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WO2016043354A1 - 새로운 알츠하이머 질환 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

새로운 알츠하이머 질환 치료용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2016043354A1
WO2016043354A1 PCT/KR2014/008578 KR2014008578W WO2016043354A1 WO 2016043354 A1 WO2016043354 A1 WO 2016043354A1 KR 2014008578 W KR2014008578 W KR 2014008578W WO 2016043354 A1 WO2016043354 A1 WO 2016043354A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
osmotin
alzheimer
disease
mice
carrier
Prior art date
Application number
PCT/KR2014/008578
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김명옥
윤광호
Original Assignee
경상대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경상대학교 산학협력단 filed Critical 경상대학교 산학협력단
Priority to PCT/KR2014/008578 priority Critical patent/WO2016043354A1/ko
Priority to US15/510,826 priority patent/US20170246245A1/en
Publication of WO2016043354A1 publication Critical patent/WO2016043354A1/ko

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/168—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition, and more particularly to a pharmaceutical composition for treating a new Alzheimer's disease.
  • Dementia disease is a fundamental and core symptom of short-term and long-term memory impairment, and is thought to consist of memory impairment and disorientation resulting from this and a high level of brain dysfunction.
  • AD Alzheimer's dementia
  • 'AD' Alzheimer's dementia
  • 'AD' Alzheimer's dementia
  • 'AD' Alzheimer's dementia
  • acetylcholine, glutamic acid, neuropeptides, and monoamines appear to be impaired, which impairs the function of these neurotransmitters. It is estimated to be the main cause of AD.
  • the eruption conduction AD of the hippocampal nerve cells through the accumulation of old spots outside the cells of the ⁇ -amyloid peptide was observed. It is estimated to be one of the major causes.
  • Korean Patent No. 1308232 discloses a composition for preventing and treating brain injury by alcohol containing osmotin.
  • the present invention is to solve various problems, including the above problems, and to provide a composition for preventing or treating Alzheimer's disease.
  • these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of Alzheimer's disease comprising osmotin as an active ingredient.
  • a health functional food for improving cognitive function and memory including osmotin as an active ingredient.
  • a method of treating Alzheimer's disease in a subject comprising administering a therapeutically effective amount of osmotin to the subject having Alzheimer's disease.
  • a method for improving cognitive function and memory of a subject comprising administering a therapeutically effective amount of osmotin to a subject with Alzheimer's disease.
  • a health functional food for improving the memory and cognitive and memory disorders, including the pharmaceutical composition and Alzheimer's disease that can effectively treat Alzheimer's disease.
  • the scope of the present invention is not limited by these effects.
  • 1 is a graph showing the escape wait time results and the movement route of the Morris Water Maze Test according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of the Morris Water Maze Test according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of the Y-maze spontaneous alternation test according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing Western marker proteins showing synaptic density in hippocampus of control mice administered with carrier only, Alzheimer's disease model mice administered with carrier only (APPsw), and Alzheimer's disease model mice administered with osmotin. It is a photograph showing the result of the blotting analysis.
  • Figure 5 is a label associated with the formation of A ⁇ neural plaques in the hippocampus of control mice administered with carrier only, Alzheimer's disease model mouse (APPsw) administered with carrier only, and Alzheimer's disease model mouse administered with osmotin, according to an embodiment of the present invention. It is a photograph showing the result of Western blotting analysis for the protein.
  • APPsw Alzheimer's disease model mouse
  • osmotin osmotin
  • FIG. 6 shows Western blots for A ⁇ neurons in the cerebral cortex of control mice administered with carrier only, Alzheimer's disease model mice administered with carrier only (APPsw) and Alzheimer's disease model mice administered with osmotin.
  • the photo shows the result of the lotting.
  • Figure 7 is a series of proteins associated with tau phosphorylation in the hippocampus of control mice administered with carrier only, Alzheimer's disease model mouse administered with carrier only (APPsw) and Alzheimer's disease model mouse administered with osmotin according to one embodiment of the present invention. Photo shows Western blotting results for.
  • FIG. 8 is a western block diagram showing the degree of tau phosphorylation in the cerebral cortex of a control mouse administered with a carrier only, an Alzheimer's disease model mouse administered with a carrier (APPsw) and an Alzheimer's disease model mouse administered with an osmotin according to an embodiment of the present invention.
  • the photo shows the result of the lotting.
  • 10 is a graph quantifying the fluorescence signal from the result of step 9. * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01, and *** P ⁇ 0.001.
  • FIG. 11 shows NgR1, GABA B1 R in the DG sector of hippocampus of control mice administered with carrier only, Alzheimer's disease model mice administered with carrier only (APPsw) and Alzheimer's disease model mice administered with osmotin.
  • FIG. 12 is a graph quantifying the fluorescence signal from the result of FIG. 11. * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01, and *** P ⁇ 0.001.
  • FIG. 13 shows NgR1 and GABA B1 R in CA1 sectors of hippocampus of control mice administered with carrier only, Alzheimer's disease model mice administered with carrier only (APPsw) and Alzheimer's disease model mice administered with osmotin.
  • FIG. 14 is a graph quantifying the fluorescence signal from the result of FIG. 13. * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01, and *** P ⁇ 0.001.
  • FIG. 15 shows thioflavones for amyloid necrosis in the hippocampus of control mice administered with carrier only, Alzheimer's disease model mice administered with carrier only (APPsw) and Alzheimer's disease model mice administered with osmotin.
  • FIG. 16 is a graph quantifying the fluorescence signal from the result of FIG. 15. * P ⁇ 0.05 and ** P ⁇ 0.01.
  • Figure 17 illustrates attenuation of the formation of A ⁇ neural plaques in the cerebral cortex of control mice administered with carrier only, Alzheimer's disease model mice administered with carrier only (APPsw) and Alzheimer's disease model mice administered with osmotin according to one embodiment of the present invention. It is a series of immunofluorescence micrographs shown.
  • FIG. 19 is a hippocampus (A) and cerebral cortex (B) of a control mouse administered only a carrier, an Alzheimer's disease model mouse (APPsw) administered with a carrier, and an Alzheimer's disease model mouse administered with an osmotin, according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 21 shows the cell survival rate (A and A) of neurons in the rat fetal hippocampus (A, C, E) and cerebral cortex (B, D, F) neurons treated with various concentrations of osmotin according to an embodiment of the present invention B), cytotoxicity (C and D) and caspase-3 / 7 activity (E and F) analysis graph.
  • 22 is an image summarizing the results of experiments on how Osmotin mitigates Alzheimer's disease according to an embodiment of the present invention.
  • Osmotin is a natural protein isolated from plants and has a chemical structure similar to that of adiponectin, an animal hormone that has lipolytic and antidiabetic functions and has about 150 to 250 amino acids, depending on the individual. It is composed. Osmotin (24 kDa) is a stable protein in the family of Pathogenesis-related proteins (PR-5) homologous to the sugar-testing protein thaumatin and induces intracellular signal transduction in yeast It is known. In addition, it has been reported that the function similar to the protein that inhibits obesity and diabetes in the human body.
  • PR-5 Pathogenesis-related proteins
  • a pharmaceutical composition for the treatment of Alzheimer's disease comprising osmotin as an active ingredient.
  • the osmotin may be purified from a plant, the plant may be a tobacco plant, the osmotin may be composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the amino acid Based on the sequence can be produced by genetic recombination techniques using prokaryotic or eukaryotic cells such as yeast, plant cells, insect cells, mammalian cells.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, or the like.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, patient's age, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to reaction, and usually The skilled practitioner can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment or prophylaxis.
  • a suitable daily dosage is between 100 ⁇ g / kg and 1 mg / kg body weight. Administration may be once a day or may be divided several times over several weeks.
  • the pharmaceutical composition according to the embodiment of the present invention uses a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by those skilled in the art.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • excipients include lactose, sucrose, white sugar, glucose, corn starch, starch, talc, sorbet, crystalline cellulose, dextrin, kaolin, calcium carbonate, silicon dioxide and the like.
