WO2018179078A1 - 光分析装置、光分析方法、およびプログラム - Google Patents

Abstract

光分析装置は、光源と、ビーム整形部と、相対移動部と、光検出部と、位置検出部とを含む。光源部は光ビームを発生する。ビーム整形部は扁平ビーム部を形成する。相対移動部は被検試料および扁平ビーム部の少なくとも一方を移動することにより、被検試料と扁平ビーム部とを扁平ビーム部の短軸方向に相対移動させる。光検出部は、発光光の光強度と、短軸方向に直交する平面における発光光の発光位置と、を検出する。位置検出部は扁平ビーム部の相対移動量の情報と、光強度および発光位置の情報と、に基づいて、マーカー粒子の空間位置の検出が可能である。

Description

光分析装置、光分析方法、およびプログラム

　本発明は、光分析装置、光分析方法、およびプログラムに関する。

　例えば希薄溶液の濃度などを高精度に測定するための光分析装置が知られている。例えば、特許文献１では、溶液分子に発光粒子を付着させた状態でレーザー光を照射し、発光粒子の発光光を検知することによって、分子を計数する光分析装置が提案されている。ここで、「発光粒子」は、レーザー光の照射によって励起されて発光する。自発光する粒子と紛らわしいため、以下では、「発光粒子」をマーカー粒子と称する。

特許第５２５０１５２号公報

　しかしながら、上記のような従来技術には、以下のような問題がある。
　特許文献１に記載の光分析装置は、共焦点顕微鏡の光学系を通して、被検溶液にレーザー光を照射する。被検溶液に照射されたレーザー光のコンフォーカル・ボリュームにマーカー粒子が入ると、マーカー粒子からの発光光が共焦点顕微鏡の像面に結像される。共焦点顕微鏡では、コンフォーカル・ボリューム以外からの光は像面に入射しないため、発光光が極めて微弱でも、高精度に発光光の光強度が検出される。
　特許文献１の分析装置では、レーザー光の光軸上のコンフォーカル・ボリュームを光検出領域とする。このため、被検溶液内のマーカー粒子の位置および個数を正確に検出するには、コンフォーカル・ボリュームが被検溶液を走査する必要がある。具体的には、レーザー光がミラー偏向器によって回転されることによって、レーザー光による走査が行われる。この走査は、マーカー粒子が付着した分子のブラウン運動の速度よりも充分に高速で行われる必要がある。
　被検溶液が希薄であると、正確な濃度を求めるためにはより大きな走査体積が必要になる。具体的には、このような走査は、微小なコンフォーカル・ボリュームを平面走査し、さらに走査平面を光軸方向に移動して同様な平面走査を繰り返す必要がある。
　このため、特許文献１の光分析装置は、測定に時間がかかりやすいという問題がある。

　本発明は、上記のような問題に鑑みてなされたものであり、光照射によってマーカー粒子の位置検出を行う場合に、迅速な測定が行える光分析装置、光分析方法、およびプログラムを提供することを目的とする。

　本発明の第１の態様における光分析装置によれば、マーカー粒子を発光させる光ビームを発生する光源部と、前記光ビームの少なくとも一部によって扁平ビーム部を形成するビーム整形部と、前記マーカー粒子を含む被検試料および前記扁平ビーム部の少なくとも一方を移動することにより、前記被検試料と前記扁平ビーム部とを前記扁平ビーム部の短軸方向に相対移動させる相対移動部と、前記短軸方向において前記扁平ビーム部と対向して配置され、前記被検試料における発光光の光強度と、前記短軸方向に直交する平面における前記発光光の発光位置と、を検出する光検出部と、前記相対移動部による前記扁平ビーム部の相対移動量の情報と、前記光検出部による前記光強度および前記発光位置の情報と、に基づいて、前記被検試料における前記マーカー粒子の空間位置の検出が可能な位置検出部と、を備える。

　本発明の第２の態様における光分析装置によれば、上記第１の態様において、前記位置検出部は、前記扁平ビーム部の相対移動に伴って生じる前記発光位置における前記光強度の変化に基づいて、前記マーカー粒子の前記空間位置を算出してもよい。

　本発明の第３の態様における光分析装置によれば、上記第２の態様において、前記扁平ビーム部における少なくとも前記短軸方向と直交する長軸方向における光強度分布情報を記憶する記憶部をさらに備え、前記位置検出部は、前記記憶部に記憶された前記光強度分布情報に基づいて、前記光検出部からの前記光強度の情報を補正してもよい。

　本発明の第４の態様における光分析装置によれば、上記第１～第３のいずれか１つの態様において、前記位置検出部は、前記空間位置の情報に基づいて、前記マーカー粒子の個数を計数してもよい。

　本発明の第５の態様における上記光分析装置によれば、上記第１～第４のいずれか１つの態様において、前記位置検出部は、前記空間位置の情報に基づいて、前記マーカー粒子が付着する物質の体積を測定してもよい。

　本発明の第６の態様における光分析装置によれば、上記第１～第５のいずれか１つの態様において、前記位置検出部は、前記空間位置の情報に基づいて、複数の前記マーカー粒子の間の距離を測定してもよい。

　本発明の第７の態様における光分析装置によれば、上記第１～第６のいずれか１つの態様において、前記相対移動部は、前記被検試料内における前記マーカー粒子の拡散移動速度よりも高速で、前記扁平ビーム部を相対移動してもよい。

　本発明の第８の態様における光分析方法によれば、光ビームによって発光するマーカー粒子を含む被検試料の内部に扁平ビーム部を有する前記光ビームを照射することと、前記被検試料に対して前記扁平ビーム部を前記扁平ビーム部の短軸方向に相対移動することと、前記短軸方向における前記扁平ビーム部の相対移動中に、前記被検試料からの発光光の光強度および前記短軸方向に直交する平面における前記発光光の発光位置を検出することと、前記扁平ビーム部の相対移動量と、前記光強度および前記発光位置と、に基づいて、前記被検試料における前記マーカー粒子の空間位置の検出を行うことと、を含んでもよい。

　本発明の第９の態様におけるプログラムによれば、光ビームによって発光するマーカー粒子を含む被検試料の内部に、扁平ビーム部を前記扁平ビーム部の短軸方向に走査して取得される、前記短軸方向から見た平面における光強度分布データを取得する第１のステップと、前記光強度分布データから、前記平面における位置座標を固定した一次元の時系列データを取得する第２のステップと、前記位置座標における前記時系列データに対して前記扁平ビーム部の光強度プロファイルに基づいて補正処理を行う第３のステップと、補正処理された前記時系列データから前記マーカー粒子の空間位置を推定する第４のステップと、をコンピュータに行わせることができる。

　上記第１～第９の態様における光分析装置、光分析方法、およびプログラムによれば、光照射によってマーカー粒子の位置検出を行う場合に、迅速な測定が行える。

本発明の第１の実施形態の光分析装置の例を示す模式的な構成図である。 本発明の第１の実施形態の光分析装置における扁平ビーム部の模式的な平面図である。 本発明の第１の実施形態の光分析装置における扁平ビーム部の模式的な斜視図である。 本発明の第１の実施形態の光分析装置における扁平ビーム部の光強度プロファイルの例を示す模式図である。 本発明の第１の実施形態の光分析装置における制御ユニットの構成を示すブロック図である。 本発明の第１の実施形態の光分析装置の動作例を示すフローチャートである。 本発明の第１の実施形態の光分析方法における時系列の輝度分布の一例を示す模式図およびグラフである。 本発明の第１の実施形態の光分析方法における推定処理の一例を示すフローチャートである。 本発明の第１の実施形態の光分析装置における推定処理の一例を示す模式的なグラフである。 本発明の第２の実施形態の光分析装置における制御ユニットの構成を示すブロック図である。 本発明の第３の実施形態の光分析装置における制御ユニットの構成を示すブロック図である。

　以下では、本発明の実施形態について添付図面を参照して説明する。すべての図面において、実施形態が異なる場合であっても、同一または相当する部材には同一の符号を付し、共通する説明は省略する。

［第１の実施形態］
　本発明の第１の実施形態の光分析装置について説明する。
　図１は、本発明の第１の実施形態の光分析装置の例を示す模式的な断面図である。図２は、本発明の第１の実施形態の光分析装置における扁平ビーム部の模式的な平面図である。図３は、本発明の第１の実施形態の光分析装置における扁平ビーム部の模式的な斜視図である。図４は、本発明の第１の実施形態の光分析装置における扁平ビーム部の光強度プロファイルの例を示す模式図である。
　なお、各図面は、模式図のため形状や寸法は誇張されている（以下の図面も同じ）。

