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WO2019009693A1 - Agente sensibilizador de tumores multirresistentes - Google Patents

Agente sensibilizador de tumores multirresistentes Download PDF

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Publication number
WO2019009693A1
WO2019009693A1 PCT/MX2018/000065 MX2018000065W WO2019009693A1 WO 2019009693 A1 WO2019009693 A1 WO 2019009693A1 MX 2018000065 W MX2018000065 W MX 2018000065W WO 2019009693 A1 WO2019009693 A1 WO 2019009693A1
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WO
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cur
use according
further characterized
administered
cells
Prior art date
Application number
PCT/MX2018/000065
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English (en)
French (fr)
Inventor
Irma Gabriela González Herrera
Original Assignee
Instituto Nacional De Neurología Y Neurocirugía
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Instituto Nacional De Neurología Y Neurocirugía filed Critical Instituto Nacional De Neurología Y Neurocirugía
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Priority to US16/629,125 priority patent/US11684592B2/en
Publication of WO2019009693A1 publication Critical patent/WO2019009693A1/es

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Definitions

  • the present invention is inserted within the fields of pharmacology and human health.
  • the present invention relates to the use of Cur- [G-2] -OH in the preparation of medicaments and pharmaceutical formulations useful for sensitizing various types of cancer resistant to chemotherapy and / or radiotherapy (multiresistant), mainly glioblastoma. , as well as the treatment of patients with various types of multiresistant tumors with drugs containing Cur- [G- 2] -OH as an active ingredient.
  • chemotherapy represents the backbone of the treatment for many types of cancer at different stages of the disease.
  • Cancer resistance to chemotherapy is the innate and / or acquired ability of cancer cells to evade the effects of chemotherapy and is one of the most pressing problems in cancer therapy because it results in a therapeutic failure and eventually in the death of the patient (Alfarouk et al. Cancer Cell Int (2015) 1 5:71).
  • a common characteristic of the most aggressive types of cancer is the resistance to conventional treatments such as radiotherapy, chemotherapy and some specific drugs and is responsible for the poor prognosis in these patients.
  • glioblastoma multiforme stands out as the brain tumor most common primary, characterized by rapid cell growth and great local spread, which is why it has the worst clinical prognosis, both in adults as in children (Das A. et al., Cancer, 2010 Jan 1; 1 16 (1): 164-76). Inevitably, death quickly ensues as a consequence of the local progression of the tumor and its recurrence (Gagliano N.
  • Nrf2 in cellular protection, being considered as the main actor in the cellular antioxidant response (Sykiotis GP, and Bohmann D. Dev Cell, 2008; 14 (1): 76-85). It is generally assumed that, under basal conditions, the interaction of Nrf2 with Keapl results in low levels of expression of the genes whose promoter contains the antioxidant response element (ARE), which include, among others, the genes encoding the antioxidant enzymes, the thioredoxin system and many ATP-dependent drug flow pumps (Zhang M, et al., Bioscience Hypotheses 2009; 2 (4): 261-263).
  • ARE antioxidant response element
  • Keapl Under conditions of oxidative or electrophilic stress, Keapl releases Nrf2, allowing its translocation to the nucleus, where it exerts its function transcriptional in genes with ARE sites (Itoh K. et al., Genes Dev. 1999 Jan 1; 13 (1): 76-86). Once the action of Nrf2 is completed, the Keap1 / Cul3 complex delocalizes the Nrf2 protein from the nucleus to the cytoplasm, where its proteasomal degradation occurs (O'Connell MA and Hayes JD, Biochem Soc Trans., 2015; 43 (4)). : 687-9).
  • Nrf2 neoplasminogen activator
  • these mechanisms do not operate in the same way, since in these cells there is a chronic activation of Nrf2 that gives them protection against a hypoxic and nutrient-free environment, and the cytotoxic effects of the anticancer agents (Shibata T. et al., Proc Nati Acad Sci USA, 2008; 105 (36): 13568-73, Bai X. et al., Drug Metab Rev. 2016; 20: 1-27; Ga ⁇ án-Gómez I. et al. al Free Radie Biol Med. 2013; 65: 750-64.), although it is unknown how tumor cells maintain high levels of Nrf2.
  • Nrf2 Ras2, Ras2, and others.
  • p62 Sequestosome-1 protein p62 / SQSTM
  • a multifunctional cytoplasmic protein which acts as a scaffold to direct other proteins and organelles towards the autophagic pathway.
  • the p62 protein interacts directly with Keapl, in such a way that it interferes with the formation of the Keap1-Nrf2 complex (Copple IM et al., J Biol Chem. 2010; 285 (22): 16782-8), but also has a site ARE in its promoter (Jain A. et al., J Biol Chem. 2010; 285 (29): 22576-91), in such a way that its expression is induced by oxidative stress in an Nrf2-dependent manner, leading to a regulation of retro-feeding type, where a higher expression of p62, could mean the greater nuclear activity of Nrf2.
  • p62 is indispensable for survival and proliferation of tumor cells, but not for normal cells, is considered an ideal therapeutic target (Gabai VL and Shifrin VI, International Reviews of immunology, 2014; 33: 375-382), so the development of agents that decrease the expression of p62 and / or Nrf2 as a strategy to treat the most aggressive tumor types is a current topic of great interest (Shibata T, et al., Proc Nati Acad Sci US A. 2008; 105 (36): 13568-73; Gabai VL. And Shifrin VI, International Reviews of immunology, 2014; 33: 375-382; Kansanen E, et al., Redox Biol. 2013; 1: 45-9).
  • Nrf2 pathway has represented a great challenge, due to its structural similarity with other members of the bZIP family of proteins (Kansanen E. et al., Redox Biol. 2013; 1: 45-9 ) so that to date there are few effective inhibitors reported.
  • antioxidants can function as coadjuvant sensitizers to antitumor therapies (Santandreu FM et al Cell Physiol Biochem 2008, 22 (5-6): 757-68; Gagliano N. et al., Anticancer Drugs, 2010; 21 (2): 140-50), but its use for these purposes has not yet been possible.
  • An example of these antioxidants is curcumin, which has anticancer and antioxidant activity (Rahman I. et al., Biochem Pharmacol., 2006; 72 (11): 1439-52; Kumar G. et al., Life Sci.
  • curcumin capable of causing apoptotic cell death in cancer cells in vitro, but not in their normal counterparts (Hail N Jr. Free Radie Biol Med. 2008; 44 (7): 1382-93), however, the potential The therapeutic use of curcumin could not be exploited, due to its hydrophobic nature, poor bioavailability and instability in light and physiological pH (Lin JK et al., Biofactors 2000; 13: 153-158; Sharma RA., et al. Cancer Res. 2004; 10: 6847-6854).
  • patents US8,487, 139 and US9,328,081 and patent applications US2012 / 0003177 and MX / a / 2015/006734 describe curcumin derivatives with improved solubility and which are useful as anticancer agents.
  • Gamage et al. (Gamage NH et al., 2016. J Nanomed Nanotechnol, 2016 Aug; 7 (4)), Shi et al. (Shi W. et al., 2007 Org Lett., Dec. 20; 9 (26): 5461-4) and Wang et al. (Wang L. et al., 2013. J Mater Sci Mater Med. Sep; 24 (9): 2137-44) describe curcumin analogues useful for the treatment of different types of cancer. The efficacy of this type of compounds and strategies has yet to be proven in the clinical setting.
  • a current problem in cancer treatment is the presence of innate or acquired resistance in many types of tumors, which decreases the therapeutic options available.
  • the strategies of sensitization of tumors resistant to the therapies are based on the use of a drug or agent to make the cancer cells are more susceptible to a second drug.
  • the sensitization of tumors allows restoring the activity of the second drug and / or decreasing its dose, which entails a lower toxicity.
  • the present invention relates to the use of the dendrimer-curcumin conjugate Cur- [G-2] -OH of formula:
  • HO OH as a sensitizing agent for multiresistant tumors (chemoresistant and / or radioresistant).
  • Figure 1 shows the detection assays of apoptotic cells by dual staining with propidium iodide (YP) and Hoechst 33342 (H) in C6 cells treated with 100 ⁇ curcumin (CUR) or Cur- [G-2] -OH 300 ⁇ for 24 and 48 hours. Images are shown in clear field microscopy (MCC), staining with propidium iodide (YP) and Hoechst 33342 (H) separately and the superposition of both dyes (S).
  • MCC clear field microscopy
  • S superposition of both dyes
  • Figure 2 shows the detection assays of apoptotic cells by dual staining with propidium iodide (YP) and Hoechst 33342 (H) in C6 cells treated with 100 ⁇ curcumin (CUR) or Cur- [G-2] -OH 300 ⁇ to a 20X amplification.
  • Cells treated with curcumin show condensation of chromatin (stars), nuclear fragmentation (thin arrows) and apoptotic bodies (arrowheads), suggesting induction of apoptosis.
  • the cells treated with Cur- [G-2] -OH have nuclei with relaxed chromatin and without staining with YP (thick arrows).
  • Figure 3 shows the fragmentation studies of DNA in C6 cells treated with curcumin 100 ⁇ (CUR) or Cur- [G2] -OH 300 ⁇ for 24h and control cells (CON). DNA fragmentation was only evident in cells treated with curcumin, whereas in cells treated with Cur- [G-2] -OH the DNA remains packed and does not migrate in the gei.
  • CUR curcumin 100 ⁇
  • CON control cells
  • Figure 4 shows the expression of the autophagy markers p62 and Beclinl, using 40 g of total proteins from C6 cells treated with Cur- [G2] -OH for 24 h and from C6 cells without treatment.
  • An anti- ⁇ -actin antibody was used as charge control.
  • the decrease in the expression of p62 and the increase of Beclinl in the cells treated with Cur- [G2] -OH is observed with respect to the cells without treatment (20X increase).
  • Figure 5 shows micrographs (20X) representative of the expression of autophagy markers p62, Beclinl and LC3 in C6 cells treated for 24h with different concentrations of Cur- [G2] -OH.
  • Treatment with Cur- [G2] -OH induces the increase in expression and perinuclear accumulation of Beclinl.
  • LC3 is detected in nuclear granules, and as the concentration of Cur- [G2] -OH increases, it is detected in the cytoplasm with the characteristic dotted pattern.
  • Treatment with Cur- [G2] -OH decreases the expression of p62, particularly in the nucleus and at higher concentrations of Cur- [G2] -OH p62 is detected in cytoplasmic aggregates that form autophagosomes.
  • Figure 6 shows the results of the studies of Nrf2 and Keap 1 expression and the co-localization of Nrf2-p62, Keap1-p62 and Keap1-Nrf2 in C6 cells treated with different concentrations of Cur- [G2] -OH for 24h and of C6 cells without treatment.
  • the presence of high basal levels of p62, Nrf2 and Keapl is observed in C6 cells without treatment, mainly in the nucleus.
  • Treatment with Cur- [G2] -OH induces the loss of Nrf2 expression in the cytoplasm, its attenuation in the nucleus; while the expression of Keapl is maintained, both in the nucleus and in the cytoplasm.
  • the expression of p62 decreases in the nucleus and an interaction of Keapl with Nrf2 is observed in this subcellular compartment, in a concentration-dependent manner.
  • Figure 7 shows the levels of phosphorylation, by the Immunoblot technique, of the transcription factor elF2-a in cells treated with different concentrations of curcumin (CUR) and different concentrations of Cur- [G2] -OH during 24h, as well as the Nrf2 levels, in cells treated with Cur- [G2] -OH 300 ⁇ .
  • CUR curcumin
  • Cur- [G2] -OH A significant decrease in the phosphorylation of elF2-a is observed in cells treated with Cur- [G2] -OH, without substantial changes in the levels of elF2-a total, whereas the treatment with curcumin increases both the levels of elF2- to total as the levels of p-elF2a.
  • the treatment with Cur- [G2] -OH causes a substantial decrease in the levels of the Nrf2 protein relative to the cells without treatment.
  • FIG 8 shows the levels of Reactive Oxygen Species (EROs) in C6 cells treated with curcumin (CUR) and with Cur- [G2] -OH in the presence and absence of N-acetyl Cysteine (NAC) for one hour. It is observed that the Cur- [G2] -OH promotes the generation of EROs in a concentration-dependent manner, even in the presence of N-acetyl Cysteine (NAC), a specific inhibitor of EROs. Treatment with curcumin produces lesser amounts of EROs and its effect is amplified with the use of NAC. An inducer of reactive species (Piocyanin) was used as a positive control.
  • Siocyanin An inducer of reactive species
  • Figure 9 shows the effect of treatment with Cur- [G2] -OH on glutathione (GSH) concentrations in C6 cells.