  • binder include polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, ethyl cellulose, methyl cellulose, gum arabic, tragacanth, gelatin, shellac, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, calcium citrate, Dextrin, pectin, and the like.
  • the lubricant include magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, hardened vegetable oil, and the like.
  • coloring agent if it is normally permitted to add to a pharmaceutical, all can be used. These tablets and granules can be appropriately coated according to sugar, gelatin coating, and other needs. Moreover, preservatives, antioxidants, etc. can be added as needed.
  • a health functional food for improving cognitive function and memory including osmotin as an active ingredient.
  • the osmotin may be isolated and purified from the plant, the plant may be a tobacco plant, the osmotin may be composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the amino acid Based on the sequence can be produced by genetic recombination techniques using prokaryotic or eukaryotic cells such as yeast, plant cells, insect cells, mammalian cells.
  • a method of treating Alzheimer's disease in a subject comprising administering a therapeutically effective amount of osmotin to the subject having Alzheimer's disease.
  • a method for improving cognitive function and memory of a subject comprising administering a therapeutically effective amount of osmotin to a subject with Alzheimer's disease.
  • mice 8-week-old male C57BL / 6J mice (WT) and transformed C57BL / 6J-Tg (NSE-APPsw) KLAR mice (hereinafter abbreviated as 'APPsw') of the body weight of 23 ⁇ 1.5 g, respectively, are Jackson's It was purchased from the laboratory and the Ministry of Food and Drug Safety (Korea).
  • the breeding conditions of the mice were daytime 16 hours / night 8 hours light cycle, the temperature was maintained at 23 °C, humidity 60 ⁇ 10%, water and food was placed in a condition that can be arbitrarily accessible.
  • osmotin homogeneously purified osmotin from 428 mM NaCl-adaptive cultured tobacco ( Nicotiana tabacum cv. Wisconsin38) cells conventionally reported in the present invention was isolated and used in the present invention (Shah et al. Cell Death & Disease , 5: e1026, 2014).
  • Osmotin was provided as a sterile solution (3 mg / ml, 1 / 8-fold PBS), and activity was determined by IC 50 against Saccharomyces cerevisiae strain BWG1-7a (osmotin concentration at which 50% of the strains were killed upon osmotin treatment). ) was measured at 0.2 ⁇ M.
  • mice Nine month old WT mice (30 ⁇ 1.2 g) and APPsw mice (39 ⁇ 0.8 g) were used. Osmotin was diluted using sterile distilled water (vehicle) and then delivered via intraperitoneal injection (15 mg / kg body weight). For molecular analysis of the osmotin effect in brain tissue, after the behavioral test, each mouse was repeatedly injected with a vehicle or osmotin and sacrificed after 12 hours.
  • a water maze test was performed to analyze hippocampal-dependent learning, including acquisition of spatial memory and long-term spatial memory.
  • the method disclosed previously (Morris, RGM, Learning and Motivation 12, 239-260, 1981) was applied to the following method.
  • Experimental equipment consisting of a circular bath (10 cm in diameter x 40 cm in height) and an escape support (platform (10 cm in diameter)) was prepared, and the water in the bath (temperature 22 ⁇ 1 ° C.) was filled to a height of 26 cm.
  • a hidden 10 cm diameter support was placed at a fixed position approximately 1 cm below the water surface, in the middle of the quadrant, and non-toxic white-soluble dye was added to the water to make it opaque and cloudy.
  • the first 3 days were performed without administration of osmotin or carrier, and 3 days after the start of training, dementia model mice were intraperitoneally injected only with osmotin or vehicle and control mice with vehicle only. And the same training was repeated as above.
  • the support was removed for probe test. The time spent by each experimental animal was recorded in the support quadrant.
  • alteration studies were first performed in untreated mice and then repeated in dementia model mice injected only with osmotin or carrier intraperitoneally. Memory was measured by recording the waiting time to escape from the support (FIG. 1). As a result, the escape latency decreased slowly for all groups and on day 3 the dementia model mice recorded much higher escape latency ( ⁇ 1.8 times) compared to normal mice.
  • the retention time in the quadrant was the largest in the normal mice (control) treated only with the carrier, the dementia model mice administered osmotin showed a medium retention time, the carrier only treatment It was significantly lower in one dementia model mouse.
  • the Y-maze was composed of three arms, each of which had a length of 50 cm, a width of 10 cm, a height of 20 cm, and each of which had a fixed angle of 120 °.
  • Each mouse could explore the white Y-maze, where each mouse was placed in the Y-maze and allowed to acclimate for 10 minutes in the environment prior to the start of the behavioral experiment. The mouse was then positioned in the center of the Y-maze to face the junction of the two arms in a randomly selected direction and allowed to explore the maze for 8 minutes.
  • the change rate calculated as above is considered to be correlated with the spatial memory capacity.
  • a modified Y-maze experiment was first performed on dementia model mice administered with only a carrier. Then, the mice were intraperitoneally administered osmotin or carrier, and the same experiment was repeated to compare the results (FIG. 3). As shown in Figure 3, the dementia model mice recorded a lower rate of change compared to the control as expected, indicating lower spatial memory.
  • the carrier-only group did not cause any significant change in the rate of alteration in both groups (control, normal mice and dementia model mice), whereas the rate of change was significantly higher in the group treated with osmotin in the dementia model mice. Increasing short-term memory disorders were found.
  • the reaction was performed with a secondary antibody to which horseradish peroxidase (HRP) was attached, and then cross-reacting protein was detected with ECL.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the primary antibodies of PARP-1, phospho-CDK5 (Tyr 15), CDK5, SNAP-25, IDE, neprilysin / CD10 (NEP), ⁇ -amyloid, BACE1, and phospho-tau (Ser 413 ) were selected from Santa Cruz Biotech (US).
  • Cognitive memory loss in Alzheimer's dementia is more closely associated with loss of synaptic density in the hippocampus at an early stage of disease than amyloid beta plaques or the appearance of NFT22, 23 (Scheff SW et al., Neurobiol.Aging) , 27 (10): 1372-1384, 2006).
  • Western blotting analysis revealed that the expression levels of presynaptic vesicle membrane-specific proteins, synaptophysin, and SNAP-25 were significantly increased in APPsw mice after osmotin treatment ( 4).
  • Nogo receptors as well as AMPA receptors are known to play an important role in synaptic plasticity.
  • the expression of GABABRs is regulated in part by the interaction of Nogo-66 receptor 1 (NgR1) and its ligand, Nogo-66 (axon-inhibiting N-terminal domain of Nogo A). Therefore, the inventors of the Western blotting analysis of the expression levels of NgR1, Nogo A and GABA B1 R, the expression of NgR1 and Nogo A in the hippocampus of the dementia model (APPsw) mice markedly increased compared to the control mice, GABA B1 Although the expression of R was decreased, it was confirmed that this phenomenon was recovered when osmotin was administered (FIG. 4).
  • Phosphorylation-CREB makes synapses more resistant to the deleterious effects of ⁇ and activates gene expression associated with long-term improvements in learning and memory synaptic function in Alzheimer's model mice. Therefore, the inventors also examined the expression pattern of phosphorylated CREB through Western blotting analysis, and as a result, the amount of phosphorylated-CREB (Ser 133 ) was lower in the carrier-treated APPsw mouse compared to the control group, whereas the APPsw mouse It was confirmed that the expression of phosphorylated-CREB (Ser 133 ) was increased during osmotin treatment (FIG. 4). This molecular level change suggests that osmotin enhances synaptic plasticity, increases neuronal axon regeneration, and enhances synaptic activity in the hippocampus of the Alzheimer's model.
  • amyloid beta oligomers and aggregates become early pathological markers of Alzheimer's disease in brain tissue.