　図１に示す本実施形態の光分析装置１は、試料１０（被検試料）に光を照射して試料１０を分析する。試料１０は、マーカー粒子が含まれ、マーカー粒子に光照射可能な光透過性を有していれば、特に制限されない。例えば、試料１０は、マーカー粒子自身またはマーカー粒子が付着した物質が分散された試料溶液Ｓと、試料溶液Ｓを保持する透明体とによって構成されてもよい。
　試料溶液Ｓに含まれる物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸などの生体分子、あるいはこれら生体分子の凝集体、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物が挙げられる。試料溶液Ｓに含まれる物質は、例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなどの非生物学的な粒子であってもよい。
　試料溶液Ｓ中に含まれるマーカー粒子としては、励起光によって発光する適宜の粒子が用いられる。マーカー粒子の例としては、例えば、蛍光色素等の発光標識が付加された粒子、蛍光性粒子などが挙げられる。
　マーカー粒子は、試料溶液Ｓ中に分散していてもよし、溶解していてもよい。

　本実施形態の光分析装置１は、光源部２、ビーム偏向器３（相対移動部）、ビーム整形部４、試料保持部５、テレセントリック光学系６、撮像部７（光検出部）、および制御ユニット８を備える。

　光源部２は、マーカー粒子を発光させる励起光である光ビームＬ１を発生する。光ビームＬ１は、一例として、コリメートされた平行ビームである。
　光ビームＬ１の波長は、試料１０に含まれるマーカー粒子を励起する波長が含まれていれば特に限定されない。例えば、励起波長が異なる複数種類のマーカー粒子が試料溶液Ｓに含まれている場合には、光ビームＬ１は複数のピーク波長が含まれていてもよい。
　以下では、一例として、マーカー粒子の励起光波長がλであるとして説明する。この場合、光ビームＬ１の波長分布は、ピーク波長がλであることがより好ましい。しかし、光ビームＬ１の波長分布は、波長λにおいて安定した光強度を有していれば、波長λとずれたピーク波長を有していてもよい。
　例えば、光ビームＬ１は、波長λまたはその近傍にピーク波長を有するレーザー光が用いられてもよい。

　光源部２は、例えば、レーザー光源などの、光ビームＬ１を発生するための適宜の光源を少なくとも備える。光源部２は、さらに必要に応じて適宜のビーム径を有する平行ビームを得るための光学系を備えてもよい。
　光源部２は、後述する制御ユニット８と通信可能に接続されている。光源部２は、制御ユニット８からの制御信号によって、光ビームＬ１のオン／オフと、光ビームＬ１の光強度とが制御される。

　光源部２によって発生される光ビームＬ１は、光軸Ｏ１に沿ってビーム偏向器３に向かって照射される。

　以下の説明では、簡単のため、図１に記載されたＸＹＺ直交座標系が参照される場合がある。Ｚ軸は、光軸Ｏ１に平行な軸線である。Ｘ軸は、Ｚ軸に直交する軸線である。Ｙ軸は、Ｚ軸およびＸ軸に直交する軸線である。図１に示す配置例では、一例として、Ｚ軸は鉛直軸、ＸＹ平面は水平面である。Ｚ軸の正方向は、図示の下から上に向かう方向である。Ｘ軸の正方向は、図示の左から右に向かう方向である。Ｙ軸の正方向は、図示の紙面手前側から紙面奥側に向かう方向である。

　光ビームＬ１のビーム径は、後述する扁平ビーム部ＬＦに必要な大きさに応じた適宜の値が用いられる。例えば、光ビームＬ１は円形ビームでもよい。円形ビームのビーム径は、１０００μｍとされてもよい。

　ビーム偏向器３は、光ビームＬ１の光軸Ｏ１を反復偏向する。具体的には、ビーム偏向器３は、光軸Ｏ１をＺＸ平面内において反射する。ビーム偏向器３の装置構成は、光ビームＬ１を反復偏向できれば、特に限定されない。図１に示す例では、ビーム偏向器３は、ガルバノスキャナーが用いられている。
　ビーム偏向器３は、光ビームＬ１を反射する偏向面３ａを有するガルバノミラーと、回転中心軸線Ｒを中心としてガルバノミラーを揺動させる駆動部３ｂと、を備える。
　駆動部３ｂとしては、例えば、周知のガルバノモーターが用いられてもよい。回転中心軸線Ｒは、一例として、Ｙ軸に平行である。偏向面３ａは回転中心軸線Ｒを含む平面反射面で構成される。
　ビーム偏向器３は、後述する制御ユニット８と通信可能に接続されている。ビーム偏向器３の駆動部３ｂは、制御ユニット８からの制御信号によって、揺動のオン／オフが制御される。ビーム偏向器３の揺動動作と、揺動周波数とは、固定されていてよい。ビーム偏向器３の揺動動作と、揺動周波数とは、制御ユニット８によって制御されてもよい。

　ビーム偏向器３の偏向面３ａが揺動すると、光軸Ｏ１は、ＺＸ平面内において光軸Ｏ２のように反射される。このため、光ビームＬ１は、進行方向が異なる平行ビームである光ビームＬ２として、光軸Ｏ２に沿って進む。
　光ビームＬ２において、ＺＸ平面内で光軸Ｏ２と直交する方向（走査方向）のビーム径は、光ビームＬ１におけるＸ軸方向のビーム径と同様である。光ビームＬ２において、走査方向と直交する方向（Ｙ軸方向）におけるビーム径は、光ビームＬ１におけるＹ軸方向のビーム径と同様である。
　例えば、偏向面３ａの位置が二点鎖線のように変化すると、光軸Ｏ１は、光軸Ｏ２’のように、偏向面３ａの角度変化に応じた方向に反射される。
　図１に示す例では、ビーム偏向器３は、入射光である光ビームＬ１を、Ｘ軸を中心として反復偏向することが可能である。

　ビーム整形部４は、光ビームＬ２から扁平ビーム部ＬＦを形成する装置部分である。
　扁平ビーム部ＬＦは、光軸に直交する断面（以下、ビーム断面と称する）のビーム径が２軸方向において大きく異なるビーム形状の部位を表す。ビーム断面において、最大のビーム径が得られる方向を長軸方向と称する。ビーム断面において長軸方向と直交する方向を短軸方向と称する。

　扁平ビーム部ＬＦにおいて、長軸方向の長軸ビーム径Ｗ１と、短軸方向の短軸ビーム径Ｗ２とすると、短軸ビーム径Ｗ２は、少なくともマーカー粒子の大きさよりも大きい。長軸ビーム径Ｗ１は、測定領域を広くするためにできるだけ大きい値にすることがより好ましい。例えば、長軸ビーム径Ｗ１は、５００μｍ以上２０００μｍ以下でもよい。長軸ビーム径Ｗ１は、１０００μｍ以上２０００μｍ以下であることがより好ましい。
　例えば、短軸ビーム径Ｗ２は、５μｍ以上２０μｍ以下でもよい。短軸ビーム径Ｗ２は、１０μｍ以上２０μｍ以下であることがより好ましい。
　例えば、長軸ビーム径Ｗ１と短軸ビーム径Ｗ２との比Ｗ１／Ｗ２は、２５以上４００以下でもよい。Ｗ１／Ｗ２は、５０以上２００以下であることがより好ましい。

　扁平ビーム部ＬＦにおける長軸ビーム径Ｗ１、短軸ビーム径Ｗ２、および比Ｗ１／Ｗ２は、扁平ビーム部ＬＦの光軸に沿う方向（以下、光軸方向という場合がある）において一定でもよいし、変化してもよい。
　扁平ビーム部ＬＦにおける長軸ビーム径Ｗ１の変化幅は、０μｍ以上１００μｍ以下であることがより好ましい。あるいは、扁平ビーム部ＬＦにおける長軸ビーム径Ｗ１の変化幅は、最小値のＷ１に対して１０％以下であってもよい。扁平ビーム部ＬＦにおける短軸ビーム径Ｗ２の変化幅は、０μｍ以上１μｍ以下であることがより好ましい。あるいは、扁平ビーム部ＬＦにおける短軸ビーム径Ｗ２の変化幅は、最小値のＷ２に対して１０％以下であってもよい。扁平ビーム部ＬＦにおける比Ｗ１／Ｗ２の変化幅は、最小値のＷ１／Ｗ２に対して１０％以下であることがより好ましい。

　後述するように、光軸方向における扁平ビーム部ＬＦの長さＷ３は長いほど、測定領域が拡大される。測定領域が広範囲であると測定時間が短縮される。長さＷ３は長いほど好ましい。ただし、長さＷ３は、試料１０の大きさを超える必要はない。
　例えば、長さＷ３は、１００μｍ以上５００μｍ以下であってもよい。長さＷ３は、２００μｍ以上５００μｍ以下であることがより好ましい。

