.
I . 항암바이러스 (0TS-412)의 세포독성 실험
실험예 1. 항암바이러스의 종양세포사멸 효과 확인
항암바이러스 (0TS-412)의 세포 독성을 확인하기 위해 10종의 인간 암세포주와 3종의 마우스 암세포주에서 독성을 평가하였다. 구체적으로， HeLa, PC-3, DU-145, HT-29, HCT-116 , A549, NCI-H23, NCI-H460 , MCF-7, MDA-MB-231 ,
4T1 , Renca 및 B16F10 암세포주에서 독성을 평가하였다. HeLa, A549 , 4T1 , B16F10 세포는 ATCC (미국)로부터 입수하였고, 나머지 9종의 암세포주는 한국세포주은행 (KCLB)으로부터 입수하였다.
먼저， 각각의 암세포주에서 o .5 MOK0.5 pfu八: el l )의 항암바이러스를 감염시킨 후 72시간 동안 배양하였다. 그 후， CCK8(Cel l Count ing Ki t8)을 이용하여 세포독성을 분석하였다.
그 결과, 마우스 암세포주인 4T1， Renca, B16F10 암세포주에서 80% 이상의 생존률을 보였으며， 상대적으로 높은 저항성을 나타냈다. 하지만， 나머지 암세포주에서는 72시간 후 대부분 30% 이하의 생존률을 보였으며, 높은 세포독성을 나타내는 것을 확인하였다 (도 1) . 이를 통해 마우스 암세포주에서 항암바이러스가거의 증식하지 못하는 것을 확인하였다.
나아가, 항암바이러스의 증식능이 다른 인간 유래 또는 마우스 유래의 암세포주를 각각 마우스에 식립하여， 인간 암세포-식립 마우스 (xenogrft model )와 마우스 암세포-식립 마우스 (al lograft )를 만들어 동물실험을 수행하였다. 특히, 마우스 암세포 식림 마우스에서는 항암바이러스 증식이 제한적인 상태에서 히드록시유레아와 병용 투여할 경우 항암효과가 증가하는지 확인하기 위해 실험을 계획하였다.
II . 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스 (wtk_) 및 히드록시유레아 (hydroxyurea)의 항암치료효과 확인: Renca I
실시예 2.1마우스신장암세포식림 마우스 제조 및 약물투여
오리엔트 바이오 (Or ient Bio , Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스 (암컷, 7주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5x10® 세포수의 Renca 암세포주 (한국세포주은행)로 동종이식 (al lograft )을 수행하였다. 종양의 크기가 100 mm3 내지 150 mm3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스 ( tk_)는 마우스 신장암세포-식림 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식림 마우스를 4개 그룹 (n=4)으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며， 항암바이러스 (Wtk-， lxlO7 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 항암바이러스 ( tk_, lxlO7 pfu)와 재조합형 인간 과립구 집단 자극 인자 (Recomb inant human granulocyte colony-st imulat ing factor , rh-G~CSF , 75 //g/kg)를 투여받는 그룹 및 항암바이러스 (Wtk_, lxlO7 pfu)와 히드록시유레아 (30 rag/kg)를 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스는 종양 내 투여하였으며， 첫 번째 투여 후 15일 뒤 두 번째 투여하였다. rh-G-CSF 또는 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 4일 전부터 희생시키기: 전까지 복강 내 2019/168346 1»（：1^1{2019/002376 투여하였다.
실시예 2.2. 종양크기 변화확인
실시예 2. 1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 16일째에 희생시켜 종양의 크기를 측정한 결과， 항암바이러스와
Figure imgf000018_0001
투여받은 그룹은 음성대조군 및 양성대조군과 종양의 크기가 비슷하였으며， 초기 종양의 크기에서 10배 이상 증가한것을 관찰하였다. 반면， 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여받은 그룹은 음성대조군, 양성대조군 및 다른 실험군에 비해 마우스의 종양의 크기가 작았으며, 초기 종양의 크기에서 7배 정도 증가한 것을 관찰하였다（도 2）. 특히， 양성대조군에 비해 종양의 크기가 작은 것을 통해 히드록시유레아와 항암바이러스를 병용 투여할 경우 항암효과가 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 2.3체중변화확인
실시예 2. 1의 대조군 및 실험군에 각각의 약물을 투여하기 전， 투여한 당일， 4일， 10일 및 15일차에 마우스의 체중을 측정하였다. 마우스의 체중은 18일차의 체중에서 종양의 무게를 차감하여 계산하였고, 종양의 무게（ 는 가장 짧은 직경과 가장 긴 직경을 X 라 했을 때 헤 2으로 계산하였다.