  • the present inventors determined the amount of amyloid precursor protein (APP) and amyloid beta peptides in hippocampal tissue after osmotin administration. Analysis via Western blotting analysis (FIG. 5). The results of FIG. 5 showed that the expression of APP and amyloid beta peptides in hippocampus of APPsw mice was higher than that of control mice when only carrier was administered.
  • APP amyloid precursor protein
  • FIG. 5 The results of FIG. 5 showed that the expression of APP and amyloid beta peptides in hippocampus of APPsw mice was higher than that of control mice when only carrier was administered.
  • IDE insulin degrading enzyme
  • NEP neprilysin
  • BACE1 beta-secreatase 1
  • Phosphorylation in the S / TP motif of the microtubule-associated protein tau is known to be the cause of tau inclusions in paired helical filaments (PHFs) found in the brains of Alzheimer's disease patients ( Noble et al ., Neuron . 38 (4): 555-565, 2003).
  • PPFs paired helical filaments
  • This pathology is known to be induced by ⁇ peptide through upregulation of Cdk5 activity due to the characteristics of neurons in Alzheimer's disease patients.
  • ⁇ peptides are known to induce calpain-mediated protein cleavage to p25, a more potent activator for Cdk5 activity of Cdk5 activating protein p35 (Lee et al ., Nature .
  • Cdk5 is also activated by phosphorylation of Tyr 15 .
  • the present inventors have studied the Alzheimer's disease marker proteins calpain, p25, phosphorylated-Cdk5 (Tyr 15 ), and phosphorylation-in the hippocampus of three experimental groups (control mouse, APPsw mouse administered with carrier only, and osmotin-administered APPsw mouse). Western blotting analysis was performed for tau (Ser 413 ) (FIG. 7), and Western blotting analysis for phosphorylated-tau was performed on the cerebral cortical tissues of the three experimental groups (FIG.
  • mice were fixed transcardially with ice-cold 4% paraformaldehyde. After brain collection, 4% paraformaldehyde was post-fixed for 72 hours and finally transferred to 20% sucrose and left for 72 hours.
  • Brain tissue was embedded with an optimal cutting temperature compound (OCT) under liquid nitrogen and then cut into coronal sections with a thickness of 14 ⁇ m using CM 3050C cryostat (Leica). Tissue sections were enclosed with ProbeOn Plus slides (Fisher, USA). For immunofluorescence analysis, slides were washed twice for 15 minutes in 0.01 M PBS.
  • OCT optimal cutting temperature compound
  • Each section was covered with Proteinase K solution and placed in a wet chamber at 37 ° C. for 5 minutes, after which each section was left in PBS blocking solution containing 5% normal goat serum and 0.3% Triton X-100 for 1 hour. I was. After performing the blocking step, the slides were treated with the primary antibody (1: 100 dilution in the blocking solution) and reacted overnight. Primary antibodies to ⁇ -amyloid, phospho-tau (Ser 413 ), synaptophysin, GABA B1 R, and Nogo-66 receptors were used for the analysis.
  • the washed sections were soaked in 0.25% potassium permanganate for 5 minutes, followed by 1% K 2 S 2 O 5 and It was soaked in 1% oxalic acid for 5 minutes and then soaked in 0.02% thioflavine-S solution for 8 minutes.
  • the brain sections were then rinsed twice in 80% ethanol for 1 minute and washed with slow running tap water for 4-5 minutes. Then, 70, 80, 95% alcohol was continuously immersed in dehydration and soaked in xylene. After encapsulation with coverslips, tissue sections were irradiated with a confocal laser microscope (Flouview FV 1000). All fluorescence signals were quantified using Image J Software (National Institutes of Health, USA) and expressed in integrated optical density (IOD).
  • Nogo receptors are also known to play an important role in synaptic plasticity, and the expression of GABABRs is partially dependent on Nogo-66 receptor 1 (NgR1) and its ligand, Nogo-66 (axon-inhibiting N-terminal). It has been reported to be regulated by the interaction of domain of Nogo A). Therefore, the present inventors investigated the expression of NgR1 in the coronary ammonis 1 (CA1) dentate gyrus (DG) of the hippocampus of APPsw mice compared to control mice by immunofluorescence analysis.
  • CA1 coronary ammonis 1
  • DG dentate gyrus
  • NgR1 As a result, overexpression of NgR1 was observed in CA1 and DG of hippocampus of APPsw mice compared to the control group, and it was confirmed that the expression level of NgR1 was significantly decreased when osmotin was administered to APPsw mice. In particular, in the case of DG, the expression level of NgR1 decreased to the control level. In contrast, GABA B1 R showed the opposite result to NgR1 (FIGS. 11 to 14).
  • amyloid beta ganglia which is known as a cause of Alzheimer's dementia
  • thioflavin S staining known to specifically stain amyloid beta
  • FIG. 16 it was confirmed that A ⁇ peptides and A ⁇ neural plaques could hardly be found in the hippocampus of control mice treated only with carriers, and accumulated mainly in DG and CA1 regions of APPsw mouse hippocampus treated with carriers only.
  • Osmotin-administered APPsw mice reduced the accumulation of total amyloid ⁇ peptides and A ⁇ neural plaques in the DG and CA1 regions of the hippocampus compared to carrier-treated APPsw mice.
  • histological analysis was performed in the cerebral cortex (FIGS. 17 and 18), which also yielded similar results to the Western blotting analysis described above.
  • FIGS. 19 and 20 the inventors analyzed the amount of phosphorylated-tau (Ser 413 ) in the hippocampus and cerebral cortex by immunofluorescence analysis (FIGS. 19 and 20).
  • Figure 19 A is a dye of the p-tau (Ser 413) in the hippocampus results
  • B represents the staining of p-tau (Ser 413) in the cerebral cortex
  • Figure 20 is a graph quantifying the immunofluorescence analysis to be.
  • GD brain tissue from rat embryos 17.5 days after gestational day (GD) for primary culture of developing neurons in the developing cerebral cortex and hippocampus.
  • Aliquots (100 ⁇ L) containing 2 ⁇ 10 4 cells were divided into two 96-well plates containing cell growth DMEM medium containing 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin and at 5% CO 2 , 37 ° C. conditions. Incubated. After 3 days, the medium was completely removed and one plate was added with 100 ⁇ l of new growth medium (plate 1) and the other with growth medium containing 5 mM ⁇ -amyloid peptide (A ⁇ 1-42 , Sigma, USA). Replaced (plate 2).
  • plate 1 Incubated for 24 hours, plate 1 was then replaced with medium supplemented with 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 ⁇ g / ml of osmotin, whereas plate 2 was A ⁇ 1-42 (5 mM) and 0, 0.1, The growth medium was replaced with 0.2 or 0.4 ⁇ g / ml of osmotin.
  • cell survival, cytotoxicity and caspase-3 / 7 activity were measured using the ApoTox-Glo TM Triplex Assay (Promega, USA) kit and Glomax Multi® Detection System (Promega, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • Osmotin up to 0.4 ⁇ M is treated with A ⁇ 1-42 peptide to protect the hippocampus and cortical nerves from the deleterious effects of A ⁇ 1-42 on cell survival, cytotoxicity, and caspase-3 / 7 activity (E and F in Fig. 21).
  • osmotin is nontoxic at the concentration of the in vitro experiments used in this example and protects neurons from neuronal damage induced by A ⁇ , which supports the in vivo experimental results.
  • Each data was expressed as mean ⁇ standard deviation and ANOVA analysis by students' t- test was performed using Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, California). Statistical significance was shown at P ⁇ 0.05. 22 is an image summarizing the results of experiments on how Osmotin mitigates Alzheimer's disease. Osmotin is thought to alter APP processing, synaptic dysfuction, and neurofibrilary tangles through the activity of AMPK.
  • Osmotin according to an embodiment of the present invention not only crosses the blood brain barrier, but has been proved effective in improving cognitive function of dementia model animals, and thus may be usefully used as a therapeutic agent for dementia derived from natural products.
  • SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence of osmotin derived from tobacco ( N. tabacum ).