  • Figure 10 shows the sensitization assays of glioblastoma C6 cells, multi-resistant to oxidative stress, by treatment with Cur- [G2] -OH.
  • the cells were incubated with different concentrations of FeS0 4 , Cur- [G-2] -OH and combinations of both.
  • the cells were pre-incubated with FeS0 4 for 2 hours, and subsequently the treatment was carried out with the Cur- [G2] -OH, incubating for 22 more hours (FeS0 4 + Cur- [G2] -OH ).
  • the Cur- [G2] - OH was first added, incubating for 4 hours, and subsequently the treatment with FeSO, for 20 more hours (Cur- [G2] -OH + FeS04).
  • the percentage of cell viability is presented with respect to the treatment of C6 cells with FeS0 4 , Cur- [G2J-OH and the combination of both either pre-incubating with FeS0 4 and subsequently adding the Cur- [G2] -OH or vice versa .
  • a synergism is observed between the Cur- [G-2] -OH and the FeSO, when the cells are pre-incubated with Cur- [G-2] -OH and then FeS0 4 is added.
  • curcumin as an anticancer agent
  • its bioavailability and stability under physiological conditions are not suitable for therapeutic use. Due to this, it has been devised, on the one hand, various forms of administration or release that allow curcumin to have an adequate physiological effect and on the other hand, various derivatives of curcumin have been developed with the aim of improving its solubility, stability in physiological conditions and bioavailability, but maintaining its anticancer properties and its specificity on tumor cells.
  • Cur- [G-2] -OH is a derivative of curcumin that has improved characteristics of solubility, stability and bioavailability with respect to curcumin, but which maintains an antioxidant and anti-carcinogenic effect as good or better than that of curcumin.
  • the present invention relates to a second use of the compound Cur- [G-2] -OH, as an agent that allows to increase the sensitivity or decrease the innate or acquired resistance of multiresistant tumors.
  • Cur- [G-2] -OH an agent that allows to increase the sensitivity or decrease the innate or acquired resistance of multiresistant tumors.
  • this compound has the ability to sensitize or diminish the innate or acquired resistance of multi-resistant tumor cells, ie, improvement the response to treatment with conventional chemotherapeutic and / or radiotherapeutic agents, to which these cells were initially resistant, thus improving their effectiveness.
  • the present invention overcomes the deficiencies of the state of the art by providing a new use of the curcumin derivative Cur- [G-2] -OH, as a sensitizing agent, through the decrease in innate or acquired resistance of multiresistant tumors, including glioblastoma, as well as new multiresistant tumor treatment schemes by administering the Cur- [G-2] -OH or pharmaceutical formulations comprising it, between 1 to 72 hours before the administration of conventional therapy.
  • the present invention is based on the unexpected fact that the Cur- [G-2] -OH, administered from 1 to 72 hours before conventional therapy, is capable of inhibiting the Nrf2 pathway, of knocking down the production of GSH and of promote autophagy in multiresistant cancer cells, which eliminates the innate or acquired resistance of this type of tumors, causing them to be sensitive to conventional treatment.
  • multiresistant tumor refers to a malignant and aggressive tumor, which does not respond to conventional anticancer treatments, such as chemotherapeutic agents or ionizing radiation.
  • the terms "sensitizer” and “sensitizing agent” refer to a compound, formulation or medicament that has the ability to make multi-resistant tumor cells more sensitive to chemo- and / or or radiotherapeutics, or to decrease the resistance of said tumor cells to said agents.
  • a “sensitizing agent” has the ability to improve the efficacy of conventional treatment in tumors that are resistant to this type of treatment and can therefore be used as adjuvant therapy in the treatment of multiresistant tumors.
  • sensitize refers to increasing the sensitivity or decreasing the resistance of a multidrug-resistant tumor to conventional chemotherapeutic and / or radiotherapeutic agents. Terms such as sensitivity and sensitization are associated terms that refer to the effect produced by these sensitizing agents on multiresistant tumors, improving their response to treatment with chemo and / or radiotherapeutic agents.
  • the term "conventional therapy” refers to the use, with the intention of reducing or eliminating tumors, of certain toxic chemical compounds, which can be classified as taxanes, camptothecins, based agents in platinum, nitrosoureas, anthracyclines and epipodophyllotoxins, used alone or in combination of two or more of them, and / or ionizing radiation.
  • the terms “antitumor agent” or “anticancer agent” are similar terms that could describe a conventional therapy against cancer, so these terms are used interchangeably within of the present application.
  • glioblastoma refers to the most common and deadly tumor among tumors of the fast-growing Central Nervous System, composed of a heterogeneous mixture of poorly astrocytic tumor cells. differentiated, with pleomorphism, necrosis, vascular proliferation and frequent mitosis.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of an active compound that is necessary to obtain the desired therapeutic effect. In this particular case it refers to a sufficient amount of the Cur- [G-2] -OH which is capable of improving the sensitivity of the tumor cells to conventional therapy.
  • the first step was to elucidate the mechanism of action of the Cur- [G2] -OH, for which the determination of apoptotic death was carried out by dual staining with propidium iodide and Hoechst (Zanotto-Filho A. et al., J Nutr Biochem, 2012 Jun; 23 (6): 591-601) on rat glioma C6 cells (ATCC® CCL-107 TM) treated with curcumin and with Cur- [G2] -OH.
  • the C6 cells treated with Cur- [G2] -OH quickly acquired a microscopic morphology different from the cells treated with curcumin, from the first hours post-treatment, when there is still no cell death, and until late times of exposure (Figure 1) .
  • Cur- [G2] -OH The treatment with Cur- [G2] -OH rapidly induces the increase in the expression of the proteins Beclinl ( Figure 4) and LC3, which occurs as a function of time and the concentration of Cur- [G2] -OH ( Figure 5 ).
  • the Cur- [G2] -OH promotes the perinuclear accumulation of Beclinl. Also, at low concentrations and in early times, it is observed that LC3 is strongly detected in nuclear granules, while as the concentration and / or time increases, it is also detected in the cytoplasm with the characteristic dotted pattern.
  • p62 is a protein that participates in multiple signaling pathways, and in particular, in the regulation of the signaling pathway of Nrf2 which has been implicated in the mechanisms of tumor resistance to conventional therapies.
  • Cur- [G2] -OH studies of Nrf2 and Keap 1 expression and colocalizations of Nrf2-p62, Keap1-p62 and Keap1-Nrf2 were carried out in C6 cells with and without administration of Cur- [G2] -OH.
  • Figure 7 shows a significant decrease in the phosphorylation of F2-a before treatment with Cur- [G2] -OH, without substantial changes occurring in the levels of total F2-a, which coincides with a significant decrease in the total levels of the Nrf2 protein, confirming the effect of this compound on the Nrf2 pathway.
  • curcumin increases both the levels of the total F2-a and the levels of p-the F2c1, suggesting the coexistence of two opposing mechanisms: on the one hand, the induction of apoptosis, and on the other, the synthesis of Nrf2.
  • GSH glutathione levels
  • this compound can be administered in several doses at short times, to achieve its intracellular accumulation and thereby achieve the complete elimination of GSH and improve the sensitization of multiresistant tumors.
  • Cur- [G-2] -OH Another possible mechanism of action of the Cur- [G-2] -OH to reverse the tumor multiresistance, could be through the inhibition of the expression of the protein Mrp1 (Multidrug-Resistance-Associated Protein 1), which is key in the development of tumor tolerance to chemotherapy and is also dependent on the Nrf2-ARE pathway (Ji L. et al., PLoS One. 2013 May 7; 8 (5): e63404).
  • Mrp1 Multidrug-Resistance-Associated Protein 1
  • the invention relates to the use of the curcumin derivative Cur- [G-2] -OH of the formula:
  • HO OH to prepare a drug useful to increase the sensitivity or decrease the innate or acquired resistance to conventional therapies in tumors multiresistant in humans, mainly glioblastoma, where said compound is administered between 1 h and 72 h prior to the administration of conventional therapy.
  • Cur- [G-2] -OH can be used, as described in Landeros JM. et al. 2017. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. Feb 1; 71: 351 -362 and in the patent application MX20150006734, or any of its known derivatives in the state of the art.
  • the aforementioned documents further describe the methods of obtaining or synthesizing Cur- [G-2] -OH.
  • Cur- [G-2] -OH can be combined with pharmaceutically acceptable excipients and optionally with sustained release matrices, such as biodegradable polymers, for example, to form therapeutic compositions by standard techniques known in the art.
  • sustained release matrices such as biodegradable polymers
  • compositions or formulations of the Cur- [G-2] -OH can be used, which can be prepared by any conventional methodology known in the state of the art.
  • multiresistant cancer refers to any type of cancer resistant to conventional treatments, especially those characterized by overexpression of the Nrf2 pathway, including but not limited to: breast, ovarian, prostate, lung, esophagus, colorectal, head and neck, as well as metastatic melanoma, hepatocellular carcinoma and glioblastoma multiforme.
  • Cur- [G-2] -OH is used to sensitize glioblastoma multiforme.
  • the Cur- [G-2] -OH is used to sensitize metastatic melanoma.
  • Cur- [G-2] -OH For the sensitizing effect of Cur- [G-2] -OH to be effective, this compound must be administered prior to the administration of conventional therapy.
  • the Cur- [G-2] -OH is administered between 1 to 72 hours before conventional therapy.
  • the Cur- [G-2] -OH is administered 24 to 48 hours before conventional therapy.
  • the Cur- [G-2] -OH is administered between 1 to 72 hours before conventional therapy and its concentration is kept constant by the administration of several doses at short times, such as, for example, doses 2h, 4h, 6h, 8h or 12h.
  • the Cur- [G-2] -OH is administered between 1 to 72 hours before conventional therapy and the concentration of the Cur- [G-2J-OH is kept constant by the administration of sustained doses. at short times, but its administration is continued during one or several cycles of chemotherapy and / or radiotherapy.
  • any anti-tumor therapy can be used after administration of the Cur- [G-2] -OH.
  • antitumor therapy refers to any type of cancer therapy based on the induction of oxidative stress, mainly those dependent on the Nrf2 pathway.
  • Antitumor compounds that can be administered after sensitization with Cur- [G-2] -OH include, but are not limited to, paclitaxel, doxorubicin, cyclosporin A, daunorubicin, adriamycin, gemcitabine, etoposide and temozolamide, in which demonstrated that the associated resistance is due to the overexpression of the P-gp protein, which is mediated by the expression of the MRP-1 protein dependent on the Nrf2 pathway, in addition to that it has been observed that the curcuminoids block the overexpression of P -gp (Xu D. et al., Mol Med Rep. 2013 Jan; 7 (1): 1 15-21).
  • Nrf2 Nrf2
  • a group of compounds that can be used are those in which it has been described that they induce overexpression of Nrf2 among those without limiting verapamil, 5-flouracil, gemcitabine, doxorubicin, cyclophosphamide, valproic acid, temozolamide, anthracyclines, epirubicin, tamoxifen , radiotherapy, and platinum-derived compounds, such as cisplatin and oxaliplatin (Kang KA and Hyun JW Toxicol Res. 2017 Jan; 33 (1): 1-5).
  • the antitumor compound that is administered after sensitization with the Cur- [G-2] -OH is temozolamide.
  • conventional therapy antitumor that is administered after sensitization with the Cur- [G-2] -OH is radiotherapy and temozolamide.
  • the antitumor compound that is administered after sensitization with the Cur- [G-2] -OH is a compound derived from platinum.
  • the multiresistant tumor is glioblastoma multiforme and the conventional therapy that is administered after sensitization with the Cur- [G-2] -OH is radiotherapy and temozolamide.
  • the therapeutically effective dose of a compound will depend on a variety of factors including the disorder being treated and its severity; the pharmaceutical formulation used; the age, body weight, health status, sex and diet of the patient; the time of administration, the route of administration and the rate of excretion of the compound; the duration of the treatment; the drugs that are used in combination; and other similar factors well known in medical science, so that a person skilled in the art will be able to establish in his moment the adequate dose to sensitize a patient with a multiresistant tumor using the Cur- [G-2] -OH.
  • the Cur- [G-2] -OH is administered at doses between 5 and 500 mg / kg / day.
  • the Cur- [G-2] -OH is administered at doses between 5 and 50 mg / kg / day.
  • the Cur- [G-2] -OH is administered at doses between 20 and 25 mg / kg / day.
  • the Cur- [G-2] -OH can be adapted to create formulations suitable for oral, rectal, nasal, inhalation administration (McClure, R. et al., J. Alzheimers Dis. 2015; 44 (1): 283-95). , topical (including dermal, transdermal, buccal and sublingual), vaginal or parenteral (including subcutaneous, intramuscular, intravenous, intraocular, intratracheal and epidural) according to the methods known in the state of the art.
