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KR102381952B1 - 항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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KR102381952B1
KR102381952B1 KR1020200185295A KR20200185295A KR102381952B1 KR 102381952 B1 KR102381952 B1 KR 102381952B1 KR 1020200185295 A KR1020200185295 A KR 1020200185295A KR 20200185295 A KR20200185295 A KR 20200185295A KR 102381952 B1 KR102381952 B1 KR 102381952B1
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virus
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Abstract

본 발명은 항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 것이다. 본 발명의 항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 기존의 항암바이러스만을 투여하는 경우보다 종양 억제 효과가 우수하고, 항암바이러스에 저항성이 있는 암세포도 사멸시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING CANCER COMPRISING ONCOLYTIC VIRUS AND HYDROXYUREA}
본 발명은 항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
항암바이러스(Oncolytic virus)는 종양 특이적인 표적 능력, 암세포에서의 증식능력 및 암세포 사멸능력이 우수하여, 최근 항암바이러스를 기반으로 하는 다양한 임상연구가 진행되고 있다. 2015년에는 미국과 유럽에서 헤르페스 심플렉스 바이러스를 기반으로 하는 항암바이러스인 티벡(talimogene laherparepvec, T-Vec)이 진행성 흑색종 치료제로 상업화에 성공하면서 항암바이러스 분야의 시대가 시작되었다.
최근 항암바이러스의 유용성은 그 자체로서의 효능을 넘어 종양 면역을 활성화시켜 다른 면역치료제와의 병용 치료제로써의 가능성도 보여주고 있다. 항암바이러스 개발 초기인 2000년도 까지는 바이러스의 암세포 특이적 증식을 통한 직접 사멸 효과가 상대적으로 더 중요하였다. 하지만, 이후의 임상연구에서는 직접적인 암세포 사멸 효과보다 종양면역의 활성화가 핵심적 기전임을 알게 되었고, 이를 이용하여 최근에는 항암바이러스를 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor) 등과 같은 면역치료제와 병용 투여하는 치료제가 개발되고 있다. 이는 항암바이러스가 면역이 억제되어 있는 종양미세환경을 면역치료가 적합한 종양미세환경으로 전환시켜주기 때문인 것으로 알려져 있다(Christopher J. LaRocca and Susanne G. Warner, Clin Transl Med., 2018, 7:35).
그러나, 지금까지 다수의 항암바이러스 임상연구에서는 종양미세환경이 간과되어 왔다. 임상연구에서 항암바이러스 치료 후, 급속한 종양 괴사(acute tumor necrosis), 지속적 종양반응(durable response) 또는 완치(complete response)가 나타나기도 하지만, 때로는 종양의 진행(progressive disease) 또는 조기사망(early death)과 같은 예측하기 어려운 결과(pharmacodynamics variability)로 이어지기도 한다. 실예로, 백시니아 바이러스를 기반으로 하는 펙사벡(Pexa-vec)의 경우 1상 임상시험에서 항암바이러스 치료 후 한 달 이내에 조기 사망 환자가 발생한 바 있다.
따라서, 항암바이러스의 치료효과를 증진시키기 위해서는 암세포, 환자의 면역 상태 및 항암바이러스 사이의 상호작용에 대한 이해가 필요하며, 이를 바탕으로 임상적 효능을 높일 수 있는 기술에 대한 연구가 필요한 실정이다.
Christopher J. LaRocca and Susanne G. Warner, Clin Transl Med., 2018, 7:35).
이에 본 발명자들은 항암바이러스의 항암효과를 증진시키기 위해 연구한 결과, 항암바이러스 및 히드록시유레아를 암이 발병된 개체에 병용 투여하는 경우 기존의 항암바이러스만을 투여하는 경우보다 항암효과가 우수한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은, 항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 암이 발병된 개체에 항암바이러스 및 히드록시유레아를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다.
본 발명의 항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 기존의 항암바이러스만을 투여하는 경우보다 항암효과 및 안전성이 우수하고, 항암바이러스에 저항성이 있는 암세포는 성장을 억제시킬 수 있으며, 항암바이러스가 증식 가능한 암세포의 경우 사멸시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 13종의 암세포주에 항암바이러스(OTS-412)를 처리한 후, 암세포주의 세포생존율을 나타낸 도면이다.
도 2는 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca I)에 항암바이러스(VVtk-), 유전자재조합 인간 과립구 콜로니 자극인자(rhG-CSF) 및 히드록시유레아(HU)를 투여한 후 마우스의 종양 크기를 측정한 도면이다.
도 3은 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca I)에 항암바이러스(VVtk-), rhG-CSF 및 HU를 투여한 후, 마우스의 체중을 측정한 도면이다.
도 4는 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca II)에서의 항암바이러스 (VVtk-) 및 HU의 병용 투여에 의한 항암치료 효과를 확인하기 위한 실험 스케줄을 도식화한 도면이다.
도 5는 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca II)에 항암바이러스(VVtk-) 및 HU를 투여한 후, 마우스의 종양 크기를 측정한 도면이다.
도 6은 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca III)에 항암바이러스(WRVVtk-) 및 HU를 전신투여한 후, 종양 크기를 측정한 도면이다.
도 7은 마우스-유방암세포-식립 마우스(4T1)에 항암바이러스(OTS-412) 및 HU를 투여한 후, 마우스의 종양 크기를 측정한 도면이다.
도 8은 마우스-유방암세포-식립 마우스(4T1)에 항암바이러스(OTS-412) 및 HU를 투여한 후, 18일 뒤 희생시킨 마우스의 종양표면에 나타난 소결절의 수를 계산한 도면이다.
도 9는 마우스-유방암세포-식립 마우스(4T1)에 항암바이러스(OTS-412) 및 HU를 투여한 후, 21일 동안의 몸무게 변화를 측정한 도면이다.