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Abstract

본 발명은 약학적 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 오스모틴을 유효성분으로 포함하는 새로운 알츠하이머 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

새로운 알츠하이머 질환 치료용 약학적 조성물
본 발명은 약학적 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 새로운 알츠하이머 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
치매질환은 단기간 및 장기간 기억장해가 기본적이며 또한 중핵증상으로 관찰되며, 기억장해와 이것에 기인한 부위감각상실(disorientation) 및 이것에 대한 고도의 뇌기능 장해로 이루어지는 것으로 생각되어 진다.
알츠하이머형 치매증(Alzheimer's dementia, 이하 'AD'로 약칭함)은 운동력과 인지능력 저하의 파행적인 진행과 함께 다양한 심리적, 행동장애 증상이 동반되며 초기의 경미한 증상에서 시작하여 최종적으로 자발적인 개인생활이 불가능할 정도로 진행되어 그 피해가 심각하다. AD에 있어서는, 환자의 아세틸콜린(acetylcholine)계, 글루타민산(glutamic acid)계, 신경펩티드(neuropeptides)계 및 모노아민(monoamine)계에서의 신경전달의 기능저하가 나타나, 이들 신경전달계의 기능 장해가 AD의 주된 원인인 것으로 추정되고 있다. 또한, β-아밀로이드 펩티드(β-amyloid peptide)에 의해 유발된 신경세포 독성작용의 관점으로부터, β-아밀로이드 펩티드의 세포 밖으로의 노인 반점의 집적을 통한 해마 신경세포의 탈락에 의한 발증기전도 AD의 주요 원인 중 하나로 추정되고 있다.
오스모틴 관련 치료용 조성물에 관한 선행문헌을 살펴보면, 대한민국 등록특허 제1308232호에 오스모틴을 포함하는 알코올에 의한 뇌손상 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있다.
그러나 현재까지 알츠하이머병의 진전을 억제하는 치료제는 개발되고 있으나, 이를 제대로 치료할 수 있는 효과적인 치료방법은 개발되지 않고 있는 실정이다. 본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 알츠하이머 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 오스모틴을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머 병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 오스모틴을 유효성분으로 포함하는 인지기능 개선 및 기억력 증진용 건강기능식품이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 오스모틴을 알츠하이머 병에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 알츠하이머병을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 오스모틴을 알츠하이머 병에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 인지기능 개선 및 기억력 증진 방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 알츠하이머 병을 효과적으로 치료할 수 있는 약학적 조성물 및 알츠하이머병을 포함하는 인지 및 기억 장애의 개선 및 기억력 증진용 건강기능식품을 제조할 수 있게 된다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 수중미로실험(Morris Water Maze Test)의 탈출대기시간 결과 및 이동경로를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 수중미로실험(Morris Water Maze Test)의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 Y-미로실험(Y-maze spontaneous alternation test)의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 담체만 투여한 대조군 마우스, 담체만 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스(APPsw) 및 오스모틴을 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스의 해마에서 시냅스 밀도를 나타내는 표지 단백질의 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 담체만 투여한 대조군 마우스, 담체만 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스(APPsw) 및 오스모틴을 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스의 해마에서의 Aβ 신경반의 형성과 관련된 표지 단백질에 대한 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 담체만 투여한 대조군 마우스, 담체만 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스(APPsw) 및 오스모틴을 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스의 대뇌피질에서 Aβ 신경반에 대한 웨스턴 블롯팅 결과를 나타내는 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 담체만 투여한 대조군 마우스, 담체만 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스(APPsw) 및 오스모틴을 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스의 해마에서 tau 인산화와 관련된 일련의 단백질들에 대한 웨스턴 블롯팅 결과를 나타내는 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 담체만 투여한 대조군 마우스, 담체만 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스(APPsw) 및 오스모틴을 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스의 대뇌피질에서 tau 인산화 정도를 확인한 웨스턴 블롯팅 결과를 나타내는 사진이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 담체만 투여한 대조군 마우스, 담체만 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스(APPsw) 및 오스모틴을 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스의 해마에서 Synasptophysin, GABAB1R에 대한 면역형광 현미경 사진이다. 스케일바는 200 μm 및 10 μm이다.
도 10은 상기 9의 결과에서 형광신호를 정량화한 그래프이다. *P<0.05, **P<0.01, 및 ***P<0.001.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따라 담체만 투여한 대조군 마우스, 담체만 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스(APPsw) 및 오스모틴을 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스의 해마의 DG 섹터에서 NgR1, GABAB1R에 대한 면역형광 분석 결과를 나타내는 이미지이다. 스케일바는 200 μm 및 10 μm이다.
도 12는 상기 도 11의 결과에서 형광신호를 정량화한 그래프이다. *P<0.05, **P<0.01, 및 ***P<0.001.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따라 담체만 투여한 대조군 마우스, 담체만 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스(APPsw) 및 오스모틴을 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스의 해마의 CA1 섹터에서 NgR1, GABAB1R에 대한 면역형광 분석 결과를 나타내는 이미지이다. 스케일바는 200 μm 및 10 μm이다.
도 14는 상기 도 13의 결과에서 형광신호를 정량화한 그래프이다. *P<0.05, **P<0.01, 및 ***P<0.001.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따라 담체만 투여한 대조군 마우스, 담체만 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스(APPsw) 및 오스모틴을 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스의 해마 부분에서 아밀로이드 신경반에 대한 티오플라빈 S 염색 결과(thioflavin S staining)와 아밀로이드 베타(amyloid β)에 대한 면역형광 현미경 사진이다. 스케일바는 200 μm, 50 μm, 및 10 μm이다.
도 16은 상기 도 15의 결과에서 형광신호를 정량화한 그래프이다. *P<0.05 및 **P<0.01.
도 17은 본 발명의 일실시예에 따라 담체만 투여한 대조군 마우스, 담체만 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스(APPsw) 및 오스모틴을 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스의 대뇌피질에서 Aβ 신경반의 형성의 감쇄를 나타내는 일련의 면역형광 현미경 사진이다.
도 18은 상기 도 17의 면역형광 분석에서의 형광신호를 정량화한 그래프이다.
도 19는 본 발명의 일실시예에 따라 담체만 투여한 대조군 마우스, 담체만 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스(APPsw) 및 오스모틴을 투여한 알츠하이머 질병 모델 마우스의 해마(A) 및 대뇌피질(B)에서의 인산화 tau(Ser413)의 양을 측정한 면역형광 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 20은 상기 도 19의 결과에서 형광신호를 정량화한 그래프이다. *P<0.05, **P<0.01, 및 ***P<0.001.
도 21은 본 발명의 일실시예에 따라 다양한 농도의 오스모틴이 처리된 백서 태아 해마(A, C, E) 및 대뇌피질(B, D, F) 뉴런에서의 신경세포의 세포생존율(A 및 B), 세포독성(C 및 D) 및 caspase-3/7 활성(E 및 F)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 22는 본 발명의 일실시예에 따라 오스모틴이 어떤 경로를 통해 알츠하이머 질병을 완화 시키는지에 대한 실험 결과를 요약한 이미지이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 "오스모틴(Osmotin)"은 식물에서 분리한 천연단백질로 지방분해 및 당뇨억제 기능을 가진 동물 호르몬인 아디포넥틴과 유사한 화학구조를 가지고 있고 개체에 따라 약 150개 내지 250개의 아미노산으로 구성된다. 오스모틴(24 kDa)은 당분-측정 단백질 타우마틴(sweet-testing protein thaumatin)과 상동성을 가지는 PR-5(Pathogenesis-related protein) 패밀리에 포함되는 안정한 단백질이고, 효모에서 세포 내 신호 전달을 유도하는 것으로 알려져 있다. 또한 인체 내에서 비만 및 당뇨를 억제하는 단백질과 유사한 기능을 한다는 사실이 보고된 바 있다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 오스모틴을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병의 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 오스모틴은 식물체로부터 분리 정제된 것일 수 있고, 상기 식물체는 담배속 식물체일 수 있으며, 상기 오스모틴은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 상기 아미노산 서열에 기반하여 원핵생물 또는 효모, 식물세포, 곤충세포, 포유동물 세포와 같은 진핵생물의 세포를 이용하여 유전자 재조합 기술에 의해 생산될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 적합한 1일 투여량은, 100 μg/kg 내지 1 mg/kg(체중)이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 몇 주간 수회 나누어 투여할 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(corn starch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘, 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth), 젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린, 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의, 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 오스모틴을 유효성분으로 포함하는 인지기능 개선 및 기억력 증진용 건강기능식품이 제공된다.
