JP2016206652A - 試料の３次元構造の撮像方法及び顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

【課題】局在系顕微鏡法において演算処理を複雑化させることなく簡単に試料の３次元構造の撮像を可能とする技術を提供する。【解決手段】試料の３次元構造を撮像する方法であって、所定の波長の光により励起した場合に蛍光性を有する第１の状態と蛍光性を有しない第２の状態とをスイッチング可能な物質により試料の構造をラベリングする。所定の波長の光により照明光学系を用いて物質を照明し、第１の状態にある物質の少なくとも一部を励起する。励起された物質を結像光学系を用いて結像する。結像する工程において生じる視差を有する複数の画像を取得する。複数の画像における物質の試料内における光軸と垂直な面内方向の位置を特定する。複数の画像における物質の試料内における面内方向の位置を用いて、物質の試料内の光軸方向の位置を特定する。物質を励起する工程から物質の光軸方向の位置を特定する工程までを繰り返し、前記試料全体の３次元構造を得る。【選択図】図２

Description

本発明は、超解像顕微鏡法による試料の３次元構造の撮像方法に関する。

超解像顕微鏡法により、可視光の回折限界を超える高分解能が達成できることが知られている。超解像顕微鏡法の１つである局在系顕微鏡法では、視野内の蛍光物質を励起すると、物質から蛍光がランダムに放出される。これを結像光学系を用いて撮像素子上に複数回に分けて結像させてそれぞれの画像の輝点の位置情報を求める。そして、各画像で検出された輝点の情報を１つの画像に重ね合わせることにより、可視光の波長による分解能を超える微細構造の画像を得る。

従来より、局在系顕微鏡法を用いて試料の３次元画像を得る技術も存在している。
例えば、非特許文献１は、シリンドリカルレンズを用いた方法である。シリンドリカルレンズを用いる方法では、シリンドリカルレンズを光路上に配置することで発生する非点収差を利用する。すなわち、非点収差によって試料からの光は、楕円の形状となり、ｚ方向の座標により、楕円率は変化する。このことから、楕円率よりｚ方向の位置、すなわち高さの情報を得て、局在系顕微鏡法により得たｘｙ方向の画像にｚ方向の高さ情報を加えて３次元画像を生成する。

非特許文献２は二重らせんを用いる方法である。二重らせん（double helix）を用いる方法では、位相変調をおこなうことによりＰＳＦ（Point Spread Function、点拡がり関数）を二重らせん形状とする。このため、あるｚについてのｘｙ面の画像には、２点が映り込み、２点の回転角は、ｚ方向の座標によることとなる。こうして、２点の回転角とｚ方向の位置すなわち高さの情報との関係から高さ情報を得て、局在系顕微鏡法により得たｘｙ方向の画像にｚ方向の高さ情報を加えて３次元画像を生成する。

"Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy", Science, 2008 February 8, Vol.319 no.5864 pp.810-813 "Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function", PNAS, 2009 January 9, Vol.106 pp.2995-2999

上記のシリンドリカルレンズや二重らせんを用いて局在顕微鏡法による３次元画像を生成する方法では、通常の局在顕微鏡法のように、ガウシアンフィッティングや重心検出により輝点のｘｙ位置を求めることができない。すなわち、ｚ位置によりＰＳＦ形状が変わることから、輝点のｘｙ位置を求めるためのフィッティング等の算出処理が複雑になってしまう。

また、局在系顕微鏡法では、輝点密度が低いと数多くの画像が必要となるため、撮像時間が増大する。そのため、撮像時間を短縮しようとすると蛍光物質のラベリング（すなわち蛍光標識すること）などの実験条件を調整して輝点密度が高くなるようにする必要があり、同様に輝点のｘｙ位置を求めるためのフィッティング等の算出処理が複雑になってしまう。

本発明は、局在系顕微鏡法において、演算処理を複雑化させることなく、簡単に試料の３次元構造の撮像を可能とする技術を提供することを目的とする。また、輝点密度が高い場合においても演算処理を複雑化させることなく、簡単に試料の３次元構造の撮像を可能とする技術を提供することを第２の目的とする。