도 10은 마우스-유방암세포-식립 마우스(4T1)에 항암바이러스(OTS-412) 및 고용량의 HU를 투여한 후, 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 11은 마우스-유방암세포-식립 마우스(4T1)에 항암바이러스(OTS-412) 및 고용량의 HU를 투여한 후, 생존율을 측정한 도면이다.
도 12는 인간-폐암세포(NCI-H460)-식립 마우스에 항암바이러스(OTS-412) 및 HU를 투여한 후, 15일 동안 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 13은 인간-대장암세포(HCT-116)-식립 마우스에 항암바이러스(OTS-412) 및 HU를 투여한 후, 28일 동안 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 14는 인간-대장암세포(HCT-116)-식립 마우스에 항암바이러스(OTS-412) 및 HU를 투여한 후, 17일째 각 그룹의 마우스의 종양 사진을 비교한 도면이다.
도 15는 인간-대장암세포(HCT-116)-식립 마우스에 항암바이러스(OTS-412) 및 HU를 투여한 후, 28일째 각 그룹의 마우스의 종양 사진을 비교한 도면이다.
도 16은 인간-대장암세포(HT-29)-식립 마우스에 항암바이러스(OTS-412) 및 HU를 투여한 후, 마우스의 종양 전체를 H&E 염색한 사진이다.
도 17은 인간-대장암세포(HT-29)-식립 마우스에 항암바이러스(OTS-412) 및 HU를 투여한 후, 종양조직을 TUNEL 염색한 사진이다.
도 18은 마우스-신장암세포-식립 마우스에 헤르페스 심플렉스 바이러스 1(HSV1) 및 HU를 투여한 후, 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 19는 마우스-신장암세포-식립 마우스에 아데노바이러스(Adeno virus) 및 HU를 투여한 후, 종양의 크기를 측정한 도면이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면은 항암바이러스 및 히드록시유레아(hydroxyurea)를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물에 포함된 항암바이러스 및 히드록시유레아는 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 항암바이러스 및 히드록시유레아는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 히드록시유레아를 먼저 투여한 후 상기 항암바이러스를 투여할 수 있다. 나아가, 상기 항암바이러스를 먼저 투여한 후 상기 히드록시유레아를 투여할 수 있다. 또한, 상기 히드록시유레아를 먼저 투여한 후 상기 항암바이러스를 투여하고 다시 상기 히드록시유레아를 투여할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "항암바이러스"란, 암세포에서만 특이적으로 증식하도록 바이러스의 유전자를 조작하여 암세포를 파괴하는 재조합 바이러스를 의미한다. 상기 항암바이러스는 아데노바이러스(Adenovirus), 허피스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 홍역 바이러스(Measles virus), 렌티바이러스(Lentivirus), 레트로바이러스(Retrovirus), 싸이토메갈로 바이러스(Cytomegalovirus), 배큘로바이러스(baculovirus), 아데노연관바이러스(Adeno-associated virus), 점액종 바이러스(Myxoma virus), 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 폴리오바이러스(Poliovirus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 파보바이러스(Parvovirus), 코사키 바이러스(Coxsackie virus), 세네카바이러스(Senecavirus), 백시니아 바이러스(Vaccinia virus) 또는 오소폭스바이러스(Orthopoxvirus)로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항암바이러스는 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 또는 아데노바이러스(Adenovirus)로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J) 또는 IHD-W(International Health Division-White) 백시니아 바이러스 주(strain)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항암바이러스는 티미딘 키나아제(Thymidine kinase, TK) 유전자를 결손시킨 것일 수 있다. 상기 항암바이러스는 티미딘 키나아제(Thymidine Kinase) 유전자가 결실되고, 변이된 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나아제(Herpes simplex virus type 1 Thymidine Kinase) 유전자가 삽입된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 항암바이러스는 티미딘 키나아제 유전자를 결손시킨 재조합 백시니아 바이러스일 수 있다. 구체적으로, 상기 항암바이러스는 백시니아 바이러스의 티미딘 키나아제 유전자가 결손되고, 헤르페스 심플렉스 바이러스 1의 티미딘 키나아제(HSV1-TK) 유전자가 삽입된 재조합 백시니아 바이러스일 수 있다. 구체적으로, 상기 항암바이러스는 과립구-대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF) 및 β-갈락토시다아제 유전자가 삽입되지 않고 티미딘 키나아제 유전자가 결손된 재조합 백시니아 바이러스(VVtk-)일 수 있다.
또한, 상기 항암바이러스는 티미딘 키나아제(Thymidine kinase, TK) 유전자가 결손되고, 인간 GM-CSF 또는 인간 G-CSF 유전자가 삽입된 재조합 백시니아 바이러스일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “유전자 결손”이란, 유전자 일부 결실, 전부 결실, 또는 유전자 내부에 외래 유전자가 삽입되어 유전자가 발현되지 않는 것을 의미한다. 상기 유전자의 일부가 결실될 경우, 발현되는 폴레펩타이드의 N-말단 또는 C-말단의 일부 아미노산이 결실될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "TK(thymidine kinase)"란, 티미딘 키나아제로 불리며, 뉴클레오티드의 생합성에 관여하는 효소를 의미한다. 상기 TK는 세포 및 바이러스의 뉴클레오티드의 생합성에 모두 쓰이는 효소이다. 이때, 세포의 경우 정상세포는 더 이상 분열하지 않아 TK가 존재하지 않으며, 모근세포처럼 빠르게 분열하는 세포라 하더라도 TK의 양이 바이러스가 이용할 만큼 충분하지 않다. 이러한 점을 이용해 바이러스에서 TK 유전자를 결손 시킴으로써 바이러스가 암세포의 TK가 존재하는 경우에만 증식할 수 있게 함으로써, 암세포만을 선택적으로 사멸시킬 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “GM-CSF”란, 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)로 대식세포, T세포, 비만 세포, 자연살해세포, 내피세포 및 섬유아세포에 의해 분비되는 단백질을 의미한다. GM-CSF는 줄기세포가 과립구(호중구, 호염기구, 호산구)과 단핵구를 생산하도록 자극한다. 또한, GM-CSF는 대식세포의 수를 급격히 늘려 면역반응을 유도한다. 상기 GM-CSF는 인간 유래일 수 있으며, GenBank: AAA52578.1의 서열을 가지는 단백질일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "G-CSF"란, 과립구 콜로니 자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor)로 염증이나 내독소(endotoxin)에 자극을 받아서 대식세포, 섬유모세포, 내피세포 등이 생산하는 사이토카인을 의미한다. 상기 G-CSF는 호중구의 생산을 촉진시킨다. 상기 G-CSF는 인간 유래일 수 있으며(rhGCSF), GenBank: AAA03056.1의 서열을 가지는 단백질일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "히드록시유레아"란, 하기 화학식을 갖는 화합물이다.