그 결과, 음성대조군 및 항암바이러스와 此 -。요!7를 투여받은 그룹의 마우스 체중은 약 20% 이상 감소한 반면, 실험의 마우스의 체중은 약물을 투여하기 전의 85% 이상으로 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다（도 3）.
III . 마우스 신장암세포 식림 마우스에서의 항암바이러스（ ^） 및 히드록시유례아의 항암치료효과확인: 1¾1« I I
실시예 3.1. 마우스신장암세포식림 마우스제조및 약물투여
오리엔트 바이오（아 810 , 8113311）에서 분양 받은 ^>^ \b/c 마우스（암컷，
7주）를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5x10® 세포수의
Figure imgf000018_0002
암세포주（한국세포주은행）로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 3 내지 150 3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스（\ _）는 마우스 신장암세포-식림 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다（11=13）. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며， 2019/168346 1»（：1^1{2019/002376 항암바이러스
Figure imgf000019_0001
또는 히드록시유레아（30 1 /1¾）를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스는 종양 내 1회 투여하였으며， 첫 번째 투여 후 17일 뒤 두 번째 투여하였다. 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 3일 전부터 희생 1일 전까지 항암바이러스를 투여하는 날을 제외하고 1일 1회 복강 내 투여하였다（도 4）.
실시예 3.2. 종양크기 변화확인
실시예 3. 1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 17일째에 희생시켜 종양의 크기를 측정한 결과, 음성대조군 및 양성대조군의 마우스 종양 크기는 10 내지 15배로 급격히 증가한 반면， 실험군의 마우스의 종양 크기는 음성대조군 및 양성대조군에 비해 3배 가까이 작은 것을 확인하였다（도 5）. 이를 통해 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여할 경우, 항암바이러스가 거의 증식하지 않는 종양모델에서도 항암효과가크게 증가하는 것을 확인하였다.
IV. 마우스 신장암세포 식림 마우스에서의 항암바이러스
Figure imgf000019_0002
및 히드록시유레아의 항암치료효과확인:
Figure imgf000019_0003
실시예 4.1. 마우스신장암세포식림 마우스제조및 약물투여
오리엔트 바이오（아 610 , ）에서 분양 받은
Figure imgf000019_0004
마우스（암컷，
7주）를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5x10® 세포수의 ｛ 미 암세포주（한국세포주은행）로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 !3 내지 150 3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다. 한편， 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스（■— ）는 마우스 신장암세포 식립 마우스 모델에서 증식이 가능하다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹（11=6）으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며， 항암바이러스（\附\ _，
Figure imgf000019_0005
또는 히드록시유례아（60 ! /1¾）를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스는 복강 내 1회 투여하였다. 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 6일까지 항암바이러스를 투여하는 날을 제외하고 1일 1회 복강 내 투여하였다.
실시예 4.2. 종양크기 변화확인 2019/168346 1»（그1^112019/002376 실시예 4. 1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 14일 동안 종양의 크기를 측정한 결과, 음성대조군 및 양성대조군의 마우스 종양의 크기는 8 내지 10배 가까이 증가한 반면, 항실험군의 마우스의 종양 크기는 약 3배 가까지 증가하였으며， 이를 통해， 항암바이러스 및 히드록시유레아를 병용투여할 경우 종양의 성장이 현저히 억제되는 것을 확인하였다（도 6）.
V. 마우스 유방암세포 식림 마우스에서의 항암바이러스（0稱-412） 및 히드록시유례아의 항암치료효과확인: 411 I
실시예 5.1. 마우스신장암세포식림마우스제조및 약물투여
오리엔트 바이오（아 310 , 묘배 ）에서 분양 받은
Figure imgf000020_0001
마우스（암컷, 7주）를 일주일의 적응기간을 거친 후에 2x10® 세포수의 411 암세포주（한국세포주은행）로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 빼3 내지 150 3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다. 한편， 백시니아 유래 항암바이러스（아 _412）는 유방암세포-식림 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다.