本発明の一態様に係る試料の３次元構造を撮像する方法によれば、所定の波長の光により励起した場合に蛍光性を有する第１の状態と蛍光性を有しない第２の状態とをスイッチング可能な物質により、前記試料の構造をラベリングする工程と、前記所定の波長の光により照明光学系を用いて前記物質を照明し、前記第１の状態にある物質の少なくとも一部を励起する工程と、前記励起された物質を結像光学系を用いて結像する工程と、前記結像する工程において生じる視差を有する複数の画像を取得する工程と、前記複数の画像における前記物質の前記試料内における光軸と垂直な面内方向の位置を特定する工程と、前記複数の画像における前記物質の前記試料内における前記面内方向の位置を用いて、前記物質の前記試料内における前記光軸方向の位置を特定する工程と、前記物質を励起する工程から前記物質の前記試料内における前記光軸方向の位置を特定する工程までを繰り返し、前記試料全体の３次元構造を得る工程と、を有することを特徴とする。

本発明によれば、局在系顕微鏡法において、演算処理を複雑化させることなく、簡単に試料の３次元構造を撮像することができる。また、輝点密度が高い場合においても演算処理を複雑化させることなく、簡単に試料の３次元構造の撮像することができる。

ガリレオ式平行光学系を搭載した双眼実体顕微鏡の概略構成を示す。 ３次元超解像画像を得る方法について説明する図である ＴＩＲＦ顕微鏡装置の概略構成図である。 偏光板を用いる場合の顕微鏡装置の概略構成図である。 偏光板を用いる場合の他の顕微鏡装置の概略構成図である。 第１の実施形態に係る顕微鏡装置による試料の３次元構造の撮像処理を示したフローチャートである。 第２の実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成図である。 第２の実施形態に係る顕微鏡装置の他の概略構成図である。 シート照明を適用した第２の実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成図である。 偏心位置を切り替え可能な顕微鏡装置の概略構成図である。 ディスクスキャン方式を採用した顕微鏡装置の概略構成図である。 シート照明を適用した顕微鏡装置の概略構成図である。 第３の実施形態に係る顕微鏡装置による試料の３次元構造の撮像処理を示したフローチャートである。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
＜第１の実施形態＞
（ガリレオ式顕微鏡）
図１は、本実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成図である。図１においては、ガリレオ式平行光学系を搭載した双眼実体顕微鏡の概略構成を示す。

まず、試料は、所定の波長により蛍光性を有する第１の状態と、蛍光性を有しない第２の状態とをスイッチング可能な物質により、その構造がラベリングされている。

光源２からは、所定の波長の光が発せられる。光源２から発せられた光は、照明光学系３を通して標本面５に照射される。励起光は、ダイクロイックミラー（ＤＭ）６にて反射して、対物レンズ４を通して標本面５に照射される。励起光が照射されると、試料をラベリングしている物質の一部、すなわち、第１の状態にある物質が励起される。この点については、以降に説明する顕微鏡装置においても同様である。

励起された物質からは、蛍光が発せられ、２つの結像レンズ７Ａ、７Ｂそれぞれを通してカメラ８に入射する。カメラ８は、結像レンズ７Ａ、７Ｂの結像位置に配置されている。こうして、カメラ８の撮像素子により試料の画像信号が取得され、得られた画像信号は、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）９等の情報処理装置に転送される。ＰＣ９は、カメラ８から転送された画像信号に対して必要な処理を施し、試料の超解像画像を得る。

すなわち、標本面５においては蛍光物質が励起されてランダムに光るため、カメラ８が複数回に渡り画像を撮像していくと、各タイミングで光る輝点の画像を得ることとなる。ＰＣ９では、こうして得られる複数の画像の各輝点のＸＹ面上での位置情報を重ね合わせて１枚の画像を生成する。これにより、通常の顕微鏡装置の光の波長による分解能を超える高い分解能で試料の構造を撮像することができる。

ここで、図１に示す顕微鏡装置は、双眼実体顕微鏡であり、試料内の構造からの光を分割した２つの光路（光路１０Ａ、１０Ｂ）の間には、視差が生じている。このため、本実施形態に係る顕微鏡装置では、それぞれ結像レンズ７Ａ、７Ｂを通じて得られる２枚の画像（以下においては画像対という）にある視差を利用して、試料のＺ方向の位置情報すなわち試料の高さ情報を演算する。これについて、図２を参照して説明する。

図２は、本実施形態に係る顕微鏡装置により３次元超解像画像を得る方法について説明する図である。
励起光により物質からランダムに蛍光が発せられることを利用すると、高分解能で試料のＸＹ方向構造を得ることができる。なお、Ｘ方向及びＹ方向の構造、すなわち輝点の位置情報を演算する際には、公知のマルチエミッタ対応のアルゴリズムを用いて演算する構成としてもよい。マルチエミッタ対応のアルゴリズムとしては、ベイズ推定、圧縮センシング等が挙げられる。上記のとおり、本実施形態に係る顕微鏡装置は、取得した画像対の視差を利用して試料のＺ方向の位置情報を演算し、これを公知のアルゴリズムの適用等により得られるＸＹ方向の構造に加えて、試料の３次元構造の超解像画像のデータを得る。