　扁平ビーム部ＬＦは、平行ビームで形成されてもよい。扁平ビーム部ＬＦは、収束ビームまたは発散ビームの一部分によって形成されてもよい。いずれの扁平ビーム部ＬＦも、光ビームＬ２を整形する適宜の光学系によって形成可能である。
　本実施形態では、ビーム整形部４の一例として、光ビームＬ２をＺ軸方向のみに集光するシリンドリカルレンズが用いられている。図１におけるビーム整形部４の配置において、ビーム整形部４のレンズ光軸は、Ｘ軸と平行になっている。ビーム整形部４のシリンドリカル面の母線はＹ軸方向に延びている。ビーム整形部４のＺＸ平面における前側焦点位置は、回転中心軸線Ｒに一致されている。

　このように配置されたビーム整形部４に、偏向面３ａで反射された光ビームＬ２が入射すると、ビーム整形部４から光ビームＬ３がＸ軸の正方向に出射する。
　光ビームＬ２はビーム整形部４の前側焦点位置で反射されるため、光ビームＬ３はＸ軸に平行な光軸Ｏ３を有する。ビーム整形部４は、Ｚ軸方向においてはパワーを有するため、光ビームＬ３はビーム整形部４によってＺ軸方向において集光される。光ビームＬ３は、ビーム整形部４の後側焦点位置にＸ軸方向のビームウェストを有する。
　ビーム整形部４はＹ軸方向にはパワーを有しないため、図２に示すように、光ビームＬ３はＹ軸方向においては光ビームＬ２と同様の平行ビームである。
　光ビームＬ３は、Ｘ軸方向におけるビームウェストの前後において、扁平な部位を有する。

　光ビームＬ３において扁平な部位の範囲は、例えば、光ビームＬ３の波長、光ビームＬ２のＹ軸方向のビーム径、ビーム整形部４の焦点距離などの光学的条件によって規定される。
　例えば、光ビームＬ２の波長が６３３ｎｍ、Ｙ軸方向のビーム径が１０００μｍ、ビーム整形部４の焦点距離が５０ｍｍの場合、光ビームＬ３のビームウェスト径は、Ｙ軸方向では１０００μｍ、Ｚ軸方向では１０μｍになる。例えば、Ｚ軸方向におけるビーム径が、１０μｍ以上１０．９μｍ以下の範囲におけるＸ軸方向の長さは、１１０μｍである。
　この場合、光ビームＬ３のビームウェストの前後の±５５μｍの範囲には、長軸ビーム径１０００μｍ、短軸ビーム径が１０μｍ～１０．９μｍの扁平ビーム部ＬＦが形成される。

　図３に示すように、扁平ビーム部ＬＦにおいて、Ｙ軸方向は長軸方向、Ｚ軸方向は短軸方向になっている。光ビームＬ１がレーザー光の場合、光ビームＬ３および扁平ビーム部ＬＦは、近似的にはガウシアンビームと見なせる。
　ガウシアンビームの場合、図４に模式的に示すように、光軸Ｏ３に平行な断面における光強度プロファイルはいずれもガウス分布になる。ただし、断面位置が光軸Ｏ３から離間するほど、強度ピークは低下し、分布範囲も狭くなる。
　図４には、Ｙ軸方向における位置を変えた場合の光強度プロファイルの変化が示されている。例えば、Ｘ座標がｘのビーム断面においてＹ座標がｙの位置におけるＺＸ平面に平行な断面における光強度プロファイルは、ガウス分布関数Ｉ_ｇ（ｘ，ｙ）で表される。
　例えば、光軸Ｏ３上のＸ座標をｘ_０、Ｙ座標をｙ_０とし、Ｙ軸方向の負方向に、順次離間したＹ座標ｙ_１、ｙ_２とする場合、各位置でのピーク強度Ｉ_ｇ（ｘ_０、ｙ_０）、Ｉ_ｇ（ｘ_０、ｙ_１）、Ｉ_ｇ（ｘ_０、ｙ_２）は、それぞれ、Ｘ軸方向におけるガウス分布の光強度プロファイルであるＩ_ｇ（ｘ_０，ｙ）（図示二点鎖線参照）に従う。

　図１に示すように、例えば、偏向面３ａが揺動することによって、光ビームＬ２が光軸Ｏ２と異なる光軸Ｏ２’に沿ってビーム整形部４に入射する場合、ビーム整形部４から光ビームＬ３’が出射する。光ビームＬ３’は、Ｘ軸に平行な光軸Ｏ３’を有する。光ビームＬ３’はビーム整形部４の後側焦点位置において、Ｘ軸方向のビームウェストが形成されるように集光される。このため、光ビームＬ３’によれば、光ビームＬ３と同様な扁平ビーム部ＬＦが光軸Ｏ３’上に形成される。偏向面３ａの揺動によって、扁平ビーム部ＬＦはＺ軸方向に平行移動する。ビーム偏向器３は、試料１０の位置が固定される場合に、試料１０に対して、扁平ビーム部ＬＦを扁平ビーム部ＬＦの短軸方向に相対移動させる相対移動部を構成している。

　扁平ビーム部ＬＦのＺ軸方向における移動速度（以下、移動速度）は、測定の目的に応じて適宜の移動速度とされればよい。移動速度は一定であることがより好ましいが、移動位置の検知が可能であれば、移動速度は変化してもよい。
　ただし、扁平ビーム部ＬＦの移動速度は、試料溶液Ｓ内におけるマーカー粒子またはマーカー粒子が付着した物質の移動速度に比べて高速であることがより好ましい。試料溶液Ｓ内のマーカー粒子またはマーカー粒子が付着した物質は、例えば、ブラウン運動によってランダムに移動する。このため、扁平ビーム部ＬＦの移動速度は、試料溶液Ｓ内のマーカー粒子またはマーカー粒子が付着した物質のブラウン運動による拡散移動速度よりも高速であることがより好ましい。

　試料保持部５は、ビーム整形部４のＸ軸方向の正方向側において試料１０を載置する装置部分である。試料保持部５は、扁平ビーム部ＬＦのＺ軸方向における移動範囲に試料１０を載置できる位置に配置されている。

　テレセントリック光学系６は、試料１０のマーカー粒子からの微弱な光を高精度に取得するために設けられている。
　テレセントリック光学系６は、対物レンズ６Ａ、絞り６Ｃ、および結像レンズ６Ｂを備える。テレセントリック光学系６の光軸は、扁平ビーム部ＬＦの短軸に平行に配置されている。
　対物レンズ６Ａは、扁平ビーム部ＬＦが形成される領域に前側焦点位置を合わせることができる位置に配置されている。
　絞り６Ｃは、対物レンズ６Ａの前側焦点位置と共役な位置に開口する開口部６ａを有する。
　結像レンズ６Ｂは、対物レンズ６Ａで集光され、開口部６ａを通過した光を像面に結像する。
　対物レンズ６Ａおよび結像レンズ６Ｂで構成される結像光学系の倍率は、後述する撮像部７の分解能に応じて設定される。

　撮像部７は、扁平ビーム部ＬＦにマーカー粒子が通過することによって発生する発光光の光強度と、扁平ビーム部ＬＦの短軸方向に直交する平面における発光光の発光位置を検出する光検出部である。本実施形態では、扁平ビーム部ＬＦの短軸方向に直交する平面は、ＸＹ平面に平行な平面である。
　撮像部７は、例えば、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ素子などからなる撮像素子で構成される。撮像部７の撮像面７ａはテレセントリック光学系６の像面に配置される。
　撮像部７の画素数は、短軸方向から見た扁平ビーム部ＬＦの面積と、必要な光量および発光位置の検出分解能と、テレセントリック光学系６の倍率と、に応じて、適宜設定される。
　例えば、Ｗ１×Ｗ３の範囲が１０００μｍ×２００μｍの場合に、検出位置分解能が１μｍであるとする。例えば、撮像部７として、画素サイズが６．４５μｍ×６．４５μｍの撮像素子を用いることにすると、テレセントリック光学系６の結像倍率は６倍とされてもよい。この場合、撮像部７は、１３４４画素×２５６画素よりも大きな有効画像領域を有していればよい。撮像部７がさらに広い有効画像領域を有する場合には、さらにテレセントリック光学系６の結像倍率を向上することによって、発光位置の検出分解能または光量の検出分解能を向上することができる。

　撮像部７は、後述する制御ユニット８と通信可能に接続されている。撮像部７は、制御ユニット８からの制御信号に応じて、撮像した画像信号を制御ユニット８に送出する。

　次に、光分析装置１の動作を制御する制御ユニット８の機能構成について説明する。
　図５は、本発明の第１の実施形態の光分析装置における制御ユニットの構成を示すブロック図である。

　図５に示すように、制御ユニット８は、装置制御部１０６、画像情報取得部１０１、画像データ生成部１０２、記憶部１０３、空間位置検出処理部１０４（位置検出部）、および測定情報生成部１０５を備える。
　装置制御部１０６は、光分析装置１における全体的な動作を制御する。装置制御部１０６は光源部２、ビーム偏向器３、画像情報取得部１０１、および空間位置検出処理部１０４と通信可能に接続されている。さらに、装置制御部１０６は、操作部１１と通信可能に接続されている。