  • the formulations can conveniently be presented in unit dosage form and can be prepared by conventional pharmaceutical techniques known in the state of the art. Such techniques include the stage of putting in association the active ingredient and a pharmaceutical vehicle or excipient.
  • formulations in the form of nasal drops can be developed, to reach concentrations, for example between 50 and 500 mg / kg as described in Madane R. G. and Mahajan H. S. Drug Deliv. 2016 May; 23 (4): 1326-34, or formulations for atomization at concentrations of 0.5 to 2.5 mM / ml, for example, (McClure R. et al., J. Alzheimers Dis. 2015 Jan 1; 44 (1): 283 -295).
  • the formulations for intranasal application will generally be isotonic and may contain excipients to adjust or stabilize the pH, between 6.4 and 6.8, a surfactant, such as Tween 80, for example and a viscosifying agent, such as cellulose, gum arabic, alginate, pectins, vinyl and acrylic polymers, among others.
  • a surfactant such as Tween 80
  • a viscosifying agent such as cellulose, gum arabic, alginate, pectins, vinyl and acrylic polymers, among others.
  • concentrations of 1 to 20 mg / kg may be used, for example, (Duan J. et al., Int J Pharm., 2010 Nov 15; 400 (1-2): 21-1-20. ). Because these preparations are intended for the administration of large volumes, it can be prepared as a sterile concentrated dilution, which prior to its administration, is diluted in the final volume with an isotonic solution with the blood.
  • concentrations of 50 to 200 mg / kg can be used (Gal S. et al Chem Phys Lipids, 2007 Dec; 50 (2): 186-203).
  • Cur- [G-2] -OH Due to the instability of the Cur- [G-2] -OH in the acidic pH of the gastric juices, it should be administered in the form of gastro-resistant delayed-release capsules, prepared in such a way that they resist the gastric juice and release the active principle in the stomach. intestinal fluid.
  • a hydrogel with concentrations of approximately 50 to 500 mg / ml can be used (Li C. et al., Acta Biomater, 2015. Jan. 1: 222-32).
  • the formulation required for topical preparations is based on gelled liquids (hydrogel), whose bases are generally water, glycerol and gelled propylene glycol with the help of appropriate gelling agents such as starch, cellulose derivatives, magnesium and aluminum silicates and carbomers , among others.
  • the route of administration of the Cur- [G-2] -0H or its pharmaceutical formulations is by inhalation.
  • the route of administration is topically.
  • the route of administration is parenterally.
  • the invention in another embodiment, relates to a method for increasing the sensitivity of multiresistant tumors, which comprises: a) administering to a subject in need, a therapeutically effective amount of Cur- [G-2] -OH, b) let go between 1 and 72 hours after the administration of Cur- [G-2] -OH and c) administer a chemotherapeutic or radiotherapeutic agent.
  • the multiresistant tumor is selected from the group comprising: breast, ovarian, prostate, lung, esophagus, colorectal, head and neck tumors, as well as metastatic melanoma, hepatocellular carcinoma and glioblastoma multiforme, among others, mainly those multiresistant tumors associated with overexpression of the Nrf2 pathway.
  • the multiresistant tumor is glioblastoma multiforme.
  • the multiresistant tumor is metastatic melanoma.
  • the Cur- [G-2] -OH is administered between 1 h and 72 h before the chemotherapeutic or radiotherapeutic agent.
  • the Cur- [G-2] -OH is administered between 24h and 48h before the chemotherapeutic or radiotherapeutic agent.
  • the chemotherapeutic agent is temozolamide.
  • the chemotherapeutic agent is radiotherapy and temozolamide.
  • the chemotherapeutic agent is a compound derived from platinum.
  • the route of administration of Cur- [G-2] -OH is by inhalation
  • the route of administration of Cur- [G-2] -OH is parenterally.
  • C6 cells (1 x 10 6 ) were seeded in Petri dishes (100mm) at a confluence of 70%. They were treated with curcumin (100 ⁇ ) or Cur- [G2] -OH (300 ⁇ ) and incubated for 24 and 48 hours. The controls were incubated only with vehicle (DMSO or PBS respectively).
  • the DNA was extracted using Trizol (Invitrogen e 1 5596-026), according to the supplier's specifications, and quantified in a spectrophotometer (Genesys 8 ® ). 20 pg of DNA from each sample was deposited on a 1.5% agarose gel. Electrophoresis was performed at 100V for 90 minutes. The gel was stained with the Hydragreen TM dye (ACTGene ACT-IDM604) and DNA detection was performed using the ethidium bromide filter and UV light in the photoidocumentor chemidoc-it TS2 imager (UVP, CA).
  • C6 cells were cultured in 25cm 2 culture bottles (Corning ® NY) to form a confluent monolayer of 70% (approximately 4 x 10 B cells) and treated with Cur- [G2] -OH (300 ⁇ ) for 24 hours.
  • the cells were washed in cold PBS, and lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 0.01% IGEPAL) was added with a protease inhibitor cocktail (Sigma ® P8340), and centrifuged to recover the supernatant.
  • the proteins were quantified by Lowry's method (Lowry et al., 1951).
  • the membranes were blocked with skim milk and subsequently incubated with the respective primary antibody (Beclinl, ab62557, p62, ab91526, LC3, ab1688, Nrf2, sc-30915, p-elF2a, sc-12412, elF2, sc-1386 or ⁇ -actina, sc-47778) under stirring overnight at 4 ° C. After incubation, the membranes were washed with a Tween 20 tris-base salt buffer (TBST) and incubated with the respective horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody (SIGMA).
  • Tween 20 tris-base salt buffer Tween 20 tris-base salt buffer
  • the bands were visualized by chemiluminescence with the Western Blotting reagents Luminol Reagent (Santacruz Biotechnology ® ), and the ChemiDoc-lt ® TS2 photodocument (Imaging System UVP, LLC).
  • the cells were incubated in the first primary antibody (Keapl or Nrf2) at 4 ° C overnight, and were subsequently washed and re-incubated with the secondary antibody conjugated with the fluorochrome (Alexa fluor 488 abcam® ab150129), in the darkness for 1 hour at room temperature. They were washed and again blocked 30 minutes with goat serum; the serum was removed and the solution of the respective primary primary antibody (p62 or Nrf2) was placed. It was incubated at 4 ° C overnight. For the incubation of the secondary antibodies, the same procedure was used, but using the Alexa Fluor 647 Abcam® antibody (Ab150079).
  • the fluorochrome Alexa fluor 488 abcam® ab150129
  • EROs Reactive Oxygen Species
  • pyocyanin 200 ⁇ was used as inducer, N-Acetyl Cysteine (NAC, 400 ⁇ ) as inhibitor, or DMEM medium with or without DMSO as a negative control.
  • NAC N-Acetyl Cysteine
  • DMEM medium DMEM medium with or without DMSO
  • ERO detection solution was added.
  • the reduced glutathione (GSH) concentrations were measured by a colorimetric assay using the GT10 kit (Oxford Biomedical Research®), following the manufacturer's instructions. 5x10 5 C6 cells were seeded in 50 mm Petri dishes (Corning ®) to a confluence of 70%, treated with Cur- [G2] -OH at concentrations of 6, 45, 90 and 300 ⁇ and incubated for 24 hours . The controls were incubated with DMEM medium only. The absorbance of the samples was read at 400 nm in the Cytation3 ® multimodal plate reader (BioTeck, USA). It is observed that at low concentrations of Cur- [G2] -OH a synthesis of GSH is induced in C6 cells, but at high concentrations the synthesis of GSH is inhibited decreasing its concentration in the cells.
  • C6 cells were seeded (1 x 10 5 cells / well) in 96-well plates. At 24 h, a group of cells were treated with FeS0 4 at concentrations of 50, 80, 100 and 150 ⁇ or with Cur- [G2] -OH at concentrations of 240 and 300 ⁇ and incubated for an additional 24 h.
  • Another group of cells was previously incubated for 2 h with the oxidizing agent FeS0 4 at concentrations of 50, 80, 100 and 150 ⁇ and subsequently washed to add the Cur- [G2] -OH at concentrations of 240 and 300 ⁇ , continuing the incubation until complete 24h.
  • a final cell group was first treated with the Cur- [G2] -OH at concentrations of 240 and 300 ⁇ for 4 h and then the medium was changed and the FeS0 4 was added at concentrations of 50, 80, 100 and 150 ⁇ continuing the incubation for 20h more.

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Abstract

La presente invención se refiere al uso del compuesto Cur-[G-2]-OH como un agente sensibilizador en una amplia gama de tumores multirresistentes, especialmente el glioblastoma, los cuales se caracterizan por la sobreexpresión de la vía Nrf2.

Description

AGENTE SENSIBILIZADOR DE TUMORES MULTIRRESISTENTES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se inserta dentro de los campos de la farmacología y de la salud humana. De manera general la presente invención se refiere al uso del Cur-[G-2]-OH en la preparación de medicamentos y formulaciones farmacéuticas útiles para sensibilizar diversos tipos de cáncer resistentes a la quimioterapia y/o a la radioterapia (multirresistentes), principalmente glioblastoma, así como al tratamiento de pacientes con diversos tipo de tumores multirresistentes con medicamentos que contienen al Cur-[G- 2]-OH como ingrediente activo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En 2012 hubo 14.1 millones de nuevos casos de cáncer y 8.2 millones de defunciones por cáncer a nivel mundial (Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012. GLOBOCAN 2012 (IARC)).
En el cáncer, la quimioterapia representa la columna vertebral del tratamiento para muchos tipos de cáncer en diferentes etapas de la enfermedad. La resistencia del cáncer a la quimioterapia es la capacidad innata y/o adquirida de las células cancerosas de evadir los efectos de la quimioterapia y es uno de los problemas más apremiantes en la terapia del cáncer debido a que resulta en un fracaso terapéutico y eventualmente en la muerte del paciente (Alfarouk et al. Cáncer Cell Int (2015) 1 5:71 ).
Una característica común de los tipos de cáncer más agresivos, es la resistencia a los tratamientos convencionales como la radioterapia, la quimioterapia y algunos fármacos específicos y es la responsable del mal pronóstico en estos pacientes.
Entre los tumores con mayor tendencia a desarrollar resistencia se encuentran los de seno, ovario, próstata, melanoma metastásico, pulmón, colorectal, cabeza y cuello, esófago, carcinoma hepatocelular y glioblastoma multiforme, de los cuales sobresale el glioblastoma multiforme por ser el tumor cerebral primario más común, caracterizado por un crecimiento celular rápido y una gran propagación local, por lo que tiene el peor pronóstico clínico, tanto en adultos como en niños (Das A. et al. Cáncer. 2010 Jan 1 ; 1 16(1 ): 164-76). Inevitablemente, la muerte sobreviene rápidamente como consecuencia de la progresión local del tumor y su recurrencia (Gagliano N. et al. Anticancer Drugs. 2010; 21 (2): 140-50), y hasta el día de hoy, ningún paciente con diagnóstico de glioblastoma ha sido curado (Lefranc F., Kiss R. Neurosurg Focus. 2006; 20 (3): E7), por lo que es una enfermedad mortal que continúa desafiando todas las estrategias terapéuticas actuales.
Aunque varios mecanismos han sido implicados en la adquisición de multirresistencia por las células tumorales (Pan ST. et al. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2016 Aug;43(8):723-37), evidencias recientes han perfilado a la vía de señalización dependiente del factor de transcripción Nrf2, como crítica en este proceso (Gañán-Gómez I. et al. Free Radie Biol Med. 2013; 65:750-64; Bai X. et al. Drug Metab Rev. 2016; 20: 1 -27), debido a que se ha encontrado que esta proteína se sobre-expresa aberrantemente en diversos tipos de cáncer que incluyen el de próstata, ovario, endometrio, seno, pulmón, páncreas, esófago y más recientemente, melanoma y glioblastoma (Zhang P. et al. Mol Cáncer Ther. 2010; 9(2):336-46; Shim GS. et al. Free Radie Biol Med. 2009; Jiang T. et al. Cáncer Res. 2010; 70(13):5486-96; Syu JP. et al. Oncotarget. 2016; 7(12): 14659-72; Singh A. et al. Cáncer Res. 200; 68(19):7975-84; Arlt A. et al. Oncogene. 2013; 32(40):4825-35; Yamamoto S. et al. Mol Cáncer Res. 2014; 12(1 ):58-68; Rocha CR. et al. Oncotarget. 2016), siendo responsable de su quimiorresistencia y radiorresistencia.
