[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

WO2019039968A1 - Антитела для связывания имиглюцеразы и их применение в аффинной хроматографии - Google Patents

Антитела для связывания имиглюцеразы и их применение в аффинной хроматографии Download PDF

Info

Publication number
WO2019039968A1
WO2019039968A1 PCT/RU2018/000491 RU2018000491W WO2019039968A1 WO 2019039968 A1 WO2019039968 A1 WO 2019039968A1 RU 2018000491 W RU2018000491 W RU 2018000491W WO 2019039968 A1 WO2019039968 A1 WO 2019039968A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
imiglucerase
antibody
antibodies
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/RU2018/000491
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Роман Львович АНИСИМОВ
Владимир Михайлович СИМОНОВ
Сергей Александрович КАТОРКИН
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум"
Publication of WO2019039968A1 publication Critical patent/WO2019039968A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01045—Glucosylceramidase (3.2.1.45), i.e. beta-glucocerebrosidase

Definitions

  • the invention relates to industrial medical biotechnology and can be used in chromatographic purification of imiglucerase from culture fluids of a clone producer.
  • the invention also relates to sequences for single-chain Fv fragments (scFv) of an antibody, to their monovalent and bivalent (di-antibody) forms that are specific for human imiglucerase. Full-size antibodies obtained using these fragments also have the ability to communicate imiglucerase with high efficiency.
  • Antibodies or their fragments form complexes with imiglucerase, which can dissociate in the presence of 30 percent or more (v / v) of ethylene glycol or propylene glycol.
  • an immunosorbent was created for the isolation and purification of imiglucerase from culture liquids, the use of which allows to obtain a preparation of active imiglucerase from the culture fluid in one stage that does not contain contaminants detected by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the presented technical solution also relates to the creation of an improved method for the purification of imiglucerase using immunochromatography on a high affinity sorbent.
  • the invention also relates to sequences of isolated peptides having a high degree of affinity for imiglucerase.
  • Recombinant beta-glucocerebrosidase is an analogue of human lysosomal beta-glucocerebrosidase (synonyms: imiglucerase, beta-glucocerebrosidase, acid beta-glucosidase, alglucerase, glucosylceramidase).
  • Purified imiglucerase is a monomeric glycoprotein, which consists of 497 amino acid residues and an oligosaccharide component. Imiglucerase compensates for the functional deficiency of the enzymatic activity of beta-glucocerebrosidase.
  • Imiglucerase catalyzes the glycolipid glycolipid hydrolysis to glucose and ceramide and prevents the accumulation of glucocerebroside in macrophages, i.e. interferes with the formation of Gaucher cells.
  • Gaucher disease is the most common lysosomal storage disorder.
  • glucocerebrosidase which leads to the accumulation of glucocerebroside in many tissues, including the spleen, liver, kidneys, lungs, brain and bone marrow.
  • a ligand can be either a mono- or a polyclonal antibody or an antibody fragment.
  • Monoclonal antibodies have a number of significant advantages, for example, their monospecificity gives a high reproducibility of the chromatorgagic process, and the ligand can be reprocessed (Scopes, RK (1994) Protein Purification: Principles and Practice, 3rd edn. Springer- Verlag New York Inc., New York ).
  • monoclonal antibodies may be relatively sensitive to column sterilization procedures, which shorten the life of the column and contaminate the product with antibody fragments. Due to the potential immunogenicity of these fragments representing the foreign mouse protein, considerable effort is required at the process validation stage to confirm the purity of the product. Also, the method of obtaining producers of monoclonal antibodies in most cases makes it impossible to produce ligands with desired elution conditions. Thus, it seems logical to search for potential affinity ligands using phage display, in which candidates are selected under predetermined conditions (pH, ionic strength, non-denaturing target protein, elution conditions).
  • the resulting affinity ligands which are antibodies and antibody fragments, can be effectively reproduced in large quantities.
  • modern fermentation techniques suggest single-stranded antibody fragments (scFv) up to 1.2 g per liter (expression in E. coli), and full-length antibodies up to 5-12 g / l (expression in Chinese hamster oocytes) (Andre Frenzel, Michael Hust and Thomas Schirrmann (2013) Expression of Recombinant Antibodies. Front Immunol. 2013; 4: 217).
  • the objective of this invention was the development of antibodies or antibody fragments, suitable for creating highly effective immunosorbent for the industrial isolation of imiglucerase.
  • the developed molecules are human IgGl, or fragments thereof, which distinguishes them favorably from mouse monoclonal antibodies.
  • there is no immune response to potentially contaminating the drug antibody fragments and in the case of using single-chain fragments produced in E. coli, there is no theoretical the possibility of viral contamination.
  • Elution from the sorbent, created using these antibodies (antibody fragments) occurs under mild conditions, in the presence of from 30 to 60 percent ethylene glycol.
  • the essential feature of scFv and antibodies of the invention due to their primary structure, is their ability to specifically and at the same time reversibly bind imiglucerase in such a way that the complex dissociates in the presence of 30 percent or more (v / v) of ethylene glycol or propylene glycol. This property directly determines the obtaining of the technical result of the invention - highly efficient purification of imiglucerase from the culture fluid in one step, and also allows the use of the proposed scFv and antibodies in a wide range of biotechnological applications, including for various diagnostic purposes.
  • An antibody or antibody fragment for imiglucerase binding according to the invention contains a heavy chain variable fragment having amino acid sequences CDRH1, CDRH2, CDRH3, where the amino acid sequence of CDRH1 is selected from the group SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 37, the amino acid sequence of CDRH2 is selected from the group of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38; the amino acid sequence of CDRH3 is selected from the group of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 37, the amino acid sequence of CDRH2 is selected from the group of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO :
  • This antibody or antibody fragment contains a kappa or lambda light chain variable fragment having amino acid sequences CDRL1, CDRL2, CDRL3, where the amino acid the CDRLl sequence is selected from the group of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40; where the amino acid sequence of CDRL2 is selected from the group of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID): 41; the amino acid sequence of CDRL3 is selected from the group of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42.
  • the antibody or its fragment according to the invention is capable of forming a complex with imiglucerase, dissociating in the presence of 30 percent or more (/ y) of ethylene glycol or propylene glycol, which provides a number of technical results — the possibility of obtaining a specific complex with imiglucerase in the presence of a large amount of contaminants in the crude lysate; the possibility of non-specific interactions, and, accordingly, the possibility of purification of imiglucerase from a cell lysate in one stage of chromatographic purification and.
  • the antibody fragments presented in the present invention have an established amino acid sequence, on the basis of which Fv, scFv, Fab, F (ab ') fragments, diabetes, linear antibodies that can be combined with other amino acid sequences can be made, for example, targeting a sorbent with polylysin tag, various combinations of fragments, their dimers, trimers (diabodies, triates, tetratels, Bis-scFv, minitells, Fab2, Fab3) and so on. These fragments of the antigen-binding region of any antibody determine the specificity of its binding to the antigen.
  • Monovalent F (ab) fragments have one antigen-binding site, while bivalent F (ab ') 2 fragments have two antigen-binding regions that are linked by disulfide bonds.
  • the reduction of F (ab ') 2 fragments gives 2 monovalent Fab' fragments, which have a free sulfhydryl group, which is used for conjugation with other molecules.
  • the Fv fragment is the smallest fragment resulting from enzymatic cleavage of IgG and IgM class antibodies.
  • the Fv fragment has an antigen-binding site consisting of the VH and VK regions, but there are no CH1 and CL regions. Chains VH and VL are held together in the Fv fragment by non-covalent interactions.
  • scFv variable single-chain fragments
  • linker has a length of at least 12 residues
  • the ScFv fragments are mostly monomeric.
  • Linkers which are 3-11 residues in length, give ScFv molecules that cannot fold into the functional domain of Fv. These molecules bind to the second ScFv molecule, creating a bivalent diacell - dimer of the antibody fragment of the scFv format, "diabody”.
  • a diabody can also be bispecific (Bis-scFv), or it can be monospecific divalent. If the length of the linker is less than three residues, the scFv molecules combine into a tritel or tetratel. Multivalent scFvs have a greater functional affinity of binding to their target antigens than their univalent counterparts due to binding to two target antigens, which reduces the rate of dissociation of an antibody fragment.
  • Minitel are scFv-CH3 fusion proteins, which are assembled into bivalent dimers. Miniature scFv fragments can be generated with two different variable domains, which allows these Bis-scFv molecules to simultaneously bind to two different epitopes. Genetic methods.
  • Fab-dimers bispecific (Fab-dimers) and Fab2 trispecific Fab trimers (Fab3). These antibody fragments are able to bind to 2 (Fab2) or 3 (Fab3) with different antigens at once.
  • camelides nanobody
  • hcAb specific Heavy Chain Antibodies
  • the fab portion of these antibodies called VHH (the antibody heavy chain variable domain), is the smallest antigen-binding region found in nature. Nanobodies are recombinant VHH domains capable of binding antigens.