具体的には、ｎ＝ｋのタイミングで撮像して得られた画像対（画像１、２）の視差Δｘからこの視差をＺ方向の位置情報に変換し、ｎ＝ｋにおいて撮像された輝点の高さ情報とする。図２に示す例では、Ｚ方向の高さ情報をスケールにしたがって表している。

図２においては、説明の簡単のため、ｎ＝ｋのタイミングで得られた画像対のうち、１つの輝点についての視差Δｘを示しているが、各輝点につき視差を求め、これからＺ方向の位置情報に変換することにより、画像中の各輝点の高さ情報を得る。

同様に、次のタイミングｎ＝ｋ＋１で撮像して得られた画像対についても、視差からＺ方向の位置情報に変換して、ｎ＝ｋ＋１において得られた画像対中の輝点の高さ情報を得る。

このように、従来の超解像顕微鏡法と同様に複数回の撮像を行い、それぞれの撮像タイミングｎにて得られたＸ、Ｙ及びＺ方向の位置情報を重ね合わせて１つの画像を生成することにより、試料の超解像の３次元形状画像を得る。

従来における局在系顕微鏡法によれば、超解像の３次元形状の画像を得ようとすると、Ｘ、Ｙ及びＺ方向の位置情報を求めるための演算処理が非常に複雑なものとなっていた。しかし、本実施形態によれば、視差のある画像対のそれぞれからＺ方向の位置情報を求めて、従来と同様に複数回撮像を行って得られるＸ及びＹ方向の位置情報と合わせる処理を実施するのみで、試料全体の高分解能での３次元構造の撮像が可能となる。すなわち、演算処理を複雑化させることなく、簡単に３次元の超解像画像の生成が可能となる。

ここで、局在系顕微鏡法で撮像枚数を減らして撮像時間の短縮を図るため、実験条件を調整して輝点密度を高くした場合について説明する。
各輝点位置を精度良く求めるアルゴリズムは、”Simultaneous multiple-emitter fitting for single molecule super-resolution imaging”, Biomedical Optics Express, 2011 May 1, Vol.2 pp.1377-1393等に知られている。解析領域内に複数の輝点が含まれる場合でも対応可能なアルゴリズムは、マルチエミッタ対応アルゴリズムと呼ばれる。このアルゴリズムを適用した場合には、各輝点が他の輝点と十分に分離されていない状態においても、各輝点の位置を検出することが可能となる。そのため一度の撮像で多数の輝点位置を求めることができ、超解像画像を得るために必要な合計撮像回数を少なく抑えることが可能になる。このようなマルチエミッタ対応のアルゴリズムの例としては、ベイズ推定、圧縮センシング等がある。

上述のマルチエミッタ対応のアルゴリズムを用いてＸ方向及びＹ方向の位置情報を演算すると、輝点を高密度で検出することができる。これにより、超解像画像の撮像時間を短縮できる。これに画像対の視差からＺ方向の位置情報を演算してマルチエミッタ対応のアルゴリズムで求めたＸ方向及びＹ方向の位置情報とあわせて用いることで、高密度撮像時間を短縮しつつ、簡単な演算で試料の３次元構造を得ることが可能となる。

なお、上記においてランダムに蛍光を発する機構としては、ＰＡＬＭ、ＳＴＯＲＭ、ｄＳＴＯＲＭ、自発ブリンキングなど既存の任意の方法を用いることができる。また、輝点密度が高い状態とは、蛍光を発光可能な状態（第一の状態）にある物質の少なくとも一部が第一の状態にある最近傍の物質と結像の空間分解能以内の距離で励起される状態である。

上記においては、図１のガリレオ式顕微鏡を例に説明しているが、本実施形態に係る局在系顕微鏡法における３次元の超解像画像を生成する方法は、他の方式の顕微鏡装置によっても実現することができる。以下に、具体的に説明する。

（ＴＩＲＦ（Total Internal Reflection Fluorescence、全反射照明）顕微鏡）
図３は、ＴＩＲＦ顕微鏡装置の概略構成図である。
ＴＩＲＦ顕微鏡では、光源２から発せられた光は、照明光学系３を通して励起される。励起光は、ＤＭ６を通して、対物レンズ４の後側焦点面（瞳面）の光軸からそれた位置に集光して、標本面５に照射される。このとき標本面５において、全反射照明となるように配置される。ＴＩＲＦ顕微鏡では、結像レンズ７Ａ、７Ｂのそれぞれを透過した光をカメラ８の撮像素子にて撮像して得られる２つの画像には、視差が存在することとなる。これより、図１のガリレオ式顕微鏡と同様に、ＰＣ９において、視差のある画像対を得ることができる。