Numerosos trabajos han demostrado la relevancia de Nrf2 en la protección celular, considerándose como el principal actor en la respuesta antioxidante celular (Sykiotis GP. y Bohmann D. Dev Cell. 2008; 14(1 ):76-85). Generalmente se asume que, en condiciones básales, la interacción de Nrf2 con Keapl resulta en bajos niveles de expresión de los genes cuyo promotor contiene el elemento de respuesta antioxidante (ARE), que comprenden entre otros, los genes codificadores de las enzimas antioxidantes, el sistema tioredoxin y muchas bombas de flujo de fármacos dependientes de ATP (Zhang M, et al. Biosciencie Hypotheses 2009; 2(4):261 -263).
Bajo condiciones de estrés oxidativo o electrofílico, Keapl libera a Nrf2, permitiendo su translocación al núcleo, en donde ejerce su función transcripcional en los genes con sitios ARE (Itoh K. et al. Genes Dev. 1999 Jan 1 ; 13(1 ):76-86). Una vez terminada la acción de Nrf2, el complejo Keap1 /Cul3 deslocaliza a la proteína Nrf2 del núcleo hacia el citoplasma, en donde ocurre su degradación proteasomal (O'Connell MA. y Hayes JD. Biochem Soc Trans. 2015; 43(4): 687-9). Sin embargo, se sabe que en las células tumorales estos mecanismos no operan de igual modo, dado que en estas células se produce una activación crónica de Nrf2 que les confiere protección ante un medio hipóxico y carente de nutrientes, y ante los efectos citotóxicos de los agentes anticancerígenos (Shibata T. et al. Proc Nati Acad Sci USA. 2008; 105(36): 13568-73, Bai X. et al. Drug Metab Rev. 2016; 20: 1 -27; Gañán-Gómez I. et al. Free Radie Biol Med. 2013; 65:750-64.), aunque se desconoce cómo es que las células tumorales mantienen altos niveles de Nrf2.
Además de Keapl , se han descrito otras proteínas reguladoras de la actividad de Nrf2, entre las cuales destaca p62 (Sequestosome-1 protein p62/SQSTM), una proteína citoplásmica multifuncional, que actúa como andamio para dirigir otras proteínas y organelos hacia la vía autofágica (Jaramillo C. Y Zhang D. Genes and dev. 2013; 27: 2179-2191 ).
La proteína p62 interactúa directamente con Keapl , de manera que interfiere con la formación del complejo Keap1-Nrf2 (Copple IM. et al. J Biol Chem. 2010; 285(22): 16782-8), pero, además cuenta con un sitio ARE en su promotor (Jain A. et al. J Biol Chem. 2010; 285(29):22576-91 ), de tal forma que su expresión se induce por el estrés oxidativo de manera dependiente de Nrf2, llevando a una regulación de tipo retro-alimentación, donde una mayor expresión de p62, podría significar la mayor actividad nuclear de Nrf2.
Se ha demostrado que hay una correlación positiva entre los altos niveles de Nrf2 y p62 en los tipos de cáncer más agresivos (Thompson HG. et al. Oncogene. 2003; 22(15):2322-2333; Kitamura H. et al. Histopathology. 2006;48(2): 157-161 ; Rolland P. et al. Endocr Relat Cáncer. 2007; 14(1 ):73-80; Jain A. et al. J Biol Chem. 2010; 285(29):22576-91 ; Inami Y. et al. J Cell Biol. 201 1 ; 193(2):275-284; Inoue D. et al. Cáncer Sci. 2012; 1 03(4):760-76; Galavotti S. et al. Oncogene. 2013;32(6):699-712; Li L. et al. Cáncer Cell. 2013;24(6):738-750; Ellis RA. et al. J Invest Dermatol. 2014; 134(5): 1476-8).
Debido a que p62 es indispensable para la supervivencia y proliferación de las células tumorales, pero no para las células normales, se le considera un blanco terapéutico ideal (Gabai VL and Shifrin VI. International Reviews of immunology. 2014; 33: 375-382), por lo que el desarrollo de agentes que disminuyan la expresión de p62 y/o Nrf2 como estrategia para tratar los tipos tumorales más agresivos, es un tópico actual de gran interés (Shibata T, et al. Proc Nati Acad Sci U S A. 2008; 105(36): 13568-73; Gabai VL. y Shifrin VI. International Reviews of immunology. 2014; 33: 375-382; Kansanen E, et al. Redox Biol. 2013; 1 :45-9).
Sin embargo, el desarrollo de inhibidores específicos de la vía Nrf2 ha representado un gran reto, debido a su similitud estructural con otros miembros de la familia de proteínas tipo bZIP (Kansanen E. et al. Redox Biol. 2013; 1 :45-9) por lo que hasta la fecha hay pocos inhibidores efectivos reportados.
Se ha postulado que los antioxidantes pueden funcionar como coadyuvantes sensibilizadores a las terapias antitumorales (Santandreu FM. et al. Cell Physiol Biochem. 2008; 22 (5-6):757-68; Gagliano N. et al. Anticancer Drugs. 2010; 21 (2): 140-50), pero aún no ha sido posible su uso con estos fines. Un ejemplo de estos antioxidantes es la curcumina, que posee actividad anticancerígena y antioxidante (Rahman I. et al. Biochem Pharmacol. 2006; 72(1 1 ): 1439-52; Kumar G. et al. Life Sci. 2016; 148:313-28), capaz de provocar muerte celular apoptótica en células cancerosas in vitro, pero no en sus contrapartes normales (Hail N Jr. Free Radie Biol Med. 2008; 44(7): 1382-93), sin embargo, el potencial terapéutico de la curcumina no ha podido ser explotado, debido a su naturaleza hidrófoba, pobre biodisponibilidad e inestabilidad a la luz y al pH fisiológico (Lin JK. et al. Biofactors 2000; 13: 153-158; Sharma RA. et al. Clin Cáncer Res. 2004; 10: 6847-6854).
Se han intentado varias aproximaciones para lograr el uso terapéutico de la curcumina, empleando análogos estructurales de la curcumina y acarreadores tales como liposomas, nanopartículas, complejos fosfolipídicos, y dendrímeros. (Tiyaboonchai W. et al. Int J. Phar 2007; 337 (1 - 2); 299-306; Kumar G. et al. Life Sci. 2016; 148:31 3-28).
Por ejemplo, las patentes US8,487, 139 y US9,328,081 y las solicitudes de patente US2012/0003177 y MX/a/2015/006734, describen derivados de curcumina con solubilidad mejorada y que son útiles como agentes anticancerígenos. De igual forma Gamage y colaboradores (Gamage NH. et al. 2016. J Nanomed Nanotechnol. 2016 Aug;7(4)), Shi y colaboradores (Shi W. et al. 2007 Org Lett. Dec 20;9(26):5461 -4) y Wang y colaboradores (Wang L. et al. 2013. J Mater Sci Mater Med. Sep;24(9):2137-44) describen análogos de la curcumina útiles para el tratamiento de diferentes tipos de cáncer. La eficacia de este tipo de compuestos y estrategias está todavía por probarse en el ámbito clínico.
Una problemática actual en el tratamiento contra el cáncer es la presencia de resistencia innata o adquirida es muchos tipos de tumores, lo cual disminuye las opciones terapéuticas disponibles. Las estrategias de sensibilización de tumores resistentes a las terapias, se basan en el uso de un fármaco o agente para hacer que las células cancerígenas sean más susceptibles a un segundo fármaco. La sensibilización de tumores permite restaurar la actividad del segundo fármaco y/o disminuir su dosis lo que conlleva una menor toxicidad.
A pesar de que se han descrito diversos agentes sensibilizantes de tumores, aún existe la necesidad de nuevos compuestos o esquemas de medicación capaces de sensibilizar a las células cancerígenas multirresistentes a fin de disminuir la mortalidad de este tipo de tumores, principalmente en glioblastoma, que sigue considerándose como un tumor intratable.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invención se refiere al uso del conjugado dendrímero- curcumina Cur-[G-2]-OH de fórmula:
O OH
O !' - · - o
\..- - o o ...... . o
^ · OH
O o
H° · : : f) , OH
HO - ' O ''""^.' ..- - .
, ' ,( OH
HO
HO OH como agente sensibilizador de tumores multirresistentes (quimiorresistentes y/o radiorresistentes).
Dentro de las modalidades de la invención se incluyen el uso del Cur-[G-2]-OH para preparar un medicamento o formulación farmacéutica útil para aumentar la sensibilidad o disminuir la resistencia innata o adquirida de tumores multirresistentes y métodos o esquemas de tratamiento de pacientes con tumores multirresistentes empleando un medicamento o formulación farmacéutica que comprende al Cur-[G-2]-OH para sensibilizar o disminuir la resistencia innata o adquirida de dichos tumores y en donde el Cur-[G-2]-OH es administrado entre 1 a 72 horas previo a la administración del tratamiento convencional.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra los ensayos de detección de células apoptóticas mediante la tinción dual con yoduro de propidio (YP) y Hoechst 33342 (H) en células C6 tratadas con curcumina 100 μΜ (CUR) o Cur-[G-2]-OH 300 μΜ durante 24 y 48 horas. Se muestran imágenes en microscopía en campo claro (MCC), tinción con yoduro de propidio (YP) y Hoechst 33342 (H) por separado y la superposición de ambos colorantes (S). En las células tratadas con curcumina, se observa la totalidad de los núcleos teñidos con YP, mientras que con el tratamiento con Cur-[G-2]-OH se conserva la tinción de los núcleos similar a la de los controles sin tratar, aún a tiempos tardíos (48 horas). La tinción de los núcleos ante el tratamiento con Cur-[G-2]-OH es similar a la de los controles sin tratamiento, aún a tiempos tardíos. Amplificación 4X.
La Figura 2 muestra los ensayos de detección de células apoptóticas mediante la tinción dual con yoduro de propidio (YP) y Hoechst 33342 (H) en células C6 tratadas con curcumina 100 μΜ (CUR) o Cur-[G-2]-OH 300 μΜ a una amplificación de 20X. Las células tratadas con curcumina muestran condensación de la cromatina (estrellas), fragmentación nuclear (flechas delgadas) y cuerpos apoptóticos (cabezas de flecha), lo que sugiere inducción de apoptosis. Las células tratadas con Cur-[G-2]-OH presentan núcleos con cromatina relajada y sin tinción con YP (flechas gruesas).
La Figura 3 muestra los estudios de fragmentación del ADN en células C6 tratadas con curcumina 100μΜ (CUR) o Cur-[G2]-OH 300μΜ durante 24h y células control (CON). La fragmentación del ADN solo fue evidente en las células tratadas con curcumina, mientras que en las células tratadas con Cur-[G-2]-OH el ADN se mantiene empaquetado y no migra en el gei.
La Figura 4 muestra la expresión de los marcadores de autofagia p62 y Beclinl , empleando 40 g de proteínas totales provenientes de células C6 tratadas con Cur-[G2]-OH durante 24h y de células C6 sin tratamiento. Como control de carga se empleó un anticuerpo anti- -actina. Se observa la disminución en la expresión de p62 y el aumento de Beclinl en las células tratadas con Cur-[G2]-OH respecto de las células sin tratamiento (Aumento 20X).
La Figura 5 muestra unas micrografías (20X) representativas de la expresión de los marcadores de autofagia p62, Beclinl y LC3 en células C6 tratadas durante 24h con diferentes concentraciones de Cur-[G2]-OH. El tratamiento con Cur-[G2]-OH induce el aumento en la expresión y acumulación perinuclear de Beclinl . LC3 se detecta en gránulos nucleares, y a medida que aumenta la concentración de Cur-[G2]-OH se detecta en el citoplasma con el patrón característico de punteado. El tratamiento con Cur-[G2]-OH disminuye la expresión de p62, particularmente en el núcleo y a mayores concentraciones de Cur-[G2]-OH se detecta p62 en agregados citoplásmicos que forman los autofagosomas.
La Figura 6 muestra los resultados de los estudios de expresión de Nrf2 y Keap 1 y la co-localización de Nrf2-p62, Keap1 -p62 y Keap1 -Nrf2 en células C6 tratadas con diferentes concentraciones de Cur-[G2]-OH durante 24h y de células C6 sin tratamiento. Se observa la presencia de altos niveles básales de p62, Nrf2 y Keapl en las células C6 sin tratamiento, principalmente en el núcleo. El tratamiento con Cur-[G2]-OH induce la pérdida de expresión de Nrf2 en el citoplasma, su atenuación en el núcleo; mientras que la expresión de Keapl se mantiene, tanto en el núcleo como en el citoplasma. La expresión de p62 disminuye en el núcleo y se observa una interacción de Keapl con Nrf2 en este compartimento subcelular, de manera dependiente de la concentración. También se observa la interacción de p62 con Keapl en el citoplasma y en los autofagosomas.
