KR20230005847A

KR20230005847A - 다가 면역글로불린 단일 가변 도메인의 생산 및 정제 방법

Info

Publication number: KR20230005847A
Application number: KR1020227038044A
Authority: KR
Inventors: 플로리안 마두라; 소니아 르테스튀; 안 브리게; 톰 메르쉬에르; 엘렌 반 호렌; 차키브 보르살리
Original assignee: 아블린쓰 엔.브이.
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2023-01-10
Also published as: WO2021198260A1; AU2021246890A1; CN115397868A; JP2023519967A; IL296767A; TW202204423A; EP4126971A1; MX2022012278A; BR112022018364A2; US20230136595A1; CA3175873A1

Abstract

본 개시는 적어도 3개 또는 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드의 개선된 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 바람직하지 않은 산물-관련 입체형태 변이체가 감소되거나 부재하는 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드를 생산, 정제 및 단리하는 개선된 방법이 제공된다.

Description

다가 면역글로불린 단일 가변 도메인의 생산 및 정제 방법

1. 기술분야

본 출원은 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)의 생산 및 정제 분야에 관한 것이다.

본 출원은 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 산물-관련 입체형태 변이체가 감소되거나 부재하는 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드를 생산, 정제 및 단리하기 위한 개선된 방법이 제공된다. 이 방법에 따라 생산/정제된 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드는 산물-관련 입체형태 변이체가 감소되거나 부재하기 때문에 산물 균질성 측면에서 더 우수하다. 이는 예를 들어 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드의 치료 적용의 맥락에서 유리하다. 따라서 이 방법은 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 균질한 폴리펩티드의 제조를 제공하며, 증가된 균질성 및/또는 효능이 얻어진다. 따라서, 본 출원은 또한 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는, 치료 용도를 위한 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 개선된 조성물을 기재한다.

2. 배경 기술

치료 적용을 위해, 면역글로불린은 산물 품질이 매우 높아야 한다. 이를 위해서는 특히 구조적 측면에서 균질성이 필요하다. 또한, 생산 비용은 생산 공정 동안 직면하는 어려움에 크게 영향을 받는다. 낮은 수율 또는 균질성 부재는 생산 공정의 경제성에 영향을 미치며, 따라서 치료 비용 전반에 영향을 미칠 것이다. 예를 들어, 원하는 단백질로부터 원하는 단백질의 입체형태 변이체를 분리하는 것의 어려움은 복잡하고 비용이 많이 드는 정제 전략을 필요로 할 것이다.

다른 요구 사항 중에서, 치료 단백질은 완전히 기능적이어야 한다. 단백질 기능은 기타 요인 중에서 발효, 정제 및 보관 동안 단백질의 화학적 및 물리적 안정성에 의존한다. 화학적 불안정성은 특히 탈아미드화, 이성질체화, 라세미화, 가수분해, 산화, 피로글루타메이트 형성, 카바밀화, 베타 제거 및/또는 디설피드 교환에 의해 유발될 수 있다. 물리적 불안정은 항체 변성, 응집, 침전 또는 흡착에 의해 유발될 수 있다. 그 중 응집, 탈아미드화 및 산화가 항체 분해의 가장 일반적인 원인으로 알려져 있다(Cleland et al., 1993, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 307-377).

특히 시험관내 번역, 대장균(E. coli), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 차이니즈 햄스터 난소 세포, 곤충 세포에서의 배큘로바이러스 시스템 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함하는 광범위한 발현 시스템에 걸친 통상적 면역글로불린 및 이의 단편에 대해 기능적 산물의 적절한 수율을 얻는 것의 한계가 보고되었다(Ryabova et al., Nature Biotechnology 15: 79, 1997; Humphreys et al., FEES Letters 380: 194, 1996; Shusta et al., Nature Biotech. 16: 773, 1998; Hsu et al., Protein Expr.& Purif. 7: 281, 1996; Mohan et al., Biotechnol. & Bioeng. 98: 611, 2007; Xu et al., Metabol. Engineer. 7: 269, 2005; Merk et al., J. Biochem. 125: 328, 1999; Whiteley et al., J. Biol. Chem. 272: 22556, 1997; Gasser et al., Biotechnol. Bioeng. 94: 353, 2006; Demarest and Glaser, Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 11(5): 675-87, 2008; Honegger, Handb. Exp. Pharmacol. 181: 47-68, 2008; Wang et al., J. Pharm. Sci. 96(1): 1-26, 2007).

관찰된 이러한 어려움과는 대조적으로, 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)은 충분한 속도 및 수준으로 대장균과 같은 원핵생물 유기체, 피치아 파스토리스와 같은 하등 진핵생물 또는 CHO 세포와 같은 고등 진핵생물과 같은 상이한 숙주 세포에서 완전히 기능적인 형태로 용이하게 발현될 수 있다. 예를 들어 WO 2010/056550에 기재된 바와 같이 포유동물 세포(예를 들어 CHO 세포)와 같은 고등 진핵생물에서 ISVD의 생물약제 생산은 종종 저 pH 처리에 의한 하류 정제 공정에서의 바이러스 제거/불활성화를 필요로 한다. 효모와 같은 하등 진핵생물에서는 바이러스 불활성화 문제가 존재하지 않는다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 단일 가변 도메인에 의한 항원 결합 부위의 형성을 특징으로 하며, 이는 항원 인식을 위해 추가 도메인과의 상호작용을(예를 들어 VH/VL 상호작용의 형태로) 필요로 하지 않는다. 면역글로불린 단일 가변 도메인의 하나의 구체예로서 NANOBODY® ISVD의 생산은, 예를 들어 WO 94/25591에 광범위하게 기재되어 있다.

이러한 장점에도 불구하고, 구조적으로 균질한 ISVD 산물을 생산하는 데 있어서의 문제가 보고되었다. 예를 들어, WO 2010/125187에서 ISVD의 생산은 적어도 하나의 디설피드 가교가 없는 산물 관련 변이체가 동반될 수 있다는 것을 나타내었다. 더욱이, WO2012/05600은 적어도 하나의 카바밀화 아미노산 잔기를 포함하는 생산된 ISVD의 입체형태 변이체의 존재를 기재하고 있다.

그러나, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 구조적으로 균질하고 기능적인 ISVD 산물을 얻기 위한 추가적인 구체적 문제는 보고되지 않았다.

3. 요약

적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 다가 폴리펩티드 산물의 생산 공정 동안 산물 관련 입체형태 변이체가 관찰되었다. 숙주, 특히 효모와 같은 하등 진핵생물 숙주인 숙주에서 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 다가 폴리펩티드 산물의 생산 시 산물-관련 입체형태 변이체가 관찰되었다. 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 다가 폴리펩티드 산물의 입체형태 변이체가 숙주, 특히 효모와 같은 하등 진핵생물 숙주인 숙주에서 폴리펩티드의 발현으로부터 생성된다는 것이 밝혀질 수 있다. 본 발명자들은 본원에 제공된 바와 같은 분석용 SE-HPLC 및/또는 분석용 IEX-HPLC와 같은 특정 분석용 크로마토그래피 기술에 의해 산물-관련 입체형태 변이체를 확인할 수 있었다. 본 발명의 기술은 산물-관련 입체형태 변이체의 감소 또는 부재를 특징으로 하는, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 다가 폴리펩티드를 생산, 정제 및 단리하는 방법에 관한 것이다.

본 출원은 폴리펩티드 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 적어도 3개 또는 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드를 단리 또는 정제하는 방법을 제공하며, 방법은

a) 입체형태 변이체를 (원하는) 폴리펩티드로 전환시키는 조건을 적용하는 단계;

b) 입체형태 변이체를 제거하는 단계; 또는

c) (a) 및 (b)의 조합을 포함한다.

본 출원에 제공된 방법에 의해 단리/정제될 폴리펩티드는 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있다. 본 출원에 제공된 방법에 의해 단리/정제될 폴리펩티드는 CHO 세포가 아닌 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있다. 본 출원에 제공된 방법에 의해 단리/정제될 폴리펩티드는 효모와 같은 하등 진핵생물 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있다. 입체형태 변이체는 숙주, 특히 효모와 같은 하등 진핵생물 숙주인 숙주에서 폴리펩티드의 발현으로 초래된다. 비제한적으로, 효모는 피치아(Pichia)(코마가탤라(Komagataella)), 한세눌라(Hansenula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 토룰롭시스(Torulopsis), 토룰라스포라(Torulaspora), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 시테로마이세스(Citeromyces), 파키솔렌(Pachysolen), 데바로마이세스(Debaromyces), 메추니코위아(Metschunikowia), 로도스포리디움(Rhodosporidium), 류코스포리디움(Leucosporidium), 보트리오아스쿠스(Botryoascus), 스포리디오볼루스(Sporidiobolus), 엔도마이콥시스(Endomycopsis)일 수 있다. 한 양태에서, 본 출원에 제공된 방법에 의해 단리/정제될 폴리펩티드는 피치아, 특히 피치아 파스토리스에서의 발현에 의해 얻을 수 있다.

한 실시형태에서, 조성물의 입체형태 변이체 백분율(%)은 5% 이하로 감소된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물의 입체형태 변이체 백분율(%)은 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 예컨대 0.5%, 0.1% 또는 심지어 0% 입체형태 변이체로 감소된다.

본원에 기재된 방법에 의해 전환될 및/또는 제거될 입체형태 변이체는 보다 조밀한 형태를 특징으로 한다. 본원에 기재된 방법에 의해 전환될 및/또는 제거될 입체형태 변이체는 또한 감소된 수력학적 부피를 특징으로 한다. 입체형태 변이체의 조밀한 형태는 감소된 수력학적 부피로 인한 것일 수 있다. 입체형태 변이체는 또한 변경된 표면 전하 및/또는 표면 소수성을 특징으로 할 수 있다. 따라서 입체형태 변이체는 감소된 수력학적 부피, 변경된 표면 전하 및/또는 변경된 표면 소수성을 특징으로 할 수 있다. 어떠한 가설에도 구애받지 않고, 본원에 기재된 방법에 의해 전환될 및/또는 제거될 입체형태 변이체는 폴리펩티드에 존재하는 ISVD 빌딩 블록 사이의 약한 분자내 상호작용을 특징으로 하여, (원하는) 폴리펩티드와 비교하여 입체형태 변이체의 감소된 수력학적 부피, 변경된 표면 전하 및/또는 변경된 표면 소수성을 초래할 수 있다.

생물리적 매개변수의 상기 차이로 인해, 본원에 제공된 방법에 의해 전환될 및/또는 제거될 입체형태 변이체는 분석용 SE-HPLC 및/또는 분석용 IEX-HPLC와 같은 크로마토그래피 기술에 의해 구별될 수 있다. 따라서, 한 실시형태에서 본원에 제공된 방법에 의해 전환될 및/또는 제거될 입체형태 변이체는 폴리펩티드와 비교하여 SE-HPLC에서 증가된 체류 시간을 특징으로 한다. 또 다른 실시형태에서, 입체형태 변이체는 폴리펩티드와 비교하여 IEX-HPLC에서 변경된 체류 시간을 특징으로 한다. 또 다른 실시형태에서, 입체형태 변이체는 폴리펩티드와 비교하여 SE-HPLC에서 증가된 체류 시간 및 IEX-HPLC에서 변경된 체류 시간을 특징으로 한다.

한 양태에서, 입체형태 변이체는 적합한 조건을 적용함으로써 폴리펩티드로 전환되고, 입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키는 조건은 다음으로부터 선택된다:

i) 단리 및/또는 정제 공정의 단계에서 저 pH 처리의 적용;

ii) 단리 및/또는 정제 공정의 단계에서 무질서유발제의 적용;

iii) 단리 및/또는 정제 공정의 단계에서 열 스트레스의 적용; 또는

iv) i) 내지 iii) 중 임의의 것의 조합.

입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키기 위한 저 pH 처리는 입체형태 변이체를 포함하는 조성물의 pH를 약 pH 3.2 이하, 또는 약 pH 3.0 이하로 감소시키는 것을 포함한다. 한 양태에서, pH는 약 pH 3.2 내지 약 pH 2.1, 약 3.0 내지 약 pH 2.1, 약 pH 2.9 내지 약 pH 2.1, 약 pH 2.7 내지 약 pH 2.1, 또는 약 pH 2.6 내지 약 pH 2.3으로 감소된다. pH 처리는 입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키기 충분한 양의 시간 동안 적용된다. 본 출원에 제공된 교시를 고려하여 당업자는 입체형태 변이체의 폴리펩티드로의 전환이 경시적으로 증가한다는 것을 인식한다. 그러나, 적어도 약 1시간 동안과 같이 적어도 0.5시간 동안의 저 pH 처리 후에, 입체형태 변이체의 폴리펩티드로의 실질적인 유용한 수준으로의 전환이 이미 달성된다. 따라서, 한 양태에서, 저 pH 처리는 적어도 약 0.5시간 동안, 적어도 약 1시간 동안, 적어도 약 2시간 동안, 또는 적어도 약 4시간 동안 적용된다. 특정 양태에서, pH는 약 pH 3.2 내지 약 pH 2.1, 예컨대 약 pH 3.2, 3.0, 2.9, 2.7, 2.5, 2.3 또는 2.1로 감소된다. 또 다른 특정 양태에서, pH는 약 pH 3.0 내지 약 pH 2.1, 예컨대 약 pH 3.0, 2.9, 2.7, 2.5, 2.3, 또는 2.1로 감소된다. 또 다른 특정 양태에서, pH는 약 pH 2.9 내지 약 pH 2.1, 예컨대 약 pH 2.9, 2.7, 2.5, 2.3, 또는 2.1로 감소된다. 또 다른 특정 양태에서, pH는 약 pH 2.5 내지 약 pH 2.1, 예컨대 pH 2.5, pH 2.3, 또는 pH 2.1로 감소된다. 또 다른 특정 양태에서, pH는 적어도 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 1시간 동안 약 pH 3.2 이하로 감소된다. 예를 들어, pH는 적어도 약 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 약 1.0시간 동안 약 pH 3.2 내지 약 2.1로 감소된다. 또 다른 양태에서, pH는 적어도 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 1시간 동안 약 pH 3.0 이하로 감소된다. 예를 들어, pH는 적어도 약 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 1.0시간 동안 약 pH 3.0 내지 약 2.1로 감소된다. 또 다른 양태에서, pH는 적어도 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 1시간 동안 약 pH 2.9 이하로 감소된다. 예를 들어, pH는 적어도 약 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 1.0시간 동안 약 pH 2.9 내지 약 2.1로 감소된다. 또 다른 양태에서, pH는 적어도 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 1시간 동안 약 pH 2.7 이하로 감소된다. 예를 들어, pH는 적어도 약 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 약 1.0시간 동안 약 pH 2.7 내지 약 2.1로 감소된다. 또 다른 양태에서, 저 pH 처리는 적어도 1 pH 단위로 저 pH 처리에 사용되는 pH를 증가시킴으로써 종료된다. 한 실시형태에서, 단리/정제될 폴리펩티드는 피치아, 특히 피치아 파스토리스에서의 발현에 의해 얻을 수 있다.

또 다른 특정 양태에서, pH는 적어도 약 1시간 동안, 또는 적어도 약 2시간 동안 약 pH 2.5 이하로 감소된다. 또 다른 특정 양태에서, pH는 적어도 약 1시간 동안 약 pH 2.3 이하로 감소된다. 또 다른 양태에서, 저 pH 처리는 적어도 1 pH 단위로 저 pH 처리에 사용되는 pH를 증가시킴으로써 종료된다. 한 실시형태에서, 단리/정제될 폴리펩티드는 피치아, 특히 피치아 파스토리스에서의 발현으로부터 얻을 수 있다.

입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키기 위해 사용되는 저 pH 처리는 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 전에 또는 후에 적용될 수 있다. 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 전이란 저 pH 처리가 정제될 폴리펩티드를 갖는 조성물이 크로마토그래피 기술의 정지상에 적용되기 전에 적용된다는 것을 의미한다. 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 후란 저 pH 처리가 정제될 폴리펩티드가 크로마토그래피 기술의 정지상으로부터 용출된 후에 적용되는 것을 의미한다. 크로마토그래피 기술의 정지상은 수지 또는 막을 포함하는 크로마토그래피 컬럼과 같이, 사용되는 크로마토그래피 물질이다. 따라서, 저 pH 처리는 사용되는 크로마토그래피 기술의 정지상으로부터 폴리펩티드를 용출한 후에 적용될 수 있다. 저 pH 처리는 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계에서 얻은 용출액에 적용될 수 있다. 이 실시형태에서, 폴리펩티드는 크로마토그래피 기술의 정지상/크로마토그래피 물질에 결합되거나 이로부터 용출되지 않는다(즉, 여전히 접촉하고 있음). 이어서 용출 후, 얻은 용출액은 본원에 기재된 바와 같이 입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키기 충분한 양의 시간 동안 저 pH 처리로 조정된다. 따라서, 한 실시형태에서 저 pH 처리는 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계의 정지상으로부터 폴리펩티드의 용출 후에, 즉 용출액으로 적용된다. 한 실시형태에서, 단리/정제될 폴리펩티드는 피치아, 특히 피치아 파스토리스에서의 발현에 의해 얻을 수 있다.

입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키기 위한 저 pH 처리는 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 동안에도 적용될 수 있다. 정제 단계 동안이란 저 pH 처리가 정제될 폴리펩티드를 갖는 조성물이 크로마토그래피 기술의 정지상에 적용되는(즉, 정제될 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 크로마토그래피 기술의 정지상/크로마토그래피 물질과 접촉하는) 동안 적용된다는 것을 의미한다. 정제 단계 동안, 정제될 폴리펩티드를 갖는 조성물은 정지상/크로마토그래피 물질과 접촉할 수 있거나(예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피에서와 같이) 또는 (가역적으로) 정지상/크로마토그래피 물질에 결합될 수 있다(예를 들어, 친화도 크로마토그래피에서와 같이). 한 양태에서, 용출 완충액은 pH 2.5 이하의 pH를 갖는다. 일반적으로 용출액의 실제 pH는 저 pH 용출 완충액의 초기 pH보다 항상 높은 것으로 알려져 있다. 예를 들어, pH 3.0의 용출 완충액을 사용한 용출은 pH 3.8의 용출액 pH를 초래할 수 있다. 그 이유는 사용된 크로마토그래피 기술의 정지상에 존재하고 더 높은 pH를 갖는 잔류 유체(예를 들어 정지상의 보관, 평형화 또는 회수에 사용되는 완충액 유체 또는 폴리펩티드를 정지상에 결합시키기 위해 사용되는 완충액)가 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 동안 저 pH 처리에 사용된 저 pH 완충액과 혼합되기 때문일 수 있다. 따라서, 대안적으로, 용출 완충액은 폴리펩티드를 함유하는 생성 용출액이 pH 2.9 이하의 pH를 갖도록 하는 pH를 갖는다. 이러한 양태에서, 생성 용출액은 선택적으로 적어도 약 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 1시간 동안 pH 3.2 이하의 pH, 예컨대 pH 2.7로 조정된다. 한 실시형태에서, 단리/정제될 폴리펩티드는 피치아, 특히 피치아 파스토리스에서의 발현에 의해 얻을 수 있다.

본 출원에 제공된 교시를 고려하여, 당업자는 입체형태 변이체의 폴리펩티드로의 전환이 경시적으로 증가한다는 것을 인식한다. 그러나, 적어도 약 1시간 동안과 같이 적어도 0.5시간 동안의 저 pH 처리 후에 입체형태 변이체의 폴리펩티드로의 실질적으로 유용한 수준으로의 전환이 이미 달성된다. 한 양태에서, 용출액의 pH는 적어도 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 1시간 동안 약 pH 3.2 이하로 감소된다. 예를 들어, pH는 적어도 약 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 약 1.0시간 동안 약 pH 3.2 내지 약 pH 2.1로 감소된다. 또 다른 양태에서, 용출액의 pH는 적어도 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 1시간 동안 약 pH 3.0 이하로 감소된다. 예를 들어, pH는 적어도 약 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 약 1.0시간 동안 약 pH 3.0 내지 약 pH 2.1로 감소된다. 또 다른 양태에서, 생성 용출액의 pH는 적어도 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 1시간 동안 약 pH 2.9 이하로 감소된다. 예를 들어, pH는 적어도 약 0.5 시간 동안, 예컨대 적어도 1.0시간 동안 약 pH 2.9 내지 약 pH 2.1로 감소된다. 또 다른 양태에서, 생성 용출액의 pH는 적어도 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 1시간 동안 약 pH 2.7 이하로 감소된다. 예를 들어, pH는 적어도 약 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 약 1.0시간 동안 약 pH 2.7 내지 약 pH 2.1로 감소된다. 대안적으로, 폴리펩티드를 함유하는 생성 용출액의 pH는 pH 2.5 이하의 pH로 감소된다. 예를 들어, pH는 적어도 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 1시간 동안 pH 2.7 이하로 감소된다. 한 실시형태에서, 단리/정제될 폴리펩티드는 피치아, 특히 피치아 파스토리스에서의 발현에 의해 얻을 수 있다.

또 다른 양태에서, 저 pH 처리는 적어도 1 pH 단위로 저 pH 처리에 사용되는 pH를 증가시킴으로써 종료된다.

또 다른 양태에서, 입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키기 위한 저 pH 처리는 단백질 A 기반 친화도 크로마토그래피에 기반하는 정제 단계 동안 적용된다. 한 실시형태에서, 단리/정제될 폴리펩티드는 피치아, 특히 피치아 파스토리스에서의 발현에 의해 얻을 수 있다. 특정 양태에서, 크로마토그래피 기술은 단백질 A 기반 친화도 크로마토그래피이며, 용출 완충액은 약 pH 2.2의 pH를 갖고, 생성 용출액의 pH는 적어도 약 1.5시간 동안 약 pH 2.5의 pH로 조정된다.

한 양태에서, 저 pH 처리는 pH를 약 pH 5.5 이상으로 증가시킴으로써 종료된다. 더욱이, 한 양태에서, 저 pH 처리는 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 후에 적용된다. 또한, 한 양태에서, 저 pH 처리는 실온에서 적용된다.

또 다른 양태에서, 무질서유발제는 입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키기 위해 사용된다. 한 양태에서, 무질서유발제는 구아니디늄 하이드로클로라이드(GuHCl)이다. 한 양태에서, GuHCl은 적어도 약 1 M, 예컨대 약 1 M 내지 약 2 M의 최종 농도로 존재한다. 한 양태에서, GuHCl은 적어도 약 2 M의 최종 농도로 존재한다. 무질서유발제 처리는 입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키기 충분한 양의 시간 동안 적용된다. 한 양태에서, GuHCl은 적어도 0.5시간 동안, 또는 적어도 1시간 동안 적용된다. 무질서유발제 처리는 ISVD 폴리펩티드 산물을 무질서유발제가 결여된 새로운 완충 시스템으로 전달함으로써 종료된다. 한 양태에서, 무질서유발제 처리는 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 후에 적용된다. 한 양태에서, 무질서유발제는 실온에서 적용된다. 한 실시형태에서, 단리/정제될 폴리펩티드는 피치아, 특히 피치아 파스토리스에서의 발현에 의해 얻을 수 있다.

입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키기 위해 적용되는 열 스트레스는 입체형태 변이체를 포함하는 조성물을 약 40℃ 내지 약 60℃, 약 45℃ 내지 약 60℃, 또는 약 50℃ 내지 약 60℃에서 인큐베이션하는 것을 포함한다. 열 스트레스는 입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키기 충분한 양의 시간 동안 적용된다. 한 양태에서, 열 스트레스는 적어도 약 1시간 동안 적용된다. 열 스트레스는 온도를 실온까지 감소시킴으로써 종료된다. 한 양태에서, 열 스트레스는 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 후에 적용된다. 한 실시형태에서, 단리/정제될 폴리펩티드는 피치아, 특히 피치아 파스토리스에서의 발현에 의해 얻을 수 있다.

또 다른 양태에서, 입체형태 변이체는 상기 조건의 조합을 사용하여 폴리펩티드로 전환된다.

또 다른 양태에서, 입체형태 변이체는 하나 이상의 크로마토그래피 기술에 의해 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 다가 폴리펩티드를 포함하는 조성물로부터 제거된다. 한 양태에서, 크로마토그래피 기술은 수력학적 부피, 표면 전하 또는 표면 소수성에 기반하는 크로마토그래피 기술이다. 한 양태에서, 크로마토그래피 기술은 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 이온 교환 크로마토그래피(IEX), 양이온 교환 크로마토그래피(CEX), 혼합 모드 크로마토그래피(MMC), 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)이다. 한 실시형태에서, 단리/정제될 폴리펩티드는 피치아, 특히 피치아 파스토리스에서의 발현에 의해 얻을 수 있다.

추가의 양태에서, 입체형태 변이체는 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 다가 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 적어도 20 mg 단백질/ml 수지, 적어도 30 mg 단백질/ml 수지, 또는 적어도 45 mg 단백질/ml 수지의 로딩 인수를 사용하여 크로마토그래피 컬럼에 적용함으로써 제거된다. 이 양태의 한 실시형태에서, 크로마토그래피 컬럼은 단백질 A 컬럼이다. 한 실시형태에서, 단리/정제될 폴리펩티드는 피치아, 특히 피치아 파스토리스에서의 발현에 의해 얻을 수 있다.

또 다른 양태에서, 입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키는 조건 중 하나 이상이 단독으로, 또는 입체형태 변이체를 제거하는 하나 이상의 기술과 조합되어 적용된다.

적어도 3개 또는 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법이 또한 제공되며, 방법은

a) 입체형태 변이체를

i) 단리 및/또는 정제 공정의 단계에서 저 pH 처리를 적용하거나;

ii) 단리 및/또는 정제 공정의 단계에서 무질서유발제를 적용하거나;

iii) 단리 및/또는 정제 공정의 단계에서 열 스트레스를 적용하거나;

iv) i) 내지 iii) 중 임의의 것을 조합함으로써,

폴리펩티드로 전환시키는 단계로서,

조건은 본원에 추가로 기재된 바와 같은, 단계;

b) 본원에 추가로 기재된 바와 같이 입체형태 변이체를 제거하는 단계; 또는

c) a) 및 b)의 조합을 포함한다.

특히, 하기 실시형태가 제공된다:

실시형태 1. 폴리펩티드 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 적어도 3개 또는 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드를 단리 또는 정제하는 방법으로서,

a) 입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키는 조건을 적용하는 단계;

b) 입체형태 변이체를 제거하는 단계; 또는

c) (a) 및 (b)의 조합

을 포함하고, 선택적으로 단리 또는 정제될 폴리펩티드는 CHO 세포가 아닌 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있는, 방법.

실시형태 2. 실시형태 1에 있어서, 입체형태 변이체가 하등 진핵생물 숙주와 같은 CHO 세포가 아닌 숙주에서의 폴리펩티드의 발현으로부터 생산되는, 방법.

실시형태 3: 실시형태 1에 있어서, 단리 또는 정제될 폴리펩티드는 하등 진핵생물 숙주인 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있는, 방법.

실시형태 4: 실시형태 2 및 실시형태 3에 있어서, 하등 진핵생물 숙주가 피치아, 한세눌라, 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 칸디다, 토룰롭시스, 토룰라스포라, 스키조사카로마이세스, 시테로마이세스, 파키솔렌, 데바로마이세스, 메추니코위아, 로도스포리디움, 류코스포리디움, 보트리오아스쿠스, 스포리디오볼루스, 엔도마이콥시스와 같은 효모인, 방법.

실시형태 5. 실시형태 4에 있어서, 효모가 피치아 파스토리스와 같은 피치아인, 방법.

실시형태 6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 입체형태 변이체가 폴리펩티드와 비교하여 더 조밀한 형태를 특징으로 하는, 방법.

실시형태 7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 입체형태 변이체가 폴리펩티드와 비교하여 감소된 수력학적 부피를 갖는, 방법.

실시형태 8. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 입체형태 변이체가 폴리펩티드와 비교하여 SE-HPLC에서 증가된 체류 시간을 특징으로 하는, 방법.

실시형태 9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 입체형태 변이체가 폴리펩티드와 비교하여 IEX-HPLC에서 변경된 체류 시간을 특징으로 하는, 방법.

실시형태 10. 실시형태 9에 있어서, 입체형태 변이체가 폴리펩티드와 비교하여 IEX-HPLC에서 감소된 체류 시간을 특징으로 하는, 방법.

실시형태 11. 실시형태 9에 있어서, 입체형태 변이체가 폴리펩티드와 비교하여 IEX-HPLC에서 증가된 체류 시간을 특징으로 하는, 방법.

실시형태 12. 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 3개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 14. 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 3개의 ISVD, 4개의 ISVD, 또는 5개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 15. 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키는 조건이

i) 단리 및/또는 정제 공정의 단계에서 저 pH 처리의 적용으로서, 선택적으로 저 pH 처리는 조성물의 pH를 약 pH 3.2 이하, 또는 약 pH 3.0 이하로 감소시키는 단계를 포함하는, 적용;

ii) 단리 및/또는 정제 공정의 단계에서 무질서유발제의 적용으로서, 선택적으로 무질서유발제는 구아니디늄 하이드로클로라이드(GuHCl)인, 적용;

iii) 단리 및/또는 정제 공정의 단계에서 열 스트레스의 적용으로서, 선택적으로 40℃ 내지 약 60℃에서 입체형태 변이체를 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 적용; 또는

iv) i) 내지 iii) 중 임의의 단계의 조합

으로부터 선택되고, 임의의 조건이 입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키기 충분한 양의 시간 동안 적용되는, 방법.

실시형태 16: 실시형태 15에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되고, 저 pH 처리가 조성물의 pH를 약 pH 3.0 이하로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.

실시형태 17. 실시형태 15 및 실시형태 16에 있어서, pH가 약 pH 3.2 내지 약 pH 2.1, 약 pH 3.0 내지 약 pH 2.1, 약 pH 2.9 내지 약 pH 2.1, 또는 약 pH 2.7 내지 약 pH 2.1, 또는 약 pH 2.6 내지 약 pH 2.3으로 감소되는, 방법.

실시형태 18. 실시형태 17에 있어서, pH가 약 pH 3.0, 약 pH 2.9, 약 pH 2.8, 약 pH 2.7, 약 pH 2.6, 약 pH 2.5, 약 pH 2.4, 약 pH 2.3, 약 pH 2.2, 또는 약 pH 2.1로 감소되는, 방법.

실시형태 19. 실시형태 15 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 저 pH 처리가 적어도 약 0.5시간 동안, 적어도 약 1시간 동안, 적어도 약 2시간 동안, 또는 적어도 약 4시간 동안 적용되는, 방법.

실시형태 20. 실시형태 15 내지 19 중 어느 하나에 있어서, pH가 약 pH 2.5 이하로 감소되는, 방법.

실시형태 21. 실시형태 15 내지 19에 있어서, pH가 적어도 0.5시간 동안, 적어도 1시간 동안, 선택적으로 적어도 2시간 동안 약 pH 3.0 내지 약 pH 2.1로 감소되는, 방법.

실시형태 22. 실시형태 21에 있어서, pH가 약 pH 2.7 내지 약 pH 2.1로 감소되는, 방법.

실시형태 23. 실시형태 15 내지 19 중 어느 하나에 있어서, pH가 적어도 1시간 동안, 선택적으로 적어도 2시간 동안 약 pH 2.7 내지 약 pH 2.1로 감소되는, 방법.

실시형태 24. 실시형태 23에 있어서, pH가 적어도 1시간 동안, 선택적으로 적어도 2시간 동안 약 pH 2.6 내지 약 pH 2.3으로 감소되는, 방법.

실시형태 25. 실시형태 15 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 다가 폴리펩티드가 5개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 26. 실시형태 25에 있어서, pH가 약 pH 2.6 이하로 감소되는, 방법.

실시형태 27. 실시형태 25 및 26에 있어서, 저 pH 처리가 1 내지 2시간 적용되는, 방법.

실시형태 28. 실시형태 27에 따른 방법으로서, 폴리펩티드가 서열 번호 1로 구성되는, 방법.

실시형태 29. 실시형태 15 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 다가 폴리펩티드가 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 30. 실시형태 29에 있어서, pH가 약 pH 2.9 이하, 예컨대 약 pH 2.5로 감소되는, 방법.

실시형태 31. 실시형태 29 또는 30에 있어서, 저 pH 처리가 1 내지 2시간 적용되는, 방법.

실시형태 32. 실시형태 31에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 2로 구성되는, 방법.

실시형태 33. 실시형태 31에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 70 또는 서열 번호 71로 구성되는, 방법.

실시형태 34. 실시형태 15 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 다가 폴리펩티드가 3개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 35. 실시형태 34에 있어서, pH가 약 pH 3.0 이하, 예컨대 약 pH 2.5로 감소되는, 방법.

실시형태 36. 실시형태 34 및 35에 있어서, 저 pH 처리가 2 내지 4시간 적용되는, 방법.

실시형태 37. 실시형태 36에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 69로 구성되는, 방법.

실시형태 38. 실시형태 15 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 저 pH 처리가 적어도 1 pH 단위로, 적어도 2 pH 단위로, 또는 약 pH 5.5 이상으로 pH를 증가시킴으로써 종료되는, 방법.

실시형태 39. 실시형태 15 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 저 pH 처리가 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 전에 또는 후에 적용되는, 방법.

실시형태 40. 실시형태 39에 있어서, 저 pH 처리가 크로마토그래피 기술의 정지상에 조성물을 적용하기 전에 적용되는, 방법.

실시형태 41. 실시형태 39에 있어서, 저 pH 처리가 크로마토그래피 기술의 정지상으로부터 조성물을 용출한 후에 적용되는, 방법.

실시형태 42. 실시형태 15 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 저 pH 처리가 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 동안 적용되고, 정제될 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 크로마토그래피 기술의 정지상과 접촉하는, 방법.

실시형태 43. 실시형태 39 내지 42에 있어서, 크로마토그래피 기술이 단백질 A 기반 친화도 크로마토그래피인, 방법.

실시형태 44. 실시형태 43에 있어서, 크로마토그래피 기술이 단백질 A 기반 친화도 크로마토그래피이고, 용출 완충액이 pH 2.5 이하의 pH를 갖는, 방법.

실시형태 45. 실시형태 43에 있어서, 크로마토그래피 기술이 단백질 A 기반 친화도 크로마토그래피이고, 용출 완충액은 폴리펩티드를 함유하는 생성 용출액이 pH 2.9 이하의 pH를 갖도록 하는 pH를 갖는, 방법.

실시형태 46. 실시형태 43 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드를 함유하는 용출액의 pH가 선택적으로 적어도 약 1시간 동안 pH 3.2 이하의 pH, 예컨대 pH 3.0 이하의 pH 또는 pH 2.7 이하의 pH로 조정되는, 방법.

실시형태 47. 실시형태 43 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드를 함유하는 용출액의 pH가 선택적으로 적어도 약 1시간 동안 pH 2.5 이하의 pH로 조정되는, 방법.

실시형태 48. 실시형태 42에 있어서, 크로마토그래피 기술이 단백질 A 기반 친화도 크로마토그래피이고, 용출 완충액이 약 pH 2.2의 pH를 갖고, 폴리펩티드를 함유하는 용출액의 pH가 적어도 약 1.5시간 동안 약 pH 2.5의 pH로 조정되는, 방법.

실시형태 49. 실시형태 42 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 저 pH 처리 후 용출액의 pH가 적어도 1 pH 단위, 적어도 2 pH 단위로, 또는 약 pH 5.5 이상의 pH로 증가되는, 방법.

실시형태 50. 실시형태 15 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 저 pH 처리가 실온에서 적용되는, 방법.

실시형태 51. 실시형태 15 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 저 pH 처리에

a) 적절한 양의 1 M 아세트산나트륨(pH 5.5)을 조성물/용출액에 첨가하여 약 50 mM 아세트산나트륨의 최종 농도를 얻는 단계;

b) 조성물/용출액의 pH를 pH 5.5로 조정하는 단계; 및

c) 물을 사용하여 조성물/용출액의 전도도를 약 6 mS/cm 이하로 조정하는 단계가 뒤따르는, 방법.

실시형태 52. 실시형태 51에 있어서, b)에서의 pH가 NaOH로 조정되는, 방법.

실시형태 53. 실시형태 51 또는 52에 있어서, 폴리펩티드가 5개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 54. 실시형태 51 및 52에 있어서, 폴리펩티드가 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 55. 실시형태 54에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 2로 구성되는, 방법.

실시형태 56. 실시형태 15 내지 55 중 어느 하나에 있어서, GuHCl이 적어도 약 1 M, 또는 적어도 약 2 M의 최종 농도로 적용되는, 방법.

실시형태 57. 실시형태 15 내지 56에 있어서, GuHCl이 적어도 0.5시간 동안, 또는 적어도 1시간 동안 적용되는, 방법.

실시형태 58. 실시형태 56 및 57에 있어서, GuHCl이 적어도 0.5시간 동안 적어도 약 1 M의 최종 농도로 적용되는, 방법.

실시형태 59. 실시형태 58에 있어서, GuHCl이 0.5시간 내지 1시간 동안 적어도 약 1 M의 최종 농도로 적용되는, 방법.

실시형태 60. 실시형태 56 및 57에 있어서, GuHCl이 적어도 0.5시간 동안 약 2 M의 최종 농도로 적용되는, 방법.

실시형태 61. 실시형태 60에 있어서, GuHCl이 0.5시간 내지 1시간 동안 적어도 약 2 M의 최종 농도로 적용되는, 방법.

실시형태 62. 실시형태 56 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 63. 실시형태 61에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 1로 구성되는, 방법.

실시형태 64. 실시형태 61에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 2로 구성되는, 방법.

실시형태 65. 실시형태 15 또는 56 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 무질서유발제 처리가 실온에서 적용되는, 방법.

실시형태 66. 실시형태 15 또는 56 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 무질서유발제 처리가 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 전에 또는 후에 적용되는, 방법.

실시형태 67. 실시형태 66에 있어서, 폴리펩티드가 크로마토그래피 기술의 정지상으로부터 용출되고, 무질서유발제 처리가 생성 용출액에 적용되는, 방법.

실시형태 68. 실시형태 15 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 열 스트레스가 적어도 약 1시간 이상 동안, 또는 약 1 내지 4시간 동안 적용되는, 방법.

실시형태 69. 실시형태 68에 있어서, 열 스트레스가 약 40℃ 내지 약 60℃, 약 45℃ 내지 약 60℃, 또는 약 50℃ 내지 약 60℃에서 적용되는, 방법.