상기 제작한 마우스 유방암세포 식림 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다（ 4）. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며, 항암바이러스（0 _412 , 뇨107 pίu） 또는 히드록시유레아（30 1 /1¾）를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스는 종양 내 1회 투여하였다. 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 3일 전부터 희생 1일 전까지 항암바이러스를투여하는 날을 제외하고 1일 1회 복강 내 투여하였다.
실시예 5.2. 종양크기 변화확인
실시예 5. 1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 10일 동안 종양의 크기의 변화를 측정한 결과， 음성대조군 및 양성대조군의 마우스 종양의 크기가 5배 가까이 증가하는 반면， 실험군의 마우스의 종양의 크기는 3배 가까이 증가하는 것을 관찰하였다（도 7）. 이를 통해， 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여하는 경우 각각의 약물을 단독투여하는 경우보다 항암효과가 우수한 것을 확인하였다.
VI . 마우스 유방암세포 식림 마우스에서의 항암바이러스（0粥-412） 및 히드록시유레아의 항암치료효과확인: 411 I I 2019/168346 1»（：1^1{2019/002376 실시예 6.1. 마우스유방암세포 식림 마우스 제조및 약물투여
오리엔트 바이오（아 位 비0 , 요애 ）에서 분양 받은 8315/0 마우스（암컷，
7주）를 일주일의 적응기간을 거친 후에 1 106 세포수의 411 암세포주（한국세포주은행）로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 빼3 내지 150 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스（0 -412）는 유방암세포주-식림 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다. 항암바이러스또한， 411 세포주-식림 마우스는 폐조직을 포함한 전신으로의 전이가 진행되는 동물모델이며, 일반적으로 종양 표면의 소결절（아년나 ）의 수로써 전이를 평가한다.
상기 제작한 마우스 유방암세포 식림 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다（11=5）. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며， 항암바이러스（0 _412, 1난07 ?比） 또는 히드록시유레아（30 1 /1¾）를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스는 종양 내 첫 번째 투여한 뒤 7일째 두 번째 투여하였다. 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 3일 전부터 희생시키기 3일 전까지 항암바이러스를 투여하는 날을 제외하고 1일 1회 복강 내 투여하였다.
실시예 6.2. 종양크기 변화확인
실시예 6. 1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 21일째에 희생시켜 종양의 결절의 수를 계산한 결과, 항암바이러스만 투여받은 그룹의 마우스의 경우 결절의 수가 음성대조군에 비해 1.5배 많이 생성되었다. 반면, 실험군의 마우스의 경우 결절의 수가 0.5배로 현저히 적게 생성된 것을 확인하였다（도 8）. 이를 통해 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여하는 경우 다른 장기로의 전이를 억제시키는 것을 확인한 것이다. · 실시예 6.3. 반복투여에 의한 안전성 확인
실시예 6. 1과 같은 마우스 유방암세포 식림 마우스 모델을 제조하고（11=10） 약물을 투여한 후 7일, 14일， 17일 및 21일차에 마우스의 체중을 측정하였다. 그 결과， 모든 군의 마우스 체중이 2주 뒤부터 감소하는 양상을 보였으나, 21일째 실험군의 마우스의 체중이 가장높게 나타났다. 다른 세 군의 마우스의 경우에도 21일째 10%내외로 체중이 감소하였다. 이를 통해 항암바이러스를 반복 투여하고 2019/168346 1»（：1^1{2019/002376 히드록시유레아를 병용 투여하는 경우에도 안전한 것을 확인하였다（도 9）.
VII . 마우스 유방암세포 식림 마우스에서의 항암바이러스（0桃-412） 및 고용량의 히드록시유례아의 항암치료효과확인: 411 III
실시예 7.1. 마우스신장암세포식립 마우스제조및 약물투여
오리엔트 바이오（아 610 , 요 ）에서 분양 받은 묘 八: 마우스（암컷，
7주）를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5x10® 세포수의 411 암세포주（한국세포주은행）로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 50 11113 내지 200 빼3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다. 한편， 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스（01 -412）는 유방암세포주-식림 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다.
상기 제작한 마우스 유방암세포 식림 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며, 항암바이러스（0 - 412 ,
Figure imgf000022_0001
또는 고용량의 히드록시유레아（90 0 /1¾）를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다 . 항암바이러스와 고용량의 히드록시유레아를 병용 투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스는 종양 내 1회 투여하였다. 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 3일 전부터 희생 1일 전까지 항암바이러스를 투여하는 날을 제외하고 1일 1회 복강 내 투여하였다.