상기 건강기능식품에 있어서, 상기 오스모틴은 식물체로부터 분리 정제된 것일 수 있고, 상기 식물체는 담배속 식물체일 수 있으며, 상기 오스모틴은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 상기 아미노산 서열에 기반하여 원핵생물 또는 효모, 식물세포, 곤충세포, 포유동물 세포와 같은 진핵생물의 세포를 이용하여 유전자 재조합 기술에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 오스모틴을 알츠하이머 병에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 알츠하이머병을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 오스모틴을 알츠하이머 병에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 인지기능 개선 및 기억력 증진 방법이 제공된다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
실시예 1: 동물행동학적 분석을 통한 인지기능측정
1-1: 실험동물
본 발명에서 체중 23±1.5 g의 8주령 웅성 C57BL/6J 마우스(WT)와 형질전환된 C57BL/6J-Tg(NSE-APPsw)KLAR 마우스(이하, 'APPsw'로 약칭함)를 각각 미국의 Jackson's laboratory 및 식품의약품안전처(대한민국)에서 구입하였다. 상기 마우스의 사육조건은 낮 16시간/밤 8시간 명암주기로, 온도는 23℃, 습도는 60±10 %를 유지하였고, 물과 음식은 임의로 접근할 수 있는 조건에 두었다.
1-2: 오스모틴 처리
본 발명에서 종래에 보고된 428 mM NaCl-적응 배양된 담배(Nicotiana tabacum cv. Wisconsin38) 세포로부터 균질하게 정제된 오스모틴을 본 발명에서 분리하여 사용하였다(Shah et al. Cell Death & Disease, 5: e1026, 2014). 오스모틴은 멸균 용액(3 mg/ml, 1/8배 PBS)으로 제공됐으며, 활성은 Saccharomyces cerevisiae strain BWG1-7a에 대한 IC50(오스모틴 처리시 50%의 상기 균주가 사멸하는 오스모틴의 농도)인, 0.2 μM로 측정되었다. 9개월이 된 WT 마우스(30±1.2 g)와 APPsw 마우스(39±0.8 g)를 사용하였다. 멸균된 증류수(vehicle)를 사용하여 오스모틴을 희석한 후, 복강내 주입(intraperitoneal injection)을 통해 전달하였다(15 mg/kg 체중). 뇌조직에서 오스모틴 효과의 분자적 분석을 위하여, 행동실험(behavior test) 이후에 각 마우스에 담체(vehicle) 또는 오스모틴을 반복적으로 주입을 하였고 12시간 후에 희생시켰다.
1-3: 수중미로실험(Morris Water Maze Test)
본 발명에서 공간 기억 및 장기 공간 기억의 습득을 포함하여 해마 의존 학습(hippocampal-dependent learning)을 분석하기 위해 수중미로실험(Morris Water Maze Test; MWM)을 수행하였다. 종래에 개시된 방법(Morris, R.G.M., Learning and Motivation 12, 239-260, 1981)을 응용하여 하기의 방법으로 실시하였다. 원형의 수조(지름 10 cm x 높이 40 cm)와 탈출용 지지대(platform, 지름 10cm)로 이루어진 실험장비를 준비하여, 수조의 물(온도 22±1℃)은 26 cm의 높이까지 채웠다. 감춰진 10 cm 지름의 지지대를 수면 밑 대략 1 cm, 사분면의 가운데 고정된 위치에 두었고, 무독성 백색-수용성 염료를 물에 첨가하여 불투명하여 혼탁해지도록 하였다. 수면훈련은 6일 동안 연속적으로 이루어졌다. 수중미로실험은 실험동물이 수조 주변의 표지물을 이용하여 지지대를 찾아가기 때문에 주변의 환경 변화가 없도록 표지물을 실험기간 동안 일정하게 유지 하였다. 각 마우스는 하루에 2회 훈련 기간을 실시하였고, 각 훈련은 사분면의 다른 방향에서 시작하도록 2회 실험으로 구성하였다. 수중 미로에서 탈출하는 대기 시간은 60초 관찰 기간 동안 계산하였다. 만약 마우스가 60초 안에 수중의 지지대를 찾지 못한다면, 마우스를 부드럽게 지지대로 안내하고 10초 동안 지지대에 머물 수 있게 하여 주변의 단서를 다시 기억할 수 있도록 하였다. 최초 3일까지는 오스모틴 또는 담체의 투여 없이 수행되었고, 훈련 개시 3일 경과 후에, 치매모델 마우스에 오스모틴(osmotin) 또는 담체(vehicle)만을, 대조군인 정상마우스에는 담체(vehicle)만을 복강 내 주사하였고, 동일한 훈련을 상기와 같이 반복하였다. 상기 지지대는 탐침 시험(probe test)을 위해 제거하였다. 지지대 사분면에 각각의 실험동물에 의해 소비되는 시간을 기록하였다. 공간적 작업 기억에 오스모틴의 효과를 조사하기 위해, 변경 조사는 먼저 미처리-마우스에서 수행한 다음, 오스모틴 또는 담체만을 복강 내 주사한 치매모델 마우스에서 반복 수행하였다. 기억력은 지지대에서 탈출하기까지 대기시간을 기록함으로써 측정하였다(도 1). 그 결과, 탈출 대기 시간이 모든 그룹에 대해 시간 서서히 감소하였고 3일째에 치매모델 마우스는 정상마우스에 비해 훨씬 더 높은 탈출 대기 시간(~ 1.8 배)을 기록하였다. 훈련 개시 3일 후에도 치매모델 마우스는 담체만 또는 오스모틴을 복강 내 주입하였고 매일 훈련은 지속되었다. 탈출대기 시간은 모든 그룹에서 6일에 거쳐 점차적으로 줄어들었으나, 담체만 처리한 치매모델 마우스에 비해 오스모틴을 투여한 치매모델 마우스에서의 감소율이 더 컸다. 5일 및 6일 째에 두 그룹 사이에서 탈출 대기시간과 운동경로 길이에서 확연한 차이를 관찰할 수 있었다. 그러나, 오스모틴을 투여한 치매모델 마우스의 탈출대기시간의 평균치는 여전히 담체만 처리한 정상마우스에 비해 높았는데, 이는 실험 조건 하에 오스모틴이 공간적 기억 손실을 부분적으로 회복시킴을 시사하는 것이다. 그런 다음, 본 발명자는 7일째에 숨겨진 지지대 없이 MWM probe test를 수행하였다(도 2). 종래에 숨겨진 플랫폼을 포함하는 사분면에서의 마우스의 체류시간을 기억 기능의 척도로 간주하였다. 그 결과 도 2에서 나타난 바와 같이, 해당 사분면에서의 체류시간은 담체만 처리한 정상마우스(대조군)에서 가장 컸고, 오스모틴이 투여된 치매모델 마우스는 중간 정도의 체류시간을 나타냈으며, 담체만 처리한 치매모델 마우스에서 유의하게 낮았다. 이러한 결과는 오스모틴이 치매모델 마우스에서 해마의 공간기억 결손을 억제함을 나타낸다.