실시형태 70. 실시형태 68에 있어서, 열 스트레스가 약 40℃ 내지 약 55℃, 약 45℃ 내지 55℃, 또는 약 48℃ 내지 약 52℃에서 적용되는, 방법.

실시형태 71. 실시형태 68에 있어서, 열 스트레스가 약 50℃에서 적용되는, 방법.

실시형태 72. 실시형태 71에 있어서, 열 스트레스가 1시간 동안 약 50℃에서 적용되는, 방법.

실시형태 73. 실시형태 72에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 74. 실시형태 72에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 1로 구성되는, 방법.

실시형태 75. 실시형태 72에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 2로 구성되는, 방법.

실시형태 76. 실시형태 15, 또는 68 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 열 스트레스가 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 전에 또는 후에 적용되는, 방법.

실시형태 77. 실시형태 76에 있어서, 열 스트레스 처리가 크로마토그래피 기술의 정지상에 조성물을 적용하기 전에 또는 크로마토그래피 기술의 정지상으로부터 조성물을 용출한 후에 적용되는, 방법.

실시형태 78. 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 입체형태 변이체가 하나 이상의 크로마토그래피 기술에 의해 제거되는, 방법.

실시형태 79. 실시형태 78에 있어서, 입체형태 변이체가 하나 이상의 크로마토그래피 기술에 의해 제거되기 전에 SE-HPLC 및 IEX-HPLC와 같은 분석용 크로마토그래피 기술에 의해 확인된, 방법.

실시형태 80. 실시형태 78 및 79에 있어서, 크로마토그래피 기술이 수력학적 부피, 표면 전하 또는 표면 소수성에 기반하는 크로마토그래피 기술인, 방법.

실시형태 81. 실시형태 80에 있어서, 크로마토그래피 기술이 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 이온 교환 크로마토그래피(IEX), 혼합 모드 크로마토그래피(MMC) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 중 임의의 것으로부터 선택되는, 방법.

실시형태 82. 실시형태 81에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피(IEX)가 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)인, 방법.

실시형태 83. 실시형태 81에 있어서, HIC가 HIC 컬럼 수지에 기반하는, 방법.

실시형태 84. 실시형태 83에 있어서, HIC 수지가 Capto 페닐 ImpRes, Capto 부틸 ImpRes, 페닐 HP, 및 Capto 부틸 중 임의의 것으로부터 선택되는, 방법.

실시형태 85. 실시형태 81에 있어서, HIC가 HIC 막에 기반하는, 방법.

실시형태 86. 실시형태 1 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 적어도 20 mg 단백질/ml 수지, 적어도 30 mg 단백질/ml 수지, 적어도 45 mg 단백질/ml 수지의 로딩 인수를 사용하여 크로마토그래피 컬럼에 적용되고, 선택적으로 크로마토그래피 컬럼은 단백질 A 컬럼인, 방법.

실시형태 87. 실시형태 86에 있어서, 조성물이 적어도 45 mg 단백질/ml 수지의 로딩 인수를 사용하여 단백질 A 컬럼에 적용되는, 방법.

실시형태 88. 실시형태 87에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 2로 구성되는, 방법.

실시형태 89. 실시형태 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키는 조건 중 하나 이상이 단독으로, 또는 입체형태 변이체를 제거하는 하나 이상의 기술과 조합되어 적용되는, 방법.

실시형태 90. 적어도 3개 또는 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드를 단리 또는 정제하는 방법으로서,

i) 단리 또는 정제 공정의 단계에서 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 저 pH 처리를 적용하는 단계로서, 선택적으로 저 pH 처리는 조성물의 pH를 약 pH 3.2 이하, 또는 pH 3.0 이하로 감소시키는 것을 포함하는, 단계;

ii) 단리 또는 정제 공정의 단계에서 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 무질서유발제를 적용하는 단계로서, 선택적으로 무질서유발제는 GuHCl인, 단계;

iii) 단리 또는 정제 공정의 단계에서 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 열 스트레스를 적용하는 단계로서, 선택적으로 40℃ 내지 약 60℃에서 입체형태 변이체를 인큐베이션하는 것을 포함하는, 단계;

iv) 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 적어도 20 mg/ml, 적어도 30 mg/ml, 적어도 45 mg/ml의 로딩 인수를 사용하여 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계로서, 선택적으로 크로마토그래피 컬럼은 단백질 A 컬럼인, 단계; 또는

v) i) 내지 iv) 중 임의의 것의 조합

중 하나 이상을 포함하며, 선택적으로 단리 또는 정제될 폴리펩티드는 CHO 세포가 아닌 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있는, 방법.

실시형태 91: 실시형태 90에 있어서, 입체형태 변이체가 하등 진핵생물 숙주와 같은 CHO 세포가 아닌 숙주에서의 폴리펩티드의 발현으로부터 생산되는, 방법.

실시형태 92. 실시형태 90에 있어서, 단리 또는 정제될 폴리펩티드는 하등 진핵생물 숙주인 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있는, 방법.

실시형태 93. 실시형태 91 및 실시형태 92에 있어서, 하등 진핵생물 숙주가 피치아, 한세눌라, 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 칸디다, 토룰롭시스, 토룰라스포라, 스키조사카로마이세스, 시테로마이세스, 파키솔렌, 데바로마이세스, 메추니코위아, 로도스포리디움, 류코스포리디움, 보트리오아스쿠스, 스포리디오볼루스, 엔도마이콥시스와 같은 효모인, 방법.

실시형태 94. 실시형태 93에 있어서, 효모가 피치아 파스토리스와 같은 피치아인, 방법.

실시형태 95. 실시형태 90 내지 94 중 어느 하나에 있어서, pH가 약 pH 3.2 내지 약 pH 2.1, 약 pH 3.0 내지 약 pH 2.1, 약 pH 2.9 내지 약 pH 2.1, 약 pH 2.7 내지 약 pH 2.1, 또는 약 pH 2.6 내지 약 pH 2.3으로 감소되는, 방법.

실시형태 96. 실시형태 95에 있어서, pH가 약 pH 3.0, 약 pH 2.9, 약 pH 2.8, 약 pH 2.7, 약 pH 2.6, 약 pH 2.5, 약 pH 2.4, 약 pH 2.3, 약 pH 2.2, 또는 약 pH 2.1로 감소되는, 방법.

실시형태 97. 실시형태 90 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 저 pH 처리가 적어도 약 0.5시간 동안, 적어도 약 1시간 동안, 적어도 약 2시간 동안, 또는 적어도 약 4시간 동안 적용되는, 방법.

실시형태 98. 실시형태 90 내지 97 중 어느 하나에 있어서, pH가 약 pH 2.5 이하로 감소되는, 방법.

실시형태 99. 실시형태 90 내지 97에 있어서, pH가 적어도 0.5시간 동안, 적어도 1시간 동안 또는 적어도 2시간 동안 약 pH 3.0 내지 약 pH 2.1로 감소되는, 방법.

실시형태 100. 실시형태 99에 있어서, pH가 약 pH 2.7 내지 약 pH 2.1로 감소되는, 방법.

실시형태 101. 실시형태 90 내지 97 중 어느 하나에 있어서, pH가 적어도 1시간 동안, 선택적으로 적어도 2시간 동안 약 pH 2.7 내지 약 pH 2.1로 감소되는, 방법.

실시형태 102. 실시형태 101에 있어서, pH가 적어도 1시간 동안, 선택적으로 적어도 2시간 동안 약 pH 2.6 내지 약 pH 2.3으로 감소되는, 방법.

실시형태 103. 실시형태 90 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 다가 폴리펩티드가 3개의 ISVD, 4개의 ISVD, 또는 5개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 104. 실시형태 90 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 105. 실시형태 90 내지 104 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 5개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 106. 실시형태 105에 있어서, pH가 약 pH 2.6 이하로 감소되는, 방법.

실시형태 107. 실시형태 103 내지 106에 있어서, 저 pH 처리가 1 내지 2시간 적용되는, 방법.

실시형태 108. 실시형태 107에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 1로 구성되는, 방법.

실시형태 109. 실시형태 90 내지 104 중 어느 하나에 있어서, 다가 폴리펩티드가 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 110. 실시형태 109에 있어서, pH가 약 pH 2.9 이하, 예를 들어, 약 pH 2.5로 감소되는, 방법.

실시형태 111. 실시형태 109 및 110에 있어서, 저 pH 처리가 1 내지 2시간 적용되는, 방법.

실시형태 112. 실시형태 111에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 2로 구성되는, 방법.

실시형태 113. 실시형태 111에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 70 또는 서열 번호 71로 구성되는, 방법.

실시형태 114. 실시형태 90 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 다가 폴리펩티드가 3개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 115. 실시형태 114에 있어서, pH가 약 pH 3.0 이하, 예컨대, 약 pH 2.5로 감소되는, 방법.

실시형태 116. 실시형태 114 및 115에 있어서, 저 pH 처리가 2 내지 4시간 적용되는, 방법.

실시형태 117. 실시형태 116에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 69로 구성되는, 방법.

실시형태 118. 실시형태 90 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 저 pH 처리가 적어도 1 pH 단위로, 적어도 2 pH 단위로, 또는 약 pH 5.5 이상으로 pH를 증가시킴으로써 종료되는, 방법.

실시형태 119. 실시형태 90 내지 118 중 어느 하나에 있어서, 저 pH 처리가 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 전에 또는 후에 적용되는, 방법.

실시형태 120. 실시형태 119에 있어서, 저 pH 처리가 크로마토그래피 기술의 정지상에 조성물을 적용하기 전에 적용되는, 방법.

실시형태 121. 실시형태 119에 있어서, 저 pH 처리가 크로마토그래피 기술의 정지상으로부터 조성물을 용출한 후에 적용되는, 방법.

실시형태 122. 실시형태 90 내지 118 중 어느 하나에 있어서, 저 pH 처리가 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 동안 적용되고, 정제될 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 크로마토그래피 기술의 정지상과 접촉하는, 방법.

실시형태 123. 실시형태 119 내지 122에 있어서, 크로마토그래피 기술이 단백질 A 기반 친화도 크로마토그래피인, 방법.

실시형태 124. 실시형태 123에 있어서, 크로마토그래피 기술이 단백질 A 기반 친화도 크로마토그래피이고, 용출 완충액이 pH 2.5 이하의 pH를 갖는, 방법.

실시형태 125. 실시형태 123에 있어서, 크로마토그래피 기술이 단백질 A 기반 친화도 크로마토그래피이고, 용출 완충액은 폴리펩티드를 함유하는 생성 용출액이 pH 2.9 이하의 pH를 갖도록 하는 pH를 갖는, 방법.

실시형태 126. 실시형태 123 내지 125 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드를 함유하는 용출액의 pH가 선택적으로 적어도 1시간 동안 3.0 이하의 pH로, 예컨대 선택적으로 적어도 0.5시간 또는 약 1시간 동안 pH 2.7 이하의 pH로 조정되는, 방법.

실시형태 127. 실시형태 123 내지 125 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드를 함유하는 용출액의 pH가 선택적으로 적어도 약 0.5시간 또는 1시간 동안, pH 2.5 이하의 pH로 조정되는, 방법.

실시형태 128. 실시형태 122에 있어서, 크로마토그래피 기술이 단백질 A 기반 친화도 크로마토그래피이고, 용출 완충액이 약 pH 2.2의 pH를 갖고, 폴리펩티드를 함유하는 용출액의 pH가 적어도 약 1.5시간 동안 약 pH 2.5의 pH로 조정되는, 방법.

실시형태 129. 실시형태 119 내지 128 중 어느 하나에 있어서, 저 pH 처리 후 용출액의 pH가 적어도 1 pH 단위, 적어도 2 pH 단위, 또는 약 pH 5.5 이상의 pH로 증가되는, 방법.

실시형태 130. 실시형태 90 내지 129 중 어느 하나에 있어서, 저 pH 처리가 실온에서 적용되는, 방법.

실시형태 131. 실시형태 90 내지 130 중 어느 하나에 있어서, 저 pH 처리에

b) 조성물/용출액의 pH를 pH 5.5로 조정하는 단계; 및

실시형태 132. 실시형태 131에 있어서, b)에서의 pH가 NaOH로 조정되는, 방법.

실시형태 133. 실시형태 131 및 132에 있어서, 폴리펩티드가 5개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 134. 실시형태 131 및 132에 있어서, 폴리펩티드가 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 135. 실시형태 134에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 2로 구성되는, 방법.

실시형태 136. 실시형태 90 내지 135 중 어느 하나에 있어서, GuHCl이 적어도 약 1 M, 또는 적어도 약 2 M의 최종 농도로 적용되는, 방법.

실시형태 137. 실시형태 90 또는 136에 있어서, GuHCl이 적어도 0.5시간 동안, 또는 적어도 1시간 동안 적용되는, 방법.

실시형태 138. 실시형태 136 및 137에 있어서, GuHCl이 적어도 0.5시간 동안 적어도 약 1 M의 최종 농도로 적용되는, 방법.

실시형태 139. 실시형태 138에 있어서, GuHCl이 0.5시간 내지 1시간 동안 적어도 약 1 M의 최종 농도로 적용되는, 방법.

실시형태 140. 실시형태 136 및 137에 있어서, GuHCl이 적어도 0.5시간 동안 약 2 M의 최종 농도로 적용되는, 방법.

실시형태 141. 실시형태 140에 있어서, GuHCl이 0.5시간 내지 1시간 동안 적어도 약 2 M의 최종 농도로 적용되는, 방법.

실시형태 142. 실시형태 90 또는 136 내지 141 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 143. 실시형태 142에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 1로 구성되는, 방법.

실시형태 144. 실시형태 142에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 2로 구성되는, 방법.

실시형태 145. 실시형태 90 또는 136 내지 144 중 어느 하나에 있어서, 무질서유발제 처리가 실온에서 적용되는, 방법.

실시형태 146. 실시형태 90 또는 136 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 무질서유발제 처리가 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 전에 또는 후에 적용되는, 방법.

실시형태 147. 실시형태 146에 있어서, 폴리펩티드가 크로마토그래피 기술의 정지상으로부터 용출되고 무질서유발제 처리가 생성 용출액에 적용되는, 방법.

실시형태 148. 실시형태 90 내지 147에 있어서, 열 스트레스가 적어도 약 1시간 동안, 또는 약 1 내지 4시간 동안 적용되는, 방법.

실시형태 149. 실시형태 148에 있어서, 열 스트레스가 약 40℃ 내지 약 60℃, 약 45℃ 내지 약 60℃, 또는 약 50℃ 내지 약 60℃에서 적용되는, 방법.

실시형태 150. 실시형태 148에 있어서, 열 스트레스가 약 40℃ 내지 약 55℃, 약 45℃ 내지 55℃, 또는 약 48℃ 내지 약 52℃에서 적용되는, 방법.

실시형태 151. 실시형태 148에 있어서, 열 스트레스가 약 50℃에서 적용되는, 방법.

실시형태 152. 실시형태 151에 있어서, 열 스트레스가 1시간 동안 약 50℃에서 적용되는, 방법.

실시형태 153. 실시형태 148 내지 152 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 154. 실시형태 152에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 1로 구성되는, 방법.

실시형태 155. 실시형태 152에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 2로 구성되는, 방법.

실시형태 156. 실시형태 90 또는 148 내지 155 중 어느 하나에 있어서, 열 스트레스가 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 전에 또는 후에 적용되는, 방법.

실시형태 157. 실시형태 156에 있어서, 열 스트레스 처리가 크로마토그래피 기술의 정지상에 조성물을 적용하기 전에 또는 크로마토그래피 기술의 정지상으로부터 조성물을 용출한 후에 적용되는, 방법.

실시형태 158. 적어도 3개 또는 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법으로서, 실시형태 1 내지 154 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드의 정제 및/또는 단리 단계를 포함하는 방법.

실시형태 159. 실시형태 158에 따른 방법으로서, 적어도

a) 선택적으로 숙주 또는 숙주 세포가 증식하도록 하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 배양하는 단계;

b) 숙주 또는 숙주 세포가 상기 폴리펩티드를 발현 및/또는 생산하도록 하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 유지하는 단계; 및

c) 실시형태 1 내지 154 중 어느 하나에 따른 단리 또는 정제 방법 중 하나 이상을 포함하는 배지로부터 분비된 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계,

를 포함하며, 선택적으로 숙주는 CHO 세포가 아닌, 방법.

실시형태 160. 실시형태 158 및 159에 있어서, 숙주가 하등 진핵생물 숙주인, 방법.

실시형태 161. 실시형태 160에 있어서, 하등 진핵생물 숙주가 피치아, 한세눌라, 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 칸디다, 토룰롭시스, 토룰라스포라, 스키조사카로마이세스, 시테로마이세스, 파키솔렌, 데바로마이세스, 메추니코위아, 로도스포리디움, 류코스포리디움, 보트리오아스쿠스, 스포리디오볼루스, 엔도마이콥시스와 같은 효모인, 방법.

실시형태 162. 실시형태 161에 있어서, 효모가 피치아 파스토리스와 같은 피치아인, 방법.

실시형태 163. 폴리펩티드 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 적어도 3개 또는 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드를 단리 또는 정제하는 방법으로서,

(1) SE-HPLC 및 IEX-HPLC와 같은 분석용 크로마토그래피 기술에 의해 입체형태 변이체를 확인하는 단계;

(2) 입체형태 변이체의 특이적 제거를 허용하도록 크로마토그래피 조건을 조정하는 단계; 및

(3) 하나 이상의 크로마토그래피 기술에 의해 폴리펩티드 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 입체형태 변이체를 제거하는 단계,

를 포함하며, 선택적으로 단리 또는 정제될 폴리펩티드는 CHO 세포가 아닌 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있는, 방법.

실시형태 164. 폴리펩티드 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 적어도 3개 또는 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드의 단리 또는 정제를 허용하도록 하나 이상의 크로마토그래피 기술을 최적화하는 방법으로서,

(2) 입체형태 변이체의 특이적 제거를 허용하도록 크로마토그래피 조건을 최적화하는 단계,

실시형태 165. 실시형태 163 및 164에 있어서, 입체형태 변이체가 CHO 세포가 아닌 숙주, 예컨대 하등 진핵생물 숙주에서의 폴리펩티드의 발현으로 생산되는, 방법.

실시형태 166: 실시형태 163 및 164에 있어서, 단리 또는 정제될 폴리펩티드는 하등 진핵생물 숙주인 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있는, 방법.

실시형태 167: 실시형태 165 및 실시형태 166에 있어서, 하등 진핵생물 숙주가 피치아, 한세눌라, 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 칸디다, 토룰롭시스, 토룰라스포라, 스키조사카로마이세스, 시테로마이세스, 파키솔렌, 데바로마이세스, 메추니코위아, 로도스포리디움, 류코스포리디움, 보트리오아스쿠스, 스포리디오볼루스, 엔도마이콥시스와 같은 효모인, 방법.

실시형태 168. 실시형태 167에 있어서, 효모가 피치아 파스토리스와 같은 피치아인, 방법.

실시형태 169. 실시형태 163 내지 168 중 어느 하나에 있어서, 입체형태 변이체가 폴리펩티드와 비교하여 더 조밀한 형태를 특징으로 하는, 방법.

실시형태 170. 실시형태 163 내지 169 중 어느 하나에 있어서, 입체형태 변이체가 폴리펩티드와 비교하여 감소된 수력학적 부피를 갖는, 방법.

실시형태 171. 실시형태 163 내지 170 중 어느 하나에 있어서, 입체형태 변이체가 폴리펩티드와 비교하여 SE-HPLC에서 증가된 체류 시간을 특징으로 하는, 방법.

실시형태 172. 실시형태 163 내지 171 중 어느 하나에 있어서, 입체형태 변이체가 폴리펩티드와 비교하여 IEX-HPLC에서 변경된 체류 시간을 특징으로 하는, 방법.

실시형태 173. 실시형태 172에 있어서, 입체형태 변이체가 폴리펩티드와 비교하여 IEX-HPLC에서 감소된 체류 시간을 특징으로 하는, 방법.

실시형태 174. 실시형태 172에 있어서, 입체형태 변이체가 폴리펩티드와 비교하여 IEX-HPLC에서 증가된 체류 시간을 특징으로 하는, 방법.

실시형태 175. 실시형태 163 내지 174 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 3개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 176. 실시형태 163 내지 175 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 177. 실시형태 163 내지 176 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 3개의 ISVD, 4개의 ISVD, 또는 5개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는, 방법.

실시형태 178. 실시형태 163 내지 177 중 어느 하나에 있어서, 크로마토그래피 기술이 수력학적 부피, 표면 전하 또는 표면 소수성에 기반하는 크로마토그래피 기술인, 방법.

실시형태 179. 실시형태 178에 있어서, 크로마토그래피 기술이 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 이온 교환 크로마토그래피(IEX), 혼합 모드 크로마토그래피(MMC) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 중 임의의 것으로부터 선택되는, 방법.

실시형태 180. 실시형태 179에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피(IEX)가 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)인, 방법.

실시형태 181. 실시형태 179에 있어서, HIC가 HIC 컬럼 수지에 기반하는, 방법.

실시형태 182. 실시형태 181에 있어서, HIC 수지가 Capto 페닐 ImpRes, Capto 부틸 ImpRes, 페닐 HP, 및 Capto 부틸 중 임의의 것으로부터 선택되는, 방법.

실시형태 183. 실시형태 179에 있어서, HIC가 HIC 막에 기반하는, 방법.

4. 도면에 대한 설명
도 1: 단백질 A 또는 비-단백질 A 포획 수지를 사용한 포획 후 용출액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 2: 표 2에 기재된 바와 같이 용출 완충액 A, B, C 및 D를 사용한 단백질 A 포획 후 용출액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 3: (1)의 용출 완충액 A 및 pH 중화를 포함하는 또는 포함하지 않는 (2)의 용출 완충액 B를 사용한 단백질 A 포획 후 용출액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 4: 연마 개발에 사용되는 양이온 교환 수지에 대한 화합물 A의 크로마토그래피 프로필.
도 5: 실시예 1 및 도 4에 기재된 바와 같이 분취용 CEX에서 얻은 로딩, 측면 및 상부 분획의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 6: 실시예 1 및 도 4에 기재된 바와 같이 분취용 CEX에서 얻은 입체형태 변이체-농축 측면 분획 및 입체형태 변이체-고갈 상부 분획의 IEX-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 7: 입체형태 변이체-농축(1) 및 -고갈 물질(2)의 저 pH 처리(pH 2.5) 후 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 8: 입체형태 변이체-농축 물질의 저 pH 처리(pH 2.5) 후 IEX-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 9: 실온에서 0.5시간 동안 2 M 또는 3 M GuHCl 무질서유발제로 처리된 입체형태 변이체-농축 물질의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 10: 실온에서 0.5시간 동안 2 M 또는 3 M GuHCl 무질서유발제로 처리된 입체형태 변이체-농축 물질의 IEX-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 11: 1시간 동안 50℃에서 처리된 입체형태 변이체-농축 물질의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 12: 1시간 동안 50℃에서 처리된 입체형태 변이체-농축 물질의 IEX-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 13: 실시예 4에 기재된 바와 같이, 상이한 용출 조건을 사용한 포획 용출액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 14: 실시예 4에 기재된 바와 같이, 상이한 용출 조건을 사용한 포획 용출액의 IEX-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 15: (1) 및 (2)에서 저 pH 인큐베이션 및 저 pH 후 즉각적인(T0) pH 조정 후; 및 (3) 및 (4)에서 저 pH 인큐베이션 및 저 pH에서 1시간 인큐베이션 후(T1h) pH 조정 후, 포획 용출액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 16a: pH 조정 스톡 용액의 2개의 상이한 세트의 적용 후 샘플의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 16b: 실시예 4(첫 번째 실험)에 기재된 바와 같이 IEX-HPLC에 의해 분석된 화합물 A의 산물 품질에 대한 pH의 영향.
도 16c: 실시예 4(두 번째 실험)에 기재된 바와 같이 IEX-HPLC에 의해 분석된 화합물 A의 산물 품질에 대한 pH의 영향.
도 17: 10 L 규모(1) 및 100 L 규모(2)의 포획 용출액 및 포획 여과액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 18: 10 L 규모로부터의 포획 용출액 및 포획 여과액의 IEX-HPLC 크로마토그램 (줌, 하부 패널 포함).
도 19: 100 L 규모로부터의 포획 용출액 및 포획 여과액의 IEX-HPLC 크로마토그램.
도 20: 화합물 A의 입체형태 변이체 제거에 사용된 크로마토그래피 MMC 프로필. 회색 상자 안: 분석을 위해 선택된 분획 F8 및 F11.
도 21: 실시예 6에 기재된 바와 같이 MMC에서 얻은 (1)에서의 로딩 및 분획 F8 및 (2)에서의 로딩 및 분획 F11의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 22: 실시예 6에 기재된 바와 같이 MMC에서 얻은 (1)에서의 로딩 및 분획 F8 및 (2)에서의 로딩 및 분획 F11의 IEX-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 23: 화합물 A의 입체형태 변이체 제거에 사용된 TSK 페닐 겔 5 PW(30) 수지에 대한 크로마토그래피 HIC 프로필. 회색 상자 안: 분석을 위해 선택된 분획 F26 및 F41.
도 24: TSK 페닐 겔 5 PW(30) 수지를 사용하여 HIC에서 얻은 (1)에서의 로딩 및 분획 F26 및 (2)에서의 로딩 및 분획 F41의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 25: 황산암모늄 구배와 함께 사용된 Capto 부틸 Impres 수지로의 HIC에서 얻은 상부 분획 및 로딩의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 26: 화합물 A의 입체형태 변이체 제거에 사용된 Capto 부틸 ImpRes 수지의 크로마토그래피 HIC 프로필. 회색 상자 안: 분석을 위해 선택된 F15, F20 및 F29 분획.
도 27: Capto 부틸 ImpRes 수지를 사용하여 HIC에서 얻은 로딩 및 분획 F15, F20 및 F29의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 28: Sartobind 페닐 막(필터 플레이트)에 대한 막 기반 HIC 후 포획 용출액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 29: 화합물 A의 입체형태 변이체 제거에 사용된 Sartobind 페닐 막에 대한 크로마토그래피 HIC 프로필.
도 30: Sartobind 페닐 막에 대한 HIC에서 얻은 로딩, 분획 풀 2 및 스트리핑 분획의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 31: 화합물 B의 IEX-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 32: 연마 공정 단계 동안 화합물 B의 크로마토그래피 CEX 프로필. 회색 상자 안: 분석을 위해 선택된 분획.
도 33: 실시예 7에 기재된 바와 같이 CEX에서 얻은 분획 2C4 및 풀 분획 2C7 내지 2C11의 IEX-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 34: 실시예 7에 기재된 바와 같이 CEX에서 얻은 분획 2C4 및 풀 분획 2C7 내지 2C11의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 35: 1시간 동안 pH 2.3에서 저 pH 처리 및 1 M 아세트산나트륨으로 pH 5.5로의 후속 조정 후 화합물 B의 포획 용출액의 IEX-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함). 1 M 아세트산나트륨을 사용하여 pH 5.5로 바로 조정된 포획 용출액을 대조군으로 사용했다.
도 36: 1시간 동안 pH 2.3에서 저 pH 처리 및 1 M 아세트산나트륨으로 pH 5.5로의 후속 조정 후 화합물 B의 포획 용출액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함). 1 M 아세트산나트륨을 사용하여 pH 5.5로 바로 조정된 포획 용출액을 대조군으로 사용했다.
도 37: 4 h 동안 저 pH 2.5 처리 후 화합물 B의 포획 용출액의 IEX-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 38: 4 h 동안 저 pH 2.5 처리 후 화합물 B의 포획 용출액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 39: 실온에서 0.5 h GuHCl 무질서유발제 처리 후 화합물 B의 포획 용출액의 IEX-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 40: 50℃에서 1 h 열 처리 후 화합물 B의 포획 용출액의 IEX-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함) .
도 41: 50℃에서 1 h 열 처리 후 화합물 B의 포획 용출액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 42a: pH 2.3에서 처리 및 바로 또는 1 h 후 pH 5.5로의 후속 조정 후 화합물 B의 포획 용출액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 42b: pH 2.5에서 처리 및 바로 또는 1 h 후 pH 5.5로의 후속 조정 후 화합물 B의 포획 용출액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 43: IEX-HPLC에 의해 시간의 함수로 분석된 산물 품질에 대한 저 pH 처리의 영향. (a) 2 및 4시간 동안 pH 2.3 및 pH 2.5에서 저 pH 처리를 사용한 초기 실험; (b) 2시간 및 4시간 동안; pH 2.7, pH 2.9, pH 3.1, pH 3.3, pH 3.5 및 pH 2.7에서 저 pH 처리를 사용한 추가 실험.
도 44: 2 h 동안 pH 2.4 및 pH 2.6에서 처리 및 pH 5.5로의 후속 조정 후 화합물 B의 포획 용출액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 45: 2 h 동안 pH 2.6에서 처리 및 pH 5.5로의 후속 조정 후 화합물 B의 포획 용출액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 46 화합물 B의 입체형태 변이체 제거에 사용된 크로마토그래피 CEX 프로필. 회색 상자 안: 분석을 위해 선택된 분획.
도 47: 화합물 B의 입체형태 변이체 제거에 사용된 Capto 부틸 ImpRes 수지에 대한 크로마토그래피 HIC 프로필. 회색 상자 안: 분석을 위해 선택된 분획.
도 48: 도 47에 도시된 바와 같이 Capto 부틸 ImpRes 상에서 수행된 HIC의 선택된 분획의 SDS-PAGE 분석.
도 49: IEX-HPLC 분석에 의해 평가된 산물 품질에 대한 로딩 인수의 영향을 나타내는 DOE 모델의 예측 프로필분석기.
도 50: 10 L 규모 확대로부터 사이클 1의 대표적인 포획 용출액 및 사이클 1의 대표적인 포획 여과액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 51: 100 L 규모 확대에서 사이클 1의 대표적인 포획 용출액 및 사이클 1의 대표적인 포획 여과액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 52: 가정된 모델의 도식적 표시.
도 53: (a) 0 h, 2 h 및 4 h 동안 저 pH 3.0 처리 후 피치아 파스토리스에서 생산된 화합물 C의 포획 용출액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함). (b) 0 h, 2 h 및 4 h 동안 저 pH 2.5 처리 후 화합물 C의 포획 용출액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 54: 실시예 14에 기재된 바와 같이 SE-HPLC에 의해 분석된 화합물 C의 산물 품질에 대한 pH의 영향.
도 55: 2 h 인큐베이션 후 pH 5.5에서의 처리와 비교하여 pH 2.6 및 pH 3.0에서의 저 pH 처리 후 CHO 세포에서 생산된 화합물 C의 포획 용출액의 SE-HPLC 크로마토그램(줌, 하부 패널 포함).
도 56: 실시예 16에 기재된 바와 같이 SE-HPLC에 의해 분석된 화합물 D의 산물 품질에 대한 pH의 영향.
도 57: 실시예 17에 기재된 바와 같이 SE-HPLC에 의해 분석된 화합물 E의 산물 품질에 대한 pH의 영향.

5. 상세한 설명

본 개시는 적어도 3개 또는 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드의 입체형태 변이체의 놀라운 관찰을 기재한다. 상기 폴리펩티드의 입체형태 변이체는 숙주에서 폴리펩티드의 생산 동안 관찰되었다. 특히, 입체형태 변이체는 숙주, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 하등 진핵생물 숙주에서 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드의 생산 시 관찰되었다. 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 다가 폴리펩티드 산물의 입체형태 변이체는 숙주, 특히 효모와 같은 하등 진핵생물 숙주인 숙주에서 폴리펩티드의 발현으로부터 생성된다는 것이 밝혀질 수 있다. 폴리펩티드 및 그 입체형태 변이체의 분자량은 동일하지만 입체형태 변이체는 전하/표면 특성의 변화를 나타내어 상이한 물리화학적 거동, 예를 들어 분석용 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 분석용 이온 교환 크로마토그래피에서 상이한 체류 시간을 야기한다. 따라서, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드의 입체형태 변이체는 분석용 크기 배제 크로마토그래피에서 폴리펩티드-함유 주요 피크의 쇼울더 후 피크 또는 분해된 후 피크(SE-HPLC 후 피크 1)로서 및/또는 분석용 이온 교환 크로마토그래피에서 폴리펩티드-함유 주요 피크의 후 피크 쇼울더 또는 분해된 후 피크(IEX-HPLC 후 피크 1)로서 관찰될 수 있다. 이러한 상이한 물리화학적 거동은 스크램블된 디설피드 가교 때문이 아니었다.

이러한 관찰에 기반하여, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드는 분자내 상호작용을 야기하는 특정 구조적 유연성을 허용하여 폴리펩티드가 폴리펩티드의 ISVD 빌딩 블록의 배열과 비교하여 더 조밀한 형태를 초래하는 ISVD 빌딩 블록의 입체형태 배열을 갖는 입체형태 변이체로서 발생할 수 있게 한다고 가정했다(도 52 참고). ISVD 자체는 매우 안정한 분자이지만, 놀랍게도 폴리펩티드의 원자가를 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD로 증가시키는 것(즉, ISVD 빌딩 블록의 수를 3개, 4개 이상으로 증가시키는 것)은 폴리펩티드를 분자 내 상호작용에 더 취약하게 만들 수 있는 것으로 관찰되었다. 가설에 구애받지 않고, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드는 조밀한 형태를 갖는 폴리펩티드의 입체형태 변이체를 형성하는 상기 폴리펩티드 내에서 적어도 2개의 ISVD 간 분자내 상호작용을 허용할 수 있다는 결론이 내려졌다. 조밀한 형태는 폴리펩티드에 비해 감소된 수력학적 부피를 특징으로 한다. 더욱이, 조밀한 형태는 변경된 표면 전하 및/또는 변경된 표면 소수성/소수성 노출을 특징으로 할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD 및 이의 입체형태 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드는 분석용 크로마토그래피 기술에 기반하여 구별될 수 있다. 특히, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드 및 이의 입체형태 변이체는 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC) 및/또는 이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(IEX-HPLC)와 같은 분석용 크로마토그래피 기술에 의해 수력학적 부피 및/또는 표면 전하의 이동에 기반하여 구별될 수 있다.

입체형태 변이체가 본 출원에서 밝혀진 처리 조건을 사용하여 (원하는) 폴리펩티드로 전환될 수 있다는 것이 추가로 실증되었다. 또한, 폴리펩티드와 이의 입체형태 변이체 간에 관찰된 생화학적/생물리적 차이에 기반하여, 입체형태 변이체가 본원에 기재된 바와 같이 수력학적 부피, 표면 전하 및/또는 표면 소수성에 기반하는 알려진 분취용 크로마토그래피 기술을 사용하여 폴리펩티드 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 제거될 수 있다는 것이 밝혀졌다.

5.1 정의

달리 표시되거나 정의되지 않는 한, 사용된 모든 용어는 당분야에서의 통상적인 의미를 가지며, 이는 당업자에게 명확할 것이다. 예를 들어 문헌[Sambrook et al. 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Ausubel et al. 1987 (Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York), Lewin 1985 (Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y.), Old et al. 1981 (Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2nd Ed., University of California Press, Berkeley, CA), Roitt et al. 2001 (Immunology, 6th Ed., Mosby/Elsevier, Edinburgh), Roitt et al. 2001 (Roitt's Essential Immunology, 10th Ed., Blackwell Publishing, UK), 및 Janeway et al. 2005 (Immunobiology, 6th Ed., Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York)]과 같은 표준 핸드북뿐만 아니라 여기에 인용된 일반적인 배경 기술을 참조한다.

달리 표시되지 않는 한, 구체적으로 상세하게 기재되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 당업자에게 명확할 바와 같이, 자체 공지된 방식으로 수행될 수 있고 수행되었다. 예를 들어, 다시 본원에 언급된 표준 핸드북 및 일반적인 배경 기술 그리고 여기에 인용된 추가 참고문헌; 뿐만 아니라 예를 들어 친화도 성숙과 같은 단백질 조작 기술 및 면역글로불린과 같은 단백질의 특이성 및 기타 원하는 특성을 개선하기 위한 기타 기술을 기재하는 하기 리뷰[Presta 2006 (Adv. Drug Deliv. Rev. 58: 640), Levin and Weiss 2006 (Mol. Biosyst. 2: 49), Irving et al. 2001 (J. Immunol. Methods 248: 31), Schmitz et al. 2000 (Placenta 21 Suppl. A: S106), Gonzales et al. 2005 (Tumour Biol. 26: 31)]가 참조된다.

본원에 제공된 매개변수 또는 매개변수 범위의 맥락에서 사용된 용어 "약"은 하기 의미를 가질 것이다. 달리 표시되지 않는 한 용어 "약"이 특정 값 또는 범위에 적용되는 경우, 값 또는 범위는 이를 측정하기 위해 사용된 방법만큼 정확한 것으로 해석된다. 적용에서 오류 한계가 특정되지 않은 경우, 수치 값의 마지막 소수점 자리가 그 정확도를 표시한다. 다른 오차 한계가 주어지지 않은 경우, 최대 한계는 마지막 소수점 자리에 반올림 규칙을 적용하여 확인되며, 예를 들어 pH 값이 약 pH 2.7인 경우, 오차 한계는 2.65 내지 2.74이다. 그러나 하기 매개변수의 경우, 특정 한계가 적용된다: 소수점 없이 ℃로 특정된 온도는 ± 1℃의 오차 한계를 가지며(예를 들어 약 50℃의 온도 값은 50℃ ± 1℃을 의미함); 시간(h)으로 표시된 시간은 소수점 자릿수에 관계없이 0.1시간의 오차 한계를 갖는다(예를 들어 약 1.0시간의 시간 값은 1.0시간 ± 0.1시간을 의미하고; 약 0.5시간의 시간 값은 0.5시간 ± 0.1시간을 의미함).

본 출원에서, 용어 "약"으로 표시된 임의의 매개변수는 또한 "약"이라는 용어 없이 개시되는 것으로 고려된다. 다시 말해서, 용어 "약"을 사용하여 매개변수 값을 언급하는 실시형태는 그대로 상기 매개변수의 수치 값에 관한 실시형태를 또한 기재한다. 예를 들어, "약 pH 2.7"의 pH를 특정하는 실시형태는 "pH 2.7"의 pH를 그대로 특정하는 실시형태도 개시하며; "약 pH 2.7 내지 약 pH 2.1"의 pH 범위를 특정하는 실시형태는 "pH 2.7 내지 pH 2.1" 등의 pH 범위를 특정하는 실시형태를 또한 기재한다.

