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WO2014104771A1 - 식중독 검출용 프라이머 세트를 포함하는 마이크로 pcr 칩, 이를 포함하는 실시간 pcr 장치, 및 이를 이용한 식중독 검출 방법 - Google Patents

식중독 검출용 프라이머 세트를 포함하는 마이크로 pcr 칩, 이를 포함하는 실시간 pcr 장치, 및 이를 이용한 식중독 검출 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2014104771A1
WO2014104771A1 PCT/KR2013/012238 KR2013012238W WO2014104771A1 WO 2014104771 A1 WO2014104771 A1 WO 2014104771A1 KR 2013012238 W KR2013012238 W KR 2013012238W WO 2014104771 A1 WO2014104771 A1 WO 2014104771A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
primer
seq
pcr
consecutive nucleotides
micro
Prior art date
Application number
PCT/KR2013/012238
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김성우
이세현
Original Assignee
나노바이오시스(주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 나노바이오시스(주) filed Critical 나노바이오시스(주)
Publication of WO2014104771A1 publication Critical patent/WO2014104771A1/ko

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay

Definitions

  • the present invention relates to a micro PCR chip comprising a primer set for detecting food poisoning bacteria, a real-time PCR device including the same, and a method for detecting food poisoning using the same.
  • a method for quickly and economically checking the presence of food poisoning bacteria in a sample such as food is required.
  • a common method for detecting food poisoning bacteria is to cultivate a sample in a selective medium, isolate bacteria suspected of food poisoning bacteria, and then confirm this by biochemical or immunological methods.
  • immunological methods using antibodies can detect bacteria with high accuracy, a large amount of samples are required, and protein purification, production, or peptide production of the bacteria is essential for producing antibodies required for each diagnosis. High antibody production costs are required.
  • the recently used real-time PCR method is a method for observing the increase of the PCR amplification product in real time every cycle of the PCR, a method of interpreting the detection and quantification of the fluorescent material reacted with the PCR amplification product.
  • This method eliminates the need for additional electrophoresis, excellent accuracy and sensitivity, high reproducibility, and automation, compared to conventional PCR methods that have been finalized and stained on gels to identify PCR amplification products after electrophoresis. It is possible to quantify the results, to be quick and easy, to be excellent in biological safety due to contamination by dyes such as EtBr (Ethidium Bromide) and harmful problems such as UV irradiation, and to automatically check whether a specific gene is amplified.
  • EtBr Ethidium Bromide
  • PCR Real-time polymerase chain reaction
  • a device for implementing real-time PCR is a thermal cycler having at least one heating block for performing a nucleic acid amplification reaction and a signal for measuring in real time a signal generated from a nucleic acid amplification product. And a detector.
  • Such a signal detector may be exemplified as an optical detector for detecting a fluorescence signal generated from a nucleic acid amplification product, an electrical signal detector for detecting an electrical signal generated through specific binding of a nucleic acid amplification product and a medium which is mutually coupled thereto. Can be.
  • Korean Laid-Open Patent Publication No. 10-2004-0048754 (a real-time fluorescence retrieval apparatus with temperature control) is sensitive to fluorescence of several wavelengths in a few hundred to thousands of samples within seconds and even at low concentrations of samples. It provides a compact fluorescence detector that can search and analyze enzyme reactions in real time and is portable at an economical price.
  • the prior fluorescence detection device is a device for analyzing a sample by searching for a fluorescence emitted from the sample after irradiating a light source to a biological sample, a sample container, a light source positioned to irradiate the sample container, the light emitted from the sample
  • a fluorescence retrieval device comprising a detector for detecting fluorescence, a fluorescence shifting device for moving fluorescence emitted from the sample to the detector, a wavelength selection device, and a control unit, the fluorescence retrieval device comprising: an array of LEDs arranged to sequentially emit a plurality of LEDs; A well chamber block having a plurality of wells for inserting a sample container; A multi-channel PMT for detecting fluorescence emitted from the sample by each LED emission of the LED array; And a plurality of optical fibers for individually moving the fluorescence emitted from each sample to the multi-channel PMT.
  • Korean Patent Registration No. 10-0794703 provides a device that can compare the degree of reaction of a plurality of samples by minimizing the deviation of the light detection sensitivity during the reaction in the reaction tube plate.
  • the preceding real-time monitoring device is a thermostat block system consisting of a thermoelectric element which is a heat supply source capable of supplying heat to the reaction tube and a heat transfer block for transferring heat to the reaction tube;
  • An irradiation light source unit including a lamp and an optical waveguide for irradiating uniform light to a sample in the reaction tube;
  • an optical system including a reflector for changing a light path and a light receiving unit for receiving fluorescence generated in a sample in the reaction tube by light irradiated by the irradiation light source unit.
  • Korean Patent No. 10-1089045 (A real-time monitoring device of the nucleic acid amplification reaction product) performs a nucleic acid amplification reaction such as polymerase chain reaction of a plurality of trace samples in real time to monitor the production of reaction products generated during the reaction In order to efficiently separate the interference of the excitation light and fluorescence, to provide a real-time monitoring device for a biochemical reaction including a polarizer, a polarization beam splitter, a polarization converter and the like.
  • Korean Patent Application Publication No. 10-2008-0103548 (a real-time detection device for nucleic acid amplification products) can effectively exclude or reduce the error factor on the device without using a second fluorescent signal used for correction,
  • a plurality of wells are subjected to temperature cycles to detect in real time the fluorescence intensity from the nucleic acid amplification products in each well, furthermore, the fluorescence measurement [DNA] raw obtained from the wells and the surrounding connections in the vicinity of the wells.
  • Real time of nucleic acid amplification products which can determine fluorescence intensity [DNA] real of the well by detecting fluorescence measurement [DNA] bg obtained from the wall and subtracting fluorescence measurement [DNA] bg from fluorescence measurement [DNA] raw It provides a detection device.
  • Korean Patent No. 10-0794699 (a real-time monitoring device for nucleic acid amplification reaction products) monitors the production of reaction products generated during the reaction while performing nucleic acid amplification reactions such as polymerase chain reaction of a plurality of trace samples.
  • a sample reaction unit including a reaction vessel having a plurality of wells for holding a plurality of samples, a transparent sealing cover for covering the reaction vessel, and a thermoelectric element for supplying a heat source to the reaction vessel;
  • a light emitting element unit comprising a selective transmission filter positioned in front of the excitation light source and a linear polarizer for linearly polarizing the light passing through the filter;
  • a light receiving element portion comprising a linear polarizer in a direction perpendicular to the linear polarizer of the light emitting element portion, a condenser lens for condensing light passing through the linear polarizer, a selective transmission filter for selectively transmitting the light passing through the condenser lens, and a fluorescent sensing element It provides a real-time monitoring device of the nucleic acid amplification reaction product, characterized in that configured.
  • the present invention is applicable to a detection apparatus capable of detecting food poisoning bacteria at a time quickly and accurately and a method for detecting food poisoning bacteria using same.
  • the present invention is capable of measuring a large number of small amounts of nucleic acid amplification products at the same time and rapidly, detecting a nucleic acid amplification products at low cost, and furthermore, using 16 kinds of food poisoning bacteria by utilizing a micro PCR chip that can secure the reliability of the result. It is to provide a food poisoning detection device and a detection method capable of detecting quickly and accurately at the same time.
  • One embodiment of the present invention comprises at least 16 PCR reaction chamber (chamber) with an open top surface; And an open top surface of the PCR reaction chamber, which seals the open top surface, and protrudes toward the inside of the PCR reaction chamber from a portion of the sealing surface that is in contact with the open top surface and extends along the optical path.
  • a cover having a light transmitting part made of a material comprising: comprising a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the 16 or more PCR reaction chamber and a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2
  • Primer set for detecting iap (invasion associated protein) gene of Listeria monocytogenes ;
  • Primer for detecting nucA (nuclease) gene of Staphylococcus aureus consisting of a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 set; Shigella spp.
  • a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 5 and a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 6 .
  • a primer set for detecting an invasive plasmid antigen gene ( ipaH ) of A primer set for detecting the toxR gene of Vibrio parahaemolyticus consisting of a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 7 and a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 8;
  • enterotoxin FM enterotoxin FM
  • a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 11 and a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 12 .
  • a primer set for detecting an invasion protein of invA Detecting the ail (attachment invasion locus) gene of Yersinia enterocolitica consisting of a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 13 and a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 14 Primer set for; Detects the cpe (C.
  • perfringens enterotoxin gene of Clostridium perfringens consisting of a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 15 and a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 16 Primer sets for;
  • a primer set for detecting the hipO gene of Campylobacter jejuni consisting of a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 17 and a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 18;
  • LT of Enterotoxigenic E.coli (ETEC) consisting of a primer comprising SEQ ID NO: 19 of the nucleotide sequence of a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides, and SEQ ID NO: 20 nucleotide sequence at least 15 consecutive nucleotides of the (heat-labile primer sets for detecting enterotoxin) genes;
  • STX1 shiga-like
  • EHEC Enteropathogenic E. coli
  • EIEC EIEC coli
  • a primer set for detecting ceuE gene of Camphylobacter coli consisting of a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 27 and a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 28
  • a primer set for detecting an ompW gene of Vibrio cholera consisting of a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 29 and a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides of SEQ ID NO: 30
  • a primer set for detecting the Vvh gene of Vibrio vulnificus consisting of a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides in SEQ ID NO: 31 and a primer comprising at least 15 consecutive nucleotides in SEQ ID NO:
  • the PCR reaction chamber may be implemented to have a liquid sample capacity of 10 ⁇ l or less. In this case, the PCR reaction chamber can accommodate 5-8 ⁇ l of liquid sample.
  • the light transmitting part may be disposed at the center of the sealing surface.
  • the light transmitting part may be implemented to reach a position partially spaced upward from the bottom bottom surface of the PCR reaction chamber or upward from the bottom bottom surface of the PCR reaction chamber.
  • the cover may further include a hole that penetrates through the light transmitting part, and a flexible packing part which contacts the open top surface of the PCR reaction chamber to seal the open top surface.
  • the micro PCR chip for detecting food poisoning bacteria may be implemented to have a flat plate shape.
  • the micro PCR chip for detecting food poisoning bacteria may include a first plate having a flat plate shape; A second plate having a flat plate shape disposed on the first plate, the plate having the PCR reaction chamber; And a third plate disposed on an upper portion of the second plate to seal the open top surface in contact with an open top surface of the PCR reaction chamber and serve as a cover having the light transmitting part. .
  • a hole is formed between the second plate and the third plate so as to surround the light transmitting part, and a flexible packing part which abuts the open top face of the PCR reaction chamber to seal the open top face. can do.
  • the apparatus may further include a heat dissipating unit configured to discharge heat generated from the PCR reaction chamber to the outside.
  • micro PCR chip for detecting food poisoning bacteria
  • At least one heat block implemented to be in thermal contact with at least one surface of the micro PCR chip for detecting food poisoning bacteria
  • a light detection module implemented to detect an optical signal generated from a PCR amplification product inside a PCR reaction chamber of the micro PCR chip for detecting food poisoning bacteria.
  • the micro PCR chip for detecting food poisoning bacteria A first thermal block disposed on a substrate and configured to be in thermal contact with the micro PCR chip; A second thermal block disposed on the substrate and spaced apart from the first thermal block, and configured to be in thermal contact with the micro PCR chip; A chip holder movable left and right and / or up and down by a driving means over the first row block and the second row block, and on which the micro PCR chip is mounted; And a micro PCR chip disposed between the first row block and the second row block, wherein the micro PCR chip for detecting food poisoning bacteria is moved between the first row block and the second row block by the driving means. It provides a real-time PCR device comprising a light detection module implemented to detect an optical signal generated from the PCR amplification product.
  • a micro PCR chip capable of measuring a large number of small amount of nucleic acid amplification products at the same time and quickly, detecting the nucleic acid amplification products at low cost, and further ensuring the reliability of the result is provided. It is possible to provide a food poisoning detection device and a method for detecting 16 food poisoning bacteria at the same time quickly and accurately.
  • 1 to 3 relates to a phenomenon in which the optical signal sensitivity is reduced by bubbles generated during the PCR process in a micro-miniaturized PCR vessel (small size, x1 / 20) compared to a conventional PCR vessel (large size).
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of the basic configuration of a micro PCR chip according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 relates to the principle that the optical signal is emitted from the PCR product, without the influence of bubbles generated during the PCR process in the micro PCR chip according to an embodiment of the present invention.
  • 6 relates to various types of light transmitting portions of a micro PCR chip according to an embodiment of the present invention.
  • 7 to 9 are related to the flexible packing of the micro PCR chip according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a micro PCR chip according to an embodiment of the present invention in which two or more unit modules including a PCR reaction chamber and a cover including a light transmitting unit are repeatedly implemented.
  • 11 to 12 relate to the cross-sectional exploded view of a micro PCR chip according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 13 relates to a micro PCR chip according to an embodiment of the present invention including a heat release.
  • PCR 14 to 15 are to detect an optical signal generated from a micro PCR chip, a thermal block in thermal contact with the micro PCR chip, and a PCR amplification product inside a PCR reaction chamber of the micro PCR chip according to an embodiment of the present invention. It relates to a real-time PCR device according to another embodiment of the present invention including an implemented light detection module.
  • micro PCR chips according to an embodiment of the present invention, two row blocks, a chip holder mounted with the micro PCR chip and movable between the two row blocks by a driving means, and the two row blocks.
  • an optical detection module disposed between the micro PCR chips and configured to detect an optical signal generated from a PCR amplification product inside the PCR reaction chamber of the micro PCR chip when the micro PCR chip is moved between the two thermal blocks by the driving means. It relates to a real-time PCR device according to another embodiment of the present invention.
  • 19 is an actual implementation diagram of a micro PCR chip according to an embodiment of the present invention.
  • 20 is an electrophoretic photograph of PCR using a micro PCR chip according to an embodiment of the present invention including a primer set for 16 kinds of food poisoning bacteria.
  • 21 is a table showing 16 food poisoning bacteria corresponding to the number of the electrophoresis picture of FIG.
  • Embodiments of the present invention relate to polymerase chain reaction (PCR), and more particularly, real-time PCR for monitoring nucleic acid amplification reactions in real time.
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCR is a technology that repeatedly heats and cools PCR samples and reagents containing nucleic acids, thereby serially replicating specific nucleotide sequences of nucleic acids to exponentially amplify nucleic acids having specific nucleotide sequences. It is now widely used for diagnosis and analysis of diseases in engineering and medical fields. Recently, various PCR apparatuses for efficiently performing PCR have been developed. PCR apparatus is collectively referred to as a device implemented to perform PCR for amplifying a nucleic acid having a specific base sequence.
  • a PCR device is a denaturing step of separating a double-stranded DNA into a single-stranded DNA by heating a PCR sample and reagent comprising a double-stranded DNA to a specific temperature, for example about 95 ° C., Provide an oligonucleotide primer having a sequence complementary to a specific nucleotide sequence to be amplified in the PCR sample and reagent, and cooled to a specific temperature, for example 55 °C with the isolated single strand of DNA An annealing step of forming a partial DNA-primer complex by binding the primer to a specific nucleotide sequence of a strand of DNA, and after the annealing step, the PCR sample and reagent are subjected to an activity temperature of DNA polymerase, for example, Maintaining at 72 ° C.
  • the DNA having the specific base sequence can be implemented to be exponentially amplified.
  • the recent PCR apparatus may perform the annealing step and the extension (or amplification) at the same time, in which case the PCR device performs the two steps consisting of the annealing and extension (or amplification) steps following the denaturation step. By doing so, the first circulation can be completed.
  • Real-time PCR uses a nucleic acid amplification reaction to monitor the production of nucleic acid amplification products by applying an optical system module, such as a fluorescence photometer, to a thermal cycler used for PCR.
  • an optical system module such as a fluorescence photometer
  • real-time PCR does not require electrophoresis to identify nucleic acid amplification products, which has the advantage of analyzing nucleic acid amplification products accurately and quickly in real time. Accordingly, the real-time PCR apparatus has also been actively developed in recent years. In order to realize the above advantages, the real-time PCR apparatus not only increases the efficiency of the thermal cycler but also accurately and accurately measures the optical signal generated from the nucleic acid amplification product. You should be able to.
  • 1 to 3 relates to a phenomenon in which optical signal sensitivity is reduced by bubbles generated during a PCR process in a conventional PCR vessel (large) and an ultra-miniaturized PCR vessel (small, ⁇ 1/20).
  • PCR devices For practical realization of personalized medical services, PCR devices have recently been aimed at miniaturization, portability, speed, and economy.
  • Existing PCR apparatus is not only a container for PCR samples and reagents, but also the device itself is large, difficult to operate and difficult to carry, as well as a considerable waste of PCR samples and reagents accordingly, there was also a problem that a considerable cost.
  • the large amount of PCR samples and reagents used was quite time consuming and difficult to implement efficient PCR.
  • a conventional PCR vessel (large size)
  • the right figure is a PCR vessel (small size) in which the size and liquid sample capacity are extremely small ( ⁇ 1/20) compared to the PCR vessel (large size).
  • a conventional PCR vessel (large) is composed of a reaction chamber containing a PCR sample and reagents and a cover thereof, the reaction chamber and the cover is made of a light transmitting material, about 200 ⁇ l of liquid PCR was performed with a sample capacity and about 20 ⁇ l of sample and reagents.
  • the PCR vessel (small) also includes a reaction chamber containing a PCR sample and a reagent and a cover thereof, and the reaction chamber and the cover may be made of a light transmissive material, in which case the PCR vessel ( Small) has a liquid sample capacity of about 10 ⁇ l, and PCR is performed with about 5 to 8 ⁇ l of sample and reagents received.
  • fabricating ultra-miniaturized PCR vessels can be readily implemented in the currently known art.
  • miniaturization of PCR vessels is difficult to implement easily because they have a significant adverse effect on the measurement of nucleic acid amplification products as follows.
  • FIG. 2 it is easy to identify a phenomenon in which an optical signal sensitivity decreases due to a bubble generated during a PCR process in an ultra-miniaturized PCR vessel (small size, ⁇ 1/20) compared to a conventional PCR vessel (large size).
  • PCR involves a heat supply step, so that a considerable amount of bubbles are generated inside the PCR vessel by heating the liquid sample, which blocks the light signal generated from the nucleic acid amplification product. do.
  • bubbles generated inside the PCR vessel (large) reduce the optical signal sensitivity by blocking the optical signals generated from the nucleic acid amplification products, but the internal space of the reaction vessel compared to the size and number of the bubbles themselves.
  • the bubbles are dispersed inside the PCR vessel (large) or clustered on the inner wall of the PCR vessel (large), so that although optical signal sensitivity is inferior, optical signal measurement is not impossible.