　操作部１１は、光分析装置１を操作する操作者によって操作入力が行われる装置部分である。例えば、操作部１１は、キーボード、タッチパネル、操作ボタンなどの適宜の操作入力手段によって構成される。
　操作部１１によって行われる操作入力の例としては、例えば、光分析装置１の起動、停止、測定の開始、終了、測定の条件入力などが挙げられる。
　装置制御部１０６は、操作部１１からの操作入力に基づいて、光分析装置１の動作制御を行う。装置制御部１０６が行う具体的な制御の詳細については、光分析装置１の動作とともに後述される。

　例えば、装置制御部１０６は、光源部２を所定の光強度で点灯させる制御を行う。
　例えば、装置制御部１０６は、操作部１１からの操作入力に基づいて、扁平ビーム部ＬＦのＺ軸方向における移動範囲および移動速度（ビーム偏向器３の揺動速度）を設定する。装置制御部１０６が、設定された移動範囲および移動速度で扁平ビーム部ＬＦがＺ軸方向に移動するように、ビーム偏向器３の動作を制御する。
　さらに、装置制御部１０６は、撮像部７からの画像情報の取得タイミングを制御する。装置制御部１０６は、画像データの取得タイミングに基づいて、画像情報と扁平ビーム部ＬＦの相対移動量の情報を、空間位置検出処理部１０４に送出する。

　画像情報取得部１０１は、装置制御部１０６からの制御信号に基づいて、撮像部７から撮像範囲における二次元の画像情報を取得する。取得された画像情報は、画像データ生成部１０２に送出される。
　画像データ生成部１０２は、画像情報取得部１０１から送出される画像情報から、撮像範囲における光強度分布を表す画像データを生成する。画像データ生成部１０２は、画像データを記憶部１０３に記憶させる。
　画像データ生成部１０２は、画像情報取得部１０１からの画像取得が終了すると、空間位置検出処理部１０４に分析用の画像データの生成が終了したことを通知する。

　空間位置検出処理部１０４は、記憶部１０３に記憶された各画像データに基づいて、ＸＹ平面におけるマーカー粒子の位置座標（通過位置）および各マーカー粒子による発光強度を算出する。空間位置検出処理部１０４は、マーカー粒子の各通過位置における発光強度の時系列データを生成する。
　さらに、空間位置検出処理部１０４は、時系列データに基づいて扁平ビーム部ＬＦの走査方向（Ｚ軸方向）における位置座標と、発光強度とを推定する。
　空間位置検出処理部１０４は、上述の演算処理結果に基づいて、試料１０におけるマーカー粒子の空間位置座標および発光強度を、必要に応じて記憶部１０３に記憶させる。

　測定情報生成部１０５は、空間位置検出処理部１０４から送出されたマーカー粒子の空間位置座標および発光強度に基づいて測定情報を生成する。
　測定情報生成部１０５が生成する測定情報としては、例えば、マーカー粒子の個数、マーカー粒子が付着された物質の濃度、体積、異なるマーカー粒子間の距離などが挙げられる。測定情報は、数値情報には限定されない。例えば、試料溶液Ｓに含まれる物資の種類に応じてマーカー粒子の付着個数が変えられている場合には、物質の体積の範囲におけるマーカー粒子の個数の情報から、物質の種類が測定情報として特定される。例えば、物質の体積と物質の種類との関係の情報が予め与えられている場合には、物質の体積の情報から、物質の種類が測定情報として特定される。

　測定情報生成部１０５は、表示部１２と通信可能に接続されている。測定情報生成部１０５は、測定情報を表示部１２における表示情報に変換することによって、表示部１２に表示させる。
　表示部１２の例としては、例えば、ディスプレイ、プリンタなどが挙げられる。

　制御ユニット８は、ＣＰＵ、メモリ、入出力インターフェース、外部記憶装置などを有するコンピュータを含む適宜のハードウェアで構成されてもよい。制御ユニット８に用いられるコンピュータは、上述または後述の制御機能の少なくとも一部を実現するプログラムが記録された記録媒体９（図１参照）からメモリにプログラムを読み込んでプログラムを実行してもよい。
　記憶媒体９は、コンピュータ読み取り可能な記録媒体である。例えば、記憶媒体９の例としては、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ－ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置が挙げられる。
　さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」は、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信回線のように、短時間、動的にプログラムを保持する媒体でもよい。この場合、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」は、サーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持している媒体も含まれる。
　上記プログラムは、上述または後述の制御機能をコンピュータに記録されているプログラムとの組み合わせで実現してもよい。

　次に、光分析装置１の動作について、本実施形態の光分析方法を中心として説明する。
　図６は、本発明の第１の実施形態の光分析装置の動作例を示すフローチャートである。図７（ａ）、（ｂ）は、本発明の第１の実施形態の光分析方法における時系列の輝度分布の一例を示す模式図およびグラフである。図８は、本発明の第１の実施形態の光分析方法における推定処理の一例を示すフローチャートである。図９は、本発明の第１の実施形態の光分析装置における推定処理の一例を示す模式的なグラフである。図９は、本発明の第１の実施形態の光分析装置の動作例を示すフローチャートである。図１０は、本発明の第１の実施形態の光分析装置における時系列データのフィッティング処理の一例を示す模式的なグラフである。

　本実施形態の光分析方法は、光分析装置１を用いて行うことができる。光分析装置１によって行われる分析は、図６に示すステップＳ１～Ｓ８が、図６に示すフローに沿って実行されることによって行われる。

　ステップＳ１では、扁平ビーム部ＬＦの光強度プロファイルデータ（光強度分布情報）が作成される。
　光強度プロファイルデータは、扁平ビーム部ＬＦにおける位置（ｘ，ｙ）を通るビーム断面における光強度分布に基づいて、発光光の光強度の測定値を補正できるデータであれば特に限定されない。
　例えば、扁平ビーム部ＬＦがガウシアンビームで近似できる場合、光軸上におけるビームウェストにおけるピーク強度Ｉ_０、ビームウェスト径ｗ_ｘ０、ｗ_ｙ０等を含むパラメータによって光強度分布が決まる。このため、光強度プロファイルは、これらのパラメータを含むガウス分布関数Ｉ_ｇ（ξ，η，ζ）で与えられる。ただし、ξ、η、ζは、扁平ビーム部ＬＦ上に固定された局所座標系であるξηζ座標系の座標である。ξ軸、η軸、ζ軸は、それぞれＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸に平行な座標軸であり、原点は、扁平ビーム部ＬＦのビームウェストにおけるビーム中心である。制御ユニット８の演算処理においては、必要に応じて、固定系であるＸＹＺ座標系の座標値は、ξηζ座標系の座標値に座標変換される。

　光強度プロファイルデータは、関数プログラムとして保持されてもよいし、データテーブルとして保持されてもよい。
　ガウシアンビームは光軸を含む長軸方向、短軸方向の断面プロファイルが与えられれば、光軸から外れた位置の断面プロファイルは、光軸を含む断面プロファイルから容易に換算される。

　扁平ビーム部ＬＦがガウシアンビームで精度よく近似できない場合には、光強度プロファイルデータは、より近似精度の高い他の関数あるいはそのデータテーブルで構成されてもよい。さらに、光強度プロファイルデータは、扁平ビーム部ＬＦの光強度分布の実測値に基づいた実験式あるいはデータテーブルで構成されてもよい。
　以下では、簡単のため、扁平ビーム部ＬＦがガウシアンビームとして精度よく近似できる場合の例で説明する。

　予め記憶部１０３に複数の種類の光強度プロファイルデータが記憶されている場合には、ステップＳ１は、測定者が操作部１１を通じて記憶された光強度プロファイルデータを選択するだけでよい。複数の種類の光強度プロファイルデータとしては、例えば、扁平ビーム部ＬＦのＷ１、Ｗ２、Ｗ３の数値が異なる場合、マーカー粒子の種類によって、扁平ビーム部ＬＦの光強度に対する励起光の発光感度が異なる場合などの例が挙げられる。

　ステップＳ１が終了したら、試料保持部５に試料１０が載置される。試料１０は、測定対象領域が扁平ビーム部ＬＦの走査範囲に入るように位置合わせされる。測定者は、必要に応じて操作部１１から測定条件などを入力する。測定条件が入力されない場合には、光分析装置１は予め設定されたデフォルトの測定条件で動作する。

　以上の測定準備作業が終了したら、ステップＳ２が行われる。ステップＳ２では、扁平ビーム部ＬＦの走査が開始される。
　測定準備作業が終了したら、測定者は操作部１１から測定開始の操作入力を行う。
　装置制御部１０６は、光源部２に光ビームＬ１を点灯開始する制御信号を送出する。このとき、制御信号には、必要に応じて、光ビームＬ１の波長、ビーム径などを選択する制御信号が含まれていてもよい。
　装置制御部１０６は、測定条件に応じて、ビーム偏向器３の駆動部３ｂに対して、必要に応じて、揺動動作条件、揺動周波数などの動作条件の情報を送出した後、揺動を開始する制御信号を送出する。
　ビーム偏向器３は、装置制御部１０６からの制御信号に基づいて、偏向面３ａの揺動を開始する。
　以上で、ステップＳ２が終了する。