  • Nanobodies can also be expressed directly in vivo. Fragments have advantages over full-length antibodies for some purposes — for example, they are small enough to penetrate tissues that full-length antibodies cannot penetrate. This advantage is used in therapeutic and immunohistochemical procedures. Antibody fragments, as a rule, do not have glycosylation, which allows them to be produced in prokaryotic expression systems. The absence of the Fc domain is a significant advantage for primary antibodies used for immunohistochemical and other purposes, since they significantly reduce non-specific binding to the Fc receptor. Antibody fragments that do not have Fc regions have reduced non-specific binding. Nanobodies can also be used for co-immunoprecipitation or in combination with fluorescent proteins for real-time tracking of intracellular targets in living cells.
  • a full-length antibody including fragments disclosed in the present invention, as well as monovalent antibody fraFv fragments and their combinations, are similar.
  • the scFv fragments of a monovalent antibody and their combinations that do not have Fc-domains due to the smaller size of the molecule, better penetrate into the tissue in vivo and have a lower immunogenic effect when administered to humans for diagnostic purposes.
  • Figure 1 Sensogram accumulation of complexes ATl (mAb 2D4) -Ar (A) or AT2 (mAb 2L18) -Ar (B), obtained by the BLI method on Octet QKe. Ag was serially diluted from 900 nM in steps of 2 with a constant amount of immobilized AT.
  • Panel (C) represents the scheme of non-covalent oriented immobilization of AT onto the sensor surface.
  • Panel (D) presents the calculated constants of the rates of associations (ka), dissociations (kd), KD values, their errors (BCD error), calculated values of the maximum possible number of formed complexes (Rmax) and statistical parameter of the coefficient of determination (R2).
  • Figure 2 Sensogram accumulation of complexes ATl (mAb 2D4) -Ar (A) or AT2 (mAb 2L18) -Ar (B), obtained by the BLI method on Octet QKe, repeated cycles of adsorption-regeneration.
  • Figure 5 Chromatogram of the production of ceresima from serum-free QOL on 2L18Sepharose affinity sorbent.
  • Fig.7 Immuno-affinity purification of imiglucerase columns with 2D4 Sepharose and 2L18 Sepharose from medium with 4% FBS.
  • a native scFv library made on the basis of the phagemid pSEX81 (Progen) with a variety of about 10 9 was used ; E. coli strains XLIO-Gold and XL 1 -Blue (Stratagene) and TGI (Lucigen); primers for polymerase chain reaction (Evrogen), cell line CHO-k (ATCC® CCL-61 TM). Imiglucerase preparation was provided by JSC GENERIUM.
  • Linked phages 2 ml of AAcSE buffer 50 mM ammonium acetate, pH 6.0, 800 mM NaCl, 50% ethylene glycol (Applichem) were eluted.
  • the eluate was used to infect 40 ml of Escherichia coli XL 1 -blue that were in the exponential growth phase in 2YT medium (12.5 ⁇ / ⁇ tetracycline) at 37 ° C.
  • 2YT medium (12.5 ⁇ / ⁇ tetracycline
  • Library enrichment was determined by an increase in the number of clones grown on plates after infection with eluted phage particles and by an increase in signal in ELISA, where phage particles sorbed on immobilized imiglucerase were stained with anti-M13 antibodies (horseradish peroxidase (HRP)).
  • HRP horseradish peroxidase
  • the phagmid preparation from the enriched library was separated using centrifuge microcolumns using the standard procedure (Qiagen).
  • the scFv coding sequences were cut from the phagemid by Ncol / Notl sites and ligated into the pHOG expression vector at the same sites.
  • the ligase mixture transformed Escherichia coli TGI cells, after which individual clones were expanded to express scFv in 96 and 384-well plates.
  • Imiglucerase (3 was sorbed onto the surface of MAXISORP ELISA plates (Nunc). The plates were blocked with a solution of 2% skimmed milk in AAcTS buffer.
  • the culture fluids containing scFv were mixed 1: 1 with a solution of 2% skimmed milk in AAcTS buffer and applied to the wells in 2 After incubation with the culture liquid, plate 1 was washed for 30 minutes with AAcSE buffer, plate 2 - e AAcTS to identify specific binders eluted in 50% ethylene glycol. Detection was performed using 9E10 anti-c myc mAb and HRP-conjugated anti-mouse antibodies goats (abeam).
  • nucleotide sequences of positive clones were determined.
  • Example 3 Getting single-stranded fragments that bind imiglucerase. As a result of sequencing of the clones, the nucleotide sequences of 7 single-stranded fragments of scFv antibodies (2D4, 2C11, 2L18, 2E8, 2F9, 2D 11, 3B 12) were determined.
  • SEQ ID NO: 47 (scFv 2F9) MAQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLE WMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGDI YTAMDPGGGQGTLVTVSSKXSGSASAPKLEEGEFSEARVEIVMTQSPATLSVSPGER ATLSCRTSQSVDRKLSWYQQKPGQAPRLVIYDASKRASGIPARFTGSGSGTEFTLTIS SLQSEDSAIYYCQQYSTWPLSFGGGTKVEIKAAAGSEQ LISEEDLNSHHHHHHHH
  • Clone 2D4 was most common (about 50% of all clones).
  • Clones 2F9 and 2D11 had the identical amino acid sequence of the variable domain of the heavy chain (but different nucleotide) and different light chains.
  • 2L18 and SV12 had identical CDRH3. The remaining clones were unique and had no CDR homology (Table 1).
  • the scFv sequences were reformatted into light and heavy chains of full-length human IgGl, which were then cloned into an expression vector, expression from which was carried out under the control of the CMV promoter.
  • the resulting vectors were transfected with CHO cells (CHO-k cell line (ATCC® CCL-61 TM)); the productivity of stable clones was about 0.7 grams per liter of culture.
  • Antibodies from the culture fluid were isolated by affinity chromatography on MabSelect SuRe sorbent; A method for producing antibodies and fragments is described in detail in the instructions for the columns.
  • antibodies can be isolated by any currently known method. The same applies to the method of obtaining a sorbent for binding imiglucerase, carrying antibodies of a certain structure. It can be made according to the classical method known since 1979 (J. Biochem. 1979 Apr; 85 (4): 1091-8. Activation of Sepharose with epichlorohydrin for M & A, Mizuno Y, Seno N.), but it is also possible to use any alternative methods of covalently attaching proteins to the sorbent. The examples below confirm the high imiglucerase binding efficiency of antibodies produced according to the invention.
  • suitable vectors can be selected or constructed that contain adequate regulatory sequences, including promoter, terminator, enhancer, polyadenylation sequence, marker genes, and other suitable sequences.
  • Such vectors can be plasmids.
  • monovalent and divalent scFv fragments and their equivalent variants can be used in any method that requires the use of a peptide reagent that has the ability to reversibly bind imiglucerase with high affinity.
  • Addition affine way chromatography they can be used, for example, to create a diagnostic product included in the reagent kit, which, in addition to the specifically binding agent, includes one or more reagents to determine the level of binding of the specified agent to the cells or to imiglucerase, not related to the cells, discussed above.
  • affinity chromatography is based on the distinctive feature of biologically active substances to form stable, specific and reversible complexes.
  • a specific sorbent is obtained (the so-called "stationary phase" for its second component, if all the conditions necessary for the formation of this complex are met.
  • Chromatography can be carried out using various devices and devices, and even without them, by simple sorption macromolecules emitted from the mobile phase on a specific sorbent (which is often even disposable).
  • Example 5 Obtaining full-length antibodies based on single-stranded fragments.
  • human antibodies of the IgGl class were created, suitable for industrial production and retaining the ability to specifically form a complex with imiglucerase, dissociating in the presence of 30 percent or more of ethylene glycol:
  • SEQ ID NO: 50 (Heavy chain 2D4 IgGl)
  • SEQ ID NO: 51 Light chain 2D4 lambda
  • Determination of the binding constants of the developed antibodies was performed using the method of biolayer interferometry on the device Octet QKe according to the manufacturer's recommendations.
  • ProtA biosensors PALL corp
  • the standard buffer for SPR was PBSTB (10 mM Na-phosphate, 150 mM NaCl, 0.005% Tween-20, 0.01% BSA, pH 7.4).
  • the test antibody was immobilized on experimental sensors until the layer accumulation was 1 nm. for which, for 300 s at 1000 rpm, a parallel association of a series of 7 imiglucerase concentrations was carried out.
  • Example 7 Evaluation of the stability of full-length antibodies of the invention.
  • the columns with the sorbent prepared according to the present invention were attached to AKTA TM purifier 10 or AKTA TM rige 25 chromatographic systems and equilibrated with 10CV buffer A, flow rate 0.3 ml / min. Samples were applied to the column with the obtained affinity sorbents at a flow rate of 0.2 ml / min. The columns were washed (10CV buffer A, 20CV buffer B, flow rate 0.3 ml / min) and the adsorbed protein was eluted with buffer C at a flow rate of 0.2 ml / min.
  • the specific activity in imiglucerase preparations was determined using a chromogenic test using 4-nitrophenyl-B-0-glucopyranoside (Sigma) as a substrate.
  • the content of residual FBS proteins was assessed using Cygnus immunoassay kits (Bovine Serum Albumin (BSA) Assay and Bovine IgG Assay).
  • the content of residual FBS proteins is insignificant, about or less than 1% of the total protein in the eluate (Table 3).
  • Experiments with sorption of purified imiglucerase preparations on the columns showed a sorption capacity of the columns of about 1.8-2.7 mg imiglucerase per ml of sorbent (main peak, elution with buffer C). After 10 cycles of sorption-desorption, the column capacity remained the same; Imiglucerase activity in the eluate is fully preserved (Table 2).
  • Table 2 The capacity of the immunoaffinity columns and the activity of imiglucerase after elution from the sorbents (the activity of the original preparation is 40 u / ml).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены пептиды определенной последовательности, обладающие способностью с высокой эффективностью связывать имиглюцеразу. Антитела или их фрагменты, включающие в свой состав данные последовательности, образуют комплексы с имиглюцеразой, способные диссоциировать в присутствии 30 и более процентов (v/v) этиленгликоля или пропиленгликоля. На основе антител\фрагментов создан иммуносорбент для выделения и очистки имиглюцеразы из культуральных жидкостей, применение которого позволяет получить препарат активной имиглюцеразы из культуральной жидкости за одну стадию, не содержащий детектируемых с помощью электрофореза в полиакриламидном геле загрязнений.