  • the bubble generated inside the PCR vessel (small) has a relatively small internal space of the reaction vessel relative to the size and number of bubbles itself.
  • the optical signal sensitivity is significantly reduced and non-uniform, resulting in less reliable results. Therefore, when miniaturizing the PCR apparatus and at the same time miniaturizing the PCR vessel mounted therein, it is necessary to fully consider a method of securing the reliability of the result due to the decrease in optical signal sensitivity and the nonuniformity.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of the basic configuration of a micro PCR chip according to an embodiment of the present invention.
  • a micro-polymer chain reaction chip 1 according to an embodiment of the present invention 1 includes a PCR reaction chamber 10 having an open top surface; And an open top surface of the PCR reaction chamber 10, which is in contact with the open top surface of the PCR reaction chamber 10, to seal the open top surface, and protrude toward the inside of the PCR reaction chamber 10 from a portion of the sealing surface that is in contact with the open top surface of the optical path. And a cover 20 having a light transmitting portion 25 of a light transmissive material extending along (21).
  • the PCR reaction chamber 10 is open to the upper surface, but the lower surface and the side border surface is implemented to accommodate a liquid sample, that is, a PCR sample and reagents.
  • the PCR reaction chamber 10 should be implemented so as not to be affected by repetitive heating and cooling during the PCR process, and is not limited to a specific shape and / or material as long as it can maintain this function.
  • the micro PCR chip 1 according to the embodiment of the present invention is based on the real-time optical signal measurement of the nucleic acid amplification product, at least a portion overlapping the optical path 21 is preferably implemented by a light transmissive material. Do.
  • the cover 20 abuts the open top surface of the PCR reaction chamber 10 and serves to seal the open top surface. As the cover 20 seals the open top surface of the PCR reaction chamber 10, PCR samples and reagents reacting inside the PCR reaction chamber 10 are not leaked to the outside, and the PCR reaction chamber 10 is closed. It maintains the internal temperature.
  • the cover 20 may be implemented in a variety of shapes and / or materials if it can implement the above functions.
  • the micro PCR chip 1 since the micro PCR chip 1 according to an embodiment of the present invention presupposes the real-time optical signal measurement of the nucleic acid amplification product, it is preferable that the micro PCR chip 1 is made of a light transmitting material.
  • the cover 20 protrudes toward the inside of the PCR reaction chamber 10 from a portion of the sealing surface that is in contact with the open top surface, and extends along the light path 21.
  • Light transmission portion 25 is provided.
  • the light transmitting part 25 is implemented as a light transmitting material and is implemented to extend along the light path 21 for the measurement of the nucleic acid amplification product, the optical signal generated from the nucleic acid amplification product in the PCR reaction chamber 10 passes through That's the part.
  • the light transmitting part 25 is directed toward the inside of the PCR reaction chamber 10 from a part of the sealing surface which contacts the open top surface of the PCR reaction chamber 10, that is, the bottom surface of the lid 20. It is implemented to protrude downward.
  • the protruding shape of the light transmitting part 25 may vary, but is preferably implemented in a cylindrical or square column shape.
  • the protruding shape of the light transmitting part 25 may be implemented in various ways, such that it is implemented to contact the bottom bottom surface of the PCR reaction chamber 10 (the right side of FIG. 6), or the PCR reaction. It may be implemented up to some spaced apart position upward from the bottom bottom face of the chamber 10 (left side of FIG. 6). That is, when the liquid sample is accommodated in the PCR reaction chamber 10, the light transmitting part 25 may be adjacent to or abut the surface of the liquid sample, or may pass through the surface of the liquid sample and be contained within the liquid sample. have.
  • the light transmitting part 25 may be implemented in any part of the sealing surface that contacts the open top surface of the PCR reaction chamber 10, that is, the bottom surface of the lid 20. It may be, it is preferably disposed in the center of the sealing surface, that is, the central region of the bottom surface of the cover (20).
  • the liquid sample capacity of the PCR reaction chamber 10 is not limited to a specific volume, but is preferably implemented to have a liquid sample capacity of 10 ⁇ l or less to accommodate 5 to 8 ⁇ l of liquid sample.
  • Figure 5 relates to the principle that the optical signal is emitted from the PCR product, without the influence of bubbles generated during the PCR process in the micro PCR chip according to an embodiment of the present invention.
  • the liquid sample inside the PCR vessel may be heated, thereby generating bubbles.
  • a liquid sample that is, a PCR sample and a reagent inside the PCR reaction chamber 10 of the micro PCR chip 1 according to an embodiment of the present invention is heated by a heat supply during a PCR process
  • Bubbles occur.
  • a portion of the sealed surface protruding from the bottom surface of the lid 20, that is, contacting the open top surface of the PCR reaction chamber 10 ( According to FIG. 5, the PCR reaction chamber 10 is formed by a light transmitting part 25 of a light transmitting material protruding from the central region) toward the inside of the PCR reaction chamber 10 and extending along the light path 21.
  • the formed bubble is pushed to the peripheral area of the edge surface of the light transmitting part 25 and is compressed and disposed in the peripheral space. Accordingly, the bubble completely deviates from the optical signal path (light transmitting part) 25 formed from the nucleic acid amplification product present in the liquid sample, and the optical signal sensitivity for measuring the nucleic acid amplification product is It has no effect at all. Therefore, when the nucleic acid amplification products are measured in real time during the real-time PCR process using the micro PCR chip 1 according to an embodiment of the present invention, the influence of bubbles generated inside the PCR reaction chamber 10 is not affected at all. The optical signal sensitivity is significantly increased.
  • the PCR vessel can be miniaturized.
  • the optical signal sensitivity can be significantly increased, thereby miniaturization and portability of the PCR vessel and the real-time PCR apparatus can be achieved, and further, a large number of small amount of nucleic acid amplification products can be quickly and accurately measured simultaneously. .
  • 7 to 9 are related to the flexible packing of the micro PCR chip according to an embodiment of the present invention.
  • the cover 20 of the micro PCR chip 1 includes a hole 45 penetrating through the light transmitting part 25, and the PCR reaction.
  • a flexible packing part 40 may be further included to abut the open top surface of the chamber 10 to seal the open top surface.
  • the flexible packing unit 40 serves to prevent leakage of the liquid sample due to bubble generation or pressure rise due to a temperature rise inside the PCR reaction chamber 10 during a PCR process.
  • the flexible packing part 40 is made of a material having elasticity or elasticity such as rubber or silicon to buffer the expansion force due to the bubble generation or the pressure rise, but the PCR reaction chamber 10 It is implemented to maintain the sealed state.
  • the hole 45 is implemented according to the shape of the light transmitting part 25, although it is implemented in a circular shape in Figure 7 is not limited thereto.
  • FIG. 8 illustrates a state in which the flexible packing part 40 is attached to the cover 20 but is enclosed through the light transmitting part 25, and
  • FIG. 9 illustrates that the cover 20 of FIG. The state in which the inner space of the PCR reaction chamber 10 is sealed by coupling to the upper surface of the PCR reaction chamber 10 is illustrated.
  • FIG. 10 is a micro PCR chip according to an embodiment of the present invention in which two or more unit modules including a PCR reaction chamber and a cover including a light transmitting unit are repeatedly implemented.
  • the micro PCR chip 1 significantly increases the optical signal sensitivity by the lid 20 including the PCR reaction chamber 10 and the light transmitting part 25. It is possible to implement a PCR vessel having a multi-chamber structure that can be extremely miniaturized without affecting or affecting a large number of liquid samples.
  • the micro PCR chip 1 may include two or more unit modules 50 including the PCR reaction chamber 10 and the cover 20.
  • the unit modules 50 may be arranged in a line or may be integrated in a circular space on the flat plate and implemented as two or more numbers N.
  • the unit module 50 may be implemented in 19 (19 well), 48 (48 well), 96 (96 well) and the like.
  • 11 to 12 relate to the cross-sectional exploded view of a micro PCR chip according to an embodiment of the present invention.
  • a micro PCR chip 1 may include a first plate 100 having a flat plate shape; A second plate (200) having a flat plate shape disposed on the first plate (100) and having the PCR reaction chamber (10); And a cover 20 disposed above the second plate 200 to seal the open top surface by contacting the open top surface of the PCR reaction chamber 10 and having the light transmitting part 25. It may be implemented to include a third plate 300 to play a role.
  • the first plate 100 is implemented in a flat plate shape, and serves as a bottom support of the micro PCR chip 1 according to an embodiment of the present invention.
  • the first plate 100 may be made of various materials, but in consideration of cost reduction, the first plate 100 may be made of a plastic material, for example, polycarbonate (polyarbonate, PC), polyethylene terephthalate (PET), or the like. It is preferred to be implemented with a transparent material.
  • the surface of the first plate 100 may be embodied in various ways, but is preferably treated to have a hydrophilic surface.
  • the first plate 100 may be preferably implemented in about 0.03 to 1.0 mm, more preferably in about 0.1 to 0.5 mm.
  • the second plate 200 is implemented in a flat plate shape and is disposed on the first plate 100.
  • the second plate 200 is a region of the PCR reaction chamber 10 of the micro PCR chip 1 according to an embodiment of the present invention. Serves to form.
  • the second plate 200 may be made of various materials, but in consideration of cost reduction, the second plate 200 may be made of a plastic material, for example, polycarbonate (polyarbonate, PC), polyethylene terephthalate (PET), or the like. It is preferred to be implemented with a transparent material.
  • the second plate 200 may be preferably implemented as about 0.5 to 5 mm, more preferably about 1 to 2 mm.
  • the bottom surface space of the PCR reaction chamber 10 of the micro PCR chip 1 is provided between the first plate 100 and the second plate 200.
  • An additional layer 150 in the form of a plate may be formed. This may be a bonding surface between the first plate 100 and the second plate 200, or may be an adhesive layer. Therefore, adhesion between the first plate 100 and the second plate 200 may be achieved by thermal bonding, ultrasonic bonding, ultraviolet bonding, or solvent bonding.
  • the additional layer 150 may be preferably implemented in about 0.03 to 1.0 mm, more preferably in about 0.1 to 0.5 mm.
  • the third plate 300 is implemented in a flat plate shape, but is disposed on the second plate 200, and opens the PCR reaction chamber 10 of the micro PCR chip 1 according to an embodiment of the present invention.
  • the open top surface is sealed to abut on the top surface, and serves as a cover 20 having the light transmitting part 50.
  • the third plate 200 may be made of various materials, but in consideration of cost reduction, the third plate 200 may be made of a plastic material, for example, polycarbonate (polyarbonate, PC), polyethylene terephthalate (PET), or the like. It is preferred to be implemented with a transparent material.
  • the third plate 200 may be preferably implemented as about 0.5 to 5 mm, more preferably about 1 to 2 mm.
  • the third plate 300 surrounds a hole between the second plate 200 and the third plate 300 to penetrate the light transmitting part 25, and the PCR.
  • the flexible packing part 40 may be further provided to contact the open top surface of the reaction chamber 10 to seal the open top surface.
  • the flexible packing unit 40 serves to prevent leakage of PCR samples and reagents contained in the PCR reaction chamber 10 and contamination between the plurality of chambers.
  • the flexible packing part 40 may be made of various materials having elasticity or elasticity.
  • the flexible packing part 40 may be made of silicon, telflon, or the like.
  • the flexible packing part 40 may be preferably implemented as about 0.1 to 2 mm, more preferably about 0.5 to 1 mm, and the circular hole diameter is preferably about 1.0 mm It can be implemented as.
  • Figure 13 relates to a micro PCR chip according to an embodiment of the present invention including a heat release.
  • the micro PCR chip 1 may further include a heat dissipation unit 60 implemented to discharge heat generated from the PCR reaction chamber 10 to the outside.
  • the micro PCR chip 1 according to the exemplary embodiment of the present invention has a thin plate shape as a whole and is implemented such that a plurality of unit modules 50 are integrated in a central circular region.
  • the PCR chip 1 may arrange the heat dissipation parts 60 on both sides of the central circular region.
  • FIG. 14 to 15 illustrate a real-time PCR apparatus having a single row block to which a micro PCR chip is applied according to an embodiment of the present invention.
  • the real-time PCR device 2000 includes a micro PCR chip 1 according to an embodiment of the present invention described above; One or more thermal blocks (200) implemented to thermally contact at least one surface of the micro PCR chip (1); And an optical detection module 300 implemented to detect an optical signal generated from a PCR amplification product inside the PCR reaction chamber 10 of the micro PCR chip 1.
  • the thermal block 200 is a module implemented to enable heat exchange in thermal contact with the micro PCR chip 1.
  • the thermal block 200 may be formed of various materials, and may be implemented to have a light transmittance (or partially) in order to measure the optical signal of the nucleic acid amplification product.
  • the transparent heat generating material may include all materials having heat generating property by power supply as a material having light transmittance, but preferably, indium tin oxide (ITO), a conducting polymer, carbon nano It may be selected from the group consisting of tubes (Cabon NanoTube, CNT), graphene, transparent metal oxide (TCO), and oxide-metal-oxide multilayer transparent devices.
  • ITO Indium tin oxide
  • Indium tin oxide is a mixture of indium oxide (In 2 O 3 ) and tin oxide (SnO 2 ), and is generally composed of 90% indium oxide and 10% tin oxide, and is a transparent electrode It is also called ITO.
  • Indium tin oxide has an electrical conductivity when implemented in a thin film (thin layer), and becomes yellowish gray when implemented in a lumped state, transparent and colorless.
  • Indium tin oxide is deposited on the surface of other materials by electron beam deposition, vapor deposition, and sputtering techniques.
  • Indium tin oxide is conventionally mainly used in liquid crystal displays, flat panel displays, plasma displays, touch screens, electronic paper, organic light emitting diodes, and solar cells.
  • the conducting polymer is called a plastic through which electricity is transmitted, and has the advantage of excellent light transmittance, light weight, excellent elasticity and electrical conductivity, and easy processing.
  • the conductive polymer is made from materials such as polyacetylene, polyparaenylene, polyphenol, polyaniline, and the like, and recently, may be made from polystyrene sulfonic acid and / or PEDOT (poly (3,4--ethylenedioxythiophene)).
  • Carbon NanoTube (CNT) refers to tiny molecules of 1 nanometer in diameter, with long, long rings of carbons connected by hexagonal rings.
  • Tensile force is known to be stronger than steel, more flexible, lighter, and more electrically conductive.
  • SWNT purified single-walled carbon nanotubes
  • a transparent conductor is formed, which has both transparency and conductivity.
  • Graphene graphene
  • Graphene is a material separated from graphite in the early 2000s, and is a nanomaterial composed of carbon number 6 such as carbon nanotubes and fullerenes.
  • Graphene is known to be more than 100 times higher electrical conductivity than copper, and has a very good elasticity, and has recently been implemented as a transparent electrode and used for various purposes.
  • Transparent Conductive Oxide refers to a material having transparency among various metal oxides bonded with oxygen, and includes ZnO, SnO 2 , TiO 2 , and the like. Transparent metal oxides have high conductivity and transparency and can be used as coating materials at low cost.
  • the oxide-metal-oxide multilayer transparent device is manufactured by a roll-to-roll sputtering process, and can be implemented to have flexibility of a metal, low resistance, and high permeability of an oxide.
  • the thermal block 200 may be implemented in a variety of shapes, but preferably in a flat shape.
  • the plate-shaped thermal block 200 has a large surface area in contact with the micro PCR chip 1, preferably, the plate-shaped chip, thereby providing heat evenly to the mixed solution of the PCR sample and the reagents, and thus The temperature change for each cycle can proceed rapidly.
  • the thermal block 200 may be implemented to have a light transmittance as a whole, so that most of the excitation light emitted from the light source may be transmitted as it is, thereby increasing the optical signal sensitivity.
  • the light absorbing material may be processed on the lower surface of the thermal block 200 to further increase the optical signal sensitivity.
  • the light absorbing material may be, for example, mica, but is not limited to a material having a property of absorbing light. Therefore, the light absorbing layer absorbs a part of the light derived from the light source, and the generation of reflected light acting as noise of the optical signal can be suppressed as much as possible.
  • the optical signal sensitivity may be further increased by treating an antireflective material on the upper surface of the thermal block 200.
  • the anti-reflective material may be, for example, a fluoride such as MgF 2 or an oxide such as SiO 2 or Al 2 O 3 , but is not limited as long as the material has a property of preventing light reflection.
  • the light absorbing material may be processed on the lower surface of the thermal block 200, and at the same time, the light reflection preventing material may be processed on the upper surface of the thermal block 200 to further increase the optical signal sensitivity. That is, for effective real-time PCR monitoring, the ratio of the optical signal to the noise should have the maximum possible value, and the ratio of the optical signal to the noise may be improved as the reflectance of the excitation light from the PCR chip is lower.
  • the reflectance of the excitation light of the existing thermal block of a general metallic material is about 20 to 80%, but the light reflectance is 0.2% to 4 when using the heat block 200 including the light absorbing layer or the antireflective layer. It can be reduced to within%, and when using the heat block 200 including the light absorbing layer 60 and the light reflection prevention layer 70 can reduce the light reflectance to 0.2% or less.
  • the light detection module 300 is operable to receive light emitted from the micro PCR chip 1 and a light providing unit (not shown) operably arranged to provide light to the micro PCR chip 1. It may include a light detector (not shown) disposed so as to.
  • the light providing unit is a module for providing light to the micro PCR chip (1), the light detection unit receives the light emitted from the micro PCR chip (1) PCR products carried out in the micro PCR chip (1) This module is for measuring. Light is emitted from the light providing unit, and the emitted light passes through or reflects through the PCR reaction chamber in the micro PCR chip 1, specifically, the unit module 50 of the micro PCR chip 1.
  • the light detector detects an optical signal generated by nucleic acid amplification in the PCR reaction chamber.
  • the nucleic acid amplification product (fluorescent material is bound) in the PCR reaction chamber during the PCR process in the micro PCR chip (1)
  • the light providing unit and the light detecting unit may be all disposed above or below the thermal block 200, or may be disposed respectively.
  • the arrangement of the light providing unit and the light detecting unit may be various in consideration of the arrangement relationship with other modules for optimal implementation of the real-time PCR apparatus 1000 according to another embodiment of the present invention.
  • both the light providing unit and the light detecting unit 300 may be disposed above the thermal block 200.
  • the light providing unit includes a light emitting diode (LED) light source or a laser light source, a first light filter for selecting light having a predetermined wavelength from the light emitted from the light source, and a light collecting unit for collecting light emitted from the first light filter. It may further include a first aspheric lens including a first optical lens, disposed to spread light between the light source and the first light filter.
  • the light source includes all light sources capable of emitting light, and includes a light emitting diode (LED) light source or a laser light source.