실시예 7.2. 종양크기 변화확인
실시예 7. 1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 17일 동안 종양의 크기를 측정한 결과， 음성대조군 및 양성대조군와 마우스의 종양 크기가 3.5배 가까이 증가하는 반면， 실험군의 마우스의 종양 크기는 2.5배 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해， 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여할 경우， 항암바이러스 또는 히드록시유레아를 단독투여하는 경우보다 종양의 성장 항암효과 억제되는 것을 확인하였다（도 10）.
또한, 28일째까지 각 군의 마우스의 생존율을 확인한 결과， 항암바이러스만 투여한 그룹의 마우스들은 21일째 모두 사망하였으며, 음성대조군의 경우 1마리가 생존하였다 . 반면 , 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹에서 가장 마지막까지 마우스가 생존하는 것을 확인하였다（도 11）. 이를 통해, 고용량의 히드록시유레아와 항암바이러스의 병용 투여의 안전성 및 항암효과를 확인하였다. 2019/168346 1»（：1^1{2019/002376 및 히드록시유레아의 항암치료효과확인
실시예 8.1. 인간폐암세포식림 마우스제조및투여
오리엔트 바이오
Figure imgf000023_0001
^0， &13 ）에서 분양 받은 68^/0 1111/1111 마우스를 일주일의 적응기간을 거친 후에 1난06 세포수의 1내460 폐암세포（한국세포주은행）로 이종이식（ 6110용대行）를 수행하였다. 종양의 크기가 300 3 내지 400 3에 도달하였을 때 항암바이러스 투여를 시작하였다. 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스（0 _412）는 폐암세포주-식림 마우스 모델에서 증식이 가능하다.
상기 제작한 인간 폐암세포 식립 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며， 히드록시유레아 또는 항암바이러스（01 412 , IX 105 ? ）룰 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. 항암바이러스와 히드록시유레아를（20 1 /1¾） 복강내 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스 투여는 두 번에 걸쳐 시행되었고， 첫 번째 투여 후 5일 후 두 번째 약물 투여를 실시하였다. 히드록시유레아는 첫 번째 항암바이러스 투여 전날부터 희생되는 날까지 항암바이러스 투여하는 날을 제외하고 매일 1회 투여하였다.
실시예 8.2. 종양크기 변화확인
실시예 8. 1에서 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 15일째에 희생시켜 종양의 크기를 측정한 결과， 음성대조군 및 양성대조군의 마우스의 종양 크기가 각각 11배， 9배， 7배로 급격히 증가하는 것을 관찰하였다. 반면， 실험군의 마우스의 종양 크기는 약 2.5배 증가하였고， 12일째부터는 감소하는 경향을 나타내었다（도 12）. 이를 통해， 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여하는 경우, 항암바이러스만을 단독 투여하는 경부보다 종양의 성장 속도를 효과적으로 억제시키는 것을 확인하였다.
IX. 인간 대장암세포 00-116） 식림 마우스에서의 항암바이러스（013-412） 및 히드록시유례아의 항암치료효과확인
실시예 9.1. 인간대장암세포식림 마우스제조및 투여
오리엔트 바이오（아 610 , 묘 ）에서 분양 받은
Figure imgf000023_0002
1111/1111 마우스（암컷, 7주）를 일주일의 적응기간을 거친 후에 2.5x10® 세포수의 인간 대장암 세포주인 敗1'-116 암세포주（한국세포주은행）로 이종이식을 수행하였다. 2019/168346 1»（：1^112019/002376 대장암 세포주인 敗1'-116 암세포주（한국세포주은행）로 이종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 20 3 내지 250 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다.
상기 제작한 인간 대장암세포 식립 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다（ 5）. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며， 히드록시유레아 또는 항암바이러스（0 _412 , 1산07 ?比）룰 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. 항암바이러스와 히드록시유례아를（30 1 /1¾） 복강내 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스 투여는 1회 투여되었고， 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 3일 전부터 희생되는 날까지 항암바이러스 투여하는 날을 제외하고 매일 1회 투여하였다. 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스（（/ -412）는 대장암세포주-식림 마우스 모델에서 증식이 가능하다.