[화학식 1]
Figure 112020142272239-pat00001
상기 히드록시유레아의 정확한 기전은 밝혀져 있지 않으나, DNA 합성을 저해하는 항암제로 알려져 있다. 또한, 상기 히드록시유레아는 히드록시유레아를 포함하는 상업화된 약제의 형태로 약학 조성물에 포함될 수 있다. 상기 히드록시유레아 성분을 포함하는 상업화된 약제는 Hydroxyurea®, Hydrea®, Droxia TM, Mylocel TM, Siklos® 하이드린캡슐일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 항암바이러스의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 1x105 내지 1x1018의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)의 항암바이러스를 투여할 수 있다. 구체적으로는, 1x105, 2x105, 5x105, 1x106, 2x106, 5x106, 1x107, 2x107, 5x107, 1x108, 2x108, 5x108, 1x109, 2x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x1011, 5x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위의 항암바이러스를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항암바이러스는 1x105 내지 1x1010 pfu 용량으로 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 항암바이러스는 1x105 이상, 1x109 pfu 미만의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 항암바이러스를 1x105 또는 1x107 pfu로 투여하였다.
또한, 상기 히드록시유레아는 0.1 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day 용량으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 히드록시유레아의 투여량은 0.1 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day, 1 ㎎/㎏/day 내지 80 ㎎/㎏/day, 5 ㎎/㎏/day 내지 70 ㎎/㎏/day, 10 ㎎/㎏/day 내지 60 ㎎/㎏/day 또는 20 ㎎/㎏/day 내지 50 ㎎/㎏/day로 투여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 히드록시유레아를 20 ㎎/㎏/day, 30 mg/kg/day, 60 mg/kg/day 또는 90 mg/kg/day로 투여하였다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 구체적으로, 상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, 상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 생리적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 제제로서 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 약학 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양 내(intratumoral), 복강내(intraperitoneal), 피하(sub-cutaneous), 피내(intra-dermal), 림프절내(intra-nodal) 및 정맥 내(intra-venous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 종양 내 투여, 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편, 상기 약학 조성물의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 항암바이러스를 유효성분으로 포함하는 제 1 조성물 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 제 2 조성물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
상기 항암바이러스는 약학 조성물에서 상술한 바와 같다.
상기 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 제 2 조성물은 상업화된 약제일 수 있다. 상기 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 상업화된 약제는 Hydroxyurea®, Hydrea®, Droxia TM, Mylocel TM, Siklos® 하이드린캡슐일 수 있다.
상기 항암바이러스의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 1x105 내지 1x1018의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)의 항암바이러스를 투여할 수 있다. 구체적으로는, 1x105, 2x105, 5x105, 1x106, 2x106, 5x106, 1x107, 2x107, 5x107, 1x108, 2x108, 5x108, 1x109, 2x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x1011, 5x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위의 항암바이러스를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항암바이러스는 1x105 내지 1x1010 pfu 용량으로 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 항암바이러스는 1x105 내지 1x109 pfu 미만의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 제 1 조성물을 1x105 또는 1x107pfu로 투여하였다.
또한, 상기 제 2 조성물의 투여량은 0.1 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day 용량으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 제 2 조성물의 투여량은 0.1 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day, 1 ㎎/㎏/day 내지 80 ㎎/㎏/day, 5 ㎎/㎏/day 내지 70 ㎎/㎏/day, 10 ㎎/㎏/day 내지 60 ㎎/㎏/day 또는 20 ㎎/㎏/day 내지 50 ㎎/㎏/day 로 투여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 제 2 조성물을 20 ㎎/㎏, 25 ㎎/㎏/day, 30 ㎎/㎏/day, 60 ㎎/㎏/day 또는 90 ㎎/㎏/day로 투여하였다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 구체적으로, 상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, 상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 제 1 조성물 및 제 2 조성물은 생리적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 제 1 조성물 및 제 2 조성물은 비경구 투여를 위한 제제로서 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 제 1 조성물 및 제 2 조성물의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 제 1 조성물 및 제 2 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양 내(intratumoral), 복강내(intraperitoneal), 피하(sub-cutaneous), 피내(intra-dermal), 림프절내(intra-nodal) 및 정맥 내(intra-venous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 종양 내 투여, 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편, 상기 제 1 조성물 및 제 2 조성물의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다.
또한, 상기 제 1 조성물은 2회 투여할 수 있으며, 7일 내지 30일 간격으로 개체에 투여할 수 있다. 구체적으로, 상기 제 1 조성물은 7일, 14일, 21일 또는 30일 간격으로 투여할 수 있다.