　ステップＳ２が終了すると、上述したように、光ビームＬ１は、偏向面３ａで偏向されて光ビームＬ２としてビーム整形部４に入射する。光ビームＬ２は、ビーム整形部４によって集光されて光ビームＬ３として試料１０内に出射される。光ビームＬ３のビームウェストの近傍には、扁平ビーム部ＬＦが形成される。
　扁平ビーム部ＬＦは、偏向面３ａの揺動に応じてＺ軸方向に往復移動する。
　扁平ビーム部ＬＦの移動速度Ｖは、偏向面３ａの揺動運動の角速度の変化によって決まる。ビーム整形部４がシリンドリカルレンズの場合、光ビームＬ２の半画角θとビームウェストの像高Ｈは、ビーム整形部４の焦点距離をｆとして、Ｈ＝ｆ・ｔａｎθの関係がある。偏向面３ａの角速度変化に応じて、Ｚ軸方向における各所の移動速度Ｖ（ｚ）が対応する。移動速度Ｖ（ｚ）は、測定領域において不等速であってもよいが、等速であることがより好ましい
　以下では、簡単のため、測定領域の移動速度Ｖ（ｚ）は、一定値Ｖであるとして説明する。

　ステップＳ２の後、ステップＳ３が行われる。ステップＳ３では、光強度分布データの生成が行われる。
　ビーム偏向器３が駆動されると、ビーム偏向器３は装置制御部１０６に位置出力信号を送出する。装置制御部１０６は、位置出力信号に基づいて偏向面３ａの揺動位置を解析することができる。偏向面３ａの揺動位置と扁平ビーム部ＬＦのＺ軸方向における位置とは一対一に対応する。装置制御部１０６は、ビーム偏向器３から受信する位置出力信号に基づいて、扁平ビーム部ＬＦのＺ軸方向の位置をリアルタイムに把握している。
　装置制御部１０６は、例えば、時間ｔｓから時間ｔｅまでの間に適宜の時間間隔Δｔで、画像情報取得部１０１に画像を取得させる制御信号を送出する。ここで、時間ｔｓは、扁平ビーム部ＬＦがＺ軸方向における測定領域の最下端から走査を開始する時間である。時間ｔｅは、扁平ビーム部ＬＦがＺ軸方向における測定領域の最上端への走査を終了する時間である。
　時間間隔Δｔは、扁平ビーム部ＬＦの測定領域の最下端から最上端までの移動距離Ｚｓに換算して、短軸ビーム径Ｗ２の長さを測定に必要な分割数Ｎに分割できる時間間隔である。さらに、時間間隔Δｔは、撮像部７のフレームレートによって撮像可能な大きさである。
　例えば、扁平ビーム部ＬＦの移動速度をＶとすると、時間間隔Δｔにおける扁平ビーム部ＬＦの移動量Δｚは、Δｚ＝Ｖ・Δｔである。このため、Δｔ＝Ｚｓ／（Ｖ・Ｎ）になる。
　分割数Ｎが小さすぎると、Ｚ軸方向におけるマーカー粒子の位置が精度よく検出できなくなる。分割数Ｎが大きすぎると、測定に要する時間と測定に要する演算処理が増大しすぎる。
　例えば、分割数Ｎは、１０以上３０以下とされてもよい。分割数Ｎは、１０以上２０以下であることがより好ましい。

　画像情報取得部１０１は、装置制御部１０６から送出された制御信号に基づいて、時間ｔｓから時間間隔Δｔごとに、撮像部７の画像情報を取得する。
　撮像部７が取得する画像情報は、撮像面７ａに結像した画像である。撮像面７ａには、マーカー粒子からの発光光がテレセントリック光学系６によって結像する。テレセントリック光学系６は、対物レンズ６Ａの焦点位置と光学的に共役な位置に絞り６Ｃを備える。マーカー粒子からある程度離れた位置から対物レンズ６Ａに入射するノイズ光は、絞り６Ｃによって遮光される。このため、テレセントリック光学系６の像面に結像される光像は、物体面における発光光の光量に略対応した光強度で、物体面における発光位置と光学的に共役な位置に結像される。
　ただし、対物レンズ６Ａの焦点領域内にノイズ光が入射する場合には、ノイズ光も像面に到達する。このため、すべてのノイズ光が遮光されるわけではない。

　画像情報取得部１０１は、取得した画像情報を画像データ生成部１０２に送出する。画像データ生成部１０２は、送出された画像情報から、撮像範囲における光強度分布を表す画像データを生成する。この画像データは、発光位置に対応した画素位置において、物体面における発光光の光量に略対応する輝度を有する。
　画像データ生成部１０２は、各画像データを取得時間と紐づけて記憶部１０３に記憶させる。画像データ生成部１０２は、例えば、時間ｔ＝ｔｓ＋Δｔ・（ｎ－１）に取得された画像データをＧ_ｎ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）のような配列に格納する。ここで、ｎは、１以上Ｋ（ただし、Ｋ＞Ｎ＋１）以下の整数である。指数ｎは、各画像データにおいて、測定の時系列における順序を表すとともに、画像データが取得された際の扁平ビーム部ＬＦのＺ軸方向の位置を表す。指数ｉ_ｘ，ｉ_ｙの組は、測定領域の位置（ｘ，ｙ）を中心とする矩形領域に対応する撮像面７ａ上の画素位置を表す。
　画像データＧ_ｎ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）（ｎ＝１，…，Ｋ）がすべて生成されると、画像データ生成部１０２は、空間位置検出処理部１０４に測定にすべての画像データＧ_ｎ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）が生成されたことを通知する。
　以上で、ステップＳ３が終了する。

　装置制御部１０６は、測定領域における扁平ビーム部ＬＦの走査が終了する時間ｔｅの後、空間位置検出処理部１０４に空間位置検出処理を開始する制御信号を送出する。
　空間位置検出処理部１０４は、画像データ生成部１０２からステップＳ３が終了した通知を受信した後、ステップＳ４～Ｓ７をこの順に行うことによって、空間位置検出処理を行う。

　ステップＳ４では、マーカー粒子の通過位置の位置座標が算出される。
　空間位置検出処理部１０４は、記憶部１０３からＧ_ｎ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）を読み出す。空間位置検出処理部１０４は、Ｇ_ｎ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）を用いて、マーカー粒子の通過位置の位置座標を算出する。ここでマーカー粒子の通過位置とは、本実施形態では、扁平ビーム部ＬＦの走査によって、扁平ビーム部ＬＦを通過するマーカー粒子のＸＹ平面における位置を意味する。
　扁平ビーム部ＬＦの移動速度Ｖは、試料溶液Ｓにおけるマーカー粒子の移動速度より充分に速い場合、マーカー粒子を扁平ビーム部ＬＦが通過する間、マーカー粒子は略停止している。この場合、複数の画像データの一定位置に連続して高輝度のデータが現れる位置にはマーカー粒子が存在する確率が高い。これに対して、ノイズ成分となる発光光の発光位置は、マーカー粒子のように一定にはならない。
　このため、例えば、一定の位置（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）の画素に着目して、ｎが連続する複数のＧ_ｎ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）の輝度分布を調べることによって、マーカー粒子の通過位置が判明する。
　具体的な算出方法を説明する前に、上述の輝度分布について説明する。

　図７（ａ）、（ｂ）に、扁平ビーム部ＬＦの走査と所定の画素で取得される輝度値の関係について模式的に示す。本実施形態では、マーカー粒子が静止していて扁平ビーム部ＬＦがＺ軸方向の正方向に移動する。ただし、図示の簡略化のため、図７（ａ）は、扁平ビーム部ＬＦが静止していてマーカー粒子がＺ軸方向の負方向（図示上から下に向かう方向）に移動するかのように描かれている。図７（ｂ）は、図７（ａ）におけるマーカー粒子の相対移動位置に対応した画像データの輝度を模式的に表す棒グラフである。図７（ｂ）において、ｚ_１，…ｚ_１０は、図７（ａ）に対応するＺ軸方向の移動位置を表す。棒グラフの長さは、輝度Ｉ_１，…，Ｉ_１０を表す。