各輝点の視差ΔｘをＺ方向の位置情報に変換して各輝点の高さ情報とし、複数の画像対に対して同様に高さ情報を求めていくことにより、試料の３次元の超解像画像を得ることができる。その方法については、上記のガリレオ式顕微鏡と同様であり、図２を参照して説明したとおりである。

なお、ＴＩＲＦ顕微鏡では、結像の光軸方向に関して有限の範囲のみを照明するため、標本面５近傍の物質のみが励起される。このため、試料がＺ方向に所定の厚み以上の厚い形状である場合には、焦点面外からの背景光を抑制できるＴＩＲＦ顕微鏡が好適である。

（偏光板の使用による方式）
図１のガリレオ式顕微鏡や図３のＴＩＲＦ顕微鏡の他にも、顕微鏡の光学系の構成によって視差のある画像を得て、同様に３次元形状画像を得ることも可能である。
図４は、偏光板を用いる場合の顕微鏡装置の概略構成図である。図４の光路図に示すように、光源２から発せられ、照明光学系３により励起された励起光が標本面５に照射されると、標本面５から発せられた蛍光は、ＤＭ６を透過して、所定の方向に偏光した光のみが偏光板１１Ａ、１１Ｂを透過する。実施例では、一方の偏光板である図４の偏光板１１Ａが、ｓ偏光のみを透過させ、他方の偏光板である偏光板１１Ｂが、ｐ偏光のみを透過させる。こうして、偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）１２により偏光成分ごとに分離された光が、２台のカメラ８Ａ、８Ｂのそれぞれに入射する。カメラ８Ａ、８Ｂのそれぞれにおいてはそれぞれｓ偏光成分またはｐ偏光成分の光を撮像し、ＰＣ９は、カメラ８Ａ、８Ｂから転送された画像信号より、ｓ偏光成分またはｐ偏光成分の画像を生成する。実施例では、カメラ８Ａがｓ偏光成分の光を、カメラ８Ｂがｐ偏光成分の光を撮像し、ＰＣ９は、カメラ８Ａ及び８Ｂから転送された画像信号よりそれぞれｓ偏光成分及びｐ偏光成分の画像を生成する。

ここで、ｓ偏光成分及びｐ偏光成分の画像は、それぞれ異なった瞳位置を通過して結像するため、視差が存在する。したがって、図４の構成の顕微鏡装置によっても、結像の工程において生じる視差を用いて、複数の画像対を取得して、上記の図２で説明した方法により試料の３次元の超解像画像を得ることができる。

図５は、偏光板を用いる場合の他の顕微鏡装置の概略構成図である。図５に示す顕微鏡装置は、図４のそれと比較して、１台のカメラ８でｐ偏光及びｓ偏光の２つの偏光成分の撮像を行う点で異なる。

図４の構成の顕微鏡と同様に、偏光板１１Ａを透過したｓ偏光成分の光及び偏光板１１Ｂを透過したｐ偏光成分の光は、ＰＢＳ１２で分離されて、それぞれミラー１８Ａ及びミラー１８Ｂで反射し、１台のカメラ８に入射する。図５のカメラ８は、ｓ偏光成分及びｐ偏光成分の視差の存在する画像対を同時に撮像することができる。したがって、図４の構成の顕微鏡と同様に、図２で説明した方法により、複数の画像対を取得して、試料の３次元の超解像画像を生成することができる。

図６は、本実施形態に係る顕微鏡装置による試料の３次元構造の撮像処理を示したフローチャートである。図６は、上述の同時に視差のある画像対を取得する構成の顕微鏡装置が、試料全体の３次元の超解像画像のデータを得るまでの動作フローを示す。

まず、ステップＳ１で、観察に使用する物質を選択して、選択した物質により、試料の構造をラベリングする。ステップＳ２で、物質の一部、すなわち、第１状態にある物質を励起して、ステップＳ３で、結像レンズ７を用いて、励起された物質から発せられた蛍光をカメラ８の撮像素子に結像させる。これにより、視差のある画像対が取得される。ステップＳ４で、撮像が終了したと判定されるまで、ステップＳ２の励起の工程とステップＳ３の結像の工程を複数回繰り返す。撮像が終了したと判定されると、ステップＳ５に進む。