5.2 면역글로불린 단일 가변 도메인

"단일 가변 도메인"과 상호교환적으로 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"(ISVD)은 항원 결합 부위가 단일 면역글로불린 도메인 상에 존재하고 이에 의해 형성되는 면역글로불린 분자를 정의한다. 이것은 면역글로불린 단일 가변 도메인을 2개의 면역글로불린 도메인, 특히 2개의 가변 도메인이 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성하는, "통상적인" 면역글로불린(예를 들어 모노클로날 항체) 또는 이의 단편(예를 들어 Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, 디-scFv)과 구별한다. 전형적으로, 통상적인 면역글로불린에서는, 중쇄 가변 도메인(V_H) 및 경쇄 가변 도메인(V_L)이 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성한다. 이 경우, V_H및 V_L 둘 모두의 상보성 결정 영역(CDR)이 항원 결합 부위에 기여할 것이며, 즉 총 6개의 CDR이 항원 결합 부위 형성에 관여될 것이다.

상기 정의를 고려하여, 통상적인 4-사슬 항체(예를 들어 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자; 당분야에 알려짐) 또는 Fab 단편, F(ab')₂단편, 디설피드 결합된 Fv 또는 scFv 단편과 같은 Fv 단편, 또는 이러한 통상적인 4-사슬 항체로부터 유래된 디아바디(모두 당분야에 알려짐)의 항원 결합 도메인은 보통 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 간주되지 않을 것이며, 이러한 경우 항원의 각 에피토프에 대한 결합은 보통 하나의 (단일) 면역글로불린 도메인에 의해서가 아니라 경쇄 및 중쇄 가변 도메인과 같은 한 쌍의 (연합) 면역글로불린 도메인, 즉 각각의 항원의 에피토프에 공동으로 결합하는, 면역글로불린 도메인의 V_H-V_L 쌍에 의해 일어날 것이다.

대조적으로, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 추가적인 면역글로불린 가변 도메인과 쌍을 이루지 않고 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 면역글로불린 단일 가변 도메인의 결합 부위는 단일 V_H, 단일 V_HH또는 단일 V_L도메인에 의해 형성된다.

이와 같이, 단일 항원 결합 단위(즉, 단일 항원 결합 도메인이 기능적 항원 결합 단위를 형성하기 위해 또 다른 가변 도메인과 상호작용할 필요가 없도록, 본질적으로 단일 가변 도메인으로 구성되는 기능적 항원 결합 단위)를 형성할 수 있는 한, 단일 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, V_L-서열)또는 이의 적합한 단편; 또는 중쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, V_H-서열 또는 V_HH 서열) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다.

면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)은 예를 들어 낙타화 V_H 또는 인간화 V_HH를 포함하는 V_H, V_HH와 같은 중쇄 ISVD일 수 있다. 한 실시형태에서, 이는 낙타화 V_H 또는 인간화 V_HH를 포함하는 V_HH이다. 중쇄 ISVD는 통상적인 4-사슬 항체 또는 중쇄 항체로부터 유래될 수 있다.

예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 단일 도메인 항체(또는 단일 도메인 항체로 사용하기 적합한 아미노산 서열), "dAb" 또는 dAb(또는 dAb로 사용하기 적합한 아미노산 서열) 또는 NANOBODY® ISVD(본원에 정의되고 V_HH를 포함하지만 이에 제한되지 않음); 다른 단일 가변 도메인, 또는 이들 중 어느 하나의 임의의 적합한 단편일 수 있다.

특히, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 NANOBODY® ISVD(예를 들어, 인간화 V_HH또는 낙타화 V_H를 포함하는 V_HH) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다[주: NANOBODY®는 Ablynx N.V.의 등록 상표임].

V_HH, V_HH 항체 단편 및 V_HH 항체로도 알려진 "V_HH 도메인"은 원래 "중쇄 항체"(즉, "경쇄가 없는 항체"; Hamers-Casterman et al. Nature 363: 446-448, 1993)의 항원 결합 면역글로불린 가변 도메인으로 기재되었다. 용어 "V_HH 도메인"은 이들 가변 도메인을 통상적인 4-사슬 항체에 존재하는 중쇄 가변 도메인(본원에서 "V_H도메인"으로 지칭됨) 및 통상적인 4-사슬 항체에 존재하는 경쇄 가변 도메인(본원에서 "V_L도메인"으로 지칭됨)과 구별하기 위해 선택되었다. V_HH에 대한 추가 설명은 Muyldermans의 리뷰 논문(Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001)를 참조한다.

전형적으로, 면역글로불린의 생성에는 실험 동물의 면역화, 하이브리도마를 생성하기 위한 면역글로불린 생산 세포의 융합 및 원하는 특이성에 대한 스크리닝이 관여된다. 대안적으로, 면역글로불린은 예를 들어 파지 디스플레이에 의한 나이브 또는 합성 라이브러리의 스크리닝에 의해 생성될 수 있다.

VHH와 같은 면역글로불린 서열의 생성은 다양한 간행물, 특히 WO 94/04678, Hamers-Casterman et al., 1993 및 Muyldermans et al., 2001(Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001)에서 널리 기재되었다. 이들 방법에서, 낙타과는 상기 표적 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 표적 항원으로 면역화된다. 상기 면역화로부터 얻은 VHH 레퍼토리가 표적 항원에 결합하는 VHH에 대해 추가로 스크리닝된다.

이러한 경우에, 항체의 생성은 면역화 및/또는 스크리닝을 위해 정제된 항원을 필요로 한다. 항원은 천연원으로부터 또는 재조합 생산 과정에서 정제될 수 있다.

면역글로불린 서열에 대한 면역화 및/또는 스크리닝은 이러한 항원의 펩티드 단편을 사용하여 수행될 수 있다.

마우스, 래트, 토끼, 당나귀, 인간 및 낙타과 면역글로불린 서열을 포함하는 상이한 기원의 면역글로불린 서열이 본원에 기재된 방법에서 생산, 정제 및/또는 단리될 수 있다. 또한, 완전 인간, 인간화 또는 키메라 서열이 본원에 기재된 방법에서 생성, 정제 및/또는 단리될 수 있다. 예를 들어, 낙타과 면역글로불린 서열 및 인간화 낙타과 면역글로불린 서열, 또는 낙타화된 도메인 항체, 예를 들어 Ward 등에 의해 기재된 낙타화 dAb(예를 들어 WO 94/04678 및 Riechmann, Febs Lett., 339:285-290, 1994 및 Prot. Eng., 9:531-537, 1996 참고)는 본원에 기재된 방법에서 생산, 정제 및/또는 단리될 수 있다. 더욱이, ISVD는 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되도록 융합되어 다가 및/또는 다중특이적 작제물을 형성한다(하나 이상의 V_HH도메인을 함유하는 다가 및 다중특이적 폴리펩티드 및 이의 제조에 대해서는 문헌[Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001, 뿐만 아니라 예를 들어 WO 96/34103 및 WO 99/23221]를 또한 참조). ISVD 서열은 태그 또는 기타 기능적 모이어티, 예를 들어 독소, 표지, 방사성화학물질 등을 포함할 수 있다.

"인간화 V_HH"는 자연 발생 V_HH 도메인의 아미노산 서열에 상응하지만 "인간화"된, 즉 상기 자연 발생 V_HH 서열의 아미노산 서열에서(및 특히 프레임워크 서열에서) 하나 이상의 아미노산 잔기를 인간으로부터의 통상적인 4-사슬 항체로부터의 V_H 도메인의 상응하는 위치(들)에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 대체함으로써(예를 들어, 위에 표시됨) 인간화된 아미노산 서열을 포함한다. 이것은 예를 들어 본원의 추가 설명 및 선행 기술(예를 들어 WO 2008/020079)에 기반하여 당업자에게 명확할, 자체 공지된 방식으로 수행될 수 있다. 다시 말해서, 이러한 인간화 V_HH는자체 공지된 임의의 적합한 방식으로 얻을 수 있고, 이에 따라 출발 물질로서 자연 발생 VHH 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 얻은 폴리펩티드에 엄격하게 제한되지 않는다는 점이 주지되어야 한다.

"낙타화 V_H"는 자연 발생 V_H 도메인의 아미노산 서열에 상응하지만 "낙타화된", 즉, 통상적인 4-사슬 항체로부터의 자연 발생 V_H 도메인의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기를 (낙타과) 중쇄 항체의 V_HH 도메인의 상응하는 위치(들)에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 대체함으로써 낙타화된 아미노산 서열을 포함한다. 이것은 자체 공지된 방식으로 수행될 수 있으며, 이는 예를 들어 본원의 추가 설명 및 선행 기술(예를 들어, Davies and Riechmann(1994 및 1996), 상기 문헌)에 기반하여 당업자에게 명확할 것이다. 이러한 "낙타화" 치환은 V_H-V_L 계면을 형성하고/하거나 여기에 존재하는 아미노산 위치, 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 소위 낙타과 특징 잔기에 삽입된다(예를 들어 WO 94/04678 및 Davies and Riechmann(1994 및 1996), 상기 문헌 참고). 한 실시형태에서, 낙타화 V_H를 생성하거나 설계하기 위한 출발 물질 또는 출발점으로 사용되는 V_H 서열은 포유동물로부터의 V_H 서열, 예컨대 인간의 V_H서열, 예를 들어 V_H3 서열이다. 그러나, 이러한 낙타화 V_H는 자체 공지된 임의의 적합한 방식으로 얻을 수 있고, 이에 따라 출발 물질로서 자연 발생 V_H도메인을 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 얻은 폴리펩티드에 엄격하게 제한되지 않는다는 점이 주지되어야 한다.

하나 이상의 ISVD 서열이 서로 및/또는 다른 아미노산 서열에(예를 들어 디설피드 가교를 통해) 연결되어 본 발명의 방법에서 또한 유용할 수 있는 펩티드 작제물(예를 들어 Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 작제물, "디아바디" 및 기타 다중특이적 작제물)을 제공할 수 있다는 것이 주지되어야 한다. 예를 들어, 리뷰[Holliger and Hudson, Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36)]를 참조한다. 일반적으로, 폴리펩티드가 (예를 들어 예방적, 치료 및/또는 진단적 목적을 위해) 대상체에 투여되도록 의도되는 경우, 이는 상기 대상체에서 자연 발생하지 않는 면역글로불린 서열을 포함한다.

면역글로불린 단일 가변 도메인 서열의 구조는 당분야 및 본원에서 "프레임워크 영역 1"("FR1")로; "프레임워크 영역 2"("FR2")로; "프레임워크 영역 3"("FR3")으로; 및 "프레임워크 영역 4"("FR4")로 각각 지칭되는 4개의 프레임워크 영역("FR")으로 이루어지는 것으로 간주될 수 있고; 프레임워크 영역은 당분야 및 본원에서 "상보성 결정 영역 1"("CDR1")로; "상보성 결정 지역 2"("CDR2")로; 및 "상보성 결정 영역 3"("CDR3")으로 각각 지칭되는, 3개의 상보성 결정 영역("CDR")에 의해 단속된다.

WO 08/020079(본원에 참조로 포함됨)의 58 및 59페이지의 단락 q)에 추가로 기재된 바와 같이, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 아미노산 잔기는 Riechmann 및 Muyldermans의 논문, 2000(J. Immunol. Methods 240 (1-2): 185-195; 예를 들어, 이 간행물의 도 2 참고)에서 낙타과로부터의 V_HH 도메인에 적용된 바와 같이, 문헌[Kabat et al.("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)]에 의해 제공되는 V_H도메인에 대한 일반적 넘버링에 따라 넘버링될 수 있다. V_H 도메인 및 V_HH 도메인에 대해 당분야에 잘 알려진 바와 같이 - 각각의 CDR에 있는 아미노산 잔기의 총 수는 변할 수 있고 Kabat 넘버링에 의해 표시된 아미노산 잔기의 총 수에 상응하지 않을 수 있다는 것이(즉, Kabat 넘버링에 따른 하나 이상의 위치가 실제 서열에서 점유되지 않을 수 있거나, 실제 서열이 Kabat 넘버링에 의해 허용되는 수보다 더 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있음) 주지되어야 한다. 이것은 일반적으로 Kabat에 따른 넘버링이 실제 서열에서의 아미노산 잔기의 실제 넘버링에 상응할 수도 상응하지 않을 수도 있다는 것을 의미한다. V_H도메인 및 V_HH 도메인에서 아미노산 잔기의 총 수는 일반적으로 110 내지 120, 종종 112 내지 115의 범위일 것이다. 그러나 더 짧거나 더 긴 서열이 또한 본원에 기재된 목적에 적합할 수 있다는 것이 주지되어야 한다.

CDR 서열은 Kontermann 및

(Eds. 2010, Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp. 33-51)에 기재된 바와 같이 AbM 넘버링에 따라 결정될 수 있다. 이 방법에 따르면, FR1은 위치 1 내지 25개의 아미노산 잔기를 포함하고, CDR1은 위치 26 내지 35개의 아미노산 잔기를 포함하고, FR2는 위치 36 내지 49개의 아미노산을 포함하고, CDR2는 위치 50 내지 58개의 아미노산 잔기를 포함하고, FR3은 위치 59 내지 94개의 아미노산 잔기를 포함하고, CDR3은 위치 95 내지 102개의 아미노산 잔기를 포함하고, FR4는 위치 103 내지 113개의 아미노산 잔기를 포함한다.

CDR 영역의 결정은 또한 상이한 방법에 따라 수행될 수 있다. Kabat에 따른 CDR 결정에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 FR1은 위치 1 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하고, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 CDR1은 위치 31 내지 35개의 아미노산 잔기를 포함하고, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 FR2는 위치 36 내지 49개의 아미노산을 포함하고, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 CDR2는 위치 50 내지 65개의 아미노산 잔기를 포함하고, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 FR3은 위치 66 내지 94개의 아미노산 잔기를 포함하고, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 CDR3은 위치 95 내지 102개의 아미노산 잔기를 포함하고, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 FR4는 위치 103 내지 113개의 아미노산 잔기를 포함한다.

이러한 면역글로불린 서열에서, 프레임워크 서열은 임의의 적합한 프레임워크 서열일 수 있고, 적합한 프레임워크 서열의 예는, 예를 들어 표준 핸드북 및 추가 개시 및 본원에 언급된 선행 기술에 기반하여 당업자에게 명확할 것이다.

프레임워크 서열은 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 (예를 들어, 인간화 또는 낙타화에 의해) 면역글로불린 프레임워크 서열로부터 유래된 프레임워크 서열(의 적합한 조합)이다. 예를 들어, 프레임워크 서열은 경쇄 가변 도메인(예를 들어, V_L-서열) 및/또는 중쇄 가변 도메인(예를 들어, V_H-서열 또는 V_HH서열)으로부터 유래된 프레임워크 서열일 수 있다. 한 특정 양태에서, 프레임워크 서열은 V_HH-서열로부터 유래된 프레임워크 서열(상기 프레임워크 서열은 선택적으로 부분적으로 또는 완전히 인간화되었을 수 있음)이거나 낙타화된 통상적인 V_H 서열(본원에 정의된 바와 같음)이다.

특히, 본원에 기재된 방법에서 사용된 ISVD 서열에 존재하는 프레임워크 서열은 ISVD 서열이 NANOBODY®ISVD, 예를 들어, 인간화 V_HH를 포함하는 V_HH 또는 낙타화 V_H이도록 하는 하나 이상의 특징 잔기(본원에 정의된 바와 같음)를 함유할 수 있다. 이러한 프레임워크 서열(의 적합한 조합)의 비제한적 예는 본원의 추가 개시로부터 명확해질 것이다.

다시, 면역글로불린 서열에 대해 본원에 일반적으로 기재된 바와 같이, 하나 이상의 프레임워크 서열이 적합하게 측면배치되고/되거나 이를 통해 연결된 하나 이상의 CDR 서열을 함유하는(예를 들어, 이들 CDR 및 프레임워크 서열은 단편이 유래된 전체 크기 면역글로불린 서열에서 발생할 수 있는 것과 동일한 순서로) 단편과 같은 전술한 것 중 임의의 것의 적합한 단편(또는 단편의 조합)을 사용하는 것도 가능하다.

그러나, 본 발명의 방법에서 사용된 다가 ISVD 폴리펩티드에 포함된 ISVD는 ISVD 서열(또는 이를 발현하기 위해 사용되는 뉴클레오티드 서열)의 기원에도, ISVD 서열 또는 뉴클레오티드 서열이 생성되거나 얻어지는(또는 생성되었거나 얻어진) 방식으로도 제한되지 않는다. 따라서, ISVD 서열은 자연 발생 서열(임의의 적합한 종으로부터의) 또는 합성 또는 반합성 서열일 수 있다. 구체적이지만 비제한적인 양태에서, ISVD 서열은 자연 발생 서열(임의의 적합한 종으로부터의) 또는 "인간화"(본원에 정의된 바와 같음) 면역글로불린 서열(예를 들어 부분적 또는 완전 인간화 마우스 또는 토끼 면역글로불린 서열, 특히 부분적 또는 완전 인간화 V_HH서열), "낙타화"(본원에 정의된 바와 같은) 면역글로불린 서열(특히 낙타화 V_H서열)을 포함하지만 이로 제한되지 않는 합성 또는 반합성 서열뿐만 아니라 친화도 성숙(예를 들어 합성, 무작위 또는 자연 발생 면역글로불린 서열로부터 시작), CDR 이식, 베니어링, 상이한 면역글로불린 서열로부터 유래된 조합 단편, 중첩 프라이머를 사용한 PCR 조립, 및 당업자에게 잘 알려진 면역글로불린 서열을 조작하기 위한 유사한 기술과 같은 기술에 의해 얻어진 ISVD; 또는 전술한 것 중 임의의 것의 임의의 적절한 조합이다.

유사하게, 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 뉴클레오티드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열일 수 있고, 예를 들어 적합한 자연 발생 주형(예를 들어, 세포로부터 단리된 DNA 또는 RNA)으로부터 PCR에 의해 단리된 서열, 라이브러리(특히, 발현 라이브러리)로부터 단리된 뉴클레오티드 서열, 자연 발생 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입함으로써(미스매치 PCR과 같이 자체 공지된 임의의 적합한 기술을 사용하여) 제조된 뉴클레오티드 서열, 중복 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제조된 뉴클레오티드 서열 또는 자체 공지된 DNA 합성 기술을 사용하여 제조된 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

전술된 바와 같이, ISVD는 NANOBODY® ISVD 또는 이의 적합한 단편일 수 있다. NANOBODY® ISVD의 일반적인 설명을 위해, 아래의 추가 설명뿐만 아니라 본원에 인용된 선행 기술을 참조한다. 그러나 이와 관련하여, 이 설명 및 선행 기술이 소위 "V_H3 클래스"의 NANOBODY® ISVD(즉, DP-47, DP-51 또는 DP-29와 같은 V_H3 클래스의 인간 생식계열 서열과 고도의 서열 상동성을 갖는 ISVD)를 주로 기재했다는 것이 주지되어야 한다. 그러나 가장 넓은 의미에서 본원에 기재된 방법에서 사용된 ISVD 폴리펩티드는 일반적으로 모든 유형의 NANOBODY® ISVD를 사용할 수 있으며, 예를 들어 WO 2007/118670에 기재된 바와 같이, 예를 들어 소위 "V_H4 클래스"에 속하는 NANOBODY® ISVD(즉, DP-78과 같은 V_H4 클래스의 인간 생식계열 서열과 고도의 서열 상동성을 갖는 ISVD)도 사용한다는 점이 주지되어야 한다.

일반적으로, NANOBODY® ISVD(특히 (부분적으로) 인간화 V_HH 서열을 포함하는 V_HH 서열 및 낙타화 V_H 서열)는 하나 이상의 프레임워크 서열에서(본원에 추가로 기재된 바와 같음) 하나 이상의 프레임워크 서열(또한 본원에 추가로 기재된 바와 같음)에서 하나 이상의 "특징 잔기"(본원에 기재된 바와 같음)의 존재를 특징으로 할 수 있다. 따라서 일반적으로 NANOBODY® ISVD는 다음 (일반) 구조를 갖는 면역글로불린 서열로 정의될 수 있다:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

여기서 FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 지칭하고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 지칭하고, 하나 이상의 특징 잔기는 본원에 추가로 정의된 바와 같다.

특히, 나노바디는 다음 (일반) 구조를 갖는 면역글로불린 서열일 수 있다:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

여기서 FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 지칭하고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 지칭하며, 프레임워크 서열은 본원에 추가로 정의된 바와 같다.

보다 구체적으로, NANOBODY® ISVD는 다음 (일반) 구조를 갖는 면역글로불린 서열일 수 있다:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 지칭하고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 지칭하며,

Kabat 넘버링에 따른 위치 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 및 108에서의 아미노산 잔기 중 하나 이상은 아래 표 A에 언급된 특징 잔기로부터 선택된다.

[표 A]

NANOBODY® ISVD에서의 특징 잔기

5.3 다가 ISVD 폴리펩티드 및 이의 입체형태 변이체

적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 다가 ISVD 폴리펩티드의 정제 또는 단리 방법이 제공된다. 본원에 기재된 방법에 의해 단리/정제될 다가 ISVD 폴리펩티드는 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있다. 특히, 다가 ISVD 폴리펩티드는 CHO 세포가 아닌 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있다. 다가 ISVD 폴리펩티드는 예를 들어 피치아 파스토리스에서와 같이 본원에 기재된 바와 같은 하등 진핵생물 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있다. 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 다가 ISVD 폴리펩티드의 생산, 정제 및 단리 방법이 제공된다. 방법에 의해 단리/정제/생산될 다가 ISVD 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 숙주, 예컨대 하등 진핵생물 숙주에서 생산될 수 있다. 한 양태에서, 방법에 의해 단리/정제/생산될 다가 ISVD 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 효모 숙주, 예컨대 피치아, 예를 들어 피치아 파스토리스에서 생산될 수 있다.

일반적으로, 용어 "다가"는 폴리펩티드에서 다중 ISVD(결합 단위)의 존재를 표시한다. 한 실시형태에서, 폴리펩티드는 적어도 "3가", 즉 적어도 3개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 실시형태에서, 폴리펩티드는 적어도 "4가", 즉 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 본원에 기재된 방법에서 생산, 정제 및/또는 단리된 폴리펩티드는 각각 "3가", "4가", "5가", "6가", "7가", "8가", "9가" 등일 수 있으며, 즉 폴리펩티드는 각각 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 등의 ISVD를 포함하거나 이로 구성된다. 한 실시형태에서 다가 ISVD 폴리펩티드는 3가이다. 또 다른 실시형태에서 다가 ISVD 폴리펩티드는 4가이다. 또 다른 실시형태에서, 다가 ISVD 폴리펩티드는 5가이다.

적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 다가 ISVD 작제물은 또한 다중특이적일 수 있다. 용어 "다중특이적"은 다수의 상이한 표적 분자에 대한 결합을 지칭한다. 따라서 다가 ISVD 작제물은 "이중특이적", "삼중특이적", "사중특이적" 등일 수 있으며, 즉, 각각 2개, 3개, 4개 등의 상이한 표적 분자에 결합할 수 있다.

예를 들어, 폴리펩티드는 2개의 ISVD가 인간 TNFα에 결합하고 1개의 ISVD가 인간 혈청 알부민에 결합하는, 3개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드(예를 들어 화합물 C, 서열 번호 69)와 같은 이중특이적-3가일 수 있다. 또 다른 예에서, 폴리펩티드는 하나의 ISVD는 인간 TNFα에 결합하고, 2개의 ISVD는 인간 IL23p19에 결합하고, 하나의 ISVD는 인간 혈청 알부민에 결합하는, 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드(예를 들어 화합물 B, 서열 번호 2); 또는 하나의 ISVD는 인간 TNFα에 결합하고, 2개의 ISVD는 인간 IL6에 결합하고, 하나의 ISVD는 인간 혈청 알부민에 결합하는, 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드(예를 들어 화합물 D, 서열 번호 70; 또는 화합물 E, 서열 번호 71)와 같은 삼중특이적-4가일 수 있다. 또 다른 예에서, 폴리펩티드는 2개의 ISVD는 인간 TNFα에 결합하고, 2개의 ISVD는 인간 OX40L에 결합하고, 하나의 ISVD는 인간 혈청 알부민에 결합하는, 5개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드(예를 들어, 화합물 A, 서열 번호 1)와 같은 삼중특이적-5가일 수 있다.

본원에 기재된 방법에 의해 생산/정제/단리될 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD로 구성되는 폴리펩티드는 펩티드 링커와 같은 하나 이상의 적합한 링커에 의해 연결될 수 있다. 2개 이상의 (폴리)펩티드를 연결하기 위한 링커의 사용은 당분야에 잘 알려져 있다. 예시적인 펩티드 링커를 표 B에 나타낸다. 펩티드 링커의 종종 사용되는 한 클래스는 "Gly-Ser" 또는 "GS" 링커로 알려져 있다. 이들은 본질적으로 글리신(G) 및 세린(S) 잔기로 구성된 링커이며, 일반적으로 GGGGS(서열 번호 4) 모티프(예를 들어 식 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n을 가지며, 식 중 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 이상일 수 있음)와 같은 펩티드 모티프의 하나 이상의 반복부를 포함한다. 이러한 GS 링커의 일부 종종 사용되는 예는 9GS 링커(GGGGSGGGS, 서열 번호 7), 15GS 링커(n=3) 및 35GS 링커(n=7)이다. 예를 들어 문헌[Chen et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2013 Oct 15; 65(10): 1357-1369; 및 Klein et al., Protein Eng. Des. Sel. (2014) 27 (10): 325-330]을 참조한다. 한 실시형태에서, 폴리펩티드는 9GS 링커를 사용하여 폴리펩티드의 성분을 서로 연결한다. 한 실시형태에서, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD는 선택적으로 하나 이상의 펩티드 링커를 통해, 선형(즉, 비-분지형) 서열로 서로 연결된다.

본 발명의 방법에 의해 생산/정제/단리될 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD로 구성된 폴리펩티드는 또한 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위를 포함할 수 있다. 이들 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 상기 하나 이상의 다른 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위가 없는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 증가된 반감기를 갖는 폴리펩티드를 제공할 수 있다. 예를 들어, 결합 단위는 인간 혈청 알부민과 같은 인간 혈청 단백질과 같은 혈청 단백질에 결합하는 ISVD일 수 있다(예를 들어 WO 2012/175400, WO 2015/173325, WO 2017/080850, WO 2017/085172, WO 2018/104444, WO 2018/134234, WO 2018/134235 참고). 추가로, 본 발명의 방법에 의해 생산/정제/단리될 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD로 구성되는 폴리펩티드는 또한 임의의 정제 공정에 필요한 다른 적합한 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위(예를 들어, His-태그와 같은 태그)를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 생산/정제/단리될 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드는 또한 단백질 또는 폴리펩티드의 일부를 형성할 수 있으며, 이는 예를 들어, ISVD는 아니지만 다른 기능을 제공하는 하나 이상의 추가 아미노산 서열(모두 하나 이상의 적절한 링커를 통해 선택적으로 연결됨)을 포함한다. 예를 들어, 비제한적으로 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD가 이러한 단백질 또는 폴리펩티드에서 결합 단위로 사용될 수 있으며, 이는 결합 단위로서(즉, 하나 이상의 다른 표적에 대해) 및/또는 기능 단위로서 작용할 수 있는 ISVD가 아닌 하나 이상의 추가 아미노산 서열을 선택적으로 함유할 수 있다.

[표 B]

링커 서열 ("ID"는 본원에서 사용된 서열 번호를 지칭함)

생산, 정제 및/또는 단리될 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 다가 ISVD 폴리펩티드는 본원에 기재된 생산/정제/단리 방법의 원하는 산물이다. 이와 관련하여 용어 "적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 (다가 ISVD) 폴리펩티드"는 본 출원 내에서 "폴리펩티드", "원하는 폴리펩티드 (산물)", "ISVD 폴리펩티드", "원하는 ISVD 폴리펩티드", "(다가) ISVD 폴리펩티드 (산물)", 또는 "(다가) ISVD 작제물"과 상호교환적으로 사용된다. 원하는 폴리펩티드 산물은 또한 "산물", "온전한 산물" 또는 "온전한(ISVD) 형태"로 지칭된다. 온전한 형태는 SE-HPLC 및 IEX-HPLC와 같은 분석용 크로마토그래피 기술에서 주요 피크로 나타난다.

적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 다가 ISVD 폴리펩티드의 "입체형태 변이체"는 바람직하지 않으며 본 출원에 기재된 방법(들)에 의해 원하는 ISVD 폴리펩티드로 전환되고/되거나 온전한 산물 및 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 제거되어야 한다. 입체형태 변이체는 온전한 산물에 비해 더 조밀한 형태를 특징으로 한다. 따라서 용어 "입체형태 변이체"는 본 출원 내에서 "변이체", "조밀한 변이체", "조밀한 입체형태 변이체" 또는 "조밀한 형태"와 상호교환적으로 사용된다.

조밀한 변이체는 원하는 폴리펩티드 산물에 비해 감소된 수력학적 부피를 특징으로 한다. 일반적으로 수력학적 부피는 흡수된 용매와 함께 팽창되거나 팽윤된 분자 코일이 점유하는 겉보기 부피이다. 즉, 수력학적 부피는 특정 중합체 분자가 용액에 있을 때 차지하는 공간(용액 내 거대분자의 유효 수화 부피)의 크기이다. 거대분자의 수력학적 부피는 용액에서의 그 거동, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에서의 그 체류 시간으로부터 추론될 수 있으며 이에 따라 거대분자의 크기 기반 동적 특성이다. 단백질/폴리펩티드의 수력학적 부피를 측정함으로써, SEC는 단백질 3차 구조(또는 거대분자 상호작용을 보존하는 적절한 기본 조건이 사용되는 경우 심지어 4차 구조)를 검정하여 동일한 단백질/폴리펩티드의 폴딩된 버전 및 폴딩되지 않은 버전 또는 심지어 폴딩된 그리고 폴딩되지 않은 도메인이 구별되는 것을 허용할 수 있다(분자량은 아님). 예를 들어, 전형적인 단백질 도메인의 겉보기 수력학적 반경은 폴딩된 형태 및 폴딩되지 않은 형태에 대해 각각 14Å 및 36Å일 수 있다. 폴딩된 형태가 더 작은 크기로 인해 훨씬 나중에 용출되기 때문에, SEC는 이 두 형태의 분리를 허용한다.

조밀한 변이체는 원하는 폴리펩티드 산물과 비교하여 변경된 표면 전하 및/또는 변경된 소수성 노출(표면 소수성)을 특징으로 한다.

가설에 구애받지 않고 - 변이체의 조밀한 입체형태는 (원하는 폴리펩티드 산물과 비교하여) 폴리펩티드의 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD 빌딩 블록 중 적어도 2개 간 분자내 상호작용에 기인한다. 따라서, 입체형태 변이체는 적어도 2개의 ISVD가 서로 상호작용하여 원하는 폴리펩티드 산물과 비교하여 감소된 수력학적 부피를 초래하는 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱이, 조밀한 변이체는 이에 따라 적어도 2개의 ISVD가 서로 상호작용하여 원하는 폴리펩티드 산물과 비교하여 변경된 표면 전하 및/또는 변경된 표면 소수성을 초래하는 것을 특징으로 할 수 있다.

따라서, 입체형태 변이체는 수력학적 부피의 이동에 의해 원하는 폴리펩티드 산물과 구별될 수 있다. 더욱이, 입체형태 변이체는 표면 전하 및/또는 표면 소수성의 이동에 의해 원하는 폴리펩티드 산물과 구별될 수 있다. 입체형태 변이체 및 원하는 폴리펩티드 산물은 이의 분자량이 상이하지 않다. 따라서 입체형태 변이체 및 원하는 폴리펩티드 산물은 이의 분자량으로 구별할 수 없다. 또한, 입체형태 변이체 및 원하는 폴리펩티드 산물은 이의 디설피드 가교가 상이하지 않다. 따라서 입체형태 변이체 및 원하는 폴리펩티드 산물은 스크램블된 디설피드 가교로 구별할 수 없다.

상기 기재된 바와 같은 변경으로 인해, 입체형태 변이체 및 원하는 폴리펩티드 산물은 분석용 및/또는 분취용 크로마토그래피 기술에서 관찰된 원하는 폴리펩티드 산물과 비교하여 입체형태 변이체의 변경된 체류 시간에 의해 구별될 수 있다. 예를 들어, 입체형태 변이체는 SE-HPLC 및/또는 IEX-HPLC와 같은 하나 이상의 분석용 크로마토그래피 기술에 의해 원하는 폴리펩티드 산물과 구별될 수 있다. 특히, 입체형태 변이체는 수력학적 부피의 이동에 의해 원하는 폴리펩티드 산물과 구별될 수 있으며, 상기 이동은 분석용 SE-HPLC에서 증가된 체류 시간으로 표시된다. 더욱이, 입체형태 변이체는 표면 전하의 이동에 의해 원하는 폴리펩티드 산물과 구별될 수 있으며, 상기 이동은 분석용 IEX-HPLC에서 변경된 체류 시간으로 표시된다. 온전한 산물과 비교하여 입체형태 변이체의 증가된 체류 시간은 분석용 SE-HPLC에 의해 상기 SE-HPLC의 크로마토그램에서 후 피크 쇼울더 또는 분해된 후 피크로 확인할 수 있다. 온전한 산물과 비교한 입체형태 변이체의 표면 전하의 변경은 분석용 IEX-HPLC에 의해 상기 IEX-HPLC의 크로마토그램에서 전 피크 쇼울더 또는 분해된 전 피크로, 또는 후 피크 쇼울더 또는 분해된 후 피크로 각각 확인할 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 온전한 산물과 비교하여 입체형태 변이체의 체류 시간이 감소되는지 또는 증가되는지는 온전한 산물과 비교한 입체형태 변이체의 표면 전하 차이의 품질 및 양 둘 모두 뿐만 아니라 IEX-HPLC에 사용된 조건(예를 들어 수지, 완충액, pH, 염 농도/이온 강도 등)에 의존한다. 따라서, 한 실시형태에서, 입체형태 변이체는 IEX-HPLC에서 증가된 체류 시간을 특징으로 한다. 또 다른 실시형태에서, 입체형태 변이체는 IEX-HPLC에서 감소된 체류 시간을 특징으로 한다. 이와 같이, 입체형태 변이체는 온전한 산물과 비교하여 SE-HPLC에서 증가된 체류 시간을 특징으로 한다. 입체형태 변이체는 또한 온전한 산물과 비교하여 IEX-HPLC에서 변경된(감소된 또는 증가된) 체류 시간을 특징으로 한다.

전술된 변경으로 인해, 입체형태 변이체는 또한 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 이온 교환 크로마토그래피(IEX), 예를 들어 양이온 교환 크로마토그래피(CEX), 혼합 모드 크로마토그래피(MMC) 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)와 같은 하나 이상의 분취용 크로마토그래피 기술에 의해 온전한 산물과 구별될 수도 있다. 특히, 입체형태 변이체는 (상기 분취용 크로마토그래피 기술에서 관찰된 원하는 폴리펩티드 산물과 비교하여 입체형태 변이체의 변경된 체류 시간으로 인해) 상기 분취용 크로마토그래피 기술로부터 얻은 상이한 분획에서의 그 존재에 의해 (원하는) 폴리펩티드와 구별될 수 있다. 예를 들어, 입체형태 변이체는 상부 분획으로 용출되는 원하는 폴리펩티드 산물과 비교하여 분취용 IEX(예를 들어 CEX), 분취용 MMC(예를 들어 하이드록시아파타이트 수지 기반) 및/또는 HIC(예를 들어 HIC 컬럼 수지 또는 HIC 막 기반)에서 측면 분획에서의 그 존재를 특징으로 할 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 입체형태 변이체가 전측 분획 또는 후측 분획으로 용출되는지 여부, 즉 입체형태 변이체가 각각 감소된 또는 증가된 체류 시간을 가지고 용출되는지 여부는 원하는 폴리펩티드 산물과 비교하여 입체형태 변이체의 표면 전하 및/또는 표면 소수성 차이의 품질 및 양 둘 모두 뿐만 아니라 사용된 각각의 분취용 크로마토그래피 기술에서 사용된 조건(예를 들어 수지, 완충액, pH, 염 농도/이온 강도 등)에 의존한다.

따라서, SE-HPLC 및/또는 IEX-HPLC와 같은 본원에 제공된 특정 분석용 크로마토그래피 기술에 의한 입체형태 변이체의 확인 후, 당업자는 입체형태 변이체를 제거하기 위해 분취용 크로마토그래피 기술을 조정/최적화할 수 있다.

추가 양태에서, 입체형태 변이체는 효능의 변경에 의해 원하는 폴리펩티드 산물과 구별될 수 있으며, 입체형태 변이체는 원하는 폴리펩티드 산물과 비교하여 감소된 효능(본원에 정의된 바와 같음)을 갖는다.

더욱이, 입체형태 변이체는 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법에서 원하는 폴리펩티드 산물로 전환되는 그 능력에 의해 원하는 폴리펩티드 산물과 구별될 수 있다. 보다 구체적으로, 입체형태 변이체는

i) 단리 및/또는 정제 공정의 하나 이상의 단계에서 저 pH 처리의 적용;

ii) 단리 및/또는 정제 공정의 하나 이상의 단계에서 무질서유발제의 적용;

iii) 단리 및/또는 정제 공정의 하나 이상의 단계에서 열 스트레스의 적용; 또는

iv) i) 내지 iii) 중 임의의 것의 조합 시

원하는 폴리펩티드 산물로 전환되는 그 능력을 특징으로 하며,

전환은 SE-HPLC 및/또는 IEX-HPLC와 같은 하나 이상의 분석용 크로마토그래피 기술에 의해 실증된다. 특히, 전환은 분석용 SE-HPLC의 크로마토그램에서 후 피크 쇼울더 또는 분해된 후 피크의 감소 또는 (심지어) 소실에 의해 실증된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 전환은 분석용 IEX HPLC의 크로마토그램에서 전 피크 쇼울더 또는 분해된 전 피크, 후 피크 쇼울더 또는 분해된 후 피크의 감소 또는 (심지어) 소실에 의해 실증된다.