　図７（ａ）に示すように、例えば、走査開始時にｚ_１に位置するマーカー粒子Ｍは、扁平ビーム部ＬＦのビーム径の範囲外に位置する。走査の進行とともに、マーカー粒子Ｍは、相対的に図示下方に移動して、次第に光強度が強くなる扁平ビーム部ＬＦのビーム径内の領域に進入する。
　マーカー粒子Ｍの発光量は励起光の光量に依存するため、マーカー粒子は通過位置のおける扁平ビーム部ＬＦの光強度分布を反映した励起光を発光する。このため、図７（ｂ）に示すように、位置ｚ_１における画像データの輝度Ｉ_１はきわめて低い。発光量Ｉ_１が０でないのは、レーザー光では、ビーム径の外側でも、ある程度の光強度を有するためである。
　マーカー粒子Ｍの相対移動が進み、例えば、位置ｚ_２、…、位置ｚ_４などのように、扁平ビーム部ＬＦの光強度分布の中心（光軸Ｏ３）に近づくにつれて、輝度はＩ_２、…、Ｉ_４のように増大する。発光量は、扁平ビーム部ＬＦの光強度分布の中心（光軸Ｏ３）に最も近づく位置ｚ_６で最大値Ｉ_６になる。さらに相対移動が進むと、発光量は漸次減少し、マーカー粒子Ｍが扁平ビーム部ＬＦのビーム径の範囲を抜ける位置ｚ_１０では、輝度Ｉ_１０は輝度Ｉ_１と同程度に低下する。
　図７（ｂ）の棒グラフの包絡線をとると、釣り鐘型の曲線になる。これは、扁平ビーム部ＬＦの光強度分布がガウス分布であるためである。

　このようにマーカー粒子の通過位置に対応する位置（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）の画素では、扁平ビーム部ＬＦの位置（ｘ，ｙ）におけるＺＸ平面に平行な断面における光強度プロファイルに応じて、ｎが連続する複数のＧ_ｎ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）が漸増および漸減する変化を示す。これに対し、特に図示しないが、ノイズ光に起因する輝度分布は散発的もしくは扁平ビーム部ＬＦのＺＸ平面に平行な断面における光強度プロファイルと異なる分布を有する。
　したがって、ｎが連続する複数のＧ_ｎ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）の輝度分布の形状から、マーカー粒子に起因した輝度分布かどうか判定できる。

　空間位置検出処理部１０４による具体的な判定方法は特に限定されない。
　以下では、判定方法の一例について説明する。
　例えば、空間位置検出処理部１０４は、位置（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）の画素のＧ_ｎ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）をｎの昇順に並べた輝度分布データｇ_{（ｉｘ，ｉｙ）}（ｎ）を生成する。
　空間位置検出処理部１０４は、輝度分布データｇ_{（ｉｘ，ｉｙ）}（ｎ）をｎの昇順に移動平均し、各移動平均値を閾値と比較することによって、画素（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）が通過位置に対応するか判定する。
　閾値としては、ノイズ光の輝度レベルよりも大きく、マーカー粒子が扁平ビーム部ＬＦの中心に移動したときのピーク発光量に対応する輝度未満の適宜値が用いられる。
　ステップＳ４では、マーカー粒子のＺ軸方向の位置および通過位置における他のマーカー粒子の有無は問わない。このため、空間位置検出処理部１０４は、閾値を超えたら、ただちに、ｇ_{（ｉｘ，ｉｙ）}（ｎ）の移動平均を中止し、他の画素に関して同様の判定処理を実行することができる。
　すべての画素に関して、上述の判定を行って、すべてのマーカー粒子の通過位置Ｐ_ｊ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）（ただし、ｊは１以上Ｎ_Ｐ以下の整数）が抽出されたら、ステップＳ４が終了する。ここで、Ｎ_Ｐは、抽出された通過位置Ｐ_ｊの総数である。
　ステップＳ４では、マーカー粒子の通過位置の位置座標は、画像データ上での位置（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）が求められればよい。ステップＳ４では、位置（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）を実座標（ｘ，ｙ）に換算する必要はない。

　マーカー粒子の通過位置の検出精度をより向上するため、扁平ビーム部ＬＦが走査する間にマーカー粒子が多少移動することが考慮された判定方法が用いられてもよい。
　例えば、ステップＳ４では、特定画素の周囲画素の領域も含めた輝度分布に基づいて通過位置が抽出されてもよい。具体的には、空間位置検出処理部１０４は、位置（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）における単一の画素の輝度分布データｇ_{（ｉｘ，ｉｙ）}（ｎ）に代えて、位置（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）の画素を中心として、３×３画素の範囲あるいは５×５画素の画素データの和Ｓ_ｎ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）を算出する。空間位置検出処理部１０４は、和Ｓ_ｎ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）をｎの昇順に並べて輝度分布データｓ_{（ｉｘ，ｉｙ）}（ｎ）を生成する。
　この後、輝度分布データｓ_{（ｉｘ，ｉｙ）}（ｎ）がｎの昇順に移動平均され、上記と同様に通過位置の判定が行われる。空間位置検出処理部１０４は、少なくとも位置（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）が通過位置であると判定したら、輝度分布データｓ_{（ｉｘ，ｉｙ）}（ｎ）を記憶部１０３に記憶させる。

　ステップＳ４の後、ステップＳ５が行われる。ステップＳ５では、マーカー粒子の通過位置における発光強度の時系列データが生成される。
　空間位置検出処理部１０４は、ステップＳ４において通過位置の判定が単一の画素で行われた場合には、発光強度としては、Ｇ_ｎ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）の輝度値自体が用いられる。具体的には、空間位置検出処理部１０４は、通過位置Ｐ_ｊ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）ごとのＧ_ｎ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）を抽出してｎの昇順に並べることにより、時系列データＩ_ｊ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）（ただし、ｊ＝１，…，Ｎ_Ｐ）を生成する。空間位置検出処理部１０４は、時系列データＩ_ｊ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）を記憶部１０３に記憶させる。

　ステップＳ４において通過位置の判定が位置（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）の画素の隣接エリアの画像データも含めて行われた場合には、通過位置Ｐ_ｊ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）に対応する輝度分布データｓ_{（ｉｘ，ｉｙ）}（ｎ）が用いられる。
　空間位置検出処理部１０４は、記憶部１０３から輝度分布データｓ_{（ｉｘ，ｉｙ）}（ｎ）を読み出して時系列データＩ_ｊ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）（ただし、ｊ＝１，…，Ｎ_Ｐ）を生成する。
　以上で、ステップＳ５が終了する。

　ステップＳ５の後、ステップＳ６が行われる。ステップＳ６では、マーカー粒子の走査方向における位置座標と、マーカー粒子発光強度とを、時系列データに基づいて推定する。
　ステップＳ６は、図８に示すステップＳ１１、Ｓ１２がこの順に行われる。
　ステップＳ１１では、時系列データが扁平ビーム部ＬＦの光強度プロファイルに基づいて補正される。
　例えば、図９に、時系列データＩ_ｊ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）の一部を棒グラフとして示す。図９に示す例では、指数ｎ_１～ｎ_１０の間に連続する釣り鐘型の輝度分布が存在する。空間位置検出処理部１０４は、この輝度分布に対して、光強度プロファイルに基づいてフィティングを行う。本実施形態の場合、フィッティング曲線としては、ガウス分布曲線が用いられる。フィッティング演算としては、特に限定されない。例えば、最小二乗法などが用いられてもよい。
　空間位置検出処理部１０４は、フィッティングによってフィッティング曲線Ｉ_Ｆを算出する。
　この後、空間位置検出処理部１０４は、Ｙ軸方向における扁平ビーム部Ｌ_Ｆの光強度プロファイルによる輝度の低下分を補正するために、フィッティング曲線Ｉ_Ｆを規格化する。具体的には、空間位置検出処理部１０４を、光強度プロファイルを参照して、座標ｘにおける扁平ビーム部Ｌ_Ｆの光強度のピーク値Ｉ_０と、光軸Ｏ３を含みＹ軸方向にとった断面において、座標ｙにおける光強度Ｉ_ｙとを取得する。
　空間位置検出処理部１０４は、フィッティング曲線Ｉ_Ｆに、補正係数Ｉ_０／Ｉ_ｙを乗じてフィティング曲線Ｉ_Ｆ’を生成する。この結果、フィッティング曲線Ｉ_Ｆ’のピーク値Ｉ_Ｆ’は、Ｉ_Ｆ’＝Ｉ_Ｆ・（Ｉ_０／Ｉ_ｙ）となり、光強度プロファイルによる扁平ビーム部ＬＦの光強度低下が補正される。
　以上で、ステップＳ１１が終了する。