ステップＳ５で、各画像中の輝点のＸ方向及びＹ方向の位置情報を演算する。そして、ステップＳ６で、画像対ごとに、ステップＳ５で求めたＸ方向及びＹ方向の位置情報から視差を求め、これからＺ方向の位置情報を演算する。こうして、Ｘ、Ｙ及びＺ方向の位置情報を取得すると、処理を終了する。

なお、図６においては、まずステップＳ２〜ステップＳ４までの処理で複数の画像対を取得し、その後、ステップＳ５及びステップＳ６で各画像対から輝点のＸ、Ｙ及びＺ方向の位置情報を求めているが、これに限定されるものではない。例えば、画像対を取得するごとに、取得した画像対から輝点のＸ、Ｙ及びＺ方向の位置情報を求め、この動作を繰り返していき、試料全体の３次元構造の画像データを得る構成とすることもできる。

先に図２の説明においても述べたように、図６に示す一連の処理により、複雑な演算を要することなく、簡単な演算で複数の画像対の各輝点のＸ、Ｙ及びＺ方向の位置情報を求めることができ、これにより、高分解能で試料全体の３次元構造を得ることができる。すなわち、試料の３次元の超解像画像を得ることが可能となる。

＜第２の実施形態＞
（長焦点深度化）
先に説明したように、上記の第１の実施形態においては、局在系顕微鏡法にステレオ法による計測を適用して、視差のある画像対を用いることにより、高分解能で３次元構造の撮像を行っている。本実施形態では、第１の実施形態に係る顕微鏡装置に対し、更に焦点深度を増大させる手段を設けている点で異なる。これについて、図面を参照して具体的に説明する。

図７は、本実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成図である。
本実施形態に係る顕微鏡装置の構成の上記第１の実施形態のそれとの差異点は、図７に示すように、結像光学系にアキシコンレンズ２１を配置していることにある。アキシコンレンズ２１が結像光学系に配置されることで、焦点深度が大きくなる。

超解像顕微鏡法の１つである局在系顕微鏡法では、焦点位置からＺ方向に関して離れているほどボケ光の影響が強くなり（ボケが大きくなり）、局在精度が悪化する。これに対し、図７に示すように、結像光学系にアキシコンレンズ２１を配置すると、顕微鏡装置が長焦点深度化される。すなわち、アキシコンレンズ２１の配置によって、顕微鏡装置のＰＳＦの形状はＺ方向に伸びた形状に変化し、これにより、ボケ像による局在精度の悪化を回避して、厚みのある試料であっても、Ｚ方向の超解像を得ることができる。

ここで、ボケ光による性能劣化と、Ｚ方向の分解能とは、トレードオフの関係にあり、長焦点深度化を図ると、Ｚ方向の分解能は低下することとなる。しかし、本実施形態では、局在系顕微鏡法と組み合わせてステレオ法による計測を行っている。このため、第１の実施形態と同様に複雑な演算を必要としない、公知のマルチエミッタ解析にも対応可能であるという点に加えて、焦点深度の増大によるボケ光の抑制とＺ方向の超解像とを独立に得ることができる、という効果を得る。

なお、図７に示す構成図では、視差のある画像対を得るための光の分割は、アキシコンレンズ２１による長焦点深度化の後に行っている。アキシコンレンズ２１によって結像の焦点深度の増大を誘起された光は、ビームスプリッタ２２により分割され、ミラー１８Ａ、１８Ｂ等により導かれて、カメラ８に入射する。但し、光を分割するタイミングは、これに限定されず、長焦点深度化の前に行ってもよい。

図８は、本実施形態に係る顕微鏡装置の他の概略構成図である。図８に示す構成においては、ビームスプリッタ２２で２分割した後の個別の光路上にそれぞれアキシコンレンズ２１Ａ、２１Ｂを配置する。

図８に示すように、ビームスプリッタ２２により試料からの光を分割した後にアキシコンレンズ２１Ａ、２１Ｂにより個々の焦点深度を増大させた場合であっても、図７の分割前に長焦点深度化させる構成と同様の効果を得ることができる。

なお、上記第１の実施形態においては、各種照明光学系を備える顕微鏡装置について説明しているが、本実施形態に係る顕微鏡装置では、結像光学系にアキシコンレンズ２１を配置することを特徴とするものである。このため、本実施形態のように、結像光学系にアキシコンレンズ２１を配置することにより長焦点深度化させる方法は、第１の実施形態において挙げた各種の顕微鏡装置に対して適用することが可能である。