  • the first light filter selects and emits light having a specific wavelength among incident light having various wavelength bands, and may be variously selected according to the predetermined light source.
  • the first light filter may pass only light in a wavelength band of 500 nm or less of the light emitted from the light source.
  • the first optical lens collects the incident light and increases the intensity of the emitted light.
  • the first optical lens may increase the intensity of light irradiated onto the micro PCR chip 1 through the thermal block 200.
  • the light providing unit may further include a first aspherical lens disposed to spread light between the light source and the first light filter. By adjusting the arrangement direction of the first aspherical lens, the light range emitted from the light source is extended to reach the measurable area.
  • the light detector includes a second optical lens for collecting light emitted from the micro PCR chip 1, a second optical filter for selecting light having a predetermined wavelength from the light emitted from the second optical lens, and the second optical filter.
  • An optical analyzer for detecting an optical signal from light emitted from the second optical filter, and further comprising a second aspherical lens disposed between the second optical filter and the optical analyzer to integrate light emitted from the second optical filter; And a photodiode disposed between the second aspherical lens and the optical analyzer to remove noise of light emitted from the second aspherical lens and to amplify the light emitted from the second aspherical lens.
  • the integrated circuit may further include a PDIC.
  • the second optical lens collects the incident light and increases the intensity of the emitted light.
  • the second optical lens increases the intensity of light emitted from the micro PCR chip 1 through the thermal block 200 to detect the optical signal.
  • the second light filter selects and emits light having a specific wavelength among incident light having various wavelength bands, and variously selects the light according to a predetermined wavelength of light emitted from the micro PCR chip 1 through the thermal block 200.
  • the second light filter may pass only light in a wavelength range of 500 nm or less among predetermined light emitted from the micro PCR chip 1 through the heat block 200.
  • the optical analyzer is a module that detects an optical signal from light emitted from the second optical filter, and converts expression fluorescence from an PCR sample and a reagent into an electrical signal to enable qualitative and quantitative measurement.
  • the light detector may further include a second aspherical lens disposed between the second light filter and the light analyzer to integrate light emitted from the second light filter. By adjusting the arrangement direction of the second aspherical lens, the light region emitted from the second light filter is expanded to reach the measurable region.
  • the light detector may further include a photodiode disposed between the second aspherical lens and the optical analyzer to remove noise of light emitted from the second aspherical lens and to amplify the light emitted from the second aspherical lens.
  • the real-time PCR apparatus 1000 may further include a photodiode integrated circuit (PDIC).
  • PDIC photodiode integrated circuit
  • the real-time PCR apparatus 1000 adjusts the direction of light travel so that the light emitted from the light providing unit reaches the light detecting unit, and separates light having a predetermined wavelength.
  • One or more dichroic filters may be further included.
  • the dichroic filter is a module that reflects light at an angle selectively transmitted or selectively adjusted according to the wavelength.
  • the dichroic filter is disposed to be inclined at an angle of about 45 degrees with respect to the optical axis of the light emitted from the light providing unit, and selectively transmits the light having a short wavelength component and reflects the long wavelength component at a right angle according to the wavelength thereof so that the heat block ( To the micro PCR chip 1 disposed on the substrate 200). Further, the dichroic filter is disposed to be inclined at an angle of about 45 degrees with respect to the optical axis of the light reflected from the micro PCR chip 1 and the thermal block 200, and selectively transmits the light according to the wavelength of the short wavelength component. And the long wavelength component is reflected at right angles to reach the photodetector. The light reaching the light detector may be converted into an electrical signal in the optical analyzer to indicate whether the nucleic acid is amplified and the degree of amplification.
  • 16 to 18 illustrate a real-time PCR device having two column blocks to which a micro PCR chip according to an embodiment of the present invention is applied.
  • the real-time PCR device 2000 includes a micro PCR chip 1 according to the embodiment of the present invention described above; A first thermal block (100a) disposed on the substrate (400a) and implemented to be in thermal contact with the micro PCR chip (1); A second thermal block 200a disposed on the substrate 400a to be spaced apart from the first thermal block 100a and in thermal contact with the micro PCR chip 1; A chip holder 300a movable left and right and / or up and down by the driving means 500a on the first row block 100a and the second row block 200a and on which the micro PCR chip 1 is mounted; And between the first row block 100a and the second row block 200a, wherein the micro PCR chip 1 is driven by the driving means 500a by the first row block 100a and the second row.
  • the light detection module 700a and 800a are implemented to detect an optical signal generated from a PCR amplification product inside the PCR reaction chamber 10 of the micro PCR chip 1 when moving between blocks 200a.
  • the real-time PCR apparatus 2000 may include a first row block 100a disposed on the substrate 400a; A second thermal block 200a spaced apart from the first thermal block 100a on the substrate 400a; And move up, down, and / or up and down by the driving means 500a over the first and second row blocks 100a and 200a, and the micro PCR chip 1 according to an embodiment of the present invention may be And a mounted chip holder 300a.
  • the substrate 400a does not change its physical and / or chemical properties due to heating and temperature maintenance of the first thermal block 100a and the second thermal block 200a, and the first thermal block 100a and the first thermal block 100a and the second thermal block 200a do not change. It includes all materials having a material such that mutual heat exchange does not occur between the two heat blocks 200a.
  • the substrate 400a may include or be made of a material such as plastic.
  • the first row block 100a and the second row block 200a are for maintaining a temperature for performing a denaturation step, annealing step and extension (or amplification) step for amplifying the nucleic acid.
  • the first thermal block 100a and the second thermal block 200a may include or be operably connected with various modules for providing and maintaining the required temperature required for the respective steps. . Therefore, when the chip holder 300a on which the micro PCR chip 1 is mounted is in contact with one surface of each of the row blocks 100a and 200a, the first row block 100a and the second row block 200a are provided. Since the contact surface with the micro PCR chip 1 as a whole can be heated and temperature maintained, the sample solution in the micro PCR chip 1 can be uniformly heated and temperature maintained.
  • the temperature change rate in the single thermal block is within a range of 3 to 7 ° C per second
  • a real time PCR apparatus including two thermal blocks according to another embodiment of the present invention ( 2000) the rate of temperature change in each of the thermal blocks 100a and 200a is within a range of 20 to 40 ° C. per second, thereby greatly shortening the PCR progress time.
  • Hot wires may be disposed in the first row block 100a and the second row block 200a.
  • the heating wire may be operably connected with various heat sources to maintain a temperature for performing the denaturing, annealing and extending (or amplifying) steps, and may be operably connected with various temperature sensors for monitoring the temperature of the heating wire.
  • the heating wires are vertically and / or horizontally based on the center point of the surface of each of the heat blocks 100a and 200a in order to maintain a constant internal temperature of the first and second heat blocks 100a and 200a. It may be arranged to be symmetrical. The arrangement of the hot wires symmetrically in the vertical direction and / or the horizontal direction may vary.
  • a thin film heater (not shown) may be disposed in the first thermal block 100a and the second thermal block 200a.
  • the thin-film heater is vertically and / or horizontally based on a center point of each of the thermal block 100a and 200a in order to maintain a constant internal temperature of the first and second thermal blocks 100a and 200a. May be spaced apart at regular intervals.
  • the arrangement of the thin film heater that is constant in the vertical and / or horizontal directions may vary.
  • the first thermal block 100a and the second thermal block 200a may include a metal material, for example, aluminum or may be made of aluminum for even heat distribution and rapid heat transfer over the same area.
  • the first thermal block 100a may be implemented to maintain an appropriate temperature for performing the denaturation step, or the annealing and extension (or amplification) steps.
  • the first row block 100a of the real-time PCR apparatus 2000 may maintain 50 ° C. to 100 ° C., preferably in the first row block 100 a.
  • the temperature may be maintained at 90 ° C. to 100 ° C., preferably at 95 ° C., and 55 when the annealing and extension (or amplification) steps are performed in the first heat block 100a.
  • °C to 75 °C can be maintained, preferably 72 °C can be maintained.
  • the temperature of the denaturation step or the annealing and extension (or amplification) step is not limited thereto.
  • the second row block 200a may be implemented to maintain an appropriate temperature for performing the denaturation step, or the annealing and extension (or amplification) steps.
  • the second row block 200a of the PCR apparatus according to the third embodiment of the present invention may maintain 90 ° C. to 100 ° C. when the denaturation step is performed in the second row block 200 a.
  • the temperature may be maintained at 95 ° C., and may be maintained at 55 ° C. to 75 ° C., preferably at 72 ° C., when the annealing and extension (or amplification) steps are performed in the second heat block.
  • the temperature of the denaturation step or the annealing and extension (or amplification) step is not limited thereto. Therefore, the first heat block 100a may maintain the denaturing temperature of the PCR, and when the denaturation temperature is lower than 90 ° C., denaturation of the nucleic acid that is a template of the PCR occurs, resulting in poor efficiency and low PCR efficiency.
  • the denaturation step temperature is higher than 100 ° C., the enzyme used for PCR loses activity, so the denaturation step temperature may be 90 ° C. to 100 ° C., preferably 95 ° C. have.
  • the second row block 200a may maintain annealing / extension temperature of annealing and extension (or amplification) of the PCR.
  • the extension (or amplification) step temperature is lower than 55 ° C., the specificity of the PCR product may be degraded, and if the annealing and extension (or amplification) step temperature is higher than 74 ° C., the PCR may not occur. Since the efficiency is lowered, the annealing and extension (or amplification) step temperature may be 55 ° C to 75 ° C, preferably 72 ° C.
  • the first thermal block 100a and the second thermal block 200a may be spaced apart from each other at a predetermined distance such that mutual heat exchange does not occur. Accordingly, since the heat exchange does not occur between the first heat block 100a and the second heat block 200a, the denaturation step and the nucleic acid amplification reaction may be significantly affected by a slight temperature change. Accurate temperature control of the annealing and extension (or amplification) steps is possible.
  • the real-time PCR apparatus 2000 may move left and right and / or up and down by the driving means 500a over the first row block 100a and the second row block 200a, and the micro And a chip holder 300a on which the PCR chip 1 is mounted.
  • the chip holder 300a is a module in which the micro PCR chip 1 is mounted on the real time PCR device 2000.
  • the inner wall of the chip holder 300a has the micro PCR chip 1 so that the micro PCR chip 1 does not leave the chip holder 300a when the nucleic acid amplification reaction is performed by the real-time PCR device 2000. It may have a shape or structure for fixed mounting with the outer wall of.
  • the chip holder 300a is operably connected to the driving means 500a.
  • the micro PCR chip 1 may be detachable to the chip holder (300a).
  • the driving means 500a is configured to allow the chip holder 300a on which the micro PCR chip 1 is mounted to move left and right and / or up and down over the first row block 100a and the second row block 200a. Means; By the left and right movement of the driving means 500a, the chip holder 300a on which the micro PCR chip 1 is mounted can reciprocate between the first row block 100a and the second row block 200a. In addition, by the vertical movement of the driving means 500a, the chip holder 300a on which the PCR chip 10 is mounted is in contact with and separated from the first row block 100a and the second row block 200a. Can be.
  • the left and right and / or vertical movement of the driving means 500a may be controlled by a control means (not shown), which is operably disposed inside or outside the PCR device, and the control means may be modified with a modification step of PCR. It is possible to control the contact and separation between the chip holder 300a on which the micro PCR chip 1 is mounted and the first row block 100a and the second row block 200a for the annealing and extension (or amplification) steps. Can be.
  • FIG. 17 illustrates each step of the nucleic acid amplification reaction by the movement of the chip holder of the real-time PCR device 2000 according to another embodiment of the present invention.
  • Nucleic acid amplification reaction by the real-time PCR device 2000 is based on the following steps.
  • a nucleic acid for example, double-stranded DNA, an oligonucleotide primer having a sequence complementary to a specific nucleotide sequence to be amplified, DNA polymerase, deoxyribonucleotide triphosphates, dNTP in the micro PCR chip 1
  • a sample solution including a PCR buffer (PCR buffer) is introduced, and the PCR chip 10 is mounted on the chip holder 300a.
  • the first heat block 100a is heated and maintained at a temperature for the modification step, for example, 90 ° C. to 100 ° C., preferably at 95 ° C.
  • the micro PCR chip 1 is moved downward by controlling the connecting member 520a of the driving means 500a to move the chip holder 300a on which the micro PCR chip 1 is mounted in the first row.
  • Contacting block 100a performs a first denaturation step of PCR (step x).
  • the micro PCR chip 1 is moved upward by controlling the connecting member 520a of the driving means 500a to move the chip holder 300a on which the micro PCR chip 1 is mounted in the first row.
  • the nucleic acid amplification reaction is performed by repeating steps x, y, and z after moving up to 100a (circulation step).
  • the real-time PCR device 2000 is disposed between the first row block 100a and the second row block 200a, wherein the micro PCR chip 1 is driven by the driving means 500a by the driving unit 500a.
  • Optical detection modules 700a and 800a implemented to detect an optical signal generated from a PCR amplification product inside the PCR reaction chamber 10 of the micro PCR chip 1 when moving between 100a and the second row block 200a.
  • the light source 700a and the light detector 800a are included.
  • a light source 700a is disposed between the first row block 100a and the second row block 200a and is emitted from the light source 700a on the chip holder 300a.
  • the light detector 800a is disposed to detect the light to be used, or the light detector 800a is configured to detect light emitted from the light source 700a between the first and second row blocks 100a and 200a. ) May be disposed, and the light source 700a may be disposed on the chip holder 300a.
  • the light detector 800a may be disposed on the driving means 500a, and the through means 530a may be disposed on the driving means 900a to allow the light emitted from the light source 700a to pass therethrough.
  • the nucleic acid amplification reaction can be detected in real time in the micro PCR chip 1 during the nucleic acid amplification reaction by the real-time PCR device 2000. do.
  • a separate fluorescent substance may be further added to the sample solution introduced into the micro PCR chip 1.
  • the light source 700a is disposed to be as wide as possible in the spaced space between the first column block 100a and the second column block 200a and is arranged to emit the same light as much as possible.
  • the light source 700a may be operably connected to a lens (not shown) that collects light emitted from the light source 700a and an optical filter (not shown) that filters light of a specific wavelength band.
  • the nucleic acid amplification reaction by the real time PCR device 2000 detects the degree of nucleic acid amplification in the micro PCR chip 1 in real time.
  • the connecting member 520a of the driving means 500a is controlled to move the micro PCR chip 1 from above the first row block 100a to the second row block 200a.
  • the micro PCR chip 1 is moved to a second row block by moving the upper portion of the PCR or controlling the connecting member 520a of the driving means 500a after the end of the first annealing and extension (or amplification) step.
  • the chip holder 300a on which the micro PCR chip 1 is mounted is controlled to control the connecting member 520a of the driving means 500a.
  • a step of stopping on the spaced space between the first row block 100a and the second row block 200a is performed.
  • the micro PCR chip 1 specifically, the PCR reaction chamber of the micro PCR chip 1, in this case, the PCR reaction.
  • the light detector 800a detects an optical signal generated by amplification of the nucleic acid in the chamber.
  • the light passing through the micro-PCR chip 1 of the light transmissive material passes through the driving means 500a, specifically, the penetrating portion 530a disposed on the rail 510a to the light emitting portion 800a. Can be reached.
  • the amount of target nucleic acid contained in the initial reaction sample is monitored in real time by monitoring the result of the reaction by amplification of the nucleic acid (fluorescent material bound) in the reaction channel in real time. Can be measured and analyzed.
  • first to third plates 100, 200, and 300 having a flat plate shape were prepared from a plastic material.
  • the first plate 100 was manufactured to a thickness of 0.5 mm
  • the second plate 200 was made to have a thickness of 2 mm, but was prepared by integrating 19 PCR reaction chambers 10 in a central circular region.
  • the third plate 300 has a thickness of 2 mm, and implements a circular groove on the bottom surface of the third plate 300 to correspond to the central circular region, and protrudes toward the inside of the 19 PCR reaction chambers 10. It was prepared by forming.
  • a flexible packing part 50 that can be coupled to correspond to the circular groove and the light transmitting part 50 of the third plate 300 was manufactured and attached to the bottom surface of the third plate 300.
  • a double-sided adhesive tape was adhered to the upper portion of the first plate 100 and the second plate 200 was attached to the upper portion of the first plate 100.
  • the first plate 100 and the second plate 200 may be attached to each other through a thermal bonding, an ultrasonic bonding, an ultraviolet bonding, a solvent bonding method, etc. in addition to the double-sided adhesive tape.
  • PCR samples and reagents are injected into nineteen PCR reaction chambers 10 formed by the attachment of the second plate 200, and the third plate 300 to which the flexible packing unit 50 is attached is placed.
  • the PCR reaction chamber 10 was sealed by attaching an upper portion of the second plate 200. According to FIG. 19, in this experiment example, the completed micro PCR chip 1 can be confirmed.
  • 19A is an appearance of a micro PCR chip 1 according to an embodiment of the present invention
  • B is an appearance in which a perspective view of the third plate 300 is reflected in the micro PCR chip 1 of FIG.
  • FIG. C is an enlarged view showing a state where 19 unit modules 50 are arranged in the central circular region of the micro PCR chip 1 of FIG.
  • the primers used for the real-time detection of 16 food poisoning bacteria were made to be 40 to 60% of GC%, Tm value of 65 to 75 °C conditions were prepared through Primer 3, and the produced primers were commissioned by Genotech Synthesized.
  • a list of genes specifically amplified by the primer and each food poisoning bacterium is shown in Table 1 below.
  • Table 1 below the primer names quoted the names of the genes of interest.
  • the target gene in Enteropathogenic E. coli (EPEC) is the eaeA gene, the target gene in Enteroinvasive E.
  • EIEC Escher coli
  • Campylobacter coli is the ceuE gene
  • the gene targeted in Vibrio cholerae is the ompW gene
  • the gene targeted in Vibrio vulnificus is the Vvh gene.
  • a primer IPAH-shigelle
  • influenza NA was introduced as a positive control in the other two.
  • the PCR reaction solution composition and PCR reaction conditions are described in Tables 2 and 3 below, and the PCR device used a conventional PCR apparatus of BIO-RAD.
  • FIG. 20 is an electrophoresis picture showing the results of PCR performed Experimental Example 3. According to FIG. 20, when using a micro PCR chip including each primer set for 16 kinds of food poisoning bacteria according to an embodiment of the present invention, it can be confirmed that a plurality of food poisoning bacteria genes are detected accurately and quickly.
  • NC is a negative control
  • two PCs are a positive control
  • the number 1 according to the primer set of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 is the result according to the primer set of SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NO: 4 3 is the result according to the primer set of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6
  • number 4 is the result according to the primer set of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16
  • number 5 is the result according to the primer set of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18, Number 6 results from the primer sets SEQ ID NO. 9 and SEQ ID NO.