부가적으로 또는 대안적으로, 전환은 원하는 폴리펩티드 산물의 효능 대비 효능의 부분적 또는 전체적 회복에 의해 실증된다.

5.4 생산/정제/단리 방법

전술된 다가 ISVD 폴리펩티드 산물을 단리 또는 정제하는 방법이 제공되며, 단리 또는 정제될 다가 ISVD 폴리펩티드는 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있다. 한 실시형태에서, 숙주는 CHO 세포가 아니다. 한 실시형태에서, 숙주는 본원에 제공된 바와 같은 하등 진핵생물 숙주이다(섹션 5.3 "다가 ISVD 폴리펩티드 및 이의 입체형태 변이체"). 본원에 사용된 용어 "정제하다", "정제" 또는 "정제하는"은 원하는 다가 ISVD 폴리펩티드 산물 및 입체형태 변이체를 포함하는 조성물에 불순한 요소(특히 입체형태 변이체)가 없음을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "단리하다", "단리" 또는 "단리하는"은 원하는 다가 폴리펩티드 산물이 불순한 요소 외에 원하는 다가 ISVD 폴리펩티드 산물 및 이의 입체형태 변이체 둘 모두를 포함하는 조성물로부터 구분되거나 분리된다는 것을 의미한다.

또한, 숙주에서 다가 ISVD 폴리펩티드 산물을 생산하는 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 숙주는 CHO 세포가 아니다. 한 실시형태에서, 숙주는 본원에 제공된 바와 같은 하등 진핵생물 숙주이다. 방법은 숙주 세포 또는 숙주 유기체를 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로 형질전환/형질감염시키는 단계, 숙주에서 폴리펩티드를 발현하는 단계, 이어서 하나 이상의 단리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 다가 ISVD 폴리펩티드 산물을 생산하는 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:

a) 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체 또는 또 다른 적합한 발현 시스템에서 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 발현하는 단계; 이어서

b) 원하는 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계.

하등 진핵생물 숙주 세포와 같은 숙주에 의해 생산된 다가 ISVD 폴리펩티드의 상당분에서, 산물 관련 입체형태 변이체의 존재가 관찰된다. 이 입체형태 변이체의 존재는 최종 다가 ISVD 폴리펩티드 산물의 품질 및 균질성에 영향을 미칠 수 있다. 그러나 높은 산물 품질 및 균질성은, 예를 들어 이러한 다가 ISVD 폴리펩티드 산물의 치료 용도를 위한 전제조건이다.

본 출원은 개선된 품질(즉, 감소된 수준의 입체형태 변이체 또는 그 부재)을 갖는 다가 ISVD 폴리펩티드 산물을 포함하는 조성물의 생산/정제/단리 방법을 기재한다. (1) 입체형태 변이체가 원하는 폴리펩티드 산물로 전환되고/되거나 (2) 입체형태 변이체가 다가 ISVD 폴리펩티드의 단리 또는 정제 단계 동안 제거되는 특정 조건을 적용함으로써 품질이 개선된다. 따라서, 산물-관련 입체형태 변이체를 ISVD-함유 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키는 방법이 본원에 제공된다. (원하는) 폴리펩티드 산물 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 산물-관련 입체형태 변이체를 제거하는 방법이 또한 제공된다. 산물-관련 입체형태 변이체를 (원하는) ISVD 폴리펩티드 산물로 전환시키고 (원하는) ISVD 폴리펩티드 산물 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 산물-관련 입체형태 변이체를 제거하는 방법이 제공된다.

5.4.1 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드의 생산

본 발명자들은 숙주에서 폴리펩티드의 생산 시 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드의 입체형태 변이체를 확인했다. 입체형태 변이체는 숙주, 특히 본원에 제공된 바와 같은 하등 진핵생물 숙주인 숙주에서 생산 시 관찰되었다.

당업자는 숙주 세포에서 면역글로불린 단일 가변 도메인을 생산하는 일반적인 방법을 잘 알고 있다.

일반적인 실시형태에서, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법은 아래의 섹션 5.4.3 "입체형태 변이체의 원하는 폴리펩티드 산물로의 전환" 및 5.4.4 "입체형태 변이체의 제거"에 추가로 설명된 바와 같이, 입체형태 변이체의 원하는 ISVD 폴리펩티드 산물로의 전환 및/또는 원하는 ISVD 폴리펩티드 산물 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 입체형태 변이체의 제거를 초래하는 하나 이상의 정제/단리 단계를 포함한다.

보다 구체적으로, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법은 적어도 하기 단계를 포함한다:

c) 배지로부터 분비된 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계로서, 상기 단리 및/또는 정제는 입체형태 변이체의 원하는 ISVD 폴리펩티드 산물로의 전환 및/또는 원하는 ISVD 폴리펩티드 산물 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 입체형태 변이체의 제거를 초래하는, 하나 이상의 정제/단리 단계를 포함하는, 단계.

본원에 기재된 방법에 의해 단리/정제될 ISVD 폴리펩티드는 숙주에서 생산될 수 있다. 숙주는 CHO 세포가 아닌 숙주일 수 있다. 특히, 숙주는 효모 유기체와 같은 하등 진핵생물 숙주일 수 있다. 분리/정제할 폴리펩티드의 생산에 적합한 효모 유기체는 피치아(코마가탤라), 한세눌라, 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 칸디다, 토룰롭시스, 토룰라스포라, 스키조사카로마이세스, 시테로마이세스, 파키솔렌, 데바로마이세스, 메추니코위아, 로도스포리디움, 류코스포리디움, 보트리오아스쿠스, 스포리디오볼루스, 엔도마이콥시스이다. 특정 실시형태에서 정제/단리될 폴리펩티드는 피치아, 특히 피치아 파스토리스에서 생산된다.

피치아 파스토리스와 같은 하등 진핵생물 숙주에서 ISVD의 생산은 문헌[Frenken et al. 2000 (J. Biotechnol. 78: 11-21), WO 94/25591, WO 2010/125187, WO 2012/056000, WO 2012/152823 및 WO2017/137579]에서 설명되었다. 이들 출원의 내용은 적합한 배지 및 조건을 포함하여 일반적인 배양 기술 및 방법과 관련하여 명시적으로 참조된다. 당업자는 또한 공통 일반 지식에 기반하여 숙주 세포에서 도메인의 발현에 적합한 유전자 작제물을 고안할 수 있다.

용어 "숙주 유기체" 및 "숙주 세포(들)"는 본원에서 공동으로 "숙주"로 지칭된다. 본원에 기재된 생산 방법에서, ISVD 함유 폴리펩티드의 생산에 적합한 한, 임의의 숙주(유기체) 또는 숙주 세포가 사용될 수 있다. 특히, 폴리펩티드의 일부가 산물-관련 입체형태 변이체의 형태로 생산되는 숙주(예를 들어, 하등 진핵생물 숙주)가 기재되어 있다.

적합한 숙주의 구체예는 코리네포름(coryneform) 박테리아 또는 엔테로박테리아세애(enterobacteriaceae)와 같은 원핵생물 유기체를 포함한다. 곤충 세포, 특히 BTI-TN-5B1-4 High Five™ 곤충 세포(Invitrogen), SF9 또는 Sf21 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 트리오플루시아니(Trioplusiani) 또는 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 유래 세포와 같은 배큘로바이러스 매개 재조합 발현에 적합한 곤충 세포; 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포 및 피치아(코마가탤라), 한세눌라, 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 칸디다, 토룰롭시스, 토룰라스포라, 스키조사카로마이세스, 시테로마이세스, 파키솔렌, 데바로마이세스, 메추니코위아, 로도스포리디움, 류코스포리디움, 보트리오아스쿠스, 스포리디오볼루스, 엔도마이콥시스와 같은 효모를 포함하는 하등 진핵생물 숙주도 포함된다. 한 실시형태에서, 피치아 파스토리스와 같은 효모가 숙주로서 사용된다.

생산 방법에서 사용된 숙주는 ISVD 함유 폴리펩티드를 생산할 수 있을 것이다. 이는 전형적으로 하나 이상의 ISVD 함유 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하도록 유전적으로 변형될 것이다. 유전적 변형의 비제한적 예는 예를 들어 플라스미드 또는 벡터를 사용한 형질전환, 또는 바이러스 벡터를 사용한 형질도입을 포함한다. 일부 숙주는 융합 기술에 의해 유전적으로 변형될 수 있다. 유전적 변형은 예를 들어 상동 재조합에 의한, 예를 들어 숙주의 염색체로의 통합에 의한 숙주의 유전 물질의 직접적인 변형뿐만 아니라 숙주 내로의 별도 핵산 분자, 예를 들어 플라스미드 또는 벡터의 도입을 포함한다. 종종 둘 모두의 조합이 발생할 것이며, 예를 들어 숙주는 플라스미드로 형질전환되고, 상동 재조합 시 숙주 염색체 내로(적어도 부분적으로) 통합될 것이다. 당업자는 숙주가 ISVD 함유 폴리펩티드를 생산할 수 있도록 하는 숙주의 유전적 변형의 적절한 방법을 알고 있다.

핵산의 발현 및 폴리펩티드의 생산을 위한 특정 조건 및 유전적 작제물, 예를 들어 문헌[WO 94/25591, Gasser et al. Biotechnol. Bioeng. 94: 535, 2006; Gasser et al. Appl. Environ. Microbiol. 73: 6499, 2007; 또는 Damasceno et al. Microbiol. Biotechnol. 74: 381, 2007]에 기재된 일반 배양 방법, 플라스미드, 프로모터 및 리더 서열은 당분야에 기재되어 있다.

5.4.2 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드의 정제

당업자는 ISVD 폴리펩티드(예를 들어 V_H및 V_HH)를 정제하는 일반적인 방법을 잘 알고 있다.

예를 들어, ISVD의 정제는 WO 2010/125187 및 WO 2012/056000에 기재되었다.

폴리펩티드의 생산/발현 후, 숙주는 일상적인 수단에 의해 배양 배지로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 숙주는 원심분리 또는 여과에 의해 제거될 수 있다. 배양 배지로부터 숙주를 제거하여 얻은 용액은 배양 상청액 또는 정화된 배양 상청액으로도 지칭된다.

다가 ISVD 산물은 표준 방법에 의해 인큐베이션 상청액으로부터 정제할 수 있다. 표준 방법은 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 이온 교환 크로마토그래피(IEX), 친화도 크로마토그래피(AC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 혼합 모드 크로마토그래피(MMC)를 포함하는 크로마토그래피 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 방법은 단독으로 또는 다른 정제 방법, 예를 들어 침전과 조합되어 수행될 수 있다. 당업자는 공통 일반 지식에 기반하여 ISVD 및 ISVD 함유 폴리펩티드에 대한 정제 방법의 적합한 조합을 고안할 수 있다. 구체예에 대해서는 본원에 인용된 기술을 참조한다.

아래에 상세히 기재된 바와 같이(섹션 5.4.3 "입체형태 변이체의 원하는 폴리펩티드 산물로의 전환" 및 5.4.4 "입체형태 변이체의 제거") 입체형태 변이체를 전환 또는 제거하는 임의의 조건 또는 이의 조합은 이러한 정제 방법의 임의의 단계 전에, 이 때에 또는 사이에 또는 후에 적용될 수 있다는 것이 고려된다.

임의의 또는 모든 크로마토그래피 단계는 임의의 기계적 수단에 의해 수행될 수 있다. 크로마토그래피는 예를 들어 컬럼에서 수행될 수 있다. 컬럼은 압력을 가하거나 가하지 않고 위에서 아래로 또는 아래에서 위로 수행될 수 있다. 컬럼에서 유체의 흐름 방향은 크로마토그래피 공정 동안 역전될 수 있다. 크로마토그래피는 고체 매질을 중력, 원심분리 또는 여과를 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 샘플을 로딩, 세척 및 용출하기 위해 사용되는 액체로부터 분리하는 배치 공정을 사용하여 수행될 수도 있다.

크로마토그래피는 샘플 내 일부 분자를 다른 분자보다 더 강하게 흡수하거나 보유하는 필터와 샘플을 접촉시켜 수행될 수도 있다. 하기 설명에서, 다양한 실시형태는 대부분 컬럼에서 수행되는 크로마토그래피의 맥락에서 기재된다. 그러나 당업자가 배치 공정 또는 필터를 사용하는 것과 같은 다른 양식에 대한 교시 또한 쉽게 적용할 수 있으므로, 컬럼의 사용은 사용될 수 있는 몇몇 크로마토그래피 방식 중 하나일 뿐이며, 컬럼을 사용한 예시가 컬럼 크로마토그래피에 대한 적용을 제한하지 않는 것이 이해된다.

적합한 지지체는 청구된 방법을 실행하는 데 필요한 특성을 가진 임의의 현재 이용 가능하거나 나중에 개발된 물질일 수 있으며 임의의 합성, 유기 또는 천연 중합체에 기반할 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 지지체 물질은 셀룰로스, 폴리스티렌, 아가로스, 세파로스(Sepharose), 폴리아크릴아미드 폴리메타크릴레이트, 덱스트란 및 전분과 같은 유기 물질 및 석탄, 실리카(유리 비드 또는 모래) 및 세라믹 물질와 같은 무기 물질을 포함한다. 적합한 고체 지지체는 예를 들어 문헌[Zaborsky "Immobilized Enzymes" CRC Press, 1973, Table IV on pages 28-46]에 개시되어 있다.

일반적인 방법 조건, 용액 및/또는 완충액뿐만 아니라 상이한 크로마토그래피 공정에 사용하기 위한 농도 범위는 크로마토그래피에 대한 표준 핸드북(예를 들어 G

nter Jagschies, Eva Lindskog (ed.) Biopharmaceutical Processing, Development, Design, and Implementation of Manufacturing Processes, 1^st Ed. 2017, Elsevier 참고)에 기반하여, 크로마토그래피 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다.

ISVD 폴리펩티드 정제 공정의 제1 단계는 종종 "포획 단계"로 지칭된다. 포획 단계의 목적은 공정 관련 불순물(예를 들어 비제한적으로 숙주 세포 단백질(HCP), 색상 및 DNA)을 먼저 감소시키고 높은 회수율을 유지하면서 ISVD 폴리펩티드 산물을 포획하는 것이다. 한 실시형태에서, 포획 단계는 결합 및 용출 모드에서 단백질 A 크로마토그래피에 대한 제1 정제 단계를 지칭한다.

정제 공정의 제2 단계는 종종 순도 개선을 목표로 하는 "연마 단계"로 지칭된다. 예를 들어, ISVD 폴리펩티드 정제 공정의 제2 정제 단계로서 결합 및 용출 모드의 이온 교환 크로마토그래피 단계가 산물 관련 변이체(예를 들어 비제한적으로 고분자량(HMW) 종, 저분자량(LMW) 종 및 기타 하전된 변이체)뿐만 아니라 포획 단계 후에도 여전히 존재하는 일부 공정 관련 불순물(예를 들어 비제한적으로 HCP, 잔여 단백질 A, DNA)을 제거하기/감소시키기 위해 사용될 수 있다.

하나의 예시적인 실시형태에서, 다가 ISVD 폴리펩티드는 단백질 A 상의 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피의 조합에 의해 배양 상청액으로부터 정제될 수 있다. 임의의 "정제 단계"에 대한 언급은 이러한 특정 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

단백질 A 기반 크로마토그래피

한 실시형태에서, ISVD 폴리펩티드 함유 제조물은 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 스타필로코커스 단백질 A(SpA)는 N-말단으로부터 순서대로 E, D, A, B 및 C로 명명된 5개의 거의 상동성인 도메인으로 이루어진 42 kDa 단백질이다(Sjodhal Eur. J. Biochem. 78: 471-490 (1977); Uhlen et al. J. Biol. Chem. 259: 1695-1702 (1984)). 이들 도메인은 각각 약 65% 내지 90% 아미노산 서열 동일성을 공유하는, 대략 58개의 잔기를 함유한다. 단백질 A 및 항체 간 결합 연구는 SpA의 모든 5개 도메인(E, D, A, B 및 C)이 Fc 영역을 통해 IgG에 결합하는 반면, 도메인 D 및 E는 유의한 Fab 결합을 나타내는 것을 보였다(Ljungberg et al. Mol. Immunol. 30(14): 1279-1285 (1993); Roben et al. J. Immunol. 154: 6437-6445 (1995); Starovasnik et al. Protein Sei. 8: 1423-1431 (1999). B 도메인의 기능적 유사체이자 에너지 최소화 버전인 Z-도메인(Nilsson et al. Protein Eng. 1: 107-113 (1987))은 항체 가변 도메인 영역에 대해 무시할 수 있는 결합을 갖는 것으로 나타났다(Cedergren et al. Protein Eng. 6(4): 441-448 (1993); Ljungberg et al. (1993) 상기 문헌; Starovasnik et al. (1999) 상기 문헌).

최근까지 상업적으로 이용 가능한 단백질 A 정지상은 이의 고정된 리간드로 SpA(스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 단리되거나 재조합적으로 발현됨)를 사용했다. 이러한 컬럼을 사용하면 비-단백질성 리간드를 사용하는 크로마토그래피의 다른 모드에서 전형적으로 수행되는 것과 같이 컬럼 재생 및 위생을 위해 알칼리 조건을 사용할 수 없었다(Ghose et al. Biotechnology and Bioengineering Yol. 92 (6): 665-73 (2005)). 더 강한 알칼리 조건을 견디기 위해 새로운 수지(MabSELECT™ SuRe)가 개발되었다(Ghose et al. (2005) 상기 문헌). 단백질 조작 기술을 사용하여, 단백질 A의 Z-도메인에서 다수의 아스파라긴 잔기가 대체되었고 4개의 동일하게 변형된 Z-도메인의 사량체로서 새로운 리간드가 생성되었다(Ghose et al. (2005) 상기 문헌).

따라서, 정제 방법은 제조사의 사양에 따라 시판되는 단백질 A 컬럼을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, MabSELECT™ 컬럼 또는 MabSELECT™ SuRe 컬럼(GE Healthcare Products)이 사용될 수 있다. MabSELECT™는 그 고정된 리간드로 재조합 SpA를 함유하는 시판되는 수지이다. 제어된 기공 유리에 공유 커플링된 단백질 A로 구성된 PROSEP-ATM(Millipore, UK)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 단백질 A 컬럼의 다른 시판원이 유용하게 사용될 수 있다. 다른 유용한 단백질 A 제형물은 단백질 A 세파로스 FAST FLOW™(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), Amsphere™A3(JSR Life Sciences) 및 TOYOPEARL™ 650M 단백질 A(TosoHaas Co., Philadelphia, PA)를 포함한다.

단백질 A 기반 크로마토그래피에 의한 단백질 정제는 고정된 단백질 A 리간드를 함유하는 컬럼(전형적으로, 단백질 A 또는 이의 기능적 유도체로 구성되는 흡착제가 부착된 메타크릴레이트 공중합체 또는 아가로스 비드의 변형된 지지체가 충전된 컬럼)에서 수행될 수 있다. 컬럼은 전형적으로 완충액으로 평형화되고 단백질 혼합물(표적 단백질과 오염 단백질)을 함유하는 샘플이 컬럼 상으로 로딩된다. 혼합물이 컬럼을 통과함에 따라, 표적 단백질은 컬럼 내의 흡착제(단백질 A 또는 이의 유도체)에 결합하는 반면, 일부 결합되지 않은 불순물 및 오염물은 관류된다. 그런 다음 결합된 단백질이 컬럼에서 용출된다. 이 공정에서 표적 단백질은 컬럼에 결합되는 반면 불순물 및 오염 물질은 컬럼에서 관류된다. 이후 표적 단백질이 용출액에서 회수된다.

일반적인 실시형태에서, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 정제/단리하는 방법이 제공되며, 방법은 섹션 5.4.3 "입체형태 변이체의 원하는 폴리펩티드 산물로의 전환" 및 5.4.4 "입체형태 변이체 제거"에 추가로 설명된 바와 같이, 입체형태의 변이체의 원하는 ISVD 폴리펩티드 산물로의 전환 및/또는 원하는 ISVD 폴리펩티드 산물 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 입체형태 변이체의 제거를 초래하는 하나 이상의 정제/단리 단계를 포함한다.

5.4.3 입체형태 변이체의 원하는 폴리펩티드 산물로의 전환

한 양태에서, 폴리펩티드 산물 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물은 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키는 조건을 적용함으로써 정제된다.

이러한 양태에서, 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키는 조건은 a) 저 pH 처리 적용, b) 무질서유발제 적용 c) 열 스트레스 적용, 및 d) a) 내지 c)의 처리 중 임의의 것의 조합 적용으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 한 실시형태에서, 입체형태 변이체는 저 pH 처리 및 무질서유발제를 적용함으로써 원하는 폴리펩티드 산물로 전환된다. 또 다른 실시형태에서, 입체형태 변이체는 저 pH 처리 및 열 처리를 적용함으로써 원하는 폴리펩티드 산물로 전환된다. 추가 실시형태에서, 입체형태 변이체는 열 스트레스 및 무질서유발제를 적용함으로써 원하는 폴리펩티드 산물로 전환된다. 또 다른 실시형태에서, 입체형태 변이체는 저 pH 처리, 무질서유발제 및 열 스트레스를 적용함으로써 원하는 폴리펩티드 산물로 전환된다.

입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키는 조건은 (비제한적으로) 다가 ISVD 폴리펩티드를 포함하는 배양 상청액에(포획 단계 전에), 포획 단계 동안, 포획 단계 후에 그러나 연마 단계 전에, 연마 단계 동안 또는 연마 단계 후에 적용될 수 있다. 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키는 조건은 다가 ISVD 폴리펩티드의 부분적으로 또는 고도로 정제된 제조물에 적용될 수 있다. 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키는 조건은 또한 정화된 상청액 또는 ISVD 함유 폴리펩티드의 부분적으로 또는 고도로 정제된 제조물에 대해 컬럼에 적용될 수 있다. 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키는 조건은 또한 또 다른 단계 동안, 예컨대 여과 단계 또는 정제의 임의의 다른 단계 전에 또는 후에 적용될 수 있다.

하기에서, 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키는 조건이 보다 상세히 논의된다. 이러한 조건을 적용하는 것은 다가 ISVD 폴리펩티드의 "처리"로도 지칭될 것이다.

저 pH 처리

입체형태 변이체는 저 pH 처리에 의해 원하는 폴리펩티드 산물로 전환될 수 있다.

저 pH 처리는 다가 ISVD 폴리펩티드의 정제/단리 공정 동안 언제든지 적용될 수 있다. 한 실시형태에서, 저 pH 처리는 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 전에 적용된다. 또 다른 실시형태에서, 저 pH 처리는 크로마토그래피 기술, 예를 들어 단백질 A-기반 친화도 크로마토그래피(AC)에 기반하는 정제 단계 동안 적용된다. 예를 들어, 저 pH 처리는 단백질 A 기반 친화도 크로마토그래피 ISVD 폴리펩티드 포획 단계 동안 적용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 저 pH 처리는 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 후에 적용된다. 예를 들어, 저 pH 처리는 단백질 A 기반 친화도 크로마토그래피 ISVD 폴리펩티드 포획 단계 후에(및 ISVD 폴리펩티드 연마 단계 전에) 적용될 수 있다. 대안적으로, 저 pH 처리는 ISVD 폴리펩티드 연마 단계 후에 적용될 수 있다.

저 pH 처리는 입체형태 변이체가 온전한 ISVD 폴리펩티드 산물로 전환되도록 하기 충분한 양의 시간 동안 원하는 폴리펩티드 산물 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물의 pH를 약 pH 3.2 이하로 감소시키는 것을 포함한다.

저 pH 처리는 입체형태 변이체가 온전한 ISVD 폴리펩티드 산물로 전환되도록 하기 충분한 양의 시간 동안 원하는 폴리펩티드 산물 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물의 pH를 약 pH 3.0 이하로 감소시키는 것을 포함한다.

따라서 저 pH 처리는 온전한 폴리펩티드 산물 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물(예를 들어, (단백질 A) 포획 단계 후 포획 용출액)의 pH를 약 pH 3.2 이하, 약 pH 3.1 이하, 약 pH 3.0 이하, 약 pH 2.9 이하, 약 pH 2.8 이하, 약 pH 2.7 이하, 약 pH 2.6 이하, 약 pH 2.5 이하, 약 pH 2.4 이하, 약 pH 2.3 이하, 약 pH 2.2 이하, 또는 약 pH 2.1 이하로 감소시키는 것을 포함한다. 구체적으로, 조성물의 pH는 약 pH 2.9, 약 pH 2.8, 약 pH 2.7, 약 pH 2.6, 약 pH 2.5, 약 pH 2.4, 약 pH 2.3, 약 pH 2.2, 또는 약 2.1로 감소될 수 있다. 한 실시형태에서, pH는 약 pH 3.2 내지 약 pH 2.1, 약 pH 3.0 내지 약 pH 2.1, 약 pH 2.9 내지 약 pH 2.1, 약 pH 2.7 내지 약 pH 2.1로 감소된다. 또 다른 실시형태에서, pH는 약 pH 2.6 내지 약 pH 2.3으로 감소된다. 또 다른 실시형태에서, pH는 약 pH 2.5 내지 약 pH 2.1로 감소된다.

저 pH 처리에서, pH는 임의의 일상적인 수단에 의해 감소될 수 있다. 예를 들어, 원하는 폴리펩티드 산물 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물의 pH는 HCl을(예를 들어, 0.1 M, 1 M, 3 M 또는 2.7 M과 같은 0.1 M 내지 3 M의 스톡 농도에서) 사용하여 또는 글리신을(예를 들어 0.1 M의 스톡 농도에서) 사용하여 감소될 수 있다. 당업자는 다른 적합한 수단을 쉽게 선택할 수 있다.

한 실시형태에서, 저 pH 처리는 크로마토그래피 기술, 예를 들어 단백질 A 기반 친화도 크로마토그래피에 기반하는 정제 단계 동안 적용된다. 단백질 A 기반 친화도 크로마토그래피에 사용되는 용출 완충액은 약 pH 2.5 이하의 pH를 가질 수 있다. 대안적으로, 단백질 A 기반 친화도 크로마토그래피에 사용되는 용출 완충액은 폴리펩티드를 함유하는 생성 용출액이 약 pH 3.2 이하, 예컨대 약 pH 2.9 미만의 pH를 갖도록 하는 pH를 갖는다. 상기 표시된 바와 같이 용출 완충액을 사용하는 단백질 A 컬럼으로부터 폴리펩티드의 후속적인 용출에서, 폴리펩티드를 함유하는 생성 용출액의 pH는 (선택적으로) pH 2.5 이하의 pH로 추가 감소될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 생성 용출액의 pH는 적어도 약 0.5시간, 예컨대 1시간 또는 2시간 동안 약 pH 3.2 이하의 pH로 조정될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 생성 용출액의 pH는 적어도 약 0.5시간, 예컨대 1시간 또는 2시간 동안 약 pH 2.9 이하의 pH로 조정될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 생성 용출액의 pH는 적어도 약 1시간 동안 약 pH 2.7 이하의 pH로 조정될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 크로마토그래피 기술은 단백질 A 기반 친화도 크로마토그래피이며, 용출 완충액은 약 pH 2.2의 pH를 갖고, 생성 용출액의 pH는 적어도 약 1.5시간 동안 약 pH 2.5의 pH로 조정된다.

본 발명의 기술은 또한 SE-HPLC 및 IEX-HPLC와 같은 분석용 크로마토그래피 방법에 의해 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드의 입체형태 변이체를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 기술은 저 pH 처리에 의해 입체형태 변이체를 온전한 산물로 전환시키는 개념을 추가로 제공한다. 따라서, 본원에 제공된 개념에 기반하여, 당업자는 최적 산성 pH뿐만 아니라 인큐베이션 시간 둘 모두의 측면에서 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 임의의 폴리펩티드에 대해 본원에 기재된 저 pH 처리를 조정할 수 있다.

저 pH 처리는 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 pH를 증가시킴으로써 종료될 수 있다. 저 pH 처리는 저 pH 처리된 조성물의 pH를 적어도 1 pH 단위 증가시킴으로써 종료될 수 있다. 예를 들어, 저 pH 처리가 약 pH 2.7에서 수행된 경우, pH를 적어도 약 pH 3.7로 증가시킴으로써 처리가 종료될 수 있다. 저 pH 처리는 저 pH 처리된 조성물의 pH를 적어도 2 pH 단위 증가시킴으로써 종료될 수 있다. 예를 들어, 저 pH 처리가 약 pH 2.7에서 수행된 경우, pH를 적어도 약 pH 4.7로 증가시킴으로써 처리가 종료될 수 있다. 따라서, 저 pH 처리는 pH를 약 pH 3.5 이상, 약 pH 4.0 이상, 약 pH 4.5 이상, 약 pH 5.0 이상, 약 pH 5.5 이상, pH 6.0 이상, 약 pH 6.5 이상, 약 pH 7.0 이상, 약 pH 7.5 이상, 약 pH 8.0 이상 등으로 증가시킴으로써 종료될 수 있다. 그러나, pH를 너무 높게(예를 들어, 약 pH 9 이상으로) 증가시키는 것은 폴리펩티드 산물의 (심각한) 분해를 초래할 수 있다. 이와 같이, 저 pH 처리는 pH를 약 pH 4 내지 약 pH 8, 또는 약 pH 5 내지 약 pH 7.5로 증가시킴으로써 종료된다. 당업자에게 명백한 바와 같이, pH 증가는 가능한 후속 정제, 제형화 또는 보관 단계에 필요한 pH에 적응될 수 있다. 본 출원에서, 저 pH 처리의 종료는 "pH 중화"와 상호교환적으로 사용된다.

저 pH 처리를 종료하기 위해, pH는 임의의 일상적인 수단에 의해 증가될 수 있다. 비제한적으로, 예를 들어, 조성물의 pH는 NaOH를(예를 들어, 0.1 M 또는 1 M의 스톡 농도로) 사용하여 또는 아세트산나트륨을(예를 들어, 1 M의 스톡 농도로) 사용하여 증가될 수 있다. 당업자는 다른 적합한 수단을 쉽게 선택할 수 있다.

본원에 기재된 방법에 기반하여, 당업자는 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키는 데 필요한 시간을 결정할 수 있다. 예를 들어, 저 pH 처리는 입체형태 변이가 본원에 기재된 크로마토그래피 기술에 의해 본질적으로 더 이상 검출될 수 없을 때까지, 충분한 양의 시간 동안 적용된다. 예를 들어, 저 pH 처리는 분석용 SE-HPLC를 사용하여 저 pH 처리 후 조성물의 크로마토그램에서 본질적으로 후 피크 쇼울더 또는 분해된 후 피크(입체형태 변이체를 표시함)가 관찰되지 않을 때까지, 충분한 양의 시간 동안 적용된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 저 pH 처리는 분석용 IEX-HPLC를 사용하여 저 pH 처리 후 조성물의 크로마토그램에서 본질적으로 전/후 피크 쇼울더 또는 분해된 전/후(입체형태 변이체를 표시함)가 관찰되지 않을 때까지, 충분한 양의 시간 동안 적용된다. 이와 관련하여, 저 pH 처리는 적어도 약 0.5시간 동안, 적어도 약 1시간 동안, 적어도 약 1.5시간 동안, 적어도 약 2시간 동안, 적어도 약 2.5시간 동안, 적어도 약 3시간 동안, 적어도 약 3.5시간 동안, 적어도 약 4시간 동안, 적어도 약 6시간 동안, 적어도 약 8시간 동안, 적어도 약 12시간 동안, 적어도 약 24시간 동안 적용될 수 있다. 예를 들어, 저 pH 처리는 약 0.5시간, 약 1시간, 약 1.5시간, 약 2시간, 약 2.5시간, 약 3시간, 약 3.5시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 12시간, 약 24시간 동안 적용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 저 pH 처리는 적어도 약 1시간, 또는 적어도 약 2시간, 또는 적어도 약 4시간 동안 적용될 수 있다.

한 실시형태에서, pH는 적어도 0.5시간 동안 약 pH 3.2 내지 약 2.1로, 적어도 0.5시간 동안 약 pH 2.9 내지 약 2.1로, 적어도 0.5시간 동안 약 pH 2.7 내지 약 2.1로 감소되고, 예를 들어, 0.5시간 동안 약 pH 2.9, 약 pH 2.7, 약 pH 2.5, 또는 약 pH 2.3으로 감소된다. 또 다른 실시형태에서, pH는 적어도 1시간 동안 약 pH 3.2 내지 약 2.1로, 적어도 1시간 동안 약 pH 2.9 내지 약 2.1로, 적어도 1시간 동안 약 pH 2.7 내지 약 2.1로, 예를 들어, 1시간 동안 약 pH 2.9, 약 pH 2.7, 약 pH 2.5, 또는 약 pH 2.3으로 감소된다. 또 다른 실시형태에서, pH는 적어도 2시간 동안 약 pH 3.2 내지 약 2.1로, 적어도 2시간 동안 약 pH 2.9 내지 약 2.1로, 적어도 2시간 동안 약 pH 2.7 내지 약 2.1로, 예를 들어, 2시간 동안 약 pH 2.9, 약 pH 2.7, 약 pH 2.5, 또는 약 pH 2.3으로 감소된다. 또 다른 실시형태에서, pH는 적어도 4시간 동안 약 pH 3.2 내지 약 2.1로, 적어도 4시간 동안 약 pH 2.9 내지 약 2.1로, 적어도 4시간 동안 약 pH 2.7 내지 약 2.1로, 예를 들어, 4시간 동안 약 pH 2.9, 약 pH 2.7, 약 pH 2.5, 또는 약 pH 2.3으로 감소된다. 또 다른 실시형태에서, pH는 적어도 1시간 동안, 또는 적어도 2시간 동안 약 pH 2.6 내지 약 pH 2.3으로, 예를 들어 1 또는 2시간 동안 약 pH 2.6으로 감소된다. 또 다른 실시형태에서, pH는 적어도 1시간 동안, 또는 적어도 2시간 동안 약 pH 2.4 또는 pH 2.5로, 예를 들어 2시간 동안 약 pH 2.5 내지 약 pH 2.1로 감소된다.

저 pH 처리는 온도가 ISVD 폴리펩티드의 비가역적 변성 또는 분해를 초래하지 않는 한, 광범위한 온도에서 적용될 수 있다. 예는 약 4℃ 내지 약 30℃의 온도를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 따라서, 저 pH 처리는 약 30℃, 29℃, 28℃, 27℃, 26℃, 25℃, 24℃, 23℃, 22℃, 21℃, 20℃, 19℃, 18℃, 17℃, 16℃, 15℃, 14℃, 13℃, 12℃, 11℃, 10℃, 9℃, 8℃, 7℃, 6℃, 5℃, 4℃에서 적용될 수 있다. 당업자는 저 pH 처리에 적합한 온도를 쉽게 선택할 수 있다. 한 실시형태에서, 저 pH 처리는 약 15℃ 내지 약 30℃의 온도에서 적용된다. 또 다른 실시형태에서, 저 pH 처리는 약 4℃ 내지 약 12℃의 온도에서 적용된다. 또 다른 실시형태에서, 저 pH 처리는 실온(RT), 즉 약 20℃ 내지 25℃에서 적용된다.

무질서유발제 처리

입체형태 변이체는 또한 무질서유발제를 적용함으로써 원하는 폴리펩티드 산물로 전환될 수 있다.

일반적으로 무질서유발제는 수소 결합, 반데르발스력 및 소수성 상호작용과 같은 비공유력에 의해 매개되는 분자간 및 분자내 상호작용을 방해함으로써 시스템의 엔트로피를 증가시킨다. 생체분자와 관련하여, 무질서유발제는 단백질 및 핵산(예를 들어 DNA 및 RNA)과 같은 거대분자의 구조를 파괴하고 변성시킬 수 있다. 무질서유발제는 당업자에게 잘 알려져 있으며 (비제한적으로) n-부탄올, 에탄올, 구아니디늄 클로라이드(GuHCl), 리튬 퍼클로레이트, 리튬 아세테이트, 마그네슘 클로라이드, 페놀, 2-프로판올, 나트륨 도데실 설페이트, 티오우레아, 및 요소를 포함한다. 한 실시형태에서, 입체형태 변이체는 GuHCl 또는 우레아인 무질서유발제를 적용함으로써 원하는 폴리펩티드 산물로 전환된다. 특정 실시형태에서, 입체형태 변이체는 GuHCl인 무질서유발제를 적용함으로써 원하는 폴리펩티드 산물로 전환된다.

무질서유발제는 다가 ISVD 폴리펩티드의 정제/단리 공정 동안 언제든지 적용될 수 있다. 한 실시형태에서, 무질서유발제는 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 전에(예를 들어, ISVD 폴리펩티드 포획 단계 전에 또는 ISVD 폴리펩티드 연마 단계 전에) 적용된다. 또 다른 실시형태에서, 무질서유발제는 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 후에(예를 들어, ISVD 폴리펩티드 포획 단계 후에 또는 ISVD 폴리펩티드 연마 단계 후에) 적용된다. 또 다른 실시형태에서, 무질서유발제는 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 바로 뒤에 적용되며, 크로마토그래피 기술은 단백질 A 기반 친화도 크로마토그래피(예를 들어, ISVD 폴리펩티드 포획 단계에 사용됨)이다. 따라서, 한 실시형태에서, 무질서유발제는 단백질 A 기반 ISVD 폴리펩티드 포획 단계 직후 및 임의의 연마 단계 전에 적용된다. 또 다른 실시형태에서, 무질서유발제는 ISVD 폴리펩티드 연마 단계 직후에 적용된다.

당업자는 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시킬 수 있지만 그 비가역적 변성 또는 분해를 초래하지 않는 농도로 무질서유발제가 적용되어야 한다는 것을 잘 알고 있다. 본원에 기재된 방법에 기반하여, 당업자는 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키는 데 적합한 무질서유발제의 농도를 결정할 수 있다. 입체형태 변이체가 본질적으로 본원에 기재된 크로마토그래피 기술에 의해 더 이상 검출 불가능할 때, 적합한 농도가 적용된 것이다. 예를 들어, 분석용 SE-HPLC를 사용한 무질서유발제 처리 후 조성물의 크로마토그램에서 후 피크 쇼울더 또는 분해된 후 피크(입체형태 변이체를 표시함)가 본질적으로 관찰되지 않을 때, 적합한 농도가 적용된 것이다. 부가적으로 또는 대안적으로, 분석용 IEX HPLC를 사용한 무질서유발제 처리 후 조성물의 크로마토그램에서 전/후 피크 쇼울더 또는 분해된 전/후 피크(입체형태 변이체를 표시함)가 본질적으로 관찰되지 않을 때, 적합한 농도가 적용된 것이다. 각각의 SE-HPLC 또는 IEX-HPLC 크로마토그램이 IEX-HPLC 및/또는 SE-HPLC에서 고분자량 종(HMW 종)의 형성(SE-HPLC의 전 피크) 및/또는 전체 면적의 감소(산물 손실) 또는 주요 피크의 감소를 나타내지 않는 경우, 무질서유발제에 의한 ISVD 폴리펩티드 산물의 비가역적 변성 또는 분해가 배제될 수 있다.