更には、局在系顕微鏡法にステレオ法による計測を適用した顕微鏡装置に対して更に焦点深度を増大させる構成をとることで、例えば、セクショニング顕微鏡のセクショニング分解能に要求されるレベルを従来と比べて下げること等も可能となる。これについて、図９を参照して説明する。

図９は、シート照明を適用した本実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成図である。
シート照明を適用した顕微鏡装置の具体的な構成及びその作用については、後述する第３の実施形態においても説明するが、シート照明では、励起用対物レンズ４Ａにより励起された光が試料に照明され、検出用対物レンズ４Ｂが蛍光を検出する。励起用対物レンズ４Ａによりレーザー光をシート状に広げて試料の横（図９の上方向）から照明し、これを上から（図９の右方向）から平面を撮影し、試料をＺ方向（図９の上下方向）に動かすことで、厚みのある試料についても観察することが可能となる。

このようなシート照明を適用した顕微鏡装置において、図９に示すようにアキシコンレンズ２１を結像光学系に配置すると、長焦点深度化により、ボケ光の影響による画像の精度の劣化が起きにくくなる。すなわち、画像の背景光が抑制されて、厚みのある試料であっても観察対象とできることから、シート照明を適用した顕微鏡装置等のセクショニング顕微鏡に要求されるセクショニング能のハードルを、アキシコンレンズ２１のない場合と比べて下げることができる。

このほか、先述のＴＩＲＦ（図３参照）や、テンポラルフォーカス光学系あるいはＨｉＬｏ（薄層斜光照明光）を用い、これらを組み合わせた顕微鏡等についても、結像光学系にアキシコンレンズ２１を配置し、長焦点深度化することによる効果を享受することができる。

＜第３の実施形態＞
上記の第１の実施形態においては、顕微鏡装置は、視差のある画像対の撮像を同時に行っている。これに対し、本実施形態においては、複数回に分けて撮像を行って画像対を得ている点で異なる。本実施形態に係る顕微鏡装置も、上記の第１の実施形態と同様に、さまざまな構成をとることが可能である。以下に、図面を参照して具体的に説明する。

（偏心開口の切り替えによる方式）
図１０は、偏心位置を切り替え可能な顕微鏡装置の概略構成図である。
光源２から発せられた光は、照明光学系３により標本面５に照射される。励起光は、標本面５に照射され、励起光により励起された物質から発せられた蛍光は、ＤＭ６を透過して部材１３Ａの偏心開口１４Ａまたは部材１３Ｂの偏心開口１４Ｂを透過してカメラ８にて撮像される。

部材１３Ａ、１３Ｂには、それぞれ光軸に関して図１０においては上側及び下側に、偏心開口１４Ａ、１４Ｂが設けられている。ＰＣ９は、光路上に配置される２枚の部材１３Ａ、１３Ｂを切り替える。各部材には偏心開口１４Ａ、１４Ｂが設けられており、それぞれ異なった瞳位置で光線を透過させる。透過した光は、結像レンズ７にて結像され、カメラに入射する。カメラ８の撮像素子は、部材１３Ａ、１３Ｂの偏心開口１４Ａ、１４Ｂをそれぞれ透過した光を撮像する。

このような構成を備えることで、図４の２枚の偏光板１１Ａ、１１Ｂを備える構成の顕微鏡装置と同様に、視差のある画像対を得ることができる。ここで、視差のある２つの画像の撮像は、輝点の検出精度等の観点からは、第１の実施形態のように、同時であることが好ましい。しかし、２つの画像の撮像間隔がミリ秒程度であれば、比較的高精度で画像対を取得することが可能である。したがって、図１０の構成の顕微鏡装置であっても、撮像により複数の画像対を取得して、上記の第１の実施形態と同様に、視差から各輝点のＺ方向の位置情報を求めていくことで、演算処理を複雑化させることなく、簡単に試料の３次元の超解像画像を得ることが可能である。

（ディスクスキャン方式）
図１１は、図１０の構成に更にディスクスキャン方式を採用した顕微鏡装置の概略構成図である。
光源２から発せられた光は、軸１９を中心に回転するマイクロレンズアレイ１６及び回転ディスク１５を通して対物レンズ４に入射する。回転ディスク１５には、多数のピンホールがらせん状に配置されている。マイクロレンズアレイ１６にも、回転ディスク１５のピンホールとそれぞれが対になるよう、らせん状にマイクロレンズが配置されており、これにより、光源２から発せられた光をピンホールに集光する。

回転ディスク１５（及びマイクロレンズアレイ１６）を軸１９中心に回転させると、多数のピンホールを通過した光が順次対物レンズ４を通じて標本面５に照射される。これにより、標本面５上を走査した場合と同様の効果が得られ、カメラ８においては、高速で撮像を行うことができる。