실시예 9.2. 종양크기 변화확인
실시예 9. 1에서 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 28일째에 희생시켜 종양의 크기를 측정한 결과, 음성대조군과 히드록시유레아만 투여받은 그룹의 마우스의 종양 크기가 11배로 급격히 증가하는 것을 관찰하였다. 항암바이러스를 단독으로 투여받은 그룹은 항암바이러스 투여 후 3일 후부터 종양의 크기가 서서히 감소하여 초기 종양의 크기로 유지되는 것을 확인하였다. 반면, 실험군의 경우에는 항암바이러스를 투여한 당일부터 종양의 크기가 서서히 감소하여， 항암바이러스 투여 후 14일째 초기 종양의 크기보다 줄어들기 시작하며, 28일째 거의 사라지는 것을 확인하였다（도 13）. 특히, 실험군에서 28일째 2마리에서 완전 관해가 확인되었다（도 14 및 도 15）.
X. 인간 대장암세포（ -29） 식림 마우스에서의 항암바이러스（ ^）및 히드록시유레아의 항암치료효과 확인
실시예 10.1 인간대장암세포（肝-29） 식림 마우스 제조 및 투여
오리엔트 바이오（아 810, 묘 ）에서 분양 받은
Figure imgf000024_0001
1111/1111 마우스（암컷， 7주）를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5x10® 세포수의 인간 대장암 세포주인 ｝奸-29 암세포주（한국세포주은행）로 이종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 150 3 내지 200 빼3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다.
상기 제작한 인간 대장암세포 식림 마우스를 2개 그룹으로 분류하였고， 2019/168346 1»（：1^1{2019/002376 항암바이러스（아 _412， 1 107 ?比）만 투여하는 그룹과 히드록시유레아（25
Figure imgf000025_0001
복강내 투여받는 그룹으로 나누어 8주 동안 수행하였다. 1주 내지 4주차 까지는 주당 2회씩 항암바이러스를 각 그룹에 투여하였다. 5주 및 7주 차에는 항암바이러스를 주 1회 투여하였으며 , 6주 및 8주 차에는 항암바이러스를 두 그룹 모두 투여하지 않았다. 히드록시유례아는 6주부터 8주차까지 1일 1회 투여하였다. 한편， 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스
Figure imgf000025_0002
는 대장암세포주- 식립 마우스모델에서 증식이 가능하다.
실시예 10.2. 종양크기 , 종양조직의 세포사멸 확인
8주차 마지막 날에 각 그룹의 마우스를 희생시켜 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과， 항암바이러스만을 투여한 그룹보다 항암바이러스 및 히드록시유례아를 투여한 그룹에서 종양의 크기가 감소하고 종양 조직의 상태가 호전된 것을 확인하였다（도 16）.
또한， 수집한 종양 조직을 헤마톡실린 및 에오신을 이용하여 H湖 염색을 하였다. 이때， 묘湖 염색이 진하게된 부분은 살아있는 세포를 의미한다. 그 결과, 항암바이러스 및 히드록시유레아를 투여한 그룹의 경우 항암바이러스만을 투여한 그룹보다 전반적으로 종양의 크기가 작고， 진하게 염색된 부분이 적은 것을 확인하였다（도 16）. 즉， 항암바이러스만을 투여한 대조군보다 항암바이러스 및 히드록시유레아를 병용 투여한 실험군에서 세포사멸 효과가 우수한 것을 확인하였다.
또한, 수집한 종양 조직을 II湖 염색 및 피炯느 염색을 수행하여 분석하였다. 이때,
Figure imgf000025_0003
염색이 진하게된 부분은 살아있는 세포를 의미하며， 형광 염색에서 항암바이러스는 적색 형광， 죽은 세포는 녹색 형광을 띤다.