상기 제 2 조성물은 제 1 조성물 투여 후 24시간 이내에 투여할 수 있다. 구체적으로, 상기 제 2 조성물은 제 1 조성물 투여 3일 내지 5일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여할 수 있으며, 제 1 조성물 투여한 후 24시간 후부터, 9일 내지 28일 동안 연속적으로 1일 1회 투여할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 제 1 조성물 투여 전 1일 내지 3일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여하였으며, 제 1 조성물 투여 후 13일, 17일, 18일 또는 28일 동안 제 2 조성물을 1일 1회 투여하였다.
본 발명의 또 다른 측면은 암이 발병된 개체에게 항암바이러스 및 히드록시유레아를 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 항암바이러스는 아데노바이러스(Adenovirus), 홍역 바이러스(Measles virus), 허피스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 렌티바이러스(Lentivirus), 레트로바이러스(Retrovirus), 싸이토메갈로 바이러스(Cytomegalovirus), 배큘로바이러스(baculovirus), 리오바이러스(Reovirus), 아데노연관바이러스(Adeno-associated virus), 점액종 바이러스(Myxoma virus), 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 폴리오바이러스(Poliovirus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 파보바이러스(Parvovirus), 코사키 바이러스(Coxsackie virus), 세네카바이러스(Senecavirus), 백시니아 바이러스(Vaccinia virus) 또는 오소폭스바이러스(Orthopoxvirus)로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항암바이러스는 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 또는 아데노바이러스(Adenovirus)로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J) 또는 IHD-W(International Health Division-White) 백시니아 바이러스 주(strain)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항암바이러스의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 1x105 내지 1x1018 의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)의 항암바이러스를 투여할 수 있다. 구체적으로는, 1x105, 2x105, 5x105, 1x106, 2x106, 5x106, 1x107, 2x107, 5x107, 1x108, 2x108, 5x108, 1x109, 2x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x1011, 5x1011, 1x1012, 1x1013, 1x1014, 1x1015, 1x1016, 1x1017 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위의 항암바이러스를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항암바이러스는 1x105 내지 1x1010 pfu 용량으로 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 항암바이러스는 1x105 이상, 1x109 pfu 미만의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 항암바이러스를 1x105 또는 1x107 pfu로 투여하였다.
또한, 상기 히드록시유레아는 0.1 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day 용량으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 히드록시유레아의 투여량은 0.1 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day, 1 ㎎/㎏/day 내지 80㎎/㎏/day, 5 ㎎/㎏/day 내지 70㎎/㎏/day, 10 ㎎/㎏/day 내지 60 ㎎/㎏/day 또는 20 ㎎/㎏/day 내지 50 ㎎/㎏/day로 투여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 히드록시유레아를 20 ㎎/㎏/day, 30 mg/kg/day, 60 mg/kg/day 또는 90 mg/kg/day로 투여하였다.
또한, 상기 항암바이러스는 2회 투여할 수 있으며, 7일 내지 30일 간격으로 개체에 투여할 수 있다. 구체적으로, 상기 항암바이러스는 7일, 14일, 21일 또는 30일 간격으로 투여할 수 있다.
상기 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 후 24시간 이내에 투여할 수 있다. 구체적으로, 상기 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 3일 내지 5일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여할 수 있으며, 항암바이러스 투여 후 24시간 후부터, 9일 내지 28일 동안 연속적으로 1일 1회 투여할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 히드록시유레아를 항암바이러스 투여 전 1일 내지 3일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여하였으며, 항암바이러스 투여 후 13일, 17일, 18일 또는 28일 동안 1일 1회 투여하였다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 구체적으로, 상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, 상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 항암바이러스 및 히드록시유레아는 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양 내(intratumoral), 복강내(intraperitoneal), 피하(sub-cutaneous), 피내(intra-dermal), 림프절내(intra-nodal) 및 정맥 내(intra-venous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 종양 내 투여, 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편, 상기 항암바이러스 및 히드록시유레아의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "개체"란, 본 발명의 약학 조성물을 투여하여 질환이 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태이거나 암을 앓고 있는 사람을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에 유효량의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 항암바이러스 및 히드록시유레아의 투여 경로는 목표 조직에 도달할 수 있는 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
또한, 상기 항암바이러스 및 히드록시유레아는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 항암바이러스 제조
제조예 1.1. 셔틀 플라스미드 벡터 제작
티미딘 키나아제(TK) 유전자가 결실된 항암바이러스를 제조하기 위해, ATCC(American Type Culture Collection)에서 야생형 백시니아 바이러스 NYC Department of Health 종(Wyeth strain) 및 Western Reserve 종을 구입하였다. 재조합을 위해 야생형 바이러스의 TK 부위를 firefly luciferase reporter(p7.5 promoter) 유전자를 가진 셔틀 플라스미드, firefly luciferase reporter와 헤르페스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나아제(HSV1-TK) 유전자를 가진 셔틀 플라스미드 및 GFP 유전자를 가진 셔틀 플라스미드를 벡터를 사용하여 치환하였다.
제조예 1.2. 재조합 백시니아 바이러스 제조
재조합 바이러스를 확보하기 위하여, Hela 세포(ATCC)를 6-웰 플레이트에 4x105 세포/웰 조건 및 10% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지에 배양하였다. 그 후, 야생형 백시니아 바이러스 0.05 MOI를 처리하고, 2시간 후, 2% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지로 교체한 후, 상기 제조예 1.1.에서 제작한 선형화시킨 셔틀 플라스미드 벡터 4 ㎍을 XfectTM polymer(Clonetech 631317, USA)를 이용하여 형질주입하였다. 4시간 배양 후, 세포를 2% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지로 교체한 후 72시간 추가 배양하였다. 최종적으로, 감염된 세포를 회수한 다음 동결 및 해동을 3회 반복 후, 초음파분쇄로 세포를 용해시키고, 수크로오스 쿠션 방법(sucrose cushion method)으로 분리된 재조합 백시니아 바이러스를 확보하였고 이를 VVtk-, WRVVtk-로 명명하였다.