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Abstract

본 발명의 실시예는 마이크로 PCR 칩 및 이를 포함하는 실시간 PCR 장치에 관한 것으로서, 이에 따르면 다수의 소량의 샘플을 동시에 수용함과 동시에 열 블록과의 열 접촉 효율을 최대한 확보하여 신속한 결과를 확보할 수 있고, 더 나아가 핵산 증폭 산물로부터 발광하는 광신호를 별도의 여과 또는 가공 없이도 정확하게 측정할 수 있는 마이크로 PCR 칩을 제공할 수 있고, 아울러 이를 전제로, 복잡한 광신호 측정모듈 없이도 신뢰성이 확보된 핵산증폭 결과를 신속하게 얻을 수 있는 실시간 PCR 장치를 제공할 수 있다.

Description

식중독 검출용 프라이머 세트를 포함하는 마이크로 PCR 칩, 이를 포함하는 실시간 PCR 장치, 및 이를 이용한 식중독 검출 방법
본 발명은 식중독균 검출용 프라이머 세트를 포함하는 마이크로 PCR 칩, 이를 포함하는 실시간 PCR 장치, 및 이를 이용한 식중독 검출 방법에 관한 것이다.
식중독균은 주로 육류, 낙농제품, 식수 등 음식을 통하여 전파되므로, 음식과 같은 시료에서 식중독균의 존재 여부를 신속하고 경제적으로 확인할 수 있는 방법이 요구된다. 식중독균을 검출하기 위한 통상적 방법은 선택적 배지에서 시료를 배양하여, 식중독균로 추측되는 균을 분리한 후, 이를 생화학적 또는 면역학적 방법으로 확인하는 것이다. 그러나, 항체를 이용한 면역학적인 방법은 높은 정확도로 세균의 검출이 가능하지만, 많은 양의 시료가 필요하고, 각 진단에 필요한 항체를 생산하기 위해서는 해당 세균의 단백질 순화, 생산 또는 펩타이드 제작이 필수적이며, 높은 항체 생산 비용이 요구된다. 또한, 단백질의 특성상 보관과 이용상의 어려움이 많고, 한 번에 한 종류 또는 제한된 종류의 세균 검출만이 가능하며, 세균의 배양 및 실험 단계에 있어서 긴 시간이 소모된다. 이러한 단점을 개선하기 위하여, PCR 방법을 이용한 각종 세균 검출 키트들이 연구 개발되기 시작하였다. PCR 방법을 이용한 검출 키트들은 높은 정확성과 간편성, 신속성 때문에 각종 분야에서 날로 그 수요가 증가하고 있다.
특히, 최근 많이 사용되고 있는 실시간 PCR 방법은 PCR 증폭 산물의 증가를 PCR의 매 주기마다 실시간으로 관찰하는 방법으로, PCR 증폭 산물과 반응하는 형광 물질의 검출과 정량으로 해석하는 방법이다. 이 방법은 기존의 PCR 방법이 최종 단계를 마치고 겔 상에서 염색하여 전기 영동 후 PCR 증폭 산물을 확인하는 것에 비해, 전기 영동의 추가 작업이 필요 없고, 정확도 및 민감도가 뛰어나며, 재현율이 높고, 자동화가 가능하며, 결과를 수치화할 수 있고, 신속하고 간편하며, EtBr(Ethidium Bromide)과 같은 염색제에 의한 오염 및 자외선 조사 등의 유해문제에 따른 생물학적 안전성이 뛰어나고, 자동으로 특이 유전자의 증폭 유무를 확인할 수 있다는 장점이 있다. 따라서, 실시간 PCR 방법을 통해 PCR 또는 항원/항체와 같은 정성적인 결과가 아닌 높은 특이도를 갖는 정량적인 결과를 확인할 수 있다. 또한 형광 표지 인자로 표지된 프로브를 이용하기 때문에 DNA 칩이나 항원/항체 반응에 사용되는 시료의 양 보다 적은 양의 시료로도 결과를 확인할 수 있다. 따라서, 음식물 내의 식중독균의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단하기 위해 실시간 PCR 방법을 이용한 식중독균의 검출 방법 및 검출 키트 개발의 필요성이 요구되고 있다.
실시간 PCR(real-time Polymerase chain reaction)은 핵산 증폭 산물을 겔(gel) 상에서의 전기영동 수행 없이도 반응 순환(cycle) 동안 실시간으로 확인할 수 있다는 장점으로 근래 핵산 분석 수행에 있어서 많이 활용되고 있다. 일반적으로, 실시간 PCR을 구현하기 위한 장치는 핵산 증폭 반응을 수행하는 1 이상의 열 블록(heating block)을 구비하는 열 순환 장치(thermal cycler) 및 핵산 증폭 산물로부터 발생하는 신호를 실시간으로 측정하기 위한 신호 검출기를 포함한다. 이와 같은 신호 검출기는 핵산 증폭 산물로부터 발생하는 형광 신호를 검출하기 위한 광 검출기, 핵산 증폭 산물과 이와 상호 결합하는 매개체의 특이적 결합을 통해 발생하는 전기적 신호를 검출하기 위한 전기적 신호 검출기 등으로 예시될 수 있다.
한편, 최근 의료 분야에 있어서, 맞춤 의학을 구현하기 위한 효율적인 진단 및 치료 방법이 활발하게 개발되고 있는데, 맞춤 의학을 실질적으로 실현하기 위해서는 다수의 개체에 대한 신속하고 정확한 진단 및 치료가 필요하다. 이 경우 진단 및 치료에 있어서, 핵산 증폭 단계는 가장 기초가 되는 전제 과정이고, 이를 수행하는 일 예인 실시간 PCR은 맞춤 의학 실현에 있어서 전제되는 단계라 할 것이다. 그러나, 실시간 PCR은 복잡한 수행 과정을 전제하기 때문에 완료 단계까지 상당한 시간이 소요되고, 이를 구현하기 위한 장치는 대부분 비싸고, 대형이어서 실질적인 맞춤 의학 실현에 장애가 되고 있다. 이와 같은 문제점을 해결하고자 최근 많은 시도가 이루어지고 있다.
이와 관련하여, 한국공개특허 제10-2004-0048754호(온도 제어가 가능한 리얼타임 형광 검색 장치)는 수백에서 수천의 샘플에서 여러 파장대(Wavelength)의 형광을 수초 내에 빠르고 낮은 샘플의 농도에서도 민감하게 검색하되, 효소 반응들을 리얼타임으로 검색하고 분석할 수 있으며 경제적인 가격에 휴대 가능한 소형의 형광 검색 장치를 제공한다. 구체적으로, 상기 선행 형광 검색 장치는 생물학적 샘플에 광원을 조사한 후 상기 샘플에서 방사되는 형광을 검색하여 샘플을 분석하는 장치로서, 샘플 용기, 상기 샘플 용기를 조사하도록 위치하는 광원, 상기 샘플에서 방사되는 형광을 탐지하는 탐지기, 상기 샘플에서 방사되는 형광을 상기 탐지기로 이동시키는 형광 이동 장치, 파장 선택 장치, 및 제어부를 포함하는 형광 검색 장치에 있어서, 다수의 LED 가 순차적으로 발광되도록 배열된 LED 어레이; 샘플 용기를 삽입하기 위한 다수의 웰을 가지는 웰 체임버 블록; 상기 LED 어레이의 각 LED 발광에 의해 상기 샘플에서 방사되는 형광을 탐지하기 위한 다중 채널 PMT; 및 상기 각 샘플에서 방사되는 형광을 개별적으로 상기 다중 채널 PMT 로 이동시키기 위한 다수의 광섬유를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 한국등록특허 제10-0794703호(생화학적 반응의 실시간 모니터링 장치)는 반응 튜브 플레이트 내의 반응 시 광 검출 감도 편차를 최소화하여 다종의 시료의 반응 정도를 비교분석할 수 있는 장치를 제공한다. 구체적으로, 상기 선행 실시간 모니터링 장치는 반응 튜브에 열을 공급할 수 있는 열공급원인 열전소자와 상기 반응 튜브에 열을 전달하기 위한 열전달 블록으로 이루어진 온도 조절 블록계; 상기 반응 튜브 내의 시료에 균일한 광을 조사하기 위한 램프와 광 도파관으로 이루어진 조사 광원부; 및 광 경로를 바꾸는 반사경과 상기 조사 광원부에 의해 조사되는 광에 의해 상기 반응 튜브내의 시료에서 발생되는 형광을 수광하기 위한 수광부로 구성된 광학계를 포함한다.
또한, 한국등록특허 제10-1089045호(핵산증폭반응 산물의 실시간 모니터링 장치)는 다수의 미량 시료를 중합효소연쇄반응과 같은 핵산 증폭반응을 수행하면서 반응 중에 생성되는 반응산물의 생성을 실시간으로 모니터링하기 위한 것으로서, 여기광과 형광의 간섭을 효율적으로 분리하기 위해 편광자, 편광빔분할기, 편광변환기 등을 포함하는 생화학 반응의 실시간 모니터링 장치를 제공한다.
또한, 한국공개특허 제10-2008-0103548호(핵산 증폭 생성물의 실시간 검출 장치)는 수정을 위해 사용하는 제2 형광신호를 사용하는 일 없이, 장치상의 오차 요인을 효과적으로 배제 또는 저감시킬 수 있도록, 복수의 웰에 온도 사이클을 부여하여, 각 웰에 있어서의 핵산 증폭 생성물로부터의 형광 강도를 실시간으로 검출하고, 더 나아가 웰로부터 얻어지는 형광 측정값 [DNA]raw와 이 웰 근방에 있어서의 주변의 연결벽으로부터 얻어지는 형광 측정값 [DNA]bg를 검출하고, 형광 측정값 [DNA]raw로부터 형광 측정값 [DNA]bg를 뺌으로써 당해 웰의 형광 강도 [DNA]real을 결정할 수 있는 핵산 증폭 생성물의 실시간 검출 장치를 제공한다.
또한, 한국등록특허 제10-0794699호(핵산증폭반응 산물의 실시간 모니터링 장치)는 다수의 미량 시료를 중합효소연쇄반응과 같은 핵산 증폭반응을 수행하면서 반응 중에 생성되는 반응산물의 생성을 실시간으로 모니터링하기 위해 다수의 시료를 담기 위한 다수의 웰을 가지는 반응용기와 상기 반응용기를 덮기 위한 투명한 실링커버, 및 반응용기에 열원을 공급하기 위한 열전소자로 이루어지는 시료반응부; 여기광원 앞에 위치하는 선택적 투과 필터, 필터를 통과한 광을 선편광시키기 위한 선편광자로 이루어지는 발광 소자부; 발광소자부의 선편광자에 수직한 방향으로 되어 있는 선편광자, 선편광자를 통과한 광을 집광하는 집광렌즈, 집광렌즈를 통과한 광을 선택적으로 투과시키는 선택적 투과필터 및 형광감지소자로 이루어지는 수광소자부를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산증폭반응산물의 실시간 모니터링 장치를 제공한다.
그러나, 상기 선행기술들은 다수의 핵산증폭 산물을 동시에 측정하기 위해 복잡하고 정교한 형광 신호 측정 모듈을 다수 추가하기 때문에 기기의 대형화 및 고비용 발생 문제가 여전히 문제되고 있다. 더 나아가, 상기 선행기술들은 다수의 소량 샘플을 동시에 측정하는 것을 목적으로 하지만, 핵산증폭 과정 중 소형 반응 용기에 수용된 소량의 샘플 용액에서 가열에 의해 발생하는 버블(bubble)에 의해 신호 감도가 현저히 감소하는 현상에 대해 해결 방법은 전혀 개시하지 않고 있다.
따라서, 다수의 소량의 핵산 증폭 산물을 동시에 측정함과 동시에 측정값의 신뢰성을 확보하고, 더 나아가 저비용으로 신속하게 핵산 증폭 산물의 실시간 모니터링이 가능한 실시간 PCR 구현 장치가 여전히 요구된다 할 것인데, 이는 복수의 식중독균을 동시에 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 검출 장치 및 이를 이용한 식중독균 검출 방법에 응용 가능하다.
본 발명은 다수의 소량의 핵산 증폭 산물을 동시에 신속하게 측정할 수 있고, 저가의 비용으로 핵산 증폭 산물을 검출하고, 더 나아가 결과의 신뢰성을 확보할 수 있는 마이크로 PCR 칩을 활용하여 16종의 식중독균을 동시에 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 식중독 검출 장치 및 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 언급된 해결하고자 하는 과제를 수행하기 위하여,
본 발명의 일 실시예는 상단 면이 개방된 16개 이상의 PCR 반응 챔버(chamber); 및 상기 PCR 반응 챔버의 개방 상단 면에 맞닿아 상기 개방 상단 면을 밀폐하고, 상기 개방 상단 면에 맞닿는 밀폐 면 중 일부 영역으로부터 상기 PCR 반응 챔버의 내부를 향해 돌출되되 광 경로를 따라 연장된 광 투과성 재질의 광 투과부를 구비하는 덮개(cover); 를 포함하는 것으로서, 상기 16개 이상의 PCR 반응 챔버 내에 서열번호 1의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 2의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Listeria monocytogenes의 iap (invasion associated protein) 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 3의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 4의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Staphylococcus aureus의 nucA (nuclease) 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 5의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Shigella spp.의 ipaH (invasive plasmid antigen gene) 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 7의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Vibrio parahaemolyticus의 toxR 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 9의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Bacillus cereus의 enterotoxin FM (entFM) 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 11의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Salmonella spp.의 invA (invasion protein) 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 13의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 14의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Yersinia enterocolitica의 ail (attachment invasion locus) 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 15의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 16의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Clostridium perfringens의 cpe (C. perfringens enterotoxin) 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 17의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 18의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Campylobacter jejuni의 hipO 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 19의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 20의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Enterotoxigenic E.coli (ETEC)의 LT (heat-labile enterotoxin) 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 21의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 22의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Enterohemorrhagic E.coli (EHEC)의 STX1 (shiga-like toxin-1) 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 23의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 24의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Enteropathogenic E.coli (EPEC)의 eaeA 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 25의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 26의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Enteroinvasive E.coli (EIEC)의 invA 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 27의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 28의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Camphylobacter coli의 ceuE 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 29의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 30의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Vibrio cholera의 ompW 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 및 서열번호 31의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 32의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Vibrio vulnificus의 Vvh 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 프라이머 세트를 각각 포함하는, 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩(Micro-Polymerase Chain Reaction chip)을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면,
상기 PCR 반응 챔버는 10 ㎕ 이하의 액체 샘플 수용량을 갖도록 구현될 수 있다. 이 경우, 상기 PCR 반응 챔버는 5 내지 8 ㎕의 액체 샘플을 수용할 수 있다.
상기 광 투과부는 상기 밀폐 면의 중앙에 배치될 수 있다.
상기 광 투과부는 상기 PCR 반응 챔버의 하단 바닥 면에 닿거나, 상기 PCR 반응 챔버의 하단 바닥 면으로부터 상향으로 일부 이격된 위치까지 구현될 수 있다.
상기 덮개는 상기 광 투과부를 관통하여 둘러싸는 홀(hole), 및 상기 PCR 반응 챔버의 개방 상단 면에 맞닿아 상기 개방 상단 면을 밀폐하는 플렉서블(flexible) 패킹부를 더 구비할 수 있다.
상기 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩은 평판 형상을 갖도록 구현될 수 있다.
식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩은 평판 형상의 제1 판; 상기 제1 판의 상부에 배치되는 것으로서, 상기 PCR 반응 챔버를 구비하는 평판 형상의 제2 판; 및 상기 제2 판의 상부에 배치되는 것으로서, 상기 PCR 반응 챔버의 개방 상단 면에 맞닿아 상기 개방 상단 면을 밀폐하되, 상기 광 투과부를 구비하는 덮개 역할을 수행하는 제3 판을 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 제2 판과 제3 판 사이에 상기 광 투과부를 관통하도록 둘러싸는 홀(hole), 및 상기 PCR 반응 챔버의 개방 상단 면에 맞닿아 상기 개방 상단 면을 밀폐하는 플렉서블 패킹부를 더 포함할 수 있다.
상기 PCR 반응 챔버로부터 발생하는 열을 외부로 방출하도록 구현된 열 방출부를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예는 상기 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩; 상기 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩의 적어도 일 면에 열 접촉하도록 구현된 1 이상의 열 블록; 및 상기 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩의 PCR 반응 챔버 내부의 PCR 증폭 산물로부터 발생하는 광신호를 검출하도록 구현된 광 검출 모듈을 포함하는, 실시간 PCR 장치를 제공한다.
본 발명의 다른 일 실시예는 상기 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩; 기판 상에 배치되되 상기 마이크로 PCR 칩과 열 접촉하도록 구현된 제1 열 블록; 상기 기판 상에 상기 제1 열 블록과 이격 배치되되 상기 마이크로 PCR 칩과 열 접촉하도록 구현된 제2 열 블록; 상기 제1 열 블록 및 제2 열 블록 위로 구동 수단에 의해 좌우 및/또는 상하 이동 가능하고, 상기 마이크로 PCR 칩이 장착된 칩 홀더; 및 상기 제1 열 블록과 제2 열 블록 사이에 배치되되, 상기 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩이 상기 구동 수단에 의해 상기 제1 열 블록과 제2 열 블록 간 이동시 상기 마이크로 PCR 칩의 PCR 반응 챔버 내부의 PCR 증폭 산물로부터 발생하는 광신호를 검출하도록 구현된 광 검출 모듈을 포함하는, 실시간 PCR 장치를 제공한다.
상기 언급된 과제 해결 수단에 따르면, 다수의 소량의 핵산 증폭 산물을 동시에 신속하게 측정할 수 있고, 저가의 비용으로 핵산 증폭 산물을 검출하고, 더 나아가 결과의 신뢰성을 확보할 수 있는 마이크로 PCR 칩을 활용하여 16종의 식중독균을 동시에 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 식중독 검출 장치 및 검출 방법을 제공할 수 있다.
도 1 내지 3은 종래 PCR 용기(대형) 대비 극-소형화된 PCR 용기(소형, ×1/20) 내부에서 PCR 과정 중 발생한 버블(bublle)에 의해 광신호 감도가 감소하는 현상에 관한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩의 기본 구성에 관한 단면도에 관한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩 내부에서 PCR 과정 중 발생한 버블에 의한 영향 없이, PCR 산물로부터 광신호가 방출되는 원리에 관한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩의 광 투과부의 다양한 유형에 관한 것이다.
도 7 내지 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩의 플렉서블 패킹부에 관한 것이다.