그 결과， 항암바이러스 및 히드록시유레아를 병용 투여한 그룹의 종양 조직에서 사멸된 세포가 항암바이러스만을 투여한 그룹보다 더 많이 관찰되었다. 또한， 대조군의 경우 사멸된 세포와 항암바이러스의 염색 부위가 일치하므로 항암바이러스에 의한 암세포 사멸이 확인되었다. 반면， 항암바이러스 및 히드록시유레아를 병용 투여한 그룹의 경우 세포가 사멸된 부분과 항암바이러스의 염색 부위가 상이한 것을 확인하였다. 이는 항암바이러스 및 히드록시유레아를 병용 투여한 그룹에서는 항암바이러스가 감염되지 않은 암세포에서도 세포사멸이 나타나는 것을 확인한 것이다（도 17）. 0 2019/168346 1»（：1^1{2019/002376
XI . 마우스신장암세포-식림-마우스에서의 헤르페스 심플렉스 바이러스（11^1） 및 히드록시유례아의 항암치료효과확인
실시예 11.1마우스신장암세포（1^1103） 식림 마우스제조및 투여
오리엔트 바이오（아 610 , 요배 ）에서 분양 받은
Figure imgf000026_0001
마우스（암컷， 7주）를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5x10® 세포수의 마우스 신장암 세포주인 암세포주（한국세포주은행）로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 50 3 내지 200 ¥113에 도달할 때까지 관찰한 뒤 약물 투여를 시작하였다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 대조군으로 하였으며, 히드록시유레아 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스（ , 1x10® 0打1）를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. 此 와 히드록시유례아（30 1 /1¾）를 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다.
Figure imgf000026_0002
히드록시유레아 투여 3일 후 종양 내 1회 투여되었고， 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 후 20일 동안 주 6회 복강 내 투여되었다.
실시예 11.2. 종양의 크기 변화확인
실시예 11. 1에서 각 군의 마우스에 약물을 투여한 당일， 3일째， 7일째 , 10일째， 14일째， 17일째 종양의 크기 변화를 측정한 결과， 실험군의 종양의 크기가 가장 작은 것을 확인하였으며, 이를 통해， 과 히드록시유레아를 병용 투여할 경우 항암바이러스만을 투여하는 경우보다 종양의 성장이 더 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다（도 18）.
XI I . 마우스신장암세포-식립-마우스에서의 아데노바이러스（쇼신60110 VI ^8） 및 히드록시유레아의 항암치료효과확인
실시예 12.1. 마우스신장암세포
Figure imgf000026_0003
마우스제조및 투여
오리엔트 바이오（아 미0， 8113811）에서 분양 받은 6815/0 마우스（암컷, 7주）를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5x10® 세포수의 마우스 신장암 세포주인 1¾1« 암세포주（한국세포주은행）로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 50 빼3 내지 200 11113에 도달할 때까지 관찰한 뒤 약물 투여를 시작하였다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며， 항암바이러스（쇼（160110 1'113， 1）（107 ? ）만 투여받는 그룹을 양성대조군으로 2019/168346 1»（그1^112019/002376 그룹을 실험군으로 설정하였다. 아데노바이러스는 히드록시유레아 투여 3일 후 종양 내 1회 투여되었고， 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 후 16일 동안 주 6회 복강 내 투여되었다.
실시예 12.2. 종양의 크기 변화확인
실시예 12.1에서 각 군의 마우스에 약물을 투여한 당일， 3일째， 7일째， 10일째， 14일째, 17일째 종양의 크기 변화를 측정한 결과, 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여받은 그룹의 종양의 크기가 가장 작은 것을 확인하였다. 이를 통해, 아데노바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여할 경우 항암바이러스만을 투여하는 경우보다 종양의 성장이 더 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다（도 19）.

Claims

특허청구범위
1. 항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서，
상기 조성물은 항암바이러스 및 히드록시유레아가 동시， 순차적， 또는 역 순으로 병용투여되는 것을 특징으로 하는， 암 예방또는 치료용 약학조성물.
3. 제 1항에 있어서,
상기 항암바이러스는 아데노바이러스 (Adenovirus ) 홍역 바이러스 (Measles virus) , 허피스 심플렉스 바이러스 (Herpes simplex virus) , 렌티바이러 스 (Lent ivirus) , 레트로바이러스 (Retrovirus) , 싸이토메갈로 바이러스
(Cytomegalovirus) , 배큘로바이러스 (baculovirus) , 아페노연관바이러스 (Adeno- associated virus) , 점액종 바이러스 (Myxoma virus) , 수포성 구내염 바이러스 (Vesicular stomatitis virus) , 폴리오바이러스 (Pol iovirus) , 뉴캐슬병 바이러스 (Newcastle disease virus) , 파보바이러스 (Parvovirus)， 코사키 바이러스 (Coxsackie virus) , 세네카바이러스 (Senecavirus) , 백시니아 바이러스 (Vaccinia virus) 또는 오소폭스바이러스 (Orthopoxvirus)로부터 유래된 것인， 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
4. 제 1항에 있어서,
상기 항암바이러스는 백시니아 바이러스로부터 유래된 것인， 암 예방 또 는 치료용 약학조성물.