Description

АНТИТЕЛА ДЛЯ СВЯЗЫВАНИЯ ИМИГЛЮЦЕРАЗЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В
АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Изобретение относится к промышленной медицинской биотехнологии и может найти применение при хроматографической очистке имиглюцеразы из культуральных жидкостей клона-продуцента. Изобретение относится также к последовательностям к одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv) антитела, к их моновалентным и двухвалентным (ди-антитело) формам, которые являются специфичными в отношении имиглюцеразы человека. Полноразмерные антитела, полученные с использованием данных фрагментов, также обладают способностью с высокой эффективностью связьшать имиглюцеразу. Антитела или их фрагменты образуют комплексы с имиглюцеразой, способные диссоциировать в присутствии 30 и более процентов (v/v) этиленгликоля или пропиленгликоля. На основе антител\фрагментов создан иммуносорбент для выделения и очистки имиглюцеразы из культуральных жидкостей, применение которого позволяет получить препарат активной имиглюцеразы из культуральной жидкости за одну стадию, не содержащий детектируемых с помощью электрофореза в полиакриламидном геле загрязнений. Представленное техническое решение относится также к созданию усовершенствованного способа очистки имиглюцеразы с применением иммунохроматографии на высокоаффинном сорбенте. Изобретение относится также к последовательностям выделенных пептидов, имеющих высокую степень аффинности к имиглюцеразе.
Рекомбинантная бета-глюкоцереброзидаза является аналогом лизосомальной бета-глюкоцереброзидазы человека (синонимы: имиглюцераза, бета- глюкоцереброзидаза, кислая бета-глюкозидаза, алглюцераза, глюкозилцерамидаза). Очищенная имиглюцераза представляет собой мономерный гликопротеин, в состав которого входят 497 аминокислотных остатков и олигосахаридный компонент. Имиглюцераза компенсирует функциональную недостаточность ферментативной активности бета-глюкоцереброзидазы. Имиглюцераза катализирует гидролиз гликолипида глюкоцереброзида до глюкозы и церамида и предупреждает накопление глюкоцереброзида в макрофагах, т.е. препятствует образованию клеток Гоше. Болезнь Гоше является самой распространённой из лизосомных болезней накопления. Развивается в результате недостаточности фермента глюкоцереброзидазы, которая приводит к накоплению глюкоцереброзида во многих тканях, включая селезёнку, печень, почки, лёгкие, мозг и костный мозг. В настоящее время, для лечения этой болезни применяются препараты генноинженерной глюкоцереброзидазы, самым распространенным из которых является церезим (Cerezyme®; Genzyme) (Patrick В Deegan and Timothy M Cox (2012) Imiglucerase in the treatment of Gaucher disease: a history and perspective. Drug Des Devel Ther. 2012; 6: 81-106). Отмечаются высокие расходы на производство этого препарата, что обуславливает его значительную стоимость. В связи с этим имеется необходимость в разработке новых эффективных подходов для очистки глюкоцереброзидазы, позволяющих за минимальное число стадий получить высокочистый и активный препарат.
Иммуноаффинная хроматография является широко распространенным подходом при очистке белков, дающим возможность получить высокочистые и концентрированные препараты даже из сложного стартового материала (Jack, G.W. & Beer, D.J. (1996) Immunoaffinity chromatography. Methods Mol. Biol. 59, 187-196). Лиганд -может быть как моно-, так и поликлональным антителом или же фрагментом антитела. Моноклональные антитела имеют ряд существенных преимуществ, так, их моноспецифичность дает большую воспроизводимость хроматоргафического процесса, а лиганд может быть наработан заново (Scopes, R.K. (1994) Protein Purification: Principles and Practice, 3rd edn. Springer- Verlag New York Inc., New York).
В настоящее время известен способ получения активной имиглюцеразы с помощью мышиных моноклональных антител (Aerts, J.M., Donker-Koopman, W.E., Murray, G.J., Barranger, J.A., Tager, J.M., Schram, A.W. (1986) A procedure for the rapid purification in high yield of human glucocerebrosidase using immunoaffinity chromatography with monoclonal antibodies. Anal. Biochem. l;154(2):655-63). Так же, разработано значительное число коммерческих моноклональных антител к имиглюцеразе, например, антитела производства Acris Antibodies и Aviva Systems Biology, но область применения данных антител ограничивается иммуногистохимией и аналитической биохимией, применение их в промышленной медицинской биотехнологии производителем не рассматривается.
Однако, хотя моноклональные антитела производятся для большого количества мишеней и могут потенциально рассматриваться как основной источник аффинных лигандов (Cutler, Р. (1996) Affinity chromatography. Methods Mol. Biol. 59, 157-168), ряд проблем, связанных с происхождением и природой этих антител, должны учитываться при обсуждении их использования в GMP производстве. Очищенные с их помощью мишени, предполагаемые для терапевтического использования, должны проходить процедуры вирусной инактивации для минимизации рисков вирусной контаминации продукта (Barrowcliffe, T.W. (1993) Viral inactivation vs. biological activity. Dev. Biol. Stand. 81, 125-135, Burton, S.J. (1996) Affinity chromatography: production and regulatory considerations. Am. Biotechnol. Lab. 14, 64-66). В дополнение, моноклональные антитела могут быть относительно чувствительны к процедурам стерилизации колонки, что приводит к укорачиванию жизни колонки и загрязнению продукта фрагментами антител. Из-за потенциальной иммуногенности этих фрагментов, представляющих чужеродный мышиный белок, необходимы значительные усилия на стадии валидации процесса для подтверждения чистоты продукта. Также сама методика получения продуцентов моноклональных антител в большинстве случаев делает невозможным целенаправленное получение лигандов с желательными условиями элюции. Таким образом, логичным представляется поиск потенциальных аффинных лигандов с помощью фагового дисплея, при котором отбор кандидатов ведется в заранее обозначенных условиях (рН, ионная сила, не денатурирующие целевой белок условия элюции).
Полученные аффинные лиганды, представляющие собой антитела и фрагменты антител, могут эффективно воспроизводиться в больших количествах. Так, современные методики ферментирования предполагают выход одноцепочечных фрагментов антител (scFv) до 1,2 г с литра (экспрессия в Е. coli), и полноразмерных антител до 5-12 г/л (экспрессия в ооцитах китайского хомячка) (Andre Frenzel, Michael Hust, and Thomas Schirrmann (2013) Expression of Recombinant Antibodies. Front Immunol. 2013; 4: 217).