도 10은 PCR 반응 챔버, 및 광 투과부를 구비하는 덮개를 포함하는 단위 모듈이 2 이상 반복 구현된 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩에 관한 것이다.
도 11 내지 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩의 단면 분해도에 관한 것이다.
도 13은 열 방출부를 포함하는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩에 관한 것이다.
도 14 내지 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩, 상기 마이크로 PCR 칩과 열 접촉하는 열 블록, 및 상기 마이크로 PCR 칩의 PCR 반응 챔버 내부의 PCR 증폭 산물로부터 발생하는 광신호를 검출하도록 구현된 광 검출 모듈을 포함하는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 실시간 PCR 장치에 관한 것이다.
도 16 내지 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩, 2개의 열 블록, 상기 마이크로 PCR 칩이 장착되되 구동 수단에 의해 상기 2개의 열 블록 간에 이동 가능한 칩 홀더, 및 상기 2개의 열 블록 사이에 배치되되 상기 마이크로 PCR 칩이 상기 구동 수단에 의해 상기 2개의 열 블록 간 이동시 상기 마이크로 PCR 칩의 PCR 반응 챔버 내부의 PCR 증폭 산물로부터 발생하는 광신호를 검출하도록 구현된 광 검출 모듈을 포함하는, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 실시간 PCR 장치에 관한 것이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩의 실제 구현 도면이다.
도 20은 16종의 식중독균에 관한 프라이머 세트를 포함하는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩을 이용하여 PCR을 수행한 전기영동 사진이다.
도 21은 도 20의 전기영동 사진의 번호에 해당하는 16개의 식중독균을 나타낸 표에 관한 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 실시예들을 상세하게 설명한다. 이하 설명은 본 발명에 따른 실시예들을 쉽게 이해하기 위한 수단일 뿐이며, 본 발명의 보호범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
본 발명의 실시예는 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR), 더 구체적으로, 실시간으로 핵산 증폭 반응을 모니터링하는 실시간 PCR(real-time PCR)에 관한 것이다.
PCR은 핵산을 포함하는 PCR 시료 및 시약을 반복적으로 가열 및 냉각하여 핵산의 특정 염기 서열 부위를 연쇄적으로 복제하여 그 특정 염기 서열 부위를 갖는 핵산을 기하급수적으로 증폭하는 기술로써, 생명과학, 유전공학 및 의료 분야 등에서 질병의 진단 및 분석 목적으로 현재 널리 사용되고 있다. PCR을 효율적으로 수행하기 위한 PCR 장치가 최근 다양하게 개발되고 있다. PCR 장치는 특정 염기 서열을 갖는 핵산을 증폭하는 PCR을 수행하기 위하여 구현된 장치를 통칭한다. 일반적으로, PCR 장치는 이중 가닥의 DNA를 포함하는 PCR 시료 및 시약을 특정 온도, 예를 들어 약 95℃로 가열하여 상기 이중 가닥의 DNA를 단일 가닥의 DNA로 분리하는 변성 단계(denaturing step), 상기 PCR 시료 및 시약에 증폭하고자 하는 특정 염기 서열과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프라이머를 제공하고, 상기 분리된 단일 가닥의 DNA와 함께 특정 온도, 예를 들어 55℃로 냉각하여 상기 단일 가닥의 DNA의 특정 염기 서열에 상기 프라이머를 결합시켜 부분적인 DNA-프라이머 복합체를 형성하는 어닐링 단계(annealing step), 및 상기 어닐링 단계 이후 상기 PCR 시료 및 시약을 DNA 중합효소의 활성온도, 예를 들어 72℃로 유지하여 DNA 중합효소(polymerase)에 의해 상기 부분적인 DNA-프라이머 복합체의 프라이머를 기초로 이중 가닥의 DNA를 형성하는 연장(또는 증폭) 단계(extension step)를 수행하고, 상기 연장(또는 증폭) 단계를 예를 들어, 20회 내지 40회로 반복함으로써 상기 특정 염기 서열을 갖는 DNA를 기하급수적으로 증폭할 수 있도록 구현된다. 한편, 최근 PCR 장치는 상기 어닐링 단계와 상기 연장(또는 증폭) 단계를 동시에 수행할 수 있고, 이 경우 상기 PCR 장치는 상기 변성 단계에 이은 상기 어닐링 및 연장 (또는 증폭) 단계로 구성된 2 단계를 수행함으로써, 제1 순환을 완성할 수도 있다.
실시간 PCR은 PCR에 사용되는 열 순환기(thermal cycler)에 측정 장치, 예를 들어 형광 광도계 등과 같은 광학 시스템(optical system) 모듈이 적용되어 핵산 증폭 산물이 생성되는 과정을 모니터링할 수 있는 핵산 증폭 반응을 말한다. 실시간 PCR은 일반적인 PCR과는 달리, 핵산 증폭 산물의 확인을 위한 전기영동이 요구되지 않아 실시간으로 정확하고 신속하게 핵산 증폭 산물을 분석할 수 있다는 장점이 있다. 그에 따라, 최근 실시간 PCR 장치가 또한 활발하게 개발되고 있는데, 실시간 PCR 장치가 위와 같은 장점을 충분히 발휘하기 위해서는 열 순환기의 효율을 상승시키는 것뿐만 아니라 핵산 증폭 산물로부터 발생하는 광신호를 오류 없이 정확하게 측정할 수 있어야 한다.
도 1 내지 3은 종래 PCR 용기(대형) 및 극-소형화된 PCR 용기(소형, ×1/20) 내부에서 PCR 과정 중 발생한 버블(bublle)에 의해 광신호 감도가 감소하는 현상에 관한 것이다.
맞춤 의료 서비스의 실질적인 실현을 위해 최근 PCR 장치는 소형화, 휴대화, 신속성, 및 경제성을 지향하고 있다. 기존 PCR 장치는 PCR 시료 및 시약을 담는 용기뿐만 아니라 기기 그 자체도 대형이어서 사용 조작이 어렵고, 휴대하기 어려웠을 뿐만 아니라 그에 따라 PCR 시료 및 시약도 상당히 낭비되었고, 비용 또한 상당히 발생하는 문제점이 있었다. 더 나아가, 사용되는 PCR 시료 및 시약의 양이 많아서 상당히 시간이 소요되어 효율적인 PCR이 구현되기 어려웠다.
도 1에 따르면, 좌측 그림은 종래 일반적으로 사용되는 PCR 용기(대형)이고, 우측 그림은 상기 PCR 용기(대형) 대비 크기 및 액체 샘플 수용량을 극-소형화(×1/20)한 PCR 용기(소형)를 도시한다. 일반적으로, 종래 PCR 용기(대형)는 PCR 시료 및 시약을 담는 반응 챔버(reaction chamber) 및 이의 덮개(cover)로 구성되고, 상기 반응 챔버와 덮개는 광 투과성 재질로 구현되며, 약 200 ㎕의 액체 샘플 수용량을 갖고, 약 20 ㎕의 시료와 시약을 수용한 상태에서 PCR이 수행되었다. 상기 PCR 용기(소형) 역시 PCR 시료 및 시약을 담는 반응 챔버(reaction chamber) 및 이의 덮개(cover)로 구성되고, 상기 반응 챔버와 덮개는 광 투과성 재질로 구현될 수 있는데, 이 경우 상기 PCR 용기(소형)는 약 10 ㎕의 액체 샘플 수용량을 갖고, 약 5 내지 8 ㎕의 시료와 시약을 수용한 상태에서 PCR이 수행된다. 이와 같이, 극-소형화된 PCR 용기를 제작하는 것은 현재 공지된 기술 영역에서 용이하게 구현할 수 있다. 그러나, PCR 용기의 소형화는 핵산 증폭 산물의 측정에 있어서 아래와 같이 상당한 악영향을 미치기 때문에 쉽게 구현되기 어렵다.
도 2에 따르면, 종래 PCR 용기(대형) 대비 극-소형화된 PCR 용기(소형, ×1/20) 내부에서 PCR 과정 중 발생한 버블(bublle)로 인해 광신호 감도가 감소하는 현상을 쉽게 확인할 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, PCR은 열 공급 단계를 수반하므로, PCR 용기 내부는 액체 샘플의 가열에 의해 상당한 양의 버블이 발생하는데, 이러한 버블은 핵산 증폭 산물로부터 발생하는 광신호(light signal)를 차단하게 된다. 한편, 도 2에 따르면, 상기 PCR 용기(대형) 내부에서 발생하는 버블은 비록 핵산 증폭 산물로부터 발생하는 광신호를 차단하여 광신호 감도를 감소시키지만, 버블 자체의 크기 및 개수 대비 반응 용기의 내부 공간이 충분히 크기 때문에 상기 버블은 상기 PCR 용기(대형)의 내부에서 분산되거나 상기 PCR 용기(대형)의 내벽에 군집을 형성하여 비록 광신호 감도가 떨어지기는 하지만, 광신호 측정이 불가능한 것은 아니다. 그러나, 도 2 및 도 2의 "a" 부분을 확대한 도 3에 따르면, 상기 PCR 용기(소형) 내부에서 발생하는 버블은 버블 자체 크기 및 개수 대비 반응 용기의 내부 공간이 상당히 작기 때문에 상기 버블은 핵산 증폭 산물로부터 발생하는 광신호를 차단하여 광신호 감도를 상당하게 떨어뜨리고 불균일하게 하여 결과의 신뢰도가 떨어진다. 따라서, PCR 장치를 소형화함과 동시에 이에 장착되는 PCR 용기의 소형화를 구현하는 경우 그만큼 광신호 감도의 감소 및 불균일에 따른 결과의 신뢰성을 확보하는 방안을 충분히 고려해야 한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩의 기본 구성에 관한 단면도에 관한 것이다.
도 4에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(Micro-Polymerase Chain Reaction Chip)(1)은 상단 면이 개방된 PCR 반응 챔버(chamber)(10); 및 상기 PCR 반응 챔버(10)의 개방 상단 면에 맞닿아 상기 개방 상단 면을 밀폐하고, 상기 개방 상단 면에 맞닿는 밀폐 면 중 일부 영역으로부터 상기 PCR 반응 챔버(10)의 내부를 향해 돌출되되 광 경로(21)를 따라 연장된 광 투과성 재질의 광 투과부(25)를 구비하는 덮개(cover)(20)를 포함한다.
상기 PCR 반응 챔버(10)는 상단 면이 개방되되 하단 면 및 측 테두리 면이 밀폐되어 액체 샘플, 즉 PCR 시료 및 시약을 수용하도록 구현된다. 상기 PCR 반응 챔버(10)는 PCR 과정 중 반복적인 가열 및 냉각에 영향을 받지 않도록 구현되어야 하고, 이러한 기능을 유지할 수 있다면 특정 형상 및/또는 재질로 제한되진 않는다. 다만, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)은 핵산 증폭 산물의 실시간 광신호 측정을 전제로 하기 때문에, 적어도 광 경로(21)에 중첩되는 부분은 광 투과성 재질로 구현되는 것이 바람직하다.
상기 덮개(20)는 상기 PCR 반응 챔버(10)의 개방 상단 면에 맞닿아 상기 개방 상단 면을 밀폐하는 역할을 수행한다. 상기 덮개(20)가 상기 PCR 반응 챔버(10)의 개방 상단 면을 밀폐함으로써, 상기 PCR 반응 챔버(10) 내부에서 반응하는 PCR 시료 및 시약은 외부로 유출되지 않으며, 상기 PCR 반응 챔버(10) 내부 온도를 유지하는 역할을 한다. 한편, 상기 덮개(20)는 위와 같은 기능을 구현할 수 있다면 다양한 형상 및/또는 재질로 구현될 수 있다. 다만, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)은 핵산 증폭 산물의 실시간 광신호 측정을 전제로 하기 때문에, 광 투과성 재질로 구현되는 것이 바람직하다.
한편, 도 4에 따르면, 상기 덮개(20)는 상기 개방 상단 면에 맞닿는 밀폐 면 중 일부 영역으로부터 상기 PCR 반응 챔버(10)의 내부를 향해 돌출되되 광 경로(21)를 따라 연장된 광 투과성 재질의 광 투과부(25)를 구비한다. 상기 광 투과부(25)는 광 투과성 재질로 구현되고 핵산 증폭 산물의 측정을 위한 광 경로(21)를 따라 연장되도록 구현되며, 상기 PCR 반응 챔버(10) 내부의 핵산 증폭 산물로부터 발생하는 광신호가 통과하는 부분이다. 더 나아가, 상기 광 투과부(25)는 상기 PCR 반응 챔버(10)의 개방 상단 면에 맞닿는 밀폐 면, 즉 상기 덮개(20)의 하단 면의 일부 영역으로부터 상기 PCR 반응 챔버(10)의 내부를 향해 하향 돌출되도록 구현된다. 상기 광 투과부(25)의 돌출 형상은 다양할 수 있으나, 원기둥 또는 사각기둥 형상으로 구현되는 것이 바람직하다. 또한, 도 6에 따르면, 상기 광 투과부(25)의 돌출 형상은 다양하게 구현될 수 있는데, 상기 PCR 반응 챔버(10)의 하단 바닥 면에 닿도록 구현되거나(도 6의 우측), 상기 PCR 반응 챔버(10)의 하단 바닥 면으로부터 상향으로 일부 이격된 위치까지 구현될 수 있다(도 6의 좌측). 즉, 상기 광 투과부(25)는 상기 PCR 반응 챔버(10) 내부에 액체 샘플이 수용되는 경우 상기 액체 샘플 표면에 인접하거나 맞닿거나, 더 나아가 상기 액체 샘플 표면을 통과하여 상기 액체 샘플 내부에 담겨질 수도 있다. 아울러, 상기 광 투과부(25)는 광 경로를 따라 연장되도록 구현된다면, 상기 PCR 반응 챔버(10)의 개방 상단 면에 맞닿는 밀폐 면, 즉 상기 덮개(20)의 하단 면의 임의의 일부 영역에 구현될 수 있는데, 상기 밀폐 면의 중앙, 즉 상기 덮개(20)의 하단 면의 중앙 영역에 배치되는 것이 바람직하다. 한편, 상기 PCR 반응 챔버(10)의 액체 샘플 수용량은 특정 부피로 제한되진 않지만, 10 ㎕ 이하의 액체 샘플 수용량을 갖도록 구현되어 5 내지 8 ㎕의 액체 샘플을 수용할 수 있도록 구현되는 것이 바람직하다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩 내부에서 PCR 과정 중 발생한 버블에 의한 영향 없이, PCR 산물로부터 광신호가 방출되는 원리에 관한 것이다.
PCR 과정이 진행되면서 PCR 용기 내부의 액체 샘플이 가열되어 그에 따라 버블이 발생할 수 있음은 이미 설명한 바와 같다.
도 5에 따르면, PCR 과정 중 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)의 PCR 반응 챔버(10) 내부의 액체 샘플(liquid sample), 즉 PCR 시료 및 시약이 열 공급에 의해 가열되면 버블(bubble)이 발생한다. 그러나, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)의 경우 상기 덮개(20)의 하단 면으로부터 돌출된, 즉 상기 PCR 반응 챔버(10)의 개방 상단 면에 맞닿는 밀폐 면 중 일부 영역(도 5에 따르면, 중앙 영역)으로부터 상기 PCR 반응 챔버(10)의 내부를 향해 돌출되되 광 경로(21)를 따라 연장된 광 투과성 재질의 광 투과부(25)에 의해 상기 PCR 반응 챔버(10)에 형성된 버블(bubble)이 상기 광 투과부(25)의 테두리 면의 주변 영역으로 밀려서 주변 공간에 압축 배치된다. 그에 따라, 상기 버블(bubble)은 상기 액체 샘플(liquid sample)에 존재하는 핵산 증폭 산물로부터 형성된 광신호 경로(광 투과부, 25)를 완전히 이탈하게 되고, 핵산 증폭 산물을 측정하기 위한 광신호 감도에 전혀 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)을 이용하여 실시간 PCR 과정 중 핵산 증폭 산물을 실시간으로 측정하는 경우 상기 PCR 반응 챔버(10) 내부에 발생한 버블(bubble)의 영향을 전혀 받지 않게 되어 광신호 감도가 상당하게 증가하게 된다. 그 결과, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)에 의하면, 종래 PCR 용기에 비해 그 액체 샘플 수용량을 예를 들어, 10 ㎕ 이하로 크게 줄일 수 있기 때문에 PCR 용기를 극-소형화할 수 있고, 동시에 광신호 감도를 상당하게 증가시킬 수 있기 때문에 PCR 용기 및 실시간 PCR 장치의 소형화 및 휴대화를 달성할 수 있고, 더 나아가 다수의 소량의 핵산 증폭 산물을 동시에 신속하게 정확하게 측정할 수 있다.
도 7 내지 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩의 플렉서블 패킹부에 관한 것이다.
도 7 내지 9에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)의 덮개(20)는 상기 광 투과부(25)를 관통하여 둘러싸는 홀(hole)(45), 및 상기 PCR 반응 챔버(10)의 개방 상단 면에 맞닿아 상기 개방 상단 면을 밀폐하는 플렉서블(flexible) 패킹부(40)를 더 포함할 수 있다.
상기 플랙서블 패킹부(40)는 PCR 과정 중 상기 PCR 반응 챔버(10) 내부의 온도 상승에 의한 버블(bubble) 발생 또는 압력 상승에 의해 액체 샘플의 누수를 방지하는 역할을 한다. 상기 플랙서블 패킹부(40)는 고무(rubber) 또는 실리콘(silicon) 등 탄력성 또는 신축성을 갖는 물질로 구현되어 상기 버블(bubble) 발생 또는 압력 상승에 의한 팽창력을 완충하되 상기 PCR 반응 챔버(10)의 밀폐 상태를 유지할 수 있도록 구현된다. 한편, 상기 홀(45)은 상기 광 투과부(25)의 형상에 따라 구현되기 때문에, 비록 도 7에서는 원형으로 구현되어 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 도 8은 상기 플렉서블 패킹부(40)가 상기 덮개(20)에 부착되되 상기 광 투과부(25)를 관통하여 둘러싸고 있는 상태를 도시하고, 도 9는 도 8의 상태의 덮개(20)가 상기 PCR 반응 챔버(10)의 상단 면에 결합하여 상기 PCR 반응 챔버(10)의 내부 공간을 밀폐한 상태를 도시한다.
도 10은 PCR 반응 챔버, 및 광 투과부를 구비하는 덮개를 포함하는 단위 모듈이 2 이상 반복 구현된 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩에 관한 것이다.