한 양태에서, 무질서유발제는 최종 농도가 약 0.5몰농도(M) 내지 약 3 M, 약 0.5 M 내지 약 2.5 M, 약 1 M 내지 약 2.5 M, 약 1 M 내지 약 2 M, 예컨대 약 1 M, 약 2 M, 약 2.5 M 또는 약 3 M인 GuHCl이다. 또 다른 양태에서, 무질서유발제는 최종 농도가 적어도 약 1 M, 또는 적어도 약 2 M인 GuHCl이다.

본원에 기재된 방법에 기반하여, 당업자는 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키는 데 필요한 시간을 결정할 수 있다. 예를 들어, 무질서유발제 처리는 본원에 기재된 크로마토그래피 기술에 의해 입체형태 변이체가 본질적으로 더 이상 검출 불가능할 때까지, 충분한 양의 시간 동안 적용된다. 예를 들어, 무질서유발제 처리는 분석용 SE-HPLC를 사용한 무질서유발제 처리 후 조성물의 크로마토그램에서 본질적으로 후 피크 쇼울더 또는 분해된 후 피크(입체형태 변이체를 표시함)가 관찰되지 않을 때까지, 충분한 양의 시간 동안 적용된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 분석용 IEX-HPLC를 사용한 무질서유발제 처리 후 조성물의 무질서유발제 처리는 크로마토그램에서 본질적으로 전/후 피크 쇼울더 또는 분해된 전/후 피크(입체형태 변이체를 표시함)가 관찰되지 않을 때까지 충분한 양의 시간 동안 적용된다. 당업자는 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시킬 수 있지만 그 비가역적 변성 또는 분해를 초래하지 않는 시간 동안 무질서유발제가 적용되어야 한다는 것을 잘 알고 있다. 각각의 SE-HPLC 또는 IEX-HPLC 크로마토그램이 IEX-HPLC 및/또는 SE-HPLC에서 고분자량 종(HMW 종)의 형성(SE-HPLC의 전 피크) 및/또는 전체 면적의 감소(산물 손실) 또는 주요 피크의 감소를 나타내지 않는 경우 무질서유발제에 의한 ISVD 폴리펩티드 산물의 비가역적 변성 또는 분해가 배제될 수 있다. 이와 관련하여, 무질서유발제 처리는 적어도 약 0.5시간 동안, 적어도 약 1시간 동안, 적어도 약 1.5시간 동안, 적어도 약 2시간 동안, 적어도 약 2.5시간 동안, 적어도 3시간 동안, 적어도 약 3.5시간 동안, 적어도 약 4시간 동안, 적어도 약 6시간 동안, 적어도 약 8시간 동안, 적어도 약 12시간 동안 적용될 수 있다. 예를 들어, 무질서유발제는 약 0.5시간, 약 1시간, 약 1.5시간, 약 2시간, 약 2.5시간, 약 3시간, 약 3.5시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 12시간 동안 적용될 수 있다. 한 실시형태에서, 무질서유발제는 적어도 약 0.5시간 동안, 또는 적어도 약 1시간 동안 적용될 수 있다.

이러한 양태에서, GuHCl은 적어도 약 0.5시간 동안, 또는 적어도 약 1시간 동안 적용된다. 한 실시형태에서, 무질서유발제는 약 0.5시간 동안 약 1 M 내지 약 2 M의 최종 농도의 GuHCl이다. 또 다른 실시형태에서, 무질서유발제는 약 1시간 동안 약 1 M 내지 약 2 M의 최종 농도의 GuHCl이다.

본 발명의 기술은 SE-HPLC 및 IEX-HPLC와 같은 분석용 크로마토그래피 방법에 의해 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드의 입체형태 변이체를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 기술은 또한 무질서유발제로의 처리에 의해 입체형태 변이체를 온전한 산물로 전환시키는 개념을 제공한다. 따라서, 본원에 제공된 개념에 기반하여, 당업자는 무질서유발제 농도 및 인큐베이션 시간 둘 모두의 측면에서 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 임의의 폴리펩티드에 대해 본원에 기재된 무질서유발제 처리를 조정할 수 있다.

무질서유발제 처리는 ISVD 폴리펩티드 산물을 새로운 완충 시스템(무질서유발제 비포함)으로 전달함으로써 종료될 수 있다. 전달은 일상적인 수단, 예를 들어 투석, 정용여과 또는 크로마토그래피 방법(예를 들어 크기 배제 또는 완충액 교환 크로마토그래피)에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, ISVD 폴리펩티드 산물은 투석에 의해 PBS로 전달될 수 있다. ISVD 폴리펩티드 산물은 또한 생리식염수로 전달될 수 있다. 당업자는 다른 적합한 완충 시스템을 쉽게 선택할 수 있다. 완충액 선택은 잠재적인 후속 정제, 제형화 또는 보관 단계에 필요한 완충액 조건에 의존할 수 있다.

무질서유발제 처리는 온도가 ISVD 폴리펩티드의 비가역적 변성 또는 분해를 초래하지 않는 한, 광범위한 온도에서 적용될 수 있다. 예는 약 4℃ 내지 약 30℃의 온도를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 따라서, 무질서유발제 처리는 약 30℃, 29℃, 28℃, 27℃, 26℃, 25℃, 24℃, 23℃, 22℃, 21℃, 20℃, 19℃, 18℃, 17℃, 16℃, 15℃, 14℃, 13℃, 12℃, 11℃, 10℃, 9℃, 8℃, 7℃, 6℃, 5℃, 4℃에서 적용될 수 있다. 당업자는 무질서유발제 처리에 적합한 온도를 쉽게 선택할 수 있다. 한 실시형태에서, 무질서유발제 처리는 약 15℃ 내지 약 30℃의 온도에서 적용된다. 또 다른 실시형태에서, 무질서유발제 처리는 약 4℃ 내지 약 12℃의 온도에서 적용된다. 또 다른 실시형태에서, 무질서유발제 처리는 실온, 즉 약 20℃ 내지 25℃에서 적용된다.

열 처리

입체형태 변이체는 또한 열 스트레스를 적용함으로써 원하는 폴리펩티드 산물로 전환될 수 있다. 용어 "열 처리" 및 "열 스트레스"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

열 스트레스는 다가 ISVD 폴리펩티드의 정제/단리 공정 동안 언제든지 적용될 수 있다. 한 실시형태에서, 열 스트레스는 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 전에 적용된다. 또 다른 실시형태에서, 열 스트레스는 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 후에 적용된다. 예를 들어, 열 스트레스는 단백질 A 기반 친화도 크로마토그래피 ISVD 폴리펩티드 포획 단계 후에(및 ISVD 폴리펩티드 연마 단계 전에) 적용될 수 있다. 대안적으로, 열 스트레스는 임의의 ISVD 폴리펩티드 연마 단계 후에 적용될 수 있다.

열 스트레스는 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시킬 수 있지만 그 비가역적 변성 또는 분해는 초래하지 않는 40℃ 내지 60℃의 적합한 온도에서 적용된다. 본원에 기재된 방법에 기반하여, 당업자는 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키기 적합한 온도를 결정할 수 있다. 입체형태 변이체가 본질적으로 본원에 기재된 크로마토그래피 기술에 의해 더 이상 검출 불가능할 때, 적합한 온도가 적용된 것이다. 예를 들어, 분석용 SE-HPLC를 사용한 열 스트레스 후 조성물의 크로마토그램에서 후 피크 쇼울더 또는 분해된 후 피크(입체형태 변이체를 표시함)가 본질적으로 관찰되지 않을 때, 적합한 온도가 적용된 것이다. 부가적으로 또는 대안적으로, 분석용 IEX-HPLC를 사용한 열 스트레스 후 조성물의 크로마토그램에서 전/후 피크 쇼울더 또는 분해된 전/후 피크(입체형태 변이체를 표시함)가 본질적으로 관찰되지 않을 때, 적합한 온도가 적용된 것이다. 각각의 SE-HPLC 또는 IEX-HPLC 크로마토그램이 IEX-HPLC 및 SE-HPLC에서 고분자량 종(HMW 종)의 형성(SE-HPLC의 전 피크) 및/또는 전체 면적의 감소(산물 손실) 또는 주요 피크의 감소를 나타내지 않는 경우, 열 스트레스에 의한 ISVD 폴리펩티드 산물의 비가역적 변성 또는 분해가 배제될 수 있다. 따라서, 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키기 위해 적용되는 열 스트레스는 약 40℃ 내지 약 60℃, 약 45℃ 내지 약 60℃, 또는 약 50℃ 내지 약 60℃에서 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함한다. 열 스트레스는 또한 약 40℃ 내지 약 55℃, 약 45℃ 내지 55℃, 또는 약 48℃ 내지 약 52℃, 예컨대 약 50℃에서 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 방법에 기반하여, 당업자는 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키는 데 필요한 시간을 결정할 수 있다. 열 스트레스는 입체형태 변이체가 본원에 기재된 크로마토그래피 기술에 의해 본질적으로 더 이상 검출되지 않을 때까지 충분한 양의 시간 동안 적용된다. 예를 들어, 열 스트레스는 분석용 SE-HPLC를 사용한 열 스트레스 후 조성물의 크로마토그램에서 후 피크 쇼울더 또는 분해된 후 피크(입체형태 변이체를 표시함)가 본질적으로 관찰되지 않을 때까지 충분한 양의 시간 동안 적용된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 열 스트레스는 분석용 IEX-HPLC를 사용한 열 스트레스 후 조성물의 크로마토그램에서 전/후 피크 쇼울더 또는 분해된 전/후 피크(입체형태 변이체를 표시함)가 본질적으로 관찰되지 않을 때까지 충분한 양의 시간 동안 적용된다. 당업자는 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시킬 수 있지만 그 비가역적 변성 또는 분해를 초래하지 않는 시간 동안 열 스트레스가 적용되어야 한다는 것을 잘 알고 있다. 각각의 SE-HPLC 또는 IEX-HPLC 크로마토그램이 IEX-HPLC 및 SE-HPLC에서 고분자량 종(HMW 종)의 형성(SE-HPLC의 전 피크) 또는 전체 면적의 감소(산물 손실) 또는 주요 피크의 감소를 나타내지 않는 경우, 열 스트레스에 의한 ISVD 폴리펩티드 산물의 비가역적 변성 또는 분해가 배제될 수 있다. 이와 관련하여, 열 스트레스는 4시간 이내로 적용되어야 한다. 따라서, 열 스트레스는 적어도 약 0.5시간, 적어도 약 1시간, 적어도 약 1.5시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 2.5시간, 적어도 약 3시간, 적어도 약 3.5시간, 약 4시간, 그러나 4시간 이하 동안 적용될 수 있다. 특히, 열 스트레스는 약 0.5시간, 약 1시간, 약 1.5시간, 약 2시간, 약 2.5시간, 약 3시간, 약 3.5시간, 약 4시간 동안 적용될 수 있다. 한 실시형태에서, 열 스트레스는 적어도 약 0.5시간 동안, 또는 적어도 약 1시간 동안, 예를 들어, 약 1시간 동안 50℃에서 적용된다. 또 다른 실시형태에서, 열 스트레스는 약 4시간 동안, 예를 들어 약 4시간 동안 50℃에서 적용된다.

본 발명의 기술은 SE-HPLC 및 IEX-HPLC와 같은 분석용 크로마토그래피 방법에 의해 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드의 입체형태 변이체를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 기술은 열 처리에 의해 입체형태 변이체를 온전한 산물로 전환시키는 개념을 추가로 제공한다. 따라서, 본원에 제공된 개념에 기반하여, 당업자는 최적 열 스트레스 온도뿐만 아니라 인큐베이션 시간 둘 모두의 측면에서 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 임의의 폴리펩티드에 대한 열 처리를 조정할 수 있다.

열 스트레스는 ISVD 폴리펩티드 산물을 포함하는 조성물을 약 30℃ 미만의 온도, 즉 약 4℃ 내지 약 30℃의 임의의 온도로 조정함으로써 종료될 수 있다. 따라서, 열 처리는 조성물의 온도를 약 30℃, 29℃, 28℃, 27℃, 26℃, 25℃, 24℃, 23℃, 22℃, 21℃, 20℃, 19℃, 18℃, 17℃, 16℃, 15℃, 14℃, 13℃, 12℃, 11℃, 10℃, 9 ℃, 8℃, 7℃, 6℃, 5℃, 4℃로 조절함으로써 종료된다. 한 실시형태에서, 열 처리는 조성물의 온도를 약 15℃ 내지 약 30℃로 조정함으로써 종료된다. 또 다른 실시형태에서, 열 처리는 조성물의 온도를 약 4℃ 내지 약 12℃로 조정함으로써 종료된다. 또 다른 실시형태에서, 열 처리는 조성물의 온도를 실온, 즉 약 20℃ 내지 약 25℃로 조정함으로써 종료된다. 온도 조정(열 처리의 종료를 위한)은 잠재적인 후속 정제, 제형화 또는 보관 단계에 필요한 온도로 적응될 수 있다.

입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키는 조건에 관한 일반적 양태

입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키기 위한 전술된 처리 조건은 단백질 정제/제형화에 적합한 광범위한 완충액, 특히 항체 정제/제형화에 적합한 임의의 알려진 완충액을 사용하여 적용될 수 있다. 예는 PBS, 포스페이트 완충액, 아세테이트, 히스티딘 완충액, 트리스-HCl, 글리신 완충액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. ISVD 폴리펩티드는 생리식염수에도 존재할 수 있다. 당업자는 다른 적합한 완충 시스템을 쉽게 선택할 수 있다.

입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키는 전술된 조건 중 임의의 것, 또는 이들의 임의의 조합은 아래에 추가로 기재된 바와 같이 입체형태 변이체를 제거하는 임의의 방법과 조합될 수 있다.

본원에 제공된 저 pH 처리, 무질서유발제를 사용한 처리 및 열 처리의 개념에 기반하여, 당업자는 최적의 pH, 무질서유발제 농도 및/또는 열 스트레스 온도뿐만 아니라 인큐베이션 시간의 측면에서 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 임의의 폴리펩티드에 대해 본원에 기재된 처리 조건을 조정할 수 있다.

5.4.4 입체형태 변이체의 제거 또는 감소

제거 또는 감소는 산물 관련 입체형태 변이체가 원하는 ISVD 폴리펩티드 산물 및 산물 관련 입체형태 변이체 둘 모두를 포함하는 조성물로부터 물리적으로 분리된다는 것을 의미한다. 정확한 의미는 문맥으로부터 명백할 것이다. 선행 기술에서, 당업자는 본원에 제공된 바와 같은 하등 진핵생물 숙주에서 생산될 때 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드의 입체형태 변이체의 존재에 대한 지식이 없었다. 본 출원에 의해 제공된 이러한 지식에만 기반하여, 당업자는 원하는 ISVD 폴리펩티드 산물 및 산물-관련 입체형태 변이체를 포함하는 조성물에 존재하는 입체형태 변이체를 제거하거나 감소시키기 위해 사용되는 검정 조건을 조정/최적화할 수 있다. 따라서 본원에 제공된 특정 방법(아래 섹션의 "분석용 방법" 참고)에 의해 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드의 입체형태 변이체의 확인은 입체형태 변이체가 특이적으로 제거될 수 있도록 당업자가 선행 기술의 정제 방법을 구체적으로 조정/최적화할 수 있도록 하는 전제조건이다.

원하는 폴리펩티드 산물은 원하는 폴리펩티드 산물 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 입체형태 변이체를 제거하는 조건을 적용함으로써 단리/정제된다. 이 양태에서, 입체형태 변이체는 하나 이상의 분취용 크로마토그래피 기술에 의해 제거된다. 크로마토그래피 기술은 수력학적 부피, 표면 전하 및/또는 소수성 노출/표면 소수성에 기반하는 분취용 크로마토그래피 기술일 수 있다. 한 실시형태에서, 분취용 크로마토그래피 기술은 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 이온 교환 크로마토그래피(IEX), 예를 들어 양이온 교환 크로마토그래피(CEX), 혼합 모드 크로마토그래피(MMC) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로부터 선택된다.

한 실시형태에 따르면, 입체형태 변이체는 수력학적 부피에 기반하는 분취용 크로마토그래피 분리에 의해 제거된다. 따라서, 입체형태 변이체는 분취용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 제거된다. SEC에서 크로마토그래피 컬럼은 (비제한적으로) 덱스트란 중합체(세파덱스(Sephadex)), 아가로스(세파로스) 또는 폴리아크릴아미드(세파크릴(Sephacryl) 또는 바이오겔(BioGel) P)로 이루어진 미세 다공성 비드로 충전되어 있다. 이러한 비드의 기공 크기는 거대분자의 치수를 추정하기 위해 사용된다. 비제한적으로, SEC 수지의 예는 세파덱스 기반 제품(GE Healthcare, Merck), 바이오겔 기반 제품(Bio-Rad), 세파로스 기반 제품(GE Healthcare) 및 수퍼덱스 기반 제품(GE Healthcare)을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 입체형태 변이체는 표면 전하에 기반하는 분취용 크로마토그래피 분리에 의해 제거된다. 따라서, 입체형태 변이체는 분취용 이온 교환 크로마토그래피(IEX)(예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX))를 사용하여 제거된다. 비제한적으로, IEX 수지의 예는 Poros 50HS(ThermoFischer), Poros 50HQ(ThermoFischer), SOURCE 30S(GE Healthcare), SOURCE 15S(GE Healthcare), SP 세파로스(GE Healthcare), Capto S(GE Healthcare), Capto SP Impres(GE Healthcare), Capto S ImpAct(GE Healthcare), Q 세파로스(GE Healthcare), Capto Q(GE Healthcare), DEAE 세파로스(GE Healthcare), Poros XS(Thermo Scientific™⁾, AG® 50W(Bio-Rad), AG® MP-50(Bio-Rad), Nuvia HR-S(Bio-Rad), UNOsphere™ S(Bio-Rad) 및 UNOsphere Rapid S(Bio-Rad)를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 입체형태 변이체는 표면 소수성/소수성 노출에 기반하는 분취용 크로마토그래피 분리에 의해 제거된다. 따라서, 입체형태 변이체는 분취용 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 사용하여 제거된다. 한 실시형태에서, HIC는 HIC 컬럼 수지에 기반한다. 비제한적으로, HIC 수지는 Capto 페닐 ImpRes(GE Healthcare), Capto 부틸 ImpRes(GE Healthcare), 페닐 HP(GE Healthcare), Capto 부틸(GE Healthcare), Capto 옥틸(GE Healthcare), Toyopearl PPG-600(Tosoh Biosciences), Toyopearl 페닐-600(Tosoh Biosciences), Toyopearl 페닐-650(Tosoh Biosciences), Toyopearl 부틸-600(Tosoh Biosciences), Toyopearl 부틸-650(Tosoh Biosciences), TSKgel 페닐 5-PW(Tosoh Biosciences)로부터 선택될 수 있다. 또 다른 실시형태에서 HIC는 HIC 막에 기반한다. 비제한적으로, HIC 막은 Adsorber Q(GE Healthcare), Adsorber S(GE Healthcare), Adsorber Phen(GE Healthcare), Mustang Q 시스템(Pall), NatriFlo HD-Q 막 크로마토그래피(Natrix Separations), Sartobind STIC(Sartorius), Sartobind Q(Sartorius) 또는 Sartobind 페닐(Sartorius)일 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 입체형태 변이체는 수력학적 부피, 표면 전하, 및/또는 표면 소수성/소수성 노출에 기반하는 분취용 크로마토그래피 분리에 의해 제거된다. 따라서, 입체형태 변이체는 혼합 모드 크로마토그래피(MMC)를 사용하여 제거된다. MMC는 정지상 및 분석물의 분리를 달성하기 위해 정지상 및 분석물 간 하나 초과의 상호작용 형태를 이용하는 크로마토그래피 방법을 지칭한다. 따라서 MMC 수지는 몇몇 상이한 유형의 상호작용: 이온 교환, 친화도, 크기 배제 및 소수성 상호작용이 내재적으로 가능한 리간드로 기능화된 매질에 기반한다.

다양한 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 수지가 시판되며, 임의의 이용 가능한 형태의 물질이 사용될 수 있다. 하이드록시아파타이트 크로마토그래피에 적합한 조건에 대한 상세한 설명은 WO 2005/044856 및 WO 2012/024400에 제공되며, 그 내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.

한 실시형태에서, 하이드록시아파타이트는 결정질 형태이다. 하이드록시아파타이트는 응집되어 입자를 형성하고 고온에서 안정적인 다공성 세라믹 덩어리로 소결될 수 있다. 하이드록시아파타이트의 입자 크기는 매우 다양할 수 있지만, 전형적인 입자 크기는 지름이 1 μm 내지 1000 μm 범위이고, 10 μm 내지 100 μm일 수 있다. 한 실시형태에서, 입자 크기는 20 μm이다. 또 다른 실시형태에서, 입자 크기는 40 μm이다. 또 다른 실시형태에서, 입자 크기는 80 μm이다.

세라믹 하이드록시아파타이트 컬럼의 제조에 여러 크로마토그래피 지지체가 사용될 수 있으며, 가장 광범위하게 사용되는 것은 유형 I 및 유형 II 하이드록시아파타이트이다. 유형 I은 높은 단백질 결합 능력 및 산성 단백질에 대한 더 우수한 능력을 가지고 있다. 그러나 유형 II는 단백질 결합 능력은 낮지만 핵산 및 특정 단백질의 분해능(resolution)이 더 우수하다. 유형 II 물질은 또한 알부민에 대한 매우 낮은 친화도를 갖고, 면역글로불린의 많은 종 및 클래스의 정제에 특히 적합하다. 특정 하이드록시아파타이트 유형의 선택은 당업자에 의해 결정될 수 있다.

비제한적으로, 하이드록시아파타이트 수지는 CHT 세라믹 하이드록시아파타이트, 유형 I(20, 40 또는 80 μm)(BioRad), CHT 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 II(20, 40 또는 80 μm)(BioRad), MPC™세라믹 하이드록시플루오로아파타이트 유형 I(40 μm), Ca⁺⁺Pure-HA(Tosoh BioScience)이다.

부가적으로 또는 대안적으로, 입체형태 변이체는 상기 언급된 분취용 SEC, IEX, HIC 또는 MMC의 임의의 순차적 조합을 사용하여 제거될 수 있다.

본 개시의 측면에서, 당업자는 다가 ISVD 폴리펩티드의 입체형태 변이체를 확인한 후 제거하기에(또는 적어도 감소시키기에) 적합한 크로마토그래피 조건을 찾을 수 있을 것이다. 본원에 기재된 입체형태 변이체를 확인했다면, 당업자는 선택된 크로마토그래피 방법의 매개변수 및 조건(구배, 완충액, 농도)을 적응시키고 이어서 피크(들)의 적절한 분획을 취할 수 있을 것이다. 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 본원의 실시예에서 사용된 크로마토그래피 조건이 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 다가 ISVD 폴리펩티드의 입체형태 변이체의 제거(또는 적어도 감소)에 사용될 수 있다. 실시예에서 사용된 크로마토그래피 조건은 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 특정 다가 ISVD 폴리펩티드의 입체형태 변이체를 제거하기(또는 적어도 감소시키기) 적합한 크로마토그래피 조건의 개발을 위한 기준점으로서 적어도 역할을 할 수 있다.

구체적으로, 본 출원의 교시에 기반하여, 다가 ISVD 폴리펩티드 및 이의 입체형태 변이체 둘 모두를 포함하는 조성물로부터의 입체형태 변이체의 제거 또는 감소는 다음 단계를 포함한다:

i) 분취용 크로마토그래피 기술을 적용하는 단계;

ii) 다가 ISVD 폴리펩티드의 존재에 대해 단계 (i)에서 얻은 분획을 분석하는 단계;

iii) 다가 ISVD 폴리펩티드만을 포함하며 입체형태 변이체는 포함하지 않는 단계 (ii)의 분획을 선택하는 단계.

단계 i) 및 ii)는 항체 정제 분야, 특히 ISVD 정제 분야의 당업자에게 알려진 수단에 의해 수행될 수 있다. 방법은 본원에 제공된 바와 같이 입체형태 변이체의 확인 및 입체형태 변이체의 제거/감소 둘 모두를 위해 특별히 적응/최적화될 수 있다. 적합한 예시적 분석용 및 분취용 크로마토그래피 기술은 본원에 기재되어 있다. 이러한 일반적인 기술은 입체형태 변이체의 제거/감소를 허용하도록 특별히 적응/최적화되어야 한다.

단계 ii) 및 iii)은 아래 섹션 5.4.5에 기재된 특정 분석용 크로마토그래피 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 크로마토그래피 분획은 (분석용) SE-HPLC에서 검출 가능한 후 피크 쇼울더 및/또는 별도의 후 피크가 없는 경우, 다가 ISVD 폴리펩티드만을 포함하며 입체형태 변이체는 포함하지 않는다. 분석용 IEX-HPLC에서 전 피크 쇼울더 및/또는 별도의 전 피크가 없는 경우 또는 검출 가능한 후 피크 쇼울더 및/또는 별도의 후 피크가 없는 경우, 입체형태 변이체의 존재가 또한 배제될 수 있다.

선행 기술에서, 당업자는 본원에 제공된 바와 같은 하등 진핵생물 숙주에서 생성될 때 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드의 입체형태 변이체의 존재에 대해 알지 못했다. 본 출원에 의해 제공된 이러한 지식에 기반해서만, 당업자가 입체형태 변이체의 특이적 제거/감소가 달성될 수 있도록 상기 단계 i) 내지 iii)을 조정/최적화할 수 있다.

입체형태 변이체를 함유하는 분획은 폐기될 수 있거나 본원에 기재된 전환 방법(섹션 5.4.3 "입체형태 변이체의 원하는 폴리펩티드 산물로의 전환")에 따라 처리되어 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시킬 수 있다. 전환의 성공은, 예를 들어 아래 섹션 5.4.5에 기재된 분석용 크로마토그래피 기술에 의해, 본원에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다.

단계 iii) 후에 얻은 다가 ISVD 폴리펩티드만을 포함하는 분획은 선택적으로 당분야에 알려진 추가 정제 또는 여과 단계를 거칠 수 있다.

(분석용) SE-HPLC에서 본질적으로 후 피크 쇼울더 및/또는 별도의 후 피크가 검출 불가능한 경우, 분획은 "다가 ISVD 폴리펩티드만 포함하는(그러나 입체형태 변이체는 포함하지 않는)" 것으로 간주된다. 대안적으로, 분석용 IEX-HPLC에서 전 피크 쇼울더 및/또는 별도의 전 피크가 본질적으로 없거나 후 피크 쇼울더 및/또는 별도의 후 피크가 본질적으로 검출 불가능한 경우, 분획은 "다가 ISVD 폴리펩티드만을 포함하는(그러나 입체형태 변이체는 포함하지 않는)" 것으로 간주된다. "본질적으로 전 피크 쇼울더 및/또는 별도의 전 피크가 없는" 또는 "본질적으로 후 피크 쇼울더 및/또는 별도의 후 피크가 없는"은 각각의 SE-HPLC 또는 IEX-HPLC 크로마토그램에서 전 피크/후 피크(쇼울더)의 곡선 하 면적(AUC) 대 주요 피크 및 전 피크/후 피크(쇼울더)의 총 곡선 하 면적의 비가 5% 미만, 예를 들어 4.5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 심지어 1% 이하임을 의미한다. 한 실시형태에서, 각각의 SE-HPLC 또는 IEX-HPLC 크로마토그램에서 전 피크/후 피크(쇼울더)가 검출 불가능하다.

또 다른 양태에서, 입체형태 변이체는 다가 ISVD 폴리펩티드 및 입체형태 변이체를 포함하는 조성물을 적어도 20 mg 단백질/ml 수지의 로딩 인수를 사용하여 크로마토그래피 컬럼에 적용함으로써 제거 또는 감소된다. 이러한 양태의 한 실시형태에서, 로딩 인수는 적어도 30 mg 단백질/ml 수지, 또는 적어도 45 mg 단백질/ml 수지이다. 한 실시형태에서, 크로마토그래피 컬럼은 단백질 A 컬럼이다. 따라서, 입체형태 변이체는 적어도 20 mg 단백질/ml 수지의 로딩 인수를 사용하여 다가 ISVD 폴리펩티드 및 입체형태 변이체를 포함하는 조성물을 단백질 A 컬럼에 적용함으로써 제거 또는 감소된다. 또 다른 실시형태에서, 입체형태 변이체는 다가 ISVD 폴리펩티드 및 입체형태 변이체를 포함하는 조성물을 적어도 45 mg 단백질/ml 수지의 로딩 인수를 사용하여 단백질 A 컬럼에 적용함으로써 제거 또는 감소된다.

ISVD 폴리펩티드 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 입체형태 변이체를 제거하기(또는 감소시키기) 위해 사용되는 크로마토그래피 기술(들)은 다가 ISVD 폴리펩티드를 포함하는 배양 상청액에 적용될 수 있다. 예를 들어, 포획 단계가 제거 또는 감소에 사용될 수 있다. 입체형태 변이체를 제거하기(또는 감소시키기) 위해 사용되는 크로마토그래피 기술은 다가 ISVD 폴리펩티드의 부분적으로 또는 고도로 정제된 제조물에도 적용될 수 있다. 예를 들어, 입체형태 변이체를 제거하기(또는 감소시키기) 위해 사용되는 크로마토그래피 기술은 포획 단계 후에, 그러나 제1 연마 단계에서 또는 그 전에, 또는 하나 이상의 추가 연마 단계에서, 또는 연마 단계 후에 적용될 수 있다.

5.4.5 분석용 방법

입체형태 변이체를 관찰하기 위해 사용되는 분석용 방법

적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드의 입체형태 변이체는 본원에 제공된 특정 분석용 크로마토그래피 기술에 의해 확인될 수 있다. 분석용 SE-HPLC 및 IEX-HPLC와 같은 분석용 크로마토그래피 방법은 당업자에게 알려져 있다. 그러나 이러한 방법은 입체형태 변이체를 확인하는 문제에 적응/최적화되어야 한다. 따라서 이러한 분석용 크로마토그래피 기술의 적응/최적화를 위한 전제조건은 하등 진핵생물에서 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드의 생산이 (부분적으로) 본원에 기재된 바와 같이 입체형태 변이체를 초래할 수 있다는 지식이다.

본원에 제공된 바와 같이, 입체형태 변이체는 감소된 수력학적 부피에 기반하여 원하는 폴리펩티드 산물과 구별될 수 있다. 따라서 입체형태 변이체의 존재는 분석용 SE-HPLC에 의해 검출될 수 있다. 적합한 조건을 사용하여, 입체형태 변이체의 존재는 SE-HPLC 크로마토그램에서 후 피크 쇼울더 또는 별도의 후 피크에 의해 실증된다. 따라서, 입체형태 변이체의 확인을 위해 적응된/최적화된 SE-HPLC가 본원에 기재된 바와 같이 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키는 조건을 검증하기 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 입체형태 변이체의 확인을 위해 적응된/최적화된 SE-HPLC는 원하는 폴리펩티드 산물 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 입체형태 변이체의 제거 또는 감소를 검증하기 위해 사용될 수 있다.

본원에 추가로 제공된 바와 같이, 입체형태 변이체는 변경된 표면 전하 및/또는 표면 소수성에 기반하여 원하는 폴리펩티드 산물과 구별될 수 있다. 따라서 적합한 조건을 사용하여 입체형태 변이체의 존재가 (특별히 개발된) 분석용 IEX-HPLC에 의해 검출될 수 있다. 표면 전하 및/또는 표면 소수성의 변경 품질에 따라, 입체형태 변이체의 존재가 IEX-HPLC 크로마토그램에서 전/후 피크 쇼울더 또는 별도의 전/후 피크에 의해 실증될 수 있다. 따라서, 입체형태 변이체의 확인을 위해 적응된/최적화된 IEX-HPLC는 입체형태 변이체를 원하는 폴리펩티드 산물로 전환시키는 조건을 검증하기 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 입체형태 변이체의 확인을 위해 적응된/최적화된 IEX-HPLC는 원하는 폴리펩티드 산물 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터의 입체형태 변이체의 제거 또는 감소를 검증하기 위해 사용될 수 있다.

본 개시에 기반하여, 당업자는 다가 ISVD 폴리펩티드의 입체형태 변이체를 확인하기 적합한 크로마토그래피 조건을 찾을 수 있을 것이다. 예를 들어, 그러나 이에 제한되지 않고, 본원의 실시예에서 사용된 크로마토그래피 조건이 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 다가 ISVD 폴리펩티드의 입체형태 변이체의 검출에 사용될 수 있다. 본원의 실시예에서 사용된 크로마토그래피 조건은 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD를 포함하는 특정 다가 ISVD 폴리펩티드에 대한 입체형태 변이체를 검출하기 적합한 크로마토그래피 조건의 개발을 위한 기준점으로서 적어도 역할을 할 수 있다. 기본 예시 조건을 표 C에 제공한다.

입체형태 변이체의 특성규명에 사용되는 추가 분석용 방법

하기 분석용 기술은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 그러나 이에 제한되지 않고, 적합한 조건을 표 C에 제공한다.

[표 C]

다가 ISVD 폴리펩티드의 검출 및 특성규명을 위한 예시적인 분석용 방법.

ISVD 폴리펩티드의 효능을 관찰하기 위해 사용되는 분석용 방법

입체형태 변이체는 또한 효능의 변경에 의해 원하는 폴리펩티드 산물과 구별될 수 있으며, 입체형태 변이체는 원하는 폴리펩티드 산물과 비교하여 감소된 효능을 갖는다. 더욱이, 입체형태 변이체의 원하는 폴리펩티드 산물로의 (성공적인) 전환은 각각의 원하는 폴리펩티드 산물의 효능 대비 또는 입체형태 변이체가 고갈되거나 농축되지 않은 참조 ISVD 폴리펩티드 대비 효능의 부분적 또는 완전한 회복에 의해 실증될 수 있다.

이와 관련하여 효능은 폴리펩티드에 존재하는 적어도 3개 또는 적어도 4개의 ISVD 중 하나 이상에 의해 특정 효과를 생성하는 데 필요한 폴리펩티드의 결합 능력(특정 표적에 대한), 기능적 활성 및/또는 양을 지칭한다. 효능은 시험관내 검정(예를 들어 경쟁적 리간드 결합 검정 또는 세포 기반 검정) 또는 생체내(예를 들어 동물 모델에서) 측정될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 효능은 루시퍼라제 리포터 유전자의 TNFα-유도 발현의 억제, 루시퍼라제 리포터 유전자의 IL-23 유도 발현의 억제, 루시퍼라제 리포터 유전자의 OX40L 유도 발현의 억제 또는 인간 혈청 알부민에 대한 결합 능력을 지칭할 수 있다. 원하는 폴리펩티드 산물 및 이의 입체형태 변이체 간 효능 차이를 결정하기 적합한 예시적 검정은 (비제한적으로) 다음과 같다:

TNF-알파 결합 모이어티의 효능 시험을 위한 세포 기반 리포터 검정

Glo response™ HEK293_NFkB-NLucP 세포는 NFκB 의존적 프로모터의 제어 하에 Nano 루시퍼라제를 암호화하는 리포터 작제물로 안정적으로 형질감염된 TNF 수용체 발현 세포이다. 가용성 인간 TNFα와 이들 세포의 인큐베이션은 NFκB 매개 Nano-루시퍼라제 유전자 발현을 초래한다.

검정은 일반적으로 하기와 같이 수행될 수 있다. Glo response™ HEK293_NFkB-NLucP 세포를 적합한 조직 배양 플레이트에 정상 성장 배지에 적합한 세포 수로 시딩한다. 시험될 ISVD 작제물의 희석 시리즈를 적합하고 충분한 양의 인간 TNFα에 첨가하고 37℃ 및 5% CO₂에서 충분한 시간(예를 들어 약 5시간) 동안 세포와 인큐베이션한다. 이 인큐베이션 동안, 루시퍼라제 리포터 유전자의 TNF-유도 발현이 ISVD 작제물에 의해 억제된다. 인큐베이션 후, 플레이트를 냉각한 후(예를 들어, 10분 동안) Nano-Glo 루시퍼라제 기질을 첨가하여 루시퍼라제 활성을 정량한다. 기질 첨가 5분 후, 발광을, 예를 들어 Tecan Infinite F-plex 플레이트 판독기 상에서 측정할 수 있다. 상대적 광 단위(RLU)로 표현되는 발광은 루시퍼라제의 농도와 정비례한다.

IL-23 결합 모이어티의 효능 시험을 위한 세포 기반 리포터 검정

Glo response™ HEK293_인간 IL-23R/IL-12Rb1-Luc2P는 sis-유도성 요소(SIE) 반응성 프로모터의 제어 하에 루시퍼라제 유전자를 함유하는 리포터 작제물로 안정적으로 형질감염된 세포이다. 추가로, 이들 세포는 인간 IL-23 수용체의 서브유닛, 즉 IL-12Rb1 및 IL-23R 둘 모두를 구성적으로 과발현한다. 인간 IL-23을 사용한 이들 세포의 자극은 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 유도한다.

검정은 일반적으로 하기와 같이 수행될 수 있다. Glo response™ HEK293_인간 IL-23R/IL-12Rb1-Luc2P 세포를 적합한 조직 배양 플레이트의 정상 성장 배지에 적합한 세포 수로 시딩한다. 시험될 ISVD 작제물의 희석 시리즈를 세포에 첨가한 다음, 적합한 양의 재조합 hIL-23(예를 들어 3 pM)을 첨가한다. 세포를 37℃에서 충분한 시간(예를 들어 약 6시간) 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 단계 후, 루시퍼라제 활성을 정량하기 위한 루시퍼라제 기질 5'-플루오로루시페린(Bio-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템)의 첨가 전에 플레이트의 냉각 기간(예를 들어 10분)이 필요하다. 기질 첨가 5분 후, 발광을, 예를 들어 Tecan Infinite F-plex 플레이트 판독기 상에서 측정할 수 있다. 발광(상대적 광 단위, RLU로 표현)은 루시퍼라제의 농도와 정비례한다.