　ステップＳ１１の後、ステップＳ１２が行われる。ステップＳ１２では、ステップＳ１１における補正結果から走査方向におけるマーカー粒子の位置座標と、光強度とが算出される。
　空間位置検出処理部１０４は、フィッティング曲線Ｉ_Ｆ’の中心位置ｎ_Ｆ’と、ピーク値Ｉ_０Ｆ’と、代表幅ｗ’とを算出する。ここで、中心位置ｎ_Ｆ’は、実数である。
　代表幅ｗ’は、輝度分布の範囲が通過位置における扁平ビーム部ＬＦの短軸方向のビーム径に相当するかどうかを判定するために用いられる。例えば、代表幅ｗ’は、ピーク強度の１／ｅ^２における幅が用いられる。
　空間位置検出処理部１０４は、代表幅Ｗが、短軸ビーム径Ｗ２と予め決められた許容範囲で一致する場合、フィッティングに用いた輝度分布がマーカー粒子の発光に起因すると判定する。
　この場合、空間位置検出処理部１０４は、通過位置Ｐ_ｊ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）の位置を表す、ｉ_ｘ、ｉ_ｙ、と、位置ｎ_Ｆ’とを、ＸＹＺ座標系における空間座標（ｘ_ｊ，ｙ_ｊ，ｚ_ｊ）に換算する。このようにして、通過位置Ｐ_ｊ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）におけるマーカー粒子の空間座標の推定値が算出される。
　空間位置検出処理部１０４は、ピーク値Ｉ_０Ｆ’を、通過位置Ｐ_ｊ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）のマーカー粒子の発光強度Ｉ_ｊとする。このようにして、通過位置Ｐ_ｊ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）におけるマーカー粒子の発光強度の推定値が算出される。
　空間位置検出処理部１０４は、すべての通過位置Ｐ_ｊ（ｉ_ｘ，ｉ_ｙ）における空間座標（ｘ_ｊ，ｙ_ｊ，ｚ_ｊ）と、発光強度Ｉ_ｊとを算出したら、空間座標（ｘ_ｊ，ｙ_ｊ，ｚ_ｊ）と、発光強度Ｉ_ｊとを記憶部１０３に記憶させる。さらに、空間座標（ｘ_ｊ，ｙ_ｊ，ｚ_ｊ）と、発光強度Ｉ_ｊと測定情報生成部１０５に送出する
　以上で、ステップＳ１２および図６におけるステップＳ６が終了する。

　このような推定処理によれば、輝度分布がフィティングされることによって、輝度分布データに含まれる誤差の影響が低減される。さらに、マーカー粒子のＺ軸方向における発光位置が、測定の時間間隔Δｔよりも高分解能で推定される。
　例えば、図９の輝度分布データにおけるピーク輝度は、ｎ_６においてＩ_０ｎ６になっているが、上述の各推定値とは、ずれており、より大きな誤差を有する測定値になっている。

　図６に示すように、ステップＳ６の後、ステップＳ７が行われる。ステップＳ７では、マーカー粒子の空間位置座標と発光強度との推定値から測定情報が生成される。
　測定情報生成部１０５は、マーカー粒子の空間座標（ｘ_ｊ，ｙ_ｊ，ｚ_ｊ）と、発光強度Ｉ_ｊとに基づいて、測定情報を生成する。測定情報は、少なくとも予め決められたデフォルトの測定情報が生成される。さらに測定開始前に操作部１１から操作入力された測定情報がある場合には、操作入力に応じた測定情報を生成される。

　測定情報生成部１０５は、空間位置検出処理部１０４から送出されたマーカー粒子の空間座標（ｘ_ｊ，ｙ_ｊ，ｚ_ｊ）の数を計数することによって、マーカー粒子の個数を測定情報として生成してもよい。
　測定情報生成部１０５は、マーカー粒子の個数を測定領域の体積で除することによって、マーカー粒子の濃度を測定情報として生成してもよい。
　測定情報生成部１０５は、異なるマーカー粒子の空間座標（ｘ_ｊ，ｙ_ｊ，ｚ_ｊ）からマーカー粒子間の距離を算出することによって、マーカー粒子の距離を測定情報として生成してもよい。

　測定情報生成部１０５は、各マーカー粒子間の距離が予め決められ距離以下のものをグループ化し、各グループにおけるマーカー粒子の個数を算出してもよい。この場合、記憶部１０３に予め、マーカー粒子の個数と物質の種類との対応テーブルを参照して、物質の種類の特定情報を測定情報として生成してもよい。

　測定情報生成部１０５は、各マーカー粒子が、予め決められ距離以下に密集している場合、各マーカー粒子の空間位置座標から、推定されるマーカー粒子が付着した物質の体積、表面形状、外径などを算出してもよい。測定情報生成部１０５は、これらの体積、表面形状、外径などの数値データを測定情報として生成してもよい。さらに、測定情報生成部１０５は、これらの体積、表面形状、外径などの数値データと物質の種類との対応テーブルを参照して、物質の種類の特定情報を測定情報として生成してもよい。

　測定情報生成部１０５が必要な測定情報を生成すると、ステップＳ７が終了する。
　ステップＳ７の後、ステップＳ８が行われる。ステップＳ８は、ステップＳ７で生成された測定情報が出力される。
　測定情報生成部１０５は、適宜の出力先に測定情報を出力する。例えば、測定情報生成部１０５は、測定情報を表示部１２に出力してもよい。表示部１２は、測定情報生成部１０５から表示情報に変換された測定情報を、例えば、数値、文字、画像、グラフ、表などとして表示する。
　ただし、測定情報生成部１０５による測定情報の出力先は表示部１２には限定されない。例えば、測定情報生成部１０５は、測定情報を記憶部１０３に出力してもよい。例えば、制御ユニット８が通信回線に接続されている場合には、測定情報生成部１０５は、測定情報を通信回線上の適宜の機器に出力してもよい。

　以上、説明したように、本実施形態の光分析装置１によれば、光照射によってマーカー粒子の位置検出を行う場合に、迅速な測定が行える。
　特に、光分析装置１では、扁平ビーム部ＬＦを短軸方向に走査することによって、試料１０内のマーカー粒子の発光光が時系列で取得される。短軸方向の走査はビーム偏向器３によって高速に行える。さらに、発光光の情報は、撮像部７によって扁平ビーム部ＬＦの範囲の画像情報として取得される。このため、微小なコンフォーカル・ボリュームを３次元的に走査する場合に比べて、マーカー粒子の発光位置の情報をより迅速に取得できる。

　さらに、光分析装置１では、扁平ビーム部ＬＦの光強度プロファイルに基づいて、撮像部７によって取得される輝度が補正される。このため、ガウシアンビームのように光強度分布がマーカー粒子の通過位置によって異なる場合にも、広範囲で正確な発光強度の検出が可能になる。

［第２の実施形態］
　本発明の第２の実施形態の光分析装置について説明する。
　図１０は、本発明の第２の実施形態の光分析装置における制御ユニットの構成を示すブロック図である。

　図１に示すように、本実施形態の光分析装置１Ａは、上記第１の実施形態の制御ユニット８に代えて、制御ユニット８Ａを備える。
　以下、上記第１の実施形態と異なる点を中心に説明する。

　図１０に示すように、制御ユニット８Ａは、上記第１の実施形態の制御ユニット８の記憶部１０３、空間位置検出処理部１０４に代えて、記憶部１０３Ａ、空間位置検出処理部１０４Ａ（位置検出部）を備え、測定情報生成部１０５が削除されて構成される。
　記憶部１０３Ａは、光強度プロファイルデータが記憶されていない点が、記憶部１０３と異なる。このため、空間位置検出処理部１０４Ａは、光強度プロファイルデータに基づく補正を行わない。
　このような光分析装置１Ａは、マーカー粒子の光強度を高精度に求める必要がない場合、例えば、マーカー粒子の空間位置が測定できればよい場合に特に好適である。
　ただし、光分析装置１Ａの場合でも、扁平ビーム部ＬＦとして、Ｙ軸方向におけるビーム中心寄りの範囲を使用する場合には、光強度分布の変化が少ないため補正を入れなくてもある程度正確に光強度が検出される。

　本実施形態の光分析装置１Ａによれば、上記第１の実施形態において扁平ビーム部ＬＦの光強度プロファイルデータを使用しない空間位置検出処理部１０４の動作を、空間位置検出処理部１０４Ａが上記第１の実施形態と同様に行うことができる。光分析装置１Ａにおいても、扁平ビーム部ＬＦの走査が用いられるため、光照射によってマーカー粒子の位置検出を行う場合に、迅速な測定が行える。

［第３の実施形態］
　本発明の第３の実施形態の光分析装置について説明する。
　図１１は、本発明の第３の実施形態の光分析装置における制御ユニットの構成を示すブロック図である。

　図１に示すように、本実施形態の光分析装置１Ｂは、上記第１の実施形態の制御ユニット８に代えて、制御ユニット８Ｂを備える。
　以下、上記第１の実施形態と異なる点を中心に説明する。

　図１１に示すように、制御ユニット８Ｂは、上記第１の実施形態の制御ユニット８に光強度プロファイルデータ取得部１０７が追加されて構成される。
　光強度プロファイルデータ取得部１０７は、扁平ビーム部ＬＦの光強度プロファイルデータを取得する装置部分である。