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)은 상기 PCR 반응 챔버(10) 및 광 투과부(25)를 구비하는 덮개(20)에 의해 광신호 감도를 상당하게 상승시키거나 영향을 미치지 않게 하면서 극-소형화가 가능하여 다수의 소량의 액체 샘플을 수용하는 멀티-챔버(multi chamber) 구조를 갖는 PCR 용기의 구현이 가능하다.
도 10에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)은 상기 PCR 반응 챔버(10) 및 상기 덮개(20)로 구성된 단위 모듈(50)을 2 이상 구비할 수 있다. 예를 들어, 도 10과 같이, 상기 마이크로 PCR 칩(1)이 평판 형상으로 구현될 경우 상기 단위 모듈(50)을 일렬로 나열하거나 평판 상의 원형 공간에 집적하여 2 이상의 개수(N)로 구현할 수 있어서, 예를 들어 상기 단위 모듈(50)을 19개(19 well), 48개(48 well), 96개(96 well) 등으로 구현할 수 있다.
도 11 내지 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩의 단면 분해도에 관한 것이다.
도 11에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)은 평판 형상의 제1 판(100); 상기 제1 판(100)의 상부에 배치되는 것으로서, 상기 PCR 반응 챔버(10)를 구비하는 평판 형상의 제2 판(200); 및 상기 제2 판(200)의 상부에 배치되는 것으로서, 상기 PCR 반응 챔버(10)의 개방 상단 면에 맞닿아 상기 개방 상단 면을 밀폐하되, 상기 광 투과부(25)를 구비하는 덮개(20) 역할을 수행하는 제3 판(300)을 포함하도록 구현될 수 있다.
상기 제1 판(100)은 평판 형상으로 구현되고, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)의 바닥 지지체(support) 역할을 수행한다. 상기 제1 판(100)은 다양한 재질로 구현될 수 있으나, 비용 절감을 고려하여 플라스틱 재질, 예를 들어 폴리카보네이트(polyarbonate, PC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET) 등으로 구현되고, 광 투과성 재질로 구현되는 것이 바람직하다. 아울러, 상기 제1 판(100) 표면은 다양하게 구현될 수 있으나, 친수성 표면을 갖도록 처리되는 것이 바람직하다. 아울러, 상기 제1 판(100)은 바람직하게는 약 0.03 내지 1.0 mm로 구현될 수 있고, 더 바람직하게는 약 0.1 내지 0.5 mm로 구현될 수 있다.
상기 제2 판(200)은 평판 형상으로 구현되되 상기 제1 판(100)의 상부에 배치되는 것으로서, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)의 PCR 반응 챔버(10) 영역을 형성하는 역할을 수행한다. 상기 제2 판(200)은 다양한 재질로 구현될 수 있으나, 비용 절감을 고려하여 플라스틱 재질, 예를 들어 폴리카보네이트(polyarbonate, PC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET) 등으로 구현되고, 광 투과성 재질로 구현되는 것이 바람직하다. 아울러, 상기 제2 판(200)은 바람직하게는 약 0.5 내지 5 mm로 구현될 수 있고, 더 바람직하게는 약 1 내지 2 mm로 구현될 수 있다.
한편, 도 11에 따르면, 상기 제1 판(100)과 상기 제2 판(200) 사이에 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)의 PCR 반응 챔버(10)의 바닥 면 공간을 형성하는 평판 형상의 추가 층(150)이 형성될 수도 있다. 이는 상기 제1 판(100)과 상기 제2 판(200) 사이의 접합 면이거나, 또는 접착제 층일 수 있다. 따라서, 상기 제1 판(100)과 상기 제2 판(200) 사이는 열 접합, 초음파 접합, 자외선 접합, 용매 접합 방법으로 접착 구현될 수 있다. 아울러, 상기 추가 층(150)은 바람직하게는 약 0.03 내지 1.0 mm로 구현될 수 있고, 더 바람직하게는 약 0.1 내지 0.5 mm로 구현될 수 있다.
상기 제3 판(300)은 평판 형상으로 구현되되 상기 제2 판(200)의 상부에 배치되는 것으로서, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)의 PCR 반응 챔버(10)의 개방 상단 면에 맞닿아 상기 개방 상단 면을 밀폐하되, 상기 광 투과부(50)를 구비하는 덮개(20) 역할을 수행한다. 상기 제3 판(200)은 다양한 재질로 구현될 수 있으나, 비용 절감을 고려하여 플라스틱 재질, 예를 들어 폴리카보네이트(polyarbonate, PC), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET) 등으로 구현되고, 광 투과성 재질로 구현되는 것이 바람직하다. 아울러, 상기 제3 판(200)은 바람직하게는 약 0.5 내지 5 mm로 구현될 수 있고, 더 바람직하게는 약 1 내지 2 mm로 구현될 수 있다.
한편, 도 12에 따르면, 상기 제3 판(300)은 상기 제2 판(200)과 제3 판(300) 사이에 상기 광 투과부(25)를 관통하도록 둘러싸는 홀(hole), 및 상기 PCR 반응 챔버(10)의 개방 상단 면에 맞닿아 상기 개방 상단 면을 밀폐하는 플렉서블 패킹부(40)를 더 구비할 수 있다. 상기 플렉서블 패킹부(40)는 상기 PCR 반응 챔버(10) 내부에 수용되는 PCR 시료 및 시약의 누수 및 복수의 챔버 간 오염을 방지하기 위한 역할을 수행한다. 상기 플렉서블 패킹부(40)는 탄력성 또는 신축성이 있는 다양한 재질로 구현될 수 있으나, 예를 들어 실리콘(silicon), 텔프론(telflon) 등으로 구현되는 것이 바람직하다. 아울러, 상기 플렉서블 패킹부(40)는 바람직하게는 약 0.1 내지 2 mm로 구현될 수 있고, 더 바람직하게는 약 0.5 내지 1 mm로 구현될 수 있고, 상기 원형 홀 직경은 바람직하게는 약 1.0 mm 로 구현될 수 있다.
도 13은 열 방출부를 포함하는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)은 상기 PCR 반응 챔버(10)로부터 발생하는 열을 외부로 방출하도록 구현된 열 방출부(60)를 더 포함할 수 있다. 도 13에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)은 전체적으로 얇은 평판 형상으로, 중앙 원형 영역에 복수 개의 단위 모듈(50)이 집적되도록 구현된다. 앞서 설명된 바와 같이, PCR 과정 중 상기 단위 모듈(50) 내 PCR 반응 챔버(10) 내부에서는 고온의 열이 발생하기 때문에 기기의 내열성과 반응 안정성을 고려하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)은 상기 중앙 원형 영역의 양 측면에 열 방출부(60)를 배치할 수 있다.
도 14 내지 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩이 적용된 단일 열 블록을 구비하는 실시간 PCR 장치를 도시한다.
도 14 내지 15에 따르면, 본 발명의 다른 실시예에 따른 실시간 PCR 장치(2000)는 앞서 설명된 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1); 상기 마이크로 PCR 칩(1)의 적어도 일 면에 열 접촉하도록 구현된 1 이상의 열 블록(200); 및 상기 마이크로 PCR 칩(1)의 PCR 반응 챔버(10) 내부의 PCR 증폭 산물로부터 발생하는 광신호를 검출하도록 구현된 광 검출 모듈(300)을 포함한다.
상기 열 블록(200)은 상기 마이크로 PCR 칩(1)에 열 접촉하여 열 교환이 가능하도록 구현된 모듈이다. 상기 열 블록(200)은 다양한 재질로 구현될 수 있고, 핵산 증폭 산물의 광신호를 측정하기 위해 전체적으로(또는 부분적으로) 광 투과성을 갖도록 구현될 수도 있다. 상기 투명 발열 소재는 광 투과성을 갖는 재질로서 전력 공급에 의해 발열성을 갖는 모든 물질을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 인듐 주석 산화물(Indum Tin Oxcide, ITO), 전도성 고분자(conducting polymer), 탄소나노튜브(Cabon NanoTube, CNT), 그래핀(graphene), 투명 금속 산화물(Transparent Conductive Oxide, TCO), 및 산화물-금속-산화물 다층 투명 소자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 인듐 주석 산화물(Indum Tin Oxcide, ITO)은 산화 인듐(In2O3)과 산화 주석(SnO2)이 섞여져 있으며, 일반적으로 90%의 산화 인듐과 10%의 산화 주석으로 구성되며, 투명 전극 또는 ITO로 불리기도 한다. 인듐 주석 산화물은 박막(얇은 층)으로 구현되는 경우 전기 전도율이 생기고, 투명하고 색이 존재하지 않다가 덩어리 상태로 구현되면 노란 회색을 띤다. 인듐 주석 산화물은 전자빔 증착, 증기 증착, 스퍼터링 기술에 의해 다른 물질의 표면에 증착된다, 인듐 주석 산화물은 종래까지 주로 액정 디스플레이, 평판 디스플레이, 플라스마 디스플레이, 터치스크린, 전자 종이, 유기 발광 다이오드, 태양 전지, 정전기 방지 코팅, 전자 방해 차폐물에서 주로 투명한 전도성 코팅을 제조하는데 사용되었다. 전도성 고분자(conducting polymer)는 소위 전기가 통하는 플라스틱으로 불리고, 광 투과율이 우수하고, 가벼우며, 탄성력 및 전기전도성이 우수하고, 가공이 매우 쉽다는 장점이 있다. 전도성 고분자는 폴리아세틸린, 폴리파라레닐렌, 폴리페놀, 폴리아닐린 등의 물질로부터 제조되고, 최근에는 폴리스티렌술폰산 및/또는 PEDOT(poly(3,4--ethylenedioxythiophene))로부터 제조되는 경우도 있다. 탄소나노튜브(Cabon NanoTube, CNT)는 6각형 고리로 연결된 탄소들이 긴 대롱 모양을 이루는 지름 1 나노미터 크기의 미세한 분자를 말한다. 인장력이 강철보다 강하고 유연성이 뛰어나며, 가볍고, 전기전도성이 매우 높은 것으로 알려져 있다. 한편, 정제된 단일벽 탄소나노튜브(Single-Walled Carbon Nanotube, SWNT)를 계면활성제를 이용하여 용매 분산하고 진공필터 장치를 이용하여 제작하면, 투명 전도체가 형성되고, 이는 투명성과 전도성을 모두 구비하게 된다. 그래핀(graphene)은 2000년대 초반, 흑연으로부터 분리된 물질로서, 탄소나노튜브, 풀러린(Fullerene)과 같이 원자번호 6번인 탄소로 구성된 나노물질이다. 그래핀은 구리보다 100배 이상 전기 전도성이 높고, 탄성력이 매우 우수한 것으로 알려져 있으며, 최근 투명 전극으로 구현되어 다양한 용도로 사용되고 있다. 투명 금속 산화물(Transparent Conductive Oxide, TCO)은 산소와 결합한 각종 금속 산화물 중 투명성을 갖는 물질을 총칭하는 것으로서, ZnO, SnO2, TiO2 등을 포함한다. 투명 금속 산화물은 높은 전도성과 투명도를 갖고, 적은 비용으로 코팅 물질로 사용될 수 있다. 산화물-금속-산화물 다층 투명 소자는 롤투롤 스퍼터 공정으로 제작되고, 금속의 유연성과 낮은 저항성, 산화물의 높은 투과도를 갖도록 구현될 수 있는 것으로서, ITO-Ag(또는 Cu)-ITO, AZO-Ag-AZO, GZO-Ag-GZO, IZO-Ag-IZO, IZTO-Ag-IZTO 등이 있다. 한편, 도 14 내지 15에 따르면, 상기 열 블록(200)은 다양한 형상으로 구현될 수 있으나, 바람직하게는 평판 형상으로 구현된다. 평판 형상의 열 블록(200)은 상기 마이크로 PCR 칩(1), 바람직하게는 평판 형상의 칩과 접촉하는 표면적이 넓어 PCR 시료 및 시약의 혼합액에 열을 고르게 제공할 수 있고, 그에 따라 PCR 단계의 각 사이클별 온도 변화가 신속하게 진행될 수 있다. 한편, 실시간 PCR 산물을 정확하게 모니터링하기 위해서 상기 광신호의 감도를 가능한 높일 필요가 있다. 상기 열 블록(200)은 전체적으로 광 투과성을 갖도록 구현될 수 있어서 광원으로부터 방출된 여기 광을 대부분 그대로 투과시켜 상기 광신호 감도를 높일 수 있다. 그러나, 상기 여기 광의 일부는 상기 열 블록(200) 상에서 반사되거나 또는 상기 열 블록(200)을 통과한 후 반사되어 광신호의 노이즈(noise)로서 작용할 수 있다. 따라서, 바람직하게는, 상기 열 블록(200)의 하부 면에 흡광 물질을 처리하여 광 신호 감도를 더 높일 수 있다. 상기 흡광 물질은 예를 들어, 운모(mica)일 수 있으나, 광을 흡수하는 성질을 갖는 물질이라면 제한되지 않는다. 따라서, 광원으로부터 유래된 광의 일부를 상기 흡광층이 흡수하여, 광신호의 노이즈로 작용하는 반사 광의 발생을 최대한 억제할 수 있다. 또한, 대안적으로, 상기 열 블록(200)의 상부 면에 광 반사 방지 물질을 처리하여 광신호 감도를 더 높일 수 있다. 상기 광 반사 방지 물질은 예를 들어, MgF2와 같은 불화물, SiO2, Al2O3와 같은 산화물일 수 있으나, 광 반사를 방지할 수 있는 성질을 갖는 물질이라면 제한되지 않는다. 또한, 더 바람직하게는, 상기 열 블록(200)의 하부 면에 흡광 물질을 처리하고, 동시에 상기 열 블록(200)의 상부 면에 광 반사 방지 물질을 처리하여 광신호 감도를 더 높일 수 있다. 즉, 효과적인 실시간 PCR의 모니터링을 위하여 상기 노이즈 대비 광 신호 비율은 가능한 최대 값을 가져야 하고, 상기 노이즈 대비 광 신호 비율은 상기 PCR 칩으로부터 여기 광의 반사율이 낮을수록 향상될 수 있다. 예를 들어, 일반적인 금속성 재질의 기존 열 블록의 여기 광의 반사율은 약 20 내지 80 %이지만, 상기 흡광층 또는 광반사방지층을 포함하는 상기 열 블록(200)을 사용하는 경우 광 반사율을 0.2% 내지 4% 이내로 줄일 수 있고, 상기 흡광층(60) 및 광반사방지층(70)을 포함하는 열 블록(200)을 사용하는 경우 광 반사율을 0.2% 이하로 줄일 수 있다.
상기 광 검출 모듈(300)은 상기 마이크로 PCR 칩(1)에 광을 제공하도록 구동가능하게 배치된 광 제공부(도시되지 않음) 및 상기 마이크로 PCR 칩(1)로부터 방출되는 광을 수용하도록 구동가능하게 배치된 광 검출부(도시되지 않음)를 포함할 수 있다. 상기 광 제공부는 상기 마이크로 PCR 칩(1)에 광을 제공하기 위한 모듈이고, 상기 광 검출부는 상기 마이크로 PCR 칩(1)으로부터 방출되는 광을 수용하여 상기 마이크로 PCR 칩(1)에서 수행되는 PCR 산물을 측정하기 위한 모듈이다. 상기 광 제공부로부터 광이 방출되고, 상기 방출된 광은 상기 마이크로 PCR 칩(1), 구체적으로 상기 마이크로 PCR 칩(1)의 단위 모듈(50) 내 PCR 반응 챔버를 통과하거나 반사하고, 이 경우 상기 PCR 반응 챔버 내의 핵산 증폭에 의해 발생하는 광신호를 상기 광 검출부가 검출한다. 따라서, 본 발명의 다른 실시예에 따른 실시간 PCR 장치(1000)에 따르면, 상기 마이크로 PCR 칩(1)에서 상기 PCR 과정이 진행되는 동안 상기 PCR 반응 챔버 내에서 (형광 물질이 결합된) 핵산 증폭 산물을 실시간으로 모니터링함으로써 초기 PCR 시료 및 시약에 포함되어 있는 표적 핵산의 증폭 여부 및 증폭 정도를 실시간으로 측정 및 분석할 수 있다. 또한, 상기 광 제공부 및 광 검출부는 상기 열 블록(200)을 중심으로 위 또는 아래에 모두 배치되거나 각각 배치될 수 있다. 다만, 상기 광 제공부 및 광 검출부의 배치는 본 발명의 다른 실시예에 따른 실시간 PCR 장치(1000)의 최적의 구현을 위하여 다른 모듈과의 배치 관계를 고려하여 다양할 수 있으며, 바람직하게는 도 14 내지 15에 따라, 상기 광 제공부 및 광 검출부(광 검출 모듈, 300)가 상기 열 블록(200)의 상부에 모두 배치될 수 있다. 상기 광 제공부는 LED(Light Emitting Diode) 광원 또는 레이저 광원, 상기 광원으로부터 방출되는 광에서 미리 결정된 파장을 갖는 광을 선택하는 제1 광 여과기, 및 상기 제1 광 여과기로부터 방출되는 광을 포집하는 제1 광 렌즈를 포함하고, 상기 광원과 상기 제1 광 여과기 사이에 빛을 퍼지게 하도록 배치된 제1 비구면 렌즈를 더 포함할 수 있다. 상기 광원은 광을 방출할 수 있는 모든 광원을 포함하며, LED(Light Emitting Diode) 광원 또는 레이저 광원을 포함한다. 상기 제1 광 여과기는 다양한 파장대를 갖는 입사광 중 특정 파장의 광을 선택하여 방출하는 것으로, 미리 결정된 상기 광원에 따라 다양하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 광 여과기는 상기 광원으로부터 방출되는 광 중 500 nm 이하 파장대의 광만을 통과시킬 수 있다. 상기 제1 광 렌즈는 그 입사광을 포집하여 그 방출광의 강도를 증가시키는 역할을 수행하는 것으로, 상기 열 블록(200)을 통해 상기 마이크로 PCR 칩(1)에 조사되는 광의 강도를 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 광 제공부은 상기 광원과 상기 제1 광 여과기 사이에 빛을 퍼지게 하도록 배치된 제1 비구면 렌즈를 더 포함할 수 있다. 상기 제1 비구면 렌즈의 배치 방향을 조정함으로써, 상기 광원으로부터 방출되는 광 범위를 확장하여 측정 가능한 영역에 도달하게 한다. 상기 광 검출부는 상기 마이크로 PCR 칩(1)으로부터 방출되는 광을 포집하는 제2 광 렌즈, 상기 제2 광 렌즈로부터 방출되는 광에서 미리 결정된 파장을 갖는 광을 선택하는 제2 광 여과기, 및 상기 제2 광 여과기로부터 방출되는 광으로부터 광신호를 검출하는 광 분석기를 포함하고, 상기 제2 광 여과기와 상기 광 분석기 사이에 상기 제2 광 여과기로부터 방출되는 광을 집적하도록 배치된 제2 비구면 렌즈를 더 포함하며, 상기 제2 비구면 렌즈와 상기 광 분석기 사이에 상기 제2 비구면 렌즈로부터 방출되는 광의 노이즈(noise)를 제거하고 상기 제2 비구면 렌즈로부터 방출되는 광을 증폭하도록 배치된 광다이오드 집적소자(photodiode integrated circuit, PDIC)를 더 포함할 수 있다. 상기 제2 광 렌즈는 그 입사광을 포집하여 그 방출광의 강도를 증가시키는 역할을 수행하는 것으로, 상기 열 블록(200)을 통해 상기 마이크로 PCR 칩(1)으로부터 방출되는 광의 강도를 증가시켜 광신호 검출을 용이하게 한다. 상기 제2 광 여과기는 다양한 파장대를 갖는 입사광 중 특정 파장의 광을 선택하여 방출하는 것으로, 상기 열 블록(200)을 통해 상기 마이크로 PCR 칩(1)으로부터 방출되는 미리 결정된 광의 파장에 따라 다양하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 제2 광 여과기는 상기 열 블록(200)을 통해 상기 마이크로 PCR 칩(1)으로부터 방출되는 미리 결정된 광 중 500 nm 이하 파장대의 광만을 통과시킬 수 있다. 상기 광 분석기는 상기 제2 광 여과기로부터 방출되는 광으로부터 광신호를 검출하는 모듈로서, PCR 시료 및 시약으로부터 발현 형광을 전기 신호로 전환하여 정성 및 정략적인 측정이 가능하도록 한다. 또한, 상기 광 검출부는 상기 제2 광 여과기와 상기 광 분석기 사이에 상기 제2 광 여과기로부터 방출되는 광을 집적하도록 배치된 제2 비구면 렌즈를 더 포함할 수 있다. 상기 제2 비구면 렌즈의 배치 방향을 조정함으로써, 상기 제2 광 여과기로부터 방출되는 광 영역을 확장하여 측정 가능한 영역에 도달하게 한다. 또한, 상기 광 검출부는 상기 제2 비구면 렌즈와 상기 광 분석기 사이에 상기 제2 비구면 렌즈로부터 방출되는 광의 노이즈(noise)를 제거하고, 상기 제2 비구면 렌즈로부터 방출되는 광을 증폭하도록 배치된 광다이오드 집적소자(photodiode integrated circuit, PDIC)를 더 포함할 수 있다. 상기 광다이오드 집적소자(340)를 사용함으로써, 기기의 소형화가 더욱 가능하고, 노이즈를 최소화하여 신뢰 가능한 광신호를 측정할 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 다른 실시예에 따른 실시간 PCR 장치(1000)는 상기 광 제공부로부터 방출된 광이 광 검출부까지 도달할 수 있도록 광의 진행 방향을 조절하고, 미리 결정된 파장을 갖는 광을 분리하기 위한 하나 이상의 이색성 필터를 더 포함할 수 있다. 상기 이색성 필터(dichroic filter)는 광을 파장에 따라 선택적으로 투과 또는 선택적으로 조절된 각도로 반사시키는 모듈이다. 상기 이색성 필터는 상기 광 제공부으로부터 방출되는 광의 광축에 대하여 약 45도 각도로 경사지게 배치되고, 상기 광을 그 파장에 따라 선택적으로 단파장 성분을 투과시키고 장파장 성분을 직각으로 반사시켜 상기 열 블록(200) 상에 배치된 마이크로 PCR 칩(1)에 도달하게 한다. 또한, 상기 이색성 필터는 상기 마이크로 PCR 칩(1) 및 상기 열 블록(200)으로부터 반사된 광의 광축에 대하여 약 45도 각도로 경사지게 배치되고, 상기 광을 그 파장에 따라 선택적으로 단파장 성분을 투과시키고 장파장 성분을 직각으로 반사시켜 상기 광 검출부에 도달하게 한다. 상기 광 검출부에 도달한 광은 광 분석기에서 전기 신호로 전환되어 핵산 증폭 여부 및 증폭 정도를 나타낼 수 있다.