Задачей данного изобретения являлась разработка антител или фрагментов антител, пригодных для создания высокоэффективного иммуносорбента для промышленного выделения имиглюцеразы. Разработанные молекулы являются человеческими IgGl, или же их фрагментами, что выгодно отличает их от мышиных моноклональных антител. В частности, отсутствует иммунная реакция на потенциально загрязняющие препарат фрагменты антител, а в случае использования одноцепочных фрагментов, продуцируемых в Е. coli, отсутствует теоретическая возможность вирусной контаминации. Элюция с сорбента, созданного с применением данных антител (фрагментов антител), происходит в мягких условиях, в присутствии от 30 до 60 процентов этиленгликоля. Данные условия известны как не оказывающие заметного денатурирующего влияния на имиглюцеразу (Murray G.J., Youle R.J., Gandy S.E., Zirzow G.C., Barranger J. A. (1985) Purification of beta-glucocerebrosidase by preparative-scale high-performance liquid chromatography: the use of ethylene glycol- containing buffers for chromatography of hydrophobic glycoprotein enzymes. Anal Biochem. 1985 Jun;147(2):301-10). Антитела не теряют своей связывающей способности при как минимум 50 актах сорбции/элюции, что делает возможным многократное использование сорбента. За одну стадию применение данного сорбента позволяет получить препарат активной, высокочистой имиглюцеразы из культуральной жидкости. Существенным признаком scFv и антител по изобретению, обусловленным их первичной структурой, является их способность специфично и в то же время обратимо связывать имиглюцеразу таким образом, что комплекс диссоциирует в присутствии 30 и более процентов (v/v) этиленгликоля или пропиленгликоля. Данное свойство непосредственно определяет получение технического результата изобретения - высокоэффективную очистку имиглюцеразы из культуральной жидкости в один этап, а также позволяет использовать предложеннные scFv и антитела в широком спектре биотехнологических применений, в том числе в различных диагностических целях.
Антитело или фрагмент антитела для связывания имиглюцеразы по изобретению содержит вариабельный фрагмент тяжелой цепи, имеющий аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2, CDRH3, где аминокислотная последовательностью CDRH1 выбрана из группы SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:37, аминокислотная последовательностью CDRH2 выбрана из группы SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:38; аминокислотная последовательность CDRH3 выбрана из группы SEQ
ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:39. Данное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный фрагмент легкой цепи каппа или лямбда, имеющий аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2, CDRL3, где аминокислотная последовательность CDRLl выбрана из группы SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:40; где аминокислотная последовательность CDRL2 выбрана из группы SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:35, SEQ ID ):41;где аминокислотная последовательность CDRL3 выбрана из группы SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:42. Антитело или его фрагмент по изобретению способны образовывать комплекс с имиглюцеразой, диссоцирующий в присутствии 30 и более процентов ( /у) этиленгликоля или пропиленгликоля, что обеспечивает получение ряда технических результатов - возможность получения специфического комплекса с имиглюцеразой в присутствии большого количества загрязнений в неочищенном лизате, устранение возможности неспецифических взаимодействий, и, соответственно, возможность очистки имиглюцеразы из клеточного лизата за одну стадию хроматографической очистки. Представленные в настоящем изобретении фрагменты антител имеют установленную аминокислотную последовательность, на основании которой можно составить Fv, scFv, Fab, F(ab') фрагменты, диабоди, линейные антитела которые могут быть скомбинированы с другими аминокислотными последовательностями, для ориентированной посадки на сорбент, например, с полилизиновым тагом, различные комбинации фрагментов, их димеры, тримеры (диатела, триатела, тетратела, Bis-scFv, минитела, Fab2, Fab3) и так далее. Эти фрагменты антиген-связывающего участка любого антитела определяют специфичность его связывания с антигеном. Моновалентные F(ab) фрагменты имеют один антиген-связывающий сайт, тогда как двухвалентные F(ab')2 -фрагменты имеют две антигенсвязывающие области, которые связаны дисульфидными связями. Уменьшение F(ab')2 фрагментов дает 2 моновалентных Fab' фрагмента, которые имеют свободную сульфгидрильную группу, которая используется для конъюгации с другими молекулами. Fv фрагмент - это наименьший фрагмент, получаемый в результате ферментативного расщепления антител класса IgG и IgM. Fv фрагмент имеет антиген-связывающий сайт, состоящий из областей VH и ВК, но отсутствуют СН1 и CL области. Цепи VH и VL удерживаются вместе в Fv фрагменте нековалентными взаимодействиями. б
Методы генной инженерии позволяют получать вариабельные одноцепочечные фрагменты (scFv), которые представляют собой фрагменты типа Fv и включают домены VH и VL, соединенные гибким пептидом. Когда линкер имеет длину по меньшей мере 12 остатков, фрагменты ScFv в основном мономерные. Манипуляция ориентации V-доменов и длины линкера создает различные формы молекул Fv. Линкеры, которые в длину 3-11 остатков, дают ScFv молекулы, которые не могут фолдировать в функциональный домен Fv. Эти молекулы связываются со второй молекулой ScFv, создавая двухвалентное диатело - димер фрагмента антитела формата scFv, "diabody". Диатело может быть и биспецифическое (Бис-scFv), а может и моноспецифическое дивалентное. Если длина линкера составляет менее трех остатков, молекулы scFv объединяться в тритела или тетратела. Мультивалентные scFv обладают большей функциональной аффинностью связывания со своими антигенами-мишенями, чем их аналоги одновалентные из-за связывания с двумя антигенами-мишенями, что уменьшает скорость диссоциации фрагмента антитела. Минитела представляют собой scFv-СНЗ слитые белки,- которые собираются в двухвалентные димеры. Миниатюрные фрагменты scFv могут быть сгенерированы с содержанием двух различных вариабельных доменов, что позволяет этим Бис-scFv молекулам одновременно связываться с двумя различными эпитопами. Генетические методы . также используются для создания биспецифических (Fab- димеров) и Fab2 триспецифических Fab тримеров (Fab3). Эти фрагменты антител способны связываться с 2 (Fab2) или 3 (Fab3) различными антигенами сразу. В дополнение, на основании данных о включении данных фрагментов в состав антитела, могут быть созданы камелидные антитела (нанотела, nanobody), которые содержат набор специфических Heavy Chain Antibodies (hcAb), исключительно состоящих из гомодимера тяжелых цепей и не имеют легких цепей. Fab часть этих антител называется VHH (вариабельный домен тяжелой цепи антитела), является наименьшей антиген-связывающей областью, найденной в природе. Нанотела представляют собой рекомбинантные домены из VHH, способные связывать антигены. Они очень стабильны и могут быть получены в огромном количестве с помощью традиционных систем, таких как бактерии и, таким образом, представляет собой перспективный инструмент для диагностических и терапевтических целей. Нанотела также могут быть экспрессированы непосредственно in vivo. Фрагменты имеют преимущества по сравнению с полноразмерными антителами для некоторых целей - например, они достаточно малы, чтобы проникать в ткани, в которые полноразмерные антитела не могут проникать. Это преимущество используется в терапевтических и иммуногистохимических процедурах. Фрагменты антител, как правило, не имеют гликозилирования, что позволяет их производить в прокариотических системах экспрессии. Отсутствие домена Fc является существенным преимуществом для первичных антител, используемых в иммуногистохимических и других целях, так как они значительно уменьшают неспецифическое связывание с рецептором Fc. Фрагменты антител не имеющие Fc- области, имеют редуцированное неспецифическое связывание. Нанотела могут быть использованы также для коиммунопреципитации или в сочетании с флуоресцентными белками для отслеживания в реальном времени внутриклеточных мишеней в живых клетках.
По своей способности к распознаванию имиглюцеразы человека in vitro и in vivo полноразменое антитело, включающее в свой состав раскрытые в настоящем изобретении фрагменты, равно как и фрагменты scFv моновалентного антитела и их комбинации, аналогичны. При этом фрагменты scFv моновалентного антитела и их комбинации, не имеющие Fc-доменов, за счет меньшего размера молекулы лучше проникают в ткани in vivo и оказывают меньшее иммуногенное действие при введении человеку в диагностических целях.