OX40L 결합 모이어티의 효능 시험을 위한 세포 기반 리포터 검정

OX40L의 억제에 대한 효능은 세포 기반 리포터 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, Glo Response™ NFkB-luc2/OX40 Jurkat 현탁 세포를 적합한 조직 배양 플레이트의 정상 성장 배지에 적합한 세포 수로 시딩한다. ISVD 작제물의 희석 시리즈를 세포에 첨가한 다음, 고정 농도 700 pM OX40L을 첨가한다. 그런 다음 플레이트를 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO₂에서 충분한 시간(예를 들어 3시간) 동안 인큐베이션하여 OX40L/OX40 신호전달에 의한 NF-kB 프로모터의 활성화를 허용하고, 이는 결국 루시퍼라제 유전자의 전사를 초래한다. 인큐베이션 단계 후, 루시퍼라제 활성을 정량하기 위한 루시퍼라제 기질 5'-플루오로루시페린(Bio-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템)의 첨가 전 플레이트의 냉각 기간(예를 들어 10분)이 필요하다. 기질 첨가 5분 후, 발광을, 예를 들어 Tecan Infinite F200 플레이트 판독기 상에서 측정할 수 있다. 발광(상대적 광 단위, RLU로 표현)은 루시퍼라제의 농도와 정비례한다.

알부민 결합 모이어티의 효능 시험을 위한 ELISA 기반 알부민 결합 검정

인간 혈청 알부민(HSA)에 대한 결합 효능은 직접 결합 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 96웰 마이크로타이터 플레이트를 pH 9.6의 중탄산염 완충액에서 적합한 양의 HSA로 밤새 코팅할 수 있다. 플레이트의 비특이적 결합 부위는 Superblock T20을 사용하여 실온(RT)에서 약 30분 동안 차단할 수 있다. ISVD 작제물의 희석 시리즈를 PBS + 10% Superblock T20에서 제조하고 HSA 코팅 플레이트로 옮긴 후 600 rpm에서 진탕하면서 RT에서 약 75분의 인큐베이션 단계를 수행한다. 결합된 ISVD 작제물은 예를 들어 600 rpm에서 진탕하면서 RT에서 90분 동안 1μg/mL의 마우스 항-ISVD 작제물 항체를 사용하고, 이어서 600 rpm에서 진탕하면서 RT에서 0.2 μg/mL 홀스 래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-표지 폴리클로날 토끼 항-마우스 항체와 50분 인큐베이션하여 검출할 수 있다. 결합된 HRP-표지 폴리클로날 항체는 1/3 희석된 3,5,3'5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 온을 첨가하여 측정할 수 있다. HRP 및 기질 간 생성 발색 반응은 1 M HCl의 첨가에 의해 중단된다. 광학 밀도는 예를 들어 플레이트-분광광도계를 사용하여 450 nm의 파장 및 620 nm의 참조 파장에서 측정할 수 있다. 이 OD는 코팅 HSA에 결합된 ISVD 작제물의 양과 정비례한다.

5.5 생산 및/또는 단리 또는 정제 방법에 의해 얻을 수 있는 다가 ISVD 폴리펩티드 산물

본 출원은 또한 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 얻을 수 있는 다가 ISVD 폴리펩티드 산물을 포함하는 개선된 조성물을 기재한다. 이는 산물 관련 입체형태 변이체의 감소된 수준 또는 완전한 부재를 특징으로 한다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 ISVD 폴리펩티드는 5% 미만, 예를 들어 0 내지 4.9%, 0 내지 4%, 0 내지 3%, 0 내지 2% 또는 0 내지 1% 산물-관련 입체형태 변이체를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 ISVD 폴리펩티드는 1% 미만, 0.5% 미만, 0.01% 미만의 산물-관련 입체형태 변이체를 포함한다. 한 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 다가 ISVD 폴리펩티드 산물에는 산물-관련 입체형태 변이체가 없다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 ISVD 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 5% 미만, 예를 들어 0 내지 4.9%, 0 내지 4%, 0 내지 3%, 0 내지 2% 또는 0 내지 1%의 산물-관련 입체형태 변이체를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 ISVD 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 1% 미만, 0.5% 미만, 0.01% 미만의 산물-관련 입체형태 변이체를 포함한다. 한 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 다가 ISVD 폴리펩티드 산물을 포함하는 조성물에는 산물-관련 입체형태 변이체가 없다. 당업자는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 SE-HPLC 또는 IEX-HPLC에 의해, 총 폴리펩티드%로서(즉, 전 피크 또는 후 피크(쇼울더)의 AUC/주요 피크 및 전 피크 또는 후 피크(쇼울더) 둘 모두의 총 AUC를 결정함으로써) 산물 관련 입체형태 변이체의 비율을 쉽게 결정할 수 있다.

다시 말해서, 본원에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 다가 ISVD 폴리펩티드 산물은 선행 기술 제조물과 비교하여 개선된 구조적 균질성을 특징으로 한다. 특히, 선행 기술 제조물은 5% 이상의 비율의 산물 관련 입체형태 변이체, 예컨대 5 내지 15%, 5 내지 20%, 5 내지 25% 또는 심지어 더 높은 비율의 산물 관련 입체형태 변이체를 포함할 수 있다.

개선된 구조적 균질성의 측면에서, 방법에 의해 얻을 수 있는 다가 ISVD 폴리펩티드 산물은 선행 기술 제조물과 비교하여 유리하다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 다가 ISVD 폴리펩티드 산물은 치료 적용에 유리하다. 치료 항체 사용과 관련하여 구조적 균질성이 임상 및 규제에서 가장 중요하다.

따라서, 본 출원은 또한 본원에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 다가 ISVD 폴리펩티드 산물을 포함하는 약학 제조물 및 기타 조성물을 기재한다. 본원에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 다가 ISVD 폴리펩티드 산물은 또한 치료법(즉, 의학적 용도)에서 사용될 수 있다.

당업자는 공통 일반 지식에 기반하여 본원에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 다가 ISVD 폴리펩티드 산물의 약학적으로 적합한 제형을 쉽게 제형화할 수 있다. 더욱이, 본원에 인용된 다가 ISVD 폴리펩티드를 구체적으로 다루는 참고문헌이 명시적으로 참조된다. 비제한적으로, 비강, 경구, 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 질내, 직장 적용, 국소 적용 또는 흡입에 의한 적용을 위한 제형을 포함하는 표준 적용 경로를 위한 제형이 제조될 수 있다.

당업자는 또한 본원에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 치료 유효량의 다가 ISVD 폴리펩티드의 사용을 특징으로 하는 적합한 치료 방법을 쉽게 고안할 수 있다.

6 실시예

하기 실시예는 생산 및 정제 공정 동안 다가 ISVD 작제물의 입체형태 변이체의 존재 확인을 기재한다. 이러한 입체형태 변이체는 크로마토그래피 방법을 통한 이의 분리를 허용하는 구별되는 생화학적/생물리적 거동을 나타내는 것으로 나타났다. 또한, 생화학적/생물리적 특성의 차이와는 별도로, 입체형태 변이체는 이의 각각의 표적에 대한 하나 이상의 ISVD 빌딩 블록의 효능에서 차이를 나타낸다는 것을 밝힐 수 있었다. 결국, 이러한 바람직하지 않은 입체형태 변이체가 적합한 처리 조건에 의해 온전한 ISVD 폴리펩티드로 전환될 수 있고/있거나 ISVD 작제물의 정제 공정 동안 온전한 형태뿐만 아니라 바람직하지 않은 입체형태 변이체 둘 모두를 함유하는 조성물로부터 특이적으로 감소/제거될 수 있다는 것을 나타낼 수 있다.

6.1 실시예 1: 화합물 A의 입체형태 변이체의 확인

다가 ISVD 작제물의 포획 공정 단계 동안 입체형태 변이체를 확인할 수 있음

다가 ISVD 작제물의 입체형태 변이체를 다가 ISVD 작제물 정제의 제1 단계(즉, 포획 공정 단계) 동안 확인했다. 정화된 상청액으로부터 최대 ISVD 산물을 회수하기 위해 포획 공정 단계를 수행했다.

화합물 A(서열 번호 1)의 포획 정제 공정 동안, 분석용 크기 배제 프로필(SE-HPLC; 표 C에 제시된 조건)은 크로마토그래피 공정 동안 사용된 수지 및 용출 완충액에 따라 상이한 것으로 관찰되었다.

화합물 A(서열 번호 1)는 3개의 상이한 표적에 결합하는 중쇄 라마 항체의 3개의 상이한 서열 최적화 가변 도메인을 포함하는 다가 ISVD 작제물이다. ISVD 빌딩 블록은 하기 포맷: OX40L-결합 ISVD - 9GS 링커 - OX40L-결합 ISVD - 9GS 링커 - TNFα-결합 ISVD - 9GS 링커 - 인간 혈청 알부민-결합 ISVD - 9GS 링커 - TNFα-결합 ISVD로 G/S 링커를 포함하여 머리-대-꼬리로(N-말단에서 C-말단으로) 융합되며 하기 서열을 가진다:

[표 1]

화합물 A의 아미노산 서열

도 1은 단백질 A 또는 비-단백질 A 포획 수지 상에서의 크로마토그래피 정제 후 용출액에 대한 SE-HPLC 프로필을 나타낸다. 용출액의 SE-HPLC 프로필은 비-단백질 A와 비교하여 단백질 A를 포획 수지로 사용할 때 덜 뚜렷한 후 피크 쇼울더(도 1에서 후 피크 1로 표시됨)를 나타냈다. 후 피크 쇼울더(후 피크 1)의 존재는 크로마토그래피 정제 동안 사용된 조건/수지에 의존하는 것으로 결론내렸다. 비-단백질 A 수지와 대조적으로, 단백질 A 수지 상에서의 용출은 pH가 낮다. 이러한 관찰에 기반하여, SE-HPLC 프로필에 대한 용출 완충액 pH의 영향을 시험했다. 따라서, 상이한 산성 pH를 갖는 완충액 A 내지 D(표 2에 기재됨)를 단백질 A 포획 수지로부터 화합물 A의 용출에 대해 비교했다.

[표 2]

포획 공정에 사용된 용출 완충액.

* 생성 용출액의 pH는 사용된 용출 완충액의 pH보다 약간 더 높음

도 2는 상이한 용출 완충액 A, B, C 및 D(중화 없음)를 사용한 단백질 A 포획 및 용출 후 용출액에 대한 SE-HPLC 프로필을 나타낸다. 후 피크 1은 B, C 및 D와 비교하여 용출 완충액 A에서 덜 뚜렷했다. 도 3에서 포획 용출액 및 용출 완충액 A(도 3a) 및 용출 완충액 B(도 3b)로 용출 직후에 1 M HEPES pH 7.0을 사용하여 적어도 pH 6.7로 중화된 포획 용출액에 대한 SE-HPLC 프로필을 나타낸다. SE-HPLC 프로필에서 후 피크 쇼울더(피크 1로 표시됨)는 도 2 및 도 3a 및 도 3b에서 나타난 바와 같이 pH 3.6 내지 4.7의 용출액(완충액 B 내지 D)과 비교하여 pH 2.9(완충액 A)의 용출액에 있어서 더 낮았다. 그러나, 용출액이 바로 중화된 경우, 후 피크 1은 감소되지 않았다(도 3a에서 용출액 및 중화된 용출액 비교). 따라서 "pH 유지"가 후 피크 1에 영향을 미쳤을 수 있다. 용출 완충액 B의 경우, 후 피크 1은 생성 용출액의 후속 중화와 무관하게 용출 후 관찰되었다(도 3b).

이러한 관찰에 기반하여, SE-HPLC에서 후 피크 1의 검출 가능성에 대해 pH의 영향이 존재한다는 결론내렸다. 더욱이, 후 피크 1은 ISVD 작제물의 입체형태 변이체를 나타낼 수 있다고 가정했다. 약간 증가된 체류 시간은 주요 피크에 의해 나타나는 ISVD 작제물의 온전한 형태와 비교하여 더 조밀한 입체형태를 표시할 수 있다.

다가 ISVD 작제물의 연마 공정 단계 동안 입체형태 변이체를 확인할 수 있음

연마 공정 단계 동안 다가 ISVD 작제물의 입체형태 변이체를 또한 확인할 수 있었다. 연마 공정 단계를 다가 ISVD 함유 조성물의 순도를 개선하기 위해 포획 단계 후에 수행했다.

ISVD 작제물의 연마 단계를 위해, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)를 수행했다. 따라서, 25 mM 시트레이트 pH 6.0에서 0 내지 350 mM NaCl의 선형 염 구배를 연마 CEX 수지 상에서 RT에서 20컬럼 부피(CV)에 걸쳐 적용했다. 크로마토그래피 프로필을 도 4에 도시한다.

선형 구배 동안 용출되는 상부 분획(도 4에서 분획 2A1로 지칭함)뿐만 아니라 측면(전면) 분획(도 4에서 분획 1C2로 지칭함)을 SE-HPLC에서 추가로 분석하고 로딩 물질과 비교했다(도 5). 로딩 물질에 대한 SE-HPLC에서 관찰된 후 피크 1은 CEX 수지에 대한 구배의 상부 분획에 있어서 존재하지 않았다. 대조적으로, SE-HPLC에서 유의한 후 피크 1(대략 60%)가 측면(전면) 분획에 있어서 관찰되었다.

따라서 ISVD 작제물의 입체형태 변이체도 연마 공정 단계 동안 확인할 수 있었다. CEX 연마 단계의 구별되는 용출액 분획은 SE-HPLC에서 상이한 비율의 온전한 형태(주요 피크) 및 입체형태 변이체(후 피크 1)를 함유하는 것으로 나타났다(도 5). CEX 연마 단계의 상부 분획은 입체형태 변이체가 고갈된 것으로 밝혀진 반면, 측면 분획은 오히려 이것이 농축되었다.

결과는 20 CV에 걸쳐 25 mM 시트레이트 pH 6.0 중 0 내지 350 mM NaCl의 구배를 사용하여 연마 절차에 대해 시험된 Capto SP Impres(GE Healthcare) 및 Capto S ImpAct(GE Healthcare) 그리고 예를 들어 20 CV에 걸쳐 25 mM 시트레이트 pH 6.0 중 0 내지 400 mM의 구배를 사용하여(데이터는 나타내지 않음) 및 25 mM 히스티딘 pH 6.0 및 20 CV에 걸쳐 0 내지 400 mM까의 구배를 사용하여(데이터 표시되지 않음) 연마 절차에 대해 시험된 다른 CEX 수지와 같은 상이한 양이온 교환 수지에 있어서 유사했다.

이러한 관찰은 SE-HPLC에서 관찰된 후 피크 1이 ISVD 작제물의 입체형태 변이체를 나타낼 수 있다는 결론을 더욱 강조했다. SE-HPLC에서 약간 증가된 체류 시간은 더 조밀한 형태(즉, 감소된 수력학적 부피)를 표시하는 반면, 분취용 CEX에서 관찰된 체류 시간의 약간의 차이는 온전한 ISVD 산물과 비교하여 변경된 표면 전하를 표시한다. 따라서 분취용 SEC 또는 CEX와 같은 적합한 크로마토그래피 기술을 사용하여 입체형태 변이체 및 온전한 ISVD 산물을 분리할 가능성이 있다.

6.2 실시예 2: 화합물 A의 입체형태 변이체의 확인 및 특성규명

실시예 1에서 화합물 A는 분석용 SE-HPLC 동안 주요 피크 및 후 피크 1(후 피크 쇼울더)로서 용출되는 것으로 나타났다. 약간 더 긴 체류 시간으로 인해, 후 피크 1은 다가 ISVD 작제물의 더 조밀한 형태를 지칭할 수 있다고 결론내렸다. 또한, pH 2.5의 용출 완충액을 사용하는 단백질 A 친화도 크로마토그래피는 감소된 후 피크 1/주요 피크 비를 초래할 수 있다. 그러나, 포획 용출액이 바로 중화되는 경우, 후 피크 1/주요 피크 비는 변화하지 않고 유지되었다. 따라서 입체형태 변이체는 온전한 ISVD 산물로 전환될 수 있고 따라서 분자 크기가 상이하지 않다고 결론내렸다.

입체형태 변이체의 성질을 추가로 특성규명하고 질량 변이체의 존재를 배제하기 위해, 실시예 1의 CEX 연마의 입체형태 변이체-고갈 상부 분획 및 입체형태 변이체-농축 분획으로 분석용 이온 교환 - 고성능 액체 크로마토그래피(IEX-HPLC; 표 C, 프로토콜 I에 제시된 조건), 모세관 전기영동 등전 초점분석(CE-IEF) 및 역상 초고성능 액체 크로마토그래피(RP-UHPLC)에 의한 분석을 거쳤다.

분석용 IEX-HPLC에서의 거동

분석용 SE-HPLC와 유사하게, IEX-HPLC 크로마토그램은 입체형태 변이체-고갈 상부 분획에 부재하는 입체형태 변이체-농축 측면 분획에 대해 유의한 후 피크 1(대략 46%)을 나타내었다(도 6).

CE-IEF/RP-UHPLC에서의 거동

CE-IEF 분석용 시험에서, 분취용 CEX에서 얻은 측면("농축") 및 상부("고갈") 분획 간에 거의 차이가 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 유사하게, RP-UHPLC에서 분획 둘 모두에 대한 차이가 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).

CE-IEF와 대조적으로, IEX-HPLC는 입체형태 변이체-농축 측면 CEX 분획 및 입체형태 변이체-고갈 상부 CEX 분획 간에 상이한 크로마토그래피 프로필을 나타냈다. 두 전하 기반 방법 CE-IEF 및 IEX-HPLC 간 주요 차이는 CE-IEF가 변성 조건(3 M 요소)의 존재 하에 수행된다는 것이다. CE-IEF에서의 차이 부재는 총 전하 차이를 야기하는 온전한 ISVD 산물 및 입체형태 변이체 간 화학적 변형이 없음을 표시한다. 그러나 IEX-HPLC에서의 차이는 온전한 ISVD 산물과 비교하여 입체형태 변이체의 표면 전하가 약간 변경된 것을 시사한다. 다시 말해서, 분자의 총 전하는 변화하지 않은 반면 입체형태 변화로 인해 표면 전하만 변경되었다. 이러한 관찰은 또한 변성 조건에 의해 입체형태 변이체가 제거될 수 있다는 가설을 시사한다.

RP-UHPLC에서 CEX 분획 둘 모두의 유사한 거동으로 인해, ISVD 작제물의 온전한 형태와 비교하여 조밀한 입체형태 변이체가 스크램블된 디설피드 가교로 인한다는 것은 배제되었다.

온전한 ISVD 산물 및 그 입체형태 변이체 간 효능 차이

입체형태 변이체가 그 표적 결합의 효능에 있어서 어느 정도 상이한지 여부를 추가로 조사하기 위해, 전술된 바와 같이 분취용 CEX에서 얻은 입체형태 변이체-농축 측면 분획 및 입체형태 변이체-고갈 상부 분획에 대해 하기 검정을 수행했다.

이의 각각의 표적에 대한 ISVD의 효능을 하기 검정을 사용하여 결정했다(위의 항목 5.4.5에 기재된 바와 같이).

- TNF-알파 결합 모이어티의 효능 시험을 위한 세포 기반 리포터 검정;

- OX40L 결합 모이어티의 효능 시험을 위한 세포 기반 리포터 검정;

- 알부민 결합 모이어티의 효능 시험을 위한 ELISA 기반 알부민 결합 검정.

측면("농축") 및 상부("고갈") 분획의 효능에 대한 결과를 표 3에 나타낸다.

[표 3]

연마 CEX 구배로부터 입체형태 변이체가 농축된 측면 분획 및 입체형태 변이체가 고갈된 상부 분획에 대한 효능 결과. 효능은 입체형태 변이체가 농축되거나 고갈되지 않은 참조물에 대비하여 상대적으로 표현된다.

* 0.5 내지 1.5의 효능 값은 참조와 필적하는 효능을 표시함.

** 유의함; 참조보다 낮은 효능을 표시함.

TNFα 효능 검정에서 고갈된 분획과 비교하여 입체형태 변이체-농축 분획에 있어서 효능의 유의한 감소가 관찰되었다. 따라서, 화합물 A의 입체형태 변화는 TNFα에 대한 결합 효능에 영향을 미친다.

6.3 실시예 3: 화합물 A의 입체형태에 영향을 미치는 조건 결정

실시예 1 및 실시예 2로부터의 관찰에 기반하여, 다가 ISVD 작제물의 입체형태에 영향을 미칠 수 있는 특정 실험 조건의 영향을 평가하기 위해 추가 실험을 설정했다. 시험된 조건은 온화한 변성, 스트레스 또는 무질서유발제의 존재였다. 시험된 조건을 표 4에 요약한다.

[표 4]

분석용 특성규명 실험 설정.

저 pH 처리

저 pH 처리의 경우, 분취용 CEX(전술됨)로부터의 조밀한 변이체가 농축된 및 고갈된 물질을 pH 2.5, pH 3.0 또는 pH 3.5 또는 제형물 완충액 pH 6.5(대조군)를 사용하여 100 mM 글리신의 최종 농도에 도달하도록 처리했다. 샘플을 각각의 pH에서 4시간 동안 인큐베이션한 다음 직접 분석하거나 0.1 M NaOH로 중화한 다음 분석했다. 조밀한 변이체-농축 및 -고갈 물질에 대한 pH 2.5에서의 처리의 영향을 SE-HPLC 및 IEX-HPLC(표 C; IEX-HPLC 프로토콜 I에 제시된 조건)에 의해 분석했으며 도 7a 및 b(SE-HPLC) 및 도 8(IEX-HPLC; 조밀한 변이체-농축 분획만)에 나타낸다.

pH 2.5에서 인큐베이션된 입체형태 변이체가 농축된 물질의 경우, SE-HPLC 및 IEX-HPLC 후 피크 1이 유의하게 감소했다. 이 감소는 두 분석 모두에서 주요 피크의 증가와 관련되었으므로, 이는 입체형태 변이체가 온전한 형태로 전환되었음을 실증했다. 또한, 용출액을 pH 2.5에서 4시간 동안 인큐베이션한 경우, 중화 후에도 전환이 유지되었다(데이터는 나타내지 않음). 대조군 샘플이나 입체형태 변이체가 고갈된 물질에 대해서는 변화가 관찰되지 않았다(도 7b; IEX-HPLC에 대한 데이터는 나타내지 않음). pH 3.0 및 3.5에서 인큐베이션된 물질의 경우, SE-HPLC 및 IEX-HPLC 후 피크의 약간의 감소만이 관찰되어, pH가 입체형태 변이체의 온전한 형태로의 전환을 허용하도록 충분히 낮지 않음을 제시하였다(데이터는 나타내지 않음).

이어서 온전한 형태로 전환된 조밀한 변이체의 안정성을 pH 2.5에서의 저 pH 처리 및 후속 중화 후 확인했다. 25℃에서 최대 2주 동안 온전한 형태로 전환된 이 조밀한 변이체의 보관 후, SE-HPLC 프로필에는 변화가 없어서, 조밀한 변이체-농축 물질의 pH 처리 시 온전한 형태로의 전환이 유지된다는 것을 실증하였다(조밀한 변이체-고갈 물질과 유사함). 5℃에서 2주 동안 보관한 경우에도 동일한 결과를 얻었다(데이터는 나타내지 않음).

무질서유발제를 사용한 처리

무질서유발제의 영향을 평가하기 위해, 입체형태 변이체-농축 및 -고갈 물질을 1 M, 2 M 또는 3 M의 구아니디늄 클로라이드(GuHCl)를 포함하지 않거나 포함하고 0.5시간 동안 인큐베이션하고 SE-HPLC(표 C; SE-HPLC에 제시된 조건) 및 IEX-HPLC(표 C; IEX-HPLC 프로토콜 II에 제시된 조건)에 의해 분석했다. 입체형태 변이체가 농축된 물질에 대한 2 M 및 3 M GuHCl 변성제로의 처리 영향의 결과를 도 9(SE-HPLC) 및 도 10(IEX-HPLC)에 나타낸다.

GuHCl과 함께 인큐베이션된 조밀한 변이체가 농축된 물질의 경우, 2 M의 GuHCl 농도가 적용되었을 때 SE-HPLC 및 IEX-HPLC 후 피크 1이 유의하게 감소했다. 또한, 후 피크 1 감소는 두 분석 모두에서 주요 피크의 증가와 관련되어, 입체형태 변이체가 온전한 형태로 전환되었음을 실증하였다. 입체형태 변이체가 고갈된 대조군 샘플에서는 변화가 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).

3 M GuHCl의 농도는 시험된 화합물 A에 대해 너무 높았고 고분자량(HMW) 종의 형성(SE-HPLC에서의 전 피크)에 의해 실증된 바와 같이 산물의 분해를 야기했다.

1 M GuHCl 적용 시 IEX-HPLC 및 SE-HPLC 분석 둘 모두에서 후 피크 면적이 약간 감소했다. 화합물 A의 경우 이 조건은 입체형태 변이체를 온전한 형태로 완전히 전환시키기에 충분한 변성이 아닌 것으로 보였다(데이터는 나타내지 않음).

열 스트레스 처리

열 처리를 위해, 입체형태 변이체-농축 및 -고갈 물질을 실온(RT)으로 재평형화하기 전에 50℃ 또는 60℃에서 1시간 또는 4시간 동안 인큐베이션했다. 50℃에서 1시간 동안 열 스트레스의 영향의 결과를 도 11(SE-HPLC) 및 도 12(IEX-HPLC)에 나타낸다.

입체형태 변이체-농축 물질의 경우 SE-HPLC 및 IEX-HPLC 후 피크는 물질이 50℃에서 1시간 및 4시간 인큐베이션 동안 가열될 때 유의하게 감소했다(4시간 인큐베이션에 대한 데이터는 나타내지 않음). 이 감소는 두 분석 모두에서 주요 피크의 증가와 관련되었으므로, 이는 입체형태 변이체가 온전한 형태로 전환되었음을 실증하였다. 입체형태 변이체-고갈 샘플에서는 변화가 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).

60℃에서의 인큐베이션은 화합물 A에 대해 너무 높은 것으로 보였고 SE-HPLC 및 IEX-HPLC에서 총 면적의 감소(산물 손실)와 함께 산물의 분해를 야기했다(데이터는 나타내지 않음).

pH 또는 GuHCl 처리 시 효능 회복

4시간 동안 pH 2.5 처리 또는 0.5시간 동안 2 M GuHCl 처리 후 입체형태 변이체-농축 및 -고갈 분획에 존재하는 화합물 A의 (실시예 2에 기재된 바와 같은) TNFα에 대한 효능을 미처리 샘플과 비교하여 결정했다. 결과를 표 5에 나타낸다.

[표 5]

분석용 특성규명 동안의 효능 결과.

입체형태 변이체가 고갈된 분획과 비교하여 미처리 입체형태 변이체가 농축된 분획에 대한 효능 저하가 확인되었다. 입체형태 변이체가 농축된 분획의 저 pH 처리는 입체형태 변이체-고갈 분획에 대해 관찰된 수준으로 TNFα-효능의 재획득을 초래했다. GuHCl 처리된 샘플의 경우 효능은 더 낮았지만 처리 후 농축 및 고갈 분획과 필적했다.

요약

이러한 실험을 통틀어 특정한 온화한 변성 조건 하에 또는 정전기적 상호작용(pH)을 변형할 때 온전한 형태로 전환될 수 있는 입체형태 변이체의 존재를 확인했다. 또한 변성 조건의 제거 또는 pH 조정 후에도 입체형태 변이체의 온전한 ISVD 산물로의 전환이 유지되는 것으로 나타났다. 또한, 전환 후 효능이 회복되어 25℃ 또는 5℃에서 2주 동안 유지되었다(데이터는 나타내지 않음).

6.4 실시예 4: 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의한 화합물 A의 입체형태 변이체의 분리

단백질 A 친화도 크로마토그래피 또는 화합물 A의 입체형태 변이체의 제거 동안 대안적 용출 완충액의 사용

입체형태 변이체(실시예 1 및 2)의 특성규명 동안 얻은 결과에 기반하여, 화합물 A의 포획 동안 대안적인 용출 완충액 조건을 시험했다.

용출 조건 및 결과를 표 6, 도 13(SE-HPLC) 및 도 14(IEX-HPLC)(표 C, SE-HPLC 및 IEX-HPLC 프로토콜 I에 제시된 조건)에 나타낸다.

[표 6]

포획 조건.

0.1 M NaOH를 사용하여 적어도 7.0 pH로의 용출액의 pH의 조정을 수행했다.

0.1 M 글리신 중 pH 2.2의 용출 완충액을 사용하여 수행된 실행의 경우, 용출액 물질의 일부를 0.1 M NaOH를 사용하여 pH 7.1로 바로 조정하고, 용출액 물질의 또 다른 부분에 대해 pH를 pH 2.5로 조정하고, 1.5시간 동안 인큐베이션한 다음, pH를 0.1 M NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 재조정했다.

SE-HPLC에서, 후 피크 1이 GuHCl을 사용한 용출 완충액에 있어서 유의하게 감소됨을 알 수 있었다. 그러나, GuHCl의 존재는 pH 2.2에서 완충액을 사용한 용출과 비교하여 용출액에서 HMW 종의 형성(SE-HPLC에서 전 피크)에 의해 실증된 바와 같이 산물의 분해를 야기했다. pH 2.2에서의 용출의 경우, SE-HPLC 후 피크 1은 중화되지 않은 용출액 또는 pH 2.5로 조정되고 중화 전 1.5시간 동안 인큐베이션된 용출액과 비교하여 용출액이 바로 중화되었을 때 더 높았다(도 13). 이것은 바로 중화된 용출액과 비교하여 pH 2.5로 조정되고 중화 전에 인큐베이션된 용출액에 대해 후 피크 쇼울더가 사라진 IEX-HPLC에서 확인되었다(도 14).

두 분석 모두에서, 후 피크(입체형태 변이체)의 감소는 주요 피크(온전한 형태)의 증가와 관련되었다. 이러한 결과는 모두 조밀한 변이체의 온전한 형태로의 전환을 시사하였다.

화합물 A의 입체형태 변이체의 전환을 위한 단백질 A 친화도 크로마토그래피 후 저 pH 인큐베이션의 사용

상기에서 얻은 결과에 기반하여, 입체형태 변이체를 전환시키는 수단으로서 저 pH 처리를 화합물 A에 대해 조사했다.

pH 2.1, pH 2.3, pH 2.5 및 pH 2.7 그리고 0, 1, 2, 4, 6 및 24 h의 인큐베이션에서 저 pH 처리 및 인큐베이션 길이의 영향을 조사했다. 포획 용출액의 pH를 0.1 M HCl을 사용하여 적절한 pH(2.1, 2.3, 2.5 또는 2.7)로 감소시키고 0.1 M NaOH를 사용하여 pH 6.0으로 바로 조정하거나(T0) 저 pH에서 1 h 또는 2 h 또는 4 h 또는 6 h 또는 24 h 동안 인큐베이션한 후 0.1 M NaOH를 사용하여 pH 6.0으로 조정했다(T1h, T2h, T4h, T6h 또는 T24h). 상이한 저 pH 처리된 샘플의 산물 품질을 0.1 M NaOH로 pH 6.0으로 바로 조정한 포획 용출액(대조군; T0)과 비교하고 IEX-HPLC, SE-HPLC, RP-UHPLC 및 모세관 겔 전기영동(CGE)에 의해 분석했다(표 C, 프로토콜 I에 제시된 바와 같은 IEX-HPLC 조건). SE-HPLC 결과를 도 15a 및 도 15b(T0의 경우) 및 도 15c 및 도 15d(T1h의 경우)에 나타낸다.

T0에서, SE-HPLC에서 관찰된 후 피크는 대조군과 비교하여 pH 2.1 및 pH 2.7에서 더 낮았다. 이는 이 pH 범위에서, 화합물 A의 입체형태 변이체의 전환이 즉시 발생했음을 실증한다. 그러나 SE-HPLC에서 관찰된 후 피크 1은 T0에서 이미 pH 2.1, 2.3 및 2.5에 대해 더 낮아서, 입체형태 변이체의 전환이 pH 2.5 이하의 pH에 대해 즉각적으로 발생한다는 것을 의미한다. 이것은 후 피크가 T0에서 pH 2.7에 비해 pH 2.3 및 2.5에 대해 더 낮은 IEX-HPLC(데이터는 나타내지 않음)에서 확인되었다.

1시간 인큐베이션 이후부터, SE-HPLC의 후 피크 쇼울더는 모든 pH 처리에서 유사했다.

따라서, 상기 데이터는 입체형태 변이체의 화합물 A의 온전한 형태로의 전환이 적어도 1시간 동안 pH 2.1 내지 2.7 범위의 pH에서의 모든 처리에 있어서 효과적임을 나타내었다.

RP-UHPLC 및 CGE에서는 변화가 관찰되지 않아(데이터는 나타내지 않음), 조밀한 변이체가 분자량(LMW 없음), 화학적 조성 또는 디설피드 가교(스크램블된 S-S)에서 다르지 않음을 표시하였다.

화합물 A의 입체형태 변이체의 전환을 위한 저 pH 인큐베이션이 pH 조정 스톡 용액의 농도와 무관함

pH 조정 용액 농도의 영향을 조사하기 위해, 두 세트의 pH 조정 용액을 시험했다: 첫 번째 세트는 0.1 M HCl을 사용하여 pH를 2.6으로 감소시키고 0.1 M NaOH를 사용하여 pH를 6.0으로 조정하고, 두 번째 세트는 2.7 M HCl(10% HCl과 동일)을 사용하여 pH를 2.6으로 감소시키고 1 M NaOH를 사용하여 pH를 6.0으로 조정한다. 샘플을 pH 6.0으로 조정하기 전에 pH 2.6에서 1 h 동안 인큐베이션했다. SE-HPLC 결과를 도 16a에 나타낸다.

두 세트의 pH 조정 용액의 사용은 입체형태 변이체의 온전한 형태로의 전환과 관련된 주요 피크의 증가와 관련되는 SE-HPLC 후 피크의 감소를 포함하는 필적하는 결과를 야기했다.

그런 다음 중간 규모의 확장 가능성을 평가하기 위해 중간 규모 수행을 위한 공정에 저 pH 인큐베이션 단계를 도입했다. 0.1 M HCl을 사용하여 pH를 pH 2.6으로 감소시킨 다음, 1 h 후에 0.1 M NaOH를 첨가하여 pH 6.0으로 조정했다.

SE-HPLC(표 C에 제시된 조건) 결과는 포획 용출액(저 pH 처리 전)과 비교하여 포획 여과액(저 pH 인큐베이션 포함)에 대한 주요 피크의 증가와 관련된 후 피크 1의 감소를 나타내어, 입체형태 변이체의 온전한 형태로의 전환을 확인시켜 주었다(데이터는 나타내지 않음).

화합물 A의 입체형태 변이체에 대한 다른 저 pH 처리의 영향

피치아 파스토리스에서 화합물 A의 발현 및 접선 유동 여과로의 정화 후, Amsphere A3 수지를 사용하는 포획 크로마토그래피를 사용하여 다른 불순물로부터 화합물 A를 단리했다.

컬럼을 먼저 PBS 완충액 pH 7.5로 평형화하고 관심 화합물을 함유하는 정화된 무세포 수확 물질을 로딩했다. 화합물 A는 Amsphere A3 수지에 결합하고 불순물은 컬럼에서 관류된다. 이어서, 로딩된 수지를 평형화 단계와 동일한 PBS 완충액으로 세척한 후 트리스 완충액으로 세척했다. 트리스 완충액은 pH 8.5에서 100 mM 트리스 및 1 M NaCl을 함유했다. 수지를 pH 5.5에서 두 번째 100 mM 트리스 완충액으로 추가 세척했다. 화합물 A를 저 pH 글리신 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 용출했다. 저 pH 글리신 용출 완충액은 pH 3.0에서 100 mM 글리신을 함유했다. 마지막으로, 평형화와 동일한 PBS 완충액에 보관하기 전에 수지를 100 mM NaOH로 세정했다. 모든 완충액은 183 cm/h에서 수행했다.

첫 번째 실험에서, 화합물 A의 포획 용출액 물질의 pH를 1 M HCl을 사용하여 pH 2.6, pH 2.8, pH 2.9 및 pH 3.0으로 감소시켰다. 저 pH에서 1 h 및 2 h 인큐베이션 후, 샘플을 0.2 M NaOH를 사용하여 pH 6.0으로 조정했다. T0 샘플 또는 대조군 샘플은 용출 직후에 동결된 포획 크로마토그래피였다. 이 샘플은 pH 4.3을 가졌다.

두 번째 실험에서, 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출된 산물의 pH는 2회의 포획 크로마토그래피 수행에서 4.1 및 3.7이었다. 포획 용출액의 pH를 1 M HCl을 사용하여 pH 3.2 또는 pH 3.6으로 감소시켰다. 저 pH에서 2 h 및 4h 인큐베이션 후, 샘플을 0.2 M NaOH를 사용하여 pH 6.0으로 조정했다. T0를 1 M HCl을 사용하여 화합물 A를 표적 저 pH(즉, pH 3.2 또는 3.6)로 감소시키고 0.2 M NaOH를 사용하여 pH 6.0으로 바로 조정함으로써(T0) 생성하였다.

산물 품질에 대한 pH의 영향을 IEX-HPLC에 의해 시간의 함수로 분석하였다. 표 6-1 및 6-2 그리고 도 16b 및 도 16c를 참고한다.

[표 6-1]

입체형태 변이체의 전환에 대한 저 pH 처리 영향의 IEX-HPLC 분석 결과(첫 번째 실험).

[표 6-2]

입체형태 변이체의 전환에 대한 저 pH 처리 영향의 IEX-HPLC 분석 결과(두 번째 실험).