La Figura 7 muestra los niveles de fosforilación, mediante la técnica de Inmunoblot, del factor de transcripción elF2-a en células tratadas con diferentes concentraciones de curcumina (CUR) y diferentes concentraciones de Cur-[G2]-OH durante 24h, así como los niveles de Nrf2, en células tratadas con Cur-[G2]-OH 300 μΜ. Se observa una disminución significativa de la fosforilación de elF2-a en las células tratadas con Cur-[G2]-OH, sin cambios sustanciales en los niveles de elF2-a total, mientras que el tratamiento con curcumina incrementa tanto los niveles de elF2-a total como los niveles de p- elF2a. El tratamiento con Cur-[G2]-OH provoca una disminución substancial de los niveles de la proteína Nrf2 respecto de las células sin tratamiento.
La Figura 8 muestra los niveles de Especies Reactivas de Oxígeno (EROs) en células C6 tratadas con curcumina (CUR) y con Cur-[G2]-OH en presencia y ausencia de N-acetil Cisteína (NAC) durante una hora. Se observa que el Cur-[G2]-OH promueve la generación de EROs de manera dependiente de la concentración, aún en presencia de N-acetil Cisteína (NAC), un inhibidor específico de EROs. El tratamiento con curcumina produce menor cantidad de EROs y su efecto se amplifica con el uso de NAC. Como control positivo se utilizó un inductor de especies reactivas (Piocianina).
La Figura 9 muestra el efecto del tratamiento con Cur-[G2]-OH sobre las concentraciones de glutatión (GSH) en células C6. Las células fueron tratadas durante 24 horas con diferentes concentraciones de Cur-[G2]-OH y se midieron las concentraciones de GSH mediante el método colorimétrico GT10 (Oxford Biomedical Research®). Se graficaron los promedios de 3 experimentos (n=3) ± desviación estándar.
La Figura 10 muestra los ensayos de sensibilización de células C6 de glioblastoma, multirresistentes al estrés oxidativo, mediante el tratamiento con Cur-[G2]-OH. Las células se incubaron con diferentes concentraciones de FeS04, Cur-[G-2]-OH y combinaciones de ambos. En una modalidad, las células se pre-incubaron con el FeS04 durante 2 horas, y posteriormente se realizó el tratamiento con el Cur-[G2]-OH, incubando por 22 horas más (FeS04 + Cur-[G2]-OH). En una segunda modalidad, se adicionó primero el Cur-[G2]- OH, incubando durante 4 horas, y posteriormente se realizó el tratamiento con el FeSO, por 20 horas más (Cur-[G2]-OH + FeS04). Se presenta el porcentaje de viabilidad celular respecto del tratamiento de las células C6 con FeS04, Cur- [G2J-OH y la combinación de ambos ya sea pre-incubando con FeS04 y adicionando posteriormente el Cur-[G2]-OH o viceversa. Se observa un sinergismo entre el Cur-[G-2]-OH y el FeSO, cuando las células se pre-incuban con Cur-[G-2]-OH y después se adiciona FeS04. *p<0.05, **p<0.01 , ***p<0.001 .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Dentro del estado de la técnica se describen las propiedades y ventajas del uso de la curcumina como agente anticancerígeno, sin embargo, se sabe que su biodisponibilidad y estabilidad en condiciones fisiológicas no son adecuadas para un uso terapéutico. Debido a esto se han ideado, por un lado, diversas formas de administración o liberación que permitan que la curcumina pueda tener un efecto fisiológico adecuado y por otro lado, se han desarrollado diversos derivados de la curcumina con el objetivo de mejorar su solubilidad, estabilidad en condiciones fisiológicas y biodisponibilidad, pero manteniendo sus propiedades anticancerígenas y su especificidad sobre células tumorales.
El Cur-[G-2]-OH es un derivado de la curcumina que presenta características mejoradas de solubilidad, estabilidad y biodisponibilidad respecto de la curcumina, pero que mantiene un efecto antioxidante y anticancerígeno tan bueno o mejor que el de la curcumina.
Actualmente la quimioterapia sigue siendo la columna vertebral del tratamiento para muchos tipos de cáncer, desafortunadamente, hay distintos tipos de tumores que presentan una resistencia innata o adquirida a estos tratamientos dejando prácticamente sin opciones terapéuticas a los pacientes que la presentan, lo que eventualmente provoca su muerte ante la incapacidad de detener el crecimiento tumoral, por lo que sigue siendo altamente deseable contar con nuevos medicamentos útiles para sensibilizar o disminuir la resistencia innata o adquirida de tumores resistentes a las terapias convencionales, a fin de mejorar la respuesta a este tipo de tratamientos y disminuir la mortalidad asociada a los tumores multirresistentes.
La presente invención se refiere a un segundo uso del compuesto Cur-[G-2]-OH, como un agente que permite aumentar la sensibilidad o disminuir la resistencia innata o adquirida de los tumores multirresistentes. De manera inesperada se ha observado que, independientemente del efecto anticancerígeno que pueda presentar el Cur-[G-2]-OH, este compuesto tiene la facultad de sensibilizar o disminuir la resistencia innata o adquirida de las células tumorales multirresistentes, es decir, mejora la respuesta al tratamiento con los agentes quimioterapéuticos y/o radioterapéuticos convencionales, a los cuales eran resistentes inicialmente estas células, mejorando así su efectividad.
También de manera inesperada, se ha observado que este efecto sensibilizador o de disminución de la resistencia innata o adquirida del Cur-[G- 2]-OH sobre las células cancerígenas multirresistentes, solo se produce si este compuesto es administrado previo a la administración de la terapia antitumoral, lo cual se debe a que su efecto consiste en el abatimiento de la respuesta antioxidante en dichas células tumorales multirresistentes a través de la inhibición de la vía Nrf2.
La presente invención supera las deficiencias del estado de la técnica al proporcionar un nuevo uso del derivado de curcumina Cur-[G-2]-OH, como agente sensibilizador, a través de la disminución a la resistencia innata o adquirida, de tumores multirresistentes, incluyendo el glioblastoma, así como nuevos esquemas de tratamiento de tumores multirresistentes mediante la administración del Cur-[G-2]-OH o formulaciones farmacéuticas que lo comprenden, entre 1 a 72 horas antes de la administración de la terapia convencional.
La presente invención se basa en el hecho inesperado de que el Cur-[G-2]-OH, administrado de 1 a 72 horas antes de la terapia convencional, es capaz de inhibir la vía Nrf2, de abatir la producción de GSH y de promover la autofagia en células cancerosas multirresistentes, lo cual elimina la resistencia innata o adquirida de este tipo de tumores, provocando que sean sensibles al tratamiento convencional.
Anteriormente se había descrito la actividad antitumoral directa del Cur-[G-2]-OH, pero los inventores de la presente invención han desarrollado un nuevo uso de este compuesto como agente sensibilizador, el cual permite disminuir la resistencia innata o adquirida de tumores multirresistentes a las terapias convencionales.
Como se usa en la descripción de la presente solicitud, el término "tumor multirresistente" se refiere a un tumor maligno y agresivo, que no responde a los tratamientos anticancerosos convencionales, tales como agentes quimioterapéuticos o la radiación ionizante.
Como se usa en la descripción de la presente solicitud, los términos "sensibilizador" y "agente sensibilizador" se refieren a un compuesto, formulación o medicamento que tiene la capacidad de hacer que las células tumorales multirresistentes sean más sensibles a los agentes quimio y/o radioterapéuticos, o de disminuir la resistencia de dichas células tumorales a dichos agentes. Un "agente sensibilizador" tiene la capacidad de mejorar la eficacia del tratamiento convencional en tumores que son resistentes a este tipo de tratamientos y por lo tanto pueden emplearse como terapia coadyuvante en el tratamiento de tumores multirresistentes.
El término "sensibilizar", como se usa en la presente descripción, se refiere a aumentar la sensibilidad o disminuir la resistencia de un tumor multirresistente a los agentes quimioterapéuticos y/o radioterapéuticos convencionales. Términos tales como sensibilidad y sensibilización son términos asociados que se refieren al efecto que producen estos agentes sensibilizadores sobre los tumores multirresistentes, mejorando su respuesta ante el tratamiento con agentes quimio y/o radioterapéuticos.
Como se usa en la descripción de la presente solicitud, el término "terapia convencional" se refiere al uso, con la intención de reducir o eliminar los tumores, de ciertos compuestos químicos tóxicos, los cuales se pueden clasificar como taxanos, camptotecinas, agentes basados en platino, nitrosoureas, antraciclinas y epipodofilotoxinas, empleados solos o en combinación de dos o más de ellos, y/o a las radiaciones ionizantes. Como podrá reconocer un experto en el campo técnico objeto de la presente invención, los términos "agente antitumoral" o "agente anticancerígeno" son términos similares que pudieran describir una terapia convencional contra el cáncer, por lo que estos términos se emplean de manera indistinta dentro de la presente solicitud. Como podrá reconocer un experto en el campo técnico objeto de la presente invención, el término "glioblastoma" se refiere al tumor más común y mortal entre los tumores del Sistema Nervioso Central, de rápido crecimiento, compuesto de una mezcla heterogénea de células tumorales astrocitarias pobremente diferenciadas, con pleomorfismo, necrosis, proliferación vascular y frecuente mitosis.
Como podrá reconocer un experto en el campo técnico objeto de la presente invención, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un compuesto activo que es necesaria para obtener el efecto terapéutico deseado. En este caso en particular se refiere a una cantidad suficiente del Cur-[G-2]-OH que es capaz de mejorar la sensibilidad de las células tumorales a la terapia convencional.
Para el desarrollo de la presente invención el primer paso fue dilucidar el mecanismo de acción del Cur-[G2]-OH, para lo cual se realizó la determinación de muerte apoptótica por tinción dual con yoduro de propidio y Hoechst (Zanotto-Filho A. et al. J Nutr Biochem. 2012 Jun;23(6):591 -601 ) sobre células C6 de glioma de rata (ATCC® CCL-107™) tratadas con curcumina y con Cur-[G2]-OH. Las células C6 tratadas con Cur-[G2]-OH rápidamente adquirieron una morfología microscópica distinta a las células tratadas con curcumina, desde las primeras horas post-tratamiento, cuando aún no hay muerte celular, y hasta tiempos tardíos de exposición (Figura 1 ).
Las células tratadas con curcumina presentaron condensación de la cromatina (estrellas), fragmentación nuclear (flechas delgadas) y cuerpos apoptóticos (cabezas de flecha) (Figura 2), coincidiendo con múltiples reportes que muestran que la apoptosis es el principal tipo de muerte celular promovido por la curcumina. Por su parte las células tratadas con Cur-[G-2]-OH conservan una tinción de los núcleos similar a la de los controles sin tratamiento, con abundancia de núcleos con cromatina relajada y sin tinción con el yoduro de propidio (flechas gruesas) (Figura 2).
Asimismo, se realizó un estudio de fragmentación de ADN nuclear mediante electroforesis, observándose que la fragmentación del ADN solo se presenta en las células tratadas con curcumina (Figura 3), mientras que en las células tratadas con Cur-[G-2]-OH, el ADN se mantiene empaquetado y no migra en el gel. Estos resultados indican que el Cur-[G2]-OH tiene un mecanismo de acción diferente de la apoptosis.
Una vez descartada la apoptosis como mecanismo de acción, se exploró la posibilidad de la autofagia como mecanismo de acción del Cur-[G2]- OH. Para esto se analizó la expresión de marcadores de autofagia en células C6 tratadas con Cur-[G2]-OH.
El tratamiento con Cur-[G2]-OH induce rápidamente el aumento en la expresión de las proteínas Beclinl (Figura 4) y LC3, lo que ocurre en función del tiempo y de la concentración de Cur-[G2]-OH (Figura 5). El Cur-[G2]-OH promueve la acumulación perinuclear de Beclinl . Asimismo, a bajas concentraciones y en tiempos tempranos, se observa que LC3 se detecta fuertemente en gránulos nucleares, mientras que a medida que se incrementa la concentración y/o el tiempo, también es detectado en el citoplasma con el patrón característico de punteado.
Por el contrario, la proteína p62, es fuertemente expresada en las células C6 (Figura 4), con una distribución núcleo-citoplásmica (Figura 5). Sin embargo, el tratamiento de estas células con Cur-[G2]-OH disminuye significativamente la expresión de p62, particularmente en el núcleo, aún con muy bajas concentraciones (Figuras 4 y 5). Con la mayor concentración y en tiempos tardíos (a partir de 24 horas), se detecta p62 en los agregados citoplásmicos que forman los autofagosomas.