Краткое описание чертежей.
Фиг.1 Сенсограммы накопления комплексов ATl(mAb 2D4)-Ar (А) или AT2(mAb 2L18)-Ar (В), полученные методом BLI на Octet QKe. Аг серийно разводился от 900 нМ с шагом 2 при постоянном количестве иммобилизованного AT. Панель (С) представляет схему нековалентной ориентированной иммобилизации AT на поверхность сенсора. На панели (D) представлены вычисленные константы скоростей ассоциаций (ка), диссоциаций (kd), значения KD, их погрешности (BCD error), вычисленные значения максимально возможного количества образованных комплексов (Rmax) и статистический параметр коэффициента детерминации (R2). Фиг.2 Сенсограммы накопления комплексов ATl(mAb 2D4)-Ar (А) или AT2(mAb 2L18)-Ar (В), полученные методом BLI на Octet QKe, многократные циклы адсорбции-регенерации.
Фиг.З Хроматограмма препарата очищенной имиглюцеразы на 2L18 Sepharose. Фиг.4 Препарат имиглюцеразы до и после сорбции на колонках с 2D4
Sepharose и 2L18 Sepharose.
Фиг.5 Хроматограмма получения церезима из бессывороточной КЖ на аффинном сорбенте 2L18Sepharose.
Фиг.6 Иммуноаффинная очистка имиглюцеразы на колонках с 2D4 Sepharose и 2L 18 Sepharose из безсывороточной среды.
Фиг.7 Иммуноаффинная очистка имиглюцеразы на колонках с 2D4 Sepharose и 2L18 Sepharose из среды с 4% FBS.
Все использованные штаммы бактерий, плазмиды, праймеры полимеразной цепной реакции (ПЦР), рекомбинантные белки, а также клеточная линия, продуцирующая антитела, коммерчески доступны.
В настоящем исследовании использовалась нативная scFv библиотека сделанная на основе фагмиды pSEX81 (Progen) с разнообразием примерно 109; штаммы Е. coli XLIO-Gold и XL 1 -Blue (Stratagene) и TGI (Lucigen); праймеры полимеразной цепной реакции (Евроген), клеточная линия CHO-k (АТСС® CCL- 61™). Препарат имиглюцеразы был предоставлен АО ГЕНЕРИУМ.
Все последовательности, включение которых в состав антитела обеспечивало его связывание с имиглюцеразой, были найдены методом фагового дисплея.
Пример 1. Фаговый дисплей.
Селекции проводились в Maxisorb Immunotubes (Nunc, Wiebaden, Germany) с адсорбированной на поверхности имиглюцеразой (АО ГЕНЕРИУМ) и заблокированных раствором 2% обезжиренного молока в буфере AAcTS (50 mM аммония ацетата, рН 6.0, 800 гаМ NaCl и 0,1% Tween 80). Для каждой селекции, приблизительно 10 фаговых частиц заблокированных в буфере AAcTS с 2% обезжиренного молока, добавлялись в иммунотьюбы и инкубировались при постоянном вращении в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем, раствор удалялся и иммунотьюбы промывались 10 раз в AAcTS. Связавшиеся фаги элюировались 2 мл буфера AAcSE (50 mM аммония ацетата, рН 6.0, 800 mM NaCl, 50% этиленгликоля (Applichem)). Элюат использовался для инфицирования 40 ml Escherichia coli XL 1 -blue находившихся в экспоненциальной фазе роста в среде 2YT (12.5 μ /ϊϊύ tetracycline) при 37° С. Для продукции фаговых частиц, эти клетки после рассева на чашки дополнительно заражались хелперным фагом М13К07 (Thermo Fisher Scientific) и инкубировались 10-12 часов при 30°С.
Обогащение библиотек определялось по увеличению числа клонов, выросших на чашках после заражения элюированными фаговыми частицами и по увеличению сигнала в ИФА, где сорбировавшиеся на иммобилизованной имиглюцеразе фаговые частицы прокрашивались анти-М13 антителами мечеными пероксидазой хрена (HRP) (Sigma).
Пример 2. Скрининг клонов.
Препарат фагмид из обогащенной библиотеки выделялся с помощью центрифужных микроколонок по стандартной методике (Qiagen). Последовательности, кодирующие scFv, вырезались из фагмид по сайтам Ncol/Notl и лигировались в экспрессионный вектор pHOG по тем же сайтам. Лигазной смесью трансформировались клетки Escherichia coli TGI, после чего отдельные клоны наращивались для экспрессии scFv в 96 и 384- луночных плашках. Имиглюцераза (3 сорбировалась на поверхность MAXISORP ИФА планшетов (Nunc). Планшеты блокировались раствором 2% обезжиренного молока в буфере AAcTS. Культуральные жидкости, содержащие scFv, смешивались 1:1 с раствором 2% обезжиренного молока в буфере AAcTS и вносились в лунки планшетов в 2 повторах. После инкубации с культуральной жидкостью планшет 1 промывался 30 мин с буфером AAcSE, планшет 2 - е AAcTS для выявления специфических байндеры, элюирующихся в 50% этиленгликоле. Детекция осуществлялась с использованием 9Е10 anti-c myc mAb и HRP-коньюгированными anti-mouse антителами козы (Abeam).
Для дальнейшей оценки разнообразия определялись нуклеотидные последовательности позитивных клонов.
Пример 3. Получение одноцепочечных фрагментов, связывающих имиглюцеразу. В результате секвенирования клонов были определены нуклеотидные последовательности 7-ми одноцепочных фрагментов антител scFv (2D4, 2С11, 2L18, 2Е8, 2F9, 2D 11, 3В 12).
SEQ ID NO:43 (scFv 2D4)
MAEVQLLETGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWV AVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARARIGY SSSWYFFGAFDIWGQGTMVTVSSKLSGSASAPKLEEGEFSEARVQPVLTQPPSMSV TPGQTARITCGGSKVGGNFVHWYQQKPGQAPLLVVYDDGDRPSGIPERFSGSKFGN TATLIITGVEAGDEAVYHCQVWDSITDFVFGGGTKVTVLAAAGSEQKLISEEDLNS HHHHFffl
SEQ ID NO:44 (scFv 2C11)
MAQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWM GGIIPIFGTA TYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTTYYDFW SGLAGWGQGTLVTVSSKLSGSASAPKLEEGEFSEARVDIQVTQSPSSLSASVGDRVT ITCRTSQSISSYLNWYQQI PGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ PEDFATYYCQQSYSTRFTFGPGTKVDI AAAGSEQKLISEEDLNSHHHHHH
SEQ ID NO:45 (scFv 2L18)
MAQVQLVQSGSELKKPGASV VSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEW MGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSL AEDTAVYYCARAVAGI GYGMDVWGQGTTVTVSSKLSGSASAP LEEGEFSEARVDIRMTQSPSSVSASVGDR VTITCRASQDISSWLAWYQQKPGNPPKLLIYGASNLQPGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQANSFPITFGQGTRLEIKAAAGSEQKLISEEDLNSHHHHHH
SEQ ID NO:46 (scFv 2E8)
MAQVAAAVRSRMEKPWQTLSLTCAISGDSVSSNTATWNWIRQSPSRGLEW LGRTYYRSKWSVDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARISGSN HVWGQGTTVTVSS LSGSASAPKLEEGEFSEARVQSVLTQPASVSGSPGQSITISCT GTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVTKRPSGISNRFSGF SGNTASLTVSG LQAEDEADYYCSSYAGQQQFGSVRRRDQAHVLAAAGSEQKLISEEDLNSHHHHHH
SEQ ID NO:47 (scFv 2F9) MAQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLE WMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGDI YTAMDPGGGQGTLVTVSSKXSGSASAPKLEEGEFSEARVEIVMTQSPATLSVSPGER ATLSCRTSQSVDRKLSWYQQKPGQAPRLVIYDASKRASGIPARFTGSGSGTEFTLTIS SLQSEDSAIYYCQQYSTWPLSFGGGTKVEIKAAAGSEQ LISEEDLNSHHHHHH
SEQ ID NO:48 (scFv 2D11)
MAQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLE WMGWINPNSGGTNYAQK-FQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGDI YTAMDPGGGQGTLVTVSSKLSGSASAPKLEEGEFSEARVQPVLTQPPSVSVAPGQT ARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPGVFGGGTKLTVLAAAGSEQKLISEEDLNSHHH HFffl
SEQ ID NO:49 (scFv 3B12)
MAQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGESFSGYYWSWIRQPPGKGLEWI GEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARRPYSSSWY GSYFDYWGQGTLVTVSSKLSGSASAPKLEEGEFSEARVSYELTQPPSVSVSPGQTAS ITCSGDKLGNRYVSWYQQKPGQSPVLVIYQDTKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGT QAMDEADYYCQAWDSSTVYVFGPGTKLTVLAAAGSEQKLISEEDLNSHHHHHH
Клон 2D4 встречался наиболее часто (около 50% всех клонов). Клоны 2F9 и 2D11 имели идентичную аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (но отличающуюся нуклеотидную) и разные легкие цепи. 2L18 и ЗВ12 имели идентичный CDRH3. Остальные клоны были уникальны и не имели гомологии по CDR (Табл.1).