변이된 HSV1-TK 유전자를 포함하는 재조합 백시니아 바이러스를 확보하기 위해 그 후, TK- 골육종(osteosarcoma 143 TK-)세포주에서 BrdU(Thymidine analogue, 15 ㎍/㎖) 존재 하, TK 기능이 없는 세포를 선택할 수 있는 생화학적 환경(TK- selection pressure)이 가해진 상태에서 10회의 연속 계대 배양을 통해 HSV1-TK의 돌연변이를 유도하였다. 변이된 백시니아 바이러스의 아미노산 서열 분석(amino acid sequencing)을 마크로젠에 의뢰하였다.
그 결과, 변이된 백시나아 바이러스의 HSV1-TK의 C-말단의 46번째 아미노산인 글루타민(Gln)을 코딩하는 코돈(caa)이 종결 코돈(stop codon)으로 점 돌연변이(point mutation)된 것을 확인하였다. 또한, 변이된 백시나아 바이러스의 HSV1-TK의 46번째 이후의 C-말단의 아미노산 잔기들이 결실된 것을 확인하였다. 최종적으로, 유전적 안정성이 확보된 HSV1-TK 단편을 발현하는 변이된 백시니아 바이러스(OTS-412)를 획득하였다.
I. 항암바이러스(OTS-412)의 세포독성 실험
실험예 1. 항암바이러스의 종양세포 사멸 효과 확인
항암바이러스(OTS-412)의 세포 독성을 확인하기 위해 10종의 인간 암세포주와 3종의 마우스 암세포주에서 독성을 평가하였다. 구체적으로, HeLa, PC-3, DU-145, HT-29, HCT-116, A549, NCI-H23, NCI-H460, MCF-7, MDA-MB-231, 4T1, Renca 및 B16F10 암세포주에서 독성을 평가하였다. HeLa, A549, 4T1, B16F10 세포는 ATCC(미국)로부터 입수하였고, 나머지 9종의 암세포주는 한국세포주은행(KCLB)으로부터 입수하였다.
먼저, 각각의 암세포주에서 0.5 MOI(0.5 pfu/cell)의 항암바이러스를 감염시킨 후 72시간 동안 배양하였다. 그 후, CCK8(Cell Counting Kit8)을 이용하여 세포독성을 분석하였다.
그 결과, 마우스 암세포주인 4T1, Renca, B16F10 암세포주에서 80% 이상의 생존률을 보였으며, 상대적으로 높은 저항성을 나타냈다. 하지만, 나머지 암세포주에서는 72시간 후 대부분 30% 이하의 생존률을 보였으며, 높은 세포독성을 나타내는 것을 확인하였다(도 1). 이를 통해 마우스 암세포주에서 항암바이러스가 거의 증식하지 못하는 것을 확인하였다.
나아가, 항암바이러스의 증식능이 다른 인간 유래 또는 마우스 유래의 암세포주를 각각 마우스에 식립하여, 인간 암세포-식립 마우스(xenogrft model)와 마우스 암세포-식립 마우스(allograft)를 만들어 동물실험을 수행하였다. 특히, 마우스 암세포 식립 마우스에서는 항암바이러스 증식이 제한적인 상태에서 히드록시유레아와 병용 투여할 경우 항암효과가 증가하는지 확인하기 위해 실험을 계획하였다.
II. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스(VV tk- ) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca I
실시예 2.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식(allograft)을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스(VVtk-)는 마우스 신장암세포-식립 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹(n=4)으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며, 항암바이러스(VVtk-, 1x107 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 항암바이러스(VVtk-, 1x107 pfu)와 재조합형 인간 과립구 집단 자극 인자(Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor, rh-G-CSF, 75 ㎍/㎏)를 투여받는 그룹 및 항암바이러스(VVtk-, 1x107 pfu)와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스는 종양 내 투여하였으며, 첫 번째 투여 후 15일 뒤 두 번째 투여하였다. rh-G-CSF 또는 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 4일 전부터 희생시키기 전까지 복강 내 투여하였다.
실시예 2.2. 종양 크기 변화 확인
실시예 2.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 16일째에 희생시켜 종양의 크기를 측정한 결과, 항암바이러스와 rh-G-CSF를 투여받은 그룹은 음성대조군 및 양성대조군과 종양의 크기가 비슷하였으며, 초기 종양의 크기에서 10배 이상 증가한것을 관찰하였다. 반면, 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여받은 그룹은 음성대조군, 양성대조군 및 다른 실험군에 비해 마우스의 종양의 크기가 작았으며, 초기 종양의 크기에서 7배 정도 증가한 것을 관찰하였다(도 2). 특히, 양성대조군에 비해 종양의 크기가 작은 것을 통해 히드록시유레아와 항암바이러스를 병용 투여할 경우 항암효과가 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 2.3. 체중 변화 확인
실시예 2.1의 대조군 및 실험군에 각각의 약물을 투여하기 전, 투여한 당일, 4일, 10일 및 15일차에 마우스의 체중을 측정하였다. 마우스의 체중은 18일차의 체중에서 종양의 무게를 차감하여 계산하였고, 종양의 무게(v)는 가장 짧은 직경과 가장 긴 직경을 x, y라 했을 때 v=x2y/2으로 계산하였다.
그 결과, 음성대조군 및 항암바이러스와 rh-G-CSF를 투여받은 그룹의 마우스 체중은 약 20% 이상 감소한 반면, 실험의 마우스의 체중은 약물을 투여하기 전의 85% 이상으로 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다(도 3).
III. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스(VV tk- ) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca II
실시예 3.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스(VVtk-)는 마우스 신장암세포-식립 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다(n=13). 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며, 항암바이러스(VVtk-, 1x107 pfu) 또는 히드록시유레아(30 mg/kg)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스는 종양 내 1회 투여하였으며, 첫 번째 투여 후 17일 뒤 두 번째 투여하였다. 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 3일 전부터 희생 1일 전까지 항암바이러스를 투여하는 날을 제외하고 1일 1회 복강 내 투여하였다(도 4).
실시예 3.2. 종양 크기 변화 확인
실시예 3.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 17일째에 희생시켜 종양의 크기를 측정한 결과, 음성대조군 및 양성대조군의 마우스 종양 크기는 10 내지 15배로 급격히 증가한 반면, 실험군의 마우스의 종양 크기는 음성대조군 및 양성대조군에 비해 3배 가까이 작은 것을 확인하였다(도 5). 이를 통해 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여할 경우, 항암바이러스가 거의 증식하지 않는 종양 모델에서도 항암효과가 크게 증가하는 것을 확인하였다.
IV. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스(WRVV tk- ) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca III
실시예 4.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스(WRVVtk-)는 마우스 신장암세포 식립 마우스 모델에서 증식이 가능하다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며, 항암바이러스(WRVVtk-, 1x107 pfu) 또는 히드록시유레아(60 mg/kg)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스는 복강 내 1회 투여하였다. 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 6일까지 항암바이러스를 투여하는 날을 제외하고 1일 1회 복강 내 투여하였다.
실시예 4.2. 종양 크기 변화 확인
실시예 4.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 14일 동안 종양의 크기를 측정한 결과, 음성대조군 및 양성대조군의 마우스 종양의 크기는 8 내지 10배 가까이 증가한 반면, 항실험군의 마우스의 종양 크기는 약 3배 가까지 증가하였으며, 이를 통해, 항암바이러스 및 히드록시유레아를 병용투여할 경우 종양의 성장이 현저히 억제되는 것을 확인하였다(도 6).
V. 마우스 유방암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스(OTS-412) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: 4T1 I
실시예 5.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 2x106 세포수의 4T1 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 백시니아 유래 항암바이러스(OTS-412)는 유방암세포-식립 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다.
상기 제작한 마우스 유방암세포 식립 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다(n=4). 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며, 항암바이러스(OTS-412, 1x107 pfu) 또는 히드록시유레아(30 mg/kg)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스는 종양 내 1회 투여하였다. 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 3일 전부터 희생 1일 전까지 항암바이러스를 투여하는 날을 제외하고 1일 1회 복강 내 투여하였다.
실시예 5.2. 종양 크기 변화 확인
실시예 5.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 10일 동안 종양의 크기의 변화를 측정한 결과, 음성대조군 및 양성대조군의 마우스 종양의 크기가 5배 가까이 증가하는 반면, 실험군의 마우스의 종양의 크기는 3배 가까이 증가하는 것을 관찰하였다(도 7). 이를 통해, 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여하는 경우 각각의 약물을 단독투여하는 경우보다 항암효과가 우수한 것을 확인하였다.
VI. 마우스 유방암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스(OTS-412) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: 4T1 II
실시예 6.1. 마우스 유방암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 1x106 세포수의 4T1 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스(OTS-412)는 유방암세포주-식립 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다. 항암바이러스또한, 4T1 세포주-식립 마우스는 폐조직을 포함한 전신으로의 전이가 진행되는 동물모델이며, 일반적으로 종양 표면의 소결절(nodule)의 수로써 전이를 평가한다.
상기 제작한 마우스 유방암세포 식립 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다(n=5). 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며, 항암바이러스(OTS-412, 1x107 pfu) 또는 히드록시유레아(30 mg/kg)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스는 종양 내 첫 번째 투여한 뒤 7일째 두 번째 투여하였다. 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 3일 전부터 희생시키기 3일 전까지 항암바이러스를 투여하는 날을 제외하고 1일 1회 복강 내 투여하였다.
실시예 6.2. 종양 크기 변화 확인
실시예 6.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 21일째에 희생시켜 종양의 결절의 수를 계산한 결과, 항암바이러스만 투여받은 그룹의 마우스의 경우 결절의 수가 음성대조군에 비해 1.5배 많이 생성되었다. 반면, 실험군의 마우스의 경우 결절의 수가 0.5배로 현저히 적게 생성된 것을 확인하였다(도 8). 이를 통해 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여하는 경우 다른 장기로의 전이를 억제시키는 것을 확인한 것이다.
실시예 6.3. 반복투여에 의한 안전성 확인
실시예 6.1과 같은 마우스 유방암세포 식립 마우스 모델을 제조하고(n=10) 약물을 투여한 후 7일, 14일, 17일 및 21일차에 마우스의 체중을 측정하였다. 그 결과, 모든 군의 마우스 체중이 2주 뒤부터 감소하는 양상을 보였으나, 21일째 실험군의 마우스의 체중이 가장 높게 나타났다. 다른 세 군의 마우스의 경우에도 21일째 10% 내외로 체중이 감소하였다. 이를 통해, 항암바이러스를 반복 투여하고 히드록시유레아를 병용 투여하는 경우에도 안전한 것을 확인하였다(도 9).
VII. 마우스 유방암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스(OTS-412) 및 고용량의 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: 4T1 III
실시예 7.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 4T1 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 200 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스(OTS-412)는 4T1 세포주-식립 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다.
상기 제작한 마우스 유방암세포 식립 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며, 항암바이러스(OTS-412, 1x107 pfu) 또는 고용량의 히드록시유레아(90 mg/kg)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. 항암바이러스와 고용량의 히드록시유레아를 병용 투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스는 종양 내 1회 투여하였다. 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 3일 전부터 희생 1일 전까지 항암바이러스를 투여하는 날을 제외하고 1일 1회 복강 내 투여하였다.