1-4: Y-미로 실험(Y-maze spontaneous alternation test)
본 발명자들은 자발적 변경 Y-미로 실험을 이용하여 형질전환 치매모델 마우스[APPsw]의 공간적 기억기능에 대한 오스모틴의 효과를 조사하였다. Y-미로 장치는 3개의 팔(arm)로 구성되어 있으며 각 각지의 길이는 50 cm, 넓이 10 cm, 높이는 20 cm이고 각 가지는 서로 120°의 일정한 각도로 배치된 것을 사용하였다. 각 마우스는 백색 Y-미로를 탐험할 수 있는데, 행동실험 시작하기 전에 각 마우스를 Y-미로에 두고 10분 동안 환경에서 적응할 수 있도록 하였다. 그런 다음 마우스를 무작위로 선택된 방향으로 두 팔의 교차점(junction)에 직면하도록 Y-미로의 중앙에 위치시켰고, 8분 동안 미로를 탐험할 수 있도록 하였다. 각 팔로의 총 진입수와 연속적인 3순차진입(triplets)을 행동 소프트웨어 시스템으로 기록하였다. 각 팔에 진입한 횟수 및 순서를 측정함으로써 자발적 변경율(spontaneous alteration, %)을 평가하였다. 변경(alteration)은 3개의 다른 팔에 순차적으로 들어가는 경우 1점(실제 변경: actual alternation, 즉 ABC, BCA, CAB의 순서로 진입한 경우)으로 인정하였다. 연속으로 들어가지 않을 경우 점수로 인정하지 않았다. 따라서 변경율은 하기 수학식으로 계산하였다:
변경률(%)= [연속적인 3순차진입 세트/팔에 들어간 총 진입 횟수-2] X 100.
상기와 같이 계산된 변경률은 공간기억 능력과 상관관계가 있는 것으로 간주된다.
오스모틴의 공간기억 기능에 대한 영향을 조사하기 위해, 우선 담체만 투여된 치매모델 마우스에 대하여 변경 Y-미로 실험을 수행하였다. 그런 다음 상기 마우스에 대하여 오스모틴 또는 담체만을 복강투여하고, 동일 실험을 반복하여 결과를 비교하였다(도 3). 도 3에 나타난 바와 같이, 치매모델 마우스의 경우 예상대로 대조군에 비하여 더 낮은 변경율을 기록하였는데, 이는 더 낮은 공간기억을 나타낸다. 담체만 투여한 그룹들의 경우 양 그룹(대조군인 정상마우스 및 치매모델 마우스) 모두에서 변경율에 대한 어떠한 유의한 변화를 야기하지 않은 반면, 치매모델 마우스에 오스모틴을 투여한 그룹에서는 변경율이 유의하게 증가하여 단기 기억 장애를 경감시킴을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 면역분석학적 분석
2-1: 웨스턴 블롯팅
마우스의 해마(hippocampus) 및 대뇌피질(cortex) 조직 각각 10 mg을 PRO-PREP(인트론, 한국) 단백질 추출 용액(600 μl)을 이용하여, 제조사의 지시에 따라 4℃에서 추출하였다. 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 분석 키트(Bio-Rad, 미국)을 사용하여 결정하였다. 용해물(단백질 20 μg)을 4~12% BoltTM Mini Gels(Life Tech, 미국)에서 SDS-PAGE 전기영동을 한 후 니트로셀룰로오즈 막에 전이시킨 후, 5% 탈지유(또는 BSA)로 블로킹하였다. 4℃에서 1차 항체로 12시간 이상 반응시킨 후 HRP(horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항체에 반응시킨 후에 ECL로 교차 반응(cross-reacting) 단백질을 검출하였다. PARP-1, phospho-CDK5 (Tyr 15), CDK5, SNAP-25, IDE, neprilysin/CD10(NEP), β-amyloid, BACE1 및 phospho-tau(Ser413)의 1차 항체는 Santa Cruz Biotech(미국)에서 구입하여 사용하였고, 반면 베타-액틴, 시탭토피신(synaptophysin), phospho-AMPA R(Ser845), GABAB1R, Calpain1 및 phospho-CREB(Ser133)에 대한 1차 항체는 Cell Signaling사(미국)에서 구입하여 사용하였다. 아밀로이드 전구체 단백질(APP) C-말단, Nogo A, 및 Nogo-66 수용체에 대한 1차 항체는 Millipore로부터 구입하였다. 각 밴드 별 정량분석은 Sigma Gel 소프트웨어(SPSS, 미국)을 사용하여 실시하였다. 밀도값(Density values)은 임의 단위(A.U.)로 계산하였다.
알츠하이머 치매에서 인지기억 감소가 아밀로이드 베타 플라크(Aβ plaques) 또는 NFT22, 23의 출현(appearance)보다 질병 초기단계에서 해마에서 시냅스 밀도 손실과 더 밀접하게 관련되어 있다(Scheff SW et al., Neurobiol. Aging., 27(10):1372-1384, 2006). 웨스턴 블롯팅 분석결과 오스모틴 처리시 APPsw 마우스에서 시냅스전 소포막-특이적 단백질(presynaptic vesicle membrane-specific proteins), 시냅토피신(synaptophysin) 및 SNAP-25의 발현수준이 유의하게 증가했음을 확인하였다(도 4). 한편, AMPA 수용체 소단위체 GluR1의 Ser831 및 Ser845에서의 인산화는 시냅스 가소성(synaptic plasticity)에서 중요한 역할을 하는데, 웨스턴 블롯팅 분석 결과 오스모틴 처리 치매모델(APPsw) 마우스에서 AMPA 수용체 소단위체 GluR1의 Ser845 위치에서의 인산화 형태의 양이 유의하게 증가함을 확인하였다.
AMPA 수용체뿐만 아니라 노고 수용체(Nogo receptor)는 시냅스 가소성(synaptic plasticity)에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. GABABRs의 발현은 부분적으로 Nogo-66 receptor 1(NgR1)와 그의 리간드인 Nogo-66 (axon-inhibiting N-terminal domain of Nogo A)의 상호작용에 의해 조절된다. 따라서 본 발명자들은 NgR1, Nogo A 및 GABAB1R의 발현수준을 웨스턴 블롯팅 분석한 결과, 대조군 마우스와 비교하여 치매모델(APPsw) 마우스의 해마에서 NgR1 및 Nogo A의 발현이 현저하게 증가하고 GABAB1R의 발현의 감소하나, 오스모틴 투여시 이러한 현상이 회복됨을 확인하였다(도 4). 인산화-CREB은 Aβ의 해로운 영향에 대해 더욱 저항하게 하는 시냅스를 만들고, 알츠하이머 모델 마우스에서 학습과 기억 시냅스 기능에서 장기적인 개선과 관련된 유전자 발현을 활성화한다. 따라서, 본 발명자들은 웨스턴 블롯팅 분석을 통해 인산화 CREB의 발현 양상도 조사하였는데, 그 결과 인산화-CREB(Ser133)의 양은 대조군에 비해 담체만 처리한 APPsw 마우스에서 더욱 낮아졌음을 나타낸 반면, APPsw 마우스에 오스모틴 처리시 인산화-CREB(Ser133)의 발현이 증가함을 확인하였다(도 4). 이러한 분자수준의 변화는 오스모틴이 알츠하이머 모델의 해마에서 시냅스 가소성(synaptic plasticity)을 강화하고 신경축삭의 재생을 증가시키며, 시냅스 활성을 강화함을 시사하는 것이다.
알츠하이머병에 걸린 뇌에서의 기억 손상을 야기하는 시냅스 장애는 아밀로이드 베타 올리고머의 축적 및 아밀로이드 베타 신경반의 생성에 의한 야기되는 것으로 종래에 보고되었다(Saul et al., Neurobiology of Aging, 34(11), 2564-2573, 2013). 따라서, 아밀로이드 베타 올리고머 및 응집체는 뇌조직에서 알츠하이머병의 조기 병리학적 표지가 된다. 이에, 본 발명자들은 상기 베타 아밀로이드 올리고머 및 응집체의 축적에 대한 오스모틴의 영향을 조사하기 위해, 오스모틴 투여 후의 해마 조직에서의 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP) 및 아밀로이드 베타 펩타이드의 발현양을 웨스턴 블롯팅 분석을 통해 분석하였다(도 5). 도 5의 결과를 통해 담체만 투여한 경우 APPsw 마우스의 해마에서의 APP 및 아밀로이드 베타 펩타이드의 발현양이 대조군 마우스보다 더 높음을 확인할 수 있었다.