図示するとおり、図１１の構成においても、図１０と同様に、それぞれ偏心開口１４Ａ、１４Ｂを有する部材１３Ａ、１３Ｂが光路上に設けられている。ＰＣ９の制御にしたがって光路上に配置する部材１３Ａ、１３Ｂを切り替えて撮像することで、図１０の顕微鏡装置と同様に、それぞれが異なった瞳位置で光線を透過させるため、視差のある画像対を得ることができる。したがって、ディスクスキャン方式を採用する顕微鏡装置であっても、図１０の顕微鏡装置と同様の効果を得ることができる。

ただし、ディスクスキャン方式では、光軸方向に関して有限の範囲のみを結像する。このため、試料がＺ方向に所定の厚み以上の形状である場合には、ディスクスキャン方式を採用した顕微鏡が好適である。

なお、図１１においては、図１０の構成にディスクスキャン方式を採用した場合の顕微鏡装置を例示するが、これに限定されるものではない。例えば、第１の実施形態に係る顕微鏡装置にディスクスキャン方式を用いることも可能である。

（シート照明）
図１２は、図１０の構成に更にシート照明を適用した顕微鏡装置の概略構成図である。
これまでに説明してきた顕微鏡装置では、対物レンズ４が励起光の照射と蛍光の検出とを行っている。これに対し、シート照明２０では、励起光の照射については励起用対物レンズ４Ａが行い、蛍光の検出については励起用対物レンズと垂直に配置されている検出用対物レンズ４Ｂが行う。図１２のシリンドリカルレンズ１７は、励起光ビームを絞り、試料面（図１２においては図示を省略）においてシート状の照明をするために設けられている。

シート照明２０を採用する顕微鏡装置であっても、図１０や図１１に示す構成の顕微鏡装置と同様に、開口板１３Ａ、１３Ｂを切り替えてそれぞれの偏心開口１４Ａ、１４Ｂを透過した成分からそれぞれ画像を得ることで、視差のある画像対を得る。シート照明２０を用いることで、シート状の励起光が試料に照射されるため、試料が受けるダメージを抑えつつ、試料の３次元の超解像画像を生成することができる。

シート照明２０は、結像の光軸方向に関して有限の範囲のみを照明するため、標本面５近傍の物質のみが励起される。このため、試料がＺ方向に所定の厚み以上の薄い形状である場合には、シート照明２０を用いる顕微鏡が好適である。

なお、図１２においては、図１０の構成にシート照明２０を適用した場合の顕微鏡装置を例示するが、これに限定されるものではない。例えば、第１の実施形態に係る顕微鏡装置にシート照明２０を適用することも可能である。

図１３は、本実施形態に係る顕微鏡装置による試料の３次元構造の撮像処理を示したフローチャートである。図１３は、上述の複数回に分けて撮像を行って視差のある画像対を得る構成の顕微鏡装置が、試料全体の３次元の超解像画像のデータを得るまでの動作フローを示す。

上記の第１の実施形態に係る顕微鏡装置の動作フローを示す図６と比較すると、ステップＳ１１〜ステップＳ１３までの処理は、それぞれ図６のステップＳ１〜ステップＳ３の処理と同様である。

ステップＳ１４で、Ｚ方向の位置情報の演算に必要な視差のある画像対を取得済みであるか否かを判定する。ＰＣ９において部材１３Ａ、１３Ｂの切り替え制御を行ったか否かに基づき判定することができる。画像の取得が済んでいない（ステップＳ１４でＮｏの）場合には、ステップＳ１５に進み、画像に視差を与えるための制御、すなわち、光路上に配置されている部材１３Ａと部材１３Ｂとを切り替えるための制御を実施し、ステップＳ１２に戻る。画像対の取得が済んでいる（ステップＳ１４でＹｅｓの）場合は、ステップＳ１６に進む。

ステップＳ１６以降の処理については、図６のステップＳ４以降の処理と同様である。
図１３に示す一連の処理によっても、図６の同時に画像対を取得する場合と同様の効果を得ることができる。

図１３についても、図６と同様に、例えば、画像対を取得するごとに、取得した画像対から輝点のＸ、Ｙ及びＺ方向の位置情報を求め、この動作を繰り返していき、試料全体の３次元構造の画像データを得る構成とすることもできる。