Estos resultados demuestran que el Cur-[G2]-OH induce la muerte celular por autofagia, a diferencia de la curcumina que induce apoptosis.
p62 es una proteína que participa en múltiples vías de señalización, y en particular, en la regulación de la vía de señalización de Nrf2 la cual ha sido implicada en los mecanismos de resistencia de los tumores a las terapias convencionales. Para determinar el efecto del Cur-[G2]-OH sobre p62 y la vía Nrf2 se realizaron estudios de expresión de Nrf2 y Keap 1 y colocalizaciones de Nrf2-p62, Keap1 -p62 y Keap1 -Nrf2 en células C6 con y sin la administración de Cur-[G2]-OH.
Los resultados de estos experimentos demostraron la presencia de altos niveles básales de p62, Nrf2 y Keap en las células C6 sin tratamiento, localizándose todas, tanto en el núcleo como en el citoplasma. El tratamiento con Cur-[G2]-OH induce rápidamente la disminución de la expresión de Nrf2 tanto en el citoplasma, como en el núcleo, aún a bajas concentraciones; a diferencia de Keapl que, aunque su expresión se atenúa, se sigue detectando niveles significativos, tanto en el núcleo como en el citoplasma, siendo mayor su expresión en este último (Figura 6).
Los estudios de colocalización mostraron, que es necesaria la exclusión de p62 del núcleo, para que ocurra la interacción de Keapl con Nrf2 en este compartimento subcelular y que el tratamiento con Cur-[G2]-OH promueve este mecanismo, de manera dependiente de la concentración (Figura 6). Simultáneamente, Cur-[G2]-OH también promueve la interacción de p62 con Keapl en el citoplasma y en los autofagosomas (Figura 6).
El tratamiento con Cur-[G2]-OH produce rápidamente la disminución de la expresión de Nrf2 en el citoplasma (Figura 6), lo cual no parece deberse a un aumento en la degradación en el citosol de Nrf2, puesto que Keapl es secuestrado por p62, por lo que una opción era que Cur-[G2]-OH interfiere también con la síntesis de novo de Nrf2.
Para probar esta hipótesis se analizaron los niveles de fosforilación del factor de transcripción elF2-a, debido a que la síntesis de Nrf2 en respuesta a los diversos tipos de estrés ambiental está mediada por el eje p- elF2a/ATF4/Nrf2, dependiente del estrés del retículo endoplásmico (Harding HP. et al. 2003. Mol Cell. 1 1 :619-633; Zheng Q. et al. 2014. Tumor Biol. 33:6255-6264; Cullinan y Diehl. 2006. Int J Biochem Cell Biol. Mar;38(3):317- 32).
La Figura 7, muestra una disminución significativa de la fosforilación de el F2-a ante el tratamiento con Cur-[G2]-OH, sin que ocurran cambios sustanciales en los niveles de elF2-a total, lo que coincide con una disminución importante de los niveles totales de la proteína Nrf2, confirmando el efecto de este compuesto sobre la vía Nrf2. Por el contrario, la curcumina incrementa los tanto los niveles de el F2-a total, como los niveles de p-el F2c¡, lo que sugiere la coexistencia de dos mecanismos que se contraponen: por un lado, la inducción de apoptosis, y por el otro, la síntesis de Nrf2.
Para confirmar que el tratamiento con Cur-[G2]-OH abate la respuesta antioxidante se realizaron mediciones de los niveles de las Especies Reactivas de Oxígeno (EROs) en células C6 incubadas con curcumina y con Cur-[G2]-OH. Como se observa en la Figura 8, en tan solo una hora el Cur- [G2]-OH promueve la generación de EROs de manera dependiente de la concentración, efecto que se atenúa ligeramente pero no se inhibe con el uso de un antioxidante como la N-acetil Cisteína (NAC), corroborando la falta de respuesta por parte de la vía Nrf2. En comparación, la curcumina fue mucho menos eficaz para producir EROs y su efecto se amplifica ligeramente con el uso de NAC, demostrando que el mecanismo de acción de la curcumina difiere del mecanismo de acción del Cur-[G2]-OH.
Diversos estudios han demostrado que la exposición crónica de las células tumorales a los diferentes agentes quimioterapéuticos y a las radiaciones ionizantes, provoca una selección de poblaciones resistentes a dichos agentes, y un mecanismo importante para este fenómeno, es la modulación de los niveles de glutatión (GSH) por parte de éstas poblaciones, observándose, por ejemplo, que la presencia del glutatión juega un papel importante en la sensibilización de neuroblastoma, cáncer de ovario, leucemia linfoblástica aguda y otros cánceres humanos (Colla R. et al. Oncotarget. 2016 Oct 25;7(43):70715-70737).
Además se sabe que muchos de los fármacos empleados en quimioterapia son activadores de la vía de señalización dependiente de Nrf2, lo que causa la sobreexpresión de los genes que contienen las secuencias ARE, incluyendo las enzimas glutatión transferasas, lo que da lugar a una elevación del glutatión (Wang X. J. et al. Free Radie Biol Med. 2014 May;70:68-77), cuyos niveles pueden ser críticos para el crecimiento extravascular de las células metastásicas y la resistencia tumoral en las células cancerosas. Dado lo anterior, se piensa que la disminución de los niveles de glutatión en las células cancerosas, puede ser una estrategia válida para sensibilizar a las células tumorales a los efectos de los agentes antitumorales, o para evitar que se presente la resistencia a los mismos (Traverso N. et al. Oxid Med Cell Longev. 2013;2013:972913).
En función de la importancia que representa el glutatión para los procesos de resistencia de los tumores a los agentes antineoplásicos, se realizaron experimentos para determinar las variaciones en la concentración del GSH en células C6 tratadas con diferentes concentraciones de Cur-[G2]- OH, con el objetivo de demostrar el efecto del tratamiento con este compuesto sobre los niveles de glutatión y, por ende, sobre la sensibilización de las células tumorales multirresistentes.
Los resultados de estos experimentos (Figura 9) muestran que el Cur-[G2]-OH modula los niveles de GSH intracelular en las células C6 de glioblastoma, de manera dependiente tanto de la dosis como del tiempo. La administración de dosis intermedias de Cur-[G2]-OH (45 y 90 μΜ) en las células C6, inducen una fuerte respuesta celular, lo que provoca que los niveles básales de GSH aumenten considerablemente, coincidiendo con reportes previos, que muestran que el mecanismo de defensa de las células tumorales ante el daño causado por agentes quimioterapéuticos o por radioterapia, está mediado por la modulación de los niveles de GSH (Traverso N. et al. Oxid Med Cell Longev. 2013;2013:972913).
Por otra parte, la administración de dosis elevadas de Cur-[G2]-OH (300 μΜ) provocó una disminución drástica (alrededor del 50%) en los niveles de GSH a las 24h, y la eliminación completa de los niveles de GSH se logra a las 48 horas a una concentración de 300 μΜ (datos no mostrados). El uso de concentraciones elevadas de Cur-[G2]-OH no es un inconveniente para su administración, dado que este compuesto no es tóxico para las células normales aún a concentraciones elevadas, lo que lo hace un medicamento selectivo para las células tumorales.
Considerando la estabilidad intracelular del Cur-[G2]-OH, este compuesto se puede administrar en varias dosis a tiempos cortos, para lograr su acumulación intracelular y con ello lograr la eliminación completa del GSH y mejorar la sensibilización de los tumores multirresistentes.
Finalmente, se realizaron experimentos para demostrar el efecto del tratamiento con Cur-[G2]-OH sobre la sensibilización de células tumorales multirresistentes, por ejemplo las células C6 de glioblastoma, las cuales son altamente resistentes a los agentes quimioterapéuticos y a la radioterapia. Para estos experimentos se empleó el FeS04 como agente inductor de estrés oxidativo, en distintos esquemas de administración con el Cur-[G2]-OH en células C6. El FeS04 simula las condiciones redox intracelulares producidas por diversos agentes quimioterapéuticos utilizados comúnmente y por las radiaciones ionizantes.
Los resultados demuestran la existencia de un sinergismo entre el Cur-[G-2]-OH y el FeS04, reforzando significativamente la citotoxicidad de ambos compuestos, de manera dosis dependiente. De manera importante, este efecto solamente se logra si las células C6 se incuban de manera previa con el Cur-[G-2]-OH, permitiendo que este abata la respuesta de la ruta Nrf2 y la generación de GSH y después se administra el FeS04. Este sinergismo no existe cuando las células se exponen primero al FeS04 y después al Cur-[G-2]- OH, ni cuando se administran de manera simultánea, lo que demuestra claramente que el pre-tratamiento de las células tumorales multirresistentes con el Cur-[G-2]-OH las sensibiliza al estrés oxidativo, mismo que puede ser generado por los agentes quimioterapéuticos o radioterapéuticos usados en las terapias convencionales (Figura 10).
Otro posible mecanismo de acción del Cur-[G-2]-OH para revertir la multirresistencia tumoral, podría ser a través de la inhibición de la expresión de la proteína Mrp1 (Multidrug-Resistance-Associated Protein 1 ), la cual es clave en el desarrollo de la tolerancia tumoral a la quimioterapia y es también dependiente de la vía Nrf2-ARE (Ji L. et al. PLoS One. 2013 May 7;8(5):e63404).
De acuerdo con la descripción realizada en la presente solicitud, la invención se refiere al uso del derivado de curcumina Cur-[G-2]-OH de fórmula:
O OH
O ·■·. . ■■ : . ..·■ , ,. ..O , o o
■ o 0 - o o o
OH
o O
HO
■O OH
HO 0";
OH
HO
HO OH para preparar un medicamento útil para aumentar la sensibilidad o disminuir la resistencia innata o adquirida a las terapias convencionales en tumores multirresistentes en humanos, principalmente glioblastoma, en donde dicho compuesto es administrado entre 1 h a 72h previo a la administración de la terapia convencional.
Para la puesta en práctica de la presente invención, se puede emplear el compuesto denominado Cur-[G-2]-OH, como se describe en Landeros JM. et al. 2017. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. Feb 1 ;71 :351 -362 y en la solicitud de patente MX20150006734, o cualquiera de sus derivados conocidos en el estado de la técnica. Los documentos antes citados describen además los métodos de obtención o síntesis del Cur-[G-2]-OH.
El Cur-[G-2]-OH puede combinarse con excipientes farmacéuticamente aceptables y opcionalmente con matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, por ejemplo, para formar composiciones terapéuticas mediante técnicas estándar conocidas en el campo de la técnica.
Para preparar las composiciones o formulaciones farmacéuticas del Cur-[G-2]-OH se pueden emplear sus sales farmacéuticamente aceptables, las cuales pueden prepararse mediante cualquier metodología convencional conocida en el estado de la técnica.
En una modalidad de la invención, el cáncer multirresistente se refiere a cualquier tipo de cáncer resistente a los tratamientos convencionales, especialmente aquellos caracterizados por la sobreexpresión de la vía Nrf2, entre los que se incluyen sin limitar: tumores de seno, ovario, próstata, pulmón, esófago, colorectales, de cabeza y cuello, así como el melanoma metastásico, el carcinoma hepatocelular y el glioblastoma multiforme.
En una modalidad preferida de la presente invención el Cur-[G-2]- OH se usa para sensibilizar glioblastoma multiforme.
En otra modalidad preferida de la invención, el Cur-[G-2]-OH se usa para sensibilizar melanoma metastásico.
Para que el efecto sensibilizador del Cur-[G-2]-OH sea efectivo, este compuesto debe administrarse previo a la administración de la terapia convencional. En una modalidad de la invención, el Cur-[G-2]-OH se administra entre 1 a 72 horas antes de la terapia convencional.
En una modalidad preferida de la invención, el Cur-[G-2]-OH se administra de 24 a 48 horas antes de la terapia convencional.
En una modalidad de la invención, el Cur-[G-2]-OH se administra entre 1 a 72 horas antes de la terapia convencional y su concentración se mantiene constante mediante la administración de varias dosis a tiempos cortos, como por ejemplo dosis cada 2h, 4h, 6h, 8h o 12h.
En otra modalidad de la invención, el Cur-[G-2]-OH se administra entre 1 a 72 horas antes de la terapia convencional y la concentración del Cur- [G-2J-OH se mantiene constante mediante la administración de dosis sostenidas a tiempos cortos, pero se continúa su administración durante uno o varios ciclos de la quimioterapia y/o radioterapia.