실시예 7.2. 종양 크기 변화 확인
실시예 7.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 17일 동안 종양의 크기를 측정한 결과, 음성대조군 및 양성대조군의 마우스의 종양 크기가 3.5배 가까이 증가하는 반면, 실험군의 마우스의 종양 크기는 2.5배 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여할 경우, 항암바이러스 또는 히드록시유레아를 단독투여하는 경우보다 종양의 성장 항암효과 억제되는 것을 확인하였다(도 10).
또한, 28일째까지 각 군의 마우스의 생존율을 확인한 결과, 항암바이러스만 투여한 그룹의 마우스들은 21일째 모두 사망하였으며, 음성대조군의 경우 1마리가 생존하였다. 반면, 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹에서 가장 마지막까지 마우스가 생존하는 것을 확인하였다(도 11). 이를 통해, 고용량의 히드록시유레아와 항암바이러스의 병용 투여의 안전성 및 항암효과를 확인하였다.
VIII. 인간 폐암세포(NCI-H460) 식립 마우스에서의 항암바이러스(OTS-412) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인
실시예 8.1. 인간 폐암세포 식립 마우스 제조 및 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c nu/nu 마우스를 일주일의 적응기간을 거친 후에 1x106 세포수의 NCI-H460 폐암세포(한국세포주은행)로 이종이식(xenograft)를 수행하였다. 종양의 크기가 300 ㎜3 내지 400 ㎜3에 도달하였을 때 항암바이러스 투여를 시작하였다. 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스(OTS-412)는 폐암세포주-식립 마우스 모델에서 증식이 가능하다.
상기 제작한 인간 폐암세포 식립 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며, 히드록시유레아 또는 항암바이러스(OTS-412, 1x105 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. 항암바이러스와 히드록시유레아를(20 mg/kg) 복강내 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스 투여는 두 번에 걸쳐 시행되었고, 첫 번째 투여 후 5일 후 두 번째 약물 투여를 실시하였다. 히드록시유레아는 첫 번째 항암바이러스 투여 전날부터 희생되는 날까지 항암바이러스 투여하는 날을 제외하고 매일 1회 투여하였다.
실시예 8.2. 종양 크기 변화 확인
실시예 8.1에서 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 15일째에 희생시켜 종양의 크기를 측정한 결과, 음성대조군 및 양성대조군의 마우스의 종양 크기가 각각 11배, 9배, 7배로 급격히 증가하는 것을 관찰하였다. 반면, 실험군의 마우스의 종양 크기는 약 2.5배 증가하였고, 12일째부터는 감소하는 경향을 나타내었다(도 12). 이를 통해, 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여하는 경우, 항암바이러스만을 단독 투여하는 경부보다 종양의 성장 속도를 효과적으로 억제시키는 것을 확인하였다.
IX. 인간 대장암세포(HCT-116) 식립 마우스에서의 항암바이러스(OTS-412) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인
실시예 9.1. 인간 대장암세포 식립 마우스 제조 및 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c nu/nu 마우스(암컷, 7주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 2.5x106 세포수의 인간 대장암 세포주인 HCT-116 암세포주(한국세포주은행)로 이종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 20 ㎜3 내지 250 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다.
상기 제작한 인간 대장암세포 식립 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다(n=5). 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며, 히드록시유레아 또는 항암바이러스(OTS-412, 1x107 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. 항암바이러스와 히드록시유레아를(30 mg/kg) 복강내 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스 투여는 1회 투여되었고, 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 3일 전부터 희생되는 날까지 항암바이러스 투여하는 날을 제외하고 매일 1회 투여하였다. 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스(OTS-412)는 대장암세포주-식립 마우스 모델에서 증식이 가능하다.
실시예 9.2. 종양 크기 변화 확인
실시예 9.1에서 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 28일째에 희생시켜 종양의 크기를 측정한 결과, 음성대조군과 히드록시유레아만 투여받은 그룹의 마우스의 종양 크기가 11배로 급격히 증가하는 것을 관찰하였다. 항암바이러스를 단독으로 투여받은 그룹은 항암바이러스 투여 후 3일 후부터 종양의 크기가 서서히 감소하여 초기 종양의 크기로 유지되는 것을 확인하였다. 반면, 실험군의 경우에는 항암바이러스를 투여한 당일부터 종양의 크기가 서서히 감소하여, 항암바이러스 투여 후 14일째 초기 종양의 크기보다 줄어들기 시작하며, 28일째 거의 사라지는 것을 확인하였다(도 13). 특히, 실험군에서 28일째 2마리에서 완전 관해가 확인되었다(도 14 및 도 15).
X. 인간 대장암세포(HT-29) 식립 마우스에서의 항암바이러스(VV tk- )및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인
실시예 10.1. 인간 대장암세포(HT-29) 식립 마우스 제조 및 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c nu/nu 마우스(암컷, 7주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 인간 대장암 세포주인 HT-29 암세포주(한국세포주은행)로 이종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 150 ㎜3 내지 200 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다.
상기 제작한 인간 대장암세포 식립 마우스를 2개 그룹으로 분류하였고, 항암바이러스(OTS-412, 1x107 pfu)만 투여하는 그룹과 히드록시유레아(25 mg/kg)를 복강내 투여받는 그룹으로 나누어 8주 동안 수행하였다. 1주 내지 4주차 까지는 주당 2회씩 항암바이러스를 각 그룹에 투여하였다. 5주 및 7주 차에는 항암바이러스를 주 1회 투여하였으며, 6주 및 8주 차에는 항암바이러스를 두 그룹 모두 투여하지 않았다. 히드록시유레아는 6주부터 8주차까지 1일 1회 투여하였다. 한편, 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스(VVtk-)는 대장암세포주-식립 마우스 모델에서 증식이 가능하다.