本発明は、上述した実施形態そのままに限定されるものではく、実施段階でのその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化することができる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合わせにより、種々の発明を形成することができる。例えば、実施形態に示される全構成要素を適宜組み合わせても良い。更に、異なる実施形態にわたる構成要素を適宜組み合わせてもよい。このような、発明の趣旨を逸脱しない範囲内において種々の変形や応用が可能であることはもちろんである。

２ 光源
３ 照明光学系
４、４Ａ、４Ｂ 対物レンズ
５ 標本面
６ ダイクロイックミラー
７、７Ａ、７Ｂ 結像レンズ
８ カメラ
９ ＰＣ
１０Ａ、１０Ｂ 光路
１１Ａ、１１Ｂ 偏光板
１２ 偏光ビームスプリッタ
１４Ａ、１４Ｂ 偏心開口
１５ 回転ディスク
１６ マイクロレンズアレイ
１７ シリンドリカルレンズ
１８Ａ、１８Ｂ ミラー
１９ 軸
２０ シート照明
２１ アキシコンレンズ

Claims (11)

1. 試料の３次元構造を撮像する方法であって、
   所定の波長の光により励起した場合に蛍光性を有する第１の状態と蛍光性を有しない第２の状態とをスイッチング可能な物質により、前記試料の構造をラベリングする工程と、
   前記所定の波長の光により照明光学系を用いて前記物質を照明し、前記第１の状態にある物質の少なくとも一部を励起する工程と、
   前記励起された物質を結像光学系を用いて結像する工程と、
   前記結像する工程において生じる視差を有する複数の画像を取得する工程と、
   前記複数の画像における前記物質の前記試料内における光軸と垂直な面内方向の位置を特定する工程と、
   前記複数の画像における前記物質の前記試料内における前記面内方向の位置を用いて、前記物質の前記試料内における前記光軸方向の位置を特定する工程と、
   前記物質を励起する工程から前記物質の前記試料内における前記光軸方向の位置を特定する工程までを繰り返し、前記試料全体の３次元構造を得る工程と、
   を有する３次元構造の撮像方法。
2. 前記結像する工程において、結像の焦点深度の増大を誘起させる工程と、
   を更に有することを特徴とする請求項１記載の３次元構造の撮像方法。
3. 前記結像の焦点深度の増大を誘起させる工程は、アキシコンレンズを用いてベッセルビームを生成することによる、ことを特徴とする請求項２記載の３次元構造の撮像方法。
4. 前記複数の画像を取得する工程においては、前記試料からの光を分割して、分割したそれぞれの光を用いることにより、視差のある複数の画像を同時に取得することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の３次元構造の撮像方法。
5. 前記結像の焦点深度の増大を誘起させる工程は、前記試料からの光を分割する工程の前に行うことを特徴とする請求項４記載の３次元構造の撮像方法。
6. 前記結像の焦点深度の増大を誘起させる工程は、前記試料からの光を分割する工程の後に行うことを特徴とする請求項４記載の３次元構造の撮像方法。
7. 前記照明光学系は、結像の光軸方向に有限の厚みを持ち、前記照明光学系の光軸方向に関して有限の範囲を照明することを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の３次元構造の撮像方法。
8. 前記励起する工程において、前記第一の状態にある物質の少なくとも一部は、前記第一の状態にある最近傍の物質と前記結像の空間分解能以内の距離で励起されることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項記載の３次元構造の撮像方法。
9. 前記面内方向の位置は、マルチエミッタ対応のアルゴリズムを適用して解析を行うことにより特定することを特徴とする請求項１から８のいずれか１項記載の３次元構造の撮像方法。
10. 前記結像光学系は、光軸方向の有限の範囲のみを結像させることを特徴とする請求項１記載の３次元構造の撮像方法。
11. 試料の３次元構造を撮像する顕微鏡装置であって、
    所定の波長の光により励起した場合に蛍光性を有する第１の状態と蛍光性を有しない第２の状態とをスイッチング可能な物質により、前記試料の構造をラベリングするラベリング部と、
    前記所定の波長の光により前記物質を照明し、前記第１の状態にある物質の少なくとも一部を励起する照明光学系と、
    前記励起された物質を結像する結像光学系と、
    前記結像光学系により結像する工程において生じる視差を有する複数の画像を取得し、
    前記複数の画像における前記物質の前記試料内における光軸と垂直な面内方向の位置を特定し、
    前記複数の画像における前記物質の前記試料内における前記面内方向の位置を用いて、前記物質の前記試料内における前記光軸方向の位置を特定し、
    前記物質を励起する工程から前記物質の前記試料内における前記光軸方向の位置を特定する工程までを繰り返し、前記試料全体の３次元構造を得る画像処理部と、
    を有する顕微鏡装置。