Таблица 1. Последовательности CDR тяжелой и легких цепей найденных scFv (одноцепочных фрагментов антител).
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
Специалистам известны различные способы экспрессии антител и фрагментов антител как в прокариотических клетках, таких как E.coli, (Pluckthun А. Bio/Technology 9:545-551, 1991; Gavilondo J, Larrick J.W. Biotechniques 29:128-132, 134-136, 2000), так и в культурах клеток высших эукариот (Reff М.Е. Curr Opinion Biotech. 4:573-576, 1993; Trill J.J. et al., Curr. Opinion Biotech 6:553-560, 1995). В данном случае, для получения аффинных лигандов была выбрана экспрессия в культуре эукариотических клеток. Для этого последовательности scFv были переформатированы в лёгкие и тяжелые цепи полноразмерных человеческих IgGl, которые были затем клонированы в экспрессионный вектор, экспрессия с которого осуществлялась под контролем CMV промотора. Полученными векторами были трансфецированы клетки СНО (клеточная линия CHO-k (АТСС® CCL-61™)); продуктивность стабильных клонов составила около 0,7 грамма с литра культуры. Антитела из культуральной жидкости были выделены с помощью аффинной хроматографии на сорбенте MabSelect SuRe; способ получения антител и фрагментов детально описан в инструкциях к колонкам
(https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1353507 40364/litdoc28940348_20161014190936.pdf). Так же, антитела могут быть выделены любым известным в настоящее время способом. То же самое относится к способу получения сорбента для связывания имиглюцеразы, несущего антитела определенной структуры. Он может быть сделан по классической методике, известной с 1979 года (J.Biochem. 1979 Apr;85(4):1091-8. Activation of Sepharose with epichlorohydrin and subsequent immobilization of ligand for affinity adsorbent. Matsumoto I, Mizuno Y, Seno N.), но так же возможно использование любых альтернативных методик ковалентной пришивки белков к сорбенту. Приведенные ниже примеры подтверждают высокую эффективность связывания с имиглюцеразой антител, полученных согласно изобретению.
Обладая знаниями о последовательностях CDR, обеспечивающих высокую аффинность к имиглюцеразе антител, несущих их в своем составе, и общего знания современного уровня техники квалифицированный специалист может сконструировать антитело любого известного к настоящему времени формата, включающее любую из раскрытых аминокислотных последовательностей, любым удобным способом наработать его в прокариотах или эукариотах, почистить, пришить на сорбент и провести хроматографическую очистку имиглюцеразы в указанных условиях. Так как моновалентные и двухвалентные фрагменты scFv и их эквивалентные варианты согласно изобретению могут быть получены посредством экспрессии кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты, последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует любую из полипептидных молекул, описанных выше, является частью настоящего изобретения, также как и способ экспрессии такой нуклеиновой кислоты. Для рекомбинантной экспрессии моновалентного и двухвалентного scFv и его эквивалентных вариантов могут быть выбраны или сконструированы подходящие векторы, содержащие адекватные регуляторные последовательности, включая промотор, терминатор, энхансер, последовательность полиаденилирования, маркерные гены и другие подходящие последовательности. Такими векторами могут быть плазмиды. Многие известные протоколы и методы модификации нуклеиновых кислот, например получение конструкций нуклеиновых кислот, полимеразная цепная реакция, мутагенез, секвенирование, введение ДНК в клетки, экспрессия генов, анализ белка и т.п., подробно описаны в нескольких руководствах, таких, например, как, Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, или Short Protocols in Molecular Biology, Second edition, Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, 1992 или Erlich HA PCR Technology, Stockton Press, 1989.
После их продуцирования моновалентные и двухвалентные фрагменты scFv и их эквивалентные варианты могут быть использованы в любом способе, требующем применения пептидного реагента, обладающего способностью с высокой аффинностью обратимо связывать имиглюцеразу. Помимо способа аффинной хроматографии они могут быть использованы, например, для создания диагностического продукта, включенного в набор реагентов, который, помимо специфически связьтающегося агента, включает в себя один или несколько реагентов для определения уровня связывания указанного агента с клетками или с имиглюцеразой, не связанной с клетками, как обсуждалось выше.
Другие аспекты настоящего изобретения и способы их осуществления очевидны каждому специалисту. Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приводятся примеры, которые не должны рассматриваться как ограничение его притязаний и объема.
Пример 4. Аффинная хроматография имигюцеразы.
В основе принципа аффинной хроматографии лежит отличительная особенность биологически активных веществ образовывать стабильные, специфические и обратимые комплексы. При иммобилизации одного из компонентов комплекса получается специфический сорбент (так называемая "неподвижная фаза" для второго его компонента, если соблюдаются все условия, необходимые для образования этого комплекса. Хроматография может быть проведена с использованием различных приборов и приспособлений и даже без них, путем простой сорбции макромолекулы, выделяемой из подвижной фазы, на специфическом сорбенте (который часто бывает даже одноразового употребления).
Очищенные полноразмерные антитела по изобретению или scFv пришивали на сефарозу (Sepharose 6В, GE Healthcare), активированную эпихлоргидрином. На 1 мл сефарозы в среднем можно пришить около 10 мг белка (количество оценивалось по разнице концентрации антител в растворе до и после пришивки).
В работе использовались следующие буферные растворы: PBS, рН 7.4 (Буфер
А), 20 mM NaP, 1М NaCl, рН 7.4 (Буфер В), 20 тМ NaP, 1М NaCl , 60% этиленгликоль рН 6.0 (Буфер С).
Пример 5. Получение полноразмерных антител на основе одноцепочечных фрагментов.
На основе одноцепочечных фрагментов 2D4 и 2L18 были созданы человеческие антитела класса IgGl, пригодные для промышленного производства и сохранившие способность специфично формировать комплекс с имиглюцеразой, диссоциирующий в присутствии 30 и более процентов этиленгликоля:
SEQ ID NO:50 (Тяжелая цепь 2D4 IgGl)
EVQLLETGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAV ISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARARIGYSSS WYFFGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKJPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPE YKTTPPVLDSDGSFFLYS LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQ SLSLSPGK
SEQ ID NO:51 (Легкая цепь 2D4 лямбда)
QPVLTQPPSMSVTPGQTARITCGGSKVGGNFVHWYQQKPGQAPLLVVYDD GDRPSGIPERFSGSKFGNTATLIITGVEAGDEAVYHCQVWDSITDFVFGGGTKVTVL GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETT TPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO:52 (Тяжелая цепь 2L18 IgGl)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSC ASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMG WINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARAVAGIGY GMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIE TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV GFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:53 (Легкая цепь 2L18 каппа)
DIRMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSWLAWYQQKPGNPPKLLIYGAS NLQPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGQGTRLEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW VDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT SFNRGEC