5. 제 1항에 있어서，
상기 항암바이러스는 티미딘 키나아제 (Thymidine Kinase) 유전자가 결실 된 것인, 암 예방또는 치료용 약학조성물.
6. 제 1항에 있어서，
상기 항암바이러스가 lxlO5 pfu내지 lxlO10 pfu용량으로 투여되는 것인， \¥02019/168346 1>(71'/10?2019/002376 암 예방또는 치료용 약학조성물.
7. 제 1항에 있어서，
상기 히드록시유레아가 0.1 mg/kg/day 내지 90 mg/kg/day 용량으로 투여 되는 것인， 암 예방또는 치료용 약학조성물
8. 제 1항에 있어서,
상기 암은 폐암, 대장암， 전립선암， 갑상선암， 유방암， 뇌암， 두경부암, 식도암， 피부암, 흉선압， 위암， 결장암, 간암, 난소암， 자궁암, 방광암， 직장암， 담낭암， 담도암， 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것 , 암 예방또는 치료용 약학조성물.
9. 암이 발병된 개체에 항암바이러스 및 히드록시유레아를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법 .
10. 제 9항에 있어서，
상기 항암바이러스는 아데노바이러스 (Adenovirus)， 홍역 바이러스 (Measles virus) , 허피스 심플렉스 바이러스 (Herpes simplex virus) , 렌티바이러 스 (Lentivirus) , 레트로바이러스 (Retrovirus) , 싸이토메갈로 바이러스
(Cytomegalovirus)， 배큘로바이러스 (baculovirus) , 아데노연관바이러스 (Adeno- associated virus) , 점액종 바이러스 (Myxoma virus) , 수포성 구내염 바이러스 (Vesicular stomatitis virus) , 폴리오바이러스 (Pol iovirus) , 뉴캐슬병 바이러스 (Newcastle disease virus) , 파보바이러스 (Parvovirus) , 코사키 바이러스 (Coxsackie virus) , 세네카바이러스 (Senecavirus)， 백시니아 바이러스 (Vaccinia virus) 또는오소폭스바이러스 (Orthpoxvirus)로부터 유래된 것인， 암 치료방법.
11. 제 9항에 있어서 ,
상기 항암바이러스는 백시니아 바이러스로부터 유래된 것인, 암 치료방 법. 2019/168346 1»（：1^1{2019/002376
12. 제 9항에 있어서，
상기 항암바이러스가
Figure imgf000030_0001
용량으로 투여되는 것인， 암 치료방법.
13. 제 9항에 있어서，
상기 히드록시유레아가 0.1 /뇨용八！크 내지 90 !¾/}¾八！크 용량으로 투여 되는 것인, 암 치료방법.
14. 제 9항에 있어서 ,
상기 히드록시유레아가 항암바이러스 투여 전， 중 또는 후에 적어도 1회 투여되는 것인， 암 치료방법.
15. 제 9항에 있어서，
상기 히드록시유레아가 항암바이러스 투여 3일 내지 5일 전， 항암바이러 스 투여 후 24시간 후부터， 1일 1회 , 9일 내지 28일 동안 연속적으로 투여되는 것인, 암 치료방법.
16. 제 9항에 있어서，
상기 항암바이러스가 7일 내지 30일 간격으로 개체에 투여되는 것인, 암 치료방법.
17. 제 9항에 있어서，
상기 암은 폐암, 대장암， 전립선암, 갑상선암， 유방암， 뇌암， 두경부암, 식도암， 피부암, 흉선압， 위암, 결장암， 간암， 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암， 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것， 암 치료방법 .
18. 제 9항에 있어서，
상기 항암바이러스가 종양 내（ 1:대1；111110대1）, 복강 내（intraperitoneal） 또는 정맥 내（ 1；대 - 6110113）로 투여되는 것인， 암 치료방법. 2019/168346 1»（：1/1 公019/002376
19. 암을 예방또는 치료하기 위한 제 1항와약학조성물의 용도.
20. 암의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 제 1항의 약학 조성물의 용 도
PCT/KR2019/002376 2018-02-28 2019-02-27 항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 WO2019168346A1 (ko)

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