IEX-HPLC 결과는 샘플에서 입체형태 변이체의 존재에 대해 경시적인 저 pH 처리의 긍정적 영향을 나타낸다. 첫 번째 실험 세트(pH 2.6, pH 2.8, pH 2.9 및 pH 3.0)에서, 대조군 샘플의 입체형태 변이체 수준은 3.5%였다. 두 번째 실험 세트(pH 3.2 및 3.6)에서, 입체형태 변이체 수준은 3.1%였다.

저 pH에서 2 h 인큐베이션 후, 시험된 모든 pH에서 입체형태 변이체 수준이 감소했다. 입체형태 변이체에 대한 저 pH 처리의 긍정적 효과는 pH 가 낮을수록 증가했다. pH 3.0 내지 pH 2.6에서 가장 우수한 감소가 관찰되었다.

6.5 실시예 5: 화합물 A의 저 pH 처리의 규모 확대(10 L 및 100 L)

이전 실시예에 기반하여, 화합물 A의 저 pH 인큐베이션을 위해 선택된 조건은 실온에서 ≥ 60 및 ≤ 120분 동안 표적 pH 2.6이었다. 0.1 M HCl을 사용하여 포획 용출액의 pH를 낮추고 0.1 M NaOH를 첨가하여 ≥ 60 및 ≤ 120분 후에 pH 6.0으로 조정했다. 발효 공정을 규모 10 L 및 100 L로 규모를 확대했다. 저 pH 처리 전 포획 용출액("포획 용출액"으로도 지칭함) 및 저 pH 처리 후 전술된 바와 같이 pH를 6.0으로 조정하고 여과한 후의 포획 용출액(포획 여과액으로도 지칭함)의 산물 품질을 SE-HPLC, CGE 및 IEX-HPLC와 같은 분석용 방법(표 C, IEX-HPLC 프로토콜 I에 제시된 조건)에 의해 결정했다. 모든 출발 물질을 처리하기 위해, 각 규모에 대해 3 사이클의 포획 단계를 수행했다. 상이한 규모에 대한 결과를 표 7에 나타낸다.

[표 7]

규모 확대 동안 화합물 A의 산물 품질에 대한 저 pH 처리의 영향.

* 모든 후 피크의 합.

발효 및 정제 규모와 무관하게, 저 pH 처리 및 여과 단계는 CGE 분석에서 주요 피크%와 관련하여 산물 순도에 영향을 미치지 않았다. 결과는 방법 가변성 내에 있었다. 그러나 놀랍게도, SE-HPLC에 의한 HMW 종%의 감소(도 17a(10 L) 및 도 17b(100 L) 참고)는 포획 여과액 및 포획 용출액을 비교할 때 발효(각각 10 L 및 100 L) 및 정제 규모 확대(각각 7 cm 및 20 cm 컬럼 지름) 둘 모두에서 관찰되었다; 이러한 감소는 저 pH 처리 및/또는 여과 단계의 결과이다. 더욱이, 소규모에서 이전에 관찰된 바와 같이, 포획 여과액과 포획 용출액을 비교할 때 저 pH 처리 후 IEX-HPLC에서 주요 피크 순도%의 유의한 증가뿐만 아니라 후 피크(입체형태 변이체)%의 감소가 관찰되었다(표 7 및 도 18(10 L) 및 19(100 L)). 또한, 후 피크 1(쇼울더)의 감소는 포획 여과액의 프로필에 있어서 주요 피크의 증가와 관련되었다. 이는 IEX 데이터와 상관관계가 있으며 입체형태 변이체의 화합물 A의 온전한 형태로의 전환을 확인시켜 준다.

전체적으로 결과는 저 pH 처리가 확장 가능한 공정이며 입체형태 변이체를 화합물 A의 온전한 형태로 전환시키는 데 효율적이라는 것을 나타내었다.

6.6 실시예 6: 다른 크로마토그래피 기술에 의한 화합물 A의 입체형태 변이체의 분리

화합물 A의 입체형태 변이체의 제거를 위한 혼합 모드 크로마토그래피(MMC)의 사용

위의 실시예에서 화합물 A의 입체형태 변이체가 IEX 기반 크로마토그래피 방법을 사용하여 안정적으로 분리될 수 있다는 것을 실증할 수 있었다. 입체형태 변이체 및 온전한 형태의 혼합물로부터 덜 강력한 입체형태 변이체의 제거가 다른 크로마토그래피 방법에 의해서도 달성될 수 있는지 결정하기 위해, CHT 세라믹 하이드록시아파타이트 유형 II(40 μm) 수지(BioRad)를 사용하는 혼합 모드 크로마토그래피(MMC)를 수행했다. 크로마토그래피 조건을 표 8에 요약한다.

[표 8]

화합물 A 입체형태 변이체의 제거를 위한 하이드록시아파타이트 수지의 구배 조건.

하이드록시아파타이트 수지에 대한 크로마토그래피 프로필을 도 20에 나타낸다. CEX와 유사하게, 측면(전면) 분획(F8) 및 상부 분획(F11)을 단리하여 추가 SE-HPLC 및 IEX-HPLC 분석에 사용했다. 두 분석 결과를 도 21a/도 21b(SE-HPLC) 및 도 22a/도 22b(IEX-HPLC)에 나타낸다. SE-HPLC 및 IEX-HPLC(표 C; IEX-HPLC 프로토콜 I에 제시된 조건)에서 유의미한 후 피크 1이 분획 F8(주요/상부 피크 전의 피크로부터 취한 측면 분획)에 대해 관찰되어, 이 분획에 입체형태 변이체가 농축되었음을 실증하였다. 이 분획 F11의 경우, SE-HPLC 및 IEX-HPLC 후 피크 1이 로딩 물질과 비교하여 유의하게 감소했으므로, 분획 F11은 입체형태 변이체가 고갈되었다.

결론적으로, 하이드록시아파타이트 수지에 대한 결과는 양이온 교환 수지로 얻은 결과와 유사했다. 따라서, 하이드록시아파타이트 수지는 입체형태 변이체 및 화합물 A의 온전한 형태의 혼합물로부터 덜 강력한 입체형태 변이체의 제거에 적합한 것으로 나타났다.

화합물 A의 입체형태 변이체의 제거를 위한 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)의 사용

상이한 크로마토그래피 기술 및 수지 유형에 대해 화합물 A의 온전한 형태로부터 조밀한 입체형태 변이체의 분리가 관찰됨에 따라, 또 다른 크로마토그래피 방법인 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 시험했다. 먼저, HIC TSK 페닐 겔 5 PW(30)(Tosoh) 수지를 사용한 구배를 표 9에 나타낸 조건을 사용하여 수행했다.

[표 9]

F02730252 입체형태 변이체의 제거를 위한 HIC TSK 페닐 겔 5 PW(30) 수지에 대한 구배 조건.

해당 HIC 크로마토그램을 도 23에 표시한다. CEX 및 MMC 크로마토그램에서 나타난 바와 같이, 시험된 구배는 두 개의 분리된 피크(제1(주요) 피크에 이어 또한 제2(측면) 피크)가 있는 HIC 프로필을 생성했다. 각 피크의 하나의 대표적인 분획을 추가로 분석했다. 주요 피크(F26; 상부 분획) 및 측면 피크(F41; 측면 분획)의 선택된 분획으로부터의 SE-HPLC 데이터(표 C에 제시된 조건)를 도 24a/b에 나타낸다. 해당 SE-HPLC 프로필은 SE-HPLC에서 후 피크 1이 나타나지 않으므로 상부 분획이 초기 용출되는 온전한 형태로만 구성된다는 것을 드러내었다. 대조적으로, SE-HPLC 데이터는 측면 분획의 주요 종이 거의 완전히 후기 용출되는 입체형태 변이체임을 나타내었다(거의 100% 후 피크 1).

따라서 HIC 상에서 구배를 사용하여, 원하는 온전한 형태로부터 입체형태 변이체의 우수한 분리를 달성할 수 있었다. 따라서, 이 HIC 수지는 입체형태 변이체 및 화합물 A의 온전한 형태 둘 모두의 혼합물의 입체형태 변이체 제거에 적합한 것으로 나타났다.

초기에 시험된 HIC 수지(TSK 페닐 겔 5 PW(30) 수지)가 고분해 수지였으므로, 대규모 처리에 더 적합한 다른 HIC 수지: Capto 페닐 High Sub(GE Healthcare), Capto 페닐 ImpRes(GE Healthcare), Capto 부틸 ImpRes(GE Healthcare), 페닐 HP(GE Healthcare) 및 Capto 부틸(GE Healthcare)을 시험했다. 황산암모늄 및 염화나트륨을 사용한 구배를 시험했다. 사용된 조건을 아래의 표 10에 기재한다. 황산암모늄 구배와 함께 사용된 수지 Capto 부틸 Impres에 대한 상부 분획 및 로딩의 SE- HPLC 프로필을 도 25에 나타낸다.

[표 10]

화합물 A 입체형태 변이체의 제거를 위한 Capto 페닐 High Sub, Capto 페닐 ImpRes, Capto 부틸 ImpRes, 페닐 HP, Capto 부틸 ImpRes 및 Capto 부틸 수지에 대한 구배 조건.

SE-HPLC의 후 피크는 Capto 페닐 High sub를 제외하고, 염화나트륨 및 황산암모늄을 사용한 구배 둘 모두에서 시험된 모든 수지에 대해 유의하게 감소되었다. 결과적으로 염화나트륨 또는 황산암모늄 구배로 공정 적합 HIC 수지를 사용하여 입체형태 변이체를 제거할 수 있다는 것을 확인하였다.

수지 Capto 부틸 Impres 수지 및 황산 암모늄 구배의 HIC 크로마토그램을 도 26에 나타낸다. 크로마토그램에서 나타난 바와 같이, 시험된 구배는 두 개의 분리된 피크, 제1(주요) 피크에 이어 더 작은 제2(측면) 피크를 야기했다. 주요 피크의 몇몇 분획(F15 및 F20) 및 제2(측면) 피크의 한 분획(F29)을 SE-HPLC에 의해 추가 분석했다. 생성 크로마토그램(도 27)은 분획 F29가 후기 용출되는 입체형태 변이체만을 함유한다는 것을 실증했다(거의 100% SE-HPLC 후 피크 1; 로딩 피크와 비교한 피크 이동 참고). 대조적으로, 주요 피크의 분획 15 및 20은 SE-HPLC 후 피크 1의 존재를 나타내지 않아, 이러한 분획에 후기 용출되는 바람직하지 않은 입체형태 변이체가 고갈되었음을 실증하였다.

따라서 Capto 부틸 Impres 수지를 사용하여, 소수성 상호 작용에 대한 구배를 사용하여 화합물 A의 입체형태 변이체의 우수한 분리를 달성할 수 있었다. 따라서, 이 수지는 입체형태 변이체 및 화합물 A의 온전한 형태 둘 모두의 혼합물로부터 입체형태 변이체를 제거하기 위해 사용할 수 있는 것으로 나타났다.

화합물 A의 입체형태 변이체의 제거를 위한 막 기반 HIC의 사용

입체형태 변이체 및 온전한 형태의 분리가 컬럼에서 HIC 수지를 사용하여 잘 달성될 수 있었으므로, 관류액에서 원하는 온전한 형태를 갖는 관류 모드의 단계를 개발했다. 따라서 HIC 막 Sartobind 페닐(Sartorius)을 사용하여 추가 HIC 설정을 수행했다. Sartobind 페닐 막(필터 플레이트)에 대한 스크리닝 조건을 표 11에 기재한다.

[표 11]

바람직하지 않은 입체형태 변이체의 제거를 위한 Sartobind 페닐 막(필터 플레이트)에 대한 스크리닝 조건.

대표적인 조건(조건 C2)의 SE-HPLC 프로필을 도 28에 나타낸다. SE-HPLC 후 피크 1은 입체형태 변이체를 함유하는 참조 샘플과 비교하여 유의하게 감소되었다. 참조물로 저 pH 처리를 거치지 않았지만 pH 7.4로 바로 중화된 포획 용출액(단백질 A-친화도 크로마토그래피로부터)을 사용했다. 참조물은 HIC를 거치지 않았다. 따라서 입체형태 변이체는 참조 샘플로부터 제거되거나 전환되지 않았다.

3 mL Sartobind 페닐 막을 사용하여 추가 최적화를 수행했다. 조건을 표 12에 기재한다. 황산암모늄 및 염화나트륨을 상이한 농도로 사용하여 관류액에서 온전한 형태의 회수를 최적화하였다.

[표 12]

화합물 A의 입체형태 변이체의 제거를 위한 Sartobind 페닐 막에 대한 스크리닝 조건.

최적 조건에 대한 HIC 크로마토그램을 도 29에 나타낸다. 로딩, 분획 풀 2 및 스트리핑 분획의 SE-HPLC 데이터를 도 30에 나타낸다. SE-HPLC 후 피크 1은 막의 관류로부터 풀 2에 대해 유의하게 감소되었다. 스트리핑에서는 SE-HPLC 후 피크 쇼울더, 즉 바람직하지 않은 입체형태 변이체가 농축되었다. 따라서, 입체형태 변이체를 관류 모드로 HIC 페닐 막을 사용하여 원하는 화합물 A의 온전한 형태로부터 제거했다. 회수율은 황산암모늄을 사용하여 74%였고(풀 2) 염화나트륨을 사용하여 63%였다(풀 2).

6.7 실시예 7: 화합물 B의 조밀한 변이체의 확인 및 초기 특성규명

다른 다가 ISVD 작제물에 대해서도 조밀한 변이체가 나타나는지를 확인하기 위해, 화합물 B에 대해 추가 조사를 수행했다.

화합물 B(서열 번호 2)는 3개의 상이한 표적에 결합하는 중쇄 라마 항체의 4개의 상이한 서열 최적화 가변 도메인을 포함하는 다가 ISVD 작제물이다. ISVD 빌딩 블록은 하기 포맷: TNFα-결합 ISVD - 9GS 링커 - IL23p19-결합 ISVD - 9GS 링커 - 인간 혈청 알부민-결합 ISVD - 9GS 링커 - IL23p19-결합 ISVD로 G/S 링커를 포함하여 머리-대-꼬리로(N-말단에서 C-말단으로) 융합되며 하기 서열을 가진다:

[표 13]

화합물 B의 아미노산 서열.

화합물 B 단백질의 품질을 다른 기술 중에서 분석용 IEX-HPLC (표 C, IEX-HPLC 프로토콜 II에 제시된 조건)에 의해 평가했다.

정제된 화합물 B 단백질의 경우 IEX-HPLC 프로필에서 일부 구별되는 측면 피크가 관찰되었다(도 31). 질량 분광기(MS)에 따른 2D-LC 다중 심장 절단 분석을 수행하여 변이체를 확인했다. 2D-LC-MS에 의해, IEX-HPLC(1D) 프로필에서 관찰된 모든 피크의 상부 분획을 별도로 수집하고 - 탈염 단계(2D) 후 - Q-TOF 질량 분광기에서 분석하여 IEX 피크로 나타나는 단백질 분자량의 결정을 초래했다. 2D-LC-MS 분석은 후 피크 1이 산물(주요 피크)과 동일한 분자량을 갖는 것을 나타내어, 후 피크 1이 산물과 비교하여 변경된 표면 전하 분포를 갖는 "온전한 질량 변이체"이고 따라서 잠재적으로 조밀한 형태라고 결론내렸다(데이터는 나타내지 않음).

또한 화합물 B의 연마 처리 단계 동안, 몇몇 CEX(양이온 교환 크로마토그래피) 수지는 CEX에서 화합물 A에 대해 이전에 관찰된 것과 유사한 크로마토그래피 프로필(즉, 전 피크 "쇼울더"를 갖는 주요 피크)을 나타냈다(예를 들어, 실시예 1 및 2 참고). 따라서, 화합물 B의 연마 처리 단계 동안 생성된 물질을 후속적으로 IEX-HPLC에 의해 분석했다. CEX 수지를 사용한 구배를 연마 공정 동안 수행했으며, 수행 조건을 표 14에 나타내고 크로마토그램을 도 32에 나타낸다.

[표 14]

화합물 B의 연마 처리 단계 동안 CEX 수지에 대한 구배 조건.

분획 2C4 및 분획 2C7 내지 2C11의 풀(도 32)을 IEX-HPLC 분석 및 SE-HPLC 분석을 위해 제출했다(표 C에 제시된 조건). 결과를 각각 도 33 및 도 34에 나타낸다.

IEX-HPLC 분석(도 33)에서, 분획 2C4는 33.6%의 IEX-HPLC 후 피크 1을 함유한 반면, 이 변이체는 분획 2C7 내지 2C11의 풀에 1.0% 미만으로 존재했다. SE-HPLC 결과는 분획 2C7 내지 2C11과 비교하여 후 피크 쇼울더를 나타내는 분획 2C4를 갖는 화합물 A에 대해 관찰된 것과 유사한 크로마토그래피 프로필을 나타내었다. 이들 결과는 함께, IEX-HPLC 후 피크 1이 화합물 A에 대해 관찰된 바와 같이 효능에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 "조밀한" 변이체일 수 있다는 것을 암시했다. 따라서, 분획 2C4 및 분획 2C7 내지 2C11의 풀을 효능 분석을 위해 제출했다.

TNFα, IL-23 및 HSA에 대한 화합물 B의 효능을 항목 5.4.5에 기재된 바와 같이 결정했다.

- IL-23 결합 모이어티의 효능 시험을 위한 세포 기반 리포터 검정;

효능 분석 결과를 표 15에 나타낸다.

[표 15]

CEX에서 얻은 화합물 B의 조밀한 변이체-농축 및 -고갈 분획에 대한 효능 결과.

풀 분획 2C7 내지 2C11과 비교하여 33.6% IEX-HPLC 후 피크 1을 함유하는 농축된 분획 2C4에 대해 적어도 TNFα에 대한 효능에 대해 유의한 하락이 관찰되었다. 화합물 B의 수력학적 부피 및 전하에 영향을 미치는 것 외에도, 입체형태 변화는 적어도 TNFα에 대한 결합에 영향을 미친다고 결론내렸다.

따라서 조밀한 변이체를 제거하는/전환시키는 수단을 조사했다.

6.8 실시예 8: 화합물 B의 입체형태에 영향을 미치는 조건 결정

화합물 B의 저 pH 처리

화합물 A에 대해 수행된 관찰에 기반하여, 화합물 B의 포획 용출액 물질에 대해 저 pH 인큐베이션을 시험했다. 포획 용출액의 pH를 1 M HCl을 사용하여 pH 2.1, pH 2.3 또는 pH 2.5로 감소시켰다. 저 pH에서 1 h 인큐베이션 후, 샘플을 1 M 아세트산나트륨을 사용하여 pH 5.5로 조정했다. 상이한 저 pH 처리된 샘플의 산물 품질을 1 M 아세트산나트륨을 사용하여 pH 5.5로 바로 조정된 포획 용출액(대조군)과 비교하고 IEX-HPLC(표 16 및 도 35) 및 SE-HPLC(도 36)에 의해 분석했다(실시예 7뿐만 아니라 표 C; IEX-HPLC 프로토콜 II에 제시된 조건).

[표 16]

저 pH 처리 영향의 IEX-HPLC 분석.

IEX-HPLC 분석 결과는 저 pH 처리가 산물(주요 피크 순도%)의 증가뿐만 아니라 조밀한 변이체(IEX-HPLC 후 피크 1%)의 감소를 야기한다는 것을 나타낸다. 또한, 화합물 A와 유사하게, SE-HPLC에서 관찰된 주요 피크는 저 pH 처리 후 "뾰족해져서" pH 5.5로 바로 조정된 포획 용출액에서 조밀한 변이체의 존재를 암시하였다. 전체적으로 이러한 결과는 산물(IEX-HPLC 및/또는 SE-HPLC의 주요 피크)로 전환될 수 있는 조밀한 변이체 및 이에 따라 화합물 A에 대해 관찰된 활성 산물의 존재를 실증한다.

화합물 A에 대해 수행된 관찰에 기반하고 IEX-HPLC 후 피크 1이 전환될 수 있는지를 평가하기 위해, 무질서유발제, 열 또는 저 pH에 기반하는 조건을 화합물 B에 대해 시험했다. 그런 다음 샘플을 RP-UHPLC, SE-HPLC 및 IEX-HPLC에 의해 분석했다. IEX-HPLC 후 피크 1과 관련된 변화를 갖는 결과만 여기에 나타낸다.

저 pH 처리

저 pH 처리를 위해, 화합물 B를 100 mM 최종 글리신 pH 2.5, pH 3.0 또는 pH 3.5로 또는 제형 완충액 pH 6.5(대조군)로 처리했다. 실온에서 4 h 인큐베이션 후, 샘플을 분석하거나 0.1 M NaOH로 중화한 다음 분석했다. 중화되지 않은 샘플의 IEX-HPLC 및 SE-HPLC 결과를 각각 도 37 및 38에 나타내며; 모든 결과를 표 17에 요약한다.

[표 17]

저 pH 처리 영향의 IEX-HPLC 및 SE-HPLC 분석.

샘플을 100 mM 글리신 최종 pH 2.5로 처리하고 중화를 포함하거나 포함하지 않고 실온에서 4 h 인큐베이션했을 때, 대조군과 비교하여 화합물 B의 IEX-HPLC 주요 피크%는 증가한 반면 IEX-HPLC 후 피크 1%가 감소하여(표 17 및 도 37), IEX-HPLC 후 피크 1이 입체형태 변이체임을 암시하였다. IEX-HPLC 후 피크 1은 주요 피크 및 이에 따라 활성 산물로 전환될 수 있다. 추가로, 샘플을 중화를 포함하거나 포함하지 않고 100 mM 글리신 최종 pH 3.5로 처리하고 실온에서 4 h 동안 인큐베이션했을 때 대조군과 비교하여 IEX-HPLC 결과에서 유의한 변화가 관찰되지 않았고 pH 3.0 처리 후에 IEX-HPLC 후 피크 1의 제한된 감소를 관찰할 수 있었다. SE-HPLC 결과(표 17 및 도 38)와 관련하여, HMW 종의 증가는 관찰되지 않아 IEX-HPLC 후 피크 1이 HMW 종(예를 들어, 가용성 응집체)으로 전환되지 않았음을 표시하였다. 또한, SE-HPLC 결과는 pH 2.5 처리가 주요 피크의 형태에 영향을 미치는 것을 드러내었다. pH 2.5 처리 후 주요 피크가 "뾰족해지며" 이는 IEX-HPLC 결과 및 화합물 A에서 생성된 결과와 상관관계가 있다.

무질서유발제로의 처리

무질서유발제로 처리하기 위해, 화합물 B를 3 M 최종 구아니딘 하이드로클로라이드, 2 M 최종 구아니딘 하이드로클로라이드, 1 M 최종 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 Milli Q(대조군)로 처리하고 후속적으로 실온에서 0.5시간 동안 인큐베이션했다. IEX-HPLC 결과를 도 39에 나타낸다.

샘플에서 GuHCl의 존재는 IEX-HPLC 방법 조건을 방해하여, 대조군과 비교하여 처리된 샘플의 UV 신호 감소를 초래했다. 통합된 데이터는 낮은 신호로 인해 신뢰할 수 없었지만(따라서 나타내지 않음), 크로마토그램의 오버레이는 GuHCl의 첨가가 조밀한 변이체 피크(IEX-HPLC 후 피크 1)를 감소시켰을 수 있다는 것을 표시한다. 이러한 결과는 화합물 A에 대해 얻은 결과와 일치한다.

열 스트레스 처리

열 처리를 위해, 화합물 B를 50℃에서 1 h, 50℃에서 4 h, 60℃에서 1 h, 60℃에서 4 h(이후 RT로 재평형화), RT에서 4 h 인큐베이션하거나 인큐베이션하지 않았다(대조군). IEX-HPLC 및 SE-HPLC 결과를 각각 도 40 및 41(50℃에서 1 h 동안)에 나타내고 표 18에 요약한다.

[표 18]

입체형태 변이체의 전환에 대한 열 처리 영향의 IEX-HPLC 및 SE-HPLC 분석 결과.

50℃에서 1 h, 50℃에서 4 h, 60℃에서 1 h 또는 60℃에서 4 h 동안 열 처리했을 때, 대조군과 비교하여 화합물 B의 IEX-HPLC 주요 피크%는 증가한 반면 IEX-HPLC 후 피크 1%는 감소하여, IEX-HPLC 후 피크 1이 입체형태 변이체임을 암시했다(표 18 및 도 40). IEX-HPLC 후 피크 1은 잠재적으로 주요 피크 및 이에 따라 활성 산물로 전환될 수 있었다. 또한, RT에서 4 h 동안 인큐베이션했을 때 대조군과 비교하여 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 이들 샘플을 SE-HPLC에 의해 분석했을 때, HMW 종의 증가가 관찰되지 않아 IEX-HPLC 후 피크 1이 HMW 종(예를 들어 가용성 응집체)으로 전환되지 않았음을 표시했다. 또한, SE-HPLC 결과(표 18 및 도 41)는 열 처리가 주요 피크의 형태에 영향을 미치는 것을 드러내었다. 주요 피크는 열 처리되면 "뾰족해지며" 이는 IEX-HPLC 결과 및 화합물 A에서 생성된 결과와 상관관계가 있다.

요약

종합하면, 이러한 결과는 IEX-HPLC 후 피크 1이 pH 2.5에서의 저 pH 처리, GuHCl 처리 및/또는 열 처리에 의해 IEX-HPLC 및 SE-HPLC에서 주요 피크의 더 강력한 온전한 형태(본원에서 "온전한 산물"로 지칭됨)로 전환될 수 있는 화합물 B의 입체형태 변이체(본원에서 덜 강력한 "조밀한 변이체"로 지칭됨)임을 확인시켜 주었다.

6.9 실시예 9: 화합물 B에 대한 저 pH 처리의 최적화

상기 실시예 8에 기재된 화합물 A 및 화합물 B 결과에 대한 처리에 기반하여, 조밀한 변이체를 전환시키는 수단으로서 저 pH 처리를 화합물 B에 대해 최적화했다.

피치아 파스토리스에서 화합물 B의 발현 및 수확 후, Amsphere A3 수지를 사용하는 포획 크로마토그래피를 사용하여 다른 불순물로부터 화합물 B를 단리했다.

컬럼을 먼저 PBS 완충액 pH 7.5로 평형화하고 관심 화합물을 함유하는 정화된 무세포 수확 물질을 로딩했다. 화합물 B는 Amsphere A3 수지에 결합하고 불순물은 컬럼에서 관류된다. 이어서, 로딩된 수지를 평형화 단계와 동일한 PBS 완충액으로 세척한 후 트리스 완충액으로 세척했다. 트리스 완충액은 pH 8.5에서 100 mM 트리스 및 1 M NaCl을 함유했다. 수지를 pH 5.5에서 두 번째 100 mM 트리스 완충액으로 추가 세척했다. 화합물 B를 저 pH 글리신 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 용출했다. 저 pH 글리신 용출 완충액은 pH 3에서 100 mM 글리신을 함유했다. 마지막으로 수지를 평형화와 동일한 PBS 완충액에 보관하기 전에 100 mM NaOH로 세정했다. 모든 완충액은 183 cm/h에서 수행했다.

포획 크로마토그래피 후, 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출되는 산물의 pH는 pH 3.8이었다. 그런 다음, 저 pH 인큐베이션 단계를 화합물 B에 적용했다.

저 pH 인큐베이션 시간

(1) 초기 실험: 먼저, pH 2.3 및 pH 2.5(실시예 1 참고)에서 저 pH 처리의 영향을 후속 실험에서 확인하고 저 pH에서의 인큐베이션 기간을 추가 평가했다. 포획 용출액의 pH를 1 M HCl을 사용하여 pH 2.3 또는 pH 2.5로 감소시키고 1 M 아세트산나트륨을 사용하여 pH 5.5로 바로 조정하고(T0), 저 pH에서 1 h 동안 인큐베이션한 다음 1 M 아세트산나트륨으로 조정하고(T1), 저 pH에서 2 h 동안 인큐베이션한 다음 1 M 아세트산나트륨으로 조정하거나(T2), 저 pH에서 4 h 동안 인큐베이션한 다음 1 M 아세트산나트륨으로 조정했다(T4). 상이한 저 pH 처리된 샘플의 산물 품질을 1 M 아세트산나트륨을 사용하여 pH 5.5로 바로 조정된 포획 용출액(대조군)과 비교하고 IEX-HPLC, SE-HPLC 및 CGE에 의해 분석했다(표 C; IEX-HPLC 프로토콜 II에 제시된 조건). SE-HPLC 결과를 도 42a 및 도 42b에 나타내고 표 19에 요약한다.

[표 19]

입체형태 변이체의 전환에 대한 저 pH 처리 영향의 IEX-HPLC, SE-HPLC 및 CGE 분석 결과.

IEX-HPLC 결과(표 19)와 관련하여, 대조군, pH 2.3(T0) 및 pH 2.5(T0) 간에 차이는 관찰되지 않았다. 저 pH에서 1 h 인큐베이션, 2 h 인큐베이션 및 4 h 인큐베이션에 대해 주요 피크 순도%의 유의한 증가뿐만 아니라 IEX-HPLC 후 피크 1(조밀한 변이체)%의 감소가 관찰되었다. 또한, IEX-HPLC 후 피크 1의 감소는 가장 긴 인큐베이션 시간에 가장 효율적이었다. SE-HPLC 결과(표 19, 도 42a 및 도 42b)와 관련하여, 포획 용출액 pH의 pH 2.3 또는 pH 2.5로의 감소는 HMW 종(전 피크)의 약간 증가를 야기했으나, 주로 이전에 관찰된 바와 같이 주요 피크의 협소화를 또한 야기했다. CGE 프로필(표 19)은 주요 피크 순도에 대해 상이한 샘플 간 유의차를 나타내지 않아, 조밀한 변이체가 온전한 산물과 상이한 분자량을 갖지 않는다는 초기 2D-LC 결과(실시예 7)를 확인시켜 주었다. 종합하면, 이러한 결과는 IEX-HPLC 후 피크 1이 1 h, 2 h 및 4 h 동안 저 pH 2.3 및 pH 2.5 처리에 의해 IEX-HPLC 및 SE-HPLC에서 주요 피크로 전환될 수 있는 조밀한 변이체임을 확인시켜 주었다.

(2) 추가 실험: 이어서 초기 실험의 저 pH 처리를 확장했다. 화합물 B의 포획 물질의 pH를 1 M HCl을 사용하여 pH 2.7, pH 2.9, pH 3.1, pH 3.3, pH 3.5 및 pH 3.9로 감소시켰다. 저 pH에서 2 h 및 4 h 인큐베이션 후, 샘플을 1 M 아세트산나트륨으로 pH 5.5로 조정했다.

T0은 1 M HCl을 사용하여 화합물 B의 포획 용출액의 pH를 표적 저 pH(즉, 위에서 표시된 바와 같이 pH 2.7 내지 3.9)로 감소시키고 1 M 아세트산나트륨을 사용하여 pH 5.5로 바로 조정함으로써(T0) 생성했다.

시간의 함수로 산물 품질에 대한 저 pH 처리의 영향을 IEX-HPLC에 의해 분석했다. 표 20 및 도 43a 및 도 43b를 참고한다.

[표 20]

입체형태 변이체의 전환에 대한 저 pH 처리 영향의 IEX-HPLC 분석 결과. 또한 상기 실시예 9의 초기 실험의 pH 2.3 및 pH 2.5에서의 pH 처리에 대해 관찰된 T0, T2 및 T4 결과가 포함된다.

IEX-HPLC 결과는 샘플에서 입체형태 변이체의 존재에 대한 저 pH 처리의 긍정적 영향을 나타낸다. T0 샘플에서 입체형태 변이체 수준은 시험된 모든 샘플에서 유사했다. 초기 실험 세트, 즉 pH 2.3 및 2.5에서, 수준은 약 4.5%였다. 추가 실험에서 T0(pH 2.7, 2.9, 3.1, 3.3, 3.5 및 pH 3.7)에서 대조군 샘플의 입체형태 변이체 수준은 약 3였다.

저 pH에서 2 h 인큐베이션 후, 시험된 모든 pH에서 입체형태 변이체 수준이 감소했다. 입체형태 변이체에 대한 저 pH의 긍정적 효과는 pH가 낮을수록, 즉 pH 3.0 미만에서 증가했다.

저 pH에서 4 h 인큐베이션 후, 입체형태 변이체 수준은 시험된 모든 pH에 대해 추가 감소했다. 가장 우수한 감소는 pH 2.3 내지 최대 pH 2.9에서 얻었다.

이 실시예에서 얻은 모든 결과는 특히 pH 3 이하에서, 입체형태 변이체에 대한 저 pH의 긍정적 영향을 나타낸다.

추가적인 저 pH 처리

그런 다음, 저 pH 처리의 작업 범위의 폭을 조사하기 위해, pH 2.4 및 pH 2.6에서 2 h 저 pH 인큐베이션을 조사했다. 포획 용출액의 pH를 1 M HCl을 사용하여 pH 2.4 또는 pH 2.6으로 감소시키고 샘플을 실온에서 2 h 동안 인큐베이션했다. 이어서, 샘플을 1 M 아세트산나트륨으로 pH 5.5로 조정했다. 상이한 저 pH 처리된 샘플의 산물 품질을 1 M 아세트산나트륨으로 pH 5.5로 바로 조정된 포획 용출액(대조군)과 비교하고 IEX-HPLC, SE-HPLC 및 CGE에 의해 분석했다. 결과를 도 44에 나타내고 표 21에 요약한다.

[표 21]

IEX-HPLC 결과(표 21)는 pH 2.4 및 pH 2.6에서 2 h 인큐베이션 후 주요 피크 순도%의 유의한 증가뿐만 아니라 IEX-HPLC 후 피크 1(조밀한 변이체)%의 감소를 나타낸다. SE-HPLC 결과(표 21 및 도 44)는 포획 용출액 pH의 pH 2.4 또는 pH 2.6으로의 감소가 HMW 종의 약간의 증가를 야기했으나, 이전에 관찰된 바와 같이 주요 피크의 협소화를 야기했다는 것 또한 나타낸다. CGE 프로필(표 21)은 대조군과 저 pH 처리된 샘플 간 유의차를 나타내지 않아, 조밀한 변이체가 온전한 산물과 상이한 분자량을 갖지 않는다는 초기 2D-LC 결과(실시예 7)를 확인시켜 주었다. 종합하면, 이러한 결과는 IEX-HPLC 후 피크 1이 2 h 동안 pH 2.4 및 2.6 처리에 의해 IEX-HPLC에서 주요 피크 온전한 형태로 전환될 수 있는 입체형태 변이체임을 확인시켜 주었다.

저 pH 조정 절차

마지막으로, 공정의 다음 정제 단계에 대한 영향을 고려하기 위해 pH를 적응시키는 절차를 조사했다. 실제로, pH 5.5에 도달하도록 저 pH 처리 후 1 M 아세트산나트륨으로 pH를 증가시킴으로써, 샘플의 전도도가 유의하게 상승했다. 이어서 샘플을 다음 크로마토그래피 단계에 적절한 전도도까지(≤6.0 mS/cm) 물로 고도 희석해야 했다. 이는 로딩 부피 및 결과적으로 공정 시간을 유의하게 증가시켰다.

저 pH 처리 후 pH를 조정하기 위한 상이한 접근을 2개의 독립적 실험에서 수행했다(표 22). 실험 1에서, 포획 용출액을 1 M 아세트산나트륨 pH 9를 사용하여 pH 5.5 및 전도도 ≤ 6.0 mS/cm로 바로 조정하거나(대조군 1) 포획 용출액을 먼저 2 h 동안 1 M HCl을 사용하여 pH 2.4로 조정한 다음 1 M 아세트산나트륨을 사용하여 pH 5.5로 조정하고, 전도도(≤ 6.0 mS/cm)에 도달하도록 MilliQ 수로 희석했다.

실험 2에서, 포획 용출액을 1 M 아세트산나트륨 pH 9를 사용하여 pH 5.5 및 전도도 ≤ 6.0 mS/cm로 바로 조정하거나(대조군 2) 포획 용출액을 먼저 2 h 동안 1 M HCl을 사용하여 pH 2.6으로 조정한 다음 (i) 약 50 mM 아세트산나트륨에 도달하도록 주어진 부피의 1 M 아세트산나트륨 pH 5.5를 첨가하고, (ii) 0.1 M NaOH를 사용하여 pH 5.5로 조정하고, (iii) 필요한 경우 물을 사용하여 전도도 ≤ 6.0 mS/cm로 조정함으로써, pH 5.5 및 전도도 ≤ 6.0 mS/cm로 조정했다.

[표 22]

저 pH 처리에 대한 상이한 pH 조정 접근의 영향.

^a NA: 해당 없음(시험되지 않음); 비교 조건 하에 얻은 데이터는 표 21을 참고한다.

저 pH 처리 후 pH를 pH 5.5로 증가시키기 위한 접근(표 21 및 표 22)과 무관하게, IEX-HPLC 후 피크 1%의 유사한 감소가 IEX-HPLC에서 관찰되었다. 놀랍게도, 이전의 화합물 B 결과와 비교하여, 새로운 pH 조정 접근(1 M 아세트산나트륨 pH 5.5 및 0.1 M NaOH 혼합)을 사용하여 SE-HPLC에서 관찰된 HMW 종의 증가가 존재하지 않았다(표 22 및 도 45). 더욱이, SE-HPLC 주요 피크의 협소화는 pH 2.6에서의 저 pH 처리 및 새로운 pH 조정 접근 후에도 여전히 관찰되었다(도 45). 마지막으로, 희석 인수(조정된 용출액 pH 5.5 부피/포획 용출액 부피)는 새로운 pH 조정 접근(표 22)으로 유의하게 더 낮아 다음 정제 단계에서 처리될 부피를 감소시킴으로써 전체 공정 시간을 개선했다.

6.10 실시예 10: 화합물 B에 대한 저 pH 처리의 영향

초기 특성규명에서 IEX-HPLC 후 피크 1(즉, 조밀한 변이체)에 농축된 분획에 대해 효능의 하락이 나타났고 저 pH 처리가 화합물 B의 조밀한 변이체를 보다 활성이 큰 온전한 산물로 전환시킴에 따라, 효능이 회복되었는지 평가하기 위해 화합물 B 입체형태 변이체에 대한 저 pH 처리의 영향을 아래에서 조사했다. 표 23에 나타낸 수행 조건으로, CEX 수지를 사용한 구배를 수행했다. 크로마토그램을 도 46에 나타낸다.

[표 23]

화합물 B의 조밀한 변이체 농축을 위한 CEX 수지 상의 구배 조건.