Para la aplicación de la presente invención puede emplearse cualquier terapia antitumoral después de la administración del Cur-[G-2]-OH. De manera particular terapia antitumoral se refiere a cualquier tipo de terapia contra el cáncer basada en la inducción de estrés oxidativo, principalmente aquellas dependientes de la vía Nrf2. Dentro de los compuestos antitumorales que pueden administrarse después de la sensibilización con el Cur-[G-2]-OH se incluyen sin limitar, placlitaxel, doxorubicina, ciclosporina A, daunorubicina, adriamicina, gemcítabina, etoposido y temozolamida, en los cuales se ha demostrado que la resistencia asociada se debe a la sobreexpresión de la proteína P-gp, la cual es mediada por la expresión de la proteína MRP-1 dependiente de la vía Nrf2, además de que se ha observado que los curcuminoides bloquean la sobreexpresión de P-gp (Xu D. et al. Mol Med Rep. 2013 Jan;7(1 ): 1 15-21 ). Otro grupo de compuestos que pueden emplearse son aquellos en los que se ha descrito que inducen una sobreexpresión de Nrf2 entre los que se encuentran sin limitar verapamilo, 5-flouracil, gemcítabina, doxorubicina, ciclofosfamida, ácido valpróico, temozolamida, antraciclinas, epirubicina, tamoxifén, radioterapia, y compuestos derivados del platino, tales como el cisplatino y oxaliplatino (Kang K. A. y Hyun J. W. Toxicol Res. 2017 Jan;33(1 ): 1 -5).
En una modalidad preferida de la invención el compuesto antitumoral que se administra tras la sensibilización con el Cur-[G-2]-OH es temozolamida.
En una modalidad preferida de la invención la terapia convencional antitumoral que se administra tras la sensibilización con el Cur-[G-2]-OH es radioterapia y temozolamida.
En otra modalidad preferida de la invención el compuesto antitumoral que se administra tras la sensibilización con el Cur-[G-2]-OH es un compuesto derivado del platino.
En una modalidad preferida de la invención el tumor multirresistente es glioblastoma multiforme y la terapia convencional que se administra después de la sensibilización con el Cur-[G-2]-OH es radioterapia y temozolamida.
La dosis terapéuticamente eficaz de un compuesto, específica para cualquier paciente, dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y su gravedad; la formulación farmacéutica empleada; la edad, peso corporal, estado de salud, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, la vía de administración y la velocidad de excreción del compuesto; la duración del tratamiento; los fármacos que se empleen en combinación; y otros factores similares bien conocidos en las ciencia médica, por lo que un experto en la materia podrá establecer en su momento la dosis adecuada para sensibilizar a un paciente con un tumor multirresistente empleando el Cur-[G-2]-OH.
En una modalidad de la invención, el Cur-[G-2]-OH se administra a dosis entre 5 y 500 mg/kg/día.
En una modalidad preferida de la invención, el Cur-[G-2]-OH se administra a dosis entre 5 y 50 mg/kg/día.
En otra modalidad preferida de la invención el Cur-[G-2]-OH se administra a dosis entre 20 y 25 mg/kg/día.
El Cur-[G-2]-OH puede adaptarse para crear formulaciones adecuadas para administración por vía oral, rectal, nasal, inhalatoria (McCIure. R. et al. J Alzheimers Dis. 2015;44(1 ):283-95), tópica (incluyendo dérmica, transdérmica, bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraocular, intratraqueal y epidural) de acuerdo a los métodos conocidos en el estado de la técnica. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante técnicas farmacéuticas convencionales conocidas en el estado de la técnica. Tales técnicas incluyen la etapa de poner en asociación el ingrediente activo y un vehículo o excipiente farmacéutico.
Para el caso de formulaciones de administración intranasal, se pueden desarrollar formulaciones en forma de gotas nasales, para alcanzar concentraciones, por ejemplo entre 50 y 500 mg/kg como se describe en Madane R. G. y Mahajan H. S. Drug Deliv. 2016 May;23(4): 1326-34, o formulaciones para atomización a concentraciones de 0.5 a 2.5 mM/ml, por ejemplo, (McCIure R. et al. J Alzheimers Dis. 2015 Jan 1 ; 44(1 ): 283-295).
Las formulaciones para la aplicación por vía intranasal serán generalmente isotónicas y pueden contener excipientes para ajustar o estabilizar el pH, entre 6.4 y 6.8, un agente tensoactivo, como el Tween 80, por ejemplo y un agente viscosante, como la celulosa, goma arábiga, alginato, pectinas, polímeros vinílicos y acrílicos, entre otros.
Para el caso de formulaciones para administración intravenosa, se pueden emplear concentraciones de 1 a 20 mg/kg, por ejemplo, (Duan J. et al. Int J Pharm. 2010 Nov 15;400(1 -2):21 1 -20). Debido a que estas preparaciones están destinadas a la administración de grandes volúmenes, puede preparase como una dilución concentrada estéril, la cual previo a su administración, se diluya en el volumen final con una solución isotónica con la sangre.
Para el caso de formulaciones destinadas a la administración por vía oral se pueden emplear, por ejemplo, concentraciones de 50 a 200 mg/kg (Gal S. et al Chem Phys Lipids. 2007 Dec; 1 50(2): 186-203). Debido a la inestabilidad del Cur-[G-2]-OH en el pH ácido de los jugos gástricos, se deberá administrar en forma de cápsulas gastrorresistentes de liberación retardada, preparadas de manera que resistan el jugo gástrico y liberen el principio activo en el fluido intestinal.
Para el caso de formulaciones para administración tópica se puede emplear por ejemplo un hidrogel con concentraciones de aproximadamente 50 a 500 mg/ml (Li C. et al. Acta Biomater. 2015. Jan; 1 1 : 222-32). La formulación requerida para las preparaciones tópicas es a base de líquidos gelificados (hidrogel), cuyas bases son generalmente agua, glicerol y propilénglicol gelifícado con la ayuda de agentes gelificantes apropiados tales como almidón, derivados de la celulosa, carbómeros y silicatos de magnesio y aluminio, entre otros. En una modalidad preferida de la presente invención, la vía de administración del Cur-[G-2]-0H o sus formulaciones farmacéuticas es por vía inhalatoria.
En otra modalidad preferida de la presente invención, la vía de administración es por vía tópica.
En otra modalidad preferida de la presente invención, la vía de administración es por vía parenteral.
En otra modalidad, la invención se refiere a un método para aumentar la sensibilidad de tumores multirresistentes, el cual comprende: a) administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad terapéuticamente eficaz del Cur-[G-2]-OH, b) dejar pasar entre 1 y 72 horas después de la administración del Cur-[G-2]-OH y c) administrar un agente quimioterapéutico o radioterapéutico.
En una modalidad de la invención el tumor multirresistente se selecciona del grupo que comprende: tumores de seno, ovario, próstata, pulmón, esófago, colorectales, de cabeza y cuello, así como el melanoma metastásico, el carcinoma hepatocelular y el glioblastoma multiforme, entre otros, principalmente aquellos tumores multirresistentes asociados a la sobreexpresión de la vía Nrf2.
En una modalidad preferida de la invención el tumor multirresistente es glioblastoma multiforme.
En otra modalidad preferida de la invención el tumor multirresistente es melanoma metastásico
En una modalidad preferida de la invención el Cur-[G-2]-OH se administra entre 1 h y 72h antes del agente quimioterapéutico o radioterapéutico.
En otra modalidad preferida de la invención el Cur-[G-2]-OH se administra entre 24h y 48h antes del agente quimioterapéutico o radioterapéutico.
En una modalidad preferida de la invención el agente quimioterapéutico es temozolamida.
En una modalidad preferida de la invención el agente quimioterapéutico es radioterapia y temozolamida. En una modalidad preferida de la invención el agente quimioterapéutico es un compuesto derivado del platino.
En una modalidad preferida de la invención la vía de administración del Cur-[G-2]-OH es por vía inhalatoria
En una modalidad preferida de la invención la vía de administración del Cur-[G-2]-OH es por vía tópica
En una modalidad preferida de la invención la vía de administración del Cur-[G-2]-OH es por vía parenteral.
Esta invención se ¡lustra adicionalmente por los siguientes ejemplos, que no se consideran en ningún sentido como limitaciones impuestas sobre el alcance de las reivindicaciones. Por el contrario, estos ejemplos se presentan para una mejor comprensión de la puesta en práctica de la invención, bajo el entendido de que solo representan algunas de las modalidades de la invención.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Determinación del mecanismo de acción del Cur-[G2]-OH.
Para los experimentos se utilizaron células C6 proveniente de glioma de rata (American Tissue Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S. A. ATCC® CCL-107™) cultivadas bajo condiciones estándar en medio DMEM suplementado con Suero Fetal Bovino y 15% de suero de caballo. Debido a que el peso molecular de la curcumina (368 g/mol) es prácticamente la tercera parte del peso del Cur-[G2]-OH (1065 g/mol), y dado que la estructura química del Cur-[G2j-OH contiene un núcleo de curcumina más dos dendrones de segunda generación, los experimentos se realizaron empleando una relación equimolar (1 :3) con el objetivo de hacer comparables los resultados entre curcumina y el Cur-[G2]-OH.
Determinación de muerte apoptótica por tinción dual con yoduro de propidio y Hoechst.
Se cultivaron 1 x 04 células C6/pozo con 10Ομί de medio Dulbecco's Modified Eagle's Médium (DMEM) por 24 horas en placas de 96 pozos. Las células se trataron con curcumina (100μΜ), con Cur-[G2]-OH (300μΜ), o con I vehículo respectivo como control. Después de 24 y 48 horas post-tratamiento, las células se fijaron con una mezcla de metanol/acetona (1 : 1 ) y se tiñeron con yoduro de propidio (0.5 pg/ml), se lavaron y se adicionó el colorante Hoechst 33342 (0.1 pg/ml) para tinción de los núcleos. Las células se observaron en el lector de placas Cytation 3® (BioTek® Instruments, Inc.) usando los filtros DAPI (λ=377-447 nm) y Texas Red (λ=586-647 nm), y las imágenes se capturaron y analizaron con el programa Gen5 2.06®.
Las células tratadas con Cur-[G-2]-OH presentan una tinción de los núcleos similar a la de los controles sin tratar (Figura 1 ), con abundantes núcleos con cromatina relajada y sin tinción con yoduro de propidio (flechas gruesas) (Figura 2); mientras que las células tratadas con curcumina presentan condensación de la cromatina (estrellas), fragmentación nuclear (flechas delgadas) y cuerpos apoptóticos (cabezas de flecha) que indican un mecanismo de acción mediante apoptosis (Figura 2).
Para determinar la fragmentación del ADN las células C6 (1 x106) se sembraron en cajas Petri (100mm) a una confluencia del 70%. Se trataron con curcumina (100μΜ) o Cur-[G2]-OH (300μΜ) y se incubaron durante 24 y 48 horas. Los controles fueron incubados solamente con vehículo (DMSO o PBS respectivamente).
El ADN se extrajo utilizando Trizol (lnvitrogene1 5596-026), de acuerdo con las especificaciones del proveedor, y se cuantificó en un espectrofotómetro (Genesys 8®). Se depositaron 20pg de ADN de cada muestra en un gel de agarosa al 1.5 %. La electroforesis se realizó a 100V durante 90 minutos. El gel fue teñido con el colorante Hydragreen™ (ACTGene ACT-IDM604) y la detección del ADN se realizó empleando el filtro de bromuro de etidio y luz UV en el fotodocumentador chemidoc-it TS2 imager (UVP, CA).
La fragmentación del ADN solo fue evidente en las células tratadas con curcumina, mientras que en las células tratadas con Cur-[G-2]-OH, el ADN se mantiene empaquetado y no migra en el gel (Figura 3).
Análisis de marcadores de autofagia
Se cultivaron las células C6 en botellas de cultivo de 25cm2 (Corning® N.Y.) hasta formar una monocapa confluente de 70% (aproximadamente 4 x 10B células) y se trataron con Cur-[G2]-OH (300 μΜ) durante 24 horas. Las células se lavaron en PBS frío, y se añadió buffer de lisis (Tris-HCI 50 mM, NaCI 120 mM, IGEPAL 0.01 %) con un coctel inhibidor de proteasas (Sigma® P8340), y se centrifugaron para recuperar el sobrenadante. Las proteínas fueron cuantificadas por el método de Lowry (Lowry et al. 1951 ).