한편, Aβ1-40을 분해할 수 있는 아연 금속단백질분해효소(zinc metalloproteinase)인 인슐린 분해 효소(insulin degrading enzyme, IDE) 및 네프릴라이신(neprilysin, NEP)은 알츠하이머병의 병리현상을 반전시킬 수 있는 것으로 강력하게 시사되어 왔다. 따라서, 본 발명자들은 상기 아밀로이드 베타 펩타이드와 아밀로이드 전구 단백질 외에도 상기 IDE 및 NEP의 발현을 웨스턴 블롯팅 분석으로 조사하였다. 그 결과 IDE 및 NEP의 발현양은 대조군 마우스보다 치매모델(APPsw) 마우스의 해마에서 유의하게 낮고, 오스모틴 투여 후에 유의하게 증가함을 확인하였다. 더 나아가, 단백질 절단에 의해 아밀로이드 베타 펩타이드의 생성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 BACE1(beta-secreatase 1)의 수준도 함께 조사하였는데, 상기 BACE1의 발현은 담체만 처리한 대조군과 비교하여 담체만 처리한 APPsw 마우스에서 더 높은 것으로 확인된 반면, 오스모틴 처리시 그 발현이 유의하게 감소함을 확인할 수 있었다(도 5).
또한, 오스모틴이 아밀로이드 베타 펩타이드 및 아밀로이드 베타 신경반의 대뇌피질에서의 축적을 억제할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 대뇌피질 조직에 대한 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다(도 6). 그 결과 담체만 처리된 대조군 마우스와 비교하여 담체만 처리한 APPsw 마우스의 전두엽(prefrontal) 및 이상엽(piriform) 피질에서 Aβ 신경반은 물론 APP 및/또는 Aβ 펩타이드가 증가하였고, 오스모틴 처리시 APPsw 마우스에서 이들 알츠하이머 마커가 감소됨을 확인하였다(도 6).
미세소관(microtubule)-연관 단백질 tau의 S/T-P 모티프에서의 인산화는 알츠하이머 병 환자의 뇌에서 발견되는 나선 쌍 섬유(paired helical filaments, PHF)에서 tau의 봉입(inclusion)의 원인으로 알려지고 있다(Noble et al., Neuron. 38(4):555-565, 2003). 이러한 병리현상은, 알츠하이머 병 환자의 신경세포의 특성으로 Cdk5 활성의 상향조절을 통해 Aβ 펩타이드에 의해 유도되는 것으로 알려지고 있다. 특히, Aβ 펩타이드는 Cdk5 활성화 단백질 p35의 Cdk5 활성에 있어서 더 강력한 활성화제인 p25로의 calpain-매개 단백질 절단을 유도하는 것으로 알려져 있다(Lee et al., Nature. 405(6784):360-364, 2000). p35/p25와 관련된 활성화 외에도, Cdk5는 Tyr15의 인산화에 의해서도 활성화된다. 이에, 본 발명자들은 세 가지 실험군(대조군 마우스, 담체만 투여한 APPsw 마우스 및 오스모틴 투여 APPsw 마우스)의 해마를 대상으로 상기 알츠하이머 질병 마커 단백질인 calpain, p25, 인산화-Cdk5(Tyr15), 인산화-tau(Ser413)에 대한 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였고(도 7), 상기 세 가지 실험군의 대뇌피질 조직을 대상으로 인산화-tau에 대한 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다(도 8). 그 결과 도 7에서 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 담체만 투여한 APPsw 마우스의 해마조직에서 calpain, p25, 인산화-Cdk5(Tyr15) 및 인산화-tau(Ser413)가 유의하게 증가하였으나, 오스모틴을 투여한 APPsw 마우스에서는 이들 마커의 발현이 감소하였다. 그러나, Cdk5 자체의 발현은 변화가 없는 것으로 나타나 이들 변화가 Cdk5 자체의 발현의 변화에 기인한 것 이라기보다는 Cdk5의 인산화의 조절에 의한 것임을 알 수 있었다. 한편, 대뇌피질에 대한 웨스턴 분석 결과에서도 인산화-tau(Ser413)이 대조군에 비해 담체만 투여한 APPsw 마우스에서 증가한 반면, 오스모틴을 투여한 APPsw 마우스에서는 감소하여(도 8), 오스모틴이 이들 알츠하이머 치매병과 관련된 분자 마커의 수준을 해마는 물론 대뇌피질에서 억제함을 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과는 오스모틴인 APPsw 마우스에서 이미 생성된 아밀로이드 베타를 제거함은 물론 APP로부터 아밀로이드 베타 펩타이드의 생성을 감소시킴으로써 알츠하이머병의 병리현상을 경감시킬 수 있음을 시사하는 것이다.
2-2: 조직형태학 분석
본 발명자들은 상기 실시예의 웨스턴 블롯팅 분석 상 분자 수준의 변화가 실제 뇌 조직에서 일어나는 것인지 조사하기 위해, 오스모틴 처리시의 마우스의 뇌조직에 대한 조직형태학적 분석을 수행하였다. 먼저, 마우스를 빙냉 4% 파라포름알데히드로 경심관류로(transcardially) 고정시켰다. 뇌를 수집한 후 72시간 동안 4% 파라포름알데히드로 후고정하였고 최종적으로 20% sucrose로 이동시켜 72시간 동안 정치하였다. 뇌조직은 액체 질소 하에 OCT(optimal cutting temperature compound)로 포매한(embedded) 후 CM 3050C cryostat(Leica)을 사용하여 14 ㎛ 두께로 관상면(coronal) 절편으로 잘랐다. 조직 절편은 ProbeOn Plus slides(Fisher, USA)으로 봉입하였다. 면역형광 분석을 위하여, 슬라이드는 0.01 M PBS로 15분 동안 2회 세척하였다. 각 절편은 Proteinase K 용액과 함께 커버슬립을 씌운 후 37℃의 습윤챔버에서 5분 동안 두었고 그후 각 절편은 5% 정상 염소 혈청 및 0.3% Triton X-100이 함유된 PBS 차단 용액에 1시간 동안 정치시켰다. 블로킹 단계를 수행한 후, 슬라이드에 1차 항체(블로킹 용액에 1:100 희석)를 처리하고 하룻밤동안 반응시켰다. 분석을 위해 β-amyloid, phospho-tau(Ser413), 시냅토피신(synaptophysin), GABAB1R, 및 Nogo-66 수용체 각각에 대한 1차 항체를 사용하였다. 1차 항체 반응 후, 면역복합체(immunocomplexes)는 2차 FITC-labeled 항체 또는 2차 TRITC-labeled 항체(Santa Cruz Biotechnology, 1:50)와 1.5 시간 동안 반응시킨 후 시각화하였다. 슬라이드는 Prolong Antifade 시약(Molecular Probes, 미국)으로 봉입하였고, 공초점 레이저현미경(Flouview FV 1000)으로 조사하였다. 아밀로이드 플라크(amyloid plaques)에 대한 티오플라빈 S 염색(thioflavine S staining)은 동결절편(cryoscetion)을 수분 동안 미지근한 흐르는 수돗물에서 세척한 후 수행하였다. 상기 세척된 절편을 5분 동안 0.25% 과망간산 칼륨(potassium permanganate)에 담가 둔 후, 1% K2S2O5 및 1% 옥살산에 5분 동안 담가 둔 후 8분 동안 0.02% thioflavine-S 용액에 담가 두었다. 그런 다음 뇌조직 절편을 1분 동안 2회 80% 에탄올에 헹구고, 천천히 흐르는 수돗물로 4-5분 동안 세척하였다. 그리고 나서 70, 80, 95% 알코올을 연속적으로 담가서 탈수하였고 자일렌에 담구었다. 커버슬립으로 봉입한 후 조직 절편을 공초점 레이저현미경(Flouview FV 1000)으로 조사하였다. 모든 형광 신호는 Image J Software(National Institutes of Health, USA)를 사용하여 정량하였고, 적분 광밀도(integral optical density, IOD)로 나타냈다. 그 결과, 오스모틴 투여시 해마의 치상회(dentate gyrus, DG) 영역에서 시냅토피신의 발현이 증가하였음을 확인하였다. 한편, 상기 치상회 영역에서의 GABAB1R의 발현 역시 담체만 처리한 APPsw 마우스에서 감소하였으나, 오스모틴 처리시 대조군 수준으로 회복됨을 확인하였다(도 9 및 도 10).