도 16 내지 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩이 적용된 2개의 열 블록을 구비하는 실시간 PCR 장치를 도시한다.
도 16 내지 18에 따르면, 본 발명의 다른 실시예에 따른 실시간 PCR 장치(2000)는 앞서 설명된 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1); 기판(400a) 상에 배치되되 상기 마이크로 PCR 칩(1)과 열 접촉하도록 구현된 제1 열 블록(100a); 상기 기판(400a) 상에 상기 제1 열 블록(100a)과 이격 배치되되 상기 마이크로 PCR 칩(1)과 열 접촉하도록 구현된 제2 열 블록(200a); 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a) 위로 구동 수단(500a)에 의해 좌우 및/또는 상하 이동 가능하고, 상기 마이크로 PCR 칩(1)이 장착된 칩 홀더(300a); 및 상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a) 사이에 배치되되, 상기 마이크로 PCR 칩(1)이 상기 구동 수단(500a)에 의해 상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a) 간 이동시 상기 마이크로 PCR 칩(1)의 PCR 반응 챔버(10) 내부의 PCR 증폭 산물로부터 발생하는 광신호를 검출하도록 구현된 광 검출 모듈(700a, 800a)을 포함한다.
도 16에 따르면, 본 발명의 다른 실시예에 따른 실시간 PCR 장치(2000)는 기판(400a) 상에 배치된 제1 열 블록(100a); 상기 기판(400a) 상에 상기 제1 열 블록(100a)과 이격 배치된 제2 열 블록(200a); 및 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a) 위로 구동 수단(500a)에 의해 좌우 및/또는 상하 이동 가능하고, 상기 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)이 장착된 칩 홀더(300a)를 포함한다.
상기 기판(400a)은 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a)의 가열 및 온도 유지로 인해 그 물리적 및/또는 화학적 성질이 변하지 않고, 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a) 사이에서 상호 열 교환이 일어나지 않도록 하는 재질을 갖는 모든 물질을 포함한다. 예를 들어, 상기 기판(400a)은 플라스틱 등의 재질을 포함하거나 그러한 재질로 구성될 수 있다.
상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a)은 핵산을 증폭하기 위한 변성 단계, 어닐링 단계 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 온도를 유지하기 위한 것이다. 따라서 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a)은 상기 각 단계들에 요구되는 필요한 온도를 제공하고, 이를 유지하기 위한 다양한 모듈을 포함하거나 또는 그러한 모듈과 구동가능하게 연결될 수 있다. 따라서, 상기 마이크로 PCR 칩(1)이 장착된 칩 홀더(300a)가 상기 각 열 블록(100a, 200a)의 일 면에 접촉되는 경우 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a)은 상기 마이크로 PCR 칩(1)과의 접촉 면을 전체적으로 가열 및 온도 유지할 수 있어서, 상기 마이크로 PCR 칩(1) 내의 샘플 용액을 균일하게 가열 및 온도 유지할 수 있다. 종래 단일 열 블록을 사용하는 PCR 장치는 상기 단일 열 블록에서의 온도 변화율이 초당 3 내지 7℃ 범위 내에서 이루어지는데 반해, 본 발명의 다른 실시예에 따른 2개의 열 블록을 포함하는 실시간 PCR 장치(2000)는 각각의 열 블록(100a, 200a)에서의 온도 변화율이 초당 20 내지 40℃ 범위 내에서 이루어져 PCR 진행 시간을 크게 단축시킬 수 있다.
상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a)은 그 내부에 열선(도시되지 않음)이 배치될 수 있다. 상기 열선은 상기 변성 단계, 어닐링 단계 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 온도를 유지하도록 다양한 열원과 구동가능하게 연결될 수 있고, 상기 열선의 온도를 모니터링하기 위한 다양한 온도 센서와 구동가능하게 연결될 수 있다. 상기 열선은 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a) 내부 온도를 전체적으로 일정하게 유지하기 위해 각각의 열 블록(100a, 200a) 면의 중심점을 기준으로 상하 및/또는 좌우 방향으로 대칭되도록 배치될 수 있다. 상기 상하 및/또는 좌우 방향으로 대칭된 열선의 배치는 다양할 수 있다. 또한, 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a)은 그 내부에 박막 히터(thin film heater, 도시되지 않음)가 배치될 수도 있다. 상기 박막 히터는 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a) 내부 온도를 전체적으로 일정하게 유지하기 위해 각각의 열 블록(100a, 200a) 면의 중심점을 기준으로 상하 및/또는 좌우 방향으로 일정한 간격으로 이격 배치될 수 있다. 상기 상하 및/또는 좌우 방향으로 일정한 박막 히터의 배치는 다양할 수 있다.
상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a)은 동일한 면적에 대한 고른 열 분포 및 신속한 열 전달을 위해 금속 재질, 예를 들어 알루미늄 재질을 포함하거나 또는 알루미늄 재질로 구성될 수 있다.
상기 제1 열 블록(100a)은 상기 변성 단계, 또는 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 적정 온도를 유지하도록 구현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 다른 실시예에 따른 실시간 PCR 장치(2000)의 제1 열 블록(100a)은 50℃ 내지 100℃를 유지할 수 있고, 바람직하게는 상기 제1 열 블록(100a)에서 상기 변성 단계를 수행하는 경우 90℃ 내지 100℃를 유지할 수 있고, 바람직하게는 95℃를 유지할 수 있으며, 상기 제1 열 블록(100a)에서 상기 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하는 경우에는 55℃ 내지 75℃를 유지할 수 있고, 바람직하게는 72℃를 유지할 수 있다. 다만, 상기 변성 단계, 또는 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행할 수 있는 온도라면 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제2 열 블록(200a)은 상기 변성 단계, 또는 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 적정 온도를 유지하도록 구현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제3 실시예에 따른 PCR 장치의 제2 열 블록(200a)은 상기 제2 열 블록(200a)에서 상기 변성 단계를 수행하는 경우 90℃ 내지 100℃를 유지할 수 있고, 바람직하게는 95℃를 유지할 수 있으며, 상기 제2 열 블록에서 상기 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하는 경우에는 55℃ 내지 75℃를 유지할 수 있고, 바람직하게는 72℃를 유지할 수 있다. 다만, 상기 변성 단계, 또는 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행할 수 있는 온도라면 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 상기 제1 열 블록(100a)은 PCR의 변성 단계 온도 (denaturing temperature)를 유지할 수 있으며, 변성 단계 온도가 90℃보다 낮으면 PCR의 주형이 되는 핵산의 변성이 일어나 효율이 떨어져 PCR 효율이 떨어지거나 반응이 일어나지 않을 수 있고, 변성 단계 온도가 100℃보다 높아지면 PCR에 이용되는 효소가 활성을 잃게 되므로, 상기 변성 단계 온도는 90℃ 내지 100℃일 수 있고, 바람직하게는 95℃일 수 있다. 또한, 상기 제2 열 블록(200a)은 PCR의 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계 온도(annealing/extension temperature)를 유지할 수 있다. 연장 (혹은 증폭) 단계 온도가 55℃보다 낮으면 PCR 산물의 특이성(specificity)이 떨어질 수 있고, 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계 온도가 74℃보다 높으면 프라이머에 의한 연장이 일어나지 않을 수 있기 때문에 PCR 효율이 떨어지게 되므로 상기 어니링 및 연장 (혹은 증폭) 단계 온도는 55℃ 내지 75℃일 수 있고, 바람직하게는 72℃일 수 있다.
상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a)은 상호 열 교환이 일어나지 않도록 미리 결정된 거리로 이격 배치될 수 있다. 이에 따라, 상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a) 사이에서 열 교환이 일어나지 않기 때문에, 미세한 온도 변화에 의해서도 중대한 영향을 받을 수 있는 핵산 증폭 반응에 있어서, 상기 변성 단계와 상기 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계의 정확한 온도 제어가 가능하다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 실시간 PCR 장치(2000)는 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a) 위로 구동 수단(500a)에 의해 좌우 및/또는 상하 이동 가능하고, 상기 마이크로 PCR 칩(1)이 장착된 칩 홀더(300a)를 포함한다. 상기 칩 홀더(300a)는 상기 마이크로 PCR 칩(1)이 상기 실시간 PCR 장치(2000)에 장착되는 모듈이다. 상기 칩 홀더(300a)의 내벽은 상기 실시간 PCR 장치(2000)에 의해 핵산 증폭 반응이 수행되는 경우 상기 마이크로 PCR 칩(1)이 상기 칩 홀더(300a)로부터 이탈하지 않도록 상기 마이크로 PCR 칩(1)의 외벽과 고정 장착되기 위한 형상 또는 구조를 가질 수 있다. 상기 칩 홀더(300a)는 상기 구동 수단(500a)에 구동가능하게 연결된다. 또한, 상기 마이크로 PCR 칩(1)은 상기 칩 홀더(300a)에 착탈 가능할 수 있다.
상기 구동 수단(500a)은 상기 마이크로 PCR 칩(1)이 장착된 칩 홀더(300a)를 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a) 위로 좌우 및/또는 상하 이동 가능하게 하는 모든 수단을 포함한다. 상기 구동 수단(500a)의 좌우 이동에 의해, 상기 마이크로 PCR 칩(1)이 장착된 칩 홀더(300a)는 상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a) 사이에서 왕복 운동이 가능하고, 상기 구동 수단(500a)의 상하 이동에 의해, 상기 PCR 칩(10)이 장착된 칩 홀더(300a)는 상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a)에 접촉 및 분리될 수 있다. 도 16에 도시된 실시간 PCR 장치(2000)의 구동 수단(500a)은 좌우 방향으로 연장된 레일(510a), 및 상기 레일(510a)을 통해 좌우 방향으로 슬라이딩 이동가능하게 배치되고, 상하 방향으로 슬라이딩 이동 가능한 연결 부재(520a)를 포함하고, 상기 연결 부재(520a)의 일 말단은 상기 칩 홀더가 배치된다. 상기 구동 수단(500a)의 좌우 및/또는 상하 이동은 상기 PCR 장치의 내부 또는 외부에 구동가능하게 배치된 제어 수단(도시되지 않음)에 의해 제어될 수 있고, 상기 제어 수단은 PCR의 변성 단계와 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 위한 상기 마이크로 PCR 칩(1)이 장착된 칩 홀더(300a)와 상기 제1 열 블록(100a) 및 제2 열 블록(200a) 사이의 접촉 및 분리를 제어할 수 있다.
도 17은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 실시간 PCR 장치(2000)의 칩 홀더의 이동에 의한 핵산 증폭 반응의 각 단계를 도시한다. 상기 실시간 PCR 장치(2000)에 의한 핵산 증폭 반응은 하기 단계에 의한다.
먼저, 상기 마이크로 PCR 칩(1)에 핵산, 예를 들어 이중 가닥 DNA, 증폭하고자 하는 특정 염기 서열과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머, DNA 중합효소, 삼인산화데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide triphosphates, dNTP), PCR 완충액(PCR buffer)를 포함하는 샘플 용액을 도입하고, 상기 PCR 칩(10)을 상기 칩 홀더(300a)에 장착하는 단계를 수행한다. 그 후 또는 이와 동시에 상기 제1 열 블록(100a)을 변성 단계를 위한 온도, 예를 들어, 90℃ 내지 100℃로 가열 및 유지하고, 바람직하게는 95℃로 가열 및 유지하는 단계를 수행한다. 상기 제2 열 블록(200)을 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 위한 온도, 예를 들어, 55℃ 내지 75℃로 가열 및 유지하고, 바람직하게는 72℃로 가열 및 유지하는 단계를 수행한다. 그 후, 상기 구동 수단(500a)의 연결 부재(520a)를 제어하여 상기 마이크로 PCR 칩(1)을 하향 이동시켜, 상기 마이크로 PCR 칩(1)이 장착된 칩 홀더(300a)를 상기 제1 열 블록(100a)에 접촉시켜 PCR의 제1 변성 단계를 수행한다(x 단계). 그 후, 상기 구동 수단(500a)의 연결 부재(520a)를 제어하여 상기 마이크로 PCR 칩(1)을 상향 이동시켜, 상기 마이크로 PCR 칩(1)이 장착된 칩 홀더(300a)를 상기 제1 열 블록(100a)으로부터 분리시켜 PCR의 제1 변성 단계를 종료하고, 상기 구동 수단(500a)의 연결 부재(520a)를 제어하여 상기 마이크로 PCR 칩(1)을 제2 열 블록(200a)의 위로 이동시키는 단계를 수행한다(y 단계). 그 후, 상기 구동 수단(500a)의 연결 부재(520a)를 제어하여 상기 마이크로 PCR 칩(1)을 하향 이동시켜, 상기 마이크로 PCR 칩(1)이 장착된 칩 홀더(300a)를 상기 제2 열 블록(100a)에 접촉시켜 PCR의 제1 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행한다(z 단계). 마지막으로, 상기 구동 수단(500a)의 연결 부재(520a)를 제어하여 상기 마이크로 PCR 칩(1)을 상향 이동시켜, 상기 마이크로 PCR 칩(1)이 장착된 칩 홀더(300a)를 상기 제2 열 블록(100a)으로부터 분리시켜 PCR의 제1 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 종료하고, 상기 구동 수단(500a)의 연결 부재(520a)를 제어하여 상기 마이크로 PCR 칩(1)을 제1 열 블록(100a)의 위로 이동시킨 후 상기 x, y, z 단계를 반복함으로써, 핵산 증폭 반응을 수행한다(순환 단계).
도 18은 본 발명의 다른 실시예에 따른 실시간 PCR 장치(2000)를 이용하여 실시간으로 핵산 증폭 반응을 관찰하는 단계를 도시한다. 상기 실시간 PCR 장치(2000)는 상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a) 사이에 배치되되, 상기 마이크로 PCR 칩(1)이 상기 구동 수단(500a)에 의해 상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a) 간 이동시 상기 마이크로 PCR 칩(1)의 PCR 반응 챔버(10) 내부의 PCR 증폭 산물로부터 발생하는 광신호를 검출하도록 구현된 광 검출 모듈(700a, 800a), 구체적으로 광원(700a) 및 광 검출부(800a)를 포함한다. 즉, 상기 실시간 PCR 장치(2000)는 상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a) 사이에 광원(700a)이 배치되고, 상기 칩 홀더(300a) 위에 상기 광원(700a)으로부터 방출되는 광을 검출하기 위한 광 검출부(800a)가 배치되거나, 또는 상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a) 사이에 광원(700a)으로부터 방출되는 광을 검출하기 위한 광 검출부(800a)가 배치되고, 상기 칩 홀더(300a) 위에 광원(700a)이 배치될 수 있다. 또한, 상기 광 검출부(800a)는 상기 구동 수단(500a) 위에 배치되고, 상기 구동 수단(900a)은 상기 광원(700a)으로부터 방출되는 광을 통과시키기 위한 관통부(530a)가 배치될 수 있다.