Para el análisis de las proteínas p-elF2c¡ y elF2a, los tratamientos se realizaron con curcumina (2, 15 y 30 μΜ) o Cur-[G2]-OH (6, 45 y 90 μΜ) durante 24 horas, procediendo a la lisis celular con el Buffer RI PA con inhibidor de proteasas (Sigma® P8340), NaF (5mM) y Ortovanadato de Sodio (1 mM), continuando con la misma metodología anterior. Se resolvieron 40pg de proteínas en geles SDS-PAGE al 12% y se transfirieron a membrana de polifluoruro de vinilideno (PVDF, por sus siglas en inglés) (Immobilon® Millipore). Las membranas fueron bloqueadas con leche descremada y posteriormente se incubaron con el anticuerpo primario respectivo (Beclinl , ab62557; p62, ab91526; LC3, ab1688; Nrf2, sc-30915; p-elF2a, sc-12412; elF2, sc- 1386 o β-actina, sc-47778) en agitación toda la noche a 4°C. Después de la incubación, las membranas se lavaron con un amortiguador salino de tris-base Tween 20 (TBST, por sus siglas en inglés) y se incubaron con el respectivo anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (SIGMA). Las bandas se visualizaron por quimioluminiscencia con los reactivos Western Blotting Luminol Reagent (Santacruz Biotechnology®), y el fotodocumentador ChemiDoc-lt® TS2 (Imaging System UVP, LLC).
Se observa que el tratamiento con Cur-[G-2]-OH disminuye la expresión de p62 y aumenta la expresión de Beclinl (Figura 4)
Análisis de marcadores de autofagia y de la vía Nrf2 por Inmunofluorescencia
Tinción simple: Se cultivaron 1 x10" células C6/pozo con 100pL de medio DMEM en placas de 96 pozos y se incubaron 24 horas. Las células se trataron con diferentes concentraciones de Cur-[G2]-OH (3, 6, 15, 30, 45, 90 y 150 μΜ), y se incubaron durante 6 y 24 horas. A las células control solo se les reemplazó el medio DMEM fresco. Las células se lavaron con PBS frió y se fijaron con una mezcla de metanol/acetona (1 : 1 ) durante 5 minutos; se lavaron con PBS y se incubaron con BSA al 1 % en PBST. Posteriormente, se les incubó con el anticuerpo primario (p62, Beclinl o LC3) a 4°C durante toda la noche. Se lavaron y se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con el fluorocromo (abcam® ab150073 Alexa flúor 488) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron con PBS y los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (0.1 pg/ml). Las imágenes se observaron en un lector de placas multimodal Cytation 3® y se capturaron y analizaron con el programa Gen5 2.06 empleando los filtros DAPI (λ=377-447 nm) y GFP (λ=469-525 nm).
Se observa que el tratamiento con Cur-[G2]-OH induce la expresión de Beclinl y LC3, de manera dependiente de la concentración, mientras que disminuye significativamente la expresión de p62. Asimismo, con el tratamiento con Cur-[G2]-OH se promueve la acumulación perinuclear de Beclinl y se observa que LC3 se detecta fuertemente en gránulos nucleares, mientras que a medida que se incrementa la concentración y/o el tiempo, también es detectado en el citoplasma con el patrón característico de punteado, mientras que p62 se detecta en agregados citoplásmicos que forman los autofagosomas (Figura 5).
Inmunofluorescencia secuencial: Para los estudios de colocalizaciones de Keap1 -p62, Nrf2-p62 y Keap1 -Nrf2, se cultivaron 5x103 células C6/pozo con en placas de 96 pozos de mitad de área y se incubaron 24 horas. Las células se fijaron con paraformaldehído o con metanol/acetona. Posteriormente las células se trataron con Cur-[G2]-OH (6, 45 o 90 μΜ) y se incubaron durante 24 horas. A las células control solo se les reemplazó el medio DMEM por medio fresco. Posteriormente, se lavaron con PBS frió y se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS, se lavaron y se permeabilizaron 1 0 minutos con PBST (este paso no se realizó en las células fijadas con metanol/acetona). Se lavaron nuevamente y se bloquearon en BSA al 1 % en PBST.
Las células se incubaron en el primer anticuerpo primario (Keapl o Nrf2) a 4°C toda la noche, y posteriormente se lavaron y se re-incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con el fluorocromo (Alexa flúor 488 abcam® ab150129), en la oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron y de nuevo se bloquearon 30 minutos con suero de cabra; se retiró el suero y se colocó la solución del segundo anticuerpo primario respectivo (p62 o Nrf2). Se incubó a 4°C toda la noche. Para la incubación de los anticuerpos secundarios se procedió de la misma manera descrita, pero utilizando el anticuerpo Alexa flúor 647 de abcam® (ab150079). Los núcleos se tiñeron con solución de Hoechst 33342 (0.1 pg/ml) y las imágenes fueron capturadas en un lector de placas multimodal Cytation 3® (Bio Tek®, Instruments Inc.), con el programa Gen5 2.06 empleando los filtros DAPI (λ=377-447 nm), GFP (λ=469- 525 nm) y Texas Red (λ=586-647 nm).
Se observa la presencia de altos niveles básales de p62, Nrf2 y Keapl en las células C6 sin tratamiento, principalmente en el núcleo. El tratamiento con Cur-[G2]-OH induce rápidamente la pérdida de la expresión de Nrf2 en el citoplasma y la atenuación de la señal en el núcleo; a diferencia de Keapl que se sigue detectando niveles significativos, tanto en el núcleo como en el citoplasma, siendo mayor su expresión en este último. Asimismo, se observa que el tratamiento con Cur-[G2]-OH promueve la exclusión de p62 del núcleo y su interacción con Keapl en el citoplasma y en los autofagosomas (Figura 6).
Determinación de Especies Reactivas de Oxígeno (EROs) La generación intracelular de EROs se evaluó en tiempo real, mediante microscopía de fluorescencia usando el kit de detección ENZ-5101 1 (Enzo® Life Sciences). Se cultivaron 5 x103 células por pozo en placas de 96 pozos de mitad de área (Costar 3595*) y se incubaron por 24h. Posteriormente se incubaron durante 1 hora, con curcumina (2, 15, 30 o 100 μ ), o Cur-[G2]- OH (6, 45, 90 o 300 μΜ) solos o en presencia del inhibidor (N-Acetil Cisteína, 400 μΜ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como controles se emplearon piocianina (200 μΜ) como inductor, N-Acetil Cisteína (NAC, 400 μΜ) como inhibidor, o medio DMEM con o sin DMSO como control negativo. Al término del tratamiento, se retiraron las soluciones de prueba, y se adicionó la solución de detección de EROs. Las placas fueron observadas bajo microscopía de campo claro y de fluorescencia con el filtro GFP (λ=469-525 nm), en el lector multimodal Cytation 3® (BioTek®, USA), y las imágenes se capturaron y analizaron con el programa Gen5 2.06 (BioTek®, USA). Los experimentos se realizaron cinco veces.
Se observa que el tratamiento con Cur-[G2]-OH promueve la generación de EROs de manera dependiente de la concentración, y no se modifica sustancialmente con el uso de un inhibidor antioxidante (NAC), corroborando la falta de respuesta de la vía Nrf2. El tratamiento con curcumina fue menos eficaz para producir EROs, y su efecto se amplifica ligeramente con el uso de NAC, sugiriendo un mecanismo de acción difiere al del Cur-[G2]-OH (Figura 8).
Efecto del Cur-[G2]-OH sobre la concentración del glutatión.
Las concentraciones de glutatión reducido (GSH) se midieron mediante un ensayo colorimétrico usando el kit GT10 (Oxford Biomedical Research®), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se sembraron 5x105 células C6 en cajas Petri de 50 mm (Corning ®) hasta una confluencia del 70%, se trataron con Cur-[G2]-OH a concentraciones de 6, 45, 90 y 300 μΜ y se incubaron durante 24 horas. Los controles se incubaron con medio DMEM solamente. La absorbancia de las muestras se leyó a 400 nm en el lector de placas multimodal Cytation3® (BioTeck, USA). Se observa que a bajas concentraciones de Cur-[G2]-OH se induce una síntesis de GSH en las células C6, pero a concentraciones elevadas se inhibe la síntesis de GSH disminuyendo su concentración en las células.
EJEMPLO 2
Sensibilización de células tumorales al estrés oxidativo.
Se sembraron células C6 (1 x105 células/pozo) en placas de 96 pozos. A las 24h, un grupo de células se trataron con FeS04 a concentraciones de 50, 80, 100 y 150 μΜ o con Cur-[G2]-OH a concentraciones de 240 y 300 μΜ y se incubaron durante 24h adicionales.
Otro grupo de células se incubó previamente por 2h con el agente oxidante FeS04 a concentraciones de 50, 80, 100 y 150 μΜ y posteriormente se lavaron para adicionar el Cur-[G2]-OH a concentraciones de 240 y 300 μΜ, continuando la incubación hasta completar 24h. Un último grupo de células, se trató primero con el Cur-[G2]-OH a concentraciones de 240 y 300 μ durante 4h y posteriormente se les cambió el medio y se adicionó el FeS04 a concentraciones de 50, 80, 100 y 150 μΜ continuando la incubación por 20h más.
Para determinar la viabilidad celular se empleó una prueba colorimétrica basada en la reducción del MTT (3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5- difeniltetrazolio bromuro) (Terry L. et al. Cell Viability Assays. May 1 , 2013). Los cristales de formazán se disolvieron con una mezcla de ¡sopropanol/ácido acético y las lecturas de absorbancia se realizaron a 540nm en un lector de microplacas (Molecular Devices Emax, Sunnyvale, CA, USA).
Los datos fueron analizados estad ísticamente mediante un análisis ANOVA de una vía, y post-análisis de Newman Keuls para comparaciones múltiples (n=3, Media ± SEM).
Se observa que existe un sinergismo entre el Cur-[G-2]-OH y el FeSC, reforzando significativamente la citotoxicidad de ambos compuestos de manera dosis dependiente, en comparación a su uso por separado, pero este efecto solo se produce cuando se pre-incuban las células con el Cur-[G-2]-OH y después se someten al tratamiento con FeS04 (Figura 10).

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES
1 .- El uso del compuesto Cur-[G-2]-OH de fórmula:
O OH
n O
O o
- O ' O - O o .
o Ό ·" ' . .-·■
- ·- - Q ■·■-'; OH
O
OH
HO _i, O
OH
HO
HO OH para preparar un medicamento útil para sensibilizar tumores multirresistentes en humanos, en donde dicho medicamento, se administra de manera previa a la administración de una terapia anticancerígena.
2. - El uso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el tumor multirresistente es un tumor caracterizado por la sobreexpresión de la vía Nrf2.
3. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado además porque el tumor multirresistente se selecciona del grupo que comprende tumores de seno, ovario, próstata, pulmón, cabeza y cuello, esófago, colorectales, melanoma metastásico, carcinoma hepatocelular y glioblastoma multiforme.
4. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado además porque el tumor multirresistente es glioblastoma multiforme.
5. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado además porque el tumor multirresistente es melanoma metastásico.
6. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque la terapia anticancerígena es una terapia basada en la inducción de estrés oxidativo.
7. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque la terapia anticancerígena se selecciona de radioterapia, quimioterapia o la combinación de ambas.
8. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
7, caracterizado además porque la terapia anticancerígena se selecciona del grupo que comprende radioterapia, placlitaxel, doxorubicina, ciclosporina A, daunorubicina, adriamicina, gemcitabina, etoposido y temozolamida, verapamilo, 5-flouracil, ciclofosfamida, ácido valpróico, antraciclinas, epirubicina y tamoxifén y cualquiera de sus combinaciones.
9. - El uso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la terapia anticancerígena es radioterapia.
10. - El uso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la terapia anticancerígena es radioterapia combinada con temozolamida.
1 1 . - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado además porque dicho medicamento se administra entre 1 y 72 horas antes de la terapia anticancerígena.
12. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , caracterizado además porque dicho medicamento se administra entre 24 y 48 horas antes de la terapia antícancerígena.
13. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado además porque dicho medicamento se administra a dosis sostenidas a tiempos cortos para lograr una acumulación intracelular.
14. - El uso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho el medicamento se administra cada 2h, 4h, 6h, 8h o 12h.
15. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado además porque dicho medicamento se administra entre 1 y 72 horas antes de la terapia anticancerígena, pero se continúa su administración durante uno o varios ciclos de la terapia convencional.
16. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado además porque el medicamento está formulado para administrarse por vía tópica, oral, nasal, parenteral, intraocular, intravenosa, intramuscular o subcutánea.
17. - El uso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el medicamento está formulado para administrarse por vía nasal o inhalatoria.
1 8. - El uso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el medicamento está formulado para administrarse por vía tópica.
1 9. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado además porque el Cur-[G-2]-OH se administra a dosis entre 5 y 50 mg/kg/d ía.
20. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado además porque el Cur-[G-2]-OH se administra a dosis entre 20 y 25 mg/kg/día.
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