노고 수용체(Nogo receptor) 역시 시냅스 가소성(synaptic plasticity)에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고, GABABRs의 발현은 부분적으로 Nogo-66 receptor 1(NgR1)와 그의 리간드인 Nogo-66(axon-inhibiting N-terminal domain of Nogo A)의 상호작용에 의해 조절됨이 보고되었다. 따라서 본 발명자는 면역형광 분석을 통해 대조군 마우스와 비교하여 APPsw 마우스의 해마의 아몬각1(Cornu Ammonis 1, CA1) 치상회(DG)에서의 NgR1의 발현을 조사하였다. 그 결과 대조군에 비해 APPsw 마우스의 해마의 CA1 및 DG에서의 NgR1의 과발현이 관찰되었고, 상기 APPsw 마우스에 오스모틴 투여시 NgR1의 발현양이 현저하게 감소함을 확인할 수 있었다. 특히 DG의 경우 NgR1의 발현수준이 대조군 수준으로 감소하였다. 반면, GABAB1R의 경우 NgR1과 반대의 결과를 나타냈다(도 11 내지 도 14).
아울러, 본 발명자들은 알츠하이머 치매의 원인물질로 알려지고 있는 아밀로이드 베타 신경반에 대한 면역형광 분석 및 아밀로이드 베타를 특이적으로 염색하는 것으로 알려진 티오플라빈 S 염색(thioflavin S staining)을 수행하였다(도 15및 도 16). 그 결과 Aβ 펩타이드 및 Aβ 신경반은 담체만 처리한 대조군 마우스의 해마에서 거의 발견할 수 없었고 담체만 처리한 APPsw 마우스 해마의 DG 및 CA1 영역에서 주로 축적됨을 확인하였다. 오스모틴을 투여한 APPsw 마우스에서는 담체만 처리한 APPsw 마우스와 비교하여 해마의 DG 및 CA1 영역에서 전체 아밀로이드 β 펩타이드와 Aβ 신경반의 축적을 감소시켰다. 마찬가지로 대뇌 피질에서 조직 화학 분석을 수행하였는데(도 17 및 도 18), 이 역시 상술한 웨스턴 블롯팅 분석과 유사한 결과가 도출되었다.
아울러, 본 발명자들은 해마 및 대뇌피질에서의 인산화-tau(Ser413)의 양을 면역형광 분석으로 분석하였다(도 19 및 도 20). 도 19에서 A는 해마에서의 p-tau(Ser413)의 염색 결과이고 B는 대뇌피질에서의 p-tau(Ser413)의 염색결과를 나타내며, 도 20은 상기 면역형광 분석 결과를 정량화한 그래프이다. 대조군 마우스와 비교하여 APPsw 마우스에 담체만 투여한 경우 해마 및 대뇌피질에서의 p-tau(Ser413)의 양은 현저히 증가한 반면, APPsw 마우스에 오스모틴을 투여한 경우에는 p-tau(Ser413)의 양이 현저히 감소함을 확인하였다(도 19 및 도 20).
실시예 3: 세포생존, 세포독성 및 Caspase-3 활성
본 발명자들은 임신일(gestational day, GD)로부터 17.5일 경과한 랫트 태아의 뇌조직을 발생중인 대뇌피질 및 해마의 신경세포의 1차 배양을 위해 수득하였다. 2x104세포를 포함하는 분취시료(100 μL)를 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 세포성장 DMEM 배지가 들어있는 두 96-웰 플레이트에 나누었고 5% CO2, 37℃ 온도 조건에서 배양하였다. 3일 후에 배지를 완전히 제거하고 하나의 플레이트에는 새로운 성장배지 100 ㎕를 첨가하였고(플레이트 1), 다른 하나에는 5 mM β-아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42, Sigma, USA)가 포함된 성장배지로 대체하였다(플레이트 2). 24시간 동안 배양하였고, 이후 플레이트 1은 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 μg/ml의 오스모틴이 보충된 배지로 교체되었고, 반면 플레이트 2는 Aβ1-42(5 mM) 및 0, 0.1, 0.2 또는 0.4 μg/ml의 오스모틴이 함유된 성장배지로 교체하였다. 24시간 후에 세포생존, 세포독성 및 caspase-3/7 활성을 ApoTox-GloTM Triplex Assay(Promega, USA) 키트와 Glomax Multiㄾ Detection System(Promega, USA)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다. 오스모틴 농도 0.4 μM(10 μg/ml)까지 해마 및 대뇌피질의 두 가지 유형의 신경 세포의 생존 또는 세포독성의 효과에 유의한 영향을 미치지 않았다(도 21의 A 내지 D). 세포독성 및 caspase-3/7 활성의 증가에 수반되는 세포생존도에 대한 감소는 Aβ1-42 펩타이드 처리 시 해마와 대뇌피질의 신경세포(cortical neurons)에서 관찰되었다(도 21의 E 및 F). 최대 0.4 μM까지의 오스모틴을 Aβ1-42 펩타이드와 함께 처리할 경우, 해마 및 대뇌피질 신경이 세포생존, 세포 독성, 및 caspase-3/7의 활성에 대한 Aβ1-42의 해로운 작용으로부터 보호되었다(도 21의 E 및 F). 그 결과는 상기 실시예에 사용된 실험관 내 실험의 농도에서 오스모틴은 비독성이고, Aβ에 의해 유도되는 신경 손상으로부터 신경세포를 보호하며, 이는 상기 생체 내 실험결과를 뒷받침하는 것이다. 상기 각 데이터는 평균±표준편차로 표현하였고 Prism 5(GraphPad Software, Inc., San Diego, California)를 사용하여 Students' t-test에 의한 ANOVA분석을 수행하였다. P < 0.05에서 통계적 유의성을 나타냈다. 도 22는 오스모틴이 어떤 경로를 통해 알츠하이머 질병을 완화시키는지에 대한 실험 결과를 요약한 이미지이다. 오스모틴은 AMPK의 활성을 통해 APP 프로세싱, 시냅스 기능장애(synaptic dysfuction), 신경섬유매듭(neurofibrilary tangle)을 변화시키는 것으로 추정된다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구 범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 오스모틴은 혈뇌장벽(blood brain barrier)를 통과할 뿐만 아니라, 치매 모델 동물의 인지기능개선에 효과적임이 입증되어 천연물 유래의 치매 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
서열번호 1은 담배(N. tabacum) 유래의 오스모틴의 아미노산 서열이다.

Claims (8)

  1. 오스모틴을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 오스모틴은 담배속 식물로부터 분리 정제된, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 오스모틴은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 약학적 조성물.
  4. 오스모틴을 유효성분으로 함유하는 인지기능 개선 및 기억력 증진용 건강기능식품.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 오스모틴은 담배속 식물로부터 분리 정제된, 건강기능식품.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 오스모틴은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는, 건강기능식품.
  7. 치료적으로 유효한 양의 오스모틴을 알츠하이머 병에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 알츠하이머병을 치료하는 방법.
  8. 치료적으로 유효한 양의 오스모틴을 알츠하이머 병에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 인지기능 개선 및 기억력 증진 방법.
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