실시예 10.2. 종양 크기, 종양 조직의 세포사멸 확인
8주차 마지막 날에 각 그룹의 마우스를 희생시켜 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 항암바이러스만을 투여한 그룹보다 항암바이러스 및 히드록시유레아를 투여한 그룹에서 종양의 크기가 감소하고 종양 조직의 상태가 호전된 것을 확인하였다(도 16).
또한, 수집한 종양 조직을 헤마톡실린 및 에오신을 이용하여 H&E 염색을 하였다. 이때, H&E 염색이 진하게된 부분은 살아있는 세포를 의미한다. 그 결과, 항암바이러스 및 히드록시유레아를 투여한 그룹의 경우 항암바이러스만을 투여한 그룹보다 전반적으로 종양의 크기가 작고, 진하게 염색된 부분이 적은 것을 확인하였다(도 16). 즉, 항암바이러스만을 투여한 대조군보다 항암바이러스 및 히드록시유레아를 병용 투여한 실험군에서 세포사멸 효과가 우수한 것을 확인하였다.
또한, 수집한 종양 조직을 H&E 염색 및 TUNEL 염색을 수행하여 분석하였다. 이때, H&E 염색이 진하게된 부분은 살아있는 세포를 의미하며, 형광 염색에서 항암바이러스는 적색 형광, 죽은 세포는 녹색 형광을 띤다.
그 결과, 항암바이러스 및 히드록시유레아를 병용 투여한 그룹의 종양 조직에서 사멸된 세포가 항암바이러스만을 투여한 그룹보다 더 많이 관찰되었다. 또한, 대조군의 경우 사멸된 세포와 항암바이러스의 염색 부위가 일치하므로 항암바이러스에 의한 암세포 사멸이 확인되었다. 반면, 항암바이러스 및 히드록시유레아를 병용 투여한 그룹의 경우 세포가 사멸된 부분과 항암바이러스의 염색 부위가 상이한 것을 확인하였다. 이는 항암바이러스 및 히드록시유레아를 병용 투여한 그룹에서는 항암바이러스가 감염되지 않은 암세포에서도 세포사멸이 나타나는 것을 확인한 것이다(도 17).
XI. 마우스신장암세포-식립-마우스에서의 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV1) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인
실시예 11.1. 마우스신장암세포(Renca) 식립 마우스 제조 및 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 마우스 신장암 세포주인 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 200 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 약물 투여를 시작하였다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 대조군으로 하였으며, 히드록시유레아 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV1, 1x106 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. HSV1와 히드록시유레아(30 mg/kg)를 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. HSV1은 히드록시유레아 투여 3일 후 종양 내 1회 투여되었고, 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 후 20일 동안 주 6회 복강 내 투여되었다.
실시예 11.2. 종양의 크기 변화 확인
실시예 11.1에서 각 군의 마우스에 약물을 투여한 당일, 3일째, 7일째, 10일째, 14일째, 17일째 종양의 크기 변화를 측정한 결과, 실험군의 종양의 크기가 가장 작은 것을 확인하였으며, 이를 통해, HSV1과 히드록시유레아를 병용 투여할 경우 항암바이러스만을 투여하는 경우보다 종양의 성장이 더 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 18).
XII. 마우스신장암세포-식립-마우스에서의 아데노바이러스(Adeono virus) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인
실시예 12.1. 마우스신장암세포(Renca) 식립 마우스 제조 및 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 마우스 신장암 세포주인 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 200 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 약물 투여를 시작하였다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며, 항암바이러스(Adeonovirus, 1x107 pfu)만 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. 아데노바이러스(1x107 pfu)와 히드록시유레아(30 mg/kg)를 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 아데노바이러스는 히드록시유레아 투여 3일 후 종양 내 1회 투여되었고, 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 후 16일 동안 주 6회 복강 내 투여되었다.
실시예 12.2. 종양의 크기 변화 확인
실시예 12.1에서 각 군의 마우스에 약물을 투여한 당일, 3일째, 7일째, 10일째, 14일째, 17일째 종양의 크기 변화를 측정한 결과, 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여받은 그룹의 종양의 크기가 가장 작은 것을 확인하였다. 이를 통해, 아데노바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여할 경우 항암바이러스만을 투여하는 경우보다 종양의 성장이 더 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 19).

Claims (11)

  1. 항암바이러스 및 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 증가된 항암 효과를 나타내는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 항암바이러스는 백시니아 바이러스(Vaccinia virus)로부터 유래되고, 백시니아 바이러스 자체의 티미딘 키나아제(Thymidine Kinase) 유전자가 결실되며, 이를 대신하여 허피스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나아제 유전자가 삽입된 것인, 증가된 항암 효과를 나타내는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 항암바이러스 및 상기 히드록시유레아가 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여되는 것을 특징으로 하는, 증가된 항암 효과를 나타내는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 항암바이러스가 1x105 pfu 내지 1x1010 pfu 용량으로 투여되는 것인, 증가된 항암 효과를 나타내는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 히드록시유레아가 0.1 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day 용량으로 투여되는 것인, 증가된 항암 효과를 나타내는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 증가된 항암 효과를 나타내는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 히드록시유레아가 항암바이러스 투여 전, 중 또는 후에 적어도 1회 투여되는 것인, 증가된 항암 효과를 나타내는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 히드록시유레아가 항암바이러스 투여 3일 내지 5일 전, 항암바이러스 투여 후 24시간 후부터, 1일 1회, 9일 내지 28일 동안 연속적으로 투여되는 것인, 증가된 항암 효과를 나타내는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 항암바이러스가 7일 내지 30일 간격으로 개체에 투여되는 것인, 증가된 항암 효과를 나타내는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 항암바이러스가 종양 내(intratumoral), 복강 내(intraperitoneal) 또는 정맥 내(intra-venous)로 투여되는 것인, 증가된 항암 효과를 나타내는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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