Пример 6. Измерение аффинности антител.
Определение констант связывания разработанных антител проводили, используя метод биослойной интерферометрии на приборе Octet QKe согласно рекомендациям производителя. Биосенсоры protA (PALL corp) с иммобилизованным белком А согласно рекомендациям производителя. Стандартным буфером для SPR являлся PBSTB (10 мМ Na-фосфат, 150 мМ NaCl, 0.005%-ный твин-20, 0,01%-ный BSA, рН 7,4). Далее в стандартном буфере иммобилизовали на экспериментальные сенсоры исследуемое антитело до величины накопления слоя 1 нм. для чего в течение 300 сек при 1000 об/мин проводилась параллельная ассоциация серии из 7 концентраций имиглюцеразы. Далее после 600 секунд диссоциации сенсоры регенерировали 0,1 М GlyHCl, рН 2,0. Таким образом, с сенсоров удалялись как имиглюцеразаг так и исследуемое антитело, после чего цикл повторялся. Анализ сенсограмм проводили, используя программу ForteBio Data Analysis.
Измерения аффинности анти-имиглюцеразных антител показали специфическое связывание с имиглюцеразой. Оба антитела, 2D4 и 2L18, показали сходные константы диссоциации, 41.3 нМ и 12 нМ соответственно (Фиг. 1).
Пример 7. Оценка стабильности полноразмерных антител по изобретению.
Оценка стабильности антител проводилась на приборе Octet QKe аналогично процедуре, описанной ниже (Пример 8), с тем отличием, что отсутствовала стадия диссоциации, а регенерация проводилась в буфере AAcSE, при этом с сенсоров удалялась только имиглюцераза, но не антитела.
50-кратное повторение циклов адсорбции-регенерации не выявило заметного снижения антиген-связывающей способности антител (Фиг. 2).
Таким образом, антитела демонстрируют высокую стабильность в используемых условиях, что делает возможным многократное использование сорбента на их основе. Пример 8. Очистка имиглюцеразы аффинной хроматографией.
Индивидуальные связывающие имиглюцеразу антитела, полученные в результате селекций в фаговом дисплее, были присоединены к хроматографической матрице, и их связывающая емкость, сохранение активности, чистота и условия элюции были изучены. Данный пример иллюстрирует результат очистки имиглюцеразы раскрытым в изобретении способом.
Колонки с полученным по настоящему изобретению сорбентом были присоединены к хроматографическим системам АКТА™ purifier 10 или АКТА™ риге 25 и уравновешивались 10CV буфера А, скорость протока 0,3 мл/мин. Образцы наносились на колонку с полученными аффинными сорбентами при скорости протока 0.2 мл/мин. Колонки были промыты (10CV буфера A, 20CV буфера В, скорость протока 0,3 мл/мин) и адсорбированный белок элюировался буфером С при скорости протока 0,2 мл/мин.
Образцы, наносившиеся на аффинные колонки: имиглюцераза (АО «ГЕНЕРИУМ») с удельной активностью 40 ед/мг, концентрация белка 0.24 мг/мл в PBS с 2% этиленгликолем; безсывороточная среда с экспрессирующей имиглюцеразу культуры клеток (1,2 ед/мл активности); содержащая 4% FBS среда с экспрессирующей имиглюцеразу культуры клеток (1,6 ед/мл активности).
Исходные образцы и образцы, полученные в результате хроматографии белковых фракций, анализировались с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях.
Специфическая активность в препаратах имиглюцеразы определялась с помощью хромогенного теста с использованием 4-нитрофенил-В-0-глюкопиранозида (Sigma) в качестве субстрата.
Содержание остаточных белков FBS (BSA, иммуноглобулины) оценивалось с помощью иммуноферментных наборов Cygnus (Bovine Serum Albumin (BSA) Assay и Bovine IgG Assay).
Результат: Имиглюцераза как на 2D4 Sepharose, так и на 2L18 сходит одним четко выраженным пиком при элюции буфером С (Фиг.З).
Содержание остаточных белков FBS незначительно, около или менее 1% от общего белка в элюате (Табл.3). Эксперименты с сорбцией на колонки препарата очищенной имиглюцеразы показали сорбционную емкость колонок около 1.8-2.7 мг имиглюцеразы на мл сорбента (основной пик, элюция буфером С). После 10 циклов сорбции-десорбции емкость колонки осталась прежней; активность имиглюцеразы в элюате полностью сохраняется (Табл.2). Таблица 2. Емкость иммуноаффинных колонок и активность имиглюцеразы после элюции с сорбентов (активность исходного препарата— 40 ед/мл).
Figure imgf000020_0001
Таблица 3. Остаточные белки FBS в препаратах имиглюцеразы, полученных на колонках c.2D4 Sepharose и 2L18 Sepharose из среды с 4% FBS.
Figure imgf000020_0002
Протеолитическая деградация имиглюцеразы так же отсутствует, все фракции демонстрируют единственную широкую полосу, соответствующую гликозилированной имиглюцеразе (Фиг.4) Наработка имиглюцеразы культурой эукариотических клеток может происходить как в безсьюороточной среде, так и в среде, содержащей FBS, каждый из методов имеет свои преимущества и недостатки. В элюате, полученном из сред с экспрессионных культур (Фиг.5) видимые белковые примеси так же отсутствуют (Фиг.6, Фиг.7).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антитело или фрагмент антитела, образующее комплекс с имиглюцеразой человека, диссоциирующий в присутствии 30 и более процентов (v/v) этиленгликоля или пропиленгликоля.
2. Антитело или фрагмент антитела по п.1, антиген-связывающие фрагменты которого включают в себя Fv, scFv, Fab, F(ab') фрагменты, их комбинации, диабоди, линейные антитела.
3. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-2, которое является человеческим антителом или его фрагментом.
4. Антитело или фрагмент антитела по п.1, содержащее вариабельный фрагмент тяжелой цепи, имеющий аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2, CDRH3, где аминокислотная последовательность CDRH1 выбрана из группы SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:37;
аминокислотная последовательность CDRH2 выбрана из группы SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:38;
аминокислотная последовательность CDRH3 выбрана из группы SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:39.
5. Антитело или фрагмент антитела по п.1, содержащее вариабельный фрагмент легкой цепи каппа или лямбда, имеющий аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2, CDRL3,
где аминокислотной последовательностью CDRL1 является последовательность из группы SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:34, SEQ ID O:40;
где аминокислотной последовательностью CDRL2 является последовательность из группы SEQ ID NO:5, SEQ ID ΝΟ:11, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:41; где аминокислотной последовательностью CDRL3 является последовательность из группы SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:42.
6. Антитело или фрагмент антитела по п.1, антиген-связывающие фрагменты которых могут быть скомбинированы с другими аминокислотными последовательностями, для ориентированной посадки на сорбент.
7. Антитело или фрагмент антитела по п.1, где антиген-связывающие последовательности скомбинированы с полилизиновым тагом.
8. Способ хроматографической очистки имиглюцеразы, отличающийся тем, что неподвижная фаза включает носитель с иммобилизованными антителами и\шш их фрагментами по любому из пп.1-7.
9. Способ по п.8, где элюция с сорбента происходит в присутствии от 30 до 60 процентов этиленгликоля.
PCT/RU2018/000491 2017-08-25 2018-07-24 Антитела для связывания имиглюцеразы и их применение в аффинной хроматографии WO2019039968A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017130013A RU2676956C1 (ru) 2017-08-25 2017-08-25 Антитела для связывания имиглюцеразы и их применение в аффинной хроматографии
RU2017130013 2017-08-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019039968A1 true WO2019039968A1 (ru) 2019-02-28