CEX 크로마토그램은 조밀한 변이체를 함유하는 예상되는 주요 피크 쇼울더를 표시했다. 분획 10 내지 14의 풀(도 46)을 저 pH 처리 없이 또는 pH 2.5에서 저 pH 처리 후에 IEX-HPLC 분석(표 C; IEX-HPLC 프로토콜 II에 제시된 조건)을 위해 제출했다. IEX-HPLC 결과의 요약을 표 24에 나타낸다.

[표 24]

저 pH 처리를 포함하거나 포함하지 않는 CEX 크로마토그래피에서 얻은 조밀한 변이체가 농축된 분획의 IEX-HPLC 결과.

저 pH 처리는 IEX-HPLC 후 피크 1의 19.5%에서 8.0%로의 감소에 의해 실증된 바와 같이, IEX-HPLC 후 피크 1의 조밀한 변이체를 주요 피크의 온전한 산물로 전환시켰다. 저 pH 처리된 샘플을 효능 분석을 위해 제출했고 이전에 생성된 결과와 비교했다(표 25). 저 pH 처리는 조밀한 변이체의 활성 산물로의 전환에 의해, 특히 TNFα에 대한 효능을 회복시켰다. 따라서 저 pH 처리는 화합물 B의 조밀한 변이체를 활성이 있는, 온전한 산물로 전환시키는 수단이다.

[표 25]

효능 분석 결과.

6.11 실시예 11: 화합물 B의 덜 강력한 조밀한 변이체의 제거를 위한 HIC의 사용

소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)가 화합물 A 조밀한 변이체의 제거/농축에 성공적이었으므로, HIC를 화합물 B의 조밀한 변이체 제거에 대해서도 시험했다. Capto 부틸 ImpRes 수지(GE Healthcare)를 사용한 구배를 표 26에 나타낸 수행 조건으로 수행했다. 크로마토그램을 도 47에 나타낸다. HIC 로딩(적합한 로딩 조건에서 교환된 연마 용출액 완충액) 및 용출 분획 14/19/20/24/28을 SDS-PAGE에 의해 분석했다(도 48). 분획 14 및 분획 18 내지 26을 IEX-HPLC에 의해 분석했다(표 27).

[표 26]

화합물 B의 조밀한 변이체의 제거를 위한 Capto 부틸 ImpRes 수지에 대한 구배 조건.

[표 27]

HIC에서 얻은 상이한 분획의 IEX-HPLC(표 C; 프로토콜 II에 제시된 조건) 결과.

^an.d.: 검출되지 않음

크로마토그래피 HIC 프로필에서 관찰된 바와 같이(도 47), 구배는 2개의 분리된 피크를 야기했다. SDS-PAGE 분석(도 48)은 상이한 분획의 주요 밴드가 조밀한 변이체에 대해 예상된 바와 유사한 분자량을 가짐을 나타내었다. 흥미롭게도, IEX-HPLC 분석(표 27)은 HIC 프로필의 첫 번째 피크(분획 14)만 활성 산물 및 활성이 더 작은 조밀한 변이체를 함유한다는 것을 드러내었고, 각각 47.9%의 "온전한 산물" 및 52.1%의 "조밀한 변이체"였다. 더욱이, IEX-HPLC 분석(표 27)은 HIC 프로필의 두 번째 피크(분획 19 내지 26)에 조밀한 변이체가 존재하지 않음을 나타내었다. 따라서 화합물 B의 입체형태 변이체는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 완전히 제거 및/또는 농축될 수 있었다.

6.12 실시예 12: 포획 컬럼에 대한 로딩 인수 증가에 의한 덜 강력한 조밀한 변이체의 제거/감소

화합물 B에 대한 포획 단계를 최적화하기 위해, 정제 공정의 로딩 인수(mg 산물/ml 수지), 로딩 유속(cm/h), 용출 완충액의 pH, 로딩 pH 및 세척 완충액과 같은 상이한 매개변수(즉, 인자)를 JMP(SAS Institute) 소프트웨어의 확정 스크리닝 설계(DSD)를 사용하는 실험 설계(DOE) 접근을 사용하여 평가했다. 반응에 대한 인자의 영향을 평가하기 위해 상이한 출력(즉, 반응)을 측정했다. 반응은 포획 단계 동안 IEX-HPLC 후 피크 1을 감소/제거할 수 있는지를 평가하기 위한 IEX-HPLC 분석을 포함했지만 이에 제한되지 않았다. DOE 결과를 DSD 접근에 따라 JMP 소프트웨어에 의해 분석했다. 흥미롭게도, 시험된 상이한 인자 중에서 로딩 인수만이 IEX-HPLC 후 피크 1에 영향을 미쳤다(도 49). 놀랍게도, 조밀한 변이체 IEX-HPLC 후 피크 1은 로딩 인수를 증가시킴으로써 유의하게 제거할/감소시킬 수 있었다(표 28). 따라서 ISVD 산물로 포획 컬럼의 로딩 인수 증가가 바람직하지 않은 덜 강력한 조밀한 변이체를 감소/제거하는 수단으로 사용할 수 있었다.

[표 28]

DOE 동안 포획 용출액의 IEX-HPLC(표 C; 프로토콜 II에 제시된 조건) 결과.

6.13 화합물 B(10 L 및 100 L)의 저 pH 처리의 규모 확대

상기 실시예에 기반하여, 화합물 B의 저 pH 인큐베이션을 위해 선택된 조건은 실온에서 2 h 동안 표적 pH 2.5였다. 1 M HCl을 사용하여 포획 용출액의 pH를 낮추고 (i) 약 50 mM 아세트산나트륨에 도달하도록 주어진 부피의 1 M 아세트산나트륨 pH 5.5를 첨가하고(ii) 0.1 M NaOH를 사용하여 pH 5.5로 조정하고 (iii) 필요한 경우 물을 사용하여 전도도 6.0 mS/cm 이하로 조정함으로써, 2 h 후 pH 5.5 및 전도도 6.0 mS/cm 이하로 조정하였다. 그런 다음 화합물 B의 생산 공정을 추가 정제를 위해 10 L 및 100 L의 발효 규모로 규모를 확대했다. 분석용 방법 SE-HPLC, IEX-HPLC, CGE를 사용하여 저 pH 처리 전 포획 용출액(즉, 포획 용출액) 및 전술된 바와 같이 저 pH 처리 후 5.5의 pH로 조정 및 여과 후 포획 용출액(즉, 포획 여과액)의 산물 품질을 분석했다. 각 규모에 대해 2 사이클의 포획 단계를 수행했다. 상이한 규모에 대한 결과를 표 29에 나타낸다.

[표 29]

규모 확대 동안 화합물 B의 산물 품질에 대한 저 pH 처리의 영향.

(표 C; IEX-HPLC 프로토콜 II에 제시된 SE-HPLC 및 IEX-HPLC 조건)

먼저, 발효 및 정제 규모와 무관하게, 저 pH 처리 및 여과 단계는 CGE 분석 및 CGE 프로필의 주요 피크%와 관련하여 산물 품질에 영향을 미치지 않았으며, 그 결과는 방법 가변성 범위 내에 있었다(표 29). 놀랍게도, 저 pH 처리 및/또는 여과 단계로 인한 것일 수 있는 포획 여과액 및 포획 용출액을 비교할 때 규모 확대 모두에서 HMW 종%의 감소가 관찰되었다(표 29). 또한 SE-HPLC 결과(도 50 및 도 51)는 저 pH 처리가 주요 피크의 형태에 영향을 미치는 것을 확인시켜 주었다. 저 pH 처리 후 주요 피크가 "뾰족해지며"(예를 들어 포획 여과액에서) 이는 IEX-HPLC 결과 및 화합물 A에 대해 생성된 결과와 상관관계가 있다. 마지막으로, 포획 여과액을 포획 용출액과 비교할 때 이전에 더 작은 규모에서 관찰된 바와 같이, 주요 피크 순도%의 유의한 증가뿐만 아니라 저 pH 처리 후 IEX-HPLC에서 IEX-HPLC 후 피크 1(조밀한 변이체)%의 감소가 관찰되었다(표 29).

종합하면, 결과는 저 pH 처리가 확장 가능한 공정이며 강력한 온전한 산물에서 다가 ISVD 작제물의 덜 강력하고 바람직하지 않은 조밀한 변이체를 전환시키는 데 효율적임을 나타내었다.

6.14 실시예 14: 화합물 C의 조밀한 변이체의 확인 및 초기 특성규명

다른 다가 ISVD 작제물에 대해서도 조밀한 변이체가 나타나는 것을 확인하기 위해, 화합물 C에 대해 추가 조사를 수행했다.

화합물 C(서열 번호 69)는 2개의 상이한 표적에 결합하는 중쇄 라마 항체의 3개의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 다가 ISVD 작제물이다. ISVD 빌딩 블록은 하기 포맷: TNFα-결합 ISVD - 9GS 링커 - 인간 혈청 알부민-결합 ISVD - 9GS 링커 - TNFα-결합 ISVD로 G/S 링커를 포함하여 머리-대-꼬리로(N-말단에서 C-말단으로) 융합되며 하기 서열을 가진다:

[표 30]

화합물 C의 아미노산 서열.

피치아 파스토리스에서 화합물 C의 발현 및 접선 유동 여과에 의한 화합물의 수확 후, Amsphere A3 수지를 사용하는 포획 크로마토그래피를 사용하여 다른 불순물로부터 화합물 C를 단리했다.

컬럼을 먼저 PBS 완충액 pH 7.3으로 평형화하고 화합물 C를 함유하는 정화된 무세포 수확 물질을 로딩했다. 화합물 C는 Amsphere A3 수지에 결합하고 불순물은 컬럼에서 관류된다. 이어서, 로딩된 수지를 평형화 단계와 동일한 PBS 완충액으로 세척했다. 화합물 C는 저 pH 글리신 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 용출했다. 저 pH 글리신 용출 완충액은 pH 3.0에서 100 mM 글리신을 함유했다. 마지막으로, 수지를 평형화와 동일한 PBS 완충액에서 보관하기 전에 100 mM NaOH로 세정했다. 모든 완충액은 183 cm/h에서 수행했다.

포획 크로마토그래피 후, 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출되는 산물의 pH는 pH 3.5였다. 이어서 화합물 C를 저 pH 인큐베이션을 위해 제출했다. 포획 용출액의 pH를 1 M HCl을 사용하여 pH 2.5 또는 pH 3.0으로 감소시켰다. 저 pH에서 2 h 및 4 h 동안 인큐베이션 후, 샘플을 1 M 아세트산나트륨 pH 6.0을 사용하여 pH 5.5로 조정했다. T0은 1 M HCl을 사용하여 화합물 C를 표적 저 pH(즉, pH 2.5 또는 3.0)로 감소시키고 1 M 아세트산나트륨을 사용하여 pH 5.5로 바로 조정함으로써(T0) 생성했다.

화합물 C 단백질의 품질은 SE-HPLC에 의해 평가했다. 또한 화합물 C의 경우, SE-HPLC에서 구별되는 후 피크가 관찰되었다(도 53a 및 도 53b).

산물 품질에 대한 pH의 영향을 SE-HPLC에 의해 시간의 함수로 분석했다(표 31 및 도 54 참고).

[표 31]

입체형태 변이체의 전환에 대한 저 pH 처리 영향의 SE-HPLC 분석 결과.

SE-HPLC 결과는 샘플에서 입체형태 변이체의 존재에 대한 저 pH 처리의 긍정적 영향을 나타낸다. T0 샘플의 입체형태 변이체 수준은 시험된 두 샘플에서 유사했으며, 즉, pH 2.5 샘플의 경우 조밀한 변이체의 6.7% 및 pH 3.0 샘플의 경우 입체형태 변이체의 6.8%였다. 이 두 값은 초기 샘플, 즉 입체형태 변이체 수준이 6.9%인, 저 pH로 처리되지 않은 포획 용출액과 유사하다. 저 pH에서 2 h 인큐베이션 후, 시험된 모든 pH에서 입체형태 변이체의 감소가 관찰되었다. 이 감소는 저 pH에서 4 h 인큐베이션까지 경시적으로 더 계속되었다.

이 실시예에서 얻은 모든 결과는 입체형태 변이체 백분율에 대한 저 pH의 긍정적 영향을 나타낸다.

6.15 실시예 15: CHO 세포에서 ISVD 생산 시 조밀한 변이체의 부재

CHO 세포에서 화합물 C(서열 번호 69)의 발현 후, MabSelect Xtra 수지를 사용하는 포획 크로마토그래피를 사용하여 다른 불순물로부터 화합물 C를 단리했다.

컬럼을 먼저 트리스 완충액으로 평형화하고 관심 화합물을 함유하는 정화된 무세포 수확 물질을 로딩했다. 평형화 완충액은 pH 7.5에서 50 mM 트리스, 150 mM NaCl을 함유했다. 화합물 C는 MabSelect Xtra 수지에 결합하고 불순물은 컬럼에서 관류된다. 후속적으로, 로딩된 수지를 평형화 단계와 동일한 트리스 완충액으로 세척한 후 트리스 세척 완충액으로 두 번째 세척을 했다. 세척 완충액은 pH 7.5에서 10 mM 트리스, 10 mM NaCl을 함유했다. 화합물 C를 저 pH 글리신 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 용출했다. 저 pH 글리신 용출 완충액은 pH 3.0에서 50 mM 글리신을 함유했다. 마지막으로, 수지를 100 mM 글리신 완충액 pH 2.5로 재생하고 Et-OH에 보관하기 전에 50 mM NaOH, 1 M NaCl로 세정했다. 모든 완충액은 191 cm/h에서 수행했다.

포획 크로마토그래피 후, 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출된 산물의 pH는 3.4였다. 이어서 화합물 C를 저 pH 인큐베이션에 제출했다. 포획 용출액의 pH를 1 M HCl을 사용하여 pH 2.5 또는 pH 3.0으로 감소시켰다. 저 pH에서 2 h 인큐베이션 후, 샘플을 1 M HEPES pH 7.0을 사용하여 pH 5.5로 조정했다. pH 5.5로 즉시 조정된 포획 용출액이 이 실험의 대조군 샘플이었다.

화합물 C 단백질의 품질은 SE-HPLC에 의해 평가했다. 화합물 C가 CHO 세포에서 생산되었을 때 SE-HPLC에서 후 피크가 관찰되지 않았다(도 55).

SE-HPLC 결과는 샘플에서 입체형태 변이체의 부재를 나타내었다.

6.16 화합물 D의 입체형태 변이체의 확인 및 초기 특성규명

화합물 D(서열 번호 70)는 3개의 상이한 표적에 결합하는 중쇄 라마 항체의 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 다가 ISVD 작제물이다. ISVD 빌딩 블록은 하기 포맷: TNFα-결합 ISVD - 9GS 링커 - IL-6-결합 ISVD - 9GS 링커 - 인간 혈청 알부민-결합 ISVD - 9GS 링커 - IL-6-결합 ISVD로 G/S 링커를 포함하여 머리-대-꼬리로(N-말단에서 C-말단으로) 융합되며 하기 서열을 가진다:

[표 32]

화합물 D의 아미노산 서열

피치아에서 화합물 D의 발현 및 수확 후, Amsphere A3 수지를 사용한 포획 크로마토그래피를 사용하여 다른 불순물로부터 화합물 D를 단리했다.

컬럼을 먼저 PBS 완충액 pH 7.5로 평형화하고 관심 화합물을 함유하는 정화된 무세포 수확 물질을 로딩했다. 화합물 D는 Amsphere A3 수지에 결합하고 불순물은 컬럼에서 관류된다. 이어서, 로딩된 수지를 평형화 단계와 동일한 PBS 완충액으로 세척했다. 화합물 D를 저 pH 글리신 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 용출했다. 저 pH 글리신 용출 완충액은 pH 3.0에서 100 mM 글리신을 함유했다. 마지막으로, 평형화와 동일한 PBS 완충액에서 보관하기 전에 수지를 100 mM NaOH로 세정했다. 모든 완충액은 233 cm/h에서 수행했다.

화합물 D를 저 pH 인큐베이션에 제출했다. 포획 용출액의 pH는 1 M HCl을 사용하여 pH 2.5, pH 2.7, pH 2.9, pH 3.1, pH 3.2, pH 3.4 및 pH 3.6으로 감소되었다. 저 pH에서 2 h 및 4 h 인큐베이션 후, 샘플을 0.1 M 아세트산나트륨 pH 5.6을 사용하여 pH 5.5로 조정했다. T0은 1 M HCl을 사용하여 화합물 D를 표적 저 pH(즉, pH 2.3, pH 2.7, pH 2.9, pH 3.1, pH 3.2, pH 3.4 및 pH 3.6)로 감소시키고 1 M 아세트산나트륨을 사용해서 pH 5.5로 바로 조정함으로써(T0) 생성했다.

시간의 함수로 산물 품질에 대한 pH의 영향을 SE-HPLC에 의해 분석했다(표 33 및 도 56).

[표 33]

화합물 D의 입체형태 변이체의 전환에 대한 저 pH 처리 영향의 SE-HPLC 분석 결과.

SE-HPLC 결과는 샘플에서 입체형태 변이체의 존재에 대한 저 pH 처리의 긍정적 영향을 나타낸다. T0 샘플의 입체형태 변이체 수준은 시험된 모든 샘플에서 유사했다. T0, pH 2.9, 3.1, 3.2, 3.4 및 pH 3.6에서 대조군 샘플의 입체형태 변이체 수준은 약 8.7%였다. 저 pH, 즉 pH 2.5, pH 2.7에서는 pH의 긍정적 영향으로 인해 시작량이 더 낮았다(pH 7.6 및 pH 8.2).

저 pH에서 2 h 인큐베이션 후, 입체형태 변이체 수준이 감소했다. 입체형태 변이체에 대한 저 pH의 긍정적 효과는 pH가 낮을수록 증가했다.

저 pH에서 4 h 인큐베이션 후, 입체형태 변이체 수준이 더욱 감소했다. 가장 우수한 감소는 pH 2.3 내지 최대 pH 3.1에서 얻어졌다.

이 실시예에서 얻은 모든 결과는 경시적으로 입체형태 변이체에 대한 저 pH의 긍정적 영향을 나타낸다.

6.17 실시예 17: 화합물 E의 입체형태 변이체의 확인 및 초기 특성규명

화합물 E(서열 번호 71)는 3개의 상이한 표적에 결합하는 중쇄 라마 항체의 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 다가 ISVD 작제물이다. ISVD 빌딩 블록은 하기 포맷: TNFα-결합 ISVD - 9GS 링커 - IL-6-결합 ISVD - 9GS 링커 - 인간 혈청 알부민-결합 ISVD - 9GS 링커 - IL-6-결합 ISVD로 G/S 링커를 포함하여 머리-대-꼬리로(N-말단에서 C-말단으로) 융합되며 하기 서열을 가진다:

[표 34]

화합물 E의 아미노산 서열

피치아에서 화합물 E의 발현 및 수확 후, Amsphere A3 수지를 사용한 포획 크로마토그래피를 사용하여 다른 불순물로부터 화합물 E를 단리했다.

컬럼을 먼저 PBS 완충액 pH 7.5로 평형화하고 관심 화합물을 함유하는 정화된 무세포 수확 물질을 로딩했다. 화합물 E는 Amsphere A3 수지에 결합하고 불순물은 컬럼에서 관류된다. 이어서, 로딩된 수지를 평형화 단계와 동일한 PBS 완충액으로 세척했다. 화합물 E를 저 pH 글리신 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 용출했다. 저 pH 글리신 용출 완충액은 pH 3.0에서 100 mM 글리신을 함유했다. 마지막으로, 평형화와 동일한 PBS 완충액에서 보관하기 전에 수지를 100 mM NaOH로 세정했다. 모든 완충액은 233 cm/h에서 수행했다.

화합물 E를 저 pH 인큐베이션에 제출했다. 포획 용출액의 pH는 1 M HCl을 사용하여 pH 2.5, pH 2.7, pH 2.9, pH 3.1, pH 3.2, pH 3.4 및 pH 3.6으로 감소되었다. 저 pH에서 2 h 인큐베이션 후, 샘플을 0.1 M 아세트산나트륨 pH 5.6을 사용하여 pH 5.5로 조정했다. T0은 1 M HCl을 사용하여 화합물 E를 표적 저 pH(즉, pH 2.5, pH 2.7, pH 2.9, pH 3.1, pH 3.2, pH 3.4 및 pH 3.6)로 감소시키고 1 M 아세트산나트륨을 사용해서 pH 5.5로 바로 조정함으로써(T0) 생성했다.

시간의 함수로 산물 품질에 대한 pH의 영향을 SE-HPLC에 의해 분석했다(표 35 및 도 57).

[표 35]

화합물 E의 입체형태 변이체의 전환에 대한 저 pH 처리 영향의 SE-HPLC 분석 결과.

SE-HPLC 결과는 샘플에서 입체형태 변이체의 존재에 대한 저 pH 처리의 긍정적 영향을 나타낸다. T0 샘플의 입체형태 변이체 수준은 시험된 모든 샘플에서 유사했다. T0, pH 2.9, 3.1, 3.2, 3.4 및 pH 3.6에서 대조군 샘플의 입체형태 변이체 수준은 약 7.5%(이상)였다. 저 pH, 즉 pH 2.5, pH 2.7에서는 pH의 긍정적 영향으로 인해 시작량이 더 낮았다(pH 7.2).

저 pH에서 2 h 인큐베이션 후, 입체형태 변이체 수준이 감소했다. 입체형태 변이체에 대한 저 pH의 긍정적 효과는 pH가 낮을수록 증가했다. 이 실시예에서 얻은 모든 결과는 경시적으로 입체형태 변이체에 대한 저 pH의 긍정적 영향을 나타낸다. 가장 우수한 감소는 pH 2.5 내지 최대 pH 2.9에서 얻어졌다.

SEQUENCE LISTING <110> Ablynx NV <120> METHOD FOR THE PRODUCTION AND PURIFICATION OF MULTIVALENT IMMUNGLOBULIN SINGLE VARIABLE DOMAINS <130> 219277 <160> 71 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 630 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Compound A <400> 1 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Ile 20 25 30 Tyr Ala Lys Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe 35 40 45 Val Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Arg Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ala Val Gly Gly Ala Thr Thr Val Thr Ala Ser Glu Trp Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 130 135 140 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg 145 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Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 115 120 125 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp 145 150 155 160 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser 165 170 175 Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 180 185 190 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 195 200 205 Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly 210 215 220 Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 245 250 255 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 260 265 270 Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala 275 280 285 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu 290 295 300 Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 305 310 315 320 Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro 325 330 335 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn 340 345 350 Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 355 360 <210> 70 <211> 515 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Compound D <400> 70 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala 20 25 30 Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro 130 135 140 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 145 150 155 160 Ser Tyr Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu 165 170 175 Phe Val Ser Thr Ile Asn Trp Ala Gly Ser Arg Gly Tyr Tyr Ala Asp 180 185 190 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 195 200 205 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr 210 215 220 Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Gly Gly Phe Leu Val Pro Arg Val Gly Gln 225 230 235 240 Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 245 250 255 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 260 265 270 Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 275 280 285 Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala 290 295 300 Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser 305 310 315 320 Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 325 330 335 Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro 340 345 350 Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg 355 360 365 Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 370 375 380 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val 385 390 395 400 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser 405 410 415 Leu Asp Tyr Tyr Gly Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu 420 425 430 Arg Glu Gly Val Ser Cys Ile Ser Ser Ser Glu Gly Asp Thr Tyr Tyr 435 440 445 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 450 455 460 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala 465 470 475 480 Leu Tyr Tyr Cys Ala Thr Asp Leu Ser Asp Tyr Gly Val Cys Ser Arg 485 490 495 Trp Pro Ser Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Lys Val 500 505 510 Ser Ser Ala 515 <210> 71 <211> 505 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Compound E <400> 71 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala 20 25 30 Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro 130 135 140 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ile Phe Ser 145 150 155 160 Ile Asn Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu 165 170 175 Leu Val Ala Asp Ile Phe Pro Phe Gly Ser Thr Glu Tyr Ala Asp Ser 180 185 190 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val 195 200 205 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr 210 215 220 Cys His Ser Tyr Asp Pro Arg Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 225 230 235 240 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu 245 250 255 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser 260 265 270 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly 275 280 285 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser 290 295 300 Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys 305 310 315 320 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 325 330 335 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr 340 345 350 Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 355 360 365 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 370 375 380 Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 385 390 395 400 Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Val Met Gly Trp Phe 405 410 415 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Thr Ile Asn Trp 420 425 430 Ala Gly Ser Arg Gly Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 435 440 445 Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser 450 455 460 Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Gly 465 470 475 480 Gly Phe Leu Val Pro Arg Val Gly Gln Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln 485 490 495 Gly Thr Leu Val Lys Val Ser Ser Ala 500 505

Claims

폴리펩티드 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 적어도 3개 또는 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드를 단리 또는 정제하는 방법으로서,
a) 입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키는 조건을 적용하는 단계;
b) 입체형태 변이체를 제거하는 단계; 또는
c) (a) 및 (b)의 조합을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 단리 또는 정제될 폴리펩티드는 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있는, 방법.
제2항에 있어서, 단리 또는 정제될 폴리펩티드는 CHO 세포가 아닌 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있는, 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 단리 또는 정제될 폴리펩티드는 하등 진핵생물 숙주인 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있는, 방법.
제4항에 있어서, 하등 진핵생물 숙주가 피치아(Pichia), 한세눌라(Hansenula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 토룰롭시스(Torulopsis), 토룰라스포라(Torulaspora), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 시테로마이세스(Citeromyces), 파키솔렌(Pachysolen), 데바로마이세스(Debaromyces), 메추니코위아(Metschunikowia), 로도스포리디움(Rhodosporidium), 류코스포리디움(Leucosporidium), 보트리오아스쿠스(Botryoascus), 스포리디오볼루스(Sporidiobolus), 엔도마이콥시스(Endomycopsis)와 같은 효모를 포함하는, 방법.
제5항에 있어서, 효모가 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 피치아인, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 입체형태 변이체가 폴리펩티드와 비교하여 더 조밀한 형태를 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 입체형태 변이체가 폴리펩티드와 비교하여 감소된 수력학적 부피를 갖는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 입체형태 변이체가 폴리펩티드와 비교하여 SE-HPLC에서 증가된 체류 시간을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 입체형태 변이체가 폴리펩티드와 비교하여 IEX-HPLC에서 변경된 체류 시간을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키는 조건이
i) 단리 또는 정제 공정의 단계에서 저 pH 처리의 적용으로서, 선택적으로 저 pH 처리는 조성물의 pH를 약 pH 3.2 이하, 또는 약 pH 3.0 이하로 감소시키는 것을 포함하는, 적용;
ii) 단리 또는 정제 공정의 단계에서 무질서유발제의 적용으로서, 선택적으로 무질서유발제는 구아니디늄 하이드로클로라이드(GuHCl)인, 적용;
iii) 단리 또는 정제 공정의 단계에서 열 스트레스의 적용으로서, 선택적으로 약 40℃ 내지 약 60℃에서 입체형태 변이체를 인큐베이션하는 것을 포함하는, 적용; 또는
iv) i) 내지 iii) 중 임의의 것의 조합으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되고, 저 pH 처리가 조성물의 pH를 약 pH 3.0 이하로 감소시키는 것을 포함하는, 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, pH가 약 pH 3.2 내지 약 2.1, 약 pH 3.0 내지 약 2.1, 약 pH 2.9 내지 약 pH 2.1, 약 pH 2.7 내지 약 pH 2.1, 또는 약 pH 2.6 내지 약 pH 2.3으로 감소되는, 방법.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 저 pH 처리가 적어도 약 0.5시간, 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 또는 적어도 약 4시간 동안 적용되는, 방법.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 적어도 약 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 약 1.0시간 동안 약 pH 3.2 내지 약 pH 2.1로 감소되는, 방법.
제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 적어도 약 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 약 1.0시간 동안 약 pH 3.0 내지 약 pH 2.1로 감소되는, 방법.
제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 적어도 약 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 약 1.0시간 동안 약 pH 2.9 내지 약 pH 2.1로 감소되는, 방법.
제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 적어도 약 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 약 1.0시간 동안 약 pH 2.7 내지 약 pH 2.1로 감소되는, 방법.
제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 저 pH 처리가 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 전에, 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 동안 또는 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 후에 적용되는, 방법.
제20항에 있어서, 저 pH 처리가 크로마토그래피 기술의 정지상에 조성물을 적용하기 전에, 또는 크로마토그래피 기술의 정지상으로부터 조성물을 용출한 후에 적용되는, 방법.
제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 무질서유발제가 적어도 약 1 M, 또는 적어도 약 2 M의 최종 농도의 구아니디늄 하이드로클로라이드(GuHCl)인, 방법.
제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, GuHCl이 적어도 0.5시간 동안, 또는 적어도 1시간 동안 적용되는, 방법.
제12항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 열 스트레스가 적어도 약 1시간 동안 적용되는, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 입체형태 변이체가 하나 이상의 크로마토그래피 기술에 의해 제거되고, 선택적으로 입체형태 변이체가 하나 이상의 크로마토그래피 기술에 의해 제거되기 전에 SE-HPLC 및 IEX-HPLC와 같은 분석용 크로마토그래피 기술에 의해 확인된, 방법.
제25항에 있어서, 크로마토그래피 기술이 수력학적 부피, 표면 전하 또는 표면 소수성에 기반하는 크로마토그래피 기술인, 방법.
제26항에 있어서, 크로마토그래피 기술이 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 이온 교환 크로마토그래피(IEX), 예를 들어 양이온 교환 크로마토그래피(CEX), 혼합 모드 크로마토그래피(MMC) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 중 임의의 것으로부터 선택되는, 방법.
제27항에 있어서, HIC가 HIC 컬럼 수지에 기반하는, 방법.
제27항에 있어서, HIC가 HIC 막에 기반하는, 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드의 단리 또는 정제가 조성물을 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 것을 포함하고, 조성물은 적어도 20 mg 단백질/ml 수지, 적어도 30 mg 단백질/ml 수지, 적어도 45 mg 단백질/ml 수지의 로딩 인수를 사용하여 컬럼에 적용되고, 선택적으로 크로마토그래피 컬럼은 단백질 A 컬럼인, 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 입체형태 변이체를 폴리펩티드로 전환시키는 조건 중 하나 이상이 단독으로, 또는 입체형태 변이체를 제거하는 하나 이상의 기술과 조합되어 적용되는, 방법.
적어도 3개 또는 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드를 단리 또는 정제하는 방법으로서,
i) 단리 또는 정제 공정의 단계에서 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 저 pH 처리를 적용하는 단계로서, 선택적으로 저 pH 처리는 조성물의 pH를 약 pH 3.2 이하, 또는 약 pH 3.0 이하로 감소시키는 것을 포함하는, 단계;
ii) 단리 또는 정제 공정의 단계에서 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 무질서유발제를 적용하는 단계로서, 선택적으로 무질서유발제는 GuHCl인, 단계;
iii) 단리 또는 정제 공정의 단계에서 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 열 스트레스를 적용하는 단계로서, 선택적으로 약 40℃ 내지 약 60℃에서 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하는, 단계;
iv) 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 적어도 20 mg/ml, 적어도 30 mg/ml, 적어도 45 mg/ml의 로딩 인수를 사용하여 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계로서, 선택적으로 크로마토그래피 컬럼은 단백질 A 컬럼인, 단계; 또는
v) i) 내지 iv) 중 임의의 것의 조합 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
제32항에 있어서, 단리 또는 정제될 폴리펩티드는 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있는, 방법.
제33항에 있어서, 단리 또는 정제될 폴리펩티드는 CHO 세포가 아닌 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있는, 방법.
제33항 또는 제34항에 있어서, 단리 또는 정제될 폴리펩티드는 하등 진핵생물 숙주인 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있는, 방법.
제35항에 있어서, 하등 진핵생물 숙주가 피치아, 한세눌라, 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 칸디다, 토룰롭시스, 토룰라스포라, 스키조사카로마이세스, 시테로마이세스, 파키솔렌, 데바로마이세스, 메추니코위아, 로도스포리디움, 류코스포리디움, 보트리오아스쿠스, 스포리디오볼루스, 엔도마이콥시스와 같은 효모를 포함하는, 방법.
제36항에 있어서, 효모가 피치아 파스토리스와 같은 피치아인, 방법.
제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되며, 선택적으로 저 pH 처리가 조성물의 pH를 약 pH 3.0 이하로 감소시키는 것을 포함하는, 방법.
제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 약 pH 3.2 내지 약 pH 2.1, 약 pH 3.0 내지 약 pH 2.1, 약 pH 2.9 내지 약 pH 2.1, 약 pH 2.7 내지 약 pH 2.1, 또는 약 pH 2.6 내지 약 pH 2.3으로 감소되는, 방법.
제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 저 pH 처리가 적어도 약 0.5시간, 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 또는 적어도 약 4시간 동안 적용되는, 방법.
제39항 또는 제40항에 있어서, pH가 적어도 약 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 약 1.0시간 동안 약 pH 3.2 내지 약 pH 2.1로 감소되는, 방법.
제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 적어도 약 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 약 1.0시간 동안 약 pH 3.0 내지 약 pH 2.1로 감소되는, 방법.
제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 적어도 약 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 약 1.0시간 동안 약 pH 2.9 내지 약 pH 2.1로 감소되는, 방법.
제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 적어도 약 0.5시간 동안, 예컨대 적어도 약 1.0시간 동안 약 pH 2.7 내지 약 pH 2.1로 감소되는, 방법.
제32항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 저 pH 처리가 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 전에, 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 동안 또는 크로마토그래피 기술에 기반하는 정제 단계 후에 적용되는, 방법.
제45항에 있어서, 저 pH 처리가 크로마토그래피 기술의 정지상에 조성물을 적용하기 전에 또는 크로마토그래피 기술의 정지상으로부터 조성물을 용출한 후에 적용되는, 방법.
제32항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 무질서유발제가 적어도 약 1 M, 또는 적어도 약 2 M의 최종 농도의 GuHCl인, 방법.
제32항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, GuHCl이 적어도 0.5시간 동안, 또는 적어도 1시간 동안 적용되는, 방법.
제32항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 열 스트레스가 적어도 약 1시간 동안 적용되는, 방법.
적어도 3개 또는 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 방법으로서, 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 방법에 따른 정제 또는 단리를 포함하는 방법.
제50항에 있어서, 적어도
a) 선택적으로 숙주 또는 숙주 세포가 증식하도록 하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 배양하는 단계;
b) 숙주 또는 숙주 세포가 상기 폴리펩티드를 발현 및/또는 생산하도록 하는 조건 하에 숙주 또는 숙주 세포를 유지하는 단계; 및
c) 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 단리 또는 정제 방법 중 하나 이상을 포함하는 배지로부터 분비된 폴리펩티드를 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
제50항 또는 제51항에 있어서, 숙주가 CHO 세포가 아닌, 방법.
제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주가 하등 진핵생물 숙주인, 방법.
제53항에 있어서, 하등 진핵생물 숙주가 피치아, 한세눌라, 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 칸디다, 토룰롭시스, 토룰라스포라, 스키조사카로마이세스, 시테로마이세스, 파키솔렌, 데바로마이세스, 메추니코위아, 로도스포리디움, 류코스포리디움, 보트리오아스쿠스, 스포리디오볼루스, 엔도마이콥시스와 같은 효모를 포함하는, 방법.
제54항에 있어서, 효모가 피치아 파스토리스와 같은 피치아인, 방법.
폴리펩티드 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 적어도 3개 또는 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드를 단리 또는 정제하는 방법으로서,
(1) SE-HPLC 및 IEX-HPLC와 같은 분석용 크로마토그래피 기술에 의해 입체형태 변이체를 확인하는 단계;
(2) 입체형태 변이체의 특이적 제거를 허용하도록 크로마토그래피 조건을 조정하는 단계; 및
(3) 하나 이상의 크로마토그래피 기술에 의해 폴리펩티드 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 입체형태 변이체를 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
하나 이상의 크로마토그래피 기술에 의해 폴리펩티드 및 이의 입체형태 변이체를 포함하는 조성물로부터 적어도 3개 또는 적어도 4개의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드의 단리 또는 정제를 허용하는 하나 이상의 크로마토그래피 기술을 최적화하는 방법으로서,
(1) SE-HPLC 및 IEX-HPLC와 같은 분석용 크로마토그래피 기술에 의해 입체형태 변이체를 확인하는 단계;
(2) 입체형태 변이체의 특이적 제거를 허용하도록 크로마토그래피 조건을 최적화하는 단계를 포함하는, 방법.
제56항 또는 제57항에 있어서, 단리 또는 정제될 폴리펩티드는 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있는, 방법.
제58항에 있어서, 단리 또는 정제될 폴리펩티드는 CHO 세포가 아닌 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있는, 방법.
제58항 또는 제59항에 있어서, 단리 또는 정제될 폴리펩티드는 하등 진핵생물 숙주인 숙주에서의 발현에 의해 얻을 수 있는, 방법.
제60항에 있어서, 하등 진핵생물 숙주가 피치아, 한세눌라, 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 칸디다, 토룰롭시스, 토룰라스포라, 스키조사카로마이세스, 시테로마이세스, 파키솔렌, 데바로마이세스, 메추니코위아, 로도스포리디움, 류코스포리디움, 보트리오아스쿠스, 스포리디오볼루스, 엔도마이콥시스와 같은 효모를 포함하는, 방법.
제61항에 있어서, 효모가 피치아 파스토리스와 같은 피치아인, 방법.
제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 입체형태 변이체가 제8항 내지 제11항에서와 같이 특성규명되는, 방법.
제56항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 기술이 수력학적 부피, 표면 전하 또는 표면 소수성에 기반하는 크로마토그래피 기술인, 방법.
제64항에 있어서, 크로마토그래피 기술이 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 이온 교환 크로마토그래피(IEX), 혼합 모드 크로마토그래피(MMC) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 중 임의의 것으로부터 선택되는, 방법.
제65항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피(IEX)가 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)인, 방법.
제65항에 있어서, HIC가 HIC 컬럼 수지에 기반하는, 방법.
제67항에 있어서, HIC 수지가 Capto 페닐 ImpRes, Capto 부틸 ImpRes, 페닐 HP, 및 Capto 부틸 중 임의의 것으로부터 선택되는, 방법.
제65항에 있어서, HIC가 HIC 막에 기반하는, 방법.