　光強度プロファイルデータ取得部１０７の構成は、扁平ビーム部ＬＦの光強度プロファイルデータが取得できれば、特に限定されない。
　例えば、光強度プロファイルデータ取得部１０７は、画像データ生成部１０２が取得した画像データの分析装置で構成されてもよい。この場合、光強度プロファイルデータ取得部１０７には、扁平ビーム部ＬＦの光強度プロファイルデータを取得するための標準試料の標準画像データが記憶されている。
　標準試料は、測定領域内の所定位置に多数のマーカー粒子が分散されている。標準画像データとしては、基準光源で形成した扁平ビーム部ＬＦを基準試料に照射した場合の、各走査位置における画像データが用いられる。
　光強度プロファイルデータ取得部１０７は、光分析装置１Ｂに装着された光源部２によって標準試料の画像データを取得した後、標準画像データとの差等に基づいて基準光源で形成した扁平ビーム部ＬＦの光強度プロファイルデータを補正する。このようにして、光強度プロファイルデータ取得部１０７は測定用の光強度プロファイルデータを生成する。

　光分析装置１Ｂによって、試料１０の光分析を行うには、図６のステップＳ１において、上述のような標準試料を用いた光強度プロファイルデータの取得する動作が行われる。
　光強度プロファイルデータ取得部１０７は、測定用の光強度プロファイルデータを生成すると、光強度プロファイルデータを記憶部１０３に記憶させる。この後は、上記第１の実施形態の光分析装置１と同様にして、試料１０の分析が行われる。

　本実施形態の光分析装置１Ｂによれば、標準試料を用いた光強度プロファイルデータの取得する動作が行われた後は、上記第１の実施形態の光分析装置１と同様な分析が行えるため、光照射によってマーカー粒子の位置検出を行う場合に、迅速な測定が行える。
　さらに、本実施形態によれば、光強度プロファイルデータとして、光分析装置１Ｂで発生する扁平ビーム部ＬＦの光強度プロファイルの実測値が用いられる。光分析装置１Ｂによれば、より正確な補正が可能になるため、測定精度が向上できる。
　特に、光源部２、ビーム整形部４などの経年変化が生じるなどして、扁平ビーム部ＬＦの光強プロファイルが変化しても、正確な測定を続けることができる。

　なお、上記各実施形態の説明では、試料１０が固定され、扁平ビーム部ＬＦのみが移動する相対移動部を有する例で説明した。しかし、相対移動部としては、ＬＦの照射位置が固定され、試料１０が扁平ビーム部ＬＦの短軸方向に移動する構成が用いられてもよい。例えば、試料保持部５をＺ軸方向に移動可能に構成し、扁平ビーム部ＬＦの位置を固定すればよい。この場合、例えば、ビーム偏向器３を削除して、光ビームＬ１をビーム整形部４のレンズ光軸に入射させる構成が使用可能である。
　さらに、試料１０と扁平ビーム部ＬＦとの両方が移動する相対移動部が構成されてもよい。
　このように、相対移動部の構成は、上述のビーム偏向器３には限定されない。

　上記各実施形態の説明では、扁平ビーム部を形成するビーム整形部４としてシリンドリカルレンズが用いられる場合の例で説明した。しかし、ビーム整形部４は、シリンドリカルレンズには限定されない。例えば、トロイダルレンズなどように、長軸方向および短軸方向にパワーを有する光学素子によって扁平ビーム部が形成されてもよい。

　上記各実施形態の説明では、光分析装置の測定領域が扁平ビーム部の走査範囲である場合の例で説明した。しかし、試料１０をＸ軸方向またはＹ軸方向に移動して複数回の測定が行われることによって、より広範囲の測定が行われてもよい。

　上記第２の実施形態の説明では、基準試料を用いて光強度プロファイルデータが取得される場合の例で説明した。しかし、光検出センサを扁平ビーム部の光路中に配置することによって、扁平ビーム部の光強度プロファイルを光学的に測定する光強度プロファイルデータ取得部が設けられてもよい。

　上記第１の実施形態の説明では、図６、７に示すフローに沿って光分析が行われる場合の例で説明した。しかし、各ステップにおいて並行的に実行可能な動作は並行して行われてもよい。
　さらに、図６、７に示すフローは、マーカー粒子の通過位置ごとに連続して実行できるステップは、マーカー粒子の通過位置ごとに連続して実行されてもよい。

　以上、本発明の好ましい各実施形態を説明したが、本発明はこれら各実施形態に限定されることはない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。
　また、本発明は前述した説明によって限定されることはなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

　上記各実施形態によれば、光照射によってマーカー粒子の位置検出を行う場合に、迅速な測定が行える光分析装置、光分析方法、およびプログラムを提供できる。

　１、１Ａ、１Ｂ　　光分析装置
　３　　ビーム偏向器（相対移動部）
　４　　ビーム整形部
　５　　試料保持部
　６　　テレセントリック光学系
　７　　撮像部（光検出部）
　８、８Ａ、８Ｂ　　制御ユニット
　９　　記憶媒体
　１０　　試料（被検試料）
　１０３　　記憶部
　１０４、１０４Ａ　　空間位置検出処理部（位置検出部）
　１０５　　測定情報生成部
　１０６　　装置制御部
　１０７　　光強度プロファイルデータ取得部
　ＬＦ　　扁平ビーム部
　Ｍ　　マーカー粒子

Claims (9)

1. 　マーカー粒子を発光させる光ビームを発生する光源部と、
   　前記光ビームの少なくとも一部によって扁平ビーム部を形成するビーム整形部と、
   　前記マーカー粒子を含む被検試料および前記扁平ビーム部の少なくとも一方を移動することにより、前記被検試料と前記扁平ビーム部とを前記扁平ビーム部の短軸方向に相対移動させる相対移動部と、
   　前記短軸方向において前記扁平ビーム部と対向して配置され、前記被検試料における発光光の光強度と、前記短軸方向に直交する平面における前記発光光の発光位置と、を検出する光検出部と、
   　前記相対移動部による前記扁平ビーム部の相対移動量の情報と、前記光検出部による前記光強度および前記発光位置の情報と、に基づいて、前記被検試料における前記マーカー粒子の空間位置の検出が可能な位置検出部と、
   を備える、光分析装置。
2. 　前記位置検出部は、
   　前記扁平ビーム部の相対移動に伴って生じる前記発光位置における前記光強度の変化に基づいて、前記マーカー粒子の前記空間位置を算出する、
   請求項１に記載の光分析装置。
3. 　前記扁平ビーム部における少なくとも前記短軸方向と直交する長軸方向における光強度分布情報を記憶する記憶部をさらに備え、
   　前記位置検出部は、
   　前記記憶部に記憶された前記光強度分布情報に基づいて、前記光検出部からの前記光強度の情報を補正する、
   請求項２に記載の光分析装置。
4. 　前記位置検出部は、
   　前記空間位置の情報に基づいて、前記マーカー粒子の個数を計数する、
   請求項１～３のいずれか１項に記載の光分析装置。
5. 　前記位置検出部は、
   　前記空間位置の情報に基づいて、前記マーカー粒子が付着する物質の体積を測定する、
   請求項１～４のいずれか１項に記載の光分析装置。
6. 　前記位置検出部は、
   　前記空間位置の情報に基づいて、複数の前記マーカー粒子の間の距離を測定する、
   請求項１～５のいずれか１項に記載の光分析装置。
7. 　前記相対移動部は、
   　前記被検試料内における前記マーカー粒子の拡散移動速度よりも高速で、前記扁平ビーム部を相対移動させる、
   請求項１～６のいずれか１項に記載の光分析装置。
8. 　光ビームによって発光するマーカー粒子を含む被検試料の内部に扁平ビーム部を有する前記光ビームを照射することと、
   　前記被検試料に対して前記扁平ビーム部を前記扁平ビーム部の短軸方向に相対移動することと、
   　前記短軸方向における前記扁平ビーム部の相対移動中に、前記被検試料からの発光光の光強度および前記短軸方向に直交する平面における前記発光光の発光位置を検出することと、
   　前記扁平ビーム部の相対移動量と、前記光強度および前記発光位置と、に基づいて、前記被検試料における前記マーカー粒子の空間位置の検出を行うことと、
   を含む、光分析方法。
9. 　光ビームによって発光するマーカー粒子を含む被検試料の内部に、扁平ビーム部を前記扁平ビーム部の短軸方向に走査して取得される、前記短軸方向から見た平面における光強度分布データを取得する第１のステップと、
   　前記光強度分布データから、前記平面における位置座標を固定した一次元の時系列データを取得する第２のステップと、
   　前記位置座標における前記時系列データに対して前記扁平ビーム部の光強度プロファイルに基づいて補正処理を行う第３のステップと、
   　補正処理された前記時系列データから前記マーカー粒子の空間位置を推定する第４のステップと、
   を、コンピュータに行わせるためのプログラム。

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