상기 광원(700a) 및 광 검출부(800a)의 배치에 의해, 상기 실시간 PCR 장치(2000)에 의한 핵산 증폭 반응시 상기 마이크로 PCR 칩(1) 내에서 핵산이 증폭되는 정도를 실시간으로 검출할 수 있도록 한다. 상기 마이크로 PCR 칩(1) 내에서 핵산이 증폭되는 정도를 검출하기 위해서는 상기 마이크로 PCR 칩(1)에 도입되는 샘플 용액에 별도의 형광 물질을 더 첨가할 수 있다. 상기 광원(700a)은 상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a) 사이의 이격된 공간에 가능한 넓게 분포하도록 배치되고, 가능한 동일한 광을 방출하도록 배치된다. 상기 광원(700a)은 상기 광원(700a)으로부터 방출되는 광을 포집하는 렌즈(도시되지 않음) 및 특정 파장대의 광을 여과하는 광 필터(도시되지 않음)와 구동가능하게 연결 배치될 수 있다.
상기 실시간 PCR 장치(2000)에 의한 핵산 증폭 반응시 상기 마이크로 PCR 칩(1) 내에서 핵산이 증폭되는 정도를 실시간으로 검출하는 단계는 아래와 같다.
상기 PCR의 제1 변성 단계의 종료 후 상기 구동 수단(500a)의 연결 부재(520a)를 제어하여 상기 마이크로 PCR 칩(1)을 제1 열 블록(100a)의 위로부터 제2 열 블록(200a)의 위로 이동시키거나, 또는 상기 PCR의 제1 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계의 종료 후 상기 구동 수단(500a)의 연결 부재(520a)를 제어하여 상기 마이크로 PCR 칩(1)을 제2 열 블록(200a)의 위로부터 제1 열 블록(200a)의 위로 이동시키는 경우, 상기 마이크로 PCR 칩(1)이 장착된 칩 홀더(300a)를 상기 구동 수단(500a)의 연결 부재(520a)를 제어하여 상기 제1 열 블록(100a)과 제2 열 블록(200a) 사이의 이격된 공간 상에 정지시키는 단계를 수행한다. 그 후, 상기 광원(700a)으로부터 광을 방출시키고, 상기 방출된 광은 상기 마이크로 PCR 칩(1), 구체적으로 상기 마이크로 PCR 칩(1)의 PCR 반응 챔버)를 통과하고, 이 경우 상기 PCR 반응 챔버 내의 핵산의 증폭에 의해 발생하는 광신호를 상기 광 검출부(800a)가 검출한다. 이 경우 상기 광 투과성 재질의 마이크로 PCR 칩(1)을 통과한 광은 상기 구동 수단(500a), 구체적으로 상기 레일(510a)에 배치된 관통부(530a)를 통과하여 상기 광출부(800a)에 도달할 수 있다. 따라서, 상기 PCR의 각 순환 단계가 진행되는 동안 상기 반응 채널 내에서 (형광 물질이 결합된) 핵산의 증폭에 의한 반응 결과를 실시간으로 모니터링함으로써 초기 반응 샘플에 포함되어 있는 표적 핵산의 양을 실시간으로 측정 및 분석할 수 있다.
실험예 1. 마이크로 PCR 칩의 제조
도 12와 같이, 플라스틱 재질로 평판 형상의 제1 내지 제3 판(100, 200, 300)을 준비하였다. 상기 제1 판(100)은 0.5 mm의 두께로 제조하였고, 상기 제2 판(200)은 2 mm의 두께로 하되, 19개의 PCR 반응 챔버(10)를 중앙 원형 영역에 집적시켜 제조하였고, 상기 제3 판(300)은 2 mm의 두께로 하되, 그 하단 면에 상기 중앙 원형 영역에 대응하게 원형 홈을 구현하고, 상기 19개의 PCR 반응 챔버(10) 내부를 향해 돌출되도록 광 투과부(25)를 형성하여 제조하였다. 아울러, 상기 제3 판(300)의 원형 홈 및 광 투과부(50)에 대응하여 결합할 수 있는 플렉서블 패킹부(50)를 제조하여 상기 제3 판(300)의 하단 면에 부착시켰다. 그 후, 상기 제1 판(100) 상부에 양면 접착 테이프를 접착하고 상기 제2 판(200)을 상기 제1 판(100)의 상부에 부착하였다. 이 경우 상기 양면 접착 테이프 이외에 열 접합, 초음파 접합, 자외선 접합, 용매 접합 방법 등을 통해서도 상기 제1 판(100)과 상기 제2 판(200)을 부착시킬 수 있음은 물론이다. 그 후, 상기 제2 판(200)의 부착에 의해 형성된 19개의 PCR 반응 챔버(10)에 PCR 시료 및 시약을 주입하고, 상기 플렉서블 패킹부(50)가 부착된 상기 제3 판(300)을 상기 제2 판(200) 상부에 부착하여 상기 PCR 반응 챔버(10)를 밀봉하였다. 도 19에 따르면, 본 실험예에 있어서, 완성된 마이크로 PCR 칩(1)을 확인할 수 있다. 도 19의 A 그림은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 PCR 칩(1)의 외관이고, B 그림은 A 그림의 마이크로 PCR 칩(1)에서 제3 판(300)의 투시도가 반영된 외관이고, C 그림은 B 그림의 마이크로 PCR 칩(1)의 중앙 원형 영역에 19개의 단위 모듈(50)이 배치된 상태를 도시하는 확대 도면이다.
실험예 2. 식중독균 검출용 프라이머 세트 제작 및 합성
식중독균 16종의 실시간 검출을 위해 사용한 프라이머는 GC%를 40 내지 60%가 되도록 하고, Tm 값 65 내지 75℃의 조건이 되도록 하여 Primer 3를 통해 제작하고, 제작한 프라이머를 ㈜제노텍에 의뢰하여 합성하였다. 상기 프라이머 및 각각의 식중독균에서 특이적으로 증폭되는 유전자 목록은 하기 표 1과 같다. 하기 표 1에서, 프라이머 이름은 표적이 되는 유전자의 이름을 인용하였다. 예를 들어, Enteropathogenic E.coli(EPEC)에서 표적이 되는 유전자는 eaeA 유전자이고, Enteroinvasive E.coli(EIEC)에서 표적이 되는 유전자는 invA 유전자이고, Campylobacter coli에서 표적이 되는 유전자는 ceuE 유전자이고, Vibrio cholerae에서 표적이 되는 유전자는 ompW 유전자, 및 Vibrio vulnificus에서 표적이 되는 유전자는 Vvh 유전자이다.
표 1
Strain name Productsize(bp) Primername Sequence
Listeria monocytogenes 246 IAP-F CGG ACG TTT AAC CAA GTT GCG CTA AC (서열 번호 1)
IAP-R AGC TGG GAT TGC GGT AAC AGC ATT TG (서열 번호 2)
Staphylococcus aureus 169 NUCA-F AGT TCG TCA AGG CTT GGC TAA AGT TG (서열 번호 3)
NUCA-R GCA GCA GTG ACA CTT TTA CAA TGA GC (서열 번호 4)
Shigella spp. 136 IPAH-F ACC GCC TTT CCG ATA CCG TCT C (서열 번호 5)
IPAH-R CTC TCA GTG GCA TCA GCA GCA ACA G (서열 번호 6)
Vibrio parahaemolyticus 155 TOXR-F CCA AAT AGT AAT TCG CTC GCT GAC CAA CA (서열 번호 7)
TOXR-R AAA CCT TGC TCA CGC CAA ACA AAC TC (서열 번호 8)
Bacillus cereus 157 entFM-F CGG CCG CAC AGG TTA TGT AAG TGC AGA (서열 번호 9)
entFM-R TCC AGC GAT TGA AGA TGT ATC TCC ACC TG (서열 번호 10)
Salmonella spp. 204 INVA-F AAT TAT CGC CAC GTT CGG GCA ATT CGT TA (서열 번호 11)
INVA-R TCA ATA ATA CCG GCC TTC AAA TCG GCA TC (서열 번호 12)
Yersinia enterocolitica 143 AIL-F AAC TGG GGA GTA ATA GGT TCG TTT GCT TA (서열 번호 13)
AIL-R AGG CTA ACA TAT TCG TTG ATG CGG AAA GA (서열 번호 14)
Clostridium perfringens 155 CPE-F ACA ATT TAA ATC CAA TGG TGT TCG AAA ATG C (서열 번호 15)
CPE-R GGG TTC CCC TAA TAT CCA ACC ATC TCC TTT A (서열 번호 16)
Campylobacter jejuni 200 HIPO-F GCA CTT CCA TGA CCA CCC CTT CCA A(서열 번호 17)
HIPO-R CCT GCT GAA GAG GGT TTG GGT GGT GC (서열 번호 18)
Enterotoxigenic E.coli (ETEC) 107 LT-F AAA ACG TTC CGG AGG TCT TAT GCC CAG A (서열 번호 19)
LT-R CGG TTT GTG TTC CTC TCG CGT GAT CAT A (서열 번호 20)
Enterohemorrhagic E.coli (EHEC) 159 STX1-F GCA ATT CTG GGA AGC GTG GCA TTA (서열 번호 21)
STX1-R CCC CAG AGT GGA TGA ATC CCA CAA (서열 번호 22)
Enteropathogenic E.coli(EPEC) 238 eaeA-F GGT GGT GTC GCT GGT CAT AC (서열번호 23)
eaeA-R CCT CTG CCG TTC CAT AAT GTT GT (서열번호 24)
Enteroinvasive E.coli(EIEC) 216 Inv-F1 CGC TTG ATG GGT GGG GTA TCC TGT CTA (서열번호 25)
Inv-R1 GTC TGC TCT TGG AGT TGA GTC ACT GTC TGT (서열번호 26)
Campylobacter coli 234 ceuE-F AGG AAT CAA TGC TGT GGA TGA (서열번호 27)
ceuE-R CTT GCT AGA TAC CAG TAT TCA GGA T (서열번호 28)
Vibrio cholerae 249 ompW-F TTG CTG ACA CTA AAC ATC TGC CAC CTA CC (서열번호 29)
ompW-R ACC ACA CAG AAG CGT TGA GGA ACC A (서열번호 30)
Vibrio vulnificus 213 Vvh-F CCG CCG CAC TTA CAT TGG TCC ATT CG (서열번호 31)
Vvh-R CCA CTG ACT TCG CCA CCC ACT TTC G (서열번호 32)
실험예 3. PCR 수행
실험예 1에서 획득한 식중독균의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 표 1에 기재된 본 발명의 일 실시예에 따른 식중독균 검출용 프라이머 세트 중 서열번호 1 및 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8, 및 서열번호 9 및 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32를 상기 실험예 1에서 제작된 마이크로 PCR 칩의 16개의 반응 챔버에 각각 도입하였다. 상기 마이크로 PCR 칩의 남은 3개의 반응 챔버 중 하나에는 음성 대조군(Negative control)으로서 프라이머(IPAH-shigelle)를 도입하고, 다른 두 개에는 양성 대조군(Positive control)으로서 influenza NA를 도입하였다. 본 PCR을 수행함에 있어서, PCR 반응액의 조성 및 PCR 반응 조건은 하기 표 2 및 표 3에 기재하였고, PCR 기기는 BIO-RAD 사의 conventional PCR 장치를 사용하였다.
표 2
조성 부피(㎕)
2×Master Mix(final concentration 1×) 200
정방향 프라이머(10μM) 40
역방향 프라이머(10μM) 40
주형 DNA(1ng/ul) 40
증류수(D.W.) 80
총(total) 400
표 3
단계 온도(℃) 시간 사이클(cycles)
Pre-denaturation 95 1 min 1
Denaturation 95 10 sec 30
Annealing&Extension 68 10 sec
도 20은 실험예 3의 PCR 수행 결과를 나타내내는 전기영동 사진이다. 도 20에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 16종의 식중독균을 대상으로 하는 각 프라이머 세트를 포함하는 마이크로 PCR 칩을 이용하는 경우 다수의 식중독균 유전자가 정확하고 신속하게 검출되었음을 확인할 수 있다.
도 21은 도 20의 전기영동 사진의 번호에 해당하는 16개의 식중독균을 나타낸 표에 관한 것이다. 구체적으로, NC는 음성 대조군, 2개의 PC는 양성 대조군, 번호 1은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트에 따른 결과, 번호 2는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트에 따른 결과, 번호 3은 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트에 따른 결과, 번호 4는 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 세트에 따른 결과, 번호 5는 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머 세트에 따른 결과, 번호 6은 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트에 따른 결과, 번호 7은 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 세트에 따른 결과, 번호 8은 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 세트에 따른 결과, 번호 9는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트에 따른 결과, 번호 10은 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머 세트에 따른 결과, 번호 11은 서열번호 21 및 서열번호 22의 프라이머 세트에 따른 결과, 번호 12는 서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이머 세트에 따른 결과, 번호 13은 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머 세트에 따른 결과, 번호 14는 서열번호 27 및 서열번호 28의 프라이머 세트에 따른 결과, 번호 15는 서열번호 29 및 서열번호 30의 프라이머 세트에 따른 결과, 번호 16은 서열번호 31 및 서열번호 32의 프라이머 세트에 다른 결과를 나타낸다.

Claims (12)

  1. 상단 면이 개방된 16개 이상의 PCR 반응 챔버(chamber); 및
    상기 PCR 반응 챔버의 개방 상단 면에 맞닿아 상기 개방 상단 면을 밀폐하고, 상기 개방 상단 면에 맞닿는 밀폐 면 중 일부 영역으로부터 상기 PCR 반응 챔버의 내부를 향해 돌출되되 광 경로를 따라 연장된 광 투과성 재질의 광 투과부를 구비하는 덮개(cover);
    를 포함하는 것으로서, 상기 16개 이상의 PCR 반응 챔버 내에
    서열번호 1의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 2의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Listeria monocytogenes의 iap (invasion associated protein) 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
    서열번호 3의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 4의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Staphylococcus aureus의 nucA (nuclease) 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
    서열번호 5의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Shigella spp.의 ipaH (invasive plasmid antigen gene) 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
    서열번호 7의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Vibrio parahaemolyticus의 toxR 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
    서열번호 9의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Bacillus cereus의 enterotoxin FM (entFM) 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
    서열번호 11의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Salmonella spp.의 invA (invasion protein) 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
    서열번호 13의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 14의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Yersinia enterocolitica의 ail (attachment invasion locus) 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
    서열번호 15의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 16의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Clostridium perfringens의 cpe (C. perfringens enterotoxin) 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
    서열번호 17의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 18의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Campylobacter jejuni의 hipO 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
    서열번호 19의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 20의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Enterotoxigenic E.coli (ETEC)의 LT (heat-labile enterotoxin) 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
    서열번호 21의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 22의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Enterohemorrhagic E.coli (EHEC)의 STX1 (shiga-like toxin-1) 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
    서열번호 23의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 24의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Enteropathogenic E.coli (EPEC)의 eaeA 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
    서열번호 25의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 26의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Enteroinvasive E.coli (EIEC)의 invA 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
    서열번호 27의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 28의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Camphylobacter coli의 ceuE 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
    서열번호 29의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 30의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Vibrio cholera의 ompW 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트; 및
    서열번호 31의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 및 서열번호 32의 염기 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머로 이루어진 Vibrio vulnificus의 Vvh 유전자를 검출하기 위한 프라이머 세트;
    로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 프라이머 세트를 각각 포함하는, 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩(Micro-Polymerase Chain Reaction chip).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 PCR 반응 챔버는 10 ㎕ 이하의 액체 샘플 수용량을 갖도록 구현된 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 PCR 반응 챔버는 5 내지 8 ㎕의 액체 샘플을 수용하는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 광 투과부는 상기 밀폐 면의 중앙에 배치된 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 광 투과부는 상기 PCR 반응 챔버의 하단 바닥 면에 닿거나, 상기 PCR 반응 챔버의 하단 바닥 면으로부터 상향으로 일부 이격된 위치까지 구현된 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 덮개는 상기 광 투과부를 관통하여 둘러싸는 홀(hole), 및 상기 PCR 반응 챔버의 개방 상단 면에 맞닿아 상기 개방 상단 면을 밀폐하는 플렉서블(flexible) 패킹부를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩.
  7. 제1항에 있어서,
    평판 형상을 갖는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩.
  8. 제1항에 있어서,
    평판 형상의 제1 판;
    상기 제1 판의 상부에 배치되는 것으로서, 상기 PCR 반응 챔버를 구비하는 평판 형상의 제2 판; 및
    상기 제2 판의 상부에 배치되는 것으로서, 상기 PCR 반응 챔버의 개방 상단 면에 맞닿아 상기 개방 상단 면을 밀폐하되, 상기 광 투과부를 구비하는 덮개 역할을 수행하는 제3 판;
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제2 판과 제3 판 사이에 상기 광 투과부를 관통하도록 둘러싸는 홀(hole), 및 상기 PCR 반응 챔버의 개방 상단 면에 맞닿아 상기 개방 상단 면을 밀폐하는 플렉서블 패킹부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 PCR 반응 챔버로부터 발생하는 열을 외부로 방출하도록 구현된 열 방출부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩.
  11. 제1항에 따른 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩;
    상기 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩의 적어도 일 면에 열 접촉하도록 구현된 1 이상의 열 블록; 및
    상기 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩의 PCR 반응 챔버 내부의 PCR 증폭 산물로부터 발생하는 광신호를 검출하도록 구현된 광 검출 모듈;
    을 포함하는, 실시간 PCR 장치.
  12. 제1항에 따른 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩;
    기판 상에 배치되되 상기 마이크로 PCR 칩과 열 접촉하도록 구현된 제1 열 블록;
    상기 기판 상에 상기 제1 열 블록과 이격 배치되되 상기 마이크로 PCR 칩과 열 접촉하도록 구현된 제2 열 블록;
    상기 제1 열 블록 및 제2 열 블록 위로 구동 수단에 의해 좌우 및/또는 상하 이동 가능하고, 상기 마이크로 PCR 칩이 장착된 칩 홀더; 및
    상기 제1 열 블록과 제2 열 블록 사이에 배치되되, 상기 식중독균 검출용 마이크로 PCR 칩이 상기 구동 수단에 의해 상기 제1 열 블록과 제2 열 블록 간 이동시 상기 마이크로 PCR 칩의 PCR 반응 챔버 내부의 PCR 증폭 산물로부터 발생하는 광신호를 검출하도록 구현된 광 검출 모듈;
    을 포함하는, 실시간 PCR 장치.
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