Family

ID=65025135

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2018/000491 WO2019039968A1 (ru) 2017-08-25 2018-07-24 Антитела для связывания имиглюцеразы и их применение в аффинной хроматографии

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2676956C1 (ru)
WO (1) WO2019039968A1 (ru)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0401362B1 (en) * 1988-12-23 1996-05-29 Genzyme Corporation Cho cells producing enzymatically active recombinant glucocerebrosidase
EP3143875B1 (en) * 2009-10-19 2020-05-27 Amicus Therapeutics, Inc. Novel compositions for preventing and/or treating degenerative disorders of the central nervous system

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AERTS J. M. ET AL.: "A procedure for the rapid purification in high yield of human glucocerebrosidase using immunoaffinity chromatography with monoclonal antibodies", ANAL. BIOCHEM., vol. 154, no. 2, 1986, pages 655 - 663, XP024824226, DOI: doi:10.1016/0003-2697(86)90043-6 *
ARRUEBO M. ET AL.: "Antibody-ConjuE-Library, ESP@CENET, PatSearch, PATENTSCOPE, RUPTO, NCBI, EMBL-EBI, PubMed, USPTO gated Nanoparticles for Biomedical Applications", JOURNAL OF NANOMATERIALS, vol. 2009, XP055319844, Retrieved from the Internet <URL:http://dx.doi.org/10.1155/2009/439389> *
GUO Z. ET AL.: "Preparation and characterization of scFv for affinity purification of reteplase", J. BIOCHEM. BIOPHYS. METHODS, vol. 67, 2006, pages 27 - 36, XP024996768, DOI: doi:10.1016/j.jbbm.2005.12.007 *
MURRAY G. J. ET AL.: "Purification of beta-glucocerebrosidase by preparative-scale high-performance liquid chromatography: the use of ethylene glycol-containing buffers for chromatography of hydrophobic glycoprotein enzymes", ANAL BIOCHEM., vol. 147, no. 2, June 1985 (1985-06-01), pages 301 - 310, XP024818660, DOI: doi:10.1016/0003-2697(85)90276-3 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2676956C1 (ru) 2019-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Huse et al. Purification of antibodies by affinity chromatography
EP2170960B1 (en) Single-domain antigen-binding proteins that bind mammalian igg
ES2834967T3 (es) Purificación de proteínas
JP2019525925A (ja) アフィニティークロマトグラフィー洗浄バッファー
MX2011004558A (es) Procedimientos para la purificacion de moleculas de union a antigeno de un unico dominio.
US9018137B2 (en) Method for identification and purification of multi-specific polypeptides
CN107849122B (zh) 用低电导率洗涤缓冲液进行亲和层析纯化
TW201444863A (zh) 增加蛋白質之焦－麩胺酸形成的方法
AU2017298984A1 (en) Methods of purifying Fc-containing proteins
JP2020525445A (ja) カチオン交換クロマトグラフィーの洗浄緩衝液
JP7037148B2 (ja) ヒト血清由来ＩｇＧポリクローナル抗体の分離剤、及び、それを用いたヒト血清由来ＩｇＧポリクローナル抗体を分離する方法
CN114450406A (zh) 一种断裂型内含肽、使用其的重组多肽的制备方法
Abi-Ghanem et al. Immunoaffinity chromatography: a review
RU2676956C1 (ru) Антитела для связывания имиглюцеразы и их применение в аффинной хроматографии
Capela et al. Monoclonal antibodies—addressing the challenges on the manufacturing processing of an advanced class of therapeutic agents
JP2012072091A (ja) 抗体の精製方法
JP2016504337A (ja) イオン交換クロマトグラフィーを使用して高マンノースグリコフォームのレベルを制御する方法
JP7298607B2 (ja) 変異ｖｈｈ抗体を用いたアフィニティー担体
US20240248097A1 (en) Mass spectrometry-based characterization of antibodies co-expressed in vivo
US9499633B2 (en) Dabigatran antidotes
CN111356702A (zh) 抗pd-l1抗体及其抗原结合片段
Anisimov et al. Recombinant β-Glucocerebrosidase specific immunoaffinity ligands selected from phage-displayed combinatorial scFv libraries
CN116547303A (zh) Egfr结合复合物及其制备和使用方法
KR20230005847A (ko) 다가 면역글로불린 단일 가변 도메인의 생산 및 정제 방법
CN113444142A (zh) 精氨酸在疏水性蛋白离子交换层析纯化中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18847744